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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1, eine Vorrichtung nach dem nebengeordneten Anspruch, eine Verwendung einer solchen Vorrichtung und ein Verfahren nach dem nebengeordneten Anspruch.
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Stand der Technik
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Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, dass eine Entfernung zweier Objekte auf der Nanometerskala mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden kann. Hierzu werden beispielsweise FRET-Paare (FRET: Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer) eingesetzt. Die FRET-Paare umfassen ein Fluorophor und einen Akzeptor, wobei aufgrund einer gemessenen Energietransfereffizienz zwischen den beiden FRET-Elementen die Entfernung abgeschätzt werden kann. Die Wirkungsradien in solchen FRET-Paare sind jedoch stark begrenzt, in der Regel lassen sich hiermit Entfernungen im Bereich zwischen 3 nm–10 nm bestimmen. Abstandsänderungen außerhalb dieses Bereichs können nicht oder schlecht erfasst werden.
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Aus der
US 2003/0207248 A1 ist es bekannt, FRET zur Positionsbestimmung von Zellen einzusetzen. Die
US 2006/0228708 A1 schlägt vor, an Ribosomen Fluorophore oder „quantum dots” anzubringen, um die Proteinsynthese in Echtzeit zu verfolgen.
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Offenbarung der Erfindung
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zum Erfassen einer Weggröße, insbesondere im Nanometerbereich anzugeben, wobei vorzugsweise die Begrenzung auf einen kleinen Messbereich aufgehoben werden soll.
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Zur Lösung der Aufgabe führen die Vorrichtungen des Hauptanspruchs 1 und des nebengeordneten Vorrichtungsanspruchs. Besonders bevorzugt sind Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung in der Lage, Weggrößen zur erfassen oder Abstände zwischen zwei Objekten im Raum zu erfassen, die kleiner sind als 2 nm, besonders bevorzugt kleiner als 1 nm, Typische Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung erreichen eine Dynamik, d. h. größtmögliche, erfassbare Weggröße von mehr als 10 nm, bevorzugter mehr als 20 nm. Damit werden die Bereiche der herkömmlichen FRET-Messung deutlich verlassen.
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Entscheidend ist das Vorsehen weiterer Bausteine für FRET-Paare oder für Metall-Nanopartikel, deren Plasmonen-Resonanzfrequenz sich in Abhängigkeit ihrer Umgebung ändern. Durch das Vorsehen der weiteren Partikel, d. h. eines weiteren Fluorophors, eines weiteren Akzeptors oder eines weiteren Metall-Nanopartikels, wird erreicht, dass eine Auflösung verbessert werden kann, besonders bevorzugt durch die Anwendung in der Funktionsweise eines Messschiebers.
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Erfindungsgemäße Verfahren erfassen ein Zusammenwirken des Fluorophors mit dem Akzeptor, um einen Indikator für eine relative Position der beiden Elemente zu ermitteln. Dies geschieht wie im Stand der Technik bekannt durch Erfassen der Fluoreszenz, bevorzugt mit einem Fluoreszenzspektrometer und besonders bevorzugt mit einem Fluoreszenzmikroskop, das die Beobachtung einzelner Messvorrichtungen ermöglicht. Bevorzugt ist die Erfassungseinrichtung ausgebildet, so dass zumindest zwei Wellenlängen auflösbar sind. Aus der so ermittelten Fluoreszenz der FRET-Paare kann auf eine Positionierung der einzelnen Partikel (Fluorophor, Akzeptor oder bei der Metall-Nanopartikel-Anwendung: Metall-Nanopartikel) geschlossen werden.
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Erfindungsgemäß sind auf dem ersten Element eine Mehrzahl von Fluorophoren und auf dem zweiten Element eine Mehrzahl von Akzeptoren angeordnet. Dadurch wird die Auflösung oder die Dynamik weiter vergrößert. Eine Vergrößerung der Dynamik, d. h. des maximalen Messbereichs für Weggrößen, wie insbesondere eine Abstandsänderung, wird erreicht, indem zumindest auf einem Element in Abständen von etwa mindestens 10 nm wiederholt Fluorophore oder Akzeptoren angeordnet werden. Besonders bevorzugt wird auf diese Weise erreicht, dass eine Messung von Abstandsänderungen im Bereich zwischen 1 und 100 nm unter Ausnutzung von FRET ermöglicht wird.
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Bei der Erfindung sind die Mehrzahl von Fluorophoren und die Mehrzahl von Akzeptoren auf den jeweiligen Elementen jeweils auf einer Trajektorie angeordnet, deren Kontur einer zu erfassenden Weggröße entspricht. Die zu erfassende Weggröße ist vorzugsweise eine definierte Kurve, beispielsweise eine Gerade oder ein Kreisbogenabschnitt. Kreisbogenabschnitte eignen sich dazu, Winkelverschiebungen oder Drehungen zwischen den Elementen zu messen.
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Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weisen mehr als zwei Elemente auf, wobei bevorzugt die Elemente wiederum entsprechend der Trajektorien ausgerichtet sind, sodass die zu erfassenden Messgrößen optimal erfasst werden können. Besonders bevorzugt wird für eine geradlinige Messanordnung eine parallele Anordnung der Elemente, besonders bevorzugt wird eine Anordnung mit einem Element in der Mitte, welches von zwei Elementen beidseits eingerahmt wird.
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Vorzugsweise umfasst die Mehrzahl von Fluorophoren unterschiedliche Fluorophore oder die Mehrzahl von Akzeptoren unterschiedliche Akzeptoren. Auf diese Weise wird erreicht, dass sich nicht wiederholend Fluoreszenz-Bilder ergeben, welche schwer auseinanderzuhalten sind. Durch die Verwendung von unterschiedlichen FRET-Paaren wird erreicht, dass die Dynamik und die Auflösung stark erhöht werden können.
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Vorteilhafterweise sind die Fluorophoren und die Akzeptoren ausgewählt und angeordnet, sodass aus der erfassten Wechselwirkung der Fluorophoren und der Akzeptoren eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist. Besonders bevorzugt ist die relative Position innerhalb eines vorbestimmten Messbereichs eindeutig ermittelbar. Der Messbereich hat vorzugsweise eine Auflösung von maximal 2 nm, noch bevorzugter maximal 1 nm und noch bevorzugter 0,5 nm oder 0,1 nm. Weitere typische Ausführungsformen der Erfindung haben vorzugsweise einen Messbereich von mehr als 15 nm, besonders bevorzugt mehr als 20 nm oder mehr als 50 nm. Eine Möglichkeit einer solchen Anordnung ist, zur Erhöhung der Auflösung eine Anordnung nach der Funktionsweise eines Messschiebers zu schaffen, wobei FRET-Paare derart auf den beiden Elementen angeordnet werden, sodass bei einer Verschiebung der Elemente relativ zueinander mehrere FRET-Paare gleichzeitig wechselwirken, jeweils in anderen Bereichen ihres Messbereichs.
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Analog ist eine solche Anordnung auf Trajektorien für Metall-Nanopartikel vorteilhaft. Ebenso sind vorteilhafte Ausführungsformen von der Erfindung umfasst, welche Metall-Nanopartikel auf den beiden Elementen angeordnet haben, wobei die Auswahl der Metall-Nanopartikel und die Anordnung der Metall-Nanopartikel derart erfolgt, dass aus der erfassten Wechselwirkung der Metall-Nanopartikel eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist, insbesondere innerhalb des Messbereichs, für welchen die oben genannten bevorzugten Grenzen gelten.
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Vorzugsweise sind der Fluorophor und der Akzeptor für einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer geeignet. Dies bietet den Vorteil einer leicht zu erfassenden Wechselwirkung, für welche verschiedene Paarungen mit verschiedenen abgegebenen Farbspektren bekannt sind, sodass durch Kombinationen mehrerer FRET-Paare eine Genauigkeitsverbesserung oder Messbereichsvergrößerung erreicht werden kann.
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Bevorzugte Metall-Nanopartikel für Ausführungsformen der Erfindung weisen die Eigenschaft auf, dass sich ihre Plasmonen-Resonanzfrequenz in Abhängigkeit ihrer Umgebung ändern, insbesondere in Abhängigkeit der Anwesenheit eines weiteren Metall-Nanopartikels. Vorzugsweise wird durch die Erfassungseinrichtung ein Streuspektrum der Metall-Nanopartikel erfasst. Metall-Nanopartikel, welche für typische Ausführungsformen der Erfindung benutzt werden sind Silber-Nanopartikel, welche ein Streuspektrum mit einem Maximum bei 450 nm aufweisen. Bei zwei benachbarten Silber-Nanopartikeln verschiebt sich das Maximum zu 550 nm. Durch die Analyse des Streuspektrums der Nanopartikel lässt sich daher eine Aussage darüber machen, wie die Nanopartikel relativ zueinander angeordnet sind. Durch Vorsehen von verschiedenen oder mehreren Nanopartikeln kann auf diese Weise analog zu der vorherigen Beschreibung der FRET-Paare eine Weggrößenmessung an zwei Elementen vorgenommen werden. Besonders bevorzugt umfasst die Mehrzahl von Metall-Nanopartikeln unterschiedliche Metall-Nanopartikel. Dabei bedeutet unterschiedlich unterschiedliche Größe oder eine unterschiedliche Art von Metall. Vorzugsweise sind die Metall-Nanopartikel wiederum so ausgewählt und dann in Elementen angeordnet, dass aus der erfassten Wechselwirkung der Metall-Nanopartikel eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist, insbesondere in dem Messbereich.
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Bevorzugte Elemente der typischen Ausführungsformen der Erfindung sind länglich ausgebildet oder im Wesentlichen starr ausgebildet. Dabei bedeutet im Wesentlichen starr, dass bei Einsatz der Elemente zum Erfassen einer Weggröße keine das Messergebnis beeinträchtigenden Verformungen der Elemente geschehen.
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Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weisen Elemente auf, welche DNA umfassen, besonders bevorzugt sind die Elemente zumindest im Wesentlichen aus doppelsträngiger DNA aufgebaut. Besonders bevorzugt bestehen die Elemente aus doppelsträngiger DNA und den genannten Partikeln wie FRET-Partikeln oder Metall-Nanopartikeln. Die doppelsträngige DNA für das Element bietet den Vorteil, dass sie vergleichsweise starr ist. Besonders bevorzugt werden Kombinationen von doppelsträngiger DNA, die im Sinne eines DNA-Origamis zusammengebaut sind. Zur Erläuterung des Begriffs DNA-Origami wird auf den Artikel Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M.: ”Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.”, Nature 459, 414–418 (2009) verwiesen. Die DNA-Origami-Struktur bietet den Vorteil, dass sie besonders starr ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt sind die Elemente mit einer äußeren Form aufgebaut, die eine Kontur entsprechend der zu erfassenden Weggröße aufweist.
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Entlang dieser Kontur sind vorzugsweise Partikel (FRET-Partikel oder Metall-Nanopartikel) angeordnet.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Elemente mittels einer Kupplung aus einzelsträngiger DNA gekoppelt. Dies bietet den Vorteil, dass die Elemente für die beabsichtigte Messung vorpositioniert werden können. Einzelsträngige DNA bietet dabei den Vorteil, dass sie einer Verformung einen äußerst geringen Widerstand entgegensetzt, sodass durch die einzelsträngige DNA, die Messung nicht verfälscht wird.
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Vorzugsweise werden die Elemente mit einer Kupplung, beispielsweise einer einzelsträngigen DNA an einem Fixpunkt gehalten, bevorzugt durch Anbindung an eine Oberfläche, insbesondere eine Glasoberfläche. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Lösung durchgeführt. Bei bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird die Messung oder die Erfassung der Fluoreszenz oder der Streuung der Metall-Nanopartikel wiederholt durchgeführt, um Veränderungen oder Geschwindigkeiten zu ermitteln. Vorzugsweise werden die DNA-Origami Strukturen mit einem Selbstassemblierungsprozess hergestellt, wobei die Fluorophoren und die Akzeptoren während dieses Prozesses in die Struktur integriert werden. Analog werden Metall-Nanopartikel während des Selbstassemblierungsprozesses in die DNA-Origami Struktur integriert. Besonders bevorzugt sind die beiden Elemente steif aus DNA-Origami Strukturen aufgebaut, die parallel aneinander entlang gleiten können. Dies bietet den Vorteil einer besonders effizienten Messung entlang einer Dimension.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung in einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen oder bevorzugten Ausführungsform, um einen Abstand zwischen zwei Objekten zu ermitteln, wobei an jedem der Objekte jeweils eines der zwei Elemente angeordnet ist. Weitere vorteilhafte Anwendungen sind die Ermittlungen einer Winkellage zwischen zwei Objekten. Bei Ermittlung einer Winkellage kann es vorteilhaft sein, die Elemente in einer Bogenform auszubilden, sodass die Verschiebungen beispielsweise einer Messschieber-ähnlichen Skala entlang der Bogenform auftreten.
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Besonders bevorzugt wird die Verwendung zur Abstandsermittlung zwischen Zellkomponenten einer lebenden Zelle, insbesondere innerhalb der lebenden Zelle, oder eine Abstandsermittlung zwischen Zellmembranen zweier benachbarter Zellen oder einer Abstandsermittlung zwischen einem Element der extrazellulären Matrix und einer Zellmembran oder einer Abstandsermittlung zwischen zwei Elementen der extrazellulären Matrix. Dies sind Bereiche, die bisher schwer mit Weggrößen-Ermittlungen zugänglich waren.
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In dieser Anmeldung ist der Ausdruck Weggröße allgemein zu verstehen, so sind unter Weggrößen alle Arten von Weggrößen, insbesondere auch Winkel und Abstände eingeschlossen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen einer Position eines ersten Elements relativ zu einem zweiten Element. Diese Bestimmung kann auch als eine Bestimmung einer Weggröße aufgefasst werden.
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Für die erfindungsgemäßen Verfahren und bevorzugten Verfahren gelten die oben im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Vorrichtungen und bevorzugten Vorrichtungen erläuterten Merkmale analog, wobei sich analoge Vorteile ergeben.
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Durch die geeignete Anordnung einer Vielzahl von FRET Paaren (bzw. Fluorophor-Quencher Paaren) unterschiedlicher Farben oder von Nanopartikeln entlang einer »Skala« kann eine präzise Messung von Abstandsänderungen in Bereichen zwischen einem und fünfhundert Nanometern ermöglicht werden. Die Skala kann aus zwei oder mehr steifen Elementen bestehen, die parallel gegeneinander verschoben werden können. Analog zur Funktionsweise eines Messschiebers kann jede Auslenkung der Elemente gegeneinander eine einzigartige Kombination opponierender FRET-Paare (oder Nanopartikelpaare) bewirken. Steht ein Farbstoff einem geeigneten Energietransferpartner gegenüber, wird seine Fluoreszenz gequencht. Ein frei stehender Farbstoff fluoresziert hingegen. Über das gemessene Fluoreszenzspektrum der angeregten Fluorophore – sowohl in Lösung als auch auf Einzelmolekülbasis – kann dann die Verschiebung der beiden Elemente gegeneinander bestimmt werden. Ebenso kann eine Verschiebung des Streuspektrums und somit der Elemente gegeneinander detektiert werden, wenn Nanopartikel unterschiedlicher Größen und Eigenschaften aneinander vorbei gleiten (im Folgenden wird das Prinzip nur noch Anhand der FRET-Paare erläutert). Wenn die Fluorophore an beliebige Positionen der steifen Elemente angebracht werden können, kann die Dynamik der Messanordnung frei bestimmt werden. Je weiter die beiden letzten FRET-Paare in Verschiebungsrichtung der parallelen Elemente auseinander liegen, desto größer ist die Dynamik. Die Auflösung lässt sich durch die Dichte und Anzahl der FRET-Paare bestimmen. Da die Spektren der einzelnen Farbstoffe als Superposition detektiert werden, lässt sich durch geeignete Kalibrierung des Systems jeder Position des spektralen Maximums eine eindeutige Entfernung zuordnen. Es können also auch Abstände aufgelöst werden, die wesentlich kleiner als die Abstände zwischen den FRET-Paaren in Verschiebungsrichtung sind.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Nachfolgend wird ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei die Zeichnungen zeigen:
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1 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer ersten Position;
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2 zeigt schematisch die Vorrichtung in der 1 in einer zweiten Position schematisch; und
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3 zeigt die Vorrichtung der 1 und 2 in einer dritten Position schematisch.
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Beschreibung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
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In der 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit zwei ersten Elementen 1 und einem zweiten Element 2 gezeigt. Die beiden ersten Elemente 1 bieten gegenüber nur einem ersten Element 1 den Vorteil einer größeren Fluoreszenz-Ausbeute, außerdem einer überprüfbaren Messung, wobei mit dem einen der beiden ersten Elemente das andere der beiden ersten Elemente 1 überprüft werden kann.
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An den beiden ersten Elementen 1 sind jeweils ein roter Fluorophor 3, ein gelber Fluorophor 4 und ein grüner Fluorophor 5 angeordnet. Die Fluorophore 3 bis 5 sind äquidistant auf den beiden ersten Elementen 1 jeweils angeordnet.
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Auf dem zweiten Element sind Quencher angeordnet, welche bewirken, dass bei einer Annäherung eines der Fluorophore 3 bis 5 an einen der Quencher 6 die Fluoreszenz des jeweiligen Fluorophors 3 bis 5 abnimmt oder vollständig ausgelöscht wird. Als Fluorophor-Quencher Paare sind beispielsweise Alexa488 und BHQ-1 geeignet. Geeignete FRET-Paare, welche ebenso eingesetzt werden können, sind beispielsweise Alexa488 und Alexa546. Die Farbstoffe und Akzeptoren, d. h. die Fluorophore und die Quencher oder andere Fluorophore können bezogen werden von der Firma biomers.net GmbH, Söflinger Straße 100, 89077 Ulm, Deutschland. Ebenso können von dieser Firma Thiol-Verbindungen bezogen werden. Die Thiol-Verbindungen werden insbesondere benötigt, um Metall-Nanopartikel an DNA anzubinden.
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Die Elemente 1 und 2 bestehen aus DNA-Origami mit doppelsträngiger DNA. Zur DNA-Origami-Konstruktion wird ein langer DNA-Einzelstrang als Gerüststrang verwendet, der mit Hilfe hunderter synthetischer Oligonukleotide in eine gewünschte Form gewebt wird. Auf diese Weise können steife, dreidimensionale Strukturen nahezu beliebiger Form geschaffen werden. An diesen synthetischen DNA-Strängen lässt sich prinzipiell an jeder Position mit Nanometerpräzision ein Farbstoff oder ein Akzeptor einbinden. Auf diese Weise sind die steifen Elemente 1 und 2 mit den Fluorophoren und Akzeptoren hergestellt. Zur Positionierung der Elemente 1 und 2 untereinander sind die Elemente mit einzelsträngigen DNA-Kupplungen 7 verbunden, welche einer relativen Bewegung der Elemente 1 und 2 untereinander einen kontrollierbaren Widerstand entgegensetzen.
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In der 1 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer ersten Position gezeigt, wobei die beiden roten Fluorophoren 3 und die gelben Fluorophoren 4 jeweils neben einem Quencher 6 angeordnet sind, sodass die Fluoreszenz ”geschluckt wird”. Die Fluorophoren 5 sind nicht neben einem Quencher 6 angeordnet, sodass deren grüne Fluoreszenz mit einem spektral auflösenden Fluoreszenzmikroskop erfasst werden kann. Auf diese Weise weiß ein Beobachter, wie die Elemente 1 relativ zu dem Element 2 in Längsverschiebungsrichtung angeordnet sind.
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Zu berücksichtigen ist die besondere Anordnung der Fluorophoren 3 bis 5 in äquidistantem Abstand auf den Elementen 1 und die Anordnung der Quencher 6 als Akzeptoren auf dem Element 2 ebenfalls in äquidistantem Abstand, wobei jedoch in der Mitte zwischen jeweils drei Quenchern 6 eine Lücke gelassen wurde.
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In der 2 ist die Vorrichtung der 1 noch einmal gezeigt, wobei für gleiche Teile gleiche Bezugszeichen verwendet werden. Dies gilt analog für die spätere Beschreibung der 3. Auf die Beschreibung der einzelnen Teile wird an dieser Stelle und auch bei der Figurenbeschreibung der 3 nicht noch einmal eingehend eingegangen.
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In der 2 sind die Elemente 1 in einer zweiten Position angeordnet, wobei sie in der Figur nach links verschoben sind. Dabei kommt es zu einem Aufleuchten der gelben Fluorophoren 4, da diese nun auf Höhe der Lücke der Quencher 6 des Elements 2 angeordnet sind. Auf diese Weise lässt sich durch Erfassen der Veränderung der Fluoreszenz mit einem spektral auflösenden Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenzspektrometer die Positionsänderung erfassen. Ausreichend ist dabei eine Auflösung von zumindest zwei Wellenlängen, insbesondere der Wellenlängen der Fluoreszenz. Anzumerken ist, dass auch Zwischenpositionen genauer erfasst werden können, da gleichzeitig ein Abnehmen der grünen Fluoreszenz bei Zunehmen der gelben Fluoreszenz erfolgt, sodass auch eine Auflösung verbessert werden kann.
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In der 3 ist die Anordnung der 1 und 2 nochmals gezeigt, wobei die Elemente 1 gegenüber dem Element 2 noch weiter nach links verschoben sind. Alternativ könnte dies auch als eine Verschiebung des Elements 2 weiter nach rechts interpretiert werden. Wiederum wird auf die vorherigen Figuren und Figurenbeschreibungen zu Erläuterung der entsprechenden Teile und Bezugszeichen verwiesen.
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Da nunmehr das Element 2 weiter nach rechts verschoben ist, sind die gelben Fluorophoren 4 in den Wirkungsbereich wiederum von einem Quencher 6 geraten, sodass deren Fluoreszenz unterdrückt wird. Hingegen befindet sich der rote Fluorophor 3 nicht mehr neben einem Quencher 6, sodass nunmehr eine rote Fluoreszenz mit dem Fluoreszenzspektrometer erfassbar ist. Auf diese Weise kann eine Verschiebung des Elements 2 relativ zu den Elementen 1 über die üblichen Wechselwirkungsbereiche eines FRET-Paares hinaus erfasst werden. So wäre es mit einem einzelnen FRET-Paar nicht möglich gewesen, einen derart großen Messbereich zu erfassen. Selbstverständlich kann die vorgestellte Methode beliebig erweitert werden, sodass größere Messbereich möglich werden. Es sollte angemerkt werden, dass bereits in dem in den 1 bis 3 gezeigten Beispiel die Messgenauigkeit allein dadurch erhöht wird, dass gleichzeitig verschiedene Paarungen Wechselwirkungen zeigen, sodass die Genauigkeit durch das mehrfache Auftreten der Wechselwirkungen erhöht wird.
