KR20180081494A - 암의 표적화 치료를 위한 광역학 치료제의 합성 및 조성물 - Google Patents

암의 표적화 치료를 위한 광역학 치료제의 합성 및 조성물 Download PDF

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슈미스 에이 쿨라라트네
프라빈 가가레
캐리 에이치 메이어스
필립 에스 로우
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온 타겟 래보래토리스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명에는 영상-가이드된 수술 및 광역학 요법에 유용한 신규한 화합물이 기술되어 있다. 특히, 상기 화합물은 그 화합물이 병든 조직 상에서 발현되는 수용체를 표적화하는 리간드를 사용하여 병든 조직, 예컨대 암에 전달된 후 핵 또는 미토콘드리아에 표적화된 후, 수용체 매개된 세포내이입이 수행되며, 암 세포뿐 아니라 기타 질병에 대한 효과적인 활성을 제공할 수 있다. 그의 용도를 위한 방법 및 조성물도 기술되어 있다.

Description

암의 표적화 치료를 위한 광역학 치료제의 합성 및 조성물
관련 출원
본 특허 출원은 2015년 9월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/216,148호에 관한 것이며, 이를 우선권 주장으로 하며, 이 출원의 내용은 본 개시내용에 참조로 그 전문이 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 병든 세포, 예컨대 암 세포, 종양-관련 대식세포를 발현시키는 폴레이트 수용체의 치료 방법 및 본원에서의 용도를 위한 조성물 및 화합물에 관한 것이다. 본 개시내용은 종양의 치료를 위하여 표적화된 광역학 치료(PDT:photodynamic therapeutic)제를 사용하는 방법을 제공한다. PDT제는 미토콘드리아 또는 핵을 표적화시키도록 변형된 후, 리간드, 예컨대 폴산 또는 폴레이트에 접합될 수 있으며, 이는 병원성/병든 세포에서 과발현된 수용체, 예컨대 폴레이트 수용체를 표적화하여 적절한 링커를 경유한 화합물의 특이성 및 검출을 증가시켜 수용해도, 약물동태학적 특성 및 생체이용률 등을 개선시키며, PDT제를 병든 세포 내에 방출시켜 세포 내의 미토콘드리아 또는 핵으로 가이딩되어 유출 펌프[예, ATP 결합 카세트 패밀리(ABC 트랜스포터)] 등에 의한 약물 내성이 발생하는 것을 방지한다. 그의 용도를 수반한 접합된 화합물을 사용한 치료 방법도 고려된다.
암 치료는 가장 통상적으로는 수술, 방사선 요법, 호르몬 투여 및/또는 화학요법을 수반한다. 불행하게도, 이들 요법 중 어느 것도 전이성 질환에 대하여서는 크게 효과적이지 않다. 게다가, 이들 각각은 환자가 종종 이들 요법을 거부하기에 충분한 단점을 갖는다.
악성 질환의 수술적 제거는 암에 대한 1차 치료를 위한 가장 흔하며 효과적인 치료적 개입 중 하나를 구성한다. 검출 가능한 모든 악성 병변의 절제는 전체 암 환자의 약 50%에서 검출 불가한 질환의 재발을 초래하며, 암의 재발이 보이는 환자의 경우 기대 수명을 연장시킬 수 있거나 또는 이환률을 감소시킬 수 있다. 보다 정량적인 세포수 감소를 달성하기 위한 수술적 방법은 이제 더 철저한 검토를 받고 있다는 것은 놀랍지 않다.
암의 최적의 수술적 절제의 경우, 외과의가 전체 암 조직 및 림프절의 위치를 알아내고, 장기의 이웃하는 구조 및 나머지 기능을 크게 손상시키지 않으면서 암 및 림프절을 둘다 제거할 수 있는 것이 중요하다. 40%가 넘는 암 환자에서는 암 조직이 밝혀지지 않아서 절제 후조차 일부 암 세포가 환자에게 여전히 남아 있거나 또는 밝혀지더라도 절제할 수 없었던 것으로 추정된다. 그러한 "탈출한" 악성 세포는 확인하여 제거하지 않는다면 질환 재발의 심각한 우려 또는 심지어 사망을 초래한다. 전립선암에서, 원발성 종양은 전립선의 제거에 의하여 치료될 수 있다. 그러나, 근치 전립선절제술(전립선의 완전 제거)은 심각한 단점을 지니며, 비뇨기 제어 상실 및 발기부전을 초래할 수 있다.
또 다른 치료적 개입(intervention)은 방사선 요법을 단독으로 또는 병용 치료 요법의 일부로서 수반한다. 그러나, 방사선 요법은 제2의 유형의 암의 발생 위험성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면 방사선 요법을 사용한 전립선암의 치료는 결장암 및 방광암의 위험성을 증가시킬 수 있다. 침습성 또는 전이성 암의 치료는 종종 완화성 호르몬 요법 및/또는 화학요법으로 한정된다. 호르몬 치료가 호르몬 반응성 암의 완화를 유발하기는 하나, 종양 완화의 수명을 제한하며, 투여되는 약물과 관련된 간 손상을 포함한 상당한 독성, 심혈관 질환, 체중 증가 및 골다공증이 없는 것은 아니다.
화학요법이 또한 수명을 연장시킬 수는 있으나, 그러한 항유사분열성 약물의 부작용은 종종 그의 잇점보다 크다. 오늘날 대부분의 암 요법은 투여시 실질적으로 신체의 모든 세포에 무차별적으로 분배되어 악성 및 건강한 세포 둘다에 비슷하게 손상을 야기하는 세포독성 약물을 사용한 치료를 수반한다. 그러한 통상의 화학요법은 주로 빠르게 분열하는 세포를 죽이기 위하여 설계되었으므로, 이들은 또한 확산중인 건강한 세포를 파괴하여 골수억제, 점막염, 탈모, 구역/구토, 빈혈, 말초 신경병증 및 피로 등을 포함한 오프-타겟 독성을 초래한다. 명백하게, 병적 세포에 선택적으로 표적화되어 건강한 세포에 부수적인 손상을 방지할 수 있는 세포독성 요법은 암 치료에서 상당한 진보를 이루었다. 그러므로, 암 치료의 더 안전하며, 더 효력있는 방법에 대한 상당한 수요가 존재한다.
영상-가이드된 수술은 외과의가 더 정확하게 식별하고, 주위의 건강한 조직을 손상시키지 않으면서 악성 조직을 제거하는 것을 돕는 신생 기술이다. 영상-가이드된 수술 분야에서의 고유한 과제 중 하나는 암 조직에 대하여 특이적이며, 민감하며, 종양에 선택적으로 축적되어 종양을 식별하는 것을 돕는 조영제(프로브)의 개발이다. 이는 특히 일반적인 기술에 의하여 쉽게 식별될 수 없는 숨은 병변에 대하여 그러하다. FDA가 특정 암에 대한 영상-가이드된 수술에 사용하기 위한 비표적화된 근적외선(NIR)-염료인 인도시아닌 그린(ICG)을 승인하기는 하였으나, 종양 조직의 식별에서 민감성 및 특이성에 관하여 상당한 제한을 갖는 것으로 밝혀졌다.
개선된 종양 식별에 대한 요구에 의하여 동기부여되어 일부 본 발명자들은 폴레이트 수용체 양성 암에 대한 영상-가이드된 종양 수술에 사용하기 위한 신규한 고 친화성 폴레이트 수용체(FR)-표적화된 NIR 프로브(OTL38)를 이미 개발하였다. OTL38은 합성 및 저장 중에 매우 안정하며, GMP 제조에 대하여 소규모 합성의 용이성을 입증하며, 배양액 중에서 및 동물 모델에서 원발성 및 전이성 암 세포 둘다의 경우 FR-양성 암 세포에 대하여 특이성이 크며, 래트 및 개에서는 독성이 없다. 그러한 성공적인 임상전 데이타에 기초하여, OTL38은 2014년 1월에 네덜란드 레이덴에서 단계 1a 임상 시험 및 미국의 6개의 상이한 지역에서 단계 II로 난소암 및 폐암에 대하여 진입하였다. 본 연구에서, OTL38을 사용하지 않은 경우보다 약 5배 더 많은 악성 병변이 OTL38의 도움으로 제거되었다. 게다가, 모든 절제된 형광 병변은 병리학에 의하여 악성인 것으로 확인되었다. OTL38-가이드된 절제의 사용은 종양 세포의 약 95%를 제거할 수 있다. 그래서, 가능한 한 나머지 5%의 상기 암을 제거하는 방식으로 요법을 찾거나 또는 개선시키고자 하는 수요가 존재한다.
본 발명의 일부는 영상-가이드된 수술 이후에 또는 도중에 사용될 수 있는 OTL38(폴레이트-표적화된 NIR 염료) 및 폴레이트-표적화된 치료제의 칵테일을 사용하는 신규한 접근법을 확인하고자 한다. 그러나, 그러한 접근법의 하나의 단점은 OTL38 및 폴레이트-표적화된 치료제 둘다 동일한 폴레이트 수용체와 경쟁할 것이며, 수용체에 대하여 더 높은 친화성을 갖는 화합물은 기능을 좌우한다는 것이다. 예를 들면, OTL38이 폴레이트-표적화된 치료제보다 적은 친화도를 갖는 경우, 종양에서 형광이 더 적을 것이며, 외과의는 육안과 비교시 5배 더 많은 종양을 절제할 수 없을 수 있다. 다른 한편으로, 조영제는 수용체에 대하여 더 큰 친화도를 지녀서 치료제는 원하는 치료적 결과를 생성하는데 있어서 비효율적일 것이다. 그러므로, 2종의 화합물 사이의 정확한 비를 찾거나 또는 OTL38에 부합하도록 폴레이트-표적화된 치료제의 약물동태학적 특성을 조절하여야만 한다. 대안으로, 폴레이트-표적화된 치료제의 약물동태학적 특성을 OTL38과 구별하기 위하여 이를 조절하는 대신에, 영상-가이드된 수술을 위한 OTL38의 투여 및 치료를 위한 폴레이트-표적화된 치료제의 투여 사이의 시간은 변동될 수 있다. 추가의 대안에서, 영상-가이드된 수술뿐 아니라, 치료제의 목적 둘 다를 충족시킬 수 있는 치료 양식은 이상적인 상황이 될 것이다.
광역학 요법(PDT)은 영상-가이드된 수술뿐 아니라, 요법에 사용될 수 있는 신규한 혁신적인 기술이다. 치료 양식은 특정한 유형의 광원과 조합된 광민감제(PS)를 사용한다. 적절한 선량의 PS를 조사시 광역학 반응이 발생하여 반응성 산소종(ROS)을 생성한다. 그러한 ROS는 병든 세포, 예컨대 악성 세포, 염증성 세포 및 미생물 세포의 세포사 및 괴사를 유발한다. PDT는 암으로부터 노년기 황반 변성 및 항생제-내성 감염까지의 질환을 치료하는데 사용되어 왔다.
광민감제가 특정 파장의 광에 노출시 광으로부터 광자(에너지)를 흡수하여 기저 상태(단일항 상태)로부터 여기 상태(삼중항 상태)로 활성화된다. 그 후, 이는 비-방사성 붕괴를 통하여, 광자 발광에 의하여 및/또는 에너지 전달에 의하여와 같은 3가지 방식으로 그의 기저 상태로 이완된다. 광자를 방출하는 검출 가능한 결과는 형광이다. 에너지의 전환은 ROS를 생성하며, 궁극적으로는 광독성을 초래한다. 그러나, 이들 두 프로세스(형광 및 광독성) 사이의 비는 사용된 PS의 유형에 의존한다. 그러므로, 올바른 균형을 갖는 올바른 PS를 찾는 것은 영상-가이드된 수술뿐 아니라, 수술 도중 또는 이후의 요법 둘다에 대한 완벽한 후보로서 PDT에서의 그의 사용에 중요하다.
생성된 ROS의 유형에 의존하여, 발생될 수 있는 2가지 유형의 광역학 반응이 존재한다. 타입 I PDT: 우선, 활성화된 민감제는 기질, 예컨대 세포막 또는 분자와 직접 반응하여 전자를 끌어내어 초과산화물 음이온 라디칼(O2 -)을 형성하거나 또는 전자 또는 수소 원자를 전달하여 히드록실 라디칼(OH*) 및/또는 과산화물 라디칼(OOH*)을 형성하여 자유 라디칼을 형성할 수 있다. 그후, 그러한 라디칼은 산소와 상호작용하여 산소화된 생성물(1O2)을 생성한다.
타입 II PDT에서: 활성화된 민감제는 그의 에너지를 산소에 직접 전달하여 반응성이 큰 산소종인 단일항 산소(1O2)를 형성할 수 있다. 그러한 종은 다양한 기질을 산화시킨다.
PS를 활성화시킨 후, 타입 I 및 타입 II PDT 반응 둘다가 발생할 수 있으나, 그러한 프로세스 사이의 비는 사용된 PS의 타입, 기질의 농도, 조직내에 존재하는 산소의 양 및 기질 또는 조직 내에 국소화된 PS 분자의 개수에 의존한다.
그러므로, 병든 세포뿐 아니라, 병든 세포 내의 적절한 구획에 PS를 선택적으로 표적화하는 혁신적인 기술을 개발하여 질환을 없애고자 하는 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다. 게다가, PS는 존재하는 통상의 비표적화된 PDT제의 단점을 극복하여야 한다. 예를 들면 상기 분자는 높은 효능, 높은 특이성, 더 높은 수용해도, 건강한 세포에 대하여 부작용(특히 피부 독성)이 전혀 없거나 또는 최소로 있는 낮은 독성을 지녀야만 한다.
정상 조직에서의 폴레이트 수용체(FR)의 제한된 분배 및 각종 질환 세포에서의 더 높은 수용체 발현 레벨에 기초하여, 폴산(FA)은 FR+ 암 세포, 활성화된 대식세포 및 종양 관련 대식세포로의 치료제 및 조영제의 선택적 전달을 위한 매력적인 높은 친화도 리간드를 갖는다. 현재까지, FR의 4종의 이소형(FR-α, FR-β, FR-γ 및 FR-δ)이 식별되었으나, FR-α 및 FR-β만이 진단 및 치료 적용예에서의 용도에 대하여 적절한 개수로 발현된다. FR-α는 상피-유래 암에서 과발현되어 암, 예컨대 폐, 난소, 신장, 유방, 골수 및 뇌에서 높은 레벨로 발견된다. 반대로, FR-β는 휴지 또는 휴식 중인 대식세포 상에서가 아니라, 염증성 질환 상태와 관련된 활성화된 대식세포 및 종양-관련 대식세포 상에서 발현된다. 중요하게는, 대부분의 세포는 감소된 폴레이트 담체 또는 광자 커플링된 폴레이트 트랜스포터를 경유하여 그의 요구되는 FA(비타민 B9)를 축적하며, 이는 폴레이트 접합체를 수송할 수 없다. 특정한 유형의 세포 상에서의 FR 수용체의 그와 같은 선택적 과발현으로 인하여, 폴레이트-표적화된 99mTc 및 111In SPECT 조영제, 19F PET 조영제 및 NIR 광학 조영제(OTL38)는 병원에서 FR+ 암 및 염증성 병태의 검출을 위하여 개발되었다. 게다가, 폴레이트-표적화된 화학치료제도 또한 평가되고 있다.
본 개시내용은 적절한 링커를 통하여 병든 세포 상에 과발현된 수용체를 표적화하는 리간드에 접합되는 광역학 치료제의 합성 방법을 제공한다. 그러한 치료제는 종양 및 기타 악성 병변의 치료를 위한 광역학 요법에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 폴레이트 또는 프테로일 리간드, 아미노산, 링커, PDT제가 병든 세포 내에 존재하면 PDT제를 가이드하는 소기관 표적화 모이어티 및 광역학 치료제를 포함하는 화합물 또는 그의 염 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 약제는 높은 수용해도, 우수한 PK 성질 및 높은 PDT 효능을 갖는다. 방출성 링커는 병든 세포 내에서 소기관 표적화된 PDT제를 방출하여 소기관 표적화된 PDT제가 특정한 소기관으로 이동할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 연결기는 폴리에테르 화합물, 술폰산, 글리칸, 아미노산, 이성질체, 유도체 또는 그의 라세미 혼합물일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 방출성 링커는 디술피드 결합, 산 민감성 기, 효소 민감성 기 등을 함유한다. 기타 구체예에서, 소기관 표적화제는 미토콘드리아 또는 핵 표적화제이다. 또 다른 구체예에서, 광역학 치료제는 BPheid-a 접합체 및 비수다인(Visudyne) 접합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 개시내용은 표적화제를 사용한 광역학 치료제의 변형 방법을 제공하며, 여기서 표적화제는 핵 또는 미토콘드리아를 표적화할 수 있다. 본 발명의 화합물은 암의 치료에서 특히 유용할 수 있다는 점에 유의한다. 본 발명의 특히 바람직한 화합물은 화합물 9, 화합물 11a, 화합물 11b, 화합물 12b, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15, 화합물 26, 화합물 27, 화합물 41, 화합물 58a, 화합물 59a, 화합물 60a, 화합물 64, 화합물 65a, 화합물 65c, 화합물 76a, 화합물 76c, 화합물 88a, 화합물 89, 화합물 92a, 화합물 99, 화합물 100, 화합물 104, 화합물 112a, 화합물 112b, 화합물 116 및 화합물 117을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 화합물은 단독으로 또는 기타 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 사실상, BPheid-a보다 더 우수한 EC50 값을 갖는 본원에 기재된 임의의 화합물은 본 발명의 화합물에 대한 치료적, 진단적 또는 연구 화합물로서 유용한 것으로 입증될 수 있다. 전술한 화합물의 제조를 위한 방법 및 조성물은 본원의 하기 실시예에 상세하게 설명되어 있다.
본 개시내용의 몇몇 구체예에서, 연결기는 아미노산이다. 기타 구체예에서, 연결기는 폴리에테르, 술폰산 및 그의 유도체, 글리칸 및 그의 유도체 또는 아미노산 및 그의 유도체이다.
추가의 구체예에서, 본 개시내용은 폴레이트 리간드를 사용한 연결기의 접합 방법을 제공하며, 여기서 연결기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)이다.
본 개시내용은 연결기를 프테로일 리간드에 접합시키는 방법을 제공하며, 여기서 연결기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)이다.
추가의 구체예에서, 본 개시내용은 폴레이트 리간드를 사용한 연결기의 접합 방법을 제공하며, 여기서 연결기는 술폰산 또는 디술피드 화합물이다.
본 개시내용은 연결기를 프테로일 리간드에 접합시키는 방법을 제공하며, 여기서 연결기는 술폰산 또는 디술피드 화합물이다.
몇몇 구체예에서, 본 개시내용은 아미노산을 광역학 치료제에 접합시키는 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 티로신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 그의 이성질체 또는 유도체이며, 광역학 치료제로의 접합은 디술피드 결합을 통하여 이루어진다.
본 개시내용은 아미노산을 표적화제에 접합시키는 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 티로신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 그의 이성질체 또는 유도체이며, 표적화제로의 접합은 아민 결합을 통하여 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 본 개시내용은 아미노산을 표적화제에 접합시키는 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 티로신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 그의 이성질체 또는 유도체이며, 표적화제로의 접합은 디술피드 결합을 통하여 이루어진다.
추가의 구체예에서, 상기 화합물은 표적 수용체를 발현시키는 종양 세포로의 표적화에 대하여 선택성이 크다.
몇몇 구체예에서, 본 개시내용은 약 500 ㎚ 및 약 900 ㎚ 사이의 흡수 및 방출 최대치를 갖는 PDT제로의 아미노산 연결기의 접합에 관한 것이다. 기타 구체예에서, 아미노산 연결기는 약 600 ㎚ 및 약 800 ㎚ 사이의 흡수 및 방출 최대치를 갖는 PDT제에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 암에 대한 광역학 요법, 광화학요법, 광방사 요법, 광요법, 법의학 적용예, 미네랄 적용예, 치과, 겔 염색, DNA 서열화, 신경 염색 또는 성형 수술을 위한 폴레이트-표적화된 소기관 표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPheid-a 접합체의 용도에 관한 것이다.
특정한 구체예에서, 본 개시내용은 표적화된 종양 요법에 사용되는 화합물에 관한 것이며, 여기서 화합물은 연구, 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 기타 실시양태에서, 본 개시내용은 광역학 요법 화합물 및 약학적 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
기타 구체예에서, 본 개시내용은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 갖는 화합물에 관한 것이다:
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도 1은 비표적화된 PDT제의 구조를 도시한다(5, 6, 7은 이미 승인되었으며, 2 및 4는 임상 시험 중에 있다).
도 2는 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다[사람 자궁경부암 세포주인 HeLa(HeLa는 큰 수의 폴레이트 수용체를 가짐) 세포주의 유도체]. DMSO 중에 용해된 유리 약물을 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 내의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo)(프로메가(Promega))를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 3은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 반신(윗줄) 및 전신(아래줄) 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 BPheid-a(1)를 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 4a는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 BPheid-a(1)의 효과를 도시한다. 포스페이트 완충 염수, PBS(약물 담체) 중의 50 nmol의 BPheid-a를 주사한 후 3 시간(3 h)에 45 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
도 4b는 피하 KB 종양의 성장에 대한 PBS(약물 담체 또는 대조군)의 효과를 도시한다. PBS를 주사한 후 3 시간(3 h)에 65 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
도 5는 미토콘드리아 양으로 하전된 분자를 표적화하여 미토콘드리아를 표적화하는 변형된 BPheid-a의 구조를 도시한다.
도 6은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). DMSO 중에 용해된 유리 약물을 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 7은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 반신(윗줄) 및 전신(아래줄) 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 (14)를 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 8은 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 (14)의 효과를 도시한다. 50 nmol의 14를 주사한 후 3 시간(3 h)에 53 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
도 9는 핵-표적화된 PDT제의 구조를 도시한다.
도 10은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). DMSO 중에 용해된 유리 약물을 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 11은 베이스 약물을 생성하는 상이한 기전으로 방출성 링커를 갖는 폴레이트-표적화된 BPheid-a 접합체의 구조를 도시한다.
도 12는 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 13은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 65a를 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 14는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 65a의 효과를 도시한다. 50 nmol의 65a를 주사한 후 3 시간(3 h)에 53 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 종양 부피는 칼리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(13 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 15a는 피하 KB 종양의 성장에 대한 25 nmol 투여량의 65a의 효과를 도시한다. 25 nmol의 65a를 주사한 후 3 시간(3 h)에 28 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(4 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 15b는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 65c의 효과를 도시한다. 50 nmol의 65c를 주사한 후 3 시간(3 h)에 37 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(3 일) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 16은 상이한 가용성 링커를 갖는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPheid-a 접합체의 구조를 도시한다.
도 17은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 18은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 76a 및 76c를 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 19는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 76a의 효과를 도시한다. 50 nmol의 76a를 주사한 후 3 시간(3 h)에 26 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(3 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 20은 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 76b의 효과를 도시한다. 50 nmol의 76b를 주사한 후 3 시간(3 h)에, 26 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(3 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 21은 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 76c의 효과를 도시한다. 76c를 주사한 후 3 시간(3 h)에 28 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터링하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(4 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 22는 상이한 가용성 링커를 갖는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 비수다인 접합체의 구조를 도시한다.
도 23은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 24는 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 80 또는 86을 주사하며, IVIS 영상화기 (ex=640 ㎚, em=720 ㎚, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 25는 양으로 하전된 PDT 유사체를 암 세포의 내부에서 생성하는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPheid-a 접합체의 구조를 도시한다.
도 26은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 27은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 시간 의존성 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 89a를 주사하며, 상이한 시간 간격에서 89a의 투여 후 2 h에서 IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 영상이다.
도 28은 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 89의 효과를 도시한다. 89를 주사한 후 3 시간(3 h)에 26 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(4 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 29는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 92의 효과를 도시한다. 92를 주사한 후 3 시간(3 h)에 26 ㎣ 종양을 갖는 마우스에게 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(4 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 30은 쯔비터이온성 PDT 유사체를 암 세포 내에서 생성하는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPhied-a 접합체의 구조를 도시한다.
도 31은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트-약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포 생존은 생존율을 사용하여 정량화하고, 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 32는 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 100을 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 33은 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 99의 효과를 도시한다. 99를 주사한 후 3 시간(3 h)에 61 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(2 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 34는 피하 KB 종양의 성장에 대한 50 nmol 투여량의 100의 효과를 도시한다. 100을 주사한 후 3 시간(3 h)에 122 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양은 모니터링한 시간(2 주) 동안 재발 없이 완전히 치유되었다.
도 35는 음이온성 PDT(음으로 하전된) 유사체를 암 세포 내에서 생성하는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPheid-a 및 비수다인 접합체의 구조를 도시한다.
도 36은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 37은 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 104를 주사하며, IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 상이한 시간 간격에서의 영상이다.
도 38은 피하 KB 종양의 성장에 대한 104의 효과를 도시한다. 50 nmol의 104를 주사한 후 3 시간(3 h)에 81 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
도 39는 피하 KB 종양의 성장에 대한 104의 효과를 도시한다. 25 nmol의 104를 주사한 후 3 시간(3 h)에 23 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
도 40은 음이온성 PDT(음으로 하전된) 화합물을 암 세포 내에서 생성하는 폴레이트-표적화된 방출성 디술피드 연결된 BPheid-a 접합체의 구조를 도시한다.
도 41은 KB 세포의 생존에 대한 약물 농도의 효과를 도시한다(HeLa 세포 및 HeLa 세포주의 유도체는 사람 자궁경부암 세포주이다). 무-폴레이트 RPMI 중에 용해된 폴레이트 약물 접합체를 제시된 농도로 무-폴레이트 RPMI 배양 배지 중의 KB 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 세정하고, 새로운 배지(약물 없음)로 대체하였다. 그 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존은 생존율을 사용하여 정량화하고, 셀 타이터 글로(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n=3).
도 42는 역치를 조절한 후 백색광 영상 위의 전신 형광 영상의 오버레이를 도시한다. KB 종양을 지닌 마우스에게 10 nmol의 112a를 주사하고, 112a의 투여 후 IVIS 영상화기(ex=745 ㎚, em=ICG, 노출 시간=1s)를 사용한 2 h에서의 영상이다.
도 43은 피하 KB 종양의 성장에 대한 117의 효과를 도시한다. 25 nmol의 117를 주사한 후 3 시간(3 h)에 20 ㎣ 종양을 갖는 마우스를 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 종양의 성장을 모니터하고(영상을 촬영함), 칼리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
본 발명은 폴레이트 수용체(FR)-양성 암, 종양-관련 대식세포 및 골수양-유래 억제인자 세포에 대하여 세포 배양액 및 동물 모델 둘다 중에서 높은 수용해도와 더 우수한 PK 성질 및 높은 PDT 효능을 갖는 폴레이트-표적화된-소기관(미토콘드리아 또는 핵)-표적화된-PDT제에 관한 것이다. 상기 화합물은 건강한 조직에 대하여 독성이 없거나 또는 최소한의 독성을 가지며, 검출 가능한 부작용이 없다. 게다가, 상기 분자는 높은 형광을 지니며, 투여 1 시간 이내에 종양 내에 국소화된다. 형광은 기타 조직 내에서는 관찰되지 않아서 매우 높은 종양-대-배경(신호-대-잡음) 비를 초래한다. 그러므로, 상기 분자는 영상화 FR 양성 질환, 영상-가이드된 수술 및 광역학 요법에 사용될 수 있다.
수술은 모든 고형 종양, 예컨대 전립선암, 난소암, 폐암, 유방암, 결장암 및 췌장암에 대한 최선의 요법 중 하나이다. 수술은 미국에서 고형 종양 환자의 50%에서는 효과적인 한편, 화학- 및 방사선요법 단독은 전체 암 환자의 5% 미만에서만 효과적이다. 미국에서 매년 700,000명 이상의 환자는 암 수술을 받으며, 수술 환자의 40%는 5년 이내에 국소구역 질환이 재발된다. 지난 십년에 걸쳐 종양학 분야에의 주요한 발전에도 불구하고, 해당 분야에서 극복하여야 할 상당한 장애물이 남아 있다. 예를 들면, 음성 변연(negative margins)을 갖는 원발성 종양의 완전 절제, 전이성 암 세포를 지닌 림프절의 제거, 위성 질환의 확인을 달성하는 것은 곤란한 것으로 남아 있다. 그러한 3종의 사례에서 개선을 달성하는 것은 질환 청소를 개선시킬 뿐 아니라, 수술 후 화학요법 및 방사선에 관한 결정을 안내한다.
영상 가이드된 수술 이외에, 본 발명은 PDT에 대하여 효과적인 특이성 PS 분자를 제공한다. 종양학에서의 용도의 경우, PDT가 종양의 파괴에 기여하는 3종의 주요 기전이 존재한다. 첫째, PDT에 의하여 생성된 ROS는 악성 세포를 직접 파괴할 수 있다. 둘째, PDT는 또한 종양-관련 혈관구조를 파괴하여 종양으로의 혈류를 억제하여 종양 경색을 초래할 수 있다. 마지막으로, PDT는 면역 세포를 종양 세포에 대하여 다시 보내며, 종양 세포에 대한 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 3종의 기전 모두의 조합은 질환의 장기간 치유를 생성하는 역할을 할 수 있다.
그러므로, 세포내 국소화에 사용되도록 하는 정확한 PDT 성질을 갖는 유용한 PS의 설계 및/또는 개발이 중요하다. PS는 형광 및 광독성 사이의 우수한 비, 타입 I 및 타입 II ROS 생성 사이의 우수한 비, 병든 세포에 대한 높은 선택성 및 특이성 및, 병든 세포 내에서의 미토콘드리아 또는 핵과 같은 정확한 세포내 국소화를 지녀야 한다. 게다가, 소규모 및 대규모 모두에서의 용이한 합성, 합성 및 저장 중의 안정성, 낮은 가격의 출발 물질의 입수 가능성, 수용해도, 비독성 기타 조직을 제외한 병든 세포의 효과적인 축소, 장기간 안전성도 또한 PS를 설계하기 전 고려하여야 하는 중요한 요인 및 특징이 된다.
청색광은 조직을 통하여 가장 적게 효율적으로 침투되는 반면, 적색 및 적외선 방사선은 더 깊게 침투된다(1-1.5 ㎝). 600 및 1,200 ㎚ 사이의 광 파장은 종종 조직의 광학창으로 불리운다. 그러나, 약 800 ㎚ 이하의 광만이 단일항 산소(1O2)를 생성하는데 충분한 에너지를 갖는데, 이는 더 긴 파장이 광역학 반응을 개시하기에는 불충분한 에너지를 갖기 때문이다. 그러므로, 700-800 ㎚ 사이의 PS 여기 파장은 조직에 대한 광학창에 적절할 뿐 아니라, 광역학 반응을 개시하기에 적절한 파장을 갖기 때문에 바람직하다.
광원의 선택은 PS의 흡수(형광 여기 및 작용 스펙트럼), 질환(위치, 병변의 크기, 접근 가능성 및 조직 특징), 비용 및 크기에 기초하여야 한다. PDT의 임상적 효능은 복잡한 선량측정: 총 광 선량, 광 노출 시간, 광 전달 방식(단일 대 분할된 또는 심지어 메트로놈식) 및 플루언스율에 의존할 것이다.
레이저 및 백열 광원 둘다는 PDT에 사용되어 왔으며, 유사한 효율을 나타낸다. 크고, 비효율적인 펌핑되는 염료 레이저에 비하여, 다이오드 레이저는 더 작으며, 비용 효율성이 더 크며, 설치가 단순하다. 이들은 또한 더 긴 작동 수명과 함께 자동화된 선량측정 및 보정 특징을 갖는다. 발광 다이오드(LED)는 상대적으로 좁은 스펙트럼 주파수폭 및 높은 플루언스율을 갖는 대안의 광원이다. 레이저는 확산 끝을 갖는 섬유와 커플링되어 종양을 최소 침습적 방법으로 치료할 수 있다. 내부가 강한 광 산란 물질로 도포되고, 기관에 끼워지도록 형성되는 팽창 가능한 풍선도 또한 시판되고 있다. 그래서, 광원을 체내 깊숙한 고형 기관에 영상 가이드 접근 하에서 주입하는 것이 가능하다.
PS, 광원 및 치료 파라미터의 최적의 조합의 선택은 성공적인 PDT에 대하여 중요하다. 생성된 광손상 및 세포독성의 정도는 또한 다인성이며, PS의 유형, 그의 세포외(체내분포) 및 세포내 국소화(소기관), 투여된 총 투여량, 총 광 노출(에너지 및 시간의 양), 광 플루언스율, 산소 이용 가능성 및, 약물의 투여 및 광 노출 사이의 시간에 의존한다.
종양학에서, 이상적인 PS는 공지의 화학 조성을 갖는 순수한 형태로의 이용 가능성, 높은 단일항 산소 양자 수율(ΦΔ), 가시 스펙트럼(700-800 ㎚)의 NIR 영역에서의 강한 흡수, 높은 소광 계수(εmax=50,000-100,000 M-1㎝-1), 낮은 광 표백, 종양 조직 내의 효율적인 축적 및, 광민감제 및 그의 대사물 둘 다에 대한 낮은 암 독성의 보유, 순환 중인 및 조직액 중의 안정성 및 용해도, 주사 또는 기타 방법에 의한 질환 조직 부위로의 용이한 전달을 포함한 여러 특징을 지녀야 하며, 치료 완료시 신체로부터 쉽게 배설되어야만 하며, 인체 사용에 요구되는 대량을 위한 제조에 대한 용이하게 확장 가능한 합성을 지녀야만 한다.
다수의 광민감제는 문헌에 보고되어 있으며, 대부분은 포르피린, 엽록소 및 염료(주로 근적외선 염료)의 유형에 속한다. 포르피린 및 엽록소는 더 긴 파장(750-850 ㎚)에서 더 큰 흡수, 높은 단일 산소 양자 수율, 낮은 광 표백 및, 영상-가이드된 요법에 대한 완벽한 후보물질인 포르피린계 PS를 생성하는 자연 형광을 갖는다.
여러 광민감제, 예컨대 포토프린(Photofrin), 비수다인, 포스칸(Foscan), 알루메라(Allumera), 레불란(Levulan), 메트빅스(Metvix), 헥스빅스(Hexvix), 시스뷰(Cysview) 및 레이저피린(Laserphyrin)은 임상적 용도를 위하여 상업적 입수가 가능하다. 일부 광민감제, 예컨대 투캐드(Tookad), 안트린(Antrin), 포토클로르(Photochlor), 포토센스(Photosens), 포트렉스(Photrex), 루마칸(Lumacan), 세비라(Cevira), 비소낙(Visonac), BF-200, ALA, 암피넥스(Amphinex) 및 아자디피로메텐(Azadipyrromethenes)은 임상 시험 또는 임상전 개발의 다양한 단계에서 발견된다.
PDT의 효율성에도 불구하고, 통상의 비표적화된 광민감제는 많은 단점을 갖는다. 그러한 비표적화된 광민감제는 소수성이 크며, 매우 불량한 수용해도를 갖는다. 그러므로, 형성제(formulating agent), 예컨대 크레모포르(Cremophor), 트윈(Tween) 20 등은 환자에게 투여전 사용되어 왔다. 그러나, 상기 형성제는 사람에게 독성이 있는 것으로 주지되어 있다. 게다가, 투여 가능한 제제로의 제제화 이후에도, PS는 더 긴 소요(lead) 시간으로 종양 또는 병든 부위에 국소화되는 데는 24 시간이 소요될 것이다. 게다가, 불량한 수용해도로 인하여, 종양 또는 병든 조직 내에서의 약물의 생체이용율은 매우 낮아서 약물을 덜 효율적이게 한다. 이전에 이용 가능한 PS의 비표적화된 성질로 인하여, 이들은 비특이성이 크며, 건강한 조직에 축적된다. 게다가, 내부 기관, 예컨대 간에 대한 암(dark) 독성을 피할 수 있으면서(의사가 질환 조직에 빛을 비출 것이므로), 피부 흡수에서의 광독성은 잘 확립되어 있다(연장된 일광 민감성). 그러므로, 통상의 PDT를 받는 환자는 심지어 일광으로부터의 광 노출을 피하여야만 하며, 장기간 동안 어두운 환경에 있어야 한다. 다른 한편으로, PS의 건강한 조직으로의 축적은 비-PDT 관련된 독성을 초래할 뿐 아니라, 건강한 세포에 대한 면역 반응의 활성화로 인한 심각한 부작용을 야기한다. 그러므로, 병든 세포에 대하여 특이성이며, 이에 대하여 표적화된 신규한 PS 약제에 대한 수요가 존재한다.
본 발명자들은 5종의 시판 중인 PS를 평가하였으며, 이들은 수불용성이며, 암 세포 중에서 덜 효과적이며, 누드 마우스에서 매우 높은 피부 흡수를 가지며, 종양 이종이식을 지닌 마우스의 종양에서 축적되는데 24 시간이 소요되었으며, 매우 낮은 형광을 지니며(아마도 종양에서의 PS 분자의 축적 부족으로 인함), 마우스에서의 종양 이종이식으로부터 제거될 수 없었다는 것을 발견하였다. 그래서, 종양 조직에 및/또는 종양 세포 중의 소기관에 표적화되어 개선된 종양-표적화 접근에 대한 수요가 존재한다.
세포(세포내 구획, 예컨대 미토콘드리아 또는 핵) 또는 소기관-표적화된 PS 내에서의 PS 국소화의 위치는 PDT 중의 PS에 대한 중요한 특징이 된다. 약물 전달에서 가장 중요한 소기관 2종은 미토콘드리아 및 핵이다. 미토콘드리아는 세포의 동력실(powerhouse)이며, 아폽토시스 및 세포사의 핵심 조절체이다. 핵은 유전자 물질을 지니며, 세포의 주요한 생물학적 활성을 제어한다.
치료적 접근에서의 미토콘드리아의 표적화는 이들 소기관의 표적화가 세포 대사 활성의 정지를 초래할 수 있으므로, PDT에서의 핵심 요인으로서 인지되어 왔다. 미토콘드리아는 대부분의 세포의 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 공급을 생성하며, 이는 화학적 에너지의 공급원으로서 사용된다. 미토콘드리아는 또한 매우 높은 함유량의 산소를 갖는다. 산화성 인산화 및 대사 이외에, 미토콘드리아는 세포사, 신생물, 세포 분화, 선천적 면역계, 산소 및 저산소증 및 칼슘 대사에서 중요한 역할을 한다.
PS를 미토콘드리아에 전달하는 방식에는 다수가 존재한다. 첫번째는 미토콘드리아내에서 선택적으로 축적되는 PS를 개발하는 것이다. 두번째는 미토콘드리아 내의 표적에 선택적으로 결합하는 분자에 PS를 접합시키는 것이다. 세번째는 막 전위를 사용하며, PS를 양전하 분자에 접합시킬 수 있으며, 그러한 방식으로 미토콘드리아 내의 커다란 음전위에 의하여 미토콘드리아로 PS가 몰리게 된다.
친유성 양이온 및 미토콘드리아-표적화된 펩티드 둘다는 약물 및 생활성 분자를 미토콘드리아에 표적화시키도록 개발되어 왔다. 친유성 양이온, 예컨대 트리페닐포스포늄(TPP) 유도체는 커다란 미토콘드리아 막 전위에 의하여 생체내에서 몰리게 된 미토콘드리아에 의하여 신속하게, 광범위하게 흡수된다. 그러한 전략의 사용은 미토콘드리아 내에서 더 높은 농도의 표적화된 화합물을 초래하여 효능을 증가시키며, 사용되는 화합물의 투여량을 감소시킬 수 있으며, 불활성화, 배설 또는 독성 부작용을 초래할 수 있는 미토콘드리아외 대사를 최소화할 수 있다. 게다가, 그러한 접근은 다양한 이유(예, 소수성)로 인하여 미토콘드리아에 의하여 불량하게 흡수되는 분자가 생체내에서 미토콘드리아로 보내질 수 있게 한다. 그러나, 친유성 양이온 및 미토콘드리아-표적화된 펩티드를 사용하는데 있어서의 주요한 제한은 이들이 기관-특이적이지 않으며, 화합물은 일반적으로 높은 미토콘드리아 함유량을 갖는 조직에서 선택적으로 축적되어 오프(off)-표적화된 독성을 초래한다는 점이다.
상기 발견에 기초하여, 본 발명자들은 미토콘드리아 내의 표적에 선택적으로 결합하는 분자로의 접합에 의하여 또는 (미토콘드리아의 음전위의 잇점을 이용하여) 양으로 하전된 분자로의 접합에 의하여 미토콘드리아-표적화된 PS의 라이브러리를 설계 및 개발하였다. 본 발명자들은 본 발명의 대부분의 미토콘드리아-표적화된 PS가 병원에서 현재 입수 가능한 PS에 비하여 매우 활성적이라는 것을 발견하였다. 본원에서 확인된 PS 분자는 배양액 중의 암 세포를 (시험관내) 약화시킬 수 있었다. 그러나, PS 분자는 종양 특이성이 아니며, 건강한 조직으로부터 제거하기에는 장시간이 소요되었다. 그와 같은 불량한 종양 특이성은 종양 세포로의 약물의 비표적화된 성질로 인한 것이다. 게다가, 화합물의 큰 소수성 성질은 불량한 수용해도 및 불량한 약물동태학적 특성을 초래하며, 그에 의하여 화합물의 종양 세포에 대한 불량한 생체이용률을 초래한다. 그러므로, 미토콘드리아-표적화제로 변형된 광민감제는 병든 조직에 표적화되어야 한다. 미토콘드리아로의 전달제에서의 또 다른 문제는 그의 불투과성이 큰 내부 막이다.
미토콘드리아와 달리, 핵을 둘러싼 막인 핵막(NE)은 핵 소공 복합체를 경유한 생체분자의 수송을 허용한다. 그러므로, 작은 약물 분자는 핵에 들어갈 수 있으며, DNA 손상 및 세포 주기 정지를 잠재적으로 야기한다. 그러므로, 본 발명자들은 DNA 염색제, DNA 알킬화제 등에 접합시켜 핵-표적화된 PS의 라이브러리를 설계 및 개발하였다. DNA-표적화된 PS는 능동적이며, 배양액 중에서 암 세포를 죽일 수 있으나, 동물 모델(종양을 지닌 마우스)에서는 덜 능동적이다. 불량한 용해도 및 불량한 종양 표적화는 동물 모델에서 낮은 효능에 대한 이유가 될 수 있다.
일반적으로, 소기관-표적화된 요법은 표적화된 요법으로서 PDT를 개선시킬 가능성을 갖지만, 그러한 기술을 사용하여 극복하여야 하는 문제가 더 존재한다. 의도한 표적, 의도한 조직에 대한 낮은 특이성, 건강한 조직으로부터의 느린 제거율, 낮은 신호 대 배경 비, 건강한 조직에서의 비특이성 흡수로 인한 부작용, 투여된 물질에 대한 면역 반응, 불량한 수용해도 및 순환 중의 신속한 분해를 실질적으로 도달하는 낮은 농도의 약물은 PS가 PDT에 사용될 수 있기 이전에 극복하여야 하는 일부 장애이다. 광역학 요법이 유용하게 되기 위하여서는, 상기 단점을 극복하는 것이 중요하다.
그래서, 광역학 요법 접합체의 제조에서는 수개의 기준을 고려하였다. 합성 용이성 및 화학적 안정성은 주요한 화학적 속성이 되었다. 분광학적 성질, 예컨대 흡수 및 방출 스펙트럼 및 양자 수율을 고려하였다. 수개의 생물학적 성질, 예컨대 세포 실험에서의 결합 친화도, 종양을 지닌 마우스를 사용한 전신 동물 영상화 및 생체분포를 평가하였다. 구체적으로, 생체분포의 경우, 경구 분배당 2 시간 후 죽은 마우스, 살아있는 마우스 영상화 및 투여량 확대를 포함한 여러 측면을 고려하였다. 마지막으로, 최대 내성 용량(MTD), 면역조직화학적(IHC) 분석 및 일반적인 임상 병리학 분석을 포함한 안전 고려사항을 참작하였다.
본 개시내용은 안정하며, 적외선 범위에서 형광을 방출하며, 폴레이트 수용체를 발현시키는 조직 부위에서 종양을 근절시키기 위하여 표적화된 조직 내에서 깊게 침투하는 광역학 요법 접합체를 제공한다. 보다 구체적으로, 프테로일 접합체는 표적화제에 의하여 연결기 및 아미노산을 통하여 변형된 광역학 약제에 연결된다. 더더욱 구체적으로, 연결기가 아미노산인 경우 링커는 방출성이 되는 것으로 밝혀졌다.
아미노산은 카르복실산 작용기에 연결된 아민 작용기 및 각각의 아미노산에 대하여 특이성을 갖는 측쇄를 포함하는 것으로 정의된다. 알파 아미노산은 화학식 R5CH(NH2)COOH(α-아미노산)의 임의의 화합물이며, 여기서 R5는 H 또는 임의의 공지된 아미노산 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택된다.
베타 아미노산은 베타 탄소에서 연결된 아민 작용기 및 알파 탄소에서 연결된 카르복실산 작용기를 포함하는 것으로서 정의된다. 베타 호모 아미노산은 베타 탄소에서 연결된 아민 작용기, 알파 탄소에서 연결된 카르복실산 작용기 및 알파 탄소 또는 베타 탄소에서 출발하는 측쇄를 포함하며, 여기서 측쇄는 또 다른 아미노산에 결합되는 것으로 정의된다.
자연 발생 아미노산은 (1) 산성 아미노산, (2) 염기성 아미노산, (3) 중성 극성 아미노산 및 (4) 중성 비극성 아미노산인 4개의 기로 나뉠 수 있다. 상기 다양한 기에 포함되는 대표적인 아미노산은 (1) 산성(음으로 하전된) 아미노산, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산; (2) 염기성(양으로 하전된) 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘 및 리신; (3) 중성 극성 아미노산, 예컨대 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 및 (4) 중성 비극성(소수성) 아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
자연 발생 아미노산 서열에서의 아미노산에 대한 보존 치환은 자연 발생 아미노산이 속하는 군의 또 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 아미노산의 지방족 측쇄 기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이다. 자연 발생 아미노산 발린의 보존 치환은 글리신, 알라닌, 류신 또는 이소류신의 사용을 포함한다.
아미노산의 지방족-히드록실 측쇄 기는 세린 및 트레오닌이다. 아미노산의 아미드-함유 측쇄 기는 아스파라긴 및 글루타민이다. 아미노산의 방향족 측쇄 기는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이다. 아미노산의 염기성 측쇄 기는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이다. 아미노산의 황-함유 측쇄 기는 시스테인 및 메티오닌이다. 자연 보존 아미노산 치환의 예는 류신의 경우 발린, 트레오닌의 경우 세린, 티로신의 경우 페닐알라닌, 아르기닌의 경우 리신, 메티오닌의 경우 시스테인 및 글루타민의 경우 아스파라긴이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 광역학 요법 접합체는 조직내의 종양 세포에 특이적으로 표적화되어 종양 세포의 치료적 파괴를 초래하는 것으로 본원에 제시되어 있다. 그래서, 본 개시내용의 화합물은 더욱 경제적인 영상화 기술을 초래한다. 게다가, 통상의 영상화 화합물에 비하여 본 개시내용의 화합물의 더 낮은 투여량은 체내로의 이물질의 투여에 수반되는 독성 및 기타 부작용을 최소로 하는 추가의 잇점이 존재한다.
게다가, 상기 광역학 요법 접합체의 용도는 원발성 종양의 보다 정확하며, 보다 효율적인 절제를 초래하여 음성 변연을 생성할 뿐 아니라, 전이성 암 세포를 지닌 림프절의 정확한 확인 및 제거 및 위성 질환의 확인을 초래할 것이다. 각각의 상기 잇점은 치료되는 환자에 대한 더 우수한 임상 결과와 긍정적인 상관관계를 갖는다.
상기 화합물은 형광-매개된 분자 단층촬영 영상화 시스템, 예컨대 심부 조직에서의 근적외선 형광을 검출하도록 설계된 것과 함께 사용될 수 있다. 상기 화합물은 분자 및 조직 특이성을 제공하며, 높은 형광 콘트라스트, 더 밝은 형광 신호를 산출하며, 배경 자동형광을 감소시켜서 병든 조직(예, 암)의 생체내 개선된 조기 검출 및 분자 표적 평가를 허용한다. 상기 화합물은 심부 조직에 대하여 입체 영상화, 표적화된 수술 및 생물학적 샘풀 중의 표적 세포 유형의 양을 정량화하는 방법에 사용될 수 있다.
화합물
한 구체예에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)을 포함하는 화합물 또는 그의 약학적 허용 가능한 염, 또는 그의 동위원소에 관한 것이다:
<화학식 (I)>
Figure pct00026
상기 식에서,
L은 아미노산이며,
L' 약물동태학적(PK) 특성을 개선시키는 링커이며,
L"는 소기관-표적화된 광역학 치료(PDT)제를 방출시키는 방출성 링커이며,
X는 소기관-표적화제이며,
Y는 광역학 치료제이다.
상기 아미노산의 비제한적인 예는 시스테인, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 리신, 오르니틴, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 및 글루타민 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
특정한 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 화합물은 화합물을 특정한 세포 또는 조직 타입에 표적화하고, 그러한 표적화된 세포 또는 조직의 영상화를 허용하는데 효과적인 리간드를 포함한다. 리간드는 프테로일 모이어티 또는 폴레이트 모이어티인 것이 바람직하며, 리간드는 프테로일 모이어티인 것이 더욱 바람직하다. 그러나, 숙련된 기술자는 화합물을 특정한 세포 표면 단백질 또는 관심의 수용체 단백질에 표적화시키는데 몇몇 기타 리간드를 사용할 수 있다는 것으로 고려한다. 특정한 및 바람직한 실시양태에서, 리간드는 하기의 프테로일을 포함한다:
Figure pct00027
화합물의 합성
본원에 개시된 화합물은 문헌에 공지된 통상의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면 광역학 요법제 화합물은 이미 보고된 바와 같이 합성되었다는 것을 참조한다.
그러나, 특정한 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 화합물(즉, 화학식 I의 화합물)을 생성하는 더욱 효율적인 합성 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 각각의 하기 반응식 1 내지 12에 상술된 일반적인 반응식에 따라 생성될 수 있다:
베이스 약물의 합성
<반응식 1>
Figure pct00028
Figure pct00029
시약 및 조건: (a) MeOH, 아르곤 하에서, 14 h, (b) TFA, 아르곤 하에서, 1 h (c) NH2CH2CH2SO3H, DMF, 12 h.
반응식 1은 현재 임상 시험 중에 있는 비표적화된 PDT제를 생성하는데 이미 사용된 합성 반응식을 도시한다. 한 실시양태에서, 박테리오클로로필-a는 아르곤 하에서 14 시간 동안 메탄올과 반응하여 BPheid-a(생성물 (1))를 산출한다. BPheid-a는 아르곤 하에서 트리플루오로아세트산과 반응하여 화합물(2)를 산출한다. 화합물(2)는 타우린 및 디메틸포름아미드(DMF)와 12 시간 동안 반응하여 화합물(3) 및 (4)를 산출한다. 화합물(5), (6) 및 (7)은 시판 중이다.
그러나, 상기 시판 중인 PDT는 일반적으로 불량한 수불용성이지만, 암 세포에서는 효과적이지 않으며, 누드 마우스에서는 매우 높은 피부 흡수를 가지며, 마우스 종양 모델에서는 축적되는데 장시간이 소요되지만, 이들은 매우 낮은 형광 및 불량한 제거를 나타낸다는 점에 유의한다. 그래서, 본 발명자들은 변형된 BPheid 화합물을 생성하여 상기 단점을 극복하고자 하였다.
선택된 변형된 BPheid -a 화합물의 합성
<반응식 2>
Figure pct00030
시약 및 조건: (a) NH2NH2, DMF, 아르곤 하에서, 23℃, 3 h; (b) CH3I, CHCl3, 23℃, 아르곤 하에서, 4 일.
반응식 2는 변형된 BPheid-a 화합물을 생성하는데 사용된 합성 반응식을 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(1)을 히드라진 및 디메틸포름아미드와 아르곤 하에서 23℃에서 3 시간 동안 반응시킨다. 생성된 화합물(24)을 메틸 아이오다이드 및 클로로포름과 23℃에서 아르곤 하에서 4 일 동안 반응시켜 화합물(26)을 산출하였다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 히드라진 및 디메틸포름아미드와 아르곤 하에서 23℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 생성된 화합물(25)을 메틸 아이오다이드 및 클로로포름과 23℃에서 아르곤 하에서 4 일 동안 반응시켜 화합물(27)을 산출하였다.
<반응식 3>
Figure pct00031
Figure pct00032
시약 및 조건: (a) 디메틸 술페이트, MeOH/H2O, 65℃, 2 h; (b) H2/Pd, DCM, 23℃, 4 h; (c) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 34, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h.
반응식 3은 변형된 BPheid-a 화합물을 생성하는데 사용된 합성 반응식의 또 다른 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(32)을 디메틸 술페이트, MeOH/H2O, 65℃, 2 h 반응시킨다. 생성된 화합물(33)을 H2/Pd, DCM, 23℃, 4 h 반응시켜 화합물(34)을 산출한다. 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(34), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(9)을 산출하였다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(34), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(10)을 산출하였다.
<반응식 4>
Figure pct00033
Figure pct00034
시약 및 조건: (a) (i) Ph3P(+)CH2CH2COOH/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 32, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (b) H2/Pd, DCM, 23℃, 2 h; (c) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 36, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (d) NH2NH2, DMF, 아르곤 하에서, 23℃, 3 h.
반응식 4는 변형된 BPheid-a 화합물을 생성하는데 사용된 합성 반응식의 또 다른 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(32)을 (i) Ph3P(+)CH2CH2COOH/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨다. 생성된 화합물(35)을 화합물(32), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(36)을 산출한다. 화합물(1)은 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(36), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켰다. 생성된 화합물(13a)을 NH2NH2, DMF, 아르곤 하에서, 23℃, 3 h 반응시켜 화합물(14a)을 산출한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(36), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시킨다. 생성된 화합물(13b)을 NH2NH2, DMF, 아르곤 하에서, 23℃, 3 h 반응시켜 화합물(14b)을 산출하였다.
<반응식 5>
Figure pct00035
시약 및 조건: (a) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) NH2-Glu-(OtBu)-OH, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (b) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) 글루코사민, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (iii) TFA, 23℃, 1 h.
반응식 5는 변형된 BPheid-a 화합물을 생성하는데 사용된 합성 반응식의 또 다른 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) NH2-Glu-(OtBu)-OH,DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시킨다. 생성된 화합물(37)을 (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) 글루코사민, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (iii) TFA, 23℃, 1 h 반응시켜 화합물(19a)을 산출하였다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) NH2-Glu-(OtBu)-OH, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켰다. 생성된 화합물(38)을 (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min; (ii) 글루코사민, DIPEA, DMF, 23℃, 2 시간 동안; (iii) TFA, 23℃, 1 h 반응시켜 화합물(19b)을 산출하였다.
본 발명은 핵에 특이적으로 표적화되는 PDT제의 생성에 관한 것이다.
(a) 선택된 핵- 표적화된 PDT제의 합성
<반응식 6>
Figure pct00036
Figure pct00037
시약 및 조건: (a) (i) 벤다무스틴/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 32, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (b) H2/Pd, DCM, 23℃, 2 h; (c) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 51, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (iii) TFA, 23℃, 1 h.
반응식 6은 핵-표적화된 PDT제를 생성하는데 사용된 합성 반응식의 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(32)을 (i) 벤다무스틴/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 32, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시킨다. 생성된 화합물(50)을 H2/Pd, DCM, 23℃, 2 시간 동안 반응시켜 화합물(51)을 산출한다. 화합물(1)을 (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 51, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (iii) TFA, 23℃, 1 h 반응시켜 화합물(42a)을 산출한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 51, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (iii) TFA, 23℃, 1 h 반응시켜 화합물(42b)을 산출한다.
<반응식 7>
Figure pct00038
Figure pct00039
시약 및 조건: (a) (i) N10-메틸-4-아미노-4-데옥시프테로산 (R=CH3) 또는 4-아미노-4-데옥시프테로산 (R=H)/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 32, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (b) TFA, 23℃, 1 h (c) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 54 또는 55, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h.
반응식 7은 핵-표적화된 PDT제를 생성하는데 사용된 합성 반응식의 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(32)을 4-아미노-4-데옥시프테로산 (R=H)/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 동안 반응시켰다. 생성된 화합물(52)을 TFA와 23℃에서 1 시간 동안 반응시켜 화합물(54)을 산출한다.
또 다른 실시양태에서, 화합물(32)을 N10-메틸-4-아미노-4-데옥시프테로산(R=CH3), DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 동안 반응시킨다. 생성된 화합물(53)을 TFA와 23℃에서 1 시간 동안 반응시켜 화합물(55)을 산출한다.
한 실시양태에서, 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(54), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(43a)을 산출한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(54), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(43b)을 산출한다.
한 실시양태에서, 화합물(2)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(54), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(44a)을 산출한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(54), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(44b)을 산출한다.
<반응식 8>
Figure pct00040
Figure pct00041
시약 및 조건: (a) (i) 3-(4-보로노페닐)-프로판산/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 32, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h; (b) H2/Pd, DCM, 23℃, 2 h; (c) (i) HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min, (ii) 57, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h.
반응식 8은 핵-표적화된 PDT제를 생성하는데 사용된 합성 반응식의 실시양태를 예시한다. 한 실시양태에서, 화합물(32)을 3-(4-보로노페닐)-프로판산/HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시킨다. 생성된 화합물(56)을 H2/Pd, DCM, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(57)을 산출한다. 화합물(1)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(57), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(49a)을 산출한다.
또 다른 실시양태에서, 화합물(2)을 HATU, DIPEA, DMF, 23℃, 15 min 반응시킨 후, 화합물(57), DIPEA, DMF, 23℃, 2 h 반응시켜 화합물(49b)을 산출한다.
<반응식 9>
Figure pct00042
폴레이트-Asp(SO3H)-Cys-SH 링커의 합성. 시약 및 조건: (a) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) Fmoc-Asp(SO3H)-OH, HATU, DMF/DIPEA, 2 h; b) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) Fmoc-Glu(OtBu)-OH,HATU, DMF/DIPEA, 2 h; c) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) N10-TFA-프테로산, HATU, DMF/DIPEA, 2 h; d) TFA:H2O:TIPS:EDTA (92.5:2.5:2.5:2.5), 1 h.
<반응식 10>
Figure pct00043
Figure pct00044
디술피드 활성화된 BPheid-a의 합성. 시약 및 조건: (a) i) MeOC(O)SCl/CH3CN, 0℃, 0.5 h; ii) 2,2/-디피리딜-디술피드/CH3CN, 0℃, 2 h; (b) i) 디포스겐, HOBt, TEA/CH3CN, 0℃; ii) Δ/ 50℃, 24 h; (c) NH2NH2, DIPEA/CH2Cl2, 0℃ 내지 실온, 45 min; (d) i) HATU, DIPEA/DMF, -15℃, 45 min; ii) 74, DMF, -15℃ 내지 실온, 45 min. Py=피리딜.
<반응식 11a>
Figure pct00045
(a) 시약 및 조건: (a) i) H2O/NaHCO3 (pH=7±0.2), 아르곤, r.t.; ii) 75a 또는 b/ DMSO, 아르곤, r.t., 15 min.
사용 방법
본 발명의 화합물은 광역학 요법에 사용될 것이다. 본원에 사용된 용어 "광역학 요법(PDT, 광화학요법)"은 광민감제(PDT제, 광역학 치료제) 및 광민감제를 여기시킬 수 있는 광선의 존재에 의하여 병변을 손상 및 파괴하는 요법을 지칭한다. 광민감제를 투여한 후 광선으로 조사하는 PDT에서, 세포는 반응성 산소종(ROS)에 의하여 손상된다. 광역학 요법에서, 열은 발생하지 않으며, 국소화된 치료가 가능하다. 그러므로, 단백질의 열 변성은 발생하지 않으므로, 표적 부위 및 표적 부위 주위의 조직은 괴사되지 않으며, 표적 부위만이 신뢰성 있게 손상될 수 있다. 광민감제를 사용하지 않고 광선, 예컨대 레이저 빔만을 사용할 경우, 레이저 빔으로 조사된 부위에서 열이 발생하지 않을 수 있다. 그러므로, 주변 조직은 손상되지 않을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 광역학 요법의 사용 방법은 또한 광민감제를 사용하지 않고 레이저만을 사용한 조사를 위한 방법 또는 장치에 비하여 우수한 효과를 갖는다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 조직 내의 종양을 최소 침습성 절차를 사용하여 특이적으로 및 민감하게 근절 및/또는 절제시키는데 사용될 수 있는 본원에 개시된 화합물(예를 들면 화학식 I, I(a), I(b), I(c) 및/또는 I(d)) 중 적어도 하나를 혼입하는 방법에 관한 것이다. 그러한 방식으로, 본 개시내용의 화합물은 폴레이트 수용체를 발현시키며, 수용체를 과발현시키는 질환을 갖는 생물학적 조직의 임의의 질병의 치료에 유용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 질환은 암, 신경변성 질환, 호흡 질환, 대사 질환, 유전 질환, 골 질환, 피부 질환 및 환경 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 화합물은 암 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 개시된 화합물 및 방법은 임의의 개수의 암 또는 종양 또는 둘다를 치료하기 위하여 표적 조직 또는 종양의 영상화에 사용될 수 있다. 개시된 하합물은 난소암, 폐암, 두경부암, 췌장암, 장간막암, 전립선암, 신장암, 위암, 직장암, 위장암, 방광암, 백혈병(모발 세포 백혈병 및 만성 골수형성 백혈병 포함), 유방암, 흑색종, 악성 흑색종, 신장 세포 암종, 결장직장 암종, 결장암, 진행 결장직장 암종의 간 전이, 림프종(선 림프종 포함), 악성 림프종, 카포시 육종, 비-흑색종 피부암(편평 세포 암종 및 기저 세포 암종 포함), 혈관종, 다발성 골수종 및 신경아교종을 포함하나 이에 제한되지 않는 심부 조직 종양의 광역학 치료에서의 용도에 적절하다. 개사된 화합물은 고형 종양, 피부 종양 및 고형 유방 종양 성장을 포함하나 이에 제한되지 않은 여러 유형의 포유동물 종양의 치료에 적절하다.
개시된 화합물의 투여량은 선택된 광역학 요법 화합물, 치료적 프로토콜의 성질, 개개의 피험체 및 숙련된 의사의 판단을 포함하나 이에 제한되지 않는 요인에 의존하여 숙련된 기술자에 의하여 최적화될 것이다.
따라서, 개시된 진단 방법에서, 병든 조직(및 결합된 또는 흡수된 표적화 구조물)은 여기 광에 (예를 들면 수술에 의하여 생성된 개구에 의하여 또는 내부 위치에 광의 내시경 전달에 의하여) "노출된다". 개시된 방법은 피험체에서, 예컨대 자연적인 체강 또는 수술에 의하여 생성된 개구 내에서 내부 부위에 위치한 병든 조직의 생체내 검출에 특히 적절하며, 여기서 병든 조직은 본 개시내용의 화합물의 흡수에 의하여 강조된 부위의 생검 또는 수술 적출의 절차를 돕기 위하여 "잘 보이게 된다"(즉, 사람의 눈에 노출된다). 종양 조직의 정확한 위치 및/또는 표면적은 본 개시내용의 화합물의 흡수에 의하여 쉽게 결정되므로, 본 개시내용의 화합물의 사용 방법은 광역학 치료제 및 레이저 소스(수술 중에 및 영상화에 저 에너지를 사용할 수 있음)를 사용하여 절제되는 덩어리의 실시간 정확한 윤곽, 크기 등을 "보는" 것을 필요로 하는 외과의에게 중요한 가이드를 제공한다. 수술 후, 나머지 종양 세포는 고 에너지를 사용하는 레이저 소스에 의하여 약화될 수 있다.
그래서, 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 높은 용해도 및 더 우수한 PK 성질을 갖는 병든-표적화된 및 소기관-표적화된 PDT제가 영상-가이드된 수술에 이어서 광역학 치료에 사용될 수 있다는 것을 수반한다.
유사한 방식으로, 본 개시내용의 화합물은 화합물을 표적 세포 유형 중 적어도 하나의 세포에 결합시키는 것을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 상기 화합물과 접촉시켜 생물학적 샘플 중의 표적 세포 타입을 확인하는데 사용된다. 그 후, 결합된 화합물은 수용체 매개된 세포내이입에 의하여 내재화되며, 소기관-표적화된 PDT제를 병든 세포의 엔도좀에 방출한다. 그 후, PDT제에 부착된 가이드된 분자에 의존하여, 소기관-표적화된 PDT제는 병든 세포의 미토콘드리아 또는 핵에 운반될 것이다. 그러한 사례에서, 가장 바람직하게는, 표적화된 병든 세포 타입은 종양 세포 또는 종양 세포가 퍼진 림프절 또는 종양-관련 대식세포 또는 골수양-유래 억제인자 세포이다.
실제로, 숙련된 기술자는 본 개시내용의 화합물을 단독으로 또는 표적화 검출 가능한 모이어티의 칵테일의 일부로서 투여되며, 조사 중인 부위에서 존재할 수 있는 임의의 표적 조직에 의하여 상기 화합물 및 표적화 모이어티가 결합되거나 및/또는 흡수되도록 한 후 광원을 공급한다. 통상적으로, 본 개시내용의 화합물 및 임의의 추가의 표적화 모이어티는 본 개시내용의 형광 화합물뿐 아니라, 임의의 추가의 형광 구조물이 표적 조직에 의하여 흡수되도록 하는 시간 동안 및 조성으로 수술 전 투여될 것이다.
당업자는 각각이 표적 부위에 특이적으로 결합되는, 연속 투여되는 형광 표적화 구조물의 조합을 계획할 수 있을 것이다. 표적 조직을 확인하기 위하여 상기 칵테일에 사용되는 형광 표적화 구조물 전부는 본 개시내용의 화합물과 동일한 파장 대역 내에서 또는 동일한 파장에서 형광을 나타내는 형광단(예, 본 개시내용의 화합물 중에서 광의 근적외선 파장에 민감한 형광)을 포함하여 본 개시내용의 방법의 실시에 사용되는 상이한 표적화 구조물 전부로부터 동시 형광을 여기시키는데 사용될 필요가 있는 상이한 광원의 개수를 감소시키는 것이 바람직하다. 그러나, 본 개시내용의 화합물을 제외한 추가의 표적 모이어티는 본 개시내용의 형광 화합물과는 상이한 색상(즉, 상이한 파장을 가짐)에서 조사 광에 반응하여 형광을 띨 수 있는 것으로 고려한다. 본 개시내용의 화합물로부터 발산되는 형광의 색상 및 추가의 표적 화합물의 색상의 차이는 관찰자가 병든 조직의 위치 및 크기를 결정하는 것을 도울 수 있다. 몇몇 예에서, 관찰자가 표적 조직의 위치 및 크기를 결정하는 것을 추가로 돕기 위하여 병든 조직 및 정상 조직 사이의 콘트라스트가 추가로 향상되도록 표적 정상 조직에 표적화된 표적화 구조물 중의 형광단 및 병든 조직을 표적화시키는 본 개시내용의 화합물을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시내용의 화합물 이외에 상기 추가의 형광단 및 표적화제의 사용은 정상 조직으로부터 발산되는 임의의 자연 형광이 신체 부분에서 정상 조직에 표적화된 보충 표적화 구조물 중의 형광단(들)으로부터 발산하는 형광에 의하여 가려지게 되는 잇점을 제공한다. 정상 및 표적 조직으로부터 발산되는 형광 사이의 색상차가 클수록 관찰자는 표적 조직의 윤곽 및 크기를 가시화하기가 쉬워진다. 예를 들면, 본 개시내용의 화합물로부터 표적 조직(즉, 비정상 조직)으로 적외선광을 생성하는 형광단 및, 건강한 조직에 녹색광을 생성하는 형광단을 포함하는 형광 표적화 구조물을 표적화하는 것은 관찰자가 표적 조직을 정상 조직으로부터 구별하는 것을 돕는다. 당업자는 뚜렷한 시각적 색상 콘트라스트를 제시하는 형광단의 조합을 쉽게 선택할 수 있다.
특히 유용한 조합은 OTL38을 사용하는 영상 가이드된 수술과 조합한 본 발명의 PDT의 용도이다. OTL38의 용도를 위한 방법 및 조성물은 예를 들면 미국 특허 제9,061,057호에 개시되어 있으며, 이 특허는 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 방법의 실시에 사용되는 광의 스펙트럼은 표적화 구조물 또는 표적화 구조물 내에 함유된 생물학적 적합성 형광 모이어티의 뚜렷한 여기 파장에 해당하는 적어도 하나의 파장을 함유하도록 선택된다. 일반적으로, 본 개시내용의 방법의 실시에 사용된 여기 광은 약 600 ㎚ 내지 약 850 ㎚의 근적외선 파장 범위에서 광의 적어도 하나의 여기 파장을 포함한다.
그러나, 상이한 파장에서 형광을 띠는 표적화 리간드의 조합이 본 개시내용의 실시에 사용될 경우, 여기 광의 스펙트럼은 적어도 하나의 여기 파장을 사용된 각각의 형광단에 제공하기에 충분히 넓어야 한다. 예를 들면, 정상 조직을 병든 조직으로부터 구별하기 위하여 상이한 색상의 형광단을 선택할 때 광(들)의 여기 스텍트럼은 정상 및 표적 조직에 표적화된 형광단에 대한 여기 파장을 포함하는 것이 특히 이롭다.
본원에서 언급한 바와 같이, 본 개시내용의 화합물은 본 개시내용의 화합물의 일부인 프테로일 또는 폴레이트 리간드에 의하여 폴레이트 수용체에 특이적으로 표적화된다. 추가의 표적화 모이어티가 사용되는 실시양태에서, 추가의 표적화 모이어티의 표적화 구조물은 관심의 표적 조직에 의하여 특이적으로 예를 들면 표적 조직에서 질환 또는 비정상 상태를 특징으로 하는 세포 상에서 또는 내에서 함유되는 항원 또는 기타 표면 특징에 결합 및/또는 흡수되도록 선택된다. 기타 진단 검정에서와 같이, 표적화 구조물이 표적 조직에 선택적으로 또는 질환 또는 비정상 상태와 관련된 항원에 결합되거나 또는 그에 의하여 흡수되는 것이 바람직하나; 표적 조직을 나타내는 형광 영상이 시계에서 건강한 조직 또는 구조로부터의 임의의 형광과는 뚜렷한 것으로 명백하게 가시화될 수 있도록 표적 조직 중의 항원의 농도 또는 표적 조직에 대한 표적화 구조물의 친화도가 시계에서 건강한 조직에 대하여서보다 충분히 더 크다면 건강한 조직 또는 세포 구조에 결합되거나 또는 그에 의하여 흡수되는 리간드 모이어티를 함유하는 표적화 구조물은 본 개시내용의 방법의 실시에 사용될 수 있다.
예를 들면, 결장암은 종종 암배아 항원(CEA)의 존재를 특징으로 하지만, 그러한 항원은 또한 건강한 개체에서의 특정 조직과 관련되어 있다. 그러나, 암성 결장 조직에서의 CEA의 농도는 종종 건강한 조직에서 존재하는 것보다 커서 항-CEA 항체는 본 개시내용의 실시에서 리간드 모이어티로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 데옥시글루코스는 정도를 달리하여 건강한 조직에 의하여 흡수 및 이용되며, 특정한 공지의 기관, 예컨대 심장을 제외한 건강한 조직에서의 그의 대사는 실질적으로 종양에서보다 더 낮다. 그러므로, 체내에서 데옥시글루코스 소비의 공지의 패턴은 데옥시글루코스의 예상외로 높은 흡수가 종양 세포의 존재를 표시하는 부위의 결정에 도움을 주는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 의하여 검출된 질환 또는 비정상 상태는 특이성 결합 리간드가 알려져 있는 공지의 표적 조직의 존재를 특징으로 하는 임의의 유형일 수 있다. 예를 들면, 각종 심장 병태는 괴사성 또는 허혈성 조직의 생성 또는 특이성 결합 리간드가 알려져 있는 동맥경화 조직의 생성을 특징으로 한다. 또 다른 예시의 예로서, 유방암은 CA15-3, CA19-9, CEA 또는 HER2/neu에 대한 모노클로날 항체에 의하여 확인된 암성 조직의 생성을 특징으로 한다. 표적 조직은 결합 리간드가 알려져 있는 표면 항원 또는, 세포내 마커(즉, 항원)를 생성하는 세포를 특징으로 할 수 있는데, 이는 다수의 표적화 구조물이 세포막을 투과하기 때문인 것으로 고려된다. 본 개시내용의 방법을 사용하여 확인할 수 있는 대표적인 질환 병태는 상이한 유형의 종양 등으로서의 상기 다양한 병태를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비정상" 조직은 전암성 병태, 괴사성 또는 허혈성 조직 및, 결합 조직 질환과 관련된 조직 및 자가면역 질환 등을 포함한다. 추가로, 본 개시내용의 방법을 사용한 진단 또는 검사에 적절한 표적 조직의 유형의 예는 심장, 유방, 난소, 자궁, 폐, 자궁내막, 혈관, 위장관, 결장직장, 전립선 조직, 내분비 조직 등뿐 아니라, 그의 임의의 2종 이상의 조합을 포함한다.
단순히 예로서, 몇몇 흔한 악성종양에 대한 항원 및 이들이 통상적으로 발견되는 신체 위치는 당업자에게 공지되어 있으며, 표적화 리간드, 예컨대 항체 또는, 상기 항원 또는, 사실상 항원이 수용체인 리간드는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, CEA(암배아 항원)는 결장, 유방 및 폐로부터의 종양에서 흔히 발견되며; PSA(전립선 특이성 항원 또는 종종 전립선 특이성 막 항원(PSMA)으로서 지칭됨)는 전립선암에 대하여 특이성이며; CA-125는 난소암 기원의 종양에서 흔히 발견되며, CA 15-3, CA19-9, MUC-1, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2/neu는 유방암 종양에서 흔히 발견되며, 알파-페토 단백질은 고환암 및 간암 종양 모두에서 발견되며, 베타-사람 융모생식샘자극 호르몬은 고환암 및 융모막암종에서 발견되며, 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 둘다는 또한 자궁암 종양에서 발견되며, 표피 성장 인자 수용체는 방광암으로부터의 종양에서 흔히 발견된다. 기타 종양 특이성 리간드 및 마커는 당업자에게 주지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용은 폴레이트 수용체를 표적화하기 위한 폴레이트 또는 프테로일 모이어티 및, 염료를 전립선암 세포에 표적화시키기 위한 PMSA 표적 모이어티를 사용한다.
종양의 임의의 상기 통상적으로 공지된 마커는 본원에 기재된 염료를 사용하여(상기 마커를 특이적으로 표적화하는 모이어티에 대하여 프테로일 모이어티를 스위칭 아웃하여) 표적화될 수 있거나 또는 대안으로 이들 마커는 본 개시내용의 화합물을 사용하여 표적화되는 폴레이트 수용체 이외에 또는 이와 조합하여 표적화될 수 있는 것으로 고려된다. 이미 논의한 바와 같이, 표적화 모이어티가 주어진 종양 상에서 수개의 상이한 마커에 모이어티를 표적화시켜서 수개의 마커가 더 밝게 표적화되어 종양을 뚜렷하게 가시화시키는 진단 칵테일로서 작용하는 것이 특히 이로울 수 있다.
화학적 화합물 이외에, 상기 칵테일 중의 표적화 모이어티는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 그의 생물학적 활성 분절, 바람직하게는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 본 개시내용 방법의 실시에 사용된 보충 형광 표적화 구조물(들)은 또한 형광단으로 태그부착된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 무상해 분자뿐 아니라, 그의 작용성 분절, 예컨대 에피토프 결정인자를 결합시킬 수 있는 Fab, F(ab')2 및 Fv를 포함한다. 상기 분절의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들면 문헌[Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988]을 참조하며, 이는 본원에 참조로포함된다). 본 개시내용에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합된 항원에서의 임의의 항원성 결정인자를 의미한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그루핑으로 이루어지며, 일반적으로 특이성 입체 구조적 특징뿐 아니라, 특이성 하전 특징을 갖는다.
항체 이외에, 칵테일은 형광 표적화 구조물에 부착된 리간드 모이어티가 수용체에 특이적으로 결합되거나 및/또는 종양 세포에 의하여 선택적으로 흡수되는 다수의 생물학적 적합성 화합물 중에서 선택되며, 본 개시내용의 표적화 구조물 중의 리간드 모이어티로서 사용될 수 있다. 종양 세포에 의하여 선택적으로 "흡수되는" 화합물은 표면 또는 핵 수용체(예, 호르몬 수용체), 공극, 세포 지질 이중층에서의 친수성 "창" 등을 통하여 세포에 투입될 수 있다.
종양을 표적화하는 상기 유형의 화합물의 예는 소마토스타틴, 소마토스타틴 수용체-결합 펩티드, 데옥시글루코스, 메티오닌 등이다. 특히 유용한 소마토스타틴 수용체-결합 펩티드는 옥트레오티드로서 공지된 소마토스타틴의 장시간 작용하는, 옥타펩티드 유사체(D-페닐알라닐-L-시스테이닐-L-페닐알라닐-D-트립토필-L-리실-L-트레오닐-N-[2-히드록시-1-(히드록시메틸)프로필]-L-시스테인아미드 시클릭(2→7)-디술피드), 옥트레오티드의 경구 제제인 란레오티드, P829, P587 등이다. 소마토스타틴-결합 펩티드는 미국 특허 제5,871,711호에 개시되어 있으며, 환원 조건 하에서 그의 카르복실 말단 아미노산을 통하여 방사성동위원소에 상기 펩티드를 공유 연결시키는 방법은 미국 특허 제5,843,401호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 당업자는 방사성동위원소 대신에 본 개시내용의 형광 모이어티를 치환하여 형광-민감성 소마토스타틴 수용체-결합 펩티드의 제조에 대하여 상기 교시내용을 쉽게 조정할 수 있다.
소마토스타틴 및 소마토스타틴 수용체-결합 펩티드는 질환 상태가 신경내분비 또는 내분비 종양인 경우 표적화 구조물 중의 종양-표적화 리간드 모이어티로서 사용하기에 특히 효과적이다. 본 개시내용의 방법을 사용하여 진단될 수 있는 신경내분비 종양의 예는 선종(GH-생성 및 TSH-생성), 도세포 종양, 유암종, 미분화된 신경내분비 암종, 소세포 및 비-소세포 폐암, 신경내분비 및/또는 중간 세포 암종, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 유방, 신장, 후두, 부비동 및 타액선의 신경내분비 종양, 수막종, 고 분화 아교-유래 종양, 갈색세포종, 신경모세포종, 신경절신경(모)세포종, 부신경절종, 유두상, 갑상선 세포에서의 난포 및 수질 암종, 메르켈 세포 암종 및 흑색종뿐 아니라, 육아종 및 림프종을 포함한다. 그러한 종양 세포는 소마토스타틴 수용체를 갖는 것으로 공지되어 있으며, 본 개시내용의 형광 표적화 구조물 중의 종양-표적화 리간드로서 소마토스타틴 또는 소마토스타틴 수용체 결합 펩티드를 사용하여 표적화될 수 있다.
바소인테스티날 펩티드(VIP) 수용체 섬광조영술(I. Virgolini, EurJ . Clin . Invest. 27(10):793-800, 1997)에 사용된 VIP는 또한 본 개시내용에서 소 원발성 선암종, 간 전이 및, 위장관의 특정한 내분비 종양의 진단 방법에 유용하다.
종양에 의하여 선택적으로 흡수되는 종양-표적화 리간드의 예시의 또 다른 분자는 데옥시글루코스이며, 이는 각종 상이한 유형의 종양에서 선택적으로 흡수되는 것으로 공지되어 있다. 종양-표적화 리간드로서 데옥시글루코스를 사용하여 검출될 수 있는 종양의 유형의 예는 흑색종, 결장직장 및 췌장 종양, 림프종(HD 및 NHL 둘다), 두경부 종양, 골수종, 난소의 암, 암, 유방 및 뇌(고도 및 뇌하수체 선종), 육종(등급 의존성), 간암, 고환암, 갑상선(등급 의존성) 소세포 폐암, 방광 및 자궁 암 등을 포함한다.
본 개시내용의 칵테일에 사용될 수 있는 기타 종양-표적화 화합물은 1-아미노-시클로부탄-1-카르복실산 및 L-메티오닌을 포함한다. L-메티오닌은 단백질 합성에서 필요한 필수 아미노산이다. 악성 세포는 변형된 메티오닌 대사를 가지며, 메티오닌의 외부 공급원을 필요로 하는 것으로 공지되어 있다.
종양 수용체에 대한 특이성으로 결합되며 및/또는 종양 세포에 의하여 선택적으로 흡수되는 생물학적 적합성 종양-표적화 화합물의 추가의 예는 포유동물 호르몬, 특히 성 호르몬, 신경전달물질 및, 종양 세포에 의하여 선택적으로 흡수되는 서로 소통하는 종양 세포에 의하여 발현되는 화합물, 예컨대 염색체 이상, 예컨대 클론 내에서의 전달 또는 역전으로부터 발생하는 신규한 분비된 단백질 구조물을 포함한다.
성 호르몬, 세포 성장 호르몬, 시토킨, 내분비 호르몬, 에리트로포이에틴 등을 포함한 호르몬은 또한 종양 표적화 모이어티로서 잘 작용한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 다수의 종양 유형은 호르몬, 예를 들면 에스트로겐, 프로게스테론, 안드로겐, 예컨대 테스토스테론 등에 대한 수용체를 발현시킨다. 그러한 호르몬은 종양 세포에 의하여, 예를 들면 특이성 수용체를 통하여 선택적으로 흡수된다.
본 개시내용의 방법의 실시에 사용된 표적화 구조물 및 보충 표적화 구조물은 당업자에게 공지된 임의의 경로, 예컨대 국소, 관절내, 수조내, 안구내, 심실내, 경막내, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 기관내, 강내 등에 의하여 뿐 아니라, 그의 임의의 2종 이상의 임의의 조합에 의하여 투여될 수 있다.
투여에 대한 가장 적절한 경로는 치료되는 질환 상태 또는 의심되는 병태 또는 진단되는 종양의 위치에 의존하여 변경될 것이다. 예를 들면, 염증성 병태 및 각종 종양의 치료의 경우, 여기 광(예, 강내)에 의하여 조사되는 신체 부분에 직접 주사에 의한 투여를 포함한 국소 투여는 표적화 구조물(예, 형광 태그부착된 항체)이 그의 전신 투여를 수반할 수 있는 합병증의 우려 없이 고 농도로 투여될 수 있는 잇점을 제공한다.
본 개시내용의 화합물뿐 아니라, 본 개시내용의 화합물을 포함하는 진단 칵테일에 사용된 임의의 추가의 표적화 구조물은 진단을 위한 "유효량"으로 투여된다. 유효량은 피험체에서 조사 중인 신체 부위내에 위치하는 임의의 표적 조직을 직접 가시화하는 것을 돕는데 필요한 표적화 구조물의 양이다. 용어로서 본원에 사용된 "피험체"는 임의의 포유동물, 예컨대 반려동물, 가축 또는 동물원의 동물, 바람직하게는 사람을 포함하는 것으로 고려한다. 진단 용도에 효과적인 양은 물론 조사되는 신체 부위의 크기 및 위치, 표적 조직에 대한 표적화 구조물의 친화도, 표적 조직의 유형뿐 아니라, 투여 경로에 의존할 것이다. 표적화 구조물의 국소 농도가 몇몇 사례에서는 전신 투여시 안전성으로 달성될 수 있는 것보다 국소 투여 후 더 높을 수 있기는 하나, 표적화 구조물의 국소 투여는 통상적으로 임의의 방식의 전신 투여보다 더 작은 투여량을 필요로 할 것이다.
개개의 피험체는 증상의 중증도에서의 넓은 변동을 나타낼 수 있으며, 각각의 표적화 구조물은 표적에 대한 표적화 구조물의 친화도, 체내 과정에 의한 표적화 구조물의 제거율, 그에 함유된 형광단의 성질 등을 포함한 그의 독특한 진단 특징을 지니므로, 숙련의는 인자를 따져볼 것이며, 그에 따라 투여량을 변경시킬 것이다.
본 개시내용의 화합물뿐 아니라, 상기 화합물을 포함하는 칵테일은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하는 공지의 방법에 따라 무균 주사 가능한 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 무균 주사 가능한 제제는 또한 비독성 비경구 허용 가능한 희석제 또는 용매 중에서, 예를 들면 1,4-부탄디올 중의 액제로서 무균 주사 가능한 액제 또는 현탁액이 될 수 있다. 무균 고정유는 용매 또는 현탁 매체로서 통상적으로 사용된다. 이를 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드, 지방산(올레산 포함), 자연 발생 식물성유, 예컨대 참기름, 코코넛유, 땅콩유, 면실유 등 또는 합성 지방 비히클, 예컨대 에틸 올레에이트 등을 포함한 임의의 무자극 고정유를 사용할 수 있다. 완충제, 방부제, 산화방지제 등은 필요할 경우 혼입될 수 있거나 또는 대안으로 제제를 포함할 수 있다.
다양한 변화는 그의 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이 본 개시내용에서 이루어질 수 있으므로, 본 개시내용은 상세한 설명에 구체적으로 개시된 것 이외에, 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같은 실시양태를 포함한다.
하기 실시예는 단지 본 개시내용의 특정한 실시양태를 예시하기 위하여 제공되며, 첨부된 청구범위의 범주로 한정하는 것을 의도하지 않는다. 본원에 논의된 바와 같이, 개시된 화합물 및 방법의 특정한 특징은 그들이 제공하는 작업성 또는 잇점에 필수적이지 않은 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 화합물이 사용될 특정한 용도에 의존하여 다양한 아미노산 및 아미노산 유도체뿐 아니라 표적 리간드를 혼입할 수 있다. 당업자는 상기 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함된다는 것을 인지할 것이다.
실시예
하기 실시예에서, 광역학 요법 (PDT)에 대한 표적화된 신규한 병든 조직뿐 아니라, 소기관-표적화된 광민감제 (PS)의 합성이 설명되며, 상기 화합물의 합성이 제시된다.
하기 실시예에서, 화합물의 시험관내 효능은 KB 세포를 사용하여 측정한다. 그러한 검정에서, KB 세포는 70% 전면생장률로 성장하였으며, 2 시간 동안 증가되는 농도의 PS로 파동 처리하였다. 미결합 접합체를 제거하기 위하여 세정한 후, 세포를 레이저 빔(25 개의 웰당 6 ㎽/㎠, 12 J/㎠ 및 노출 직경=6 ㎝)에 32 분 동안 노출시키고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 새로운 배지 내에서 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 셀 타이터 글로를 사용하여 방출된 ATP의 생체발광 정량화에 의하여 측정하였다. 소 분자 약물은 <2 시간 이내에 (비표적화된 조직으로부터) 생체내 제거되는 것으로 밝혀졌으므로, 전술한 2 시간 노출을 선택하였으며, 이는 약물의 더 긴 노출이 비생리적 결과를 산출하다는 것을 시사한다.
하기 실시예에 제시된 데이타는 EC50 값을 나타낸다. EC50은 절반의 최대 유효 농도이며, 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. EC50 값이 낮을수록 활성은 크다. 본 출원인은 EC50 <50 ㎚의 화합물은 활성인 것으로, EC50 <10 ㎚의 화합물은 활성이 매우 큰 것으로 간주한다.
하기 실시예에서, 화합물의 생체내 효능은 누드 마우스에서 KB 종양 세포 이종이식을 사용하여 측정한다. 그러한 실험에서, KB 세포를 피하 이식하고, 종양의 성장을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상화의 경우, 종양이 250-350 ㎣이 되면, 화합물을 꼬리 정맥을 통하여 주사하고, 종양 내의 PS의 축적을 IVIS 영상화기를 사용한 형광 영상화를 사용하여 (48 시간에 걸쳐) 모니터링하였다. 게다가, 종양이 ~50 ㎣로 성장하면, 화합물을 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 화합물을 주사한 후 3 시간(3 h)에, 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. BPheid-a의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다.
실시예 1:
본 실시예에서, 본 발명자들은 시판 중인 비표적화된 PDT제 또는 현재 임상 시험 중에 있는 유사한 약제의 임상전 평가를 수행하였다. 본 실험의 목적은 2가지이었다. 첫째, 목적은 암세포에서의 시판 중인 광민감제의 광역학 치료적 효능을 평가하는 것이며, 둘째, 종양 이종이식 마우스 모델에서 암 세포에서의 시판 중인 광민감제의 광역학 치료적 효능을 평가하는 것이다.
투캐드 및 그의 유사체의 합성
로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter Sphaeroides)(150 g)의 수성 페이스트를 메탄올(2.2 ℓ) 중에 현탁시키고, 아르곤을 암실에서 14 시간 동안 교반하면서 그린 현탁액을 통하여 버블링시켰다. 현탁액을 소결 유리 깔때기를 통하여 여과하고, 여과액이 거의 무색이 될 때까지 잔류물을 메탄올로 세정하였다. 여과액을 회전 증발기 상에서 증발시키고, 고 진공 하에서 건조시켜 미정제 박테리오클로로필-a(8)을 암녹색 고체로서 얻었다.
상기 단계에서 얻은 미정제 박테리오클로로필-a(8)를 TFA(120 ㎖, 물 중의 80%) 중에 현탁시켰다. 아르곤을 반응 혼합물을 통하여 10 분 동안 버블링시키고, 내용물을 암실에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(400 ㎖)에 붓고, 클로로포름(3×300 ㎖)을 사용하여 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세정하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름(50 ㎖) 중에 용해시키고, 헥산(800 ㎖)에 격렬히 교반하면서 부었다. 침전된 암갈색 고체를 여과하고, 고 진공 하에서 건조시켜 박테리오페오포르비드-a(BPheid-a)(1)를 얻었다.
아르곤으로 10 분 동안 버블링시킨 클로로포름(60 ㎖)을 Pd(OAc)2(784 ㎎, 3.53 mmol, 6 equiv) 및 아스코르브산나트륨(700 ㎎, 3.53 mmol, 6 equiv)의 혼합물에 격렬한 교반 하에 첨가한 후, 탈기시킨 메탄올(360 ㎖)을 첨가하였다. 또 다른 플라스크 내에서 BPheid-a(360 ㎎, 0.59 mmol, 1 equiv)를 탈기시킨 클로로포름(100 ㎖) 중에 용해시키고, 상기 용액에 서서히 2 분 이내에 첨가하였다. 반응 내용물을 아르곤으로 10 분 동안 버블링하고, 암실에서 23℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 농축시켰다. 생성된 암갈색-자주색 고체를 메탄올/클로로포름(20/100 ㎖) 중에 재용해시키고, 셀라이트를 통하여 여과하고, 농축시켰다. 아스코르브산나트륨(0.4%) 처리된 실리카 및 디클로로메탄 중의 0-10% 메탄올을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 미정제 고체를 정제하여 화합물 2(투캐드)를 얻었다.
타우린(32 ㎎, 0.26 mmol)을 1M K2HPO4(1 ㎖) 중에 용해시키고, 수성 HCl을 사용하여 pH를 8.2로 조절하였다. 물을 증발시키고, 고체를 고 진공 하에서 건조시켰다. 상기 고체에 Pd-BPheid-a(화합물(3))(20 ㎎, 0.032 mmol) 및 DMSO(3 ㎖)를 첨가하고, 아르곤을 2 분 동안 용액을 통하여 버블링시켰다. 반응 혼합물을 60℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물 3을 암갈색 고체로서 얻었다.
Pd-BPheid-a(3)(50 ㎎, 0.07 mmol)을 DMSO(7.5 ㎖) 중에 용해시키고, 아르곤을 2 분 동안 용액을 통하여 버블링시켰다. 또 다른 플라스크에서, 타우린(70 ㎎, 0.55 mmol)을 1M K2HPO4(2.17 ㎖) 중에 용해시키고, 수성 HCl을 사용하여 pH를 8.2로 조절하였다. 이 용액을 상기 용액에 첨가하였다. 아르곤을 반응 혼합물을 통하여 또 다른 5 분 동안 버블링시키고, 내용물을 40℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물로부터 회전 증발기를 사용하여 40℃에서 제거하고, 내용물을 40℃에서 40 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 투캐드 가용물(4)을 암갈색 고체로서 얻었다.
화합물 1 내지 5는 KB 세포 상에서 테스트하여 그의 효능을 구하였다. 도 2는 세포 생존에 대한 상기 약물의 농도의 효과를 도시한다.
<표 1>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 각종 비표적화된 PDT제의 효과
Figure pct00046
비표적화된 PS의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였다.
테스트한 모든 비표적화된 PS의 EC50 값은 상기 약제가 암 세포 중에서 활성이 없어서 PDT에 대하여 적절하지 않다는 것을 나타낸다. 불량한 수용해도, 불량한 세포 침투 및 암 세포 내에서 불충분한 소기관 국소화를 포함한 그와 같은 활성 부족에 대한 이유는 다수가 존재한다.
또한, Pd 킬레이트 생성된 화합물(3 및 4)은 비-킬레이트 생성된 분자(1 및 2)에 비하여 활성이 더 적다는 점에 유의한다. 게다가, 화합물 4는 화합물 1에 비하여 활성이 적다. 이와 같은 활성의 손실은 친핵체를 사용한 5원 고리(케톤 기 및 메틸 에스테르를 가짐)의 개환으로 인하여 일 수 있다.
암 세포에 대한 상기 비표적화된 PS의 특이성을 설정하기 위하여, BPheid-a를 KB 종양을 갖는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하였다. 마우스를 종양 중의 PS의 축적에 대하여 IVIS 영상화기를 사용하여 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 마우스의 피부에서 BPheid-a의 비특이성 흡수를 나타냈다. 게다가, 피부로부터 제거하는데 장시간 소요되었다. BPheid-a는 종양에 축적되는데 약 24 시간 소요되었으며, 종양에서의 형광은 매우 낮으며, 이는 매우 적은 BPheid-a 분자가 실질적으로 종양 조직에 도달되었다는 것을 나타낸다. BPheid-a 분자의 이용 가능성의 부족은 예를 들면 불량한 수용해도, 불량한 세포 침투, 약물의 낮은 생체이용률, 종양에 충분한 수의 분자를 제공하지 않는 약물 및, 암 세포 내에서의 불충분한 소기관 국소화를 포함한 다양한 이유에 기인할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포를 누두 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 BPheid-a(1)를 사용한 처치를 개시하기 전 약 50 ㎣로 성장하도록 하였다. 50 nmol의 BPheid-a를 주사한 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. BPheid-a의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. BPheid-a로 처치한 KB 종양은 <1 주의 2배 시간으로 자라서 2 주 처치 기간 종반에 >600 ㎣에 도달하였으며, 마우스는 커다른 종양 부피로 인하여 3 주 이내에 안락사시켜야만 한다. 다른 한편으로, PBS(포스페이트 완충 염수) 처치된 마우스 종양은 종양 궤양으로 인한 안락사 전에 3 주 이내에 600 ㎣ 넘게 자랐다. 이는 무처치 대조군 마우스에 비하여 종양에 대한 BPheid-a로부터의 몇몇 효과가 존재하였다는 것을 나타낸다.
상기 연구로부터, 본 출원인은 비표적화된 통상의 PDT제가 기껏해야 비효율적인 PDT 분자라는 결론을 도출하였다. 본 출원인은 물 중에서 불용성이 크며, 세포 배양액 중에서 낮은 효능을 갖는 것으로 나타났다. 게다가, 피부에서의 높은 흡수 및 낮은 종양-대-배경 비 둘다를 갖는 것과 동시에 비특이성이 크다. 상기 통상의 승인된 PDT 분자는 종양에 국소화시키는데 24 시간 이상 소요되며, 국소화될 때 종양에는 낮은 농도의 약물 분자만이 존재하며, 동물 모델에서는 매우 낮은 효능을 갖는 것으로 나타났다. 게다가, 상기 분자의 용도는 종양에서 낮은 농도의 PDT제에 의하여 방해되며, 이는 매우 낮은 수준의 형광이 존재하여 종양 영상화 또는 영상-가이드된 수술에서의 사용에 충분한 형광을 생성하지 못한다는 것을 의미한다.
실시예 2: 미토콘드리아- 표적화된 변형된 PDT제의 임상전 평가
본 실시예에서, 친유성 양이온성 분자 또는 양이온성 펩티드 또는, 미토콘드리아 내에서 표적에 선택적으로 결합되는 분자에 접합시켜 미토콘드리아를 표적화하여 BPheid-a를 변형시키며; 암 세포에서 변형된 BPheid-a 유사체를 표적화하는 미토콘드리아의 광역학 치료적 효능을 평가하고; 세포 배양액 중의 가장 활성이 큰 분자에 대한 종양 이종이식을 지니는 마우스에서 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하는 것을 목적으로 한다.
(a) 선택된 변형된 BPheid -a 유사체의 합성
히드라진(10.2 ㎕, 0.33 mmol, 10 equiv)을 디메틸포름아미드(3.3 ㎖) 중의 BPheid-a(1)(20 ㎎, 0.033 mmol, 1 equiv) 또는 투캐드(2)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 5 분 동안 탈기시키고, 23℃에서 3 시간 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 반응을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(24) 또는 (25)를 암갈색 고체로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(13.5 ㎕, 0.078 ㎜ol) 및 CH3I(50 ㎕)를 탈기시킨 CHCl3(3 ㎖) 중에 용해된 화합물(24)(5 ㎎, 0.0078 ㎜ol) 또는 (25)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 23℃에서 4 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(26) 암갈색 고체로서 얻었다.
디메틸 술페이트(0.52 ㎖, 5.57 mmol)를 MeOH(8 ㎖) 및 물(5 ㎖) 중의 화합물(32)(400 ㎎, 1.11 mmol), K2CO3(1.5 g, 11.1 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 현탁액을 23℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 물로 희석하고, EtOAc(3×70 ㎖)를 사용하여 추출하였다. 유기물을 물, 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물(33)을 담황색 오일로서 얻었다.
탄소상 팔라듐(80 ㎎)을 DCM(10 ㎖) 중의 화합물(33)(250 ㎎, 0.57 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 내용물을 수소 풍선 대기 하에서 4 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 농축시켜 화합물(34)을 맑은 오일로서 얻었다.
DIPEA(21 ㎕, 0.123 mmol, 3 equiv)를 탈기시킨 DMF(2 ㎖) 중의 BPheid-a(25 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv) 및 HATU(15.5 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv)의 용액에 첨가하고, 내용물을 23℃에서 15 분 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 그 후, 탈기시킨 DMF(0.5 ㎖) 중의 5-아미노-1-(tert-부톡시)-N,N,N-트리메틸-1-옥소펜탄-2-아미늄 메틸 술페이트(35 ㎎, 0.054 mmol, 1 equiv)의 용액을 반응 용기에 넣었다. 반응 혼합물을 23℃에서 또 다른 1 시간 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 물을 첨가하여 커플링제를 파괴하고, 반응을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(16)을 암갈색 고체로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(146 ㎕, 0.842 mmol)을 DMF(3.5 ㎖) 중의 화합물(32)(140 ㎎, 0.337 mmol), HATU(128 ㎎, 0.337 mmol) 및 (2-카르복시에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드(121 ㎎, 0.337 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 내용물을 23℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 물로 희석하고, EtOAc(3×100 ㎖)를 사용하여 추출하였다. 유기물을 물, 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물(35)을 맑은 진한 오일로서 얻었다.
탄소상 팔라듐(50 ㎎)을 DCM(10 ㎖) 중의 화합물(33)(100 ㎎, 0.148 ㎜ol)의 용액에 첨가하였다. 반응 내용물을 수소 풍선 대기 하에서 24 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 농축시키고, HPLC을 사용하여 정제하여 화합물(36)을 얻었다.
DIPEA(21 ㎕, 0.123 mmol, 3 equiv)를 탈기시킨 DMF(2 ㎖) 중의 BPheid-a(25 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv) 및 HATU(15.5 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv)의 용액에 첨가하고, 내용물을 23℃에서 15 분 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 그 후, 탈기시킨 DMF(0.5 ㎖) 중의 (S)-(3-((5-아미노-1-(tert-부톡시)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-3-옥소프로필)트리페닐포스포늄 브로마이드(30 ㎎, 0.054 mmol, 1 equiv)의 용액을 반응 용기에 넣었다. 반응 혼합물을 23℃에서 또 다른 1 시간 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 물을 첨가하여 커플링제를 파괴하고, 반응을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물 13a를 암갈색 고체로서 얻었다.
히드라진(3.1 ㎕, 0.10 mmol, 5 equiv)을 디메틸포름아미드(2 ㎖) 중의 화합물 13(20 ㎎, 0.02 mmol, 1 equiv)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 5 분 동안 탈기시키고, 23℃에서 1 시간 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 반응을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물 14a를 암갈색 고체로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(120 ㎕, 0.697 mmol)을 DMF(13.9 ㎖) 중의 BPheid-a(85 ㎎, 0.139 mmol), HATU(63.5 ㎎, 0.167 mmol)의 용액에 첨가하였다. 아르곤을 혼합물을 통하여 5 분 동안 버블링시키고, 암실에서 20 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 (S)-3-아미노-4-(tert-부톡시)-4-옥소부탄산(34 ㎎, 0.167 mmol)을 DMSO(5 ㎖) 중에 용해시켜 맑은 용액을 형성하였다(용액 B). 용액 B를 캐뉼라를 통하여 용액 A에 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(37)을 얻었다.
디이소프로필에틸아민(38 ㎕, 0.214 mmol)을 DMF(7.1 ㎖) 중의 화합물(37)(57 ㎎, 0.072 mmol), HATU(27.2 ㎎, 0.072 mmol)의 용액에 첨가하였다. 아르곤을 혼합물을 통하여 5 분 동안 버블링시키고, 암실에서 15 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 D-(α)-글루코사민·HCl(15.4 ㎎, 0.72 mmol)을 DMSO(2.5 ㎖) 중에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(25 ㎕, 0.143 mmol)을 첨가하였다(용액 B). 용액 B를 캐뉼라를 통하여 용액 A에 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하였다.
정제된 생성물(50 ㎎, 0.055 mmol)을 탈기시킨 TFA(3 ㎖) 중에 용해시키고, 아르곤 하에서 23℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 미정제 잔류물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(19a)을 암갈색 고체로서 얻었다.
시험관내 연구
<표 2>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 미토콘드리아-표적화된 변형된 PDT제의 효과
Figure pct00047
미토콘드리아-표적화된 BPheid-a 분자의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였다. 데이타는 EC50 값으로 보고하였다.
친유성 양이온성 분자 또는 양이온성 펩티드 또는, 미토콘드리아 내에서 표적에 선택적으로 결합되는 분자, 예컨대 당 등에 접합시켜 미토콘드리아 표적화제를 사용한 BPheid-a의 변형은 BPheid-a에 비하여 활성이 큰 화합물을 발견하였다. 특히, 14 및 26 둘다는 낮은 나노몰 범위(각각 3.7 nM 및 8.4 nM)에서 활성을 가지며, 암 세포를 죽이는데 있어서 활성이 컸다. 게다가, 화합물 9, 11b, 12b, 13 및 16은 또한 암 세포를 효과적으로 약화시키는데 있어서 효율적이었다. 이들 활성 화합물 대부분은 4급 암모늄[-N(+)(CH3)3] 또는 히드라지드[-NH-N(+)(CH3)3] 또는 트리페닐포스펜[-P(+)Ph3]으로서 양이온성 하전을 갖는다.
본 출원인은 또한 소수성 분자가 친수성 분자보다 활성이 더 크며, 예를 들면 화합물 9, 12b, 및 13은 11a 및 12a에 비하여 소수성이 더 크다는 점을 인지하였다. 화합물 11a 및 12a는 유리 카르복실산 기를 갖는 한편, 그러한 산 기는 화합물 9, 12b, 및 13에서의 소수성 보호기인 tert-부틸 기로 보호된다. 그러므로, 11a 및 12a는 9, 12b 및 13보다 친수성이 더 크다. 작용의 특정한 이론 또는 기전에 국소화되지는 않지만, 소수성 양이온은 혈장 및 미토콘드리아 내막을 통한 친유성 양이온의 이동으로 인하여 활성이 더 클 수 있다. 이는 막 통과를 위한 활성화 에너지를 효과적으로 낮추는 양이온의 커다란 소수성 표면적 및 커다란 이온 반경의 결과이다. 네른스트(Nernst) 방정식은 약 60 ㎷의 막 전위당 10배 증가되어 미토콘드리아 내에서 그의 수백배 흡수를 초래하는 친유성 양이온의 막 전위 의존성 흡수를 적절하게 기재한다.
본 출원인은 Pd 킬레이트 생성된 화합물이 그의 비-킬레이트 생성된 대응부보다 활성이 적다는 것을 관찰하였다(예, 9 대 10 및 26 대 27 및 30 대 31). 이는 Pd 금속에 의한 자유 라디칼 형성의 켄칭으로 인한 것일 수 있다.
마지막으로, 화합물 26을 제외하고, 친핵체를 사용한 5원 고리(케톤 기 및 메틸 에스테르를 가짐)의 개환은 PDT제의 활성 손실을 초래하거나 또는 효능을 감소시킨다.
(b) 생체내 연구
암 세포에 대한 본원의 미토콘드리아-표적화된 PS의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 14(암 세포에서 활성이 가장 큰 화합물)는 KB 종양을 갖는 누드 마우스에 그의 어깨에서 주사하고, IVIS 영상화기를 사용한 형광 영상화에 의하여 종양 축적을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 마우스의 피부 및 신장에서 화합물 14의 비특이성 흡수를 나타낸다. 신장에서의 형광은 또한 신장을 통한 약물의 제거율로 인한 것일 수 있다. 그러한 데이타로부터, 미토콘드리아를 표적화하는 BPheid-a의 변형이 세포 배양액 중에서 더 큰 활성 데이타를 산출하기는 하나, 생체내 데이타는 세포 배양액 데이타로서 유망하지 않은 것으로 보인다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포를 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 화합물(14)을 사용한 처치 개시 전에 약 50 ㎣로 성장하도록 하였다. 50 nmol의 화합물(14)를 주사한 후 3 시간(3 h)에, 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 14의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 14로 처치한 KB 종양은 <1 주의 2배 시간으로 자라서 2주 처치 기간 종반에 약 500 ㎣에 도달하였다. 이와 같은 생체내 효능의 부족은 불량한 용해도, 불량한 PK 성질 및 분자의 종양 표적화의 부재로 인한 것일 수 있다.
실시예 3. 핵- 표적화된 PDT제의 임상전 평가
본 실시예의 목적은 DNA 결합제, DNA 알킬화제 등에 접합시켜 핵을 표적화하기 위하여 BPheid-a를 변형시켜 암 세포에서의 핵-표적화된 변형된 BPheid-a 유사체의 광역학 치료 효능을 평가하고, 세포 배양액 중의 가장 활성이 큰 분자에 대한 종양 이종이식을 지닌 마우스에서 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
디이소프로필에틸아민(120 ㎕, 0.691 mmol)을 DMF(5 ㎖) 중의 N10-메틸-4-아미노-4-데옥시프테로산(75 ㎎, 0.23 mmol), HATU(88 ㎎, 0.23 mmol)의 용액에 첨가하고, 23℃에서 15 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 화합물(32-a)(47 ㎎, 0.23 mmol)을 DMSO(5 ㎖) 중에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(120 ㎕, 0.691 mmol)을 첨가하였다(용액 B). 용액 B를 용액 A에 캐뉼라에 의하여 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하였다. DMF(3.5 ㎖) 중의 (2-카르복시에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드(121 ㎎, 0.337 mmol). 반응 내용물을 23℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 에테르(500 ㎖)에 첨가하고, 침전된 고체를 건조시키고, 고 진공 하에서 건조시켜 화합물(53)을 진한 오일로서 얻었다.
화합물(53)(100 ㎎, 0.195 mmol)을 TFA (6 ㎖) 중에 용해시키고, 아르곤 하에서 23℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 미정제 잔류물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(55)을 황색 고체로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(30 ㎕, 0.175 mmol)을 DMF(5.8 ㎖) 중의 BPheid-a(35.6 ㎎, 0.058 ㎜ol), HATU(22.1 ㎎, 0.058 ㎜ol)의 용액에 첨가하고, 23℃에서 15 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 화합물(55)(24 ㎎, 0.058 ㎜ol)을 DMSO(5 ㎖) 중에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(30 ㎕, 0.175 mmol)을 첨가하였다(용액 B). 용액 B를 용액 A에 캐뉼라에 의하여 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(44)을 얻었다.
<표 3>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 핵-표적화된 변형된 PDT제의 효과
Figure pct00048
핵-표적화의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값에 따라 보고하였다.
핵-표적화제를 사용한 BPheid-a의 변형은 BPheid-a에 비하여 활성인 PS의 발견을 초래하였다. 본 출원인이 합성한 화합물 중에서, 화합물 41은 활성이 가장 크다. 그러한 BPheid-a 분자는 니트로겐 머스타드 알킬화제의 부류에 속하는 화학요법 약물로 변형시킨다. 그러한 DNA 알킬화제(멜팔란)는 이미다졸 고리의 7번 질소 원자와 반응할 수 있는 2개의 알킬 클로린 기를 지녀서 DNA 합성 및 세포 증식을 억제할 수 있다.
5. 폴레이트- 표적화된 방출성 BPheid -a 접합체의 임상전 평가
그룹 A: 방출성 링커 부분의 변화(상이한 방출 기전을 통한 유리 약물의 방출)
본 실시예의 목적은 상이한 조건 하에서 각종 방출성 링커를 통하여 상이한 방출성 기전으로 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 BPheid-a를 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화시키며, 암 세포에서 광역학 치료 효능을 평가하고, 세포 배양액 중의 활성이 가장 큰 분자에 대하여 종양 이종이식을 지니는 마우스에서 생체내 전신 영상화 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
합성
<반응식 11b>
Figure pct00049
폴레이트-Asp(SO3H)-Cys-SH 링커의 합성. 시약 및 조건: (a) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) Fmoc-Asp(SO3H)-OH, HATU, DMF/DIPEA, 2 h; b) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, HATU, DMF/DIPEA, 2 h; c) (i) 20% 피페리딘/DMF, r.t., 10 min; (ii) N10-TFA-프테로산, HATU, DMF/DIPEA, 2 h; d) TFA:H2O:TIPS:EDTA (92.5:2.5:2.5:2.5), 1 h.
하기 합성 반응식을 사용하였다:
1. L-Cys(Trt)-2-클로로트리틸 수지(700 ㎎, 0.49 mmol)를 디클로로메탄(DCM)(10 ㎖)에 이어서 디메틸포름아미드(DMF, 10 ㎖)로 팽창시켰다.
2. DMF 중의 20% 피페리딘의 용액(3×10 ㎖)을 수지에 첨가하고, 아르곤을 10 분 동안 매번 버블링시켰다.
3. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 DCM(1×10 ㎖)으로 5 분 동안 매번 세정하였다.
4. 카이저(Kaiser) 테스트를 수행하여 유리 아민의 형성을 측정하였다.
5. DMF(8 ㎖) 중의 Fmoc-Asp(SO3H)-OH(500 ㎎, 1.29 mmol), HATU(490 ㎎, 1.29 mmol) 및 DIPEA(448 ㎕, 2.58 ㎜ol)의 용액을 첨가하였다. 아르곤을 2 시간 동안 버블링시켰다.
6. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 DCM(1×10 ㎖)으로 5 분 동안 매번 세정하였다.
7. 카이저 테스트를 수행하여 커플링 효율을 측정하였다.
8. DMF 중의 20% 피페리딘의 용액(3×10 ㎖)을 수지에 첨가하고, 아르곤을 10 분 동안 매번 버블링시켰다.
9. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 DCM(1×10 ㎖)으로 5 분 동안 매번 세정하였다.
10. 카이저 테스트를 수행하여 유리 아민의 형성을 측정하였다.
11. DMF(8 ㎖) 중의 Fmoc-Glu-(α-OtBu)-OH(625 ㎎, 1.47 mmol), HATU(559 ㎎, 1.47 mmol) 및 DIPEA(6.0 equiv)의 용액을 첨가하였다. 아르곤을 2 시간 동안 버블링시켰다.
12. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 DCM(1×10 ㎖)으로 5 분 동안 매번 세정하였다.
13. 카이저 테스트를 수행하여 커플링 효율을 측정하였다.
14. DMF 중의 20% 피페리딘의 용액(3×10 ㎖)을 수지에 첨가하고, 아르곤을 10 분 동안 매번 버블링시켰다.
15. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 DCM(1×10 ㎖)으로 5 분 동안 매번 세정하였다.
16. 카이저 테스트를 수행하여 유리 아민의 형성을 측정하였다.
17. DMF(8 ㎖) 중의 Pte_10N-TFA-OH (600 g, 1.47 mmol), HATU(559 ㎎, 1.47 mmol) 및 DIPEA(6.0 equiv)의 용액을 첨가하였다. 아르곤을 2 시간 동안 버블링시켰다.
18. 수지를 DMF(3×10 ㎖) 및 이소프로판올(3×10 ㎖)로 5 분 동안 매번 세정하였다.
19. 카이저 테스트를 수행하여 커플링 효율을 측정하였다.
20. 수지를 DCM(10 ㎖)으로 팽창시켰다.
21. 최종 화합물을 트리플루오로아세트산 TFA:H2O:트리이소프로필실란(TIPS):EDT 칵테일(92.5:2.5:2.5:2.5)(3×10 ㎖×30 min)을 사용하여 수지로부터 분해시키고, 칵테일 세정액을 에테르(300 ㎖)에 교반하에 적가하여 담황색 침전물을 얻었다.
22. 침전된 고체를 여과하고, 에테르(5×50 ㎖)로 세정하고, 고 진공 하에서 건조시켜 원하는 화합물(70)을 회백색 고체로서 얻었다.
23.
<반응식 11c>
Figure pct00050
Figure pct00051
디술피드 활성화된 BPheid-a의 합성. 시약 및 조건: (a) i) MeOC(O)SCl/CH3CN, 0℃, 0.5 h; ii) 2,2/-디피리딜-디술피드/CH3CN, 0℃, 2 h; (b) i) 디포스겐, HOBt, TEA/ CH3CN, 0℃; ii) Δ/ 50℃, 24 h; (c) NH2NH2, DIPEA/ CH2Cl2, 0℃ 내지 실온, 45 min; (d) i) HATU, DIPEA/DMF, -15℃, 45 min; ii) 74, DMF, -15℃ 내지 실온, 45 min. Py=피리딜.
CH3CN(30.0 ㎖) 중의 메톡시카르보닐술페닐 클로라이드의 용액(3.1 ㎖, 34.25 mmol)에 0℃에서 CH3CN(1.0 ㎖) 중의 2-머캅토에탄올(2.4 ㎖, 34.25 mmol)을 적가하고, 반응 혼합물을 -10℃에서 30 분 동안 교반되도록 하였다. CH3CN(18.0 ㎖) 중의 2-티오피리딘(3.46 g, 31.13 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 2 시간 동안 환류시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 10℃에서 1 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 CH3CN으로 세정하고, 진공 하에서 실온에서 건조시켜 순수한 생성물(72)을 백색 고체(4.0 g, 57.5%)로서 얻었다.
CH3CN(35 ㎖) 중의 2-(피리딘-2-일-디술파닐)에탄올(2.0, 8.94 mmol), HOBT(1.58 g, 11.71 mmol) 및 TEA(1.25 ㎖, 8.94 mmol)의 용액에 0℃에서 디포스겐(0.72 ㎖, 5.98 ㎜ol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 24 시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, CH3CN으로 세정하고, 진공 하에서 실온에서 건조시켜 순수한 생성물(73)을 옅은 백색 고체(3.48 g, 95.7%)로서 얻었다.
CH2Cl2(5.0 ㎖) 중의 2-[벤조트리아졸-1-일-(옥시카르보닐옥시)-에틸디술파닐]-피리딘 히드로클로라이드(685 ㎎, 1.62 mmol) 및 DIPEA(600 ㎕, 3.4 mmol)의 용액에 0℃에서 히드라진을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15 분 동안 및 30 분 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과한 후, 미정제 화합물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, CH2Cl2 중의 2% MeOH)를 사용하여 정제하여 생성물(74)을 무색 오일(371 ㎎, 93.4%)로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(29 ㎕, 0.163 mmol, 2.4 equiv)을 DMF(3 ㎖) 중의 BPheid-a(화합물 2)(40 ㎎, 0.065 mmol, 1 equiv) 및 HATU(30 ㎎, 0.079 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 아르곤을 반응 혼합물을 통하여 5 분 동안 버블링시키고, 암실에서 20 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 화합물 74을 DMF 중에 용해시켜 맑은 용액 (용액 B)을 얻었다. 용액 B를 용액 A에 캐뉼라에 의하여 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(75a)을 얻었다.
<반응식 12>
Figure pct00052
(a) 시약 및 조건: (a) i) H2O/NaHCO3 (pH=7±0.2), 아르곤, r.t.; ii) 75a 또는 75b/ DMSO, 아르곤, r.t., 15 min.
DMSO(0.5 ㎖) 중의 화합물(75a)(8.5 ㎎, 0.0104 mmol, 1 equiv) 및 화합물(70)(18.3 ㎎, 0.02048 ㎜ol, 2 equiv)의 용액에 아르곤으로 탈기시키며, 23℃에서 아르곤 하에서 7 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(65a)을 암갈색 고체로서 얻었다.
시험관내 연구
<표 6>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00053
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된-BPheid-a 접합체의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값에 따라 보고하였다.
EC50은 절반의 최대 유효 농도이며, 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. EC50 값이 낮을수록 활성은 크다. 본 출원인은 EC50 <50 nM의 화합물은 활성인 것으로, EC50 <10 nM의 화합물은 활성이 매우 큰 것으로 간주한다.
폴레이트-표적화된 방출성 변형된 BPheid-a 접합체는 배양액 중의 암 세포에 대하여 활성이 크며, 특히 64, 65a 및 65c가 그러하다. 이는 약물 접합체의 더 높은 용해도가 세포에 더 많은 약물을 투입하게 하기 때문이다. 게다가, 약물 접합체는 폴레이트 수용체 매개된 세포내이입을 통하여 내재화되며, 약물을 엔도좀 내에 방출한다. 방출된 약물 분자는 필수 소기관으로 이동될 수 있다.
(a) 생체내 연구
(i) 시간 의존성 전신 영상화
암 세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 65a를 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a가 약물의 투여 1 시간 이내에 종양에 국소화되며, 그의 형광 성질을 손실하지 않으면서 24 시간에 걸쳐 종양 내에 잔존한다는 것을 시사한다. 화합물 65a는 FR-양성 종양에 대한 특이성이 컸으며, 기타 조직에서는 형광이 관찰되지 않아서 높은 종양 대 배경 비를 초래하였다. 게다가, 화합물 65a을 지닌 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)보다 형광성이 더 커서 59a보다 65a의 더 큰 수의 분자가 종양에 도달하였다는 것을 나타낸다. 그러한 증가된 약물동태학적 특성은 59a에 비하여 65a의 더 높은 용해도로 인한 것일 수 있다. 게다가, 암 세포 내부에서의 폴레이트 접합체의 방출은 유리 수용체 재순환율을 증가시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포 내부에서의 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a의 방출은 BPheid-a의 미토콘드리아 국소화를 증가시킬 수 있다.
(ii) FR -양성 KB 종양을 지니는 마우스에 대한 폴레이트- 표적화된 비방출성-BPhied-a의 효과
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포는 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol 또는 25 nmol의 화합물 65a 또는 65c를 사용한 처치 개시 전 약 50 ㎣로 성장하도록 하였다. 약물 주사후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 화합물 둘다는 KB 종양의 성장을 억제하였다. 65a 또는 65c로 처치한 마우스는 투여량(50 및 25 nmol) 둘다에서의 종양 퇴행을 나타냈으며, 이는 실험 기간 종반까지 유지되었다. 화합물 65a 및 65c에 대하여 제시된 데이타는 이들이 항종양 치료제로서 유망한 임상 후보라는 것을 나타낸다.
실시예 6. 폴레이트- 표적화된 방출성 BPheid -a 접합체의 임상전 평가
그룹 B: 약물의 생체이용률을 개선시키기 위한 수용성 링커 부분의 변동
본 실시예의 목적은 수용성 링커를 갖는 방출성 링커를 통하여 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 BPheid-a를 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화시키고, 암 세포에서의 광역학 치료 효능을 평가하며, 세포 배양액 중의 가장 큰 활성 분자에 대하여 종양 이종이식을 지니는 마우스에서 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
a) 합성
모든 화합물은 실시예 v에서 65a에 대하여 기재된 유사한 방법 및 절차를 사용하여 합성하였다.
b) 시험관내 연구
<표 7>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00054
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a 접합체의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값으로 보고하였다.
모든 화합물은 BPheid-a(1)에 비하여 활성이 크다. 화합물 65a, 65c, 76a 및 76c는 암 세포에 대하여 큰 효능이 있었다. 그러한 특이한 활성은 향상된 수용해도, 세포 내부에서의 약물의 방출, 폴레이트 매개된 세포내이입 및 미토콘드리아 국소화에 기인할 수 있다.
c) 생체내 연구
암 세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 76a & 76c를 KB 종양을 지니는 누드 마우스에게 그의 어깨에 주사하고, IVIS 영상화기를 사용한 형광 영상화에 의하여 종양 축적을 모니터링하였다(65a-c로부터의 유사한 실험에 대한 데이타는 실시예 v에 포함되었다). 시간 의존성 전신 영상은 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a는 약물 투여 1 시간 이내에 종양내에 주로 국소화되며, 종양에서는 24 시간에 걸쳐 그의 형광 성질을 손실하지 않으면서 남아있다는 것을 시사한다. 화합물 76a & 76c는 FR-양성 종양에 대한 특이성이 크며, 기타 조직에서는 형광이 관찰되지 않았다. 그래서, 상기 화합물은 형광의 유용하며 높은 종양 대 배경비를 생성한다. 게다가, 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)보다 형광이 더 크며, 이는 59a보다 76a & 76c의 더 큰 수의 분자가 종양 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 두 분자 모두 유사한 수의 친수성 작용기 및 유사한 용해도 성질을 가지므로, 활성에서의 차이는 암 조직 내의 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a의 방출에 기인할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포는 누드 마우스 암컷에게 피하 이식하고, 50 nmol의 76a-c를 사용한 처치 개시 전 약 50 ㎣로 성장하도록 하였다(65a-c로부터의 유사한 실험에 대한 데이타는 실시예 v에 포함되었다). 약물을 주사한 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 3종의 화합물 모두 KB 종양의 성장을 억제하였다. 그러나, 76c로 처치된 마우스는 더 긴 시간 동안 종양 퇴행을 나타냈으며, 이는 우수한 임상 후보에 대한 전망을 나타내는 것이 주목할만하다. 게다가, Pd-킬레이트 생성된 접합체 76b는 여전히 유효하기는 하나, 76a 및 76c에 비하여 마우스에서 활성이 더 적었다.
실시예 7: 폴레이트- 표적화된 방출성 비수다인 접합체의 임상전 평가
그룹 C: 약물의 생체이용률을 개선시키기 위한 수용성 링커 부분의 변화
본 실시예의 목적은 수용성 링커를 갖는 방출성 링커를 통하여 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 비수다인을 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화시키고, 암 세포에서의 광역학 치료 효능을 평가하며, 세포 배양액 중의 가장 큰 활성 분자에 대한 종양 이종이식을 지니는 마우스에서 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
a) 합성
모든 화합물은 실시예 V에서 65a에 대하여 기재된 바와 유사한 방법 및 절차를 사용하여 합성하였다.
b) 시험관내 연구
<표 8>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00055
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 비수다인 접합체의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값으로 보고하였다. 그러한 데이타는 3종의 접합체 81, 85, 및 87이 암 세포에서 활성이 없다는 것을 나타냈다.
(c) 생체내 연구
(80) 및 ( 86)을 사용한 FR 양성 KB 종양 이종이식의 시간 의존성 전신 영상화
암 세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 비수다인의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 80 & 86을 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 두 접합체가 약물 투여 1 시간 이내에 종양내에 주로 국소화되었다는 것을 시사한다. 그러나, 종양에서의 형광은 폴레이트-BPheid-a 접합체(59a, 65a, 76a & 76c)보다 적었다. 이는 BPheid-a 및 비수다인 사이의 광학 성질에서의 차이로 인한 것일 수 있다. 본 출원인은 80 및 86 둘다 마우스의 눈에 축적되었다는 것을 인지하였다. 비수다인이 눈에 축적되기 쉽다는 것은 문헌에 이미 발표되었다.
실시예 8: 폴레이트- 표적화된 방출성 BPheid -a 접합체의 임상전 평가
그룹 D: 암 세포 내에서 양이온성 BPheid -a 유사체(양으로 하전된 PDT제)의 방출
본 실시예의 목적은 수용성 링커를 갖는 방출성 링커에 의하여 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 BPheid-a를 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화시켜 세포 내에서 양이온성 BPheid-a 유사체를 궁극적으로 방출시키기 위함이다. 제2의 목적은 암 세포에서의 광역학 치료 효능을 평가하고, 세포 배양액 중의 가장 큰 활성 분자에 대한 종양 이종이식을 지니는 마우스에서의 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
<반응식 13>
Figure pct00056
엔도좀 중의 디술피드 환원제, 예컨대 글루타티온, 티오레독신 등의 존재하에 폴레이트-표적화된 자기-희생(self-immolative) 전구약물, 예컨대 65a로부터 양으로 하전된 변형된 PDT제의 디술피드 매개된 방출에 대한 가능한 기전
합성: 모든 화합물은 실시예 5에서 65a에 대하여 기재된 바와 유사한 방법 및 절차를 사용하여 합성하였다.
(b) 시험관내 연구
<표 9>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00057
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값으로 보고하였다.
대부분의 화합물은 비표적화된 BPheid-a(1)에 비하여 활성을 가졌다. 화합물 65a 및 89a는 이 그룹에서 큰 효능이 있으며, 88a 및 92a는 또한 활성 분자로서 간주될 수 있다.
(c) 생체내 연구
암 세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 89a을 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 2 시간 시점에서의 전신 영상은 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a(89a)가 종양내에 주로 국소화되어 있다는 것을 시시한다. 화합물 89a는 FR-양성 종양에 대하여 특이성이 크며, 기타 조직에서는 형광이 관찰되지 않아서 높은 종양 대 배경 비를 초래하였다. 게다가, 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)(및 비표적화된 BPheid-a 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a)보다 형광이 크다. 분자의 높은 용해도 및 방출은 여기서 차이를 생성할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시키는 KB 세포는 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 89a 또는 92a를 사용한 처치 개시 전 약 50 ㎣로 성장하도록 하였다. 약물을 주사한 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 화합물 둘다는 종양을 완전하게 감소시켰으며, 더 긴 시간 동안 종양 퇴행을 나타냈으며, 이는 우수한 임상 후보로서 전망을 나타낸다.
실시예 9: 폴레이트- 표적화된 방출성 BPheid -a의 임상전 평가
그룹 E: 암 세포 내에서의 쯔비터이온성 BPheid -a 유사체(중성 하전된 PDT제)의 방출
본 실시예의 목적은 수용성 링커를 갖는 방출성 링커를 통하여 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 BPheid-a를 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화하여 세포 내에서 중성 하전된 BPheid-a 유사체를 궁극적으로 방출하기 위함이다. 두번째 목적은 암 세포에서 광역학 치료 효능을 평가하고, 세포 배양액 중의 가장 큰 활성 분자에 대한 종양 이종이식을 지니는 마우스에서의 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
<반응식 14>
Figure pct00058
엔도좀 중의 디술피드 환원제, 예컨대 글루타티온, 티오레독신 등의 존재하에서 폴레이트-표적화된 자기-희생 전구약물, 예컨대 99로부터 쯔비터이온성 PDT제의 디술피드 매개된 방출에 대한 가능한 기전
(a) 합성
DIPEA(21 ㎕,0.123 mmol, 3 equiv)를 탈기시킨 DMF(2 ㎖) 중의 BPheid-a(25 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv) 및 HATU(15.5 ㎎, 0.041 mmol, 1 equiv)의 용액에 첨가하고, 내용물을 23℃에서 15 분 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 그 후, 탈기시킨 DMF(0.5 ㎖) 중의 5-아미노-1-(tert-부톡시)-N,N,N-트리메틸-1-옥소펜탄-2-아미늄 메틸 술페이트(35 ㎎, 0.054 mmol, 1 equiv)의 용액을 반응 용기에 넣었다. 반응 혼합물을 23℃에서 또 다른 1 시간 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 물을 첨가하여 커플링제를 파괴하고, 반응을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(16)을 암갈색 고체로서 얻었다.
화합물(16)(10 ㎎, 0.011 mmol)을 물(6 ㎖) 중의 탈기시킨 80% TFA 중에 용해시키고, 아르곤 하에서 23℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 미정제 잔류물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(18)을 암갈색 고체로서 얻었다.
디이소프로필에틸아민(29 ㎕, 0.163 mmol, 2.4 equiv)을 DMF(3 ㎖) 중의 BPheid-a(화합물 2)(40 ㎎, 0.065 mmol, 1 equiv) 및 HATU(30 ㎎, 0.079 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 아르곤을 반응 혼합물을 통하여 5 분 동안 버블링시키고, 암실에서 20 분 동안 교반하였다(용액 A). 또 다른 플라스크 내에서 2-(페닐디술파닐)에틸 히드라진카르복실레이트를 DMF 중에 용해시켜 맑은 용액(용액 B)을 형성하였다. 용액 B를 용액 A에 캐뉼라에 의하여 첨가하고, 내용물을 1 시간 동안 교반하였다. 완료시 반응 혼합물을 C18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC에 의하여 정제하여 화합물(4)를 얻었다.
(a) 시험관내 연구
<표 10>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00059
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 방법에 따라 사용하였으며, 데이타는 EC50 값에 따라 보고하였다.
본 출원인이 테스트한 3종의 화합물은 비표적화된 BPheid-a(1)에 비하여 활성을 갖는다. 화합물 99 및 100은 그룹 중에서 큰 효능이 있었다.
생체내 연구:
(i) ( 100)을 사용한 FR 양성 KB 종양 이종이식의 시간 의존성 전신 영상화
암 세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 100을 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a(100)가 1 시간 이내에 종양 내에 주로 국소화되어 있다는 것을 시사한다. 화합물 100은 FR-양성 종양에 대하여 특이성이 크며, 기타 조직에서는 형광이 관찰되지 않아서 높은 종양 대 배경 비를 초래하였다. 게다가, 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)(및 비표적화된 BPheid-a 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a)보다 형광이 크다. 분자의 더 높은 용해도 및 방출은 여기서 차이를 설명할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포를 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 99 또는 100을 사용한 처치의 개시 전 약 100 ㎣으로 성장하게 하였다. 약물 주사 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 화합물 둘다는 종양을 완전히 치유하였으며, 2 주 동안 종양 퇴행을 나타냈다.
실시예 10: 폴레이트- 표적화된 방출성 BPheid -a 접합체의 임상전 평가
그룹 F: 암 세포 내에서의 음이온성 변형된 BPheid -a 유사체(음으로 하전됨 )의 방출
본 실시예의 목적은 수용성 링커를 갖는 방출성 링커에 의하여 폴산(폴레이트, 비타민 B9)에 접합시켜 BPheid-a를 폴레이트 수용체 양성 종양 세포에 표적화하여 궁극적으로 세포 내에서 음전하 BPheid-a 유사체를 방출하기 위함이다. 두번째 목적은 암 세포에서의 광역학 치료 효능을 평가하고, 세포 배양액 중에서 가장 큰 활성 분자에 대한 종양 이종이식을 지니는 마우스에서의 생체내 전신 영상화 능력 및 PDT 효능을 평가하기 위함이다.
<반응식 15>
Figure pct00060
엔도좀 중의 디술피드 환원제, 예컨대 글루타티온, 티오레독신 등의 존재하에서 폴레이트-표적화된 자기-희생 전구약물, 예컨대 104로부터 쯔비터이온성 PDT제의 디술피드 매개된 방출에 대한 가능한 기전
(a) 시험관내 연구
<표 11>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00061
폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예 부문의 개시에서 하기 기재된 방법에 따라 사용하였으며, 데이타는 EC50 값에 따라 보고하였다.
화합물 64 및 104 둘다는 암 세포를 능동적으로 죽였다.
(a) 생체내 연구
(i) 전신 영상화
암세포에 대한 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 104를 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 시간 의존성 전신 영상은 폴레이트- 및 미토콘드리아-표적화된 방출성 BPheid-a(104)가 1 시간 이내에 종양 내에 주로 국소화되어 있다는 것을 시사한다. 화합물 104은 FR-양성 종양에 대하여 특이성이 크며, 기타 조직에서는 형광이 관찰되지 않았다. 그래서, 화합물 104는 높은 종양 대 배경 비를 생성하는데 유용하다. 게다가, 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)(및 비표적화된 BPheid-a 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a)보다 더 큰 형광을 나타냈다. 분자의 더 높은 용해도 및 방출은 그러한 차이를 설명할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포를 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 104를 사용한 처치 개시 전 약 20 ㎣로 성장하도록 하였다(화합물 64에 대한 유사한 데이타가 상기 실시예에서 보고된다). 약물 주사 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 화합물 64 및 104는 종양을 완전하게 치유할 수 있으며, 2 주 종안 종양 퇴행을 나타냈다. 화합물 둘다 임상적 후보로서 간주될 수 있다.
실시예 11. 폴레이트- 표적화된 방출성 BPhied -a의 임상전 평가
그룹 G: 기타
(a) 시험관내 연구
<표 12>
배양액 중의 KB 세포의 생존에 대한 폴레이트-표적화된 약물 농도의 효과
Figure pct00062
폴레이트- 및 핵-표적화된 BPheid-a의 시험관내 효능을 측정하기 위하여, KB 세포를 실시예의 개시에서 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며, 데이타는 EC50 값에 따라 보고하였다.
(a) 생체내 연구
(i) 전신 영상화
암 세포에 대한 폴레이트- 및 핵-표적화된 방출성 BPheid-a의 특이성을 설정하기 위하여, 화합물 112a를 KB 종양을 지니는 누드 마우스에 그의 어깨에 주사하고, 형광 영상화에 의하여 IVIS 영상화기를 사용하여 종양 축적을 모니터링하였다. 전신 영상은 폴레이트- 및 핵-표적화된 방출성 BPheid-a(112a)가 주로 종양 내에 국소화되었다는 것을 시사한다. 화합물 112a는 FR-양성 종양에 대하여 특이성이 크며, 기타 조직에서는 형광이 존재하지 않았다. 그래서, 그러한 화합물은 높은 종양 대 배경 비를 생성한다. 게다가, 종양은 폴레이트-표적화된 비방출성 BPheid-a 접합체(59a)(및 비표적화된 BPheid-a 및 미토콘드리아-표적화된 BPheid-a)보다 형광이 더 컸다. 분자의 더 높은 용해도 및 방출은 여기서 차이를 생성할 수 있다.
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB 세포를 누드 마우스 암컷에 피하 이식하고, 50 nmol의 117을 사용한 처치 개시 전 약 20 ㎣으로 성장하도록 하였다. 약물을 주사한 후 3 시간(3 h)에 종양을 레이저 빔(75 ㎽/㎠, 137 J/㎠, 노출 직경=7.5-8 ㎜)으로 38 분 동안 처치하였다. 접합체의 생체내 효능은 종양 부피의 감소를 모니터링하여 평가하였다. 화합물 117은 종양을 완전하게 치유할 수 있으며, 3 주 동안 종양 퇴행을 나타냈다.

Claims (77)

  1. 하기 화학식을 갖는 광역학 치료 화합물 또는 그의 약학적 허용 가능한 염, 또는 그의 동위원소:
    Figure pct00063

    상기 식에서,
    L은 아미노산이며,
    L'는 약물동태학적 특성을 개선시키는 링커이며,
    L"는 소기관-표적화된 광역학 치료(PDT)제를 방출하는 방출성 링커이며,
    X는 소기관-표적화제이며,
    Y는 광역학 치료제이다.
  2. 제1항에 있어서, Y는
    Figure pct00064
    ,
    Figure pct00065
    ,
    ,
    Figure pct00067
    ,
    Figure pct00068
    ,
    Figure pct00069
    ,
    Figure pct00070
    ,
    Figure pct00071
    ,
    Figure pct00072
    (16),
    Figure pct00073
    ,
    Figure pct00074
    ,
    Figure pct00075
    ,
    Figure pct00076
    ,
    Figure pct00077
    ,
    Figure pct00078
    ,
    Figure pct00079
    ,
    Figure pct00080
    ,
    Figure pct00081
    ,
    Figure pct00082
    ,
    Figure pct00083
    ,
    Figure pct00084
    ,
    Figure pct00085
    ,
    Figure pct00086
    ,
    Figure pct00087
    ,
    Figure pct00088
    ,
    Figure pct00089
    ,
    Figure pct00090
    ,
    Figure pct00091
    ,
    Figure pct00092
    및
    Figure pct00093
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, Y는 가시 스펙트럼에서 흡수 및 방출 최대치를 갖는 것인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, Y는 약 680 ㎚ 내지 약 800 ㎚의 흡수 및 방출 최대치를 갖는 것인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, Y는 높은 소광 계수(€max)를 갖는 화합물.
  6. 제5항에 있어서, Y는 약 50,000 내지 약 100,000 M- 1 ㎝-1 범위 내에 있는 €max를 갖는 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, Y는 높은 단일항 산소 양자 수율(ΦΔ)을 갖는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 화합물은
    Figure pct00094
    ,
    Figure pct00095
    ,
    Figure pct00096
    ,
    Figure pct00097
    ,
    Figure pct00098
    ,
    Figure pct00099
    ,
    Figure pct00100
    ,
    Figure pct00101
    ,
    Figure pct00102
    ,
    Figure pct00103
    ,
    Figure pct00104
    ,
    Figure pct00105
    ,
    Figure pct00106
    ,
    Figure pct00107
    ,
    Figure pct00108
    ,
    Figure pct00109
    ,
    Figure pct00110
    ,
    Figure pct00111
    ,
    Figure pct00112
    ,
    Figure pct00113
    ,
    Figure pct00114
    ,
    Figure pct00115
    ,
    Figure pct00116
    ,
    Figure pct00117
    ,
    Figure pct00118
    ,
    Figure pct00119
    ,
    Figure pct00120
    ,
    Figure pct00121
    ,
    Figure pct00122
    ,
    Figure pct00123
    ,
    Figure pct00124
    ,
    Figure pct00125
    ,
    Figure pct00126
    ,
    Figure pct00127
    ,
    Figure pct00128
    ,
    Figure pct00129
    ,
    Figure pct00130
    ,
    Figure pct00131
    ,
    Figure pct00132
    ,
    Figure pct00133
    ,
    Figure pct00134
    ,
    Figure pct00135
    ,
    Figure pct00136
    , 및 이들의 칼륨, 나트륨 또는 암모늄 염을 갖는 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 화합물은 조직 세포 중의 그의 분포 후 형광을 띠는 것인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 화합물은 근적외선 파장의 여기 광으로 화합물을 처리함으로써 형광을 띠는 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 화합물은 폴레이트 수용체에 대한 폴산의 결합 친화도와 유사한 폴레이트 수용체 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 것인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 화합물은 종양 세포로의 표적화에 대하여 큰 선택성을 갖는 것인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, L은 아미노산 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 글루탐산, 아스파르트산, 리신, 오르니틴, 시스테인, 세린, 아르기닌, 및 그의 이성질체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 알파 아미노산, 호모 아미노산 및 베타 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 아미노산은 단일 또는 디펩티드 결합을 통하여 프테로일 리간드에 접합되는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, L'는 폴리에테르, 술폰산, 글리칸, 아미노산 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리옥시에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  19. 제17항에 있어서, 술폰산 및 그의 유도체는
    Figure pct00137

    Figure pct00138
    및
    Figure pct00139
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  20. 제17항에 있어서, 글리칸 및 그의 유도체는
    Figure pct00140
    ,
    Figure pct00141
    및
    Figure pct00142
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  21. 제17항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 자연 발생 아미노산 또는 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 알파 아미노산, 호모 아미노산, 베타 아미노산, 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 양전하 측쇄를 포함하는 아미노산 또는 아미노산 유도체는 아르기닌, 리신, 오르니틴, 히스티딘 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  24. 제22항에 있어서, 음전하 측쇄 기를 포함하는 아미노산 또는 아미노산 유도체는 아스파르트산, 글루탐산, 그의 이성질체 또는 유도체인 화합물.
  25. 제21항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 황-함유 측쇄 기를 포함하는 것인 화합물.
  26. 제29항에 있어서, 황-함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산 또는 아미노산 유도체는 시스테인인 화합물.
  27. 제21항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 유도체는 칼코겐-함유 측쇄 기를 포함하는 것인 화합물.
  28. 제31항에 있어서, 칼코겐-함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산 또는 아미노산 유도체는 셀레노시스테인인 화합물.
  29. 제1항에 있어서, L"는 방출성 링커 또는 비방출성 링커 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  30. 제33항에 있어서, 방출성 링커 및 그의 유도체는
    Figure pct00143
    ,
    Figure pct00144
    ,
    Figure pct00145
    ,
    Figure pct00146
    ,
    Figure pct00147
    ,
    Figure pct00148
    ,
    Figure pct00149
    ,
    Figure pct00150
    ,
    Figure pct00151
    ,
    Figure pct00152
    ,
    Figure pct00153
    및
    Figure pct00154
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  31. 제1항에 있어서, X는 병든 세포 내의 소기관에 대하여 표적화하는 소기관 표적화제인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 소기관 표적화제는 상기 PDT제를 병든 세포의 미토콘드리아에 대하여 표적화하는 것인 화합물.
  33. 제32항에 있어서, 미토콘드리아-표적화된 PDT제는
    Figure pct00155
    ,
    Figure pct00156
    ,
    Figure pct00157
    ,
    Figure pct00158
    ,
    Figure pct00159

    Figure pct00160
    ,
    Figure pct00161
    (16),
    Figure pct00162
    ,
    Figure pct00163
    ,
    Figure pct00164
    ,
    _
    Figure pct00165
    ,
    Figure pct00166
    ,
    Figure pct00167
    ,
    Figure pct00168
    ,
    Figure pct00169
    ,
    Figure pct00170
    ,
    Figure pct00171
    및
    Figure pct00172
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  34. 제31항에 있어서, 소기관 표적화제는 상기 PDT제를 병든 세포의 핵에 대하여 표적화하는 것인 화합물.
  35. 제34항에 있어서, 핵-표적화된 PDT제는
    Figure pct00173
    ,
    Figure pct00174
    ,
    Figure pct00175
    ,
    Figure pct00176
    ,
    Figure pct00177
    ,
    Figure pct00178
    ,
    Figure pct00179
    ,
    Figure pct00180
    ,
    Figure pct00181
    및
    Figure pct00182
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  36. 제1항의 화합물 및 약학적 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  37. 폴레이트 수용체를 발현시키는 생물학적 조직 상에서 광역학 요법을 수행하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 조직을 제1항의 조성물과 접촉시키는 단계,
    (b) 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내에서 분배되며, 비표적화된 조직으로부터 제거될 수 있는 시간을 허용하는 단계;
    (c) 조직을 화합물에 의하여 흡수 가능한 파장의 여기 광으로 조사하는 단계
    를 포함하고, 상기 조성물은 반응성 산소종(ROS)을 생성함으로써 병든 세포의 세포사 및 괴사를 유도하여 생물학적 조직을 파괴하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 조직은 피험체에 존재하며, 피험체는 동물 또는 사람인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 생물학적 조직은 수용체를 과발현시키는 질환을 갖는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 병든 세포는 악성 세포, 종양-관련 대식세포 및 골수양-유래 억제인자 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 발현시키는 폴레이트 수용체인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 질환은 암, 신경변성 질환, 호흡 질환, 대사 질환, 유전 질환, 골 질환, 환경 질환 및 피부 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 조직은 폴레이트 수용체를 발현시키는 암 또는 림프절인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 암은 난소암, 폐암, 자궁내막암, 자궁암, 유방암, 신장암, 간암, 방광암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 뇌하수체암, 갑상선암, 자궁경부암, 중피종 암, 뇌암, 두경부암, 전립선암, 고환암, 피부암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 암은 난소암인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 암은 폐암인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 암은 자궁내막암인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 암은 자궁암인 방법.
  48. 제42항에 있어서, 암은 유방암인 방법.
  49. 제42항에 있어서, 암은 신장암인 방법.
  50. 제42항에 있어서, 암은 자궁경부암인 방법.
  51. 제37항에 있어서, 조직 또는 림프절은 폴레이트 수용체를 발현시키는 종양-관련 대식세포를 갖는 종양 조직인 방법.
  52. 제37항에 있어서, 여기 광은 근적외선 파장 광인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 여기 광 파장은 약 600 내지 약 1,000 나노미터 범위 내에 있는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 여기 광 파장은 약 670 내지 약 850 나노미터 범위 내에 있는 것인 방법.
  55. 제1항의 화합물을 포함하는 키트.
  56. 제55항에 있어서, 질환은 암, 신경변성 질환, 호흡 질환, 대사 질환 및 피부 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  57. 제55항에 있어서, 제1항의 화합물의 유도체를 더 포함하는 키트.
  58. 화합물 9, 화합물 11a, 화합물 11b, 화합물 12b, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15, 화합물 26, 화합물 27, 화합물 41, 화합물 58a, 화합물 59a, 화합물 60a, 화합물 64, 화합물 65a, 화합물 65c, 화합물 76a, 화합물 76c, 화합물 88a, 화합물 89, 화합물 92a, 화합물 99, 화합물 100, 화합물 104, 화합물 112a, 화합물 112b, 화합물 116 및 화합물 117로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  59. Figure pct00183
    ,
    Figure pct00184
    ,
    Figure pct00185
    ,
    Figure pct00186
    ,
    Figure pct00187
    ,
    Figure pct00188
    ,
    Figure pct00189
    ,
    Figure pct00190
    ,
    Figure pct00191
    ,
    Figure pct00192
    ,
    Figure pct00193
    ,
    Figure pct00194
    ,
    Figure pct00195
    ,
    Figure pct00196
    ,
    Figure pct00197
    ,
    Figure pct00198
    ,
    Figure pct00199
    ,
    Figure pct00200
    ,
    Figure pct00201
    ,
    Figure pct00202
    ,
    Figure pct00203
    ,
    Figure pct00204
    ,
    Figure pct00205
    ,
    Figure pct00206
    및
    Figure pct00207
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  60. 폴레이트 수용체를 발현시키는 생물학적 조직 상에서 광역학 요법을 수행하는 방법으로서,
    (a) 폴레이트 수용체를 발현시키는 생물학적 조직을 제59항의 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내에 분배될 수 있는 시간을 허용하는 단계;
    (c) 조직을 화합물에 의하여 흡수 가능한 파장의 여기 광으로 조사하는 단계
    를 포함하고, 조성물은 반응성 산소종(ROS)을 생성함으로써 병든 세포의 세포사 및 괴사를 유발하여 생물학적 조직을 파괴하는 것인 방법.
  61. 고형 암을 치료하는 방법으로서, 상기 고형 종양에 제72항의 화합물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 일단 상기 화합물이 상기 종양에 분포된 후에 상기 화합물을 조사하여 세포사, 세포 감소를 생성하거나 또는 달리 상기 고형 암의 치료를 실시하는 조사 단계를 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 종양은 상기 조성물의 투여 이전에, 이후에 또는 동시에 절개되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 병든 조직은 OTL38(폴레이트-수용체 표적화된 NIR 염료)의 보조에 의해 시각화되고, OTL38은
    Figure pct00208
    의 구조 또는 그의 라세미 혼합물을 가지며, 여기서
    X는
    Figure pct00209
    및
    Figure pct00210
    또는 그의 라세미 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    Y는 화학식
    Figure pct00211
    에 의하여 나타나며, 여기서
    R1은 O, S, NH, CH2 및 CH2CH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R2는 CH2 및 CH2CH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 생물학적 조직은 피험체 내에 존재하며, 피험체는 동물 또는 사람인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 생물학적 조직은 수용체를 과발현시키는 질환을 갖는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 질환은 폴레이트 수용체를 발현시키며, 악성 세포, 염증성 세포 및 미생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 내에 존재하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 질환은 암, 염증성 질환, 면역학적 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 신경변성 질환, 호흡 질환, 대사 질환, 유전 질환, 감염 질환, 골 질환, 환경 질환 및 피부 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 조직은 폴레이트 수용체를 발현시키는 암 또는 림프절인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 암은 난소암, 폐암, 자궁내막암, 자궁암, 유방암, 신장암, 간암, 방광암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 뇌하수체암, 갑상선암, 자궁경부암, 중피종 암, 뇌암, 두경부암, 전립선암, 고환암, 피부암 및 식도암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 암은 난소암인 방법.
  71. 제68항에 있어서, 암은 폐암인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 암은 자궁내막암인 방법.
  73. 제68항에 있어서, 암은 자궁암인 방법.
  74. 제68항에 있어서, 암은 유방암인 방법.
  75. 제68항에 있어서, 암은 신장암인 방법.
  76. 제68항에 있어서, 암은 자궁경부암인 방법.
  77. 제68항에 있어서, 조직 또는 림프절은 폴레이트 수용체를 발현시키는 종양-관련 대식세포를 갖는 종양 조직인 방법.
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