TWI457565B - 用於鑑別出改變ＮＡＰＥ－ＰＬＤ或Ａｂｈ４之作用劑的分析方法 - Google Patents

用於鑑別出改變ＮＡＰＥ－ＰＬＤ或Ａｂｈ４之作用劑的分析方法 Download PDF

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Description

用於鑑別出改變NAPE－PLD或Abh4之作用劑的分析方法 本發明之背景
水解N－醯基磷脂醯乙醇胺的磷脂酵素D(NAPE－PLD)是一種催化N－醯基磷脂醯乙醇胺(NAPE)水解為磷脂酸和花生四烯酸乙醇醯胺的磷脂酵素(圖1)。α/β－水解酵素－4(Abh4，也可縮寫為Abhd4)籍一替代途徑生成花生四烯酸乙醇醯胺。花生四烯酸乙醇醯胺是一種已知的內源性大麻素。由於花生四烯酸乙醇醯胺生物合成的抑制可能具有與大麻素－1(CB1)拮抗劑的某些效應相同的效應或更多的效應，因此NAPE－PLD和Abh4成為生物學上引人矚目的焦點。因此，調節NAPE－PLD或Abh4活性的治療方法可用於各種疾病的治療。這些疾病包括但不限於肥胖症、糖尿病和動脈硬化症。
由於發現調節NAPE－PLD的化合物具有治療潛力，製藥行業存在開發高通量篩選(HTS)檢測的需要。但NAPE－PLD是一種獨特的酵素。它的結構和催化方式不同於包括其他磷脂酵素D(PLD)在內的其他脂肪酵素。與其他催化類似物反應且依賴組胺酸的PLD酵素不同的是，NAPE－PLD是一種鋅依賴性酵素，類似於細菌鋅金屬β－內醯胺酵素。受質中的N－醯基部分是NAPE－PLD識別受質所需要的，而其他PLD則利用磷脂醯膽鹼或磷脂醯肌醇作為受質(Schmid et al.,J.Biol.Chem.258：9302－9306,1983；Okamoto et al.,J.Biol.Chem.279：5298－5305,2004；Gottlin et al.,Proc.Natl.Acad.USA 95：9202－9207,1998；Petersen and Hansen,FEBS Lett.455：41－44,1999；Ueda et al.,Curr.Med.Chem.12：1413－1422,2005).Acad.USA 95：9202－9207,1998；Petersen and Hansen,FEBS Lett.455：41－44,1999；Ueda et al.,Curr.Med.Chem.12：1413－1422,2005)。因此，文獻中報導的許多用於PLD的檢測方法不能改用於測量NAPE－PLD。測量從PLD釋放出的對硝基苯酚的分光光度檢測不涉及NAPE－PLD酵素活性所必須的N－醯基部分(Hagishita et al.,Anal.Biochem.276：161－165,1999；D'Arrigo et al.,Analytica Chimica Acta 304：249－254,1995)。檢測膽鹼(許多普通PLD的產物)之形成的檢測方法也不適用，因為NAPE－PLD不生成膽鹼(Hojjati and Jiang,J.Lipid Res.47：673－676,2006)。用於PLD的連續螢光取代檢測可檢測游離脂肪酸的生成，該檢測需要另外結合磷脂酵素A(即間接測量PLD活性)並使用不含N－醯基部分的受質(Kinkaid and Wilton,Biochem.Soc.Trans.25：S595,1997)。其他方法採用了某些另外的技術，例如層析以及檢測用HTS方法不易檢測的pH變化和膜電荷的技術(Petersen et al.,J.Lipid Res.41：1532－1538,2000；Morris et al.,Anal.Biochem.252：1,1997；Aridor et al.,Methods Enzymol.404：108－115,2005)。近來開發的幾種用於脂肪酵素的HTS檢測法沒有所需的N－醯基部分(Schmidt and Bornscheuer,Biomol.Eng.22：51－56,2005)。與NAPE－PLD不同的是，Abh4不是鋅依賴性酵素，而是絲胺酸水解酵素(Simon和Cravatt,J.Biol.Chem.281：26465,2006)。
據報導用於檢測NAPE－PLD活性的方法使用了帶放射性標誌的NAPE，隨後再使用薄層層析(Okamoto et al.,J.Biol.Chem.279：5298－5304,2004)、鋯沈澱(Petersen et al.,J.Lipid Res.41：1532－1538,2000)或液相層析(Fezza et al.,Analytical Biochemistry 339：113－120,2005)定量釋放的放射性標誌產物。
HTS方式檢測中通常使用螢光淬熄和螢光能量轉移方法。但螢光淬熄和螢光能量轉移方法或任何其他可進行HTS的方法尚未應用於NAPE－PLD。我們已經採用了螢光BODIPY基團和淬熄基團2,4－二硝基苯酚(DNP)(Hendrickson et al.,Anal.Biochem.276：27－35,1999)來研發可進行NAPE－PLD高通量篩選的新型檢測方法。與HTS相容的NAPE－PLD螢光檢測以作為受質的BODIPY和DNP雙標記的N－醯基磷脂醯乙醇胺(PED6)為基礎。作為一個完整的分子，來自BODIPY部分的螢光被DNP部分淬熄；PED6發生酵素水解後，DNP部分從BODIPY部分釋放出來，使BODIPY發射出螢光(參見圖2)。螢光強度與NAPE－PLD的活性成正比。該新穎檢測法增加了篩選的通量，可在短時間內檢測更多的化合物。而且，該HTS方式的檢測方法避免了涉及放射性的操作、廢物管理和處理問題以及放射標誌材料的薄層層析。
Abh4是含有α/β蛋白折疊的水解酵素家族成員。有人認為Abh4參與了內源性大麻素花生四烯酸乙醇醯胺的生物合成途徑(AEA；花生四烯酸乙醇醯胺)(Simon and Cravatt,J.Biol.Chem.281：26465,2006)。有人認為該途徑是使用NAPE－PLD酵素途徑的替代途徑。Simon和Cravatt描述的測量Abh4酵素活性的檢測法使用了放射性的NAPE受質，隨後通過薄層層析分離產物。該檢測法繁瑣，顯然不適合於高通量化合物篩選。此外，由於需要謹慎的操作和處理步驟，放射性的使用對於常規檢測也是不可取的。Simon和Cravatt使用的放射性受質為不帶化學標記、螢光標記或其他標記的NAPE。
我們假設我們首次成功用於測量NAPE－PLD活性的NAPE類似物PED6也可應用於Abh4。我們預期Abh4將切割2－位的酯鍵，該酯鍵不同於NAPE－PLD切割的鍵(參見圖3)，但是解除淬熄後螢光增加的最終結果卻會是相同的。1－位的酯鍵可能也會為Abh4切割，但不會產生可測量的螢光變化。對Abh4酵素使用帶標記的受質PED6是新穎的，因為沒有任何證據表明該酵素可耐受受質中的標記，且可將PED6水解到可測量的程度。
本發明之詳細說明
本說明書所引用的所有出版物均作為參考文獻納入本說明書。除非另行說明，本說明書所使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術人員通常所理解的相同含義。
本說明書和所附申請專利範圍使用的術語僅是為了描述具體實施例的目的，它們在本說明書中的使用並非是限 制本發明。單字的單數形式包括複數形式，除非上下文清楚地表明其為單數含義。例如，單數形式的「一種」和「該」也包括複數形式。此外，在提及一種劑時也可能包括兩種或更多劑的混合物。因此，術語「一種劑」包括多種劑，包括這些劑的混合物和/或鏡像異構物。還應注意到術語「或」在使用時其含義一般包括「和/或」，除非上下文清楚地表明其具體含義。還應理解的是，本說明書中使用的術語「包括」和/或「含有」，規定了該特徵、步驟、元件和/或組分的存在，但不排除這些特徵、步驟、元件和/或組分的一個或多個其他特徵、步驟、元件、組分和/或其組合的存在或添加。
而且，根據本發明可使用本技術領域內的常規分子生物學、微生物學和DNA重組技術。這些技術在文獻中有詳細解釋。例如可參閱Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(下文稱「Sambrook et al.，1989」)；DNA Cloning：A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney,ed.(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)。
本發明的一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：(a)將NAPE－PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(b)將一劑加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(c)將一種受質加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和淬熄劑部分，其中供體部分和淬熄劑部分之間的分子內近距離產生了淬熄的可檢測信號；(d)將該劑、該NAPE－PLD或Abh4和該受質在該儲槽陣列中培育一段預定的時間；(e)在該儲槽陣列中NAPE－PLD或Abh4從該受質上除去淬熄劑部分後，測量來自供體部分的可檢測信號的量；以及(f)將包括該化學劑、該受質和該NAPE－PLD或Abh4的第一儲槽中的可檢測信號的量與包括該受質和該NAPE－PLD或Abh4的第二儲槽中的可檢測信號的量進行比較，當差異超過預定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
本發明的另一實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：(a)將NAPE－PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(b)將一種化學劑加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(c)將一種受質加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和淬熄劑部分，其中供體部分和淬熄劑部分之間的分子內近距離產生了淬熄的可檢測信號；(d)在該儲槽陣列中 NAPE－PLD或Abh4從該受質除去淬熄部分後，在第一時間點測量來自供體部分的可檢測信號的量；(e)將該劑、該NAPE－PLD或Abh4和該受質在該儲槽陣列中培育一段預定的時間；(f)在該儲槽陣列中NAPE－PLD或Abh4從該受質除去淬熄部分後，在第二時間點測量來自供體部分的可檢測信號的量；以及(g)將第一時間點的可檢測信號的量與第二時間點的可檢測信號的量進行比較，當差異超過預定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
「預定的」表示該時間段或該閾值是在採用本發明的方法之前事先確定的。該時間段或閾值可任意地或憑經驗選擇。一個非限制性實例是進行一段時程然後根據時程的結果選擇一段時間來測量可檢測的信號。「時間段」可以為任何單位的時間；非限制性實例包括秒、分鐘或小時。「閾值」係指表明一種反應所需的可檢測信號的量。
本發明的一個實施例使用了可檢測信號。技術人員可輕易地理解本發明可能採用的數量眾多的可檢測信號。非限制性實例包括螢光染料、發色團、酵素、連接子部分、生物素、電子供體、電子受體、染料、金屬和放射性核種。
本發明的一個實施例使用了一供體部分和一淬熄劑部分。非限制性實例包括BODIPY和DNP、若丹明和DNP、Cy染料和DNP、Alexa和QSY染料和BODIPY和DNP。技術人員可輕易鑒別出使用不同供體和淬熄劑部分的其他適宜組合，這些不同的供體和淬熄劑部分具有合適的性質，使得它們可以為本發明所利用。
本發明可加以修改而用於許多技術，以生成可檢測的信號。一個非限制性實例是使用螢光共振能量轉移(更常稱為FRET)。螢光共振能量轉移是激發態的螢光團的能量轉移到其鄰近的第二發色團的過程。例如，螢光共振能量轉移涉及激發電子態的供體螢光團，它可以將其激發能量通過長程偶極－偶極交互作用而轉移到附近的受體發色團。共振能量轉移可以認為是偶聯的振盪器，例如一對以相同頻率振動的音叉。因此，取決於所使用的供體和受體部分，技術人員可以測量供體－受體對分子內交互作用引起的可測量信號，以及分子內相互作用分離或破壞後來自供體部分或受體部分的可測量信號，或來自兩者的可測量信號。供體－受體對的非限制性實例包括藍綠色螢光蛋白－黃色螢光蛋白對，綠色螢光蛋白－藍色螢光蛋白對，銪和別藻藍蛋白，藍綠色螢光蛋白/黃色螢光蛋白，綠色螢光蛋白/藍色螢光蛋白，具有合適激發波長和發射波長的不同Cy染料、不同BODIPY染料或不同Alexa染料的組合，Texas紅和螢光素，BODIPY和螢光素，若丹明和螢光素，具有適宜螢光屬性的不同BODIPY染料的組合，具有適宜螢光屬性的不同Cy染料的組合，鍺螯合物或其他稀土元素螯合物和APC、XL665或其他改質APC。技術人員可輕易地理解Cy染料是許多具有類似結構但不同螢光屬性染料的通用名。與之類似，BODIPY和Alexa紅代表了一類具有類似結構和不同螢光屬性的染料。因此理論上許多組合適宜於FRET。一個非限制性實例是BODIPY480與Cy染料520。
因此，本發明的一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：(a)將NAPE－PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(b)將一種劑加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(c)將一種受質加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和受體部分；(d)將該劑、該NAPE－PLD或Abh4和該受質培育一段預定的時間；(e)測量可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於供體部分、受體部分、供體部分與受體部分之比和供體－受體部分複合物；以及(f)將包括該劑、該受質和該NAPE－PLD或Abh4的第一儲槽中的可檢測信號的量與包括包括該受質和該NAPE－PLD或Abh4的第二儲槽中的可檢測信號的量進行比較，當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
本發明的另一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：(a)將NAPE－PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(b)將一種劑加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；(c)將一種受質加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和受體部分；(d)在第一時間點測量可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於供體部分、受體部分、供體部分與受體部分之比和供體－受體部分複合物；(e)培育該化學劑、該NAPE－PLD或Abh4和該受質一段預定的時間；(f)在第二時間點測量可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於供體部分、受體部分、供體部分與受體部分之比 和供體－受體部分複合物；以及(g)將第一時間點的可檢測信號的量與第二時間點的可檢測信號的量進行比較，當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
由於本發明的原理基於受質分子內部從能量供體部分到能量受體部分的能量轉移。在涵蓋範圍最寬情況下，當任何兩個處於適宜位置的部分即供體和受體(或淬熄劑)由受質分子連接在一起時，該檢測均能發揮作用。作為一個非限制性實例，供體位於NAPE受質三條脂肪酸鏈的其中一條上(例如鏈1或2)，能量受體(或淬熄劑)位於另一位點但仍近到足以發生能量轉移(例如鏈3，參見圖3)。受質水解前，供體和受體(或淬熄劑)距離很近，來自供體的可檢測信號為受體(或淬熄劑)所淬熄。受質水解後，供體和受體(或淬熄劑)被分開，產生可檢測信號例如來自供體的螢光的釋放，它作為檢測酵素活性的一種讀數。作為替代實例，受質水解以及供體和受體分開後，可以檢測到來自供體的螢光，還可以檢測來自受體的螢光，其中供體和受體信號之一或兩者可以被測量，或供體與受體之比可以被測量。
下列為供體－受體位置組合的非限制性實例：鏈1和3，鏈2和3，鏈3和1或鏈3和2(圖3)。本領域技術人員可理解鏈1和2的烴鏈可以變動。鏈3也可以變動，但應保持其N－醯基部分。螢光探針可位於鏈上的任何位置，只要該調節不會干擾NAPE－PLD酵素的活性。螢光供體和受體對必須相容，使得當供體受某波長激發時，供體發射出適宜波長的光以被對面的螢光素接收或淬熄。有幾種螢光供 體－受體對的組合。作為舉例，可使用組合的非限制性實例包括：藍綠色螢光蛋白－黃色螢光蛋白對，綠色螢光蛋白－藍色螢光蛋白對，銪和別藻藍蛋白，藍綠色螢光蛋白－黃色螢光蛋白，綠色螢光蛋白/藍色螢光蛋白，和具有適宜激發波長和發射波長的不同Cy染料，不同BODIPY染料或不同Alexa染料的組合，BODIPY和DNP，若丹明和DNP，Cy染料和DNP，Alexa和QSY染料，BODIPY和DNP，Texas紅和螢光素，BODIPY和螢光素，若丹明和螢光素，具有適宜螢光屬性的不同BODIPY染料的組合，具有適宜螢光屬性的不同Cy染料的組合以及鍺螯合物或其他稀土元素螯合物和APC，XL665或其他改質APC。
本領域技術人員很容易理解，NAPE－PLD或Abh4、劑和受質可以任意次序加入或可一起加入。一個非限制性實例是將NAPE－PLD或Abh4、受質和劑製備成一種混合物，並在一個步驟中加入該混合物。另外一個非限制性實施例是首先加入受質，然後是劑繼而是NAPE－PLD或Abh4。任何加入次序均可採用。另外一個實施例是可在步驟a、b或c之間增加一個對NAPE－PLD或Abh4、劑或受質中任何一種或多種物質進行培育一段預定的時間的步驟。各種改進方法例如將受質、劑或NAPE－PLD或Abh4一步加入或以不同次序加入，完全屬於本領域技術人員的知識和能力範圍之內並都被認為是本發明的實施例。
本發明的一個實施例使用了受質。該受質可為NAPE－PLD或Abh4可作用於其上的任何材料或物質。一個 非限制性實例是PED6。
本發明的一個實施例使用了包括人全長NAPE－PLD的NAPE－PLD酵素。也可使用來自其他物種的NAPE－PLD。NAPE－PLD可表現為還包括其他蛋白，例如可用於蛋白分離的HIS標籤。而且，可使用截短形式的NAPE－PLD酵素。一個非限制性實例是SEQ ID NO.3。如果截短，該截短不可影響活性位點。可以使用任何截短方式，只要被截短的蛋白仍含有完整的活性位點。
本發明的一個實施例使用了包括人全長Abh4的Abh4酵素。一個非限制性實例是SEQ ID NO.5。也可使用來自其他物種的Abh4。Abh4可表現為還包括其他蛋白，例如可用於蛋白分離的HIS標籤。而且，可使用截短形式的Abh4酵素。如果截短，該截短不可影響活性位點。可以使用任何截短方式，只要被截短的蛋白仍含有完整的活性位點。
本發明提供了鑑定(例如篩選、檢測、鑑定、分析和定量)某些調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法。本說明書所用的術語「劑」、「試劑」、「檢測化合物」、「候選藥物」或「調節劑」或語法上相當的成分，描述了用於本發明之檢測且其調節NAPE－PLD或Abh4活性的能力經過檢測的任何天然或合成的分子，例如蛋白質、寡胜肽(例如長度為約5到約25個胺基酸，較佳者為約10到20或12到18個胺基酸，更佳者為約12、15或18個胺基酸)、小有機分子、多醣、脂質(例如神經鞘脂)、脂肪酸、聚核苷酸和寡核苷酸等。對可以被檢測的化合物沒有特殊限制。實例包括低、 中或高分子量的化學分子的單一劑或庫、純化蛋白質、基因庫的表現產品、合成胜肽庫、細胞提取物和培養上清。劑包含不同劑的任何組合。
劑可含有至少一種或多種可溶或不可溶的因子、細胞基質組分、調適培養基、細胞提取物、組織提取物、培植體、pH調節劑、氣體、滲透壓調節劑、離子強度調節劑、病毒、DNA、RNA或基因片段。劑可以為試劑庫的形式，例如提供足夠的多樣性或相反地局限於類似結構或特點的組合或隨機庫。劑可以選擇性地連接到融合夥伴上，例如靶向化合物、挽救化合物(rescue compound)，二聚化合物，穩定化合物，可定址化合物和其他功能部分。一般而言，通過鑑定具有一些所需屬性或活性如抑制活性或調節活性的試劑(稱為「先導化合物」或「先導」)可生成具有有效屬性的新化學實體。該先導化合物然後被用作支架來創造該先導化合物的變體，並且評價這些變體化合物的屬性和活性。
劑可包括處理條件以及外部和內部條件或環境的操縱。此類劑的一個非限制性實例包括紫外線。
本發明的一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法。術語「調節」包括NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的任何改變。因此，術語「調節」可指NAPE－PLD活性或Abh4活性的抑制劑、誘導劑或調節劑。
術語「抑制劑」包括可阻斷、干擾或防止NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的任何藥物、化學物、蛋白質或蛋白 片段。而且，抑制劑可為例如分子伴侶、抗體或抑制性RNA(RNAi)，它們阻斷細胞蛋白的表現，從而抑制直接或間接影響NAPE－PLD或Abh4的途徑。「阻斷」不需要為絕對的，任何可測量的抑制作用均表明發生了阻斷。「抑制劑」可以為培養條件的控制，例如增加氧氣或去除氧氣或改變培養基組分來阻斷、干擾或防止細胞反應，從而防止或干擾或阻斷NAPE－PLD或Abh4的活性或特異性。
術語「誘導劑」包括可啟動、刺激或增強NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的任何藥物、化學品、蛋白質或蛋白片段。而且，誘導劑可以為分子伴侶、抗體或抑制性RNA(RNAi)，它們阻斷細胞蛋白的表現，從而去除抑制或直接啟動或刺激細胞反應、活性或途徑。「誘導劑」可以為培養條件的控制，例如增加氧氣或去除氧氣或改變培養基組分來阻斷、干擾或防止細胞反應，最終啟動、刺激或增強NAPE－PLD或Abh4的活性或特異性。
術語「調節劑」包括可調節NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的強度、比例或特性，或可調節NAPE－PLD或Abh4活性或特異性參與的細胞反應、活性或途徑的強度、比例或特性的任何藥物、化學品、蛋白質或蛋白片段。而且，調節劑可以為分子伴侶、抗體或抑制性RNA(RNAi)，它們阻斷細胞蛋白的表現，從而去除抑制或誘導最終影響NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的細胞反應、活性或途徑。「調節劑」可以為培養條件的控制，例如增加氧氣或去除氧氣或改變培養基組分來調節可能影響NAPE－PLD或 Abh4的活性或特異性的細胞反應的強度、比例或特性。
在本發明的另一實施例中，調節劑可以與誘導劑配合使用，使得誘導劑的調節劑令誘導劑效力上升(例如導致NAPE－PLD或Abh4活性增加)或令誘導劑效力下降(例如導致NAPE－PLD或Abh4活性下降)。抑制劑的調節劑使得抑制劑效力下降(例如增加NAPE－PLD或Abh4的活性)或使得抑制劑效力上升(例如降低NAPE－PLD或Abh4的活性)。
抑制劑、誘導劑或調節劑也可用於類比疾病狀態的途徑或方面。作為一個非限制性示意性實例，本發明的一個實施例為在NAPE－PLD或Abh4抑制劑、誘導劑或調節劑存在下鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性的劑。這些抑制劑、誘導劑或調節劑模擬了心理障礙、糖尿病或肥胖症的某些方面。因此，本發明的一個實施例包括用於鑑定可改善疾病狀態之試劑的篩選方法，其中NAPE－PLD或Abh4的活性或特異性被認為受到影響。
本發明的另一實施例是使用一種以上的誘導劑、抑制劑或調節劑。使用一種以上的誘導劑、抑制劑或調節劑可以但不限於具有相加效應、逆效應、協同效應或影響多條途徑。
本發明的一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法還包括一種對照。對照是一個為技術人員熟知的技術術語。適宜的對照可取決於使用的檢測參數或研究的實驗問題。對照可以是一套特別的檢測條件或者是在培養基中加入或去除某個具體化合物。對照可 以被認為是陽性對照，使得添加的檢測條件或對照化合物引起了預期反應。例如，如果預計研究的劑抑制NAPE－PLD或Abh4，陽性對照將為已知可抑制NAPE－PLD或Abh4的化合物或化學劑。對照也可以為陰性對照。陰性對照可以為一套特別的檢測條件或者是在培養基中加入或去除會引起預期反應的某個具體化合物或劑。例如，如果預計研究所用之劑抑制NAPE－PLD或Abh4，那麼陰性對照將預計不抑制NAPE－PLD或Abh4。對照可以為「溶劑」對照。例如，如果試劑溶解於DMSO中，那麼溶劑對照將為不含試劑的DMSO。對照也可以只不過是使用歷史資料。
本發明的一個實施例是這樣一種方法，它通過在該儲槽中培養短暫或穩定轉染以表現NAPE－PLD或Abh4的原核或真核細胞而提供NAPE－PLD或Abh4。因此，本發明的另一個實施例是使用短暫或穩定轉化的細胞來表現或過表現NAPE－PLD或Abh4。表現可以為誘導型或組成型。通過將劑加入包括短暫或穩定轉化以表現或過表現NAPE－PLD或Abh4的培養細胞的儲槽中，可以檢測該劑調節NAPE－PLD或Abh4活性的能力。
本發明的重組表現載體包括核酸分子，其形式適於在宿主細胞中表現該核酸。因此，本發明的重組表現載體可包括基於用於表現的宿主細胞而選擇的一個或多個調節序列。該調節序列可操作地連接到待表現的核酸。在重組表現載體內，「可操作地連接」意為目的核酸序列連接到該調節序列上，使得該核酸序列得以表現(例如在體外轉錄/轉譯 系統或當載體引入宿主細胞後在宿主細胞內)。術語「調節序列」意為包括啟動子、促進子和其他表現控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。此類調節序列已在例如Goeddel,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中描述。調節序列包括引導該核苷酸序列在許多類型宿主細胞中組成型表現的序列(例如組織特異性調節序列)。本領域技術人員會理解，表現載體的設計可取決於諸如待轉化的宿主細胞、所需蛋白表現水準選擇等一類的因素。本發明的表現載體可引入宿主細胞而生成由本說明書描述的核酸編碼的蛋白或胜肽。
本說明書使用的術語「過度表現」系指多胜肽例如可能參與細胞凋亡或細胞生存機制的分子在細胞內的表現，其表現水準高於正常情況下表現該多胜肽的細胞或正常情況下不表現該多胜肽的細胞內的該多胜肽正常表現水準。例如，與正常情況下表現該多胜肽的野生型、基態或未誘導細胞的該多胜肽表現相比，該多胜肽的表現可以超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70、80%、90%、100%或更多。目的多胜肽的突變體、變異體或類似物都可以過度表現。
本說明書所使用的術語「短暫」表現系指與細胞染色體分開的外源核酸分子的表現。短暫表現一般在外源核酸進入細胞2至3天後達到最高水準，隨後其表現下降。
本說明書所使用的術語「穩定」表現系指成為細胞染 色體一部分的外源核酸分子的表現。一般而言，用於基因穩定表現的載體包括一個或多個選擇標記物。
用於轉化、非轉化、原代培養和生物樣品的細胞培養技術為本技術領域內眾所周知。生物樣品或培養細胞可以儲存起來，直至需要使用時。用於培養的培養基可專門設計或從市面購得。
本發明的一個實施例使用了可從市面購得的細胞系。例如，可以使用的細胞來自American Tissue Culture Company或其他來源。細胞可以為原核細胞或真核細胞。本發明不受使用細胞類型的局限。也可使用原代培養。未分化細胞可以採用各種劑處理以使細胞分化出特定表型。例如，誘導分化為寡突膠質細胞的前體細胞是本發明的一個實施例。使用的具體細胞類型可通過所需細胞類型特異表現的標記物來選擇，或者通過特定標記物的丟失來選擇。細胞可通過通常由技術人員使用的例如流式細胞儀等方法來進行分離或分類。
本發明的一個實施例使用了均一的細胞群。本發明的一個實施例使用了不均一的細胞群。細胞可以為任何類型和任何比例的細胞以完成本發明之檢測。
細胞可從生物樣品獲得。生物樣品可包括但不限於組織或體液、組織切片例如活檢和屍檢樣品和用於組織學檢測的冰凍切片。此類樣品包括血液、痰液、組織、培養細胞例如原代培養、外植體和轉化細胞、糞便和尿液等。生物樣品可以從真核生物獲得，包括從哺乳動物例如靈長類 如黑猩猩、獼猴或人類、牛、犬、貓、齧齒類如豚鼠、大鼠、小鼠，兔或鳥、爬行類或魚獲得。
本發明的一個實施例是在高通量篩選(HTS)方法中的用途。HTS是數以千計的不同化合物在設計用於構建疾病病理的生物機制或方面模型的檢測中的自動同步偵測。一種以上化合物例如多種化合物可以同時例如同一批檢測。在一個實施例中，術語HTS篩選方法系指偵測一種化合物或多種化合物影響目的指標讀數能力的檢測。
本發明的一個實施例使用了機器人或工作站設備。用於細胞培養和樣品處理的液相處理系統、分析儀器例如螢光讀取儀或閃爍計數器和機器人技術為本技術領域內眾所周知。技術人員可獲得機械系統例如機器人臂或所謂「摘櫻桃」設備。可從市面上購得商用讀取儀來分析，例如常規96－孔板或384－孔板。可獲得單個樣品、多個樣品或培養板樣品讀取儀，可用它們來分析預先確定的孔並生成原始資料報告。原始資料可通過許多種方式轉化和呈現。
本發明的一個實施例包括一列可接收細胞和其他材料如培養基的儲槽。在本發明範圍內，一儲槽陣列可以為適於容納細胞的至少1個或1個以上儲槽中的任何數目的儲槽。實例包括但不限於培養瓶、培養皿、試管如1.5ml試管、12孔板、96孔板、384孔板、1536孔板和可能具有4000個儲槽的微型微孔板(美國專利申請20050255580)。該儲槽陣列可經改進添加保護蓋，從而防止污染物進入或防止內容物蒸發。
該儲槽的另外一個特點是該儲槽可直接用於分析，非限制性實例包括分光光度法分析、閃爍計數和螢光測量。但是，鑒於樣品可以轉移到可進行進一步分析的適宜容器，這並不是對可在本發明範圍內使用的儲槽的限制。一個非限制性實例是修改該方法，使得該方法進一步包括提供第二儲槽陣列，其中來自第一儲槽陣列的樣品被轉移到第二儲槽陣列中。
本發明的另一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性之劑的檢測系統，該檢測系統包括：(a)一儲槽陣列；(b)NAPE－PLD或Abh4；(c)一種包括供體部分和淬熄劑部分的受質，其中該供體部分可檢測；以及(d)至少一種組分，其中該組分選自於劑、誘導劑、抑制劑、調節劑、誘導劑的調節劑、抑制劑的調節劑和對照。
本發明的一個實施例是鑑定調節NAPE－PLD或Abh4活性的化學劑的檢測系統，該檢測系統包括：(a)一儲槽陣列；(b)NAPE－PLD或Abh4；(c)一種包括供體部分和受體部分的受質，其中該供體部分或該受體部分或兩者可被檢測；以及(d)至少一種組分，其中該組分選自於化學劑、誘導劑、抑制劑、調節劑、誘導劑的調節劑、抑制劑的調節劑和對照。
本發明的一個實施例是調節NAPE－PLD或Abh4活性或特異性的組分。該組分選自於對照、化學劑、誘導劑、抑制劑、調節劑、誘導劑的調節劑和抑制劑的調節劑。該檢測系統可具有一個以上組分。
本發明的另一個實施例是包括檢測系統至少一個組分和使用說明的試劑套組。因此該檢測系統的該組分可分別提供或一起提供，例如試劑套組。根據使個體組分穩定性最大化的方法，該檢測系統的該組分可製備和包含在一個試劑套組內。此類方法為本領域技術人員所熟知。例如，該檢測系統的細胞可以懸浮液或凍乾的形式提供。還可包含該系統的附加組分，例如緩衝液、混合該檢測組分的儲槽例如微孔板或試管。該檢測系統可以試劑套組的形式提供，該試劑套組包括進行檢測的說明以及資料處理和解釋的說明。
本發明的一個實施例是用於NAPE－PLD或Abh4調節的藥物組合物，其包括由本發明之方法鑑定的治療有效量的化學劑和藥用載體。術語「治療有效量」係指劑的量可有效地治療患者或哺乳動物的疾病。作為一個非限制性實例，就肥胖症而言，藥物的治療有效量可減低體重。本發明的藥用組合物可與其他治療藥物聯用。例如，治療肥胖症時，該藥用組合物可與其他厭食劑一同服用。
本發明在下列實例中得到進一步描述，這些實例並沒有限制申請專利範圍所述的本發明的範圍。儘管為了實現和利用本發明，已經向本領域技術人員足夠詳細地舉例說明了本發明，但顯而易見的是，可以作出各種替代、修改和改進，而不偏離本發明的精神和範圍。本領域技術人員很容易地理解，本發明很適合於實現該目標並獲得本說明書提及或固有的結果和益處。下面的實例是對實施例的描 述，並不用於限定本發明的範圍。本領域技術人員可以想出它們的修改形式和其他用途。這些修改形式被包括在本發明的精神以內並由申請專利範圍限定。可對本說明書所披露的本發明作出各種不同的替代和修改，而不偏離本發明的範圍和精神。
在本說明書中舉例描述的本發明可在本說明書未特別披露的任何單個元件或多個元件、單個局限或多個局限不存在的條件下實施。本說明書所使用的術語和表達係用於描述而非限定，此類術語和表達的使用並不排除它們所顯示和描述的全部或部分特徵之任何等值物，但應認識到在本發明範圍內，各種修改是可能的。因此，應理解的是，儘管本發明已籍由諸實施例和可選擇的特徵具體地披露，仍可由本領域技術人員對本說明書所披露的概念作出修改和變動，而且此種修改和變動均被認為是屬於申請專利範圍所限定的本發明範圍之內。
實例1
NAPE－PLD酵素的製備：NAPE－PLD已在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表現。由於NAPE－PLD相對低的活性和需要大量蛋白進行高通量篩選，哺乳動物表現系統對NAPE－PLD而言不是好的選擇。為了獲得大量的蛋白來支持HTS，我們在大腸桿菌和杆狀病毒/昆蟲細胞系統中檢測了NAPE－PLD的表現。在大腸桿菌中表現的NAPE－PLD比在杆狀病毒/昆蟲細胞中表現的蛋 白具有更低的溶解度、更低的比活性和更低的表現水準。因此，我們選擇了杆狀病毒/昆蟲細胞作為支持HTS的表現系統。使用pDEST8.1載體(Invitrogen)在昆蟲細胞中表現帶有C端6個His標籤的NAPE－PLD(SEQ ID NO.1)。該表現系統通過金屬螯合層析使大量高純NAPE－PLD的生成成為可能。
NAPE－PLD的序列已在前面描述過(SEQ ID NO.2)。在TritonX－100存在下，具有C端His標籤的蛋白(分子量49kDa)在昆蟲細胞中以可溶的活性形式表現和純化。經發現，表現出的酵素其N端被截短了46個胺基酸(SEQ ID NO.3)。
實例2
一般檢測參數：一般檢測條件使用了下列材料的下列終濃度：14 nM的NAPE－PLD，10 μM PED6(受質)，10 μM的檢測化合物和1%的DMSO。PED6以凍乾粉形式購得(參見表1)並儲存在－20℃。新鮮受質溶液應每日製備。1 mg的PED6溶解在0.88 ml的乙酸乙酯中並稀釋到43.12 ml檢測緩衝液中以製備成20 μM的工作液。PED6必須避免光直射，因為它對光敏感。
將檢測化合物稀釋在適宜的緩衝液中。一個非限制性實例是pH 8.0的50 mM Tris－HCl，該緩衝液可含有DMSO，例如10%的DMSO。檢測緩衝液為pH 8.0的50 mM Tris－HCl，含0.05% Triton X－100；終止液為0.4 M HCl，含0.05% Triton X－100。
試劑的加入次序和使用的設備：
1)將酵素(NAPE－PLD，22 μM)以檢測緩衝液稀釋為28 nM。
2)製備受質(在檢測緩衝液中濃度為20 μM)。
3)使用FLEXDROP將10 μl NAPE－PLD加到檢測板上。
4)使用Cy－Bio將2 μl化合物(來自化合物板)加入檢測板上適宜的孔中。
5)在室溫下對覆蓋的檢測板培育30分鐘(化合物預培育)。
6)使用FLEXDROP將10 μl PED6加到檢測板上。
7)在室溫下對包被的檢測板培育30分鐘(酵素預培育)。
8)使用FLEXDROP加入20 μl終止液停止反應。
9)在LJL Acquest上讀數。激發光濾鏡，485 nM；發射光濾鏡，530 nM。
實例3
受質(PED6)溶劑的優化：由於PED6和NAPE－PLD的其他潛在受質為脂質類，它們極為疏水。因此，加入檢測緩衝水溶液將受質溶解在氯仿中是合理的。我們加入了0－0.05%的Triton X－100以進一步增加PED6在水溶液中的溶解度。而且據報導，高濃度的Triton X－100可增加NAPE－PLD的活性(高至0.2%)(Petersen和Hansen,FEBS Lett.455：41－44,1999)。在這些受質溶劑條件下，該檢測沒有效果(參見表2)。
對如何適宜製備受質問題的進一步研究使得我們研究了用於其他PLD的檢測條件。一篇論文使用了PLD的疏水性脂質類受質。這些疏水性脂質類受質溶解於氯仿，然後與溶於氯仿的磷脂醯肌醇/磷脂醯膽鹼(PI/PC)混合液混合(Petry et al.,J.Lipid Res.46：603－614,2005)。然後乾燥終混合液。為了將該混合液重懸浮於水溶液中，需要進行超音波處理。按照這一步驟，該檢測開始提供可檢測的信號，但訊號背景比低。將Triton X－100加入檢測緩衝水溶液中，增加了訊號背景比，但也增加了檢測雜訊(圖4)。此種嘈雜的檢測不適合於高通量篩選。
有三種方式增加疏水性脂質類受質在緩衝水溶液中的溶解度：有機溶劑(如氯仿)、脂質類(如PI和PC)或清潔劑(如Triton X－100)。由於用在最初溶解中的有機溶劑氯仿最終破壞了蛋白質，我們不得不在加入緩衝水溶液前乾燥除去氯 仿。我們假設如果我們使用了更「有利蛋白」的有機溶劑，例如乙酸乙酯，它會留在檢測緩衝水溶液中而不會破壞蛋白質，並幫助增加疏水性脂質類受質的溶解度。基於該理論，我們使用了乙酸乙酯來溶解疏水性脂質類受質，然後加入含有0－0.1% Triton X－100的緩衝水溶液而不需乾燥除去乙酸乙酯。該檢測策略效果良好(參見表2)。但是，Triton X－100工作濃度的訊號背景檢測窗口受到限制。在低Triton X－100濃度下，該疏水性脂質類受質沒有完全溶解，不能為NAPE－PLD酵素所利用，因此訊號背景比低。增加Triton X－100的濃度增加了酵素對受質的利用，導致更高的訊號背景比。然而，進一步增加Triton X－100濃度導致高得多的背景螢光，從而降低了訊號背景比(圖5)。因此，對於最佳的受質製備條件，我們選擇了條件5(表2)。
實例4
受質和酵素滴定：對於受質滴定，隨著受質濃度從5μM增加到10μM，檢測視窗幾乎增加兩倍而訊號背景比保持恒定(圖6)。使用了高濃度的酵素(1：100)以尋找當前緩衝液條件下最大的螢光信號(0.05% Triton X－100)。
對於酵素滴定，NAPE－PLD被逐級從1：100稀釋至1：6400(圖7)。通過加入終濃度為10 μM的PED6啟動反應。反應體積為20 μl。每隔兩分鐘測量螢光強度。根據這些結果，選擇14 nM的酵素(1：1600)和30分鐘的反應時間 進行進一步實驗。
實例5
NAPE－PLD的Km測定：測定出Km為3.9μM，Vmax為4.46 x 104 FU/min/μg蛋白(圖8)。Vmax的值標準化為所使用蛋白的量。為了能夠鑑定具有不同作用方式的抑制劑，包括競爭性抑制劑，我們選擇從接近測定Km值的5 μM濃度開始受質滴定，發現10 μM受質濃度給出了訊號背景比和對抑制劑敏感性的最佳結合。而且，得出了NAPE－PLD檢測條件的下列參數：14 nM酵素，10 μM受質，反應時間為30分鐘，反應體積為20 μl。
實例6
DMSO敏感性：由於許多化學庫以DMSO標準儲存液保存，我們檢測了該檢測對DMSO的敏成性(圖9)。該檢測對DMSO略顯敏感但對DMSO耐受良好。
實例7
代表性IC50 曲線：目前沒有已知的NAPE－PLD抑制劑。因此，在驗證本檢測過程中發現抑制NAPE－PLD的化合物被用於在該檢測中展示劑量反應活性(圖10)。預計初步檢測中常見的「假 陽性」效應將由破壞微囊的化合物引起，這是因為疏水性受質非常依賴於緩衝液中增強其溶解度的清潔劑。當檢測緩衝液不含有Triton X－100時，受質螢光會低得多，而且該效應可類比陽性化合物。為了鑑定此類「假陽性」，可以在有化合物和受質但沒有酵素的情況下測量螢光，以決定化合物是否干擾受質在Triton X－100存在下的螢光強度。
實例8
Abh4的製備和PED6作為受質的檢測採用pcDNA3.1zeo_DEST載體在FreeStyle 293F細胞(Invitrogen)中選殖和表現人Abh4。該細胞是用於短暫轉染的懸浮細胞系。pcDNA3.1zeo_DEST是pcDNA3.2zeo(Invitrogen)的改質載體。含有Abh4編碼序列的pcDNA3.1zeo_DEST載體披露於SEQ ID NO：4。Abh4表現時帶有C端His標籤(SEQ ID NO：5)。檢測一部分粗裂解液的PED6水解和形成的螢光。將來自轉染細胞的裂解液(75 μg蛋白)加入含有0.05% Triton X－100(溶解受質)的Tris HCl緩衝液(pH 7.6)的PED6溶液(5 μM終檢測濃度)中，終體積為100L。96孔板黑色板的反應由螢光培養板讀取儀Gemini(SpectraMax)連續監測，從最高處開始激發讀數(激發波長488 nm，發射波長520 nm)。使用沒有轉染的FreeStyle 293F細胞的裂解液(75 μg蛋白)作為對照。在這些條件下，觀察到轉染細胞裂解液比對照裂解液高19倍，表明Abh4的存在有效地水解了受質PED6(圖12)，為了進一 步驗證該結果，使用了MAFP(甲基花生四烯酸氟磷酸)抑制劑。濃度為5.34 μM時，該抑制劑表現出>95%的活性抑制，這與Simon和Cravatt(2006)的發現一致。
進行薄層層析(TLC)以確立由Abh4和NAPE－PLD催化的PED6水解的產物是不同的。使用氯仿：甲醇：氨系統的乙酸乙酯提取的酵素反應混合物在矽膠上的TLC表明反應產物不相同。
圖1顯示了水解N－醯基磷脂醯乙醇胺的磷脂酵素D(NAPE－PLD)將N－醯基磷脂醯乙醇胺(NAPE)水解為磷脂酸和花生四烯酸乙醇醯胺。
圖2顯示了包括BODIPY部分的螢光基團和DNP部分的淬熄基團的PED6完整分子的示意圖。NAPE－PLD進行酵素催化水解後，DNP部分從BODIPY部分釋放出來，使得螢光從BODIPY發射出來。
圖3顯示了任何兩個處於適宜位置的螢光分子例如BODIPY和DNP的供體和受體(或淬熄劑)部分的可能位置。標注了NAPE－PLD和Abh4的切割位點。
圖4顯示了用於製備PED6受質的TritonX－100和脂質對BODIPY螢光測量NAPE－PLD活性的訊號背景比的效應。Triton X－100終濃度為0.0125%。使用氯仿溶解受質。
圖5顯示了當使用乙酸乙酯溶解PED6受質時Triton X－100對BODIPY螢光測量NAPE－PLD活性的信號背景比 的效應。
圖6顯示了PED6受質的滴定曲線(CPS＝每秒計數)。
圖7顯示了NADE－PLD酵素的滴定曲線(CPS＝每秒計數)。
圖8顯示了NADE－PLD的Km測定。
圖9顯示了NADE－PLD檢測法中DMSO靈敏度曲線。
圖10顯示了代表性的IC50 曲線。
圖11顯示了用於表現具有C端6個His標籤的NAPE－PLD的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；與全長NAPE－PLD(SEQ ID NO.2)序列相比，表現並純化的具有C端His標籤的NAPE－PLD蛋白被發現其N端被截短(SEQ ID NO 3)。
圖12顯示了表現出的具有C端His標籤的Abh4胺基酸序列(SEQ ID NO：5)。
圖13顯示了反映PED6由Abh4水解引起的螢光發射隨時間變化的代表性軌跡(發射波長520nm)。時間以秒(secs)為單位。RFU是以每分鐘毫螢光單位計的相對螢光單位(mRFU/min)。A1(空心環)表示僅有受質對照(斜率＝17335mRFU/min)，A2(空心正方形)表示用含有Abh4的載體轉染的細胞的裂解液(斜率＝849272 mRFU/min)，A3(空心三角形)表示未轉染細胞的裂解液(斜率＝41622 mRFU/min)。
<110> sanofi－aventis US LIC Peppard,Jane V. Mehdi,Shujaath Li,Zhuyin Duguid,Mei S. <120> ASSAY METHODS FOR IDENTIFYING AGENTS THAT MODIFY THE ACTIVITY OF NAPE－PLD OR ABH4 <130> US2006/230 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> 人<400> 1<210> 2 <211> 399 <212> 蛋白質<213> 人<400> 2 <210> 3 <211> 353 <212> 蛋白質<213> 人<400> 3 <210> 4 <211> 6130 <212> DNA <213> 人工<220> <223> pcDNA3.1zeo_DEST vector containing human Abh4 <400> 4 <210> 5 <211> 348 <212> 蛋白質<213> 人<400> 5

Claims (23)

  1. 一種鑑定調節NAPE-PLD或Ab4h活性之劑的方法，該方法包括：a)將NAPE-PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；b)將一劑加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中；c)將一受質加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和淬熄劑部分，其中該供體部分和該淬熄劑部分之間的分子內近距離產生淬熄的可檢測信號。d)將該劑、該NAPE-PLD或Abh4和該受質在該儲槽陣列中培育一段預定時間；e)在該儲槽陣列中當NAPE-PLD或Abh4從該受質上除去該淬熄劑部分後，測量來自該供體部分的可檢測信號的量；以及f)將包括該劑、該受質和該NAPE-PLD或Abh4的第一儲槽中的可檢測信號的量與包括該受質和該NAPE-PLD或Abh4的第二儲槽中的可檢測信號的量進行比較當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
  2. 一種鑑定調節NAPE-PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：a)將NAPE-PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；b)將一劑加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中； c)將一種受質加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和淬熄劑部分，其中該供體部分和該淬熄劑部分之間的分子內近距離產生淬熄的可檢測信號。d)在第一時間點在該儲槽陣列中當NAPE-PLD或Abh4從該受質上除去該淬熄劑部分後，測量來自該供體部分的可檢測信號的量；e)將該劑、該NAPE-PLD或Abh4和該受質在該儲槽陣列中培育一段預定時間；f)在第二時間點在該儲槽陣列中當NAPE-PLD或Abh4從該受質上除去該淬熄劑部分後，測量來自該供體部分的可檢測信號的量；以及g)比較第一時間點的可檢測信號的量與第二時間點的可檢測信號的量，當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
  3. 一種鑑定調節NAPE-PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：a)將NAPE-PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；b)將一劑加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中；c)將一受質加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和受體部分；d)將該劑、該NAPE-PLD或Abh4和該受質培育一段預定時間； e)測量可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於該供體部分、該受體部分、供體部分與受體部分之比和供體-受體部分複合物；以及f)將包括該劑、該受質和該NAPE-PLD或Abh4的第一儲槽中的可檢測信號的量與包括受質和NAPE-PLD或Abh4的第二儲槽中的可檢測信號的量進行比較當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
  4. 一種鑑定調節NAPE-PLD或Abh4活性之劑的方法，該方法包括：a)將NAPE-PLD或Abh4加入一儲槽陣列中的至少一個儲槽中；b)將一劑加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中；c)將一種受質加入該儲槽陣列中的至少一個儲槽中，其中該受質包括供體部分和受體部分；d)測量第一時間點的可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於該供體部分、該受體部分、供體部分與受體部分之比和供體-受體部分複合物；e)將該劑、該NAPE-PLD或Abh4和該受質培育一段預定時間；f)測量第二時間點的可檢測信號的量，其中所測量的可檢測信號選自於該供體部分、該受體部分、供體部分於受體部分之比和供體-受體部分複合物；以及g)比較第一時間點的可檢測信號的量與第二時間點的可檢測信號的量 當差異超過預先確定的閾值時，即將該劑鑑定為調節劑。
  5. 根據申請專利範圍第3項或第4項之方法，其中該可檢測信號由螢光共振能量轉移測量。
  6. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法還包括在步驟c前培育該劑和該NAPE-PLD或Abh4一段預定時間。
  7. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中步驟a、b和c可以任何次序進行或可一起進行。
  8. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法還包括至少一種對照。
  9. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法還包括至少一種抑制劑、誘導劑或調節劑。
  10. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中該受質為PED6。
  11. 根據申請專利範圍第10項之方法，其中該PED6是溶解在乙酸乙酯中。
  12. 根據申請專利範圍第11項之方法，其中溶解的PED6被加入含有約0.005到0.1%的Triton X-100的緩衝液中。
  13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝液含有約0.05%的Triton X-100。
  14. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中可檢測信號選自於螢光染料、發色團、酵素、連接子部分、生物素、電子供體、電子受體、染料、金屬和放射性核種。
  15. 根據申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該供體部分和該淬熄劑部分選自於BODIPY/DNP、若丹明/DNP和Cy染料/DNP。
  16. 根據申請專利範圍第3項或第4項之方法，其中該供體部分和該受體部分選自於Texas紅和螢光素、BODIPY和螢光素、鍺和別藻藍蛋白(APC)、藍綠色螢光蛋白/黃色螢光蛋白和綠色螢光蛋白/藍色螢光蛋白。
  17. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中步驟a中的該NAPE-PLD或Abh4通過在儲槽中培養短暫或穩定轉染以表現NAPE-PLD或Abh4的原核或真核細胞來提供。
  18. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中NAPE-PLD或Abh4通過從生物樣品或從短暫或穩定轉染以表現NAPE-PLD或Abh4的細胞分離得到。
  19. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中該生物樣品的來源選自於人、猴、大鼠、小鼠、兔和豚鼠等哺乳動物。
  20. 根據申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之方法，其中有一個或多個步驟是由機器人或工作站設備執行的。
  21. 一種用於鑑定調節NAPE-PLD或Abh4活性之劑的檢測系統，該檢測系統包括：a)一儲槽陣列；b)NAPE-PLD或Abh4；c)一種包括供體部分和淬熄劑部分的受質，其中該供體部 分可檢測；以及d)至少一種組分，其中該組分選自於劑、誘導劑、抑制劑、調節劑、誘導劑的調節劑、抑制劑的調節劑和對照。
  22. 一種用於鑑定調節NAPE-PLD或Abh4活性之劑的檢測系統，該檢測系統包括：a)一儲槽陣列；b)NAPE-PLD或Abh4；c)一種包括供體部分和受體部分的受質，其中該供體部分或該受體部分或兩者可被檢測；以及d)至少一種組分，其中該組分選自於由劑、誘導劑、抑制劑、調節劑、誘導劑的調節劑、抑制劑的調節劑和對照。
  23. 一種包括根據申請專利範圍第21項或第22項之檢測系統之至少一個元件和使用說明的試劑套組。
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