CN103141300B

CN103141300B - 粗毛韧革菌发酵液和倍半萜及其应用

Info

Publication number: CN103141300B
Application number: CN201310060203.5A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 王永生
Original assignee: BEIJING LYUKE TIANCHENG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Anhui Bio Technology Co ltd
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: CN103141300A

Abstract

本发明公开了通过粗毛韧革菌液体发酵生产的粗毛韧革菌发酵液和倍半萜及其应用，具体的说本发明涉及通过粗毛韧革菌液体培养获取倍半萜生产工艺流程，以及该倍半萜的降血糖功效。经过反复试验研究发现应用该生产工艺生产的培养液含有倍半萜，经口服途径给予高血糖小鼠可显著降低其血糖和果糖胺，因此证实含有倍半萜的粗毛韧革菌培养液具有制备降低血糖保健饮品及药物的用途。本发明的培养液为桔黄色至黄褐色液体，培养液中倍半萜含量为0.4～4.0mg/mL。本发明不仅为深度开发利用粗毛韧革菌打开了一条崭新的途径，而且为控制血糖提供理想的中药。

Description

粗毛韧革菌发酵液和倍半萜及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及通过粗毛韧革菌培养生产含倍半萜的粗毛韧革菌培养液的方法，由该方法获得的粗毛韧革菌培养液或倍半萜粗品，以及含有该发酵液或倍半萜粗品的药物组合物和/或保健品具有预防和/或治疗糖尿病的药物，特别是其具有降血糖功效，因此所述的粗毛韧革菌培养液或倍半萜粗品可以用于制备降低血糖的保健品和/或药物，使其为降低血糖提供理想药物。

背景技术

糖尿病是目前中老年人的常见病和多发病，由糖尿病引起的并发症严重危及人类的生命健康。现有西药类降糖药物难免有副作用，而天然中药类降糖药物大多数降糖不明显，同时受物种资源的限制。而以药用真菌液体培养生产降糖药物则没有上述缺点。

粗毛韧革菌，是金耳的共生菌，与金耳菌种共同形成金耳子实体，并生长与海拔1900-3300米的栎树和桦树树干上。民间对金耳的认识和药用有着非常悠久的历史，早在明朝时期，著名的药物学家李时珍在他的《本草纲目》中详细记载了金耳。如“其金色者(当指金耳)治癖饮积聚，服痛金苍”。另外，《中国药用真菌》、《中国中药大典宗旨》、《云南食用菌》对金耳的药用价值均有详细介绍。金耳性温寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，调气，平阴阳；临床上治神经衰弱，肺热，哮喘，慢性支气管炎，高血压，肝炎等疾病。

近代科学研究证明金耳子实体用水煮成粘稠状后加白糖，制成的制剂可以治疗“肺热”、感冒、咳嗽、哮喘和高血压。近年来对金耳的研究表明其能产生多种生物活性物质。Kiho等发现腹腔注射金耳子实体水溶性多糖和醇溶多糖对正常小鼠，链脲霉素诱导的糖尿病小鼠以及基因缺陷型糖尿病小鼠均具降血糖作用。毛述永等发现口服云南金耳子实体水溶性多糖对四氧嘧啶糖尿病模型大鼠具有显著降血糖作用。目前由于对金耳野生资源的过度利用已经对该资源形成了很大的威胁。而传统人工栽培方式周期长，需要数月才能形成一代子实体。长期的栽培过程造成了子实体成分特别是那些生物活性物质不稳定，使得从子实体中提取活性成分缺少商业可行性。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种以粗毛韧革菌为原料进行液体深层培养的方法，以及由该发酵方法制备的粗毛韧革菌深层培养液，或称粗毛韧革菌培养液，该培养液中含有倍半萜类化合物。

本发明所使用的粗毛韧革菌菌种为市售的任意一种粗毛韧革菌菌种，也可选用自行从野生金耳中分离得到的菌种。该菌属于真菌门，伞菌纲，非褶菌目(也叫多孔菌目)，革菌科，学名Stereumhirsutum(Willd)Pers。不形成或很难形成子实体，菌丝体遇氢氧化钾溶液变暗或变黑。生殖菌丝疏松地交织在一起，分枝，有锁状联合，近无色。

本发明含有倍半萜的粗毛韧革菌深层培养液的培养工艺包括以粗毛韧革菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有倍半萜的粗毛韧革菌深层发酵液。

具体的，在本发明所述的摇瓶培养工艺中，其摇瓶培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，其中所述的摇瓶培养的培养条件是：装液量为60～150mL/250mL，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

在本发明所述种子罐培养工艺中，所述种子罐培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，大豆油0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；其中所述种子罐培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；

在本发明所述的发酵工艺中，所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖20～80，玉米粉10～40，麸皮5～30，蛋白胨3～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，CaCO₃0～10，大豆油0.2～5，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；其中所述发酵罐培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。

按照该发酵工艺，其中在进行摇瓶发酵培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的土豆培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时；其中所述的土豆培养基的组成和所用可参见诸葛健和王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367。

由本发明的方法获得的粗毛韧革菌发酵液为淡黄色到棕色的、有一定粘度的粘稠液体，其中含有菌丝体残渣形成的沉淀，该发酵液中倍半萜类化合物的含量可达0.4～4.0mg/mL。

本发明的另一目的是提供了一种以粗毛韧革菌为原料通过液体深层发酵生产倍半萜的方法，用树脂吸附本发明所描述的粗毛韧革菌的培养液，吸附后树脂经过水洗、解析、浓缩和冻干等提取步骤，得到倍半萜粗品。

具体的，本发明制备倍半萜的方法包括以下步骤：

(1)将用本发明所描述的方法生产的含有倍半萜的粗毛韧革菌培养液的酸度调节至pH1.0～3.0，3000rpm离心30分钟获得上清液；

(2)上清液用非极性大孔树脂吸附，每分钟流量为柱体积的(0.5～2)/20，所述大孔树脂的用量为发酵液体积的1/40；

(3)吸附结束后柱用大量水冲洗至无色后，用20～60％乙醇溶液洗脱；洗脱机体积大约是20-40个床体积；

(4)洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥后得到倍半萜粗品。

本发明所得到的粗毛韧革菌发酵液中倍半萜类化合物的含量可达0.3～2mg/mL；应用本发明上述制备倍半萜的方法，倍半萜的总收率可达0.5～2克/升发酵液。所得到的倍半萜粗品中倍半萜类化合物的含量可达18-34％。

本发明粗毛韧革菌深层发酵生产倍半萜的方法中，如果需要进一步分离提纯其中所含有的倍半萜化合物，可按照常规方法，例如重结晶、制备液相色谱等对上述倍半萜粗品进行分离提纯。

本发明的又一目的是提供了所述发酵液和倍半萜产品在药物和保健品制备中的应用。其中所述的药品和保健品具有降低血糖的功能。可用于制备预防和/或治疗糖尿病的药物和/或保健品。

本发明的药物组合物可按照医药领域的常规方法，使用常规的药用载体制成适于应用的常规剂型，例如可以是液体或固体的剂型，优选适于口服的剂型，例如片剂、胶囊、含片、口服液等。

本发明的方法所制备的发酵液或倍半萜的降血降脂功能，可通过下面的药剂实验证明：选取空腹小鼠，以无菌的pH4.6柠檬酸缓冲液配制的4％的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按体重160mg/kg剂量一次性腹腔注射造型，120小时后，选择血糖值大于13mmol/L的小鼠随机分为5组，每组12只，组间差异小于0.5mmol/L，设阳性对照组(I，生理盐水)、阳性药物组(二甲双胍，剂量120mg/kg体重)；粗毛韧革菌倍半萜粗品治疗低、中、高三种剂量组(分别为III、IV、V组，剂量分别以40、80、160mg/kg体重，均采用灌胃给药。

上述试验给药15d后，粗毛韧革菌倍半萜组与对照组相比，治疗组血糖与果糖胺指标均极显著降低(pH＜0.01)，可见粗毛韧革菌倍半萜15d即能显著降低高血糖小鼠血糖。因此证实了粗毛韧革菌发酵液和倍半萜具有制备具有降血糖功能的保健品和/或药品的用途。应用本发明的粗毛韧革菌培养方法，可以大规模或工业化生产粗毛韧革菌培养液，以及生产倍半萜类化合物和含有该混合物的药物组合物。由于该药物组合物中所含有的粗毛韧革菌培养液或由该培养液制备的倍半萜来源于天然菌种的培养，因此没有任何毒副作用，从而为糖尿病患者提供了理想的药物，并为粗毛韧革菌的应用开创了广阔的前景。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述的实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：粗毛韧革菌发酵液和倍半萜粗品的制备

1、用新配置的土豆培养基斜面(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)转接粗毛韧革菌菌种，培养温度27℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共84瓶)，于22℃、90转/分钟摇床培养24小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，起始pH值为5.0。

2、将上述培养的菌种5000mL接入装有45L种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为50L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速度90转/分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间90小时。其中种子罐中的种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，大豆油0.5，起始pH值为5.0。

3、将50L种子罐菌种接入装有600L发酵液培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为650L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速度90转/分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间150小时，其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉10，麸皮5，蛋白胨3，KH₂PO₄1，MgSO₄1，CaCO₃0，大豆油0.5，起始pH值为5.0。

经上述步骤后得到粗毛韧革菌发酵液，该发酵液为桔黄色，具有香味，倍半萜含量0.4mg/mL(测定方法见实施例4)。

4、将得到的发酵液的酸度调节至pH3.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂AB-8吸附，每分钟的流量为1/20柱体积，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用20％乙醇溶液洗脱，洗脱后经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品，倍半萜粗品总收率为0.3克/升发酵液。该粗品为淡黄色粉末，溶于40％甲醇和乙醇的水溶液、热水、吡啶、碱性溶液，热水溶解后振荡产生较为持久的泡沫。

实验例2：粗毛韧革菌发酵液和倍半萜粗品的制备

1、用新配置的土豆培养基斜面(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)转接粗毛韧革菌菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有90mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共40瓶)，25℃、120转/分钟摇床培养36小时。

2、将上述培养的菌种4000mL接入装有50L种子培养基的100L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为54L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速度120转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，培养时间90小时。

3、将30L种子罐菌种接入装有300L发酵液培养基的500L发酵罐中，发酵罐中，发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速度120转/分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间120小时，得到粗毛韧革菌培养液。

上述步骤使用的各种培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，起始pH值为6.5。

种子罐培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，大豆油0.1，起始pH值为6.5。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉25，麸皮20，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，CaCO₃1，大豆油0.1，起始pH值为6.5。

经上述步骤后得到粗毛韧革菌发酵液，该发酵液为桔黄色，具有香味，倍半萜含量2mg/mL(测定方法见实施例5)。

4、将得到的发酵液的酸度调节至pH2.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂AB-8吸附，每分钟的流量为1.5/20柱体积，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用50％乙醇溶液洗脱，洗脱后经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品，倍半萜粗品总收率为1克/升发酵液。该粗品为淡黄色粉末，溶于40％甲醇和乙醇的水溶液、热水、吡啶、碱性溶液，热水溶解后振荡产生较为持久的泡沫。

实施例3：粗毛韧革菌发酵液和倍半萜粗品的制备

1、用新配置的土豆培养基斜面(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)转接粗毛韧革菌菌种，培养温度30℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有150mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共10瓶)，30℃、150转每分钟摇床培养46小时。

2、将此液体摇瓶培养的菌种3000mL接入装有50L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为31.5L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速度150转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。

3、将15L一级种子菌种接入装有320L发酵液培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为335L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速度150转每分钟，通风量1∶01v/v/m，发酵时间180小时，得到粗毛韧革菌发酵液。该培养液，倍半萜含量为4.0mg/mL。

上述步骤使用的各种培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，起始pH值为8.0。

种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，大豆油0.8，起始pH值为8.0。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖80，玉米粉40，麸皮30，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，CaCO₃10，大豆油0.8，起始pH值为8.0。

4、将上述发酵液的酸度调节至pH1.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂AB-8吸附，每分钟的流量为2/20柱体积，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用60％乙醇溶液洗脱，洗脱后经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量类似于实施例3的倍半萜粗品。最终获得的倍半萜组合物的总收率为2克/升(测定方法见实施例4)。该粗品为黄色粉末，溶于40％甲醇和乙醇的水溶液、热水、吡啶、碱性溶液，热水溶解后振荡产生较为持久的泡沫。

实施例4：倍半萜粗品的测定

将实施例1、2和3得到的倍半萜粗品溶于分别无水乙醇溶液：配制100μg/mL香草醛溶液100mL，分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1mL置于试管中，补充无水乙醇至1mL，分别加入0.2mL碱性羟胺溶液混合，反应5min后，各加入3mol/LHCl溶液0.2mL，6％FeCl₃溶液0.1mL，摇匀，用70％乙醇定容至7.0mL，摇匀后，用1cm比色皿以未加碱性羟胺的样品溶液为参比溶液，于514nm波长处测定吸光度值。根据吸光光度值和香草醛浓度关系绘制标准曲线，求出香草醛浓度与吸光光度值关系公式。量取10mL发酵液蒸发干燥后用10mL酒精溶解，或者称取10mg的粗毛韧革菌培养液的粗提物溶解于10mL酒精，过滤，吸取1mL滤液两份，一份加入0.2mL碱性羟胺溶液混合；另一份以水代替羟胺溶液作为空白。反应5min后，各加入3mol/LHCl溶液0.2mL，6％FeCl₃溶液0.1mL，摇匀，用70％乙醇定容至7.0mL，摇匀后，用1cm比色皿以未加碱性羟胺的样品溶液为参比溶液，于514nm波长处测定吸光度值。根据上述求出的香草醛浓度与吸光光度值关系公式，计算培养液中倍半萜的含量(以香草醛计)，其中倍半萜主要活性成分见表1：

表1：粗毛韧革菌发酵液中倍半萜主要成分的分子量及气质联用分析保留时间

保留时间*	名称	分子量	含量
				18.60	新丁值香烯(Neoclovene)	204	3.04～4.02
19.85	石竹烯(caryophyllene)	204	1.59～2.63
				20.61	去氢白菖烯(calamenene)	204	1.72～2.36
21.85	榄香烯(elemene)	204	2.01～2.56
				23.44	Humalene	204	1.86～2.45
24.35，24.43	蛇床烯(Selinene)	204	4.55～6.78
				27.43，28.42	八氢四甲基萘甲醇(Rosifoliol)	204	8.16～11.03

*：气质联用分析图谱保留时间，分析方法为：取10ml样品溶液置于15ml顶空瓶中，将老化后的100μmPDMS萃取头插入样品瓶的顶空部分，于50℃吸附60min，吸附后的萃取头取出后直接插入气相色谱进样口，于250℃解析3min，同时启动仪器采集数据。

实施例5

将实施例1、2和3所得的发酵液于3000转/分钟离心，获得上清液，上清液浓缩3倍后得到浓缩物，该浓缩物为棕色的粘稠的液体。该浓缩物装入特制的瓶中，每瓶15毫升，经封盖、巴氏灭菌。根据需要，该保健品可每天服用一瓶或早晚各服一瓶，100人临床诊断为糖尿病的患者按此剂量服用，83人血糖显著降低，17人无明显作用。

实施例6粗毛韧革菌发酵液的倍半萜组合物降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖试验

倍半萜类组合物样品由实施例3制备获得。

实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为21-26g，由中科院上海实验动物中心提供。糖尿病小鼠模型制备；雄性小鼠禁食24小时后，腹腔注射160ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值＞13mmol/L为实验性糖尿病型鼠。

实验模型鼠按血糖水平随机分组，分为一个模型对照组(I：无菌生理盐水)、一个阳性药物组(II：二甲双胍，给药剂量120mg/kg)和3个试验组(分别给予实施例2、3和4制得的倍半萜粗品，给药剂量为80mg/kg)，每组12只，按照标准分别灌胃给药。连续给予受试物30天，每隔10天测定空腹血糖值。

结果显示：给予三个实施例制得的粗毛韧革菌倍半萜粗品小鼠的血糖值从第10天起均显著低于对照组的血糖值(p＜0.05)。这显示粗毛韧革菌倍半萜粗品具有降低血糖的作用(p＜0.05)。(测定均采用南京建成生物科技有限公司生产的血糖试剂盒)。粗毛韧革菌发酵液及其倍半萜粗品提取物可以用于制备降血糖和降血脂的药物。

与现有降血糖降血脂药物的药效比较，表明粗毛韧革菌培养液及倍半萜提取物药效快，降血糖效果明显。由于本身是一种纯中药制剂，并且原有“调气、平肝阳”等作用，因此粗毛韧革菌发酵液及倍半萜提取物服用后有益无害。本发明不仅为深度开发利用粗毛韧革菌打开了一条崭新的途径，而且为降低血糖提供了新的理想中药，将带来良好的经济效益和社会效益。

表2粗毛韧革菌倍半萜降血糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖值的影响(mmol/L)

注：时间的单位为天；*：表示与阳性对照组(I)比较，血糖值存在显著差异(p＜0.05)

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种粗毛韧革菌发酵液，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：以粗毛韧革菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有倍半萜的粗毛韧革菌发酵液；

所述的液体摇瓶培养中，其摇瓶培养基组成为：葡萄糖5～40克/升，玉米粉5～25克/升，蛋白胨1～20克/升，KH₂PO₄1～6克/升，MgSO₄1～4克/升，起始pH值为5.0～8.0，培养条件是：装液量为60～150mL/250mL，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

所述一级种子培养中，所述一级种子培养的培养基组成为：葡萄糖5～40克/升，玉米粉5～25克/升，蛋白胨1～10克/升，KH₂PO₄1～6克/升，MgSO₄1～4克/升，大豆油0.1～0.8克/升，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：接种量为5～10％体积比，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；

所述的发酵培养中，所述发酵培养的培养基组成为：葡萄糖20～80克/升，玉米粉10～40克/升，麸皮5～30克/升，蛋白胨3～10克/升，KH₂PO₄1～6克/升，MgSO₄1～4克/升，CaCO₃0～10克/升，大豆油0.2～5克/升，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：接种量为5～10％体积比，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。

2.根据权利要求1所述的粗毛韧革菌发酵液，其特征在于，在进行摇瓶培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的土豆培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时。

3.根据权利要求1或2所述的粗毛韧革菌发酵液生产倍半萜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述的粗毛韧革菌发酵液的酸度调节至pH1.0～3.0，3000rpm离心30分钟获得上清液；

(2)上清液用非极性大孔树脂吸附，每分钟流量为柱体积的1/40～1/10，所述大孔树脂的用量为发酵液体积的1/40；

(3)吸附结束后柱用大量水冲洗至无色后，用20～60％乙醇溶液洗脱；洗脱机体积为20～40个床体积；

(4)洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥后得到倍半萜粗品。

4.权利要求1或2所述粗毛韧革菌发酵液在制备药物和保健品中的应用，所述的药物和保健品具有降低血糖的功能。