CN101225361A - 通过金耳液体发酵生产的金耳发酵液或倍半萜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及金耳发酵液中倍半萜生产工艺流程，以及金耳产生的倍半萜的降血糖功效。本发明申请人经试验研究发现应用该生产工艺生产的发酵液及倍半萜经口服途径给予高血糖小鼠可显著降低其血糖和果糖胺，因此证实金耳发酵液和倍半萜具有制备降低血糖保健饮品及药物的用途。本发明的发酵液为桔黄色至黄褐色液体，发酵液及5mg/mL的倍半萜对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达72－90％。本发明不仅为深度开发利用金耳打开了一条崭新的途径，而且为降低血糖提供理想的中药。

Description

通过金耳液体发酵生产的金耳发酵液或倍半萜

技术领域

本发明涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及通过金耳发酵生产金耳发酵液或倍半萜的方法，由该方法获得的金耳发酵液或倍半萜粗品，以及含有该发酵液或倍半萜粗品的药物组合物中和/或保健品。所述的金耳发酵液或倍半萜粗品具有多种药物功能，可用于制备预防和/或治疗糖尿病、心脑血管疾病或支气管炎的药物，特别是其具有降血糖功效，使其成为降低血糖提供理想药物。

背景技术

糖尿病是目前中老年人的常见病和多发病，由糖尿病引起的并发症严重危及人们的生命健康。现有西药类降糖药物难免有副作用，而天然中药类降糖药物大多数降糖不明显，同时受物种资源的限制。而以药用真菌发酵生产降糖药物则没有上述缺点。

蛋白质非酶糖基化是指葡萄糖、果糖、乙二醛和丙二醛与蛋白质的游离氨基酸进行的一系列非酶促反应，它是糖尿病患者体内的一种非正常的生理生化反应，最终形成糖基化末端产物(advanced glycationend-products，AGEs)，造成蛋白质结构改变、功能降低和老化，引起糖尿病慢性并发症。而糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残和死亡的主要原因。因此，对非酶糖基化反应(AGEs)的抑制率可作为糖尿病治疗效果的指示参数之一。

金耳，又名黄金银耳、黄木耳、金木耳、黄耳、脑耳、胶耳，是一种稀有野生名贵食用菌和药用菌。生长在海拔1900-3300米。该菌在分类学上，属于真菌门，担子菌纲，异隔担子菌亚纲银耳目，银耳科，银耳属的一种真菌，学名Tremella aurantialbavb，生长在壳斗科植物腐木上。

民间对金耳的认识和药用有着非常悠久的历史.早在明朝时期，著名的药物学家李时珍在他的《本草纲目》中详细记载金耳。如“其金色者(当指金耳)治癖饮积聚，服痛金苍”。另外，《中国药用真菌》、《中国中药大典宗旨》、《云南食用菌》对金耳的药用价值均有详细介绍。金耳性温寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，调气，平肝阳；临床上治神经衰弱，肺热，哮喘，慢性支气管炎，高血压，肝炎等疾病。

由于金耳生长在高海拔地区，不易人工栽培，资源受到限制因此金耳的液体深层发酵，具有十分广阔的应用前景。

近年来国内外对金耳的研究主要集中于它的驯化栽培、营养成分分析以及多糖及药效等方面，对于金耳的液体培养国内也有研究和报道。由于金耳的医疗功效，一些学者从培养基、培养条件和多糖等营养因子对金耳进行了深入的研究，但未见有关次生代谢物报道以及倍半萜类化合物的报道。

对于金耳的多糖的降血糖降血脂功能，日本kiho等(Biol Pharm Bull，2001，24，1400-3)和华东师范大学瞿伟菁(营养学报.2004，26，300-303.)等人进行了菌丝体内多糖降血糖作用的研究，证明了其多糖可开发成预防和治疗糖尿病的保健品和(或)药品的可能性；熊耀康(浙江中医学院学报.2000，24，71-72；浙江中医学院学报.1999，23，50-51)报道复方金耳能提高气管平滑肌的松弛百分率，对气管平滑肌有松弛作用，并能延长药物引喘的潜伏期，故复方金耳具有较强的平喘作用。同时他们证明复方金耳可提高机体免疫功能和较强的止咳作用。李秀花杨莉莉等(山西医科大学学报.2000，31，206-207)通过实验提出金耳浓缩液有明显提高小鼠非特异性免疫作用，并且呈现剂量依赖性关系。

刘春卉(天然产物的研究与开发.2003，15，289-292.)报道金耳菌丝发酵产物能明显对抗小鼠体内血栓形成，高剂量对脑组织缺血其过氧化脂质的分解产物丙二醛含量明显增多有显著抑制作用，能明显抑制ADP诱导的血小板聚集，对动物凝血酶原的作用时间有延长作用，给药5分钟后能明显增加动物脑膜血流量，因而金耳菌丝发酵产物对动物血栓形成有较好的抑制作用。

萜类化合物在自然界中广泛存在，包括高等植物、真菌、微生物、昆虫以及海洋生物，均有萜类成分存在。萜类化合物是中草药中一类比较重要的化合物，已经发现很多萜类化合物是中草药的有效成分。其中倍半萜烯类对各种菌类、病原型病毒有防御性能，而且在植物体内具有防御虫害功效，如从向日葵和艾蒿中提取的倍半萜烯内酯和棉子酚具有抗菌、抗病毒功效。相关的研究表明对倍半萜对遗传型糖尿病小鼠的尿糖有显着的抑制作用，能增强糖尿病人使用肌松药琥珀酰胆碱所致的神经肌肉阻断作用，对于糖尿病神经系统并发症的治疗有积极的意义。同时它们也是一类重要的天然香料，是化妆品工业和食品工业不可缺少的原料。

本发明人经过深入的研究摸索出一种将金耳大规模深层发酵获得金耳发酵液的方法，该方法不同于以往的金耳液体深层发酵法在于培养的目标不同，以往都是以多糖为目标，而本发明以倍半萜类化合物为目标，并进一步由该发酵液生产倍半萜粗品、倍半萜类化合物的方法，和由本发明的方法获得的金耳发酵液、倍半萜粗品或倍半萜类化合物，含有所述发酵液和倍半萜类粗品的药物和/或保健品。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种以金耳为原料进行液体深层发酵的方法，以及由该发酵方法制备的金耳深层发酵液，或称金耳发酵液，该发酵液中含有倍半萜类化合物。

本发明所使用的金耳菌种可选用任意一种金耳菌种，例如云南、西藏或山西的野生金耳经组织分离得到的菌种。组织分离方法在多种教科书和论文中均有表述，这里不再详细列出(例如上海市农业科学院编，《食用菌栽培手册》，第12～13页，食用菌杂志编辑部出版社，1981年)。

本发明含有倍半萜的金耳深层发酵液的发酵工艺包括以金耳为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有倍半萜的金耳深层发酵液。

具体的，在本发明所述的发酵工艺中，所述的摇瓶发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄3～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0。所述的摇瓶发酵培养的培养条件是：培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时。

在本发明所述的发酵工艺中，所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)为：葡萄糖25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0。其中所述扩大培养的培养条件是：培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～36小时。

在本发明所述的发酵工艺中，所述的一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄3～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0。所述一级种子培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时。

在本发明所述的发酵工艺中，所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：含大量纤维素物质粉末25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，CaCO₃0.5～1，消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0。所述一级种子培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。

在本发明所述的发酵工艺中，在进行摇瓶发酵培养之前，首先将金耳的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～48小时；其中所述的斜面培养基是现有技术中常用的斜面培养基，例如常用的是PDA培养基，此类培养基的组成和所用可参见诸葛健和王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367。

更具体地，本发明以金耳为原料进行深层发酵的发酵工艺包括以下步骤：

(1)将金耳的斜面菌种接入新配制的PDA培养基(参见诸葛健和王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中，培养温度22～30℃，培养时间24～48小时；

(2)将步骤1的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，于22～30℃进行培养，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

(3)将步骤2得到的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有摇瓶扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～36小时；

(4)将步骤(3)得到的扩大培养的菌种按5～10％的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中进行培养，温度22～30℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；和

(5)将上述种子罐中的菌种按5～10％的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，温度22～30℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～125转/分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养时间120～180小时；得到金耳的深层发酵液。

由本发明的方法获得的金耳发酵液为淡黄色到棕色的、有一定粘度的粘稠液体，其中含有菌丝体残渣形成的沉淀，该发酵液中倍半萜类化合物的含量可达2.5～4.2克/升。经试验证明，该发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可以达到72-90％。

在本发明的发酵工艺中，上述各发酵步骤的培养基使用比为：所述摇瓶培养基与三角瓶容积之比可以是3∶10左右；所述扩大培养基与三角瓶容积之比可以是3∶10左右；所述一级种子培养基的使用比为当本发明上述的一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L；所述发酵培养基的使用比为当本发明上述的发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L。

在本发明的金耳深层发酵工艺中，所述发酵培养工艺适于在500L～2000L的发酵罐中进行。结合本领域的基本知识还可以进一步根据生产需要扩大发酵规模，以进行工业化规模的生产。

本发明的另一目的是提供了一种以金耳为原料通过液体深层发酵生产倍半萜的工艺，其特征是将上述通过金耳液体深层发酵得到的发酵液进行树脂吸附提纯等后处理得到倍半萜粗品。

其中所述的树脂吸附提纯等后处理工艺包括将由本发明上述发酵工艺步骤获得的含有倍半萜的金耳深层发酵液离心，所得到的上清液树脂吸附，然后经过洗脱、浓缩和冷冻干燥，得到倍半萜粗品。其中所述的树脂优选是大孔树脂，特别是非极性大孔树脂，例如AB-8。其中洗脱步骤所使用的洗脱液是乙醇的水溶液，优选含有20～60％乙醇的水溶液。

具体的，本发明制备倍半萜的方法包括以下步骤：

(1)用本发明上述金耳深层发酵法制备得到金耳深层发酵液；

(2)将上述步骤得到的金耳深层发酵液的酸度调节至酸性，优选pH1.0～3.0，离心，离心速度大约是3000rpm，离心时间大约30分钟；

(3)得到的上清液用非极性大孔树脂吸附，每分钟流量为柱体积的(0.5～2)/20，所述大孔树脂的用量为发酵液体积的1/40；

(4)吸附结束后柱用大量水冲洗至无色后，用20～60％乙醇溶液洗脱；洗脱剂体积大约是20-40个床体积；

(5)真空浓缩上一步骤获得的洗脱液，所得到的浓缩液经冷冻干燥后得到倍半萜粗品。

本发明所得到的金耳发酵液中倍半萜类化合物的含量可达2.5～4.2克/升；应用本发明上述制备倍半萜的方法，倍半萜的总收率可达0.5～2克/升发酵液。所得到的倍半萜粗品中倍半萜类化合物的含量可达18-34％。(这是一个结果而非条件，是否不用加优选)

利用气质联用色谱分析金耳发酵液中倍半萜成分，结果显示主要化合物分子式为：C₁₅H₂₄，其中又以下列化合物为主：

^*：气质联用分析图谱保留时间，分析方法为：取10ml样品溶液置于15ml顶空瓶中，将老化后的100umPDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于50℃吸附40min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸3min，同时启动仪器采集数据。

本发明金耳深层发酵生产倍半萜的工艺中，所述发酵培养工艺适于如果需要进一步分离提纯其中所含的倍半萜化合物，可按照常规方法，例如重结晶、制备液相色谱等对上述倍半萜粗品进行分离提纯。

经试验证明，应用本发明上述制备倍半萜的方法制备得到的5mg/mL倍半萜粗品对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达72-90％，因此具有降低血糖的功能。

蛋白质非酶糖基化是指葡萄糖、果糖、乙二醛和丙二醛与蛋白质的游离氨基酸进行的一系列非酶促反应，它是糖尿病患者体内的一种非正常的生理生化反应，最终形成糖基化末端产物(advanced glycationend-products，AGEs)，造成蛋白质结构改变、功能降低和老化，引起糖尿病慢性并发症。而糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残和死亡的主要原因。因此，对非酶糖基化反应(AGEs)的抑制率可作为糖尿病治疗效果的指示参数之一。

本发明的又一目的是提供了所述发酵液和倍半萜产品在药物和保健品制备中的应用。其中所述的药品和保健品具有降血糖降血脂功能。

本发明的又一目的是提供了用本发明的方法制备得到的金耳发酵液或倍半萜产品在制备预防和/或治疗糖尿病、心脑血管疾病或支气管炎的药物和/或保健品中的应用。

本发明的又一目的是提供了用于预防和/或治疗糖尿病、心脑血管疾病或支气管炎的药物组合物，该组合物中含有用本发明的方法制备得到的金耳发酵液或倍半萜产品，以及常规的药用载体。其中以该组合物的总重量计，所述组合物中倍半萜的含量为45％～70％。该药物组合物中还可含有预防和/或治疗糖尿病、心脑血管疾病或支气管炎的其它活性成分。

本发明的药物组合物可按照制药领域的常规方法，使用常规的药用载体制成适于应用的常规剂型，例如可以是液体或固体的剂型，优选适于口服的剂型，例如片剂、胶囊、含片、口服液等。

本发明的又一目的是提供了一种保健品，其中含有用本发明的方法制备得到的金耳发酵液或倍半萜产品。所述的保健品具有降低血糖和降低血脂的功能。所述保健品中用本发明的方法制备得到的金耳发酵液或倍半萜产品的含量低于上述药物组合物中的含量，本领域技术人员根据常识很容易确定其含量，例如其含量可根据用途有所区别，例如用于辅助治疗时，剂量可稍大；用于养生或增强营养时，剂量可稍低。

按照本领域的常规方法，可将所述的保健品制成适于应用的形式，例如液体或固体的形式，或将其加入饮食品之中。例如可将其制成适于口服的片剂、胶囊、含片、口服液等，也可以制成含有用本发明的方法制备得到的金耳发酵液或倍半萜产品的食品如蛋糕或饼干，优选饮料。

本发明的方法所制备的发酵液或倍半萜的降血糖降血脂功能，可通过下面的药效试验证明：

选取空腹血糖水平在3.5～6.3mmol/L范围的正常雄性昆明小鼠，以柠檬酸缓冲液(pH  4.6)灭菌后配制的4％的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按体重140mg/kg剂量一次性腹腔注射造型，72小时后，选择血糖值大于10mmol/L的小鼠随机分为5组，每组12只，组间差异小于0.5mmol/L，设阳性对照(I)(二甲双胍)灌胃给予生理盐水；阳性药物剂量120mg/kg体重；金耳倍半萜粗品治疗低、中、高三种剂量组(分别为III、IV、V组)，分别以20、40、80mg/kg体重灌胃。

上述试验给药7d后，金耳倍半萜组与对照组相比，治疗组血糖均极显著降低(p＜0.01)，可见金耳倍半萜7d即能显著降低高血糖小鼠血糖。

本发明人经试验研究发现应用本发明的发酵方法生产的发酵液及倍半萜经口服途径给予高血糖小鼠可显著降低其血糖和果糖胺，因此证实了金耳发酵液和倍半萜具有制备具有降血糖功能的保健饮品和/或药品的用途。应用本发明的金耳深层发酵方法，可以大规模或工业化生产金耳发酵液，以及生产其次生产品倍半萜类化合物和含有该混合物的药物组合物。由于该药物组合物中所含的金耳发酵液或由该发酵液制备的倍半萜来源于天然菌种的发酵，因此没有任何毒副作用，从而为糖尿病患者提供了理想的药物，并为金耳的应用开创了广阔的前景。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：金耳菌种的组织分离

取云南野生金耳新鲜未开伞的子实体，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75％乙醇进行子实体表面消毒后，移人超净工作台，紫外灯照射20min。将解剖刀在酒精灯火焰上灼烧后放人无菌水中降温，确保解剖刀温度不会损伤子实体组织。将子实体一分为二，在菌柄内(或柄中)、菌柄与菌盖交界处、菌盖和菌褶处切割表皮内组织，黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表面组织。用无菌镊子接人试管斜面培养基(即为PDA培养基)，每种组织各接10支，25-28℃暗培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至4-7天时，用PDA培养基试管斜面转接。

实施例2金耳发酵液的制备

1、在新配制的土豆培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的金耳菌种，培养温度27℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于27℃、150转/分钟摇床培养24小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄ 1，起始pH值为6.3。

2、将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入11mL摇瓶种子，于27℃、150转/分钟摇床培养24小时。其中所述扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄1，起始pH值为6.3。

3、将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉8，KH₂PO₄3，MgSO₄1，消泡剂0.35，起始pH值为6.3。

4、将48.5L一级种子菌种接入装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为648.5L。维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间144小时。其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉10，麸皮10，黄豆饼粉8，KH₂PO₄2，MgSO₄1，CaCO₃1，，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。

经上述步骤后得到金耳发酵液，该发酵液的发酵液菌丝体经水洗、烘干，得干菌丝体，重为18Kg，该发酵液桔黄色，具有香味，对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达72％(测定方法见实施例3)。

实施例3倍半萜粗品的制备

将实施例2得到的发酵液的酸度调节至pH1.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂吸附AB-8吸附，流速为1/20柱体积/min，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用20％乙醇溶液洗脱，洗脱液经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品。该粗品为黄色或淡黄色粉末，溶于40％甲醇和乙醇的水溶液、热水、吡啶、碱性溶液，热水溶解后振摇产生较为持久的泡沫。其组成为：

最终获得的倍半萜类组合物的干重为2.8克/升，浓度为5mg/mL倍半萜对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达84％。

发酵液和倍半萜粗品对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法如下：

取100ml发酵液，离心(3000r/min)20分钟，上清液或由上清液进一步获得的倍半萜类组合物用于测定对非酶糖基化反应抑制率。

1]体外非酶糖基化系统

将BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、己二醛(12mg/mL)和NaN3(叠氮化钠)(2mg/mL)溶于pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸缓冲液)中。

2]体外非酶糖基化发酵液干预实验

取1ml上述PBS溶液，干预组加入1ml发酵液或粗品溶液、以加1ml蒸馏水的未干预组为空白，震荡混匀，37℃避光孵育15天，而后定容至10ml待测。

3]AGEs的测定及抑制率的计算

采用Hitachi Fluorescence Spectrophotometer 650-60型荧光分光光度计测定荧光强度，测定时激发波长选择370nm，狭缝5nm，发射波长选择440nm，狭缝6nm。

发酵液对非酶糖基化反应的抑制作用以抑制率表示。抑制率根据下列公式计算：

实施例4金耳发酵液和倍半萜粗品的制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的金耳菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120转每分钟摇床培养36小时。

2、将此摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，25℃、120转每分钟摇床培养36小时。

3、将此扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。

4、将30L一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间180小时，得到金耳发酵液。该发酵液为金耳保健饮品，菌丝体干重0.63Kg，该发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率为81％。

上述步骤使用的各种培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄1，起始pH值为6.3。

扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄1，起始pH值为5.8。

一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉8，KH₂PO₄3，MgSO₄1，消泡剂0.35，起始pH值为5.8。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉10，麸皮15，黄豆饼粉8，KH₂PO₄2，MgSO₄1，CaCO₃1，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。

5、将实施例2得到的发酵液的酸度调节至pH 2.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂AB-8吸附吸附，每分钟的流量为1/20柱体积，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用50％乙醇溶液洗脱，洗脱液经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量类似于实施例3的倍半萜粗品。

最终获得的倍半萜类组合物的干重为4.2克/升，浓度为5mg/mL倍半萜对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达86％。

发酵液和倍半萜粗品对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例3。

实施例5金耳发酵液和倍半萜粗品的制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的金耳菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120转每分钟摇床培养36小时。

2、将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，25℃、120转每分钟摇床培养36小时。

3、将上述扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。

4、将30L上述一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间180小时。得到发酵液，该发酵液为金耳保健饮品，菌丝体干重7.35Kg，该发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率为81％。

上述各步骤使用的培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄1，起始pH值为6.3。

扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉5，KH₂PO₄3，MgSO₄1，起始pH值为5.8。

一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉8，KH₂PO₄3，MgSO₄1，消泡剂0.35，起始pH值为5.8。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：含大量纤维素物质粉末50，玉米粉10，麸皮15，黄豆饼粉8，KH₂PO₄2，MgSO₄1，CaCO₃1，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。

5、将上述发酵液调节至pH2.0，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂AB-8吸附，每分钟的流量为1/20柱体积，吸附结束后柱用大量水冲洗至无色后，用50％乙醇溶液解析，解析液经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量类似于实施例3的倍半萜粗品。

最终获得的倍半萜类组合物的干重为3.9克/升，浓度为5mg/mL倍半萜对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达90％。

发酵液和倍半萜粗品对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例2。

实施6含金耳倍半萜组合物的制备

按下述配比(质量百分比)配制组合物：

倍半萜粗品90％；

微晶纤维素6％；

胶体二氧化硅2％；和

硬酯酸镁2％。

制备方法：将实施例3获得的倍半萜粗品和药用辅料以上述比例混合，得到倍半萜组合物，然后按照常规技术制成片剂。

实施7含金耳发酵液保健品的制备

将实施例2所得到的发酵液于3000转/分钟离心，获得的上清液，将所得到的上清液浓缩3倍后得到浓缩物，该浓缩物为棕色的粘稠的液体。将该浓缩物装入特制的瓶中，每瓶15毫升，之后封盖，巴氏灭菌。根据需要，该保健品可每天服用一瓶或每天早晚各服用一瓶。

实施例8

金耳发酵液的倍半萜类组合物降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖试验

倍半萜类组合物样品由实施例6制备获得。

实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为21-26g，由中科院上海实验动物中心提供。糖尿病小鼠模型制备：雄性小鼠禁食24小时后，腹腔注射160-200ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值＞10mmol/l为实验性糖尿病模型鼠。

实验模型鼠按禁食3-5小时的血糖水平随机分组，分为一个模型对照组和3个试验组，试验组分三个给药剂量(低剂量组剂量为20mg/kg，中剂量组剂量为40mg/kg，高剂量组剂量为80mg/kg)和阳性药物(二甲双胍，给药剂量120mg/kg)试验组按照剂量标准分别灌胃，对照组灌以自来水。连续给予受试物30天，测空腹血糖值。

结果显示：中剂量组及高剂量组血糖值显著低于与对照组的血糖值(P＜0.05或P＜0.01)，低剂量组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。糖耐量试验结果证明：低剂量组、中剂量组及高剂量组与对照组有差异显著性(P＜0.05或P＜0.01)，这显示金耳粗提物具有降低血糖的作用。各组血糖曲线下面积有显著差异(P＜0.05)，中剂量组及高剂量组与对照组有差异显著性(P＜0.01)。该结果表明金耳发酵液粗提物显著提高四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠的糖耐量。试验结果表明在降低血糖提高糖耐量同时，金耳粗提物能够增加试验小鼠体重。

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.生产含有倍半萜的金耳发酵液的发酵工艺，其特征在于以金耳为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有倍半萜的金耳深层发酵液。

2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述的摇瓶发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄3～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0，其中所述的摇瓶发酵培养的培养条件是：培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时。

3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)为：葡萄糖25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；其中所述扩大培养的培养条件是：培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～36小时。

4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述的一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄3～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；其中所述一级种子培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时。

5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：含大量纤维素物质粉末25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，CaCO₃0.5～1，消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；其中所述一级种子培养的培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。

6.按照权利要求1所述的发酵工艺，其中在进行摇瓶发酵培养之前，首先将金耳的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～48小时；其中所述的斜面培养基是土豆培养基。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的发酵工艺，该发酵工艺包括以下步骤：

(1)将金耳的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中，培养温度22～30℃，培养时间24～48小时；

(2)将步骤1的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，于22～30℃进行培养，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

(3)将步骤2得到的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有摇瓶扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～36小时；

(4)将步骤(3)得到的扩大培养的菌种按5～10％的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中进行培养，温度22～30℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；和

(5)将上述种子罐中的菌种按5～10％的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，温度22～30℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～125转/分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养时间120～180小时；得到金耳的深层发酵液。

8.由权利要求1-6任意一项所述的发酵工艺得到的含有倍半萜的金耳发酵液；该发酵液为淡黄色到棕色的粘稠液体，该发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率在72％以上，优选体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达84％以上。

9.一种制备倍半萜的方法，该方法包括将权利要求8所述含有倍半萜的金耳深层发酵液离心，所得到的上清液树脂吸附，然后经过解析、浓缩和冷冻干燥，得到倍半萜粗品，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)将权利要求11-13任意一项所述含有倍半萜的金耳发酵液调节至pH1.0～3.0，离心；

(2)得到的上清液用非极性大孔树脂吸附，吸附结束后色谱柱用大量水冲洗至无色，然后用20～60％乙醇溶液解析；和

(3)真空浓缩上一步骤获得的解析液，所得到的浓缩液经冷冻干燥后得到倍半萜粗品；

用上述方法所得到的倍半萜的总收率可达0.5～2克/升发酵液；以及用该方法获得的倍半萜对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达84％以上。

10.用于预防和/或治疗糖尿病、心脑血管疾病或支气管炎的药物组合物，其特征在于该组合物中含有权利要求8的发酵液或权利要求9所述的方法制备的倍半萜作为活性成分。