CN107988105B - 一种海洋芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆及其应用。海洋芽孢杆菌为产多糖海洋细菌Bacillus sp.BS11，该菌株在制备抗癌药物、抗肿瘤转移药物、抗癌保健品或抗癌症复发保健品中的应用；本发明中海洋芽孢杆菌分离自海山，可用于制备抗癌药物或抗癌保健品或制备抗肿瘤转移的药物或抗肿瘤形成的保健品。本发明公开了将芽孢杆菌胞外多糖应用于制备抗癌和抗肿瘤转移药物和保健品，能够抑制A549细胞中βⅢ‑tubulin的表达，抑制癌细胞表面足丝的形成，抑制A549细胞的贴壁和附着，抑制A549细胞的转移，最终引起该细胞的失巢凋亡，从而对恶性肿瘤有一定的预防和治疗作用。

Description

一种海洋芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆及其应用。
背景技术
肺癌是导致全世界人群肿瘤相关的死亡最主要的原因，目前治疗的有效性严重受限，死亡率极高。其中，非小细胞型肺癌在所有类型的肺癌中占据了80%的比例，而化学治疗法仍然是现在治疗的标准方法。虽然这些治疗策略极大地改善了患者们的症状和生活质量，但是病患的总体存活率仍然很低。因此，寻找和开发新颖有效的药物来预防和治疗肺癌的需求依旧非常迫切。
β-tubulin是一种重要的细胞骨架蛋白，参与多种重要的细胞过程，包括有丝分裂，胞内物质转运等。在癌细胞中，β-tubulin还与伪足的形成相关，伪足是癌细胞参与癌细胞侵袭和迁移的重要细胞结构，与多种癌症的恶性化和耐药性的形成有关。因此，β-tubulin已经成为一种重要的药物靶标，多种一线的的抗癌药物都通过干扰β-tubulin的功能起到抑制癌细胞增殖的作用。还有许多抗微管蛋白的药物已经进入了临床研究。但是目前大部分的靶向β-tubulin的候选药物通常并不是特异性针对肿瘤细胞并且常常导致健康组织中的细胞分裂障碍等一系列副作用。不仅如此，临床治疗中化疗药物的抵抗已经成为一个非常严重的问题，大大降低了一些癌症患者的生存质量。因此对新颖高效的抗微管药物的持续寻找仍然在继续。
海洋多糖是一种重要的生物活性物质，这些海洋细菌活性物质在医药、食品和生物医药产业具有极大的发展潜力。按照来源，海洋多糖主要分为海洋植物多糖，海洋动物多糖，海洋微生物多糖三大类，其中海洋微生物多糖因结构新颖活性超强且易于获得而广受关注。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海洋芽孢杆菌，海洋芽孢杆菌为产多糖海洋细菌Bacillus sp. BS11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中国科学院微生物研究所），保藏日期为2017年12月，保藏编号：CGMCC NO.14928。
产多糖海洋细菌为Bacillus sp. BS11，其16s rDNA序列如下：
>Bacillus sp. strain BS11
GGCGGCGTGCTATACTGCAAGTCGAGCGAAGAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGCAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGGTAATACATCGCACCGCATGGTGCAATGTTGAAAGTTGGCTTTCGAGCTAACGCTGCAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGACGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAAATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGGGGTTGGGGGGGTTCCACCCTCAGTGCTGAAGTTAACACATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTCCTCTGACATCTGGGAAAAGGACGTCCCCTTCGGGGACAAATGACGGGGGGTGCATGTTGCCTCAGTCCGGCCGGGAAATGTGGGTAAGTCCGCACGAGCGAACCTTGACTAATTGCAAATTAA
一种海洋芽孢杆菌的应用，海洋芽孢杆菌在制备抗癌药物、抗肿瘤转移药物、抗癌保健品或抗癌症复发保健品中的应用。
所述海洋芽孢杆菌为细菌的营养细胞或完整培养物。
所述海洋芽孢杆菌为细菌的培养物浓缩物、细菌悬液、发酵液或发酵上清液。
所述海洋芽孢杆菌为细菌发酵培养纯化所得芽孢杆菌胞外多糖。
所述芽孢杆菌胞外多糖为将产多糖海洋细菌按1/1000接种量接种于含10%质量分数的蔗糖的2216E培养基中，在28 °C 、160 rpm振荡培养48 h，而后离心除去菌体，上清经醇沉，sevage试剂除蛋白，阴离子柱浓缩，分子筛分离，冻干，即得芽孢杆菌胞外多糖EPS11（依分子量分为EPS11-1, EPS11-2）。
所述芽孢杆菌胞外多糖为EPS11-1或EPS11-2；其中，EPS1-1分子量为180～100kDa，主要单糖包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖和半乳糖，其摩尔比约为1:0.99:0.70:1.05:0.07；EPS11-2分子量为20～30 kDa，主要单糖包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖和木糖，其摩尔比为1:2.58:0.68:0.13:3.09:1.41。
本发明所具有的优点为：
本发明海洋芽孢杆菌多糖在作为制备抗癌药物和保健品中的应用，能够抑制癌细胞内βⅢ-tubulin的表达，干扰癌细胞伪足的形成，抑制细胞的贴壁和迁移，最终诱导癌细胞发生失巢凋亡，从而对恶性肿瘤有一定的预防和治疗作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖的红外谱图。
图2为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药对肺癌A549细胞增殖活性影响的柱状图。
图3 A为本发明实施例提供的Transwell法检测海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药对对肺癌A549细胞迁移的影响；
图3B为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用图；
图3C为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药对肺癌A549细胞各个凋亡时间细胞数的累积图。
图4A为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药对肺癌A549细胞形态和伪足的作用图；
图4B为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药时间和剂量依赖地抑制肺癌A549细胞贴壁的作用图。
图5A为本发明实施例提供的realtime-PCR检测海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药抑制肺癌A549细胞βⅢ-tubulin mRNA相对含量作用图；
图5B，C为本发明实施例提供的western blot检测海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药（B）剂量和（C）时间依赖地抑制肺癌A549细胞中βⅢ-tubulin蛋白的表达作用图；
图5D为本发明实施例提供的免疫荧光法检测海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药剂量依赖地抑制肺癌A549细胞中βⅢ-tubulin蛋白表达的作用图；
图5E为本发明实施例提供的western blot法检测海洋芽孢杆菌胞外多糖体外给药时间依赖地抑制肺癌A549细胞中AKT激酶的磷酸化作用图。
图6A为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖注射给药对裸鼠体重变化的影响折线图；
图6B为为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖注射给药后不同组裸鼠体内肺癌A549细胞移植瘤解剖图；
图6C为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖注射给药对裸鼠肺癌A549细胞移植瘤相对瘤体积变化的影响折线图；
图6D为为本发明实施例提供的海洋芽孢杆菌胞外多糖注射给药后不同组裸鼠体内肺癌A549细胞移植瘤组织切片苏木精伊红染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明。
本发明海洋芽孢杆菌的发酵物，以及纯化获得EPS11均具有抗癌活性和抑制伪足形成的活性，进而可以制备抗癌药物或/和抗癌保健品、抑制伪足形成药物或/和抑制伪足形成保健品等。本发明首次发现该海洋芽孢杆菌的发酵物以及纯化获得胞外多糖对抗癌和抑制伪足形成具有显著的抑制作用，并公开了将海洋芽孢杆菌胞外多糖应用于制备抗癌和抑制伪足形成药物和保健品。能够诱导癌细胞内βⅢ-tubulin的表达，干扰癌细胞伪足的形成，抑制细胞的贴壁和迁移，最终诱导癌细胞的失巢凋亡，从而对恶性肿瘤有一定的预防和治疗作用。
实施例1，海洋芽孢杆菌的获得：
2016年3月份跟随“科学号”在西太平洋海山区域(139o3802’E, 11o44162’N)采集了海泥样品。采集的样品用无菌蒸馏水梯度稀释后分别取10-6, 10-5, 10-4的稀释液各0.2毫升涂布于固体培养基上，28度培养48小时。菌落用四分体划线法转接至新鲜固体培养基（5g胰蛋白胨、1g酵母膏定容于1L无菌海水中，并加入15个琼脂）培养， 转接数次直至得到菌株的纯培养物，保种备用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中国科学院微生物研究所），保藏日期为2017年12月，保藏编号：CGMCC NO.14928。
将分离到的细菌分别接种到100 mL 2216E液体培养基（5g胰蛋白胨、1g酵母膏定容于1L无菌海水中）中，28度振荡培养2天。细菌发酵液经布氏漏斗双层滤纸抽滤分离除去菌体及其中的粗杂质，再将预冷2 h的95%的乙醇加入到浓缩液中 (体积比4∶1)，把醇沉后的溶液放入冰箱中静置过夜。将其溶于适量蒸馏水后的上清液对蒸馏水透析2天，将透析液浓缩冷冻干燥即得到胞外多糖粗品，以蒸馏水溶解测定多糖的含量。通过MTT方法测定胞外多糖是否抑制肝癌细胞的生长。
MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。三联液(10% SDS，5%异丁醇，12 mM HCl)能溶解细胞中的甲瓒，通过酶标仪测定其在570 nm波长处光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
具体做法如下：将处于对数生长期的A549细胞制成细胞悬液，接种到96孔板24 h后，加入含有不同浓度多糖，每组设6个重复，作用48 h之后，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μL，继续培养4 h后，倒掉培养液，加入二甲基亚砜150 μL /孔，摇床上振荡10 min，使紫色结晶充分溶解，置酶标仪上测定波长490 nm下的吸光值。由测定的吸光值计算细胞增殖抑制率：细胞的增殖抑制率（%）=（对照组A值-试验组A值）/对照组A值×100%。 通过比较分离得到的细菌的抑制肿瘤细胞的效率，11号菌株的抗肿瘤活性最强，经鉴定该菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillus sp. 11。
实施例2
海洋芽孢杆菌Bacillus sp. 11胞外多糖的制备
挑取单菌落接种至装有5ml液体2216E培养基的试管，于28℃、 160 rpm振荡培养24h获得种子发酵液。取该芽孢杆菌的种子发酵液按0.1%的比例接种到500 ml外加1%蔗糖的2216e培养基，于28℃、 160 rpm振荡培养48h。离心（8000 rpm, 20 min）除去菌体，再加入上清液3倍体积的95%乙醇溶液4℃过夜沉淀，而后离心（8000 rpm, 20 min，4℃）取沉淀，并加水溶解全部沉淀。溶解后经Sevage试剂除蛋白三次后将溶液装入8000-14000 Da的透析袋透析。透析液经0.22 μm滤膜过滤后用阴离子柱凝缩，并经20 mM Tris、2M NaCl洗脱。收集洗脱液装入8000-14000 Da的透析袋透析，透析液经超滤浓缩后由20mM Tris、2M NaCl经分子筛（HiloadTM16/600 SuperdexTM 200）洗脱分离，分别收集在190 nm和220 nm处的特征吸收峰，即目标多糖。收集到的洗脱液经蒸馏水透析后冻干即得该海洋芽孢杆菌的胞外多糖（EPS11）产率为0.0006%。
EPS11有两个组分，EPS11-1和EPS11-2。EPS11-1分子量范围为80～100 kDa，主要组成单糖包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖和半乳糖，其摩尔比约为1:0.99:0.70:1.05:0.07。EPS11-2分子量范围为20～30 kDa，主要成分包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖和木糖，其摩尔比为1:2.58:0.68:0.13:3.09:1.41。两种组分在EPS11中含量和比例稳定。红外谱图（图1）在1226 cm-1出现硫酸基特征吸收峰，说明海洋芽孢杆菌胞外多糖为硫酸多糖。
实施例3
EPS11体外给药对肺癌A549细胞增殖活性的影响
实验方法
取对数生长期的A549 细胞，经胰蛋白酶将对数生长期的细胞液消化成单细胞悬液，细胞计数后，按照6×103个/孔的密度接种于96 孔细胞培养板，放入5% CO2、37℃的细胞培养箱中培养；第二天，向96 孔板中加入终浓度为0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.10, 0.20,0.50, 1.00 和 2.00 mg/ml的EPS11，每组浓度设3个复孔，放入培养箱中分别继续培养24h和48 h，经EPS11处理之后，每孔加入30 μl 的MTT 溶液（浓度为5 mg/ml），放入培养箱中再接着培养4 h，而后每孔再加入100 μl的三联液，放入培养箱中过夜，用酶标仪测定570nm 处的吸光值；按照下方的方法计算A549细胞的增殖抑制率： 增殖抑制率（%）=（OD 对照组－OD 实验组）/ OD 对照组 × 100%。实验重复三次，数据以± SD 表示，通过GraphPad，采用one- way anova 比较差异显著性，* P < 0.05差异显著，* * P < 0.01 差异极显著。
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11在体外对肺癌A549细胞的增殖活性具有抑制作用，实验结果见图2。海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11以浓度和时间依赖性方式显著地抑制肺癌A549细胞的体外增殖活性。海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11处理A549细胞48 h后，对A549细胞的增殖抑制率7%上升至80%。
实施例4
EPS11体外给药改变细胞形态，抑制细胞贴壁与胞外基质的黏附和贴壁是一个很重要的细胞学过程。贴壁细胞通过与胞外基质建立联系获得机械支持和存活信号。当与胞外基质的联系被切断时，部分细胞会发生失巢凋亡，癌细胞通过迁移来抵抗失巢凋亡。
伪足是癌细胞中一种很重要的细胞结构，与癌细胞的黏附，侵袭和迁移有关。当伪足被破坏时癌细胞的转移能力随之下降，从而抵御失巢凋亡的能力也下降。
实验方法
结晶紫染色法
取对数生长期的A549 细胞，经胰蛋白酶将对数生长期的细胞液消化成单细胞悬液，细胞计数后，按照6×103个/孔的密度接种于96 孔细胞培养板，放入5% CO2、37℃ 的细胞培养箱中培养；第二天，向96 孔板中加入终浓度为0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.10, 0.20,0.50, 1.00 和2.00mg/ml的EPS11，每组浓度设3个复孔，放入培养箱中分别继续培养12 h和24 h。分别吸取培养基并用PBS洗去脱落的细胞。后用95%的乙醇溶液37℃度固定30 min。洗去乙醇后用0.1%的结晶紫染液染色20 min。用PBS洗去多余染液后每孔加100 μl冰醋酸溶解结晶。用酶标仪测定590 nm 处的吸光值；按照下方的方法计算A549细胞的贴壁抑制率： 增殖抑制率（%）=（OD 对照组－OD 实验组）/ OD 对照组 × 100%。实验重复三次，数据以± SD表示，通过GraphPad，采用one-way anova 比较差异显著性，* P < 0.05差异显著，* * P <0.01 差异极显著。
扫描电镜观察
取对数期的A549细胞，胰酶消化成单细胞悬液，接种6孔板，6孔板中预先放入细胞爬片。调整细胞数量为2.5×106个/孔；24 h后，加入0, 0.05，0.10,0.15和0.20 mg/ml的海洋芽孢杆菌胞外多糖继续培养。6 h后取出细胞爬片，用5%戊二醛固定30 min。洗去戊二醛并用30-100%乙醇溶液梯度脱水。脱水后的样片方入超临界流CO2中干燥后经扫描电子显微镜观察。
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11在体外对肺癌A549细胞的贴壁具有抑制作用，实验结果见图4B。海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11以浓度和时间依赖性方式显著地抑制肺癌A549细胞的贴壁。0.10 mg/ml的EPS11处理A549细胞24 h后，对A549细胞的贴壁抑制率达到100%。电镜观察的结果（图4A）显示，在经EPS11处理后，A549细胞逐渐由多角形变为圆形，且细胞周围的伪足随EPS11浓度的上升逐渐断裂和减少。当经0.20 mg/ml的EPS11处理6后，A549细胞的伪足几乎全部消失。
实施例5
EPS11体外给药抑制细胞迁移，诱导肺癌A549细胞发生凋亡
迁移是肿瘤细胞具有的一种特殊行为，与癌症的恶性化程度有关。部分肿瘤细胞通过迁移来躲避细胞凋亡。凋亡细胞的染色质呈现浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。细胞凋亡早期，磷酯酰丝氨酸（PS）外翻，Annexin V是对PS有高度亲和力的重组蛋白，可作为外翻的PS的特异性探针并作为早期凋亡的标志之一。
实验方法
流式细胞仪检测法：
取对数期的A549细胞，经胰酶将对数生长期的细胞液消化成单细胞悬液，接种6孔板，调整细胞数量为2.5×106个/孔；24 h后，加入0, 0.1, 0.2和0.3 mg/ml的海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11继续培养；24 h后，收集A549细胞并用PBS清洗两次，500 μl 结合缓冲液重悬细胞沉淀，分别加入5 μl Annexin V-FITC and PI，室温避光孵育10 min，即刻使用流式细胞仪检测。
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11在体外能够诱导肺癌A549细胞发生凋亡。结果如图3B所示，Annexin V-FITC/PI双染实验验证了EPS11对A549细胞的凋亡的诱导作用，结果如图3C所示，不同浓度的EPS11处理肺癌A549细胞24 h后，早期凋亡细胞所占的比例分别从1.1% 上升至54.0%。
Transwell 迁移法
该实验是在Transwell Boyden chamber (Corning Costar, Cambridge, MA,USA)中进行的，该小室含有8 μm 的滤膜，可以允许细胞跨膜穿过，具体实验方法如下：取对数期HUVEC 细胞，经胰酶将对数生长期的细胞液消化成单细胞悬液，用各个不同浓度的SPS(0, 0.2, 0.3及0.4 mg/ml) 调整细胞密度为5 × 105 个/ml；取100 μl 各浓度梯度的细胞悬液加入到Transwell 培养板的上室中，设3 个复孔；下室则放入0.6 ml 含20%胎牛血清的新鲜RPMI-1640 培养基，放入二氧化碳培养箱中培养8 h；取出培养板，倒掉小室内外的培养液，PBS 清洗滤膜三次，并用95%的乙醇室温固定30 分钟，然后0.1%的结晶紫室温染色20 min；用PBS 洗去多余的染料,并用棉签将小室上表面的细胞擦掉，只留下迁移到滤膜下表面的细胞；倒置相差显微镜下观察迁移到下室的细胞，并拍照保存。
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11在体外抑制A549细胞的迁移并引起该细胞的凋亡。流式细胞仪的结果显示，EPS11呈剂量依赖的引起A549细胞凋亡，且主要为早期凋亡。Transwell实验结果表明，EPS11引起A549细胞迁移的抑制作用。
实施例6
EPS11抑制A549细胞中βⅢ-tubulin的表达，且抑制失巢凋亡抵抗相关的通路活化
β-tubulin是一种重要的细胞骨架蛋白，参与细胞的有丝分裂和胞内物质的转运等多种生物学过程。β-tubulin的也与癌细胞伪足的延伸有关。β-tubulin一共有7种亚型，其中βⅢ-tubulin在部分癌细胞中高表达，并磷酸化下游的AKT激酶，该通路的激活被认为与失巢凋亡抵抗相关。
实验方法
Realtime-PCR
将对数生长期的A549细胞接种六孔板，调整细胞数量为2.5×106个/孔；培养24 h后，加入0, 0.05, 0.10 和0.20 mg/ml的EPS11继续培养；24 h后，加入trizol裂解细胞并提取总RNA，以提取的RNA为模板反转为cDNA。以所得cDNA为模板，β-actin为内参，5'-CTGCTCGCAGCTGGAGTGAG-3'，5'CATAAATACTGCAGGAGGGC3'为引物，用SYBR@Green 法进行realtime-PCR，以检测细胞中mRNA的量。计算细胞中mRNA的量，公式如下：mRNA的相对浓度=2-ΔΔct；实验重复三次，数据以±SD 表示，通过GraphPad，采用one-way anova 比较差异显著性，* P < 0.05差异显著，* * P < 0.01 差异极显著。
Western Blot
（1）βⅢ-tubulin蛋白表达量随加药浓度的变化
将对数生长期的A549细胞接种六孔板，调整细胞数量为2.5×106个/孔；培养24 h后，加入0, 0.05, 0.10 及0.20mg/ml的EPS11继续培养；12 h后，根据每孔的细胞总量加入相应量的裂解缓冲液，振荡裂解10 min，收集裂解液离心，沸水浴煮10 min制备蛋白样品；随后蛋白样品通过10% SDS-PAGE胶分离并转移至NC膜上，随之相继孵育一抗和二抗，最后加入ECL发光液检测各蛋白表达量的变化。
（2）βⅢ-tubulin蛋白及下游AKT随加药时间的变化
将对数生长期的A549细胞接种六孔板，调整细胞数量为2.5×106个/孔；加入0.10mg/ml的EPS11分别培养0，8，16，24，36，48h后，根据每孔的细胞总量加入相应量的裂解缓冲液，振荡裂解10min，收集裂解液离心，沸水浴煮10 min制备蛋白样品；随后蛋白样品通过10% SDS-PAGE胶分离并转移至NC膜上，随之相继孵育一抗和二抗，最后加入ECL发光液检测各蛋白表达量的变化。
免疫荧光
取对数期的A549细胞，胰酶消化成单细胞悬液，接种6孔板，6孔板中预先放入细胞爬片。调整细胞数量为2.5×106个/孔；24 h后，加入0, 0.05，0.10及0.20 mg/ml的海洋芽孢杆菌胞外多糖继续培养。24h后取出细胞爬片，用4%多聚甲醛固定20min。0.1% TritonX-100通透5 min。PBS洗3遍。3%BSA封闭1h。随之相继孵育一抗，二抗和DAPI。最后封片并在荧光显微镜下观察。
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖在体外对肺癌A549细胞中βⅢ-tubulin具有抑制作用，实验结果见图5。海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11以浓度和时间依赖性方式在转录和翻译水平显著地抑制肺癌A549细胞中βⅢ-tubulin的表达。且在不影响AKT表达两的情况下，时间依赖地抑制AKT激酶的活化。
实施例7
EPS11体内给药抑制裸鼠A549细胞抑制瘤的生长体内实验的评价目标化合物有效性和安全性的有效方法。BALB/c小鼠易于饲养，管理和成瘤的特点使得BALB/c小鼠模型能广泛应用于药物有效性和安全性的评价实验中。
实验方法
A549细胞体外扩增培养至所需数量，经胰酶消化收集细胞，预冷PBS清洗2遍，PBS重悬细胞，4000万/ml。
4周龄的雄性裸鼠右侧腋窝皮下接种A549细胞0.2 ml，待肿瘤长至大约100 mm3时，将荷瘤鼠随机分组，阳性对照组静脉注射紫杉醇溶液10 mg/kg，溶剂对照组1静脉注射等容量紫杉醇溶剂（EL+EtOH按1:1混合，生理盐水稀释100倍），EPS11组静脉注射EPS1150mg/kg，溶剂对照组2静脉注射等容量EPS11溶剂（无菌水用生理盐水稀释20倍），隔天一次，静脉注射容量为0.1 ml/10g体重。每两天测量小鼠体重，肿瘤长径（a），短径（b）。根据公式V=1/2×a×b2 计算肿瘤体积，根据公式计算相对肿瘤体积RTV=Vn/V0（Vn为第n天肿瘤体积，V0为给药前肿瘤体积）。
末次给药后24小时，处死小鼠，剥取肿瘤，称重，将肿瘤组织分别进行冷冻和固定处理，固定后的组织经OCT包埋，冷冻切片，并用苏木精伊红染色观察（图6D）。
以给药天数为横坐标，分别绘制相对肿瘤体积生长曲线（图6C），以及小鼠体重变化曲线（图6A）。数据以±SD 表示，通过GraphPad，采用one-way anova 比较差异显著性，*P < 0.05差异显著，* * P < 0.01 差异极显著，***P<0.001差异非常显著（taxol组）；# P< 0.05差异显著，## P < 0.01 差异极显著，###P<0.001差异非常显著（EPS11组）。
根据以下公式计算抑瘤率：
抑瘤率（%）=（对照组RTV-实验组RTV）/对照组RTV×100
由上述实施例制得的海洋芽孢杆菌胞外多糖在裸鼠体内对肺癌A549细胞移植瘤具有抑制作用，实验结果见图6。从海洋芽孢杆菌胞外多糖EPS11在给药10天起，对应小鼠的瘤体积显著小于对照组。在完成14天的给药后，抑瘤率为42.2%。与阳性药taxol的抑瘤率46.7%较相近。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种海洋芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1091
<212> DNA
<213> 产多糖海洋细菌(Bacillus sp. BS11)
<400> 1
ggcggcgtgc tatactgcaa gtcgagcgaa gagatgggag cttgctccct gatcttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct gccctgcaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggagctaat accgggtaat acatcgcacc gcatggtgca atgttgaaag ttggctttcg 180
agctaacgct gcaggatggg cccgcggcgc attagctagt tggtaaggta atggcttacc 240
aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgac gaaggccttc gggtcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420
caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540
aaagcgcgcg caggcggtct tttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg 600
gtcattggaa actggaggac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agaaatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact 720
gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg agtgctaggg ggttgggggg gttccaccct cagtgctgaa gttaacacat 840
taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc agtggaagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgactcct ctgacatctg ggaaaaggac gtccccttcg gggacaaatg acggggggtg 1020
catgttgcct cagtccggcc gggaaatgtg ggtaagtccg cacgagcgaa ccttgactaa 1080
ttgcaaatta a 1091

Claims (4)

1.一种海洋芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌为产多糖海洋细菌（Bacillus sp.）BS11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号：CGMCC NO.14928。
2.一种按权利要求1所述的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌在制备抗癌药物或抗肿瘤转移药物中的应用；
所述癌症和肿瘤为肺癌。
3.按权利要求2所述的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：将海洋芽孢杆菌按1/1000接种量接种于含10%质量分数的蔗糖的2216E培养基中，在28 °C 、160 rpm振荡培养48 h，而后离心除去菌体，上清液经醇沉，sevage试剂除蛋白，阴离子柱浓缩，分子筛分离，冻干，得到芽孢杆菌胞外多糖EPS11，依分子量分为EPS11-1和 EPS11-2。
4.按权利要求1所述的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述海洋芽孢杆菌在制备芽孢杆菌胞外多糖EPS11-1或EPS11-2中的应用；其中，EPS1-1分子量为180～100 kDa，主要单糖包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖和半乳糖，其摩尔比约为1:0.99:0.70:1.05:0.07；EPS11-2分子量为20～30 kDa，主要单糖包括甘露糖，氨基葡萄糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖和木糖，其摩尔比为1:2.58:0.68:0.13:3.09:1.41。
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