JP5808904B2 - プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 - Google Patents
プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5808904B2 JP5808904B2 JP2010248139A JP2010248139A JP5808904B2 JP 5808904 B2 JP5808904 B2 JP 5808904B2 JP 2010248139 A JP2010248139 A JP 2010248139A JP 2010248139 A JP2010248139 A JP 2010248139A JP 5808904 B2 JP5808904 B2 JP 5808904B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phb2
- pgc1α
- gene
- amino acid
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Description
(1) プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤。
(2) プロヒビチン2(PHB2)の部分断片又は変異体を含む、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)活性調節剤。
(3) プロヒビチン2(PHB2)の部分断片又は変異体を含む、脂肪分化調節剤。
(4) プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体。
(5) プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することを含む、PHB2とPGC1αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。
(6) プロヒビチン2(PHB2)によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)のコアクチベーター活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
(7) プロヒビチン2(PHB2)によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)の転写活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
(1)脂肪分化調節剤のスクリーニング方法
本発明においては、PHB2の核における相互作用タンパク質が、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)であることが同定された。そして、PHB2はPGC1αと直接結合し、PPARγの転写活性を抑制することを明らかにされた。さらに、脂肪前駆細胞においてミトコンドリアに内在するPHB2はエストラジオールにより核へ移行されること、またエストラジオールが脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することが明らかにされた。さらに、エストラジオール非存在下においても核に局在するPHB2変異体が、脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することも明らかにされた。
パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)遺伝子は、NCBI登録番号NM_015869 としてNCBIに登録されている。ヒトPPARγタンパク質は、NCBI登録番号NP_056953としてNCBIに登録されている。
プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との結合を指標とする場合には、上記した通り、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を分析し、上記複合体の形成を促進又は阻害する被験物質が選択すればよい。
プロヒビチン2(PHB2)によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)のコアクチベーター活性の抑制を指標とする場合には、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)を接触させるが、さらにこの系に、PGC1αのコアクチベーター活性を測定できる測定系を含めておく。PGC1αのコアクチベーター活性を測定できる測定系としては、PPAR反応性エレメント(PPRE)をチミジンキナーゼ(TK)プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)、PPARγ遺伝子、PHB2遺伝子及びPGC1αを共発現させた系、あるいはGAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質(DBD-PGC1α)と、GAL4の認識配列であるUAS (upstream activator sequence) 配列を上流に有するルシフェラーゼレポーター遺伝子(GAL4-Luc)と、PHB2遺伝子とを共発現させた系などを挙げることができる。上記した系において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を指標として、PGC1αのコアクチベーター活性の抑制を測定することができる。
プロヒビチン2(PHB2)によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)の転写活性の抑制を指標とする場合には、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)を接触させるが、さらにこの系に、PPARγの転写活性の抑制を測定できる測定系を含めておく。PPARγの転写活性の抑制を測定できる測定系としては、PPAR反応性エレメント(PPRE)をチミジンキナーゼ(TK)プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)、PPARγ遺伝子、PHB2遺伝子及びPGC1αを共発現させた系などを挙げることができる。上記した系において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を指標として、PPARγの転写活性の抑制を測定することができる。
エストラジオールによるプロヒビチン2(PHB2)の核への移行を指標とする場合には、細胞内において、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)を接触させる。その後、細胞内におけるプロヒビチン2(PHB2)の局在を、例えば、細胞免疫染色などにより分析することによりスクリーニングを行うことができる。
本発明によれば、プロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤が提供される。例えば、PHB2とPGC1αとの複合体の形成を促進する物質は、脂肪分化抑制剤として有用であり、PHB2とPGC1αとの複合体の形成を抑制する物質は、脂肪分化促進剤として有用である。本発明で用いるプロヒビチン2(PHB2)とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を調節する物質としては、上記した本発明のスクリーニング方法により選択される物質を用いることもできる。
脂肪前駆細胞(3T3-L1細胞)は、脂肪細胞の分化研究に適した細胞系である。デキサメタゾン、IBMXやインスリンなどの薬剤を添加した分化培地を用いることにより、3T3-L1細胞は脂肪細胞に分化する(図1A)。誘導後7日ではoil red Oで赤く染色される中性脂肪を含んだ脂肪滴が細胞質に多く出現する(図1B)。
RT-PCRは、先ず1μgのtotal RNAからSuperscriptIIを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。次に、このcDNAを鋳型としてrTaq polymerase (TAKARA)を用いてPCRを行った。PCRのプライマーと条件は以下に示す通りである。
以上から、3T3-L1細胞は、内在性にERαやPGC1α遺伝子の発現を有すること、エストロゲンで3T3-L1細胞の脂肪分化が抑制されること、3T3-L1細胞では、エストロゲン刺激により内在性のPHB2の一部がミトコンドリアから核に移行することを示した。
ウミシイタケ(Renilla reniformis)由来luciferase (RLuc)を内部標準にしたDual luciferase assayを用いて、PHB2の核内作用を検討した。
HeLa細胞をガラスボトムディッシュに培養し、リポフェクトアミン2000を用いて野生型ERαおよび核移行シグナルを含む256−303アミノ酸の部位を欠失させた変異型ERα(ERα241G)を一過的に遺伝子導入した。翌日、10-8 M ICIまたは10-7 M E2を添加した細胞培養液に置換し2時間培養後、前述の方法で、抗GST−PHB2抗体を用いて細胞免疫染色を実施した。蛍光像は、TCS SP5(Leica)共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。
PHB2の核移行が、直接的に脂肪分化抑制作用を有するか否かを検討する目的で、E2非存在下においても核に移行する、アミノ末端に局在するミトコンドリア移行シグナルを欠失したPHB2変異体(PHB2C:51−299AA)をレンチウイルスで作製し、これを3T3-L1細胞に導入することにより、E2が関与しないPHB2の脂肪分化抑制作用の有無を検討した。
E2による肥満抑制が、PHB2の細胞内局在変化を伴うものか否かを、in vivoで検証した。
先ず、卵巣摘出施術(ovarectomy; OVX)を施行したマウスを作製し、閉経後肥満のモデルマウスとなるかを検証した。生後10週のC57BL6J雌マウスを、OVX処置後、一週間後から0.1 mg/kgのE2含有飼料またはE2不含飼料にて飼育し、体重の経時変化を比較したところ、E2不含飼料にて飼育したマウス(E2非投与群)の体重は増加したものの、E2含有群では、体重増加が認められなかった(図5A)。マウスへのE2の効果を確認するために、60日間飼育後のマウスを、解剖後に子宮重量を計測したところ、E2非投与群では子宮重量が減少していた(図5B)。しかし、E2投与群では、子宮重量は増加していた(図5B)。一方、60日間飼育後のマウスを、X線CTを用いて脛骨の海綿骨密度を計測したところ、E2非投与群で骨密度が減少していたが、E2投与群では骨密度は増加していた(図5C)。また、同様にCTによる内臓脂肪(VAT)、皮下脂肪(SAT)量を計測したところ、E2非投与群では脂肪量が増加していたが、E2投与群では脂肪量は減少していた (図5D)。以上から、OVXマウスは、閉経後肥満のモデルとなること、またE2投与によるホルモン補充療法がマウスに対して効果があり、肥満を抑制することが示された。
以上から、(1)ミトコンドリアに局在するPHB2が、ERαおよびE2の存在下にて核に移行すること、(2)PHB2は核において、脂肪分化を促進する転写因子PPARγのコアクチベータであるPGC1αに直接結合することにより、その活性を抑制し、この抑制を介してPPARγの転写活性を抑制すること、(3)E2非存在下においても、PHB2の核局在が脂肪分化を抑制することから、PHB2の直接作用として脂肪分化抑制活性があることが示された。さらに、(4)閉経後肥満のモデルであるOVXマウスの脂肪組織においても、E2が内在性PHB2の核局在を誘導し、更に脂肪細胞の肥満を抑制することを明らかにした。図6において、PHB2の肥満抑制における分子メカニズムのモデルを示す。
前述の記載に従いDual luciferase assayを実施した(n=3)。内部標準としてTK-RLuc、レポーター遺伝子としてエストロゲン反応性エレメントをTKプロモータの上流に有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(ERE-Luc)、共発現させる遺伝子にERα、マウスPGC1α遺伝子、PHB2遺伝子などを表示の組み合わせで導入した。遺伝子導入後5時間後の培地交換の際にリガンドとして10-7 M E2を添加した実験を加えた。
脂肪分化を促進する転写因子であるPPARγの転写活性に対し、各種コアクチベータを加えることにより、どのコアクチベータが転写活性を促進する検討し、さらにこれらのコアクチベータ存在下でのPPARγの転写活性を、PHB2が抑制するかを検討した。
Claims (4)
- 配列番号2で表されるプロヒビチン2(PHB2)のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号179-200からなるPHB2部分断片、または前記アミノ酸番号179-200において1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成り、かつPGC1α活性抑制作用を有するPHB2部分断片を含む、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)活性抑制剤。
- 配列番号2で表されるプロヒビチン2(PHB2)のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号179-200からなるPHB2部分断片、または前記アミノ酸番号179-200において1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成り、かつ脂肪分化阻害作用を有するPHB2部分断片を含む、脂肪分化阻害剤。
- 配列番号2で表されるプロヒビチン2(PHB2)のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号179-200からなるPHB2部分断片、または前記アミノ酸番号179-200において1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成り、かつPGC1α活性抑制作用又は脂肪分化阻害作用を有するPHB2部分断片と、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター(PGC1α)との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することを含む、PHB2とPGC1αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。
- PHB2とPGC1αとの複合体の形成を促進する被験物質を、脂肪分化阻害剤として選択する、請求項3に記載のPHB2とPGC1αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010248139A JP5808904B2 (ja) | 2009-11-05 | 2010-11-05 | プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009254332 | 2009-11-05 | ||
JP2009254332 | 2009-11-05 | ||
JP2010248139A JP5808904B2 (ja) | 2009-11-05 | 2010-11-05 | プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011116753A JP2011116753A (ja) | 2011-06-16 |
JP5808904B2 true JP5808904B2 (ja) | 2015-11-10 |
Family
ID=44282501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010248139A Active JP5808904B2 (ja) | 2009-11-05 | 2010-11-05 | プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5808904B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013172421A1 (ja) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | 杏林製薬株式会社 | Ampkタンパク質活性化剤のスクリーニング方法及びampkタンパク質活性化剤 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1175856A (ja) * | 1997-09-17 | 1999-03-23 | Takashi Tsuruo | トポイソメラーゼ結合タンパク質 |
AU1344300A (en) * | 1998-11-04 | 2000-05-22 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The | Repressor of estrogen receptor activity |
JP2007039398A (ja) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | トキシン−アンチトキシン複合体の形成を指標とする抗生物質のスクリーニング方法 |
JP2009001494A (ja) * | 2005-09-29 | 2009-01-08 | Osaka Bioscience Institute | 非典型的なプロリンリッチ配列結合阻害剤 |
JP4901753B2 (ja) * | 2005-11-24 | 2012-03-21 | 学校法人自治医科大学 | プロヒビチン2(phb2)のミトコンドリア機能 |
-
2010
- 2010-11-05 JP JP2010248139A patent/JP5808904B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011116753A (ja) | 2011-06-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hayashi et al. | Autoregulation of osteocyte Sema3A orchestrates estrogen action and counteracts bone aging | |
Fu et al. | Mitophagy directs muscle-adipose crosstalk to alleviate dietary obesity | |
Stennard et al. | Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart | |
Sourbier et al. | Englerin A stimulates PKCθ to inhibit insulin signaling and to simultaneously activate HSF1: pharmacologically induced synthetic lethality | |
KR101573009B1 (ko) | 세포막 재봉합을 조절하기 위한 조성물 및 방법 | |
Zheng et al. | Calpain-1 induces endoplasmic reticulum stress in promoting cardiomyocyte apoptosis following hypoxia/reoxygenation | |
Liu et al. | Toll-like receptor 5 deficiency attenuates interstitial cardiac fibrosis and dysfunction induced by pressure overload by inhibiting inflammation and the endothelial–mesenchymal transition | |
Hwang et al. | Deletion of Orai1 alters expression of multiple genes during osteoclast and osteoblast maturation | |
EP2572730A1 (en) | Method for prevention or treatment of metabolic syndrome | |
KR102212697B1 (ko) | Tm4sf5 단백질의 발현 변화를 이용한 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법 | |
Xu et al. | Endothelial-specific deletion of Ets-1 attenuates Angiotensin II-induced cardiac fibrosis via suppression of endothelial-to-mesenchymal transition | |
Pan et al. | Overexpression of CXCR4 synergizes with LL-37 in the metastasis of breast cancer cells | |
Ouyang et al. | DEPTOR exacerbates bone–fat imbalance in osteoporosis by transcriptionally modulating BMSC differentiation | |
WO2000046348A1 (fr) | Procede permettant d'induire une differenciation dans les adipocytes, compose regulant cette differenciation et procede de criblage correspondant | |
Sagnol et al. | Epithelial Splicing Regulatory Protein 1 (ESRP1) is a new regulator of stomach smooth muscle development and plasticity | |
JP5808904B2 (ja) | プロヒビチン2とPGC1αとの結合を用いた脂肪分化調節剤 | |
Liu et al. | Trim65 attenuates isoproterenol-induced cardiac hypertrophy by promoting autophagy and ameliorating mitochondrial dysfunction via the Jak1/Stat1 signaling pathway | |
Zhang et al. | The engrailed-1 gene stimulates brown adipogenesis | |
CN110812470A (zh) | 用于代谢调节的方法和组合物 | |
Zscheppang et al. | ErbB4 is an upstream regulator of TTF-1 fetal mouse lung type II cell development in vitro | |
Dutta et al. | Deciphering the role of aquaporins in metabolic diseases: A mini review | |
JP2013234167A (ja) | 神経変性疾患の治療及び/又は予防のための医薬組成物、及び、その有効成分のスクリーニング方法 | |
JP5286602B2 (ja) | インスリン抵抗性改善薬 | |
KR102094184B1 (ko) | Crtc 2의 간 특이적 조절에 의한 지방간 및 비만 제어용 조성물 | |
JP2012021974A (ja) | 石灰化組織における可溶化Klotho、FGF23およびFGFR複合体形成機構を利用した用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130723 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140819 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141017 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150421 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150605 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150908 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150910 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5808904 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |