WO2012001121A1 - Inhibiteurs de la calpaïne 3 pour le traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies - Google Patents

Inhibiteurs de la calpaïne 3 pour le traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies Download PDF

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mice
muscle
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Isabelle Richard
Karine Charton
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Genethon
Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • the present invention relates to the treatment of diseases affecting striated muscle (skeletal muscle and / or cardiac muscle), and in particular tibial muscular dystrophy (TMD for Tibial Muscular Dystrophy). It advocates the identification and use of calpain 3 inhibitors as drugs for the treatment of these diseases.
  • TMD tibial muscular dystrophy
  • Neuromuscular diseases include various pathologies that are generally associated with a loss of transient or permanent muscle strength. This loss of strength is usually accompanied by muscle wasting, also known as amyotrophy.
  • myopathies are an important group corresponding to attacks of the muscle fiber itself.
  • progressive muscular dystrophies are characterized by a decrease of the muscular force with generally atrophy of the muscles, as well as by visible abnormalities on muscular biopsy, revealing a modification of the tissue.
  • This group includes Duchenne muscular dystrophy (DMD), Becker muscular dystrophy (or DMB), proximal muscular dystrophies called belts or distal including tibial muscular dystrophy (or TMD).
  • Tibial muscular dystrophy Tibial Muscular Dystrophy
  • TMD Tibial muscular dystrophy
  • Tibial Muscular Dystrophy has been demonstrated for the first time in Finnish consanguineous families (Udd et al, 1993).
  • Tibial muscular dystrophy is characterized by atrophy and muscle weakness usually confined to the anterior compartment of the lower limbs, mainly Tibialis Anterior (TA).
  • TA Tibialis Anterior
  • the calf of the patients shows a prominence in its ventral part.
  • the first symptoms are declared often asymmetrically and tend to become bilateral over time (Udd et al, 1998).
  • the first clinical symptoms appear around the age of 35 (Udd et al., 1993).
  • the disease progresses slowly and in the majority of patients walking is preserved with however the impossibility of putting the heel during walking and in the most severe cases the need for a walking aid. No cardiac involvement or facial involvement was observed.
  • the CPK level remains normal or moderately high (Udd et al, 1998).
  • Patient muscle biopsies show myopathic-dystrophic changes of varying severity including changes in muscle fiber size (often the presence of larger fibers), internalized nuclei, and some basophilic or necrotic-positive fibers (Udd et al, 1992). ); (Partanen et al, 1994).
  • apoptotic nuclei have been demonstrated on Tibialis biopsies in TMD patients (Haravuori et al, 2001).
  • the biopsies visualized by electron microscopy show, in a variable way according to the patients, the presence of some vacuoles containing cellular debris whereas the structure of the sarcomère is preserved (Udd et al, 1993).
  • titin (Hackman et al, 2002).
  • the titin (OMIM # 18840, also called connectine) is a giant protein encoded by a gene of approximately 294 kb size located on chromosome 2, region 2q31 and composed of 363 exons encoding 381 388 amino acids.
  • the molecular weight of titin is 3000 to 3700 kDa (Bang et al, 2001).
  • the titine extends from the Z disk to the sarcomere M line (Furst et al, 1988, Wang et al, 1979) which corresponds to a half sarcomere.
  • Essential protein for the organization and integrity of sarcomeres it constitutes the third network of The most abundant filaments in striated muscle, representing about 10% of the myofibrillar mass after those of actin and myosin, represent the only continuous system along the length of the sarcomeres.
  • the N-terminal portions of two titin molecules belonging to two adjacent sarcomeres are anchored in Z-streak where they overlap antiparallel (Gregorio et al, 1998).
  • the C-terminal region participates in the structure of the sarcomere M-line, where two adjacent sarcomere titin molecules overlap (Obermann et al, 1997); (Furst et al., 1999). Finally, the central part of the titine (the band I) forms the elastic part of the molecule. Because of its size and its many protein interactions, titin plays an important role in assembling sarcomeres, maintaining contractile elements during contraction, integrating thick filaments into the sarcomere, controlling integrity and ensuring stability. mechanical sarcomere.
  • the deployment of the titine generates a force able to oppose the tension of stretching of the sarcomère: during the contraction of a striated muscle, the active tension comes from the action of the thin filaments of actin on the thick myosin filaments and the passive tension results from the extension of the titin.
  • the active tension comes from the action of the thin filaments of actin on the thick myosin filaments and the passive tension results from the extension of the titin.
  • it has an important role in signaling pathways (Trinick, 1994) (Labeit and Kolmerer, 1995) (Gregorio et al, 1999) (Machado and Andrew, 2000) (Squire, 1997) (Clark et al, 2002) (Lange et al, 2005), especially since it has many partners throughout the sarcomere.
  • FINmaj major in Finland
  • This mutation in the heterozygous state leads to TMD.
  • the FINmaj mutation is the consequence of an 11 bp deletion / insertion (AAGTAACATGG -> TGAAAGAAAAA) resulting in the modification of 4 acidic amino acids into 4 basic amino acids E33359_W33362delinsVKEK (EVTW -> VKEK) in a very conserved hydrophobic zone of the mlO domain titin (Hackman et al, 2002).
  • This mutation appears to be the result of a recombination of the DNA with the same sequence present in an intron located in the band A of the titin between the exons 246 (Fn3) and 247 (Ig) of the healthy gene 87 204 bp upstream from the last exon, Mex6.
  • tryptophan is mutated into a charged lysine.
  • this tryptophan residue is generally highly conserved in all Ig repeats of titin and is known to be of crucial importance in the stabilization of the hydrophobic core of the three-dimensional structure of the immunoglobulin-like domain (Improta et al, 1998).
  • calpain 3 binds to the unique region coded by the penultimate exon of titin called Mex5 (coding for the is7 domain) of titin (Kinbara et al., 1997).
  • Calpains are a family of non-lysosomal cysteine proteases activated by calcium. This family currently comprises 11 members, including 2 ubiquitous proteins (calpains 1 and 2). The physiological functions of calpains remain largely unknown. As regulatory type proteases, they presumably regulate important cellular functions.
  • Calpain 3 (also called p94) belongs to the calpain family, all of which are cysteine proteases (Dear et al., 1999). Calpain 3 is encoded by a gene consisting of 24 exons spread over a 35 kb region of chromosome 15. The 94 kDa protein has 821 amino acids and is composed of four domains found in members of the calpain family. The first biochemical characterizations of calpain 3 showed that this enzyme was self-colonizing in the form of two main fragments (Sorimachi et al., 1993). This autolysis, which takes place in the IS1 domain, is the mechanism of activation of the protease and is described as sequential (Taria et al., 2003). Thus three autolysis sites (SI, S2 and S3) have been demonstrated in IS1, resulting in the formation of a short fragment of 34 kDa and longer fragments between 55 and 60 kDa (Kinbara et al., 1998).
  • a helix encoded by the IS1 sequence closes the catalytic groove, preventing substrates and inhibitors from penetrating it (Diaz et al., 2004).
  • the latter self-polymerizes, it releases the fragment IS1 (intramolecular cleavage) which then releases the catalytic groove.
  • the protein that has become active can then cleave its substrates but also other calpain 3 molecules (intermolecular cleavage).
  • calpain 3 is predominantly present in non-autolysed 94kDa (Kinbara et al., 1998, Sorimachi et al., 1990), suggesting that it is predominantly in an inactive form and that activation signal to activate it is necessary.
  • calpain 3 The precise function of calpain 3 in skeletal muscle is not known, but its deficiency is responsible for LGMD2A. Recessive mutations in the calpain 3 gene are responsible for LGMD2A (Limb Girdle Muscular Dystrophy 2A) (Richard et al., 1995), the most common form of belted dystrophy (30 to 40% of these). It appears that there is a continuing need to develop new drugs to treat the broad spectrum of pathologies affecting striated muscle, including muscular dystrophies.
  • the present invention proposes new therapeutic approaches to treat certain forms of muscular dystrophies - in particular TMD - or cardiomyopathies, and offers the possibility of identifying new drugs intended for these pathologies.
  • the present invention is based on the demonstration by the Applicant that partial inhibition of calpain 3 can improve certain forms of muscular dystrophies, including TMD.
  • the invention relates to a composition comprising a calpain 3 inhibitor for the treatment of diseases affecting striated muscle, in particular muscular dystrophies and cardiomyopathies, and even more specifically those associated with overexpression. or overactivation of calpain 3.
  • composition comprising a calpain 3 inhibitor to prepare a medicament for the treatment of muscular dystrophies and cardiomyopathies.
  • Said composition may further contain any acceptable compound or excipient, especially pharmaceutically. It may further include other active ingredients for treating the same pathology or other pathology.
  • the inhibitor (s) of calpain 3 are the only active ingredients of the composition.
  • the route of administration may be intramuscular or intravenous, or even subcutaneous, intraperitoneal or oral.
  • calpain inhibitor 3 means any molecule able to reduce or reduce the activity of calpain 3. Since calpain 3 potentially has many biological implications in vivo, only partial suppression is preferred.
  • calpain 3 a specific inhibitor of calpain 3 is advantageously used in the context of the invention.
  • the term "specific” means that it exclusively or predominantly inhibits calpain 3 but not other biologically active proteins in vivo. In particular, it appears very important to check the specificity of the inhibitor vis-à-vis proteins close to calpain 3, namely other calpain and especially ubiquitous calpain 1 and 2.
  • the interest of an inhibitor Specifically, it generally offers greater selectivity and efficiency. Clinically, this results in fewer potential side effects.
  • the reduction or inhibition of the activity of calpain 3 can result from 2 modes of action distinct from inhibitory molecules:
  • the molecule has the effect of reducing the expression and / or the amount of calpain 3 produced, by acting in particular at the transcription / translation level of the calpain 3 gene.
  • mode of action of the antisense oligonucleotides, the AR if, the SHRs and ribozymes which constitute preferred inhibitors within the meaning of the invention.
  • Such molecules can be easily identified by those skilled in the art, in particular on the basis of the calpain 3 gene sequence.
  • a particularly relevant sequence for the therapy in humans is that of the human calpain 3 gene. SEQ ID NO: 1.
  • sequence of the murine calpain 3 gene is also of interest and is illustrated in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the targeted exons are advantageously exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 and 10.
  • the sequences that are important for splicing branching point or BP, donor and splice acceptor sites, ESE (Exonic Sequence Enhancer) splice factor binding sites (SR proteins)
  • SR proteins splice factor binding sites
  • an interfering RNA of the type si ("small interference") is also a preferred inhibitor within the meaning of the invention.
  • small interference an interfering RNA, of the type si
  • the following oligonucleotides the position of which is marked in FIG. 8, are capable of exerting this function, in both mice and humans:
  • AACCTCTCCTTCTGGTCTGAACA (SEQ ID NO: 5)
  • GCAACAAGGAGCTGGGTGT (SEQ ID NO: 7)
  • calpain 3 is "normally" produced but it is its activity that is affected by the inhibitor in question.
  • the inhibitor is typically a calpain 3 antibody, a chemical molecule, a protein or a peptide having the desired inhibitory activity.
  • the activity of calpain 3 can be measured by various tests, including those described in WO 2003/002730, WO2007 / 039699 and Milic et al. (2007).
  • proteins or peptides of interest are advantageously chosen from those having a calpain 3 inhibitory activity in vivo.
  • Isabelle Richard's team has recently shown that the myospryne protein (CMYA5, cardiomyopathy-associated 5) of sequence SEQ ID NO: 9 (human) or SEQ ID NO: 10 (murine), was able to perform this function .
  • An active fragment thereof for example of sequence SEQ ID NO: 11 (human) or SEQ ID NO: 12 (murine), can also be implemented within the scope of the invention.
  • the exogenous contribution of these proteins or active derivative peptides therefore has the consequence of reducing in vivo the activity of calpain 3 and thus of improving the pathological conditions targeted by the present invention.
  • the present invention relates to a method of identifying or screening drugs for the treatment of muscular dystrophies, advantageously TMD, or cardiomyopathies.
  • the inhibitory potential can be evaluated either by measuring the expression or production of calpain 3, or by measuring its activity, using the techniques mentioned above. These measurements are carried out in parallel in the presence and absence of the test compound, and then compared.
  • the present invention finds applications in the treatment of muscular dystrophies, affecting the skeletal muscles. More generally, pathologies targeting striated muscle, and therefore also those affecting the heart muscle called cardiomyopathies, are targeted.
  • the present invention demonstrates the possibility of treating tibial muscular dystrophy (TMD for Tibial Muscular Dystrophy) using this strategy.
  • the present invention reveals, for the first time, the correlation between muscular dystrophies and a possible overactivation of calpain 3. It is recalled that to date, only in relation to calpain 3, are dystrophies belts related to a deficient calpain 3. The present invention highlights the existence of muscular dystrophies possibly due to overexpression or overactivation of calpain 3, which may be called "dominant calpainopathies" and be treated using the proposed strategy.
  • the present invention is directed to the treatment of cardiomyopathies possibly due to overexpression or overactivation of calpain 3, or to an exogenous supply of calpain 3.
  • calpain 3 is expressed in the heart, although much more weakly than in Skeletal muscle (Taria et al., 2002) and Isabelle Richard's team showed that beyond a threshold, calpain 3 could have deleterious effects on the heart muscle.
  • the invention is further illustrated in connection with TMD in mice.
  • FIG. 1 AI Histology of muscles of heterozygous mice for the FINmaj and WT mutation.
  • TA Anterior Tibialis
  • QUA Quadriceps
  • BF Biceps Femoris
  • SOL Soleus
  • GLU Glutens
  • PLA Plantar
  • PSO Psoas
  • DEL Deltoid
  • GA Gastrocnemius
  • B Quantification of the centronucleation of the fibers of the muscles TA, QUA and BF of the mice HE and WT.
  • Figure 3 Labeling of titin degradation bands with an antibody directed against the terminal part of titin (encoded by the last exon) after subcellular fractionation of Psoas of WT and HE mice for the FINmaj mutation.
  • Figure 4 AI Histology of heterozygous muscles for FINmaj and WT mutation after IM injection of AAV coding for human calpain 3.
  • B quantification of the centronucleation of injected and non-injected TA fibers with AAV C3 of WT and HE mice.
  • Figure 5 Histology of muscles of HE and WT mice, capn3 +/- and HE / capn3 +/- at 9 months and quantification of centronucleation.
  • AL TA B / QUAD C / BF. Bar 50 ⁇ m.
  • Figure 6 Histology of muscles of HE and WT mice, capn3 +/- and HE / capn3 +/- at 12 months and quantification of centronucleation.
  • AI TA B / QUAD CI BF. Bar 50 ⁇ .
  • Figure 7 Localization of potential targets for antisense sequences, located in the introns (lowercase) / exons (upper case) 2, 3, 4, 5, 7, 8 and 10, at the level:
  • Figure 8 Position of oligonucleotides 1 to 6 (SEQ ID NOS: 3 to 8) capable of decreasing the expression of the messenger of calpain 3 by RNA interference.
  • Figure 9 RT-PCR on murine calpain 3 between exons 2 and 6 after 24h transfection of C3 minigene and AONs in HER911 cell. Whole RNA transcribed and spliced from the minigene gives a 645 bp band. The use of the exon3-ESE2 and exon4-ESE1 AONs shows the presence of a larger band of exon-jump spliced RNA. The arrows indicate the main isoforms after exon jump.
  • Figure 11 Exemption of exons 3, 4 or 5 by AONs alone or combined on endogenous calpain 3 in HER911 cells.
  • FIG. 12 RT-PCR of exon 2 to 5 (495bp) carried out on the RNAs extracted from the TAGs injected with the AONs targeting exon 3; TADs are the side controls of experience. In most TAGs the amount of calpain 3 visible is significantly decreased (arrow).
  • FIG 13 Real-time RT-PCR of calpain 3 performed on the RNAs extracted from the TAGs injected with the AONs targeting exon 3; TADs are the lateral controls of the experiment. Here for the sake of clarity only the mice injected with EX3-ESE1 are presented. In all TAGs, the amplification curve of calpain 3 is shifted to the right. Each sample is presented in duplicate.
  • Figure 14 Representation of the number of cycles at the end of which the arbitrarily chosen value of 0.2 is reached by RT-PCR in real time.
  • the construction of the targeting vector used for the generation of the FINMAJ knock-in mouse was carried out at the "Clinique de la souris" Institute (ICS, France).
  • a 2.2 kb fragment encompassing the Mex2 to Mex6 exons of titin was amplified by PCR on 129S2 / SvPas mouse genomic DNA with primers modified to introduce the GAAATAACATGG -> GTGAAAGAAAAA mutation into the exon. 6.
  • the mutated fragment was subcloned into a vector containing a lox-neomycin resistance cassette.
  • Two fragments of 2.8 kb and 3.6 kb were amplified by PCR on 129S2 / SvPas mouse genomic DNA and subcloned directly upstream. and downstream of the construction of the preceding plasmid to generate the final construct.
  • the sequence of the plasmids was checked by restriction and all the exons and exon-intron junctions were sequenced.
  • the linearized construct was electroporated into 129S2 / SvPas mouse embryonic stem (ES) cells and the G418-resistant colonies were isolated and amplified.
  • the sequence of clones obtained was validated after PCR amplification using external primers, confirmed by Southern blot with 5 'and 3' external probes and identified a clone with a correctly targeted allele.
  • the ES transgenic clone was injected into C57BL / 6J blastocysts which were reimplanted into surrogates to generate chimeric mice. Transmission to the germ line was obtained after crossing the male chimeras with CMV-CRE transgenic females expressing CRE recombinase under the CMV promoter, allowing excision of the neo cassette.
  • the Cre transgene was removed by a first cross on C57BL / 6 background; the resulting heterozygous mice were then backcrossed over 3 generations on C57BL / 6 background, and then crossed. All mice were treated according to the Council Directive of 24 November 1986 (86/609 / EEC).
  • the resulting wild-type and mutant alleles correspond to PCR fragments of 414 and 502 bp, respectively.
  • Cryosections (8 or 10 mm thick) were prepared from frozen skeletal and cardiac muscles. The cross sections were processed for histological staining hematoxylin phloxine saffron (HPS).
  • Colorimetric and immunolabeling with laminin were performed according to the ARK peroxidase kit (Dako) protocol to assess the number and minimum diameter fiber.
  • the antibodies used for these detections are respectively: a polyclonal anti-laminin antibody (Progen, P-4417, the 1: 1000 dilution).
  • the digital images of the colored sections were acquired with a CCD camera (Sony) and a motorized stage of a Nikon Eclipse E60 microscope. The images were analyzed with the Ellix software (Microvision, France).
  • the muscle tissue was weighed and homogenized using an Ultra-Turrax T8 (IKA, Germany). An in vitro test measuring calpain activity 3 was then performed on these extracts as previously described (Milic et al, 2007).
  • the proteins were extracted with the Subcellular ProteoExtract Proteome Kit (Spek, Calbiochem, Germany). Under these experimental conditions, the western blot of the cytoskeleton fraction using the M 10 antibody reveals specific titine bands.
  • the Western blots were carried out as described using 50 ⁇ g of proteins (Milic et al., 2007).
  • the analysis of the proteolytic activity of calpain 3 was carried out using a rabbit anti-calpain polyclonal antibody 3 (Baghdiguian et al., 1999, dilution 1: 150) and an anti-mouse monoclonal antibody. alpha-actin (A4700, Sigma, 1: 500 dilution). The membranes were incubated with anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies (1: 10,000) coupled to IRDye® for development by the Odyssey infrared scanner (LI-COR Biosciences, Kansas, USA). Quantification of the bands was performed with Odyssey 2.1 software (LI-COR Biosciences). Detection of the titin bands was performed using the M 10 antibody.
  • the membranes were incubated with anti-mouse or rabbit anti-secondary (1: 10,000) antibodies coupled to peroxidase (HRP, Amersham Biosciences, NJ , USA). The revelation was carried out with the Super Signal West Pico PH kit (Pierce, IL, USA).
  • AAV2 / 1 adenovirus viral preparations were generated by incorporating recombinant AAV2-ITR viral genomes into AAV1 capsids using a plasmid tri-transfection protocol as described (Bartoli, 2006). Briefly, 293 HEK cells (60% confluent) were cotransfected with pAAV-calpain3, the RepCap plasmid (pLT-RC02), and the adenoviral helper plasmid (pXX6) at a ratio of 1: 1: 2. The crude viral lysate is harvested 60 hours after transfection.
  • the crude lysate is sequentially treated by four cycles of freezing-thawing, digested by the benzonase (15 'to 37 ° C) and precipitated with ammonium sulfate. Finally, the viral lysate is purified by two cycles of CsCl ultracentrifugation followed by dialysis to remove CsCl. The determination of the viral titre is obtained by real-time PCR, as described in Fougerousse et al (2007).
  • mice received by intramuscular injection into the left Tibialis Anterior (TA) muscle 30 ⁇ l of AAVr2 / l- calpaine3 (1.10 e12 vg). One month after the injection, the mice are sacrificed and the muscles are removed and then rapidly frozen in isopentane-cooled liquid nitrogen. II) RESULTS
  • a murine Knock-in of the FINmaj mutation was created at the Mouse Clinic by homologous recombination.
  • Heterozygous mice (HE) for mutation were characterized at different ages in parallel with healthy mice (WT). Although they show no overall damage, some muscles show a centronucleating profile late, from the age of 9 months, such as TA, QUAD (Quadriceps) and BF (Biceps Femoris).
  • Muscle histology was performed in mice at 3, 6, 9 and 12 months of age and the muscles were examined by hematoxylin / eosin staining and compared to WT mice ( Figure 1A). Finally, the calculation of centronuclear fibers was performed on these same muscles compared to WT mice ( Figure 1B).
  • mice for the FINmaj mutation received an intramuscular injection, using an AAV coding for human calpain 3, at 9 months of age in one of the TAs to see what effect calpain 3 overexpression could have on the histological profile of TA.
  • the inhibitor sought is intended to perform exon skips of calpain 3 to partially block the translation of this protein, and thus reduce the amount of calpain 3 in the muscle of mice heterozygous for the FINmaj mutation.
  • Antisense sequences likely to induce exon skipping, in order to eliminate a critical exon for the proteolytic activity or to induce a reading frame break at the beginning of the sequence, are preferred candidates.
  • the targeted exons are advantageously exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 and 10.
  • sequences that are important for splicing are preferred, which are illustrated with respect to the human gene of sequence SEQ ID NO: 1, in FIG.
  • the murine sequences on the exons 3, 4 and 5 chosen are presented in Table 1: Table 1: 2'omethyl oligonucleotides specific for calpain 3 tested for exon skipping in mice.
  • oligonucleotides of 2'omethyl chemistry were synthesized at Eurogentec according to PAGE purification. 3 AONs were selected by exon (see Table 1 above).
  • the AONs were added to the cells for 24 hours by the same type of transfection. Cells were then recovered and RNA extraction was performed followed by reverse transcription. A PCR between exons 2 and 6 was then performed to determine if the exons were skipped on the minigene.
  • the expected size of the minigene after splicing with PCR exon 2 to 6 is 645pb. Other bands are visible in the case of the presence of the minigene alone which is the consequence of internal exon jump without the presence of the AONs.
  • CAPNl l A calpain with high mRNA levels in testis and located on chromosome 6. Genomics. 59: 243-7.
  • Insertion sequence of muscle-specific calpain, p94 acts as an internal propeptide. J Biol Chem. 279: 27656-66.
  • Truncating mutations in C-terminal titin can cause more severe tibial muscular dystrophy (TMD). Neuromuscul Disord. 18: 922-8.
  • Tibial muscular dystrophy is a titinopathy caused by mutations in TTN, the gene encoding the giant skeletal-muscle protein titin. Am J Hum Broom. 71: 492-500.
  • Improta S., J.K. Krueger, M. Gautel, R. A. Atkinson, J. F. Lefevre, S. Moulton, j.
  • D-Titin a giant protein with dual roles in chromosomes and muscles. J Cell Biol. 151: 639-52.
  • LGMD2A biopsies have normal calpain 3 proteolytic activity as determined by an in vitro assay. Neuromuscul Disord, 17, 148-156.
  • LGMD2J Neurology. 64: 636-42.

Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour le traitement de cardiomyopathies ou de dystrophies musculaires, en particulier la dystrophie musculaire tibiale (TMD pour Tibial Muscular Dystrophy).

Description

INHIBITEURS DE LA CALPAÏNE 3 POUR LE TRAITEMENT DE DYSTROPHIE S MUSCULAIRES ET DE CARDIOMYOPATHIES
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne le traitement de maladies affectant le muscle strié (muscles squelettiques et/ou muscle cardiaque), et en particulier de la dystrophie musculaire tibiale (TMD pour Tibial Muscular Dystrophy). Elle préconise l'identification et l'utilisation d'inhibiteurs de la calpaïne 3 comme médicaments pour le traitement de ces maladies.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les maladies neuro musculaires regroupent des pathologies diverses qui sont généralement associées à une perte de force musculaire transitoire ou permanente. Cette perte de force s'accompagne le plus souvent d'une fonte musculaire, également appelée amyotrophie. Parmi ces maladies musculaires, les myopathies constituent un groupe important correspondant à des atteintes de la fibre musculaire à proprement parler. Parmi elles, les dystrophies musculaires progressives se caractérisent par une diminution de la force musculaire avec généralement une atrophie des muscles, ainsi que par des anomalies visibles sur biopsie musculaire, révélant une modification du tissu. Appartiennent notamment à ce groupe la dystrophie musculaire de Duchenne (ou DMD), la dystrophie musculaire de Becker (ou DMB), les dystrophies musculaires proximales dite des ceintures ou distales dont la dystrophie musculaire tibiale (ou TMD). La dystrophie musculaire tibiale (TMD, Tibial Muscular Dystrophy) a été mise en évidence pour la première fois dans des familles finlandaises consanguines (Udd et al, 1993).
La dystrophie musculaire tibiale est caractérisée par une atrophie et une faiblesse musculaire en général confinée au niveau du compartiment antérieur des membres inférieurs, principalement le Tibialis Antérieur {TA). Le mollet des patients montre une proéminence dans sa partie ventrale. Les premiers symptômes se déclarent souvent de façon asymétrique et tendent avec le temps à devenir bilatéraux (Udd et al, 1998). Les premiers symptômes cliniques apparaissent vers l'âge de 35 ans {Udd et al., 1993). La maladie progresse lentement et chez la majorité des patients la marche est préservée avec toutefois l'impossibilité de poser le talon pendant la marche et dans les cas les plus sévères la nécessité d'une aide à la marche. Aucune atteinte cardiaque ni d'atteinte faciale n'a été observée. Le taux de CPK reste normal ou modérément élevé (Udd et al, 1998). Néanmoins, une grande hétérogénéité a été mise en évidence chez un panel de patient TMD (constituant près de 9% des TMD totales), avec des atteintes plus ou moins variables pouvant toucher d'autres muscles tels que le Quadriceps et le Soléaire, mais aussi quelquefois des atteintes distales et proximales pouvant même impliquer les muscles des bras (Udd et al, 2005). L'Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) réalisée sur différents patients montre un remplacement du muscle par du tissu conjonctif et adipeux dans le TA et selon l'atteinte, dans le Quadriceps et le Soléaire.
Les biopsies musculaires des patients montrent des changements myopathiques- dystrophiques de sévérité variable incluant une modification de la taille des fibres musculaires (souvent la présence de fibres plus grosses), des noyaux internalisés et quelques fibres positives aux basophiles ou nécrosées (Udd et al, 1992); (Partanen et al, 1994). De plus, des noyaux en apoptose ont pu être mis en évidence sur les biopsies de Tibialis des patients TMD (Haravuori et al, 2001). Les biopsies visualisées en microscopie électronique montrent, de façon variable selon les patients, la présence de quelques vacuoles contenant des débris cellulaires alors que la structure du sarcomère est préservée (Udd et al, 1993).
En 2002, les équipes d'Isabelle Richard et Bjarne Udd mettent en évidence la mutation la plus fréquente en Finlande dans le gène codant pour la plus grande protéine du vivant : la titine (Hackman et al, 2002). La titine (OMIM#18840, appelée également connectine) est une protéine géante codée par un gène d'une taille approximative de 294 kb situé sur le chromosome 2, région 2q31 et composé de 363 exons codant pour 381 388 acides aminés. La masse moléculaire de la titine est de 3 000 à 3 700 kDa (Bang et al, 2001). La titine s'étend du disque Z à la ligne M du sarcomère (Furst et al, 1988; Wang et al, 1979) ce qui correspond à un demi- sarcomère. Protéine essentielle pour l'organisation et l'intégrité des sarcomères, elle constitue le troisième réseau de filaments le plus abondant dans le muscle strié, représentant quelque 10% de la masse myofïbrillaire après ceux de l'actine et de la myosine et représente le seul système continu sur toute la longueur des sarcomères. Les parties N-terminales de deux molécules de titine appartenant à deux sarcomères adjacents sont ancrées dans la strie Z où elles se chevauchent de manière antiparallèle (Gregorio et al, 1998). La région C-terminale participe à la structure de la ligne M du sarcomère, où deux molécules de titine de sarcomères adjacents se superposent (Obermann et al, 1997); (Furst et al., 1999). Enfin, la partie centrale de la titine (la bande I) forme la partie élastique de la molécule. De par sa taille et ses nombreuses interactions protéiques, la titine joue un rôle important dans l'assemblage des sarcomères, le maintien des éléments contractiles pendant la contraction, l'intégration des filaments épais dans le sarcomère, contrôle l'intégrité et assure la stabilité mécanique du sarcomère. De plus, lors du travail musculaire, le déploiement de la titine génère une force capable de s'opposer à la tension d'étirement du sarcomère : pendant la contraction d'un muscle strié, la tension active provient de l'action des filaments minces d'actine sur les filaments épais de myosine et la tension passive résulte de l'extension de la titine. Enfin, elle a un rôle important dans les voies de signalisation (Trinick, 1994) (Labeit and Kolmerer, 1995) (Gregorio et al, 1999) (Machado and Andrew; 2000) (Squire, 1997) (Clark et al, 2002) (Lange et al, 2005), notamment car elle a de très nombreux partenaires tout au long du sarcomère.
Une mutation détectée sur des patients finlandais, FINmaj (majeure en Finlande), a été identifiée dans le dernier exon de la titine (Hackman et al, 2002). Cette mutation à l'état hétérozygote entraine la TMD. La mutation FINmaj est la conséquence d'une délétion/insertion de 11 pb (AAGTAACATGG -> TGAAAGAAAAA) entraînant la modification de 4 acides aminés acides en 4 acides aminés basiques E33359_W33362delinsVKEK (EVTW -> VKEK) dans une zone hydrophobe très conservée du domaine mlO de la titine (Hackman et al, 2002). Cette mutation semble être le fruit d'une recombinaison de l'ADN avec une même séquence présente dans un intron situé dans la bande A de la titine entre les exons 246 (Fn3) et 247 (Ig) du gène sain 87 204 pb en amont du dernier exon, Mex6. Dans cette mutation, le tryptophane est muté en une lysine charge. Or ce résidu tryptophane est généralement très conservé dans toutes les répétitions Ig de la titine et est connu pour être d'une importance cruciale dans la stabilisation du noyau hydrophobe de la structure tridimensionnelle du domaine Immunoglobuline-like (Improta et al, 1998). Cette mutation FINmaj a été mise en évidence chez un grand nombre de patients finlandais et la prévalence serait supérieure à 10 cas pour 100 000 en Finlande (Hackman et al., 2002). Six autres mutations faux-sens ou non-sens ont été mises en évidence dans les deux derniers exons de la titine chez des patients belges, français, italiens et espagnols (Hackman et al., 2008; Hackman et al., 2002; Pollazzon et al., 2009; Van den Bergh et al., 2003) entraînant les mêmes phénotypes que la mutation FINmaj.
De façon intéressante, il y aurait une corrélation génotype-phénotype visible notamment suite à la mise en évidence d'une atteinte beaucoup plus sévère chez les patients ayant une mutation entraînant la production d'une protéine tronquée suite à une mutation faux-sens ou un décalage du cadre de lecture introduisant un stop prématuré (Hackman et al., 2008). II a été mis en évidence par révélation d'épitopes que la partie C-terminale de la titine est absente à 50% (Hackman et al., 2008).
Parmi les nombreux partenaires de la titine, il a été montré que la calpaïne 3 se liait à la région unique codée par l'avant dernier exon de la titine appelé Mex5 (codant pour le domaine is7) de la titine (Kinbara et al., 1997).
Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres, dont 2 protéines ubiquitaires (calpaïnes 1 et 2). Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles régulent vraisemblablement des fonctions cellulaires importantes.
La calpaïne 3 (également appelée p94) appartient à la famille des calpaïnes qui sont toutes des protéases à cystéines (Dear et al., 1999). La calpaïne 3 est codée par un gène constitué de 24 exons répartis sur une région de 35 kb du chromosome 15. La protéine de 94 kDa comporte 821 acides aminés et est composée de quatre domaines retrouvés chez les membres de la famille des calpaïnes. Les premières caractérisations biochimiques de la calpaïne 3 ont montré que cette enzyme s'autolysait sous la forme de deux fragments principaux (Sorimachi et al., 1993). Cette autolyse, qui a lieu dans le domaine IS1, constitue le mécanisme d'activation de la protéase et est décrite comme séquentielle (Taveau et al., 2003). Ainsi trois sites d'autolyse (SI, S2 et S3) ont été mis en évidence dans ISl, conduisant à la formation d'un fragment court de 34 kDa et de fragments plus longs compris entre 55 et 60 kDa (Kinbara et al., 1998).
Lorsque la protéine est entière, une hélice a codée par la séquence ISl, ferme le sillon catalytique, empêchant les substrats et les inhibiteurs d'y pénétrer (Diaz et al., 2004). Lorsque celle-ci s'autolyse, elle libère le fragment ISl (coupure intramoléculaire) qui libère alors le sillon catalytique. La protéine devenue active peut alors cliver ses substrats mais également d'autres molécules de calpaïne 3 (coupure intermoléculaire). Dans le muscle, la calpaïne 3 est majoritairement présente sous forme non-autolysée de 94kDa (Kinbara et al., 1998; Sorimachi et al., 1990), suggérant qu'elle s'y trouve principalement sous une forme inactive et qu'un signal d'activation permettant de l'activer est nécessaire.
La fonction précise de la calpaïne 3 dans le muscle squelettique n'est pas connue, mais sa déficience est responsable de la LGMD2A. Des mutations récessives dans le gène de la calpaïne 3, sont à l'origine de la LGMD2A (Limb Girdle Muscular Dystrophy 2A) (Richard et al., 1995) qui est la forme la plus répandue des dystrophies des ceintures (elle représente 30 à 40 % de celles-ci). II apparaît qu'il existe un besoin persistant de développer de nouveaux médicaments permettant de traiter le vaste spectre des pathologies affectant le muscle strié, notamment les dystrophies musculaires.
Ainsi et à ce jour, aucun traitement spécifique n'est connu pour la prise en charge de la TMD. La plupart des patients nécessitent une kinésithérapie pour prévenir l'aggravation des contractures. Une piste évidente est l'apport d'un gène codant la protéine normale mais cette stratégie n'est pas applicable dans le cas de la titine, du fait de la grande taille du gène qui dépasse les capacités des vecteurs de transfert utilisés actuellement. EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention propose de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter certaines formes de dystrophies musculaires - notamment la TMD - ou de cardiomyopathies, et offre la possibilité d'identifier de nouveaux médicaments destinés à ces pathologies.
En effet, la présente invention repose sur la mise en évidence par le Demandeur qu'une inhibition partielle de la calpaïne 3 permet d'améliorer certaines formes de dystrophies musculaires, notamment la TMD.
Ainsi et selon un premier aspect, l'invention a trait à une composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour le traitement de maladies affectant le muscle strié, en particulier les dystrophies musculaires et les cardiomyopathies, et encore plus précisément celles associées à une surexpression ou une suractivation de la calpaïne 3.
En d'autres termes, il s'agit d'utiliser une composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour préparer un médicament destiné au traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies. Ladite composition peut en outre contenir tout composé ou excipient acceptable, notamment pharmaceutiquement. Elle peut en outre comprendre d'autres principes actifs destinés à traiter la même pathologie ou une autre pathologie. Selon un mode de réalisation particulier, le ou les inhibiteur(s) de la calpaïne 3 sont les seuls principes actifs de la composition.
Il peut également être envisagé d'associer, dans la même composition, au moins deux inhibiteurs de la calpaïne 3 de nature distincte, pour une administration simultanée ou décalée dans le temps. La voie d'administration peut aussi bien être intramusculaire qu'intraveineuse, voire sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale.
Le fondement de la présente invention repose donc sur la mise en évidence de l'intérêt thérapeutique des inhibiteurs de la calpaïne 3 dans le contexte de l'invention. On entend par « inhibiteur de la calpaïne 3 », toute molécule apte à diminuer ou réduire l'activité de la calpaïne 3. Dans la mesure où la calpaïne 3 a potentiellement de nombreuses implications biologiques in vivo, une suppression uniquement partielle est privilégiée.
De même, un inhibiteur spécifique de la calpaïne 3 est avantageusement mis en œuvre dans le cadre de l'invention. On entend par « spécifique », le fait qu'il inhibe exclusivement ou majoritairement la calpaïne 3 mais pas d'autres protéines bio logiquement actives in vivo. En particulier, il apparaît comme très important de vérifier la spécificité de l'inhibiteur vis-à-vis de protéines proches de la calpaïne 3, à savoir les autres calpaïnes et notamment les calpaïnes ubiquitaires 1 et 2. L'intérêt d'un inhibiteur spécifique est qu'il offre généralement une plus grande sélectivité et efficacité. Cliniquement, ceci se traduit par des effets secondaires potentiels moindres. La réduction ou inhibition de l'activité de la calpaïne 3 peut résulter de 2 modes d'action distincts des molécules inhibitrices :
Selon un premier mode de réalisation, la molécule a pour effet de diminuer l'expression et/ou la quantité de calpaïne 3 produite, en agissant notamment au niveau de la transcription/traduction du gène de la calpaïne 3. C'est par exemple le mode d'action des oligonucléotides antisens, des AR si, des ARNsh et des ribozymes qui constituent des inhibiteurs privilégiés au sens de l'invention.
De telles molécules peuvent être aisément identifiées par l'homme du métier, sur la base notamment de la séquence du gène de la calpaïne 3. Une séquence particulièrement pertinente en vue de la thérapie chez l'homme est celle du gène humain de la calpaïne 3, de séquence SEQ ID NO : 1.
Dans la mesure où les expérimentations sont réalisées au préalable chez la souris, la séquence du gène murin de la calpaïne 3 est également d'intérêt et est illustrée à la séquence SEQ ID NO : 2.
Des séquences antisens susceptibles d'induire du saut d'exons, afin d'éliminer un exon critique pour l'activité protéolytique ou d'induire une rupture du cadre de lecture en début de séquence, sont des candidats privilégiés. Les exons ciblés sont avantageusement les exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10. Au niveau des séquences correspondantes, les séquences importantes pour l'épissage (point de branchement ou BP, sites donneur et accepteur d'épissage, sites ESE (Exonic Séquence Enhancer) de liaisons de facteurs d'épissage (protéines SR)) sont privilégiées. Elles peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier et sont illustrées, en rapport avec le gène humain de séquence SEQ ID NO : 1, à la figure 7.
Il peut par exemple s'agir des séquences antisens suivantes :
Figure imgf000009_0001
Alternativement, un ARN interfèrent, de type si (« small interférence ») constitue également un inhibiteur privilégié au sens de l'invention. A titre d'exemple pour illustrer l'invention, les oligonucléotides suivants, dont la position est repérée sur la figure 8, sont susceptibles d'exercer cette fonction, à la fois chez la souris et l'homme :
TGGAAGAAGACCTCCGGAAA (SEQ ID NO : 3)
CCCATGATCAAAGTTTCAT (SEQ ID NO : 4)
AACCTCTCCTTCTGGTCTGAACA (SEQ ID NO : 5)
CCAAAGAGATGCACGGGAA (SEQ ID NO : 6)
GCAACAAGGAGCTGGGTGT (SEQ ID NO : 7)
ACAAGGACCTGAAGACACA (SEQ ID NO : 8).
L'homme du métier peut aisément vérifier si la molécule testée en tant qu'inhibiteur de la calpaïne 3 affecte le niveau d'expression et/ou de production de la calpaïne 3, notamment à l'aide des techniques bien connues suivantes :
niveau d'expression du transcrit par Northern blot ou PCR ;
- niveau de production de la protéine par détection à l'aide d'anticorps (Western blot ou ELI SA). Selon un second mode de réalisation, la calpaïne 3 est « normalement » produite mais c'est son activité qui est affectée par l'inhibiteur en question. Dans ce cas de figure, l'inhibiteur est typiquement un anticorps de la calpaïne 3, une molécule chimique, une protéine ou un peptide ayant l'activité inhibitrice recherchée.
L'activité de la calpaïne 3 peut être mesurée grâce à différents tests, notamment ceux décrits dans les documents WO 2003/002730, WO2007/039699 et Milic et al. (2007).
Concernant l'utilisation d'anticorps spécifiques de la calpaïne 3, certains sont disponibles et peuvent être mis en œuvre dans le cadre de la présente invention. Il s'agit par exemple de l'anticorps décrit dans le document Baghdiguian et al. (1999).
Concernant les protéines ou peptides d'intérêt, ceux-ci sont avantageusement choisis parmi ceux ayant une activité inhibitrice de la calpaïne 3 in vivo. Ainsi, l'équipe d'Isabelle Richard a récemment montré que la protéine myospryne (CMYA5, cardiomyopathy-associated 5) de séquence SEQ ID NO : 9 (humaine) ou SEQ ID NO : 10 (murine), était apte à assurer cette fonction. Un fragment actif de celle-ci, par exemple de séquence SEQ ID NO : 11 (humaine) ou SEQ ID NO : 12 (murine), peut également être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. L'apport exogène des ces protéines ou de peptides actifs dérivés a donc pour conséquence de réduire in vivo l'activité de la calpaïne 3 et ainsi d'améliorer les états pathologiques visés par la présente invention.
Enfin, les tests d'activité décrits ci-dessous permettent une approche pharmaco logique classique, à savoir l'identification de molécules chimiques ayant l'activité inhibitrice recherchée. A cette fin, des banques de molécules disponibles peuvent être utilisées.
Plus généralement et selon un second aspect, la présente invention concerne un procédé d'identification ou de criblage de médicaments pour le traitement de dystrophies musculaires, avantageusement de la TMD, ou de cardiomyopathies.
Il s'agit alors d'évaluer le potentiel inhibiteur du composé testé sur la calpaïne 3.
Ce procédé est avantageusement mis en œuvre in vitro. Là-encore, le potentiel inhibiteur peut être évalué soit en mesurant l'expression ou la production de calpaïne 3, soit en mesurant son activité, à l'aide des techniques mentionnées précédemment. Ces mesures sont réalisées parallèlement en présence et en absence du composé testé, puis comparées.
Dans le cas où une diminution de la calpaïne 3 est observée en présence du composé testé, celui-ci constitue un médicament candidat pour le traitement des pathologies visées.
Concernant les pathologies visées, il s'agit donc de celles associées à une surexpression ou à une suractivation de la calpaïne 3. Avantageusement, la présente invention trouve des applications dans le traitement de dystrophies musculaires, affectant les muscles squelettiques. Plus généralement sont visées les pathologies visant le muscle strié, et donc également celles affectant le muscle cardiaque appelées cardiomyopathies.
De manière très claire et pour la première fois, la présente invention met en évidence la possibilité de traiter la dystrophie musculaire tibiale (TMD pour Tibial Muscular Dystrophy) à l'aide de cette stratégie.
Plus généralement, la présente invention révèle, pour la première fois, la corrélation entre dystrophies musculaires et une possible suractivation de la calpaïne 3. Il est rappelé qu'à ce jour, ne sont identifiées, en rapport avec la calpaïne 3, que les dystrophies des ceintures liées à une calpaïne 3 déficiente. La présente invention met en lumière l'existence de dystrophies musculaires possiblement dues à une surexpression ou suractivation de la calpaïne 3, qui peuvent être appelées « calpainopathies dominantes » et être traitées à l'aide de la stratégie proposée.
De même, la présente invention vise le traitement de cardiomyopathies possiblement dues à une surexpression ou suractivation de la calpaïne 3, ou à un apport exogène de calpaïne 3. En effet, la calpaïne 3 est exprimée dans le cœur, quoique bien plus faiblement que dans le muscle squelettique (Taveau et al., 2002) et l'équipe d'Isabelle Richard a montré qu'au delà d'un seuil, la calpaïne 3 pouvait entraîner des effets délétères sur le muscle cardiaque. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative.
L'invention est illustrée plus avant en rapport avec la TMD chez la souris.
Figure 1 : AI Histologie des muscles des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj et WT. (TA=Tibialis Antérieur, QUA= Quadriceps, BF=Biceps Femoris, SOL : Soleus, GLU: Glutens, PLA : Plantaire, PSO : Psoas, DEL: Deltoïde, GA: Gastrocnemius). Atteinte du TA, QUAD et BF dans les souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj à 9 mois. B/ Quantification de la centronucléation des fibres des muscles TA, QUA et BF des souris HE et WT.
Figure 2 : Western Blot réalisé sur broyats de muscles de souris WT et HE et hybridé avec les anticorps contre la calpaïne 3 et l'actine. Quantification de la quantité de calpaïne 3 dans les muscles, rapportée à l'actine utilisée comme normalisateur en unités arbitraires (UA) (n=4).
Figure 3 : Marquage des bandes de dégradation de la titine grâce à un anticorps dirigé contre la partie terminale de la titine (codée par le dernier exon) après fractionnement subcellulaire des Psoas des souris WT et HE pou la mutation FINmaj.
Figure 4 : AI Histologie des muscles hétérozygotes pour la mutation FINmaj et WT après injection IM de l'AAV codant pour la calpaïne 3 humaine. B/ quantification de la centronucléation des fibres des TA injectés et non injectés avec l'AAV C3 des souris WT et HE.
Figure 5 : Histologie des muscles des souris HE et WT, capn3+/- et HE/ capn3+/- à 9 mois et quantification de la centronucléation. Al TA B/ QUAD C/ BF. Barre =50 um. Figure 6 : Histologie des muscles des souris HE et WT, capn3+/- et HE/ capn3+/- à 12 mois et quantification de la centronucléation. AI TA B/ QUAD CI BF. Barre = 50μιη.
Figure 7 : Localisation de cibles potentielles pour les séquences antisens, situées dans les introns (minuscules)/exons (majuscules) 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10, au niveau :
(A) des sites de branchement (en foncé, avec prédiction UMD score) et des sites d'épissage donneur et accepteur (en clair) ;
(B) des sites ESE prédits selon « rescue ESE » ;
- (C) des sites ESE prédits selon « ESE fïnder ».
Figure 8 : Position des oligonucléotides 1 à 6 (SEQ ID NOS : 3 à 8) susceptibles de diminuer l'expression du messager de la calpaïne 3 par ARN interférence. Figure 9 : RT-PCR sur la calpaïne 3 murine entre les exons 2 et 6 après transfection 24h du minigène C3 et des AONs en cellule HER911. L'ARN entier transcrit et épissé à partir du minigène donne une bande à 645 pb. L'utilisation des AONs exon3-ESE2 et exon4-ESEl montre la présence d'une bande plus importante d'ARN épissé par saut d'exon. Les flèches indiquent les isoformes principaux après saut d'exon.
Figure 10 : Test des AONs combinés sur l'exon 3, 4 ou 5 sur les cellules 911 préalablement transfectées avec le minigène calpaïne 3.
Figure 11 : Saut des exons 3, 4 ou 5 par les AONs seuls ou combinés sur la calpaïne 3 endogène dans les cellules HER911.
Figure 12 : RT-PCR de l'exon 2 à 5 (495pb) réalisées sur les ARNs extraits des TAG injectés avec les AONs ciblant l'exon 3 ; Les TAD sont les contrôles latéraux de l'expérience. Dans la plupart des TAG la quantité de calpaïne 3 visible est nettement diminuée (flèche).
Figure 13 : RT-PCR en temps réel de la calpaïne 3 réalisées sur les ARNs extraits des TAG injectés avec les AONs ciblant l'exon 3 ; les TAD sont les contrôles latéraux de l'expérience. Ici dans un souci de clarté seules les souris injectées avec ΓΑΟΝ EX3- ESE1 sont présentées. Dans tous les TAG la courbe d'amplification de la calpaïne 3 est décalée vers la droite. Chaque échantillon est présenté en duplicata.
Figure 14 : Représentation du nombre de cycles au bout duquel la valeur arbitrairement choisie de 0,2 est atteinte par RT-PCR en temps réel.
I) MATERIEL ET METHODES
1. GENERATION DES SOURIS ET GENOTYPAGE
La construction du vecteur de ciblage utilisé pour la génération de la souris knock-in FINmaj a été réalisée à l'Institut « Clinique de la souris » (ICS, France). Un fragment de 2,2 kb englobant les exons Mex2 à Mex6 de la titine a été amplifié par PCR sur de l'ADN génomique de souris 129S2/SvPas avec des amorces modifiées afin d'introduire la mutation GAAATAACATGG -> GTGAAAGAAAAA dans l'exon 6. Le fragment muté a été sous-cloné dans un vecteur contenant une cassette de résistance lox-néomycine. Deux fragments de 2,8 kb et 3,6 kb (correspondant aux bras d'homologie 5 'et 3', respectivement) ont été amplifiés par PCR sur de l'ADN génomique de souris 129S2/SvPas et sous-clonés directement en amont et en aval de la construction du plasmide précédent afin de générer la construction finale. La séquence des plasmides a été vérifiée par restriction et tous les exons et les jonctions exon-intron ont été séquencées. La construction linéarisée a été électroporée dans des cellules souches embryonnaires (ES) de souris 129S2/SvPas et les colonies G418 -résistantes ont été isolées et amplifiées. La séquence des clones obtenus a été validée après amplification PCR en utilisant des amorces externes, confirmée par Southern blot avec des sondes externes 5' et 3' et a permis d'identifier un clone avec un allèle correctement ciblé. Après caryogramme, le clone transgénique ES a été injecté dans des blastocystes C57BL/6J qui ont été réimplantés dans des mères porteuses pour générer des souris chimères. La transmission à la lignée germinale a été obtenue après croisement des chimères mâles avec des femelles transgéniques CMV-CRE exprimant la CRE recombinase sous le promoteur CMV, permettant l'excision de la cassette néo. Le transgène Cre a été éliminé par un premier croisement sur fond C57BL/6; les souris hétérozygotes résultantes ont ensuite été rétrocroisées sur 3 générations sur fond C57BL/6, puis croisées ente elles. Toutes les souris ont été traitées conformément à la directive du Conseil de la Communauté européenne du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE).
L'introduction de la mutation dans le génome murin a été vérifiée par séquençage de fragments de PCR obtenus par amplification de l'ADN de queue, isolé en utilisant le kit REDExtract-N-PCR AmpTM tissus (Sigma), à l'aide des amorces TTN 1180 située autour du site loxP (SEQ ID NO : 13 = GCTATCTGCACCTC AAAATCTGTGGGTTG) et TTN 1183 (SEQ ID NO : 14 = GAACCCTGACCC TCTGGAAGAACATC). Les allèles résultant de type sauvage et mutant correspondent à des fragments de PCR de 414 et 502 pb, respectivement.
Le modèle de souris portant à la fois la mutation FINmaj et l'allèle mutant de la calpaïne 3 a été obtenu par croisement de souris femelles avec des souris mâles déficients en calpaine 3 (Richard et al, 2000). Le génotypage pour les mutations FINmaj et calpaïne 3 a été réalisé sur l'ADN de queue, respectivement comme décrit ci-dessus et en utilisant des amorces pour la calpaïne 3 (amorces avant: GW255 (SEQ ID NO : 15 = AGTCTTCCTTCCAAAGTTGCCTGC) et GW 257 (SEQ ID NO : 16 = GTGCTACTTCCATTTGTCACGTCC) et amorce inverse GW 259 (SEQ ID NO : 17 = ACTTCTCTGAAGC AAACTCC AGCC) . Les allèles résultant de type sauvage et mutant correspondent à des fragments de PCR de 380 et de 480bp, respectivement.
2. HISTOLOGIE, IMMUNOHISTOCHIMIE ET MORPHOMETRIE
Des cryosections (8 ou 10 mm d'épaisseur) ont été préparées à partir de muscles squelettiques et cardiaques congelés. Les sections transversales ont été traitées pour la coloration histologique hématoxyline phloxine safran (HPS).
Colorimétrique et immunomarquage avec la laminine ont été réalisées selon le protocole ARK kit peroxydase (Dako) pour évaluer le nombre et le diamètre minimal de fibres. Les anticorps utilisés pour ces détections sont respectivement: un anticorps anti-laminine polyclonal (Progen, P-4417, la dilution 1 : 1000). Les images numériques des coupes colorées ont été acquises avec une caméra CCD (Sony) et d'une platine motorisée d'un microscope Nikon Eclipse E60. Les images ont été analysées avec le logiciel Ellix (Microvision, France).
3. WESTERN BLOT ET DÉ TERMINATION DE L 'ACTIVITÉ DE LA CALPAINE 3
Le tissu musculaire a été pesé et homogénéisé l'aide d'un Ultra-Turrax T8 (IKA, Allemagne). Un test in vitro mesurant l'activité calpaïne 3 a ensuite été effectué sur ces extraits comme décrit précédemment (Milic et al, 2007). Pour le western blot détectant la titine, les protéines ont été extraites avec le Kit Subcellular ProteoExtract Proteome (Spek, Calbiochem, Allemagne). Dans ces conditions expérimentales, le western blot de la fraction du cytosquelette à l'aide de l'anticorps M 10 révèle des bandes titine spécifiques. Les Western blot ont été réalisés comme décrit à l'aide de 50 μg de protéines (Milic et al, 2007).
L'analyse de l'activité protéolytique de la calpaïne 3 a été réalisée à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin anti-calpaïne 3 (Baghdiguian et al., 1999; dilution 1 : 150) et un anticorps monoclonal de souris anti-alpha-actine (A4700, Sigma; dilution au 1 : 500). Les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin (1 : 10,000) couplés à IRDye ® pour la révélation par le scanner infrarouge Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA). La quantification des bandes a été réalisée avec le logiciel Odyssey 2,1 (LI-COR Biosciences). La détection des bandes de titine a été effectuée en utilisant l'anticorps M 10. Les membranes ont été incubées avec des anticorps anti-souris ou de lapin anti-secondaire (1 : 10,000) couplé à la peroxydase (HRP; Amersham Biosciences, NJ, USA). La révélation a été réalisée avec le substrat HRP chimio luminescent Super Signal West kit Pico (Pierce, IL, USA).
4. TRANSFERT IN vivo MEDIE PAR L 'AA VDE L 'ADNC DE LA CALPAÏNE 3
Les préparations virales d'adénovirus AAV2/1 ont été générées en incorporant les génomes viraux recombinants de type AAV2-ITR dans des capsides AAV1 en utilisant un protocole de tri-transfection plasmidique comme décrit (Bartoli, 2006). Brièvement, des cellules 293 HEK (confluentes à 60%) ont été co-transfectées avec pAAV-calpain3, le plasmide RepCap (pLT-RC02), et le plasmide helper adenoviral (pXX6) à un ratio de 1 : 1 :2. Le lysat viral brut est récolté 60 heures après la transfection. Pour faciliter le relargage des particules virales, le lysat brut est séquentiellement traité par quatre cycles de congélation-décongélation, digéré par la benzonase (15' à 37°C) et précipité au sulfate d'ammonium. Finalement, le lysat viral est purifié par deux cycles d'ultracentrifugation en CsCl, puis suivi par des dialyses afin d'éliminer le CsCl. La détermination du titre viral est obtenue par PCR en temps réel, comme décrit dans Fougerousse et al (2007).
Les souris ont reçu par injection intramusculaire dans le muscle Tibialis Anterior (TA) gauche 30 μΐ d'AAVr2/l-calpaine3 (1.10e12 vg). Un mois après l'injection, les souris sont sacrifiées et les muscles sont prélevés puis rapidement congelés dans de l'azote liquide refroidi en isopentane. II) RESULTATS
I. Caractérisation du modèle murin reproduisant la mutation FINmaj à l'état hétérozygote 1) Le modèle murin portant la mutation FINmaj (knock-in) présente une atteinte musculaire tardive et localisée
Afin d'étudier la pathologie TMD, un Knock-in murin de la mutation FINmaj (souris Kl TTN FINmaj) a été créée à la Clinique de la Souris par recombinaison homologue. Les souris hétérozygotes (HE) pour la mutation ont été caractérisées à différents âges en parallèle de souris saines (WT). Bien qu'elles ne montrent aucune atteinte globale, certains muscles montrent un profil de centronucléation tardivement, à partir de l'âge de 9 mois, comme le TA, le QUAD (Quadriceps) et le BF (Biceps Femoris). L'histologie des muscles a été réalisée sur des souris de 3, 6, 9 et 12 mois et les muscles ont été examinés par coloration à l'hématoxyline/éosine et comparés à ceux de souris WT (Figure 1A). Enfin, le calcul des fibres centronucléées a été réalisé sur ces mêmes muscles comparativement aux souris WT (Figure 1B). 2) Les conséquences au niveau moléculaire de la mutation FINmaj chez les souris hétérozygotes
Il a été mis en évidence une tendance à la diminution de la quantité de protéine calpaïne 3 (non significative) chez les souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj, après réalisation d'un Western Blot sur protéines extraites des TA (Figure 2). Enfin, un marquage de la ligne M de la titine sur un western blot, permettant de voir les bandes de dégradation de celle-ci suite à un fractionnement subcellulaire des cellules musculaires, a été réalisé. Comme indiqué dans la publication de (Hackman et al., 2008), il a été mis en évidence la perte de 50% du marquage de la titine en utilisant un anticorps ciblant la partie C-terminale de la titine (Figure 3).
II. Modulation de l'expression de la calpaïne 3 dans le modèle murin reproduisant la mutation FINmaj à l'état hétérozygote 1) L'injection de calpaïne 3 aggrave l'atteinte histologique des souris TMD
Des souris saines et hétérozygotes pour la mutation FINmaj ont reçu une injection en intramusculaire, grâce à un AAV codant pour la calpaïne 3 humaine, à l'âge de 9 mois dans l'un des TA afin de regarder quel effet la surexpression de calpaïne 3 pouvait avoir sur le profil histologique du TA.
Cette surexpression n'a aucun effet sur un muscle sain. Par contre, les muscles des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj injecté avec l'AAV C3 montrent un taux de centronucléation nettement plus élevé que le TA contrôle non injecté (Figure 4 A et B).
2) La diminution de la quantité de calpaïne 3 améliore le phénotype musculaire des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj La surexpression de la calpaïne 3 dans les muscles de souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj tendant à aggraver le phénotype musculaire des souris Knock-in pour la mutation finlandaise, les conséquences de la diminution de la quantité de calpaïne 3 dans les muscles de ces souris ont été testées en croisant les souris hétérozygotes pour la mutation avec des souris déficientes en calpaïne 3 (KO calpaïne 3) (Richard et al., 2000) afin d'obtenir des souris hétérozygotes FINmaj exprimant 50% de la calpaïne 3 (capn3+/-). Les muscles des souris WT, HE, capn3+/- et HE/capn3+/- ont été analysés en histologie à l'âge de 9 et 12 mois. Il est à noter que les souris capn3+/- ne montrent aucune atteinte histologique à ces âges. A 9 mois, l'histologie des muscles TA, QUA et BF (figure 5 A, B et C) atteints chez les HE montre un profil avec très peu de fibres centronucléées. La quantification des fibres centronucléées montre une nette diminution de celles-ci et une restauration proche de ce qui est constaté chez des souris WT (n=3). La même chose a pu être observée chez les souris HE FINmaj ;capn+/-. En effet, ces souris montrent une réelle amélioration de l'état des muscles TA, QUA et BF (figure 6 A, B et C). 3) Conclusion
En conclusion, il a été montré que la diminution de l'expression de la calpaïne 3 dans les muscles atteintes des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj (majoritaire en Finlande) et entraînant chez l'Homme une dystrophie musculaire tibiale (TMD), permet de rétablir et de diminuer l'atteinte dystrophique des muscles atteints habituellement chez ces souris à l'âge de 9 mois (notamment la quantité de fibres centronucléées).
III. Identification d'inhibiteurs de la calpaïne 3
L'inhibiteur recherché est destiné à réaliser du saut d'exons de la calpaïne 3 pour bloquer en partie la traduction de cette protéine, et ainsi diminuer la quantité de calpaïne 3 dans le muscle des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj. Les séquences antisens susceptibles d'induire du saut d'exons, afin d'éliminer un exon critique pour l'activité protéolytique ou d'induire une rupture du cadre de lecture en début de séquence, sont des candidats privilégiés. Les exons ciblés sont avantageusement les exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10. Au niveau des séquences correspondantes, les séquences importantes pour l'épissage (point de branchement ou BP, sites donneur et accepteur d'épissage, sites ESE (Exonic Séquence Enhancer) de liaisons de facteurs d'épissage (protéines SR) sont privilégiées. Elles sont illustrées par rapport au gène humain de séquence SEQ ID NO : 1, à la figure 7.
Dans la mesure où les expérimentations sont réalisées au préalable chez la souris, les expériences suivantes ont été réalisées sur la séquence du gène murin de la calpaïne 3. Les séquences murines sur les exons 3 , 4 et 5 choisies sont présentées à la Table 1 : Table 1 : Oligonucléotides 2'omethyl spécifiques de la calpaïne 3 testé pour le saut d'exon chez la souris.
Figure imgf000019_0001
L'efficacité de la molécule testée en tant qu'inhibiteur de la calpaïne 3 peut être vérifiée par le niveau d'expression et/ou de production de la calpaïne 3, notamment à l'aide des techniques bien connues suivantes :
- niveau d'expression du transcrit par RT- PCR ;
- niveau de production de la protéine par détection à l'aide d'anticorps (Western blot ou ELI SA).
1) Preuve de principe du saut d'exon de la calpaïne 3 sur un minigène
Des tests préliminaires visant à évaluer la possibilité de réaliser le saut d' exons sur l'ARN de la calpaïne 3 (exon 3, 4 ou 5) ont été réalisés in vitro sur un minigène murin constitué des exons et introns 2 à 6.
Pour sauter les exons 3, 4 ou 5, des oligonucléotides de chimie 2'omethyl (AONs) ont été synthétisés chez la société Eurogentec selon une purification PAGE. 3 AONs ont été sélectionnés par exon (voir table 1 ci-dessus).
Après 24h de transfection du minigène dans des cellules de rétinoblastes humains (HER911), par le Fugène HD (Roche), les AONs ont été ajoutés aux cellules pendant 24h par le même type de transfection. Les cellules ont été ensuite récupérées et une extraction d'ARN a été réalisée suivie d'une reverse transcription. Une PCR entre les exons 2 et 6 a alors été réalisée afin de déterminer si les exons ont été sautés sur le minigène. La taille attendue du minigène après épissage avec la PCR exon 2 à 6 est de 645pb. D'autres bandes sont visibles dans le cas de la présence du minigène seul qui est la conséquence de saut d'exon interne sans présence des AONs.
Tailles possibles prédites :
ex2+ ex3 + ex4 + ex5 + ex6= 645 pb
ex2 + ex4 + ex5 + ex6 = 526 pb
ex2 + ex3+ ex5 + ex6= 511 pb
ex 2 + ex 3 + ex4 + ex 6= 476 pb
ex2 + ex 5 + ex 6 = 392 pb
ex2 + ex 3 + ex6= 342 pb
ex2 + ex6 = 223 pb
Sur le minigène, l'utilisation de l'oligonucléotide exon3-ESE2 entraîne un saut d'exon plus important de l'exon 3 (bande visible à 526 pb). L'AON exon4-ESEl permet également d'obtenir un saut de l'exon 4 plus important (Figure 9).
Ces mêmes AONs ont été testés combinés sur le minigène de la calpaïne 3 afin d'améliorer l'approche citée. Les 3 AONs ciblant l'exon 3 ainsi que ceux ciblant l'exon 4 et 5 ont été combinés et transfectés avec le minigène comme précédemment. Le trio exon 3 et exon 4 entraînent tous les deux un saut d'exon important du minigène de la calpaïne 3 (figure 10).
Enfin, le saut de ces exons a été testé sur l'ARN endogène de la calpaïne 3 dans des cellules HER911 qui contiennent une petite quantité d'ARNm calpaïne 3 mais pas la protéine correspondante. De nouveau, les AONs ont été testés seuls ou combinés. La PCR a été réalisée entre les exons 2 et 5 : taille attendue : 495 pb pour l'ARN entier.
Tailles possibles prédites :
Taille entière : ex2+ ex3 + ex4 + ex5 = 495 pb
ex2 + ex4 + ex5 = 376 pb
ex2 + ex3+ ex5 = 361 pb
ex2 + ex 5 = 242 pb
Comme il apparaît à la figure 11, ΓΑΟΝ exon4-ESE2 entraîne le saut des exons 3 et 4 entraînant une bande à 242 pb, le trio exon 3 entraîne le saut de l'exon 3 visible par la bande à 376 pb et le trio exon 4 entraîne le saut de l'exon 4 avec une bande visible à 376 pb. 2) Preuve de principe du saut d'exon de la calpaïne 3 in vivo sur les souris Kl TTN FINmaj HE.
L'approche in vivo a été réalisée en utilisant les AONs ciblant l'exon 3 seulement, cités précédemment (ex3-BP, ex3-ESEl-ex3-ESE2). 3mM de chaque AON a été associé au PEI et injectés en IM dans le TA gauche (TAG) 2 jours consécutifs chez des souris WT (« wild-type ») et hétérozygotes pour la mutation FINmaj.
Après 10 jours, les muscles ont été prélevés avec leurs témoins latéraux (TAD) et broyés pour récupérer les ARN messagers et les protéines.
Une RT-PCR réalisées entre les exons 2 à 5 de la calpaïne 3 permet de mettre en évidence dans les TAG une nette diminution de la quantité de calpaïne 3 suggérant que le saut d'exon a fonctionné et à entraîné un saut d'exon important (Figure 12).
Une RT-PCR en temps réel a ensuite été réalisée au moyen d'une sonde Taqman pour quantifier la diminution de calpaïne 3 dans les muscles TAG par rapport à leurs témoins latéraux TAD. Les courbes d'amplification PCR montrent clairement un retard d'amplification dans le cas des TAG, ainsi qu'on le voit pour exemple dans le cas des souris injectées avec ΓΑΟΝ EX3-ESE1 (Figure 13).
A partir de cette RT-PCR en temps réel, il est possible d'extraire le nombre de cycles de PCR au bout duquel la valeur (arbitraire) de 0,2 est atteinte (Figure 13 : au-niveau de la flèche). Ces valeurs ont été moyennées groupes par groupes et sont présentées à la figure 14. Ce nombre de cycles représente la quantité de matrice de départ : plus le nombre de cycles est grand, moins la calpaïne 3 est présente dans le muscle.
Un Western Blot (WB) a été réalisé sur les extraits cellulaires de cette expérience in vivo. La calpaïne 3 est mise en évidence grâce à un anticorps (12A2). Le WB montre la présence de la calpaïne 3 aux tailles de 94 et 55KD, ainsi que l'apparition d'une bande de 30 kD dans tous les TAG injectés avec les AONs. Ceci indique qu'une protéine plus petite est issue du saut d'exon, protéine qui ne comprend pas le domaine codé par l'exon 3 et qui correspond au domaine catalytique de la calpaïne 3. Cette protéine est donc non- fonctionnelle. En conclusion, ces données montrent que l'utilisation d'inhibiteurs génétiques de la calpaïne 3 peut permettre de diminuer in vitro et in vivo la quantité de calpaïne 3. La preuve de principe in vivo a été réalisée sur des souris WWT et HE pour la mutation FINmaj. Cette approche est donc possible pour traiter notamment les mutations hétérozygotes TMD.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour le traitement de dystrophies musculaires ou de cardiomyopathies.
21 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dystrophies musculaires ou les cardiomyopathies sont associées à une surexpression ou une suractivation de la calpaïne 3. 3/ Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la dystrophie musculaire est la dystrophie musculaire tibiale (TMD).
4/ Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur inhibe l'expression ou la production de la calpaïne 3.
5/ Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur est choisi dans le groupe constitué de : antisens, AR si, AR sh et ribozymes.
6/ Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que Γ antisens a une séquence choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 18 à 26.
7/ Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'ARNsi a une séquence choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 3 à 8. 8/ Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur inhibe l'activité de la calpaïne 3.
91 Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'inhibiteur est choisi dans le groupe constitué de : anticorps de la calpaïne 3, molécules chimiques, protéines ou peptides.
10/ Procédé in vitro d'identification de médicaments pour le traitement de dystrophies musculaires, avantageusement de la TMD, ou de cardiomyopathies consistant à évaluer le potentiel inhibiteur d'un composé sur la calpaïne 3. 11/ Procédé d'identification selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'expression de la calpaïne 3 est mesurée en présence et en absence du composé, une diminution de l'expression en présence du composé identifiant le composé comme un médicament.
12/ Procédé d'identification selon la revendication 10 caractérisé en ce que la quantité de calpaïne 3 produite est mesurée en présence et en absence du composé, une diminution de la quantité produite en présence du composé identifiant le composé comme un médicament.
13/ Procédé d'identification selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'activité de la calpaïne 3 est mesurée en présence et en absence du composé, une diminution de l'activité en présence du composé identifiant le composé comme un médicament.
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