CN107929331A - 一种珊瑚拟青霉提取物在抗糖尿病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种珊瑚拟青霉提取物及其应用。所述提取物是由保藏号为CGMCC14129的珊瑚拟青霉经液体培养、固体发酵培养后，菌丝体经过分离后干燥、提取而成。本发明首次发现我国存在的珊瑚拟青霉菌的提取物具有治疗糖尿病的功效，旨在为众多的糖尿病患者寻找新的降血糖新药；本发明所提供的提取物可以降低血糖浓度，无毒副作用。

Description

一种珊瑚拟青霉提取物在抗糖尿病中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种珊瑚拟青霉提取物及其应用。

背景技术

珊瑚拟青霉Penicilliopsis clavariaeformis最早于1887年被Solms-Laubach和Reink发现，广泛的在印度尼西亚等热带地区的柿子上发现。在台湾收集到的pesudocordyceps seminicola自然生长的成熟子座上发现了其子囊孢子。从Penicilliopsis clavariaeformis 中提取纯化得到的代谢产物penicilliopsin，是一种橘黄色的色素物质，分离提取得到醌茜素skyrin或大黄素emodin。Skyrin和emodin有抗抑郁或者抗肿瘤活性。近年来，具有抗抑郁和抗肿瘤作用的先导化合物一直是国内、外药物工作者寻找的热点。

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种慢性的代谢紊乱性疾病，其治疗仍然是一个世界性的难题，患者需要长期注射外源性胰岛素或口服降血糖药物。此治疗方式不仅药物副作用大，而且生活质量差，经济负担重。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种珊瑚拟青霉提取物。

本发明还提供了一种珊瑚拟青霉提取物在抗糠尿病中的应用。

本发明所采用的具体技术方案为：

本发明提供了一种珊瑚拟青霉提取物在抗糖尿病中的应用，其特征在于，所述提取物是由保藏号为CGMCC14129的珊瑚拟青霉经液体培养、固体发酵培养后，菌丝体经过分离后干燥、提取而成。

进一步的，所述珊瑚拟青霉具体培养过程如下：

（1）制作母种：将第二年不能正常发芽的君迁子种子用75%酒精消毒2-3次，再切成小块放置于消毒好的PDA培养皿中，然后置于 25℃培养箱中恒温暗培养7d，直至长出黄绿色菌丝即得生产母种，再用试管培养基斜面保存；

（2）固体培养：将燕麦斜面保存的珊瑚拟青霉菌株，取小块接在新鲜的燕麦固体斜面培养基上，然后置25 ℃的恒温培养箱中培养7 d，将该菌种放入－4 ℃的冰箱内冷冻保存待用；

（3）液体培养：从燕麦固体培养基上挑选棒状菌丝接种与种子培养液中，置25℃控温摇床和150 r·min^-1的转速下培养3 d。

进一步的，步骤（1）中，所述PDA培养皿中的PDA斜面培养基是由以下重量百分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂 2%、磷酸二氢钾 0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水。

进一步的，步骤（2）中，所述燕麦固体斜面培养基制备方法为：称取燕麦40 g煮沸30 min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂棒6 g，使琼脂完全溶解，再加入葡萄糖20 g 、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、枸缘酸铵0.2g、橘汁25g，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面。

进一步的，步骤（3）中，所述种子培养液是由以下重量百分比的原料组成：蔗糖3%、葡萄糖3%、酵母膏2%、蛋白胨1%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.1%、琼脂2%、余量为蒸馏水，PH值5.0--5.5。

本发明所述珊瑚拟青霉提取物为菌丝提取液或发酵原液；

所述菌丝浸液采用以下方法制备而成：发酵后的菌丝干燥后粉碎，取10克，加100ml蒸馏水，制成10%的混悬液，即得菌丝浸液；

所述发酵原液为液体发酵后，过滤出的滤液原液，即得。

菌种保藏信息

保藏时间：2017年6月1日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No. 14129，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

分类命名：Penicilliopsis clavariaeformis。

本发明发明人在我国发现珊瑚拟青霉菌Penicilliopsis clavariaeformis以来，对其进行了较为详细培养研究，并获取了纯菌种培养，同时还进行了液体发酵培养和固体发酵培养。对于其发酵产物我们通过实验证明有抗糖尿病作用。（珊瑚拟青霉菌种保藏于中国科学院微生物研究所普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC14129）。

本发明的有益效果为：本发明首次发现我国存在的珊瑚拟青霉菌的提取物具有治疗糖尿病的功效，旨在为众多的糖尿病患者寻找新的降血糖新药；本发明所提供的提取物可以降低血糖浓度，无毒副作用。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

1、仪器与材料

1.1 仪器日立牌全自动生化分析仪（日本），LD25-2型离心机。

1.2 材料优降糖（格列本脲，2.5 mg /片，天津太平洋制药有限公司国药准字H12020790）临用前配成 0.5 % 的混悬液。1mg/mL盐酸肾上腺素注射液（遂成药业股份有限公司国药准字H41021054）。葡萄糖（青州尧王制药有限公司国药准字H37021072）。四氧嘧啶（美国Sigma公司，批号073 H 1506），SPF昆明系小鼠雌雄各半，合格证号SCXK(鲁)20110003（山东中医药大学实验动物中心提供）。珊瑚拟青霉药液（发酵液、菌丝浸液），实验时用菌丝浸膏用蒸馏水溶解稀释至所需浓度。

实施例1

一种珊瑚拟青霉提取物，所述提取物是由保藏号为CGMCC14129的珊瑚拟青霉经液体培养、固体发酵培养后，菌丝体经过分离后干燥、提取而成。

所述珊瑚拟青霉具体培养过程如下：

（1）制作母种：将第二年不能正常发芽的君迁子种子用75%酒精消毒2-3次，再切成小块放置于消毒好的PDA培养皿中，然后置于 25℃培养箱中恒温暗培养7d，直至长出黄绿色菌丝即得生产母种，再用试管培养基斜面保存；

所述综合 PDA 斜面是由以下重量本分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂2%、磷酸二氢钾 0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水；

（2）固体培养：将燕麦斜面保存的珊瑚拟青霉菌株，取小块接在新鲜的燕麦固体斜面培养基上，然后置25 ℃的恒温培养箱中培养7 d，将该菌种放入－4 ℃的冰箱内冷冻保存待用；

所述斜面培养基制备方法为：称取燕麦40 g煮沸 30 min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂棒6 g，使琼脂完全溶解，再加入葡萄糖20 g 、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、枸缘酸铵0.2g、橘汁25g，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面；

（3）液体培养：从燕麦固体培养基上挑选棒状菌丝接种与种子培养液中，置25℃控温摇床和150 r·min^-1的转速下培养3 d；

所述种子培养液是由以下重量百分比的原料组成：蔗糖3%、葡萄糖3%、酵母膏2%、蛋白胨1%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.1%、琼脂2%、余量为蒸馏水，PH值5.0--5.5；

所述珊瑚拟青霉提取物为菌丝提取液或发酵原液；

所述菌丝浸液采用以下方法制备而成：发酵后的菌丝干燥后粉碎，取10克，加100ml蒸馏水，制成10%的混悬液，即得菌丝浸液；

效果实施例

（一）对正常小鼠血糖影响

将12小时禁食不禁水小鼠分为3组，生理盐水（NS）组，发酵液组、菌丝浸液组，每组16只，按照0.2ml/10g ig给药1次，对照组灌胃等体积NS。分别于给药后3小时、6小时分别自眼静脉丛取血，用葡萄糖氧化酶法，在取血后2小时内测定血糖值；

对正常小鼠血糖的影响珊瑚拟青霉对正常小鼠的血糖基本无影响，与NS组

相比较，给药3小时后，无显著性差异。结果见表1

表1 珊瑚拟青霉提取物对正常小鼠血糖含量的影响

（二）对小鼠葡萄糖性高血糖的影响

将小鼠随机分成5组：生理盐水（NS）组、高血糖模型组、100mg/kg优降糖组，发酵液组、菌丝浸液组，每组12只，各组均按0.2ml/10g 进行灌胃，每天一次，连续5天，NS组灌胃等体积的NS。末次给药前各组动物均禁食不禁水12小时，末次给药后1小时，除NS组腹腔注射等体积的生理NS外，其余各组按0.2ml/10g的剂量腹腔注射10%葡萄糖溶液，30分钟后摘眼球取血测血糖值。

对小鼠葡萄糖性高血糖的影响 给药组与模型组比较，均有一定的降血糖作用，有明显差异（P＜0.05）。结果见表2

表2 珊瑚拟青霉提取物对葡萄糖性高血压小鼠血糖含量的影响

与模型组比较，** P<0.01。

（三）对小鼠肾上腺素性高血糖的影响小鼠随机分组，每组12只，给药与“2.2”项下相同，仅末次给药前，各组动物禁食不禁水12小时，末次给药后1小时，除NS组静脉注射等体积的NS外，其余各组均按0.2ml/10g 静脉注射盐酸肾上腺素注射液240 μg/kg,30分钟后摘眼球取血测定血糖值。

对小鼠肾上腺素性高血糖的影响 给药组与模型组比较，其对血糖作用均有显著性差异（P＜0.01）。结果见表3。

表3 珊瑚拟青霉提取物对肾上腺素性高血糖小鼠血糖含量的影响

与模型组比较，^＃＃P<0.01。

（四）对小鼠四氧嘧啶性糖尿病的影响将禁食16小时的小鼠，腹腔注射四氧嘧啶的生理盐水溶液200mg/kg,72小时后眼底静脉丛取血测定其血糖，选取造模小鼠血糖≥10mmol/L的小鼠56只，随机分为4组，即糖尿病模型组100mg/kg优降糖组、发酵液组、菌丝浸液组、除糖尿病模型组灌胃等体积的NS外，其余各组按0.2ml/10g灌胃给药，每天一次，连续14天，于第14天眼底静脉丛取血，测定12小时禁食不禁水后小鼠血糖值。

对小鼠四氧嘧啶性糖尿病的影响 珊瑚拟青霉提取物均能降低小鼠四氧嘧啶性血糖，与模型组对照，给药前后，发酵液组差异明显（P＜0.05），优降糖、菌丝浸液组均有显著性差异（P＜0.01）。结果见表4。

表4 珊瑚拟青霉提取物对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血糖含量的影响

与模型组比较，^△P<0.05；^△△P<0.01

上述所有数据均采用表示，采用t检验进行统计学处理。

实验证明：珊瑚拟青霉发酵液和菌粉浸液对正常小鼠血糖水平无明显作用，即不干扰正常的糖代谢过程；珊瑚拟青霉发酵液和菌粉浸液对外源性葡萄糖所致高血糖小鼠血糖水平均有一定降低作用；对肾上腺素所致高血糖小鼠血糖水平具有明显的降低作用；且能降低四氧嘧啶性高血糖小鼠血糖的含量，与模型组对照，菌丝浸液与优降糖组一样，均有显著性差异。珊瑚拟青霉是一种具有开发潜力的抗糖尿病药物。

Claims (6)

1.一种珊瑚拟青霉提取物在抗糖尿病中的应用，其特征在于，所述提取物是由保藏号为CGMCC14129的珊瑚拟青霉经液体培养、固体发酵培养后，菌丝体经过分离后干燥、提取而成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述珊瑚拟青霉具体培养过程如下：

（1）制作母种 ：将第二年不能正常发芽的君迁子种子用75%酒精消毒2-3次，再切成小块放置于消毒好的PDA培养皿中，然后置于 25℃培养箱中恒温暗培养7d，直至长出黄绿色菌丝即得生产母种，再用试管培养基斜面保存；

（2）固体培养：将燕麦斜面保存的珊瑚拟青霉菌株，取小块接在新鲜的燕麦固体斜面培养基上，然后置25 ℃ 的恒温培养箱中培养7 d，将该菌种放入－4 ℃的冰箱内冷冻保存待用；

（3）液体培养：从燕麦固体培养基上挑选棒状菌丝接种与种子培养液中，置25℃控温摇床和150 r·min^-1的转速下培养3 d。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述PDA培养皿中的PDA斜面培养基是由以下重量百分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂 2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述燕麦固体斜面培养基制备方法为：称取燕麦40 g煮沸 30 min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂棒6 g，使琼脂完全溶解，再加入葡萄糖20 g 、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、枸缘酸铵0.2g、橘汁25g，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述种子培养液是由以下重量百分比的原料组成：蔗糖3%、葡萄糖3%、酵母膏2%、蛋白胨1%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.1%、琼脂2%、余量为蒸馏水，PH值5.0-5.5。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述珊瑚拟青霉提取物为菌丝提取液或发酵原液；

所述菌丝浸液采用以下方法制备而成：发酵后的菌丝干燥后粉碎，取10克，加100ml蒸馏水，制成10%的混悬液，即得菌丝浸液；

所述发酵原液为液体发酵后，过滤出的滤液原液，即得。