KR100940888B1 - 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩 및 이를이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 티로시나제 인산화(tyrosinase phosphorylation) 저해제 탐색용 단백질 칩 및 이를 이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PKC β(Protein Kinase C beta)에 의한 색소 침착 관련 효소인 티로시나제의 인산화를 저해하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 생물학적 마이크로 단백질 칩 및 이를 이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 칩 및 탐색방법은 미백관련 표적 분자를 대량으로 신속하게 스크리닝할 수 있으므로 화장품 신소재 및 피부질환 치료제를 개발하는데 이용될 수 있다.
티로시나제 인산화 저해제(tyrosinase phosphorylation inhibitor), PKC β(Protein Kinase C beta), 단백질 칩(protein chip)
Description
본 발명은 티로시나제 인산화(tyrosinase phosphorylation) 저해제 탐색용 단백질 칩 및 이를 이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PKC β(Protein Kinase C beta)에 의한 색소 침착 관련 효소인 티로시나제의 인산화를 저해하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 생물학적 마이크로 단백질 칩 및 이를 이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법에 관한 것이다.
PKC(Protein Kinase C)는 사이클릭 뉴클레오티드-독립 효소(cyclic nucleotide-independent enzyme)로 많은 표적 단백질들의 세린(serine)과 쓰레오닌(threonine) 잔기들을 인산화한다. 상기 PKC는 1977년 Nishizuka 및 협력자들에 의해 소의 소뇌(bovine cerebellum)에서 처음 발견되었으며 히스톤(Histone) 및 프로타민(protamine)을 인산화하는 단백질로 알려졌다. 이후, PKC는 개 발(development), 기억(memory), 분화(differentiation), 증식(proliferation) 및 발암(carcinogenesis) 등 많은 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려졌고, 이들은 구조, 보조인자 요구(cofactor requirements) 및 기능(function)이 서로 다른 계(family)들이 존재하는 것으로 알려졌다. 현재는 10가지의 아형(isoform)이 존재하는 것으로 확인되었으며 크게 세 분류로 나누어질 수 있다.
- 전형적인 (c)PKC 아형들(α, βI, βⅡ, γ)
: 활성이 되려면 칼슘(calcium) 및 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)이 필요하다.
- 신규한 (n)PKC 아형들(δ, ε, η(PKC-L), θ, μ)
: 활성이 되려면 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)이 필요하다.
- 비전형적인 (a)PKC 아형들(ζ, ι, λ)
: 활성이 되려면 칼슘(calcium) 및 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)이 필요하지 않다.
상기 모든 PKC는 막 상호작용을 위한 인지질 결합 도메인(phospholipid-binding domain)을 가지고 있다. PKC 분자(molecule)의 일반적인 구조는 촉매(catalytic) 및 조절(regulatory) 도메인으로 이루어져 있으며, 상기 도메인들은 보존된 부위(conserved region) 및 가변성 부위(variable region)로 각각의 아형이 구분된다.
cPKC의 활성은 시토졸(cytosol)에서부터 세포막의 결합 도메인으로의 전좌(translocation)가 포함된다. 이때 활성화된 C-키나제에 대한 수용체(receptors for activated C-kinase, RACK) 및 활성된 PKC의 상호작용이 존재하여 비활성 상태인 PKC와 구조적으로 구별된다. 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)은 cPKC의 침투(penetration)를 촉진시키며, 부착(attachment) 후에 칼슘(calcium)과 PKC의 친화성(affinity)은 효소의 활성을 증가시킨다. 포스파티딜세린(Phosphatidylserine)은 막 지질 고정(membrane lipid anchor) 역할을 한다. PKC의 β 아형은 멜라좀(melanosome)의 막 단백질인 티로시나제를 활성화시켜 멜라닌을 형성하는 것으로 알려져 있다.
티로시나제(Tyrosinase)는 포유류 및 식물 등에 널리 분포하고 있으며, 식물성 티로시나제는 과일 및 야채의 가공시에 갈변하는 현상에 관여하고 있다. 포유류의 티로시나제는 피부, 모낭,눈 등에 분포하는 멜라닌 형성세포(melanocyte)에 함유하고 있으며 자외선에 의한 손상을 방어하는 역할을 한다. 현재까지 여러 종의 생물체로부터 수많은 티로시나제가 분리, 정제되었으며 이들 티로시나제의 구조 및 기능에 대한 연구가 활발히 이루어졌다. 포유류의 티로시나제는 당화(glycosylation)의 상태에 따라 65 ~ 75kDa의 분자량을 가지며, 멜라노좀의 막(melanosomal membrane)에 존재하는 구리-의존적 당단백질(copper-dependent glycoprotein)이다. 티로시나제는 멜라닌 형성의 실제적인 첫 단계라고 할 수 있는 티로신을 변환(conversion) 시키는 효소로 멜라닌 세포생성(melanogenesis)의 핵심 효소라 할 수 있다. 이러한 효소의 역할은 티로시나제의 512개의 아미노산 서열 중 90% 이상을 차지하고 있는 멜라노좀 내부에서 일어나며, 나머지 짧은 서열 들은 대략 30개의 아미노산을 가지며 막통과(transmembrane) 및 세포질(cytoplasmic) 도메인을 이루고 있다(Hee-Young Park et. al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 268, No.16 Issue of june 5, pp.11742-11749,1993). 티로시나제의 활성은 시토졸 C-말단 서열(cytosolic C-terminal sequence)의 두 개의 세린(serine)(505 및 509)이 RACK-1에 의해 멜라노좀(melanosome)으로 전좌(translocation)된 활성화된 PKC β에 의해 인산화되면서 이루어진다(Hee-Young Park et. al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 274, No.23 Issue of june 4, pp.16470-16478, 1999).
멜라닌(Melanin)은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포에서 합성되며 피부에 유해한 영향을 끼치는 자외선을 흡수하여 피부로의 침투를 차단함으로써 피부 자체의 방어기능을 하기 위해 생성된 고분자화합물이다. 멜라닌은 멜라노사이트(melanocyte) 안에 존재하는 멜라노좀(melanosome)의 활성된 티로시나제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)이 변환되어 형성되는 화합물이다. 멜라닌 형성세포에서 멜라닌을 합성할 때에 티로시나제가 작용하게 되며, 티로시나제는 멜라닌 생성 초기에 아미노산의 일종인 티로신(히드록시 페닐알라닌)에 작용하여 디히드록시 페닐알라닌(DOPA)의 형성을 촉진하며 또한 디히드록시 페닐알라닌(DOPA)의 산화를 촉진하여 퀴논(도파퀴논: DOPA Quinone)을 형성시키고 형성된 도파퀴논은 일련의 단계를 거쳐 멜라닌이 생성된다. 따라서 티로시나제의 활성을 억제하는 저해제는 피부 색소 침착 병변 치료제 및 기능성 화장품의 미백 물질로 사용 가능할 것이라 여겨지고 있다.
지금까지 이러한 저해제의 탐색방법으로는 gel mobility-shift analysis(C. Jansen et al., Biochem . J. 246: 227-232, 1987; K. Ruscher et al., J. Biotechnol . 78: 163-170, 2000), Southwestern blotting(B. Bowen et al., Nucleic Acids Res . 8: 120, 1980; W.K. Miskimins et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 82: 6741-6744, 1985), ELISA(Y. Choo et al., Nucleic Acids Res . 21, 1993), reporter constructs in yeast assay(S.D. Hanes et al., Science 251: 426-430, 1991)가 수행되었으나 상기 방법들은 방사선 동위 원소, 웰플레이트(Well plate)를 이용한 면역효소측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 면역형광법을 이용하여, 제한된 실험 수행의 수와 시간, 복잡한 실험 방법 등의 LTS(low-throughput screening)의 문제점을 가지고 있었다.
이에 본 발명자들은 PKC β 및 티로시나제의 시토졸 도메인과의 상호작용을 스크리닝의 표적으로 선정하여 단백질 칩에 구현함으로써 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 적용하여 동시 다발적 실험 수행, 적은 농도 및 작은 분자량의 물질 탐색이 가능하여 미백 관련 표적 단백질인 티로시나제 저해제를 탐색할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩 및 이를 이용한 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 티로시나제의 시토졸 도메인(cytosolic domain) 및 막통과 도메인(transmembrane domain)을 합친 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 말토즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP)에 융합시킨 융합단백질이 고체 기판에 고정된 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 칩을 포함하는 티로시나제 저해제 탐색용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 단백질 칩에 티로시나제 인산화 저해제 후보물질을 PKC(Protein Kinase C)와 함께 첨가하는 단계;
2) 항-인산화 티로시나제 또는 항-포스포 세린 특이적 항체를 처리하는 단계;
3) 상기 단백질 칩에 결합한 항체의 양을 확인하는 단계; 및
4) 상기 저해제 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 항체 결합 정 도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법을 제공한다.
본 발명의 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩은 기존의 방사선 동위원소, 웰플레이트를 이용한 면역효소측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 면역형광법이 아닌 유리 칩(glass chip)을 이용하여 경제적, 보편적으로 보급할 수 있고, PKC β의 기질로 사용되는 티로시나제의 어려운 정제과정이 필요없이 컬럼 방법을 도입함으로써 간편화, 신속화할 수 있다. 또한, 유리 기판에서 동시 다발적인 실험을 수행할 수 있으며 적은 농도의 저해제 뿐아니라 작은 분자량의 저해제 역시 형광법으로 민감하게 측정하여 스크리닝할 수 있는 장점이 있다. 또한, 기존의 미백관련 표적물질 스크리닝과 관련하여 유전자 레벨이 아닌 단백질 레벨에서 분석하며, 알려진 기질을 이용하여 저해제를 스크리닝하는 목적이 아닌 미백관련 기질 자체를 이용할 수 있으므로 활용범위가 더 넓다. 따라서 본 발명의 티로시나제 저해제 탐색용 단백질 칩 및 이를 이용한 탐색방법은 색소 침착 관련 효소인 티로시나제의 인산화를 저해하는 저해제를 발굴하여 미백 관련 표적 분자 및 유효 신소재 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 티로시나제의 시토졸 도메인(cytosolic domain) 및 막통과 도메인(transmembrane domain)을 합친 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 말토즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP)에 융합시킨 융합단백질이 고체 기판에 고정된 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩을 제공한다.
티로시나제의 인산화는 티로시나제의 시토졸 C-말단 서열(cytosolic C-terminal sequence)의 두 개의 세린(serine)(505 및 509)이 활성화된 PKC β에 의해 인산화되는 것이다. 티로시나제는 티로신을 변환(conversion) 시키는 효소로 멜라닌 생성 중요한 역할을 함으로써 티로시나제의 인산화를 억제하는 저해제는 피부 색소 침착 병변 치료제 및 기능성 화장품의 미백 물질로 사용 가능할 것이라 여겨진다.
본 발명자들은 티로시나제의 인산화 저해제 검색을 위한 탐색방법 구축을 목표로 티로시나제 인산화 저해제 검색용 단백질 칩을 제작하였다. 단백질 칩은 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
1) 에폭시 슬라이드(epoxy slide) 위에 접착식 스티커를 이용하여 웰(well)을 형성하는 단계;
2) 단계 1)의 각 웰에 PKC β의 기질을 투입하여 배열(array)하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배열을 세척(washing) 및 블로킹(bloking)하는 단계;
상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 PKC의 기질은 티로시나제를 사용하는 것 이 바람직하나 티로시나제는 막 단백질로써 단백질 칩에 완전한 구조를 갖도록 어레이(array)하는 것에 어려움이 있으므로, 실제로 PKC β의 기질이 되는 부분인 시토졸 도메인(cytosolic domain)의 11개의 아미노산, 또는 시토졸 및 막통과(transmembrane) 도메인을 합친 30개의 아미노산 서열을 말토즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP)에 융합(fusion)시킨 MBP-TYR 융합단백질을 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 PCR을 이용하여 6H-MBP-EK-TYR11aa 및 6H-MBP-EK-TYR30aa를 제조한 후 각각 pET 벡터에 삽입하여 6H-MBP-EK-TYR11aa 및 6H-MBP-EK-TYR30aa 발현벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pET21a-6H-MBP-EK-TYR11aa 및 pET21a-6H-MBP-EK-TYR30aa를 각각 Escherichia coli BL21(DE3)에 형질도입한 재조합 균주를 배양하여 MBP-TYR 융합 단백질(6H-MBP-EK-TYR11aa 및 6H-MBP-EK-TYR30aa)을 과발현시켜 크로마토그래피로 분리하였다. 분리한 MBP-TYR 융합 단백질(6H-MBP-EK-TYR11aa 및 6H-MBP-EK-TYR30aa)을 칩(chip) 상에 어레이(array)하였다(도 9 참조).
본 발명자들은 상기 단백질 칩에 기질에 따른 티로시나제 인산화의 정도를 확인하기 위해 MBP-TYR11aa, MBP-TYR30aa, 양성 대조군의 히스톤(Histone) 및 음성 대조군의 MBP와 융합(fusion)되어 있지만 다른 서열을 가진 MBP-c2X를 각각의 기질로 이용하여 티로시나제의 인산화 정도를 형광법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 히스톤 및 MBP-TYR30aa는 단백질 칩의 신호(signal)가 강하게 탐색되었으나, 인산화 부위가 없는 MBP-c2X는 신호가 미약하였고, MBP-11aa는 인산화 부위가 있지만 신호가 미약하였다. 상기 MBP-11aa는 MBP와 융합된 부분이 PKC β와 반응하기 에 너무 짧아 입체 장애(steric hindrance)를 가진 것으로 보인다. 따라서 본 발명의 단백질 칩의 기질은 MBP-TYR30aa를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 탐색 결과가 실제로 인산화에 의한 것인지를 확인하기 위해, PKC β 또는 포스포 세린을 탐색하는 항체의 처리 유무를 나누어 확인하였다. 그 결과, PKC β를 처리하지 않거나 포스포 세린을 탐색하는 항체를 처리하지 않았을 경우는 신호가 보이지 않았다. 따라서 상기 신호가 인산화에 의한 것임을 알 수 있다.
본 발명자들은 상기 인산화가 PKC β에 의해 일어나는지 확인하기 위해, 단백질 칩에 PKC β 또는 ATP의 처리를 농도 및 시간별로 나누어 인산화 정도를 측정하였다. 그 결과, 상기 PKC β 또는 ATP의 농도가 올라갈수록 인산화의 정도가 올라갔음을 알 수 있었다. 따라서 상기 인산화는 PKC β 및 ATP에 의한 기작임을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 칩을 포함하는 티로시나제 저해제 탐색용 키트를 제공한다.
상기 키트에 티로시나제 인산화 저해제 후보물질을 처리함으로써 티로시나제의 인산화 저해 정도를 측정할 수 있다. 따라서 본 발명의 키트를 이용하면 티로시나제 저해제를 쉽게 탐색할 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 단백질 칩에 티로시나제 인산화 저해제 후보물질을 PKC(Protein Kinase C)와 함께 첨가하는 단계;
2) 항-인산화 티로시나제 또는 항-포스포 세린 특이적 항체를 처리하는 단계;
3) 상기 단백질 칩에 결합한 항체의 양을 확인하는 단계; 및
4) 상기 저해제 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 항체 결합 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법을 제공한다.
상기 탐색방법에 있어서, 단계 1)의 PKC는 PKC βⅡ인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 탐색방법에 있어서, 단계 2)의 항체는 마우스 항-포스포 세린/쓰레오닌(Mouse anti-phosphoSer/Thr)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 포스포세린(phsphoserine)을 탐색(detection)할 수 있는 항체는 모두 사용가능하다.
상기 탐색방법에 있어서, 단계 3)의 단백질 칩에 결합한 항체의 양은 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 도입하는 것이 바람직하고, 여기에는 형광 표지에 의한 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법, 형광물질의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명(plasmon resonance) 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 단백질 칩상의 항-포스포 세린 특이적 항체에 결합하는 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 티로시나제 인산화 저해제 처리시에는 결합이 억제됨을 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 티로시나제 인산화 저해 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.
본 발명자들은 상기 단백질 칩이 스크리닝 장치로서 적용가능성을 확인하기 위해 티로시나제 인산화 저해제인 티로시나제 모방 단백질(Tyrosinase mimetic peptide, TMP) 또는 PKC β의 선택적 기질로 알려진 비스인돌릴말레이미드(Bisindolylmaleimide) I 을 각각 처리하여 티로시나제 인산화의 저해 정도를 형광법으로 확인하였다. 그 결과, 상기 저해제의 처리농도가 올라갈수록 인산화의 정도가 낮아지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단백질 칩은 티로시나제 인 산화 저해제를 탐색할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 상기 단백질 칩 및 이를 이용한 탐색방법은 기존의 표적물질 스크리닝 방법인 유전자 레벨이 아닌 단백질 레벨에서 분석하는 것을 특징으로 하며, 기존의 알려진 기질을 이용하여 PKC β 저해제를 스크리닝하는 목적이 아닌 관련 기질 자체를 이용할 수 있으므로 활용범위가 더 넓은 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
티로시나제를
모방 단백질(
Tyrosinase
mimetic
peptide
)의 제조
본 발명자들은 말토즈 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)에 시토졸 도메인 중 11개의 아미노산, 및 막통과 및 세포질 도메인을 포함한 30개의 아미노산을 융합시켜 실제로 PKC β의 기질이 되는 부분이 PKC β에 쉽게 노출될 수 있도록 기질을 제작하였다. MBP의 표면에 상기 기질 서열이 잘 노출될 수 있도록 소수성 기질을 가진 엔테로키나제(enterokinase)의 분절부위(cleavage site)인 DDDDK를 MBP와 펩티드 사이에 삽입하였으며, 너무 짧은 서열로 인해 입체장애(steric hindrance)의 발생을 우려하여 11개의 서열보다 더 긴 30개의 아미노산을 함께 제작하였다. 상기 제조방법은 처음에 30aa의 길이의 주형을 DNA합성을 통하여 만들 고, 그 주형을 바탕으로 제한효소자리+DDDDK+30aa 및 제한효소자리+DDDDK+11aa의 프라이머(primer)를 제작하여 각각 PCR을 통해 증폭하였다. 이콜라이(E. coli) DH5α의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 MBP 서열을 증폭하여 앞에서 만든 서열을 붙였다. 만들어진 두 가지 서열 MBP+DDDDK+30aa 및 MBP+DDDDK+11aa를 각각 pET21a 벡터에 집어넣은 후 플라스미드를 정제, 이콜라이(E. coli) BL21에 형질전환시켜 배양 후 컬럼을 통하여 정제하였다.
<
실시예
2> 재조합
TYR30aa
및
TYR11aa
의 고농도 발현벡터의 제조
<2-1> 시약
본 발명자들은 DNA 조작과 플라스미드 분리를 위해 사용한 대장균(Escherichia coli) 균주는 DH5α(F- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA_argF)U169 end A1 recA1 hsdR17(rK- mK+)deoR thi_1 supE44 λ-gyrA96 relA1)이며, 재조합 대장균 내 유전자를 발현시키기 위해 사용한 대장균(Escherichia coli) 균주는 BL21(D3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal(λc I857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7gene1) dcm(DE3))이다. 재조합 대장균 발현을 위해 사용한 벡터는 pET21a(Novagen)이다. DNA 재조합을 위한 제한효소, DNA 폴리머라제(polymerase), T4 DNA 리가아제(ligase), RNase, PCR 시약(pfu 폴리머라제, dNTP mixture)은 Boehringer Mannheim 또는 Bioprogen 제품을 사용하였고, 배지 성분은 Difco에서 구입하였으며, 전기영동 및 단백질 정량에 사용된 시약은 Bio-rad에서 구입하여 사용하였다.
<2-2> 배지 및 배양 조건
대장균용 배지로는 LB(1% 트립토판(Tryptone), 0.5% 이스트 추출물(Yeast extract), 1% NaCl)를 사용했으며 발현용 벡터로 형질 전환된 대장균의 증식을 위하여 50ug/ml 앰피실린(ampicillin)을 사용하였다. 재조합 균주를 발현시키기 위해, 50ug/ml 앰피실린이 포함된 LB 배지에서, 온도는 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 600nm에서 O.D 약 0.6이 되었을 때 1mM 이소프로필 1-티오-베타-디-갈락토피라노사이드(Isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)를 첨가하여 T7 락 프로모터(lac promoter)가 발현되도록 하였다. 그리고, IPTG 첨가 후 4 ~ 6시간 더 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액의 최종 산소 요구량(OD)을 측정하고 균체를 회수하였다.
<2-3> 재조합 플라스미드의 제조
벡터 pET21a(도 1 참조)를 제한효소(restriction enzyme) NdeI 및 XhoI으로 37℃에서 밤새(overnight) 절단(digestion)시킨 후, 10% 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기 영동하여 크기(size)를 확인하고, 파워 겔 추출 키트(Power gel extraction kit)(Bioprogen)를 이용하여 용리(elution)하였다. 벡터 내에 삽입할 6H-MBP-EK-TYR30aa는 PCR(Perkin Elmer 2400)을 이용하여 제조하였다. MBP 및 TYR의 서열을 근거로 각각의 프라이머를 제조하였다. 상기 MBP 서열은 이콜라이(E. coli) DH5α의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로, TYR는 인간 티로시나제(oculocutaneous albinism IA, Genebank No. NM_000372)를 주형으로 하여 RT-PCR 로 증폭하였다. 이때, 막통과 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 단편으로는 상기 티로시나제의 염기서열 중 1580 내지 1669번째 부위를 이용하였다. MBP 및 TYR의 서열, 및 프라이머 서열들은 하기와 같다(표 1 참조).
| 구분 | 서열(5'->3') | |
| MBP(Maltose binding protein) | 서열번호 1 | ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACT |
| TYR | 서열번호 2 | TGT CGT CAC AAG AGA AAG CAG CTT CCT GAA GAA AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC CAC AGT TTG TAT CAG AGC CAT TTA |
| 6H-MBP | 포워드(Forward)서열번호 3 | GGC CAT ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GTA ATC |
| 리버스(reverse) 서열번호 4 | CC AAG CCA TGG AGT CTG CGC GTC TTT CAG GGC TTC ATC GAC | |
| TYR 주형 | 포워드(Forward) 서열번호 5 | AAG AGA AAG CAG CTT CCT GAA GAA AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC CAC AGT TTG TAT |
| 리버스(reverse) 서열번호 6 | CTG ATA CAA ACT GTG GTA ATC CTC TTT CTC CAT GAG GAG TGG CTG CTT TTC TTC AGG AAG CTG CTT TCT | |
| ek-TYR 30aa | 포워드(Forward) 서열번호 7 | GGC CCA TGG GAC GAC GAC GAC AAG TGT CGT CAC AAG AGA AAG CAG CTT |
| 리버스(reverse) 서열번호 8 | GGC CTC GAG TTA TAA ATG GCT CTG ATA CAA ACT | |
| ek-TYR 11aa | 포워드(Forward) 서열번호 9 | GGC CCA TGG GAC GAC GAC GAC AAG GAG GAT TAC CAC AGT |
| 리버스(reverse) 서열번호 10 | GGC CTC GAG TTA TAA ATG GCT CTG ATA | |
티로시나제 주형(template)을 제조하기 위해, 티로시나제 주형의 각각의 프라이머를 100pM으로 녹이고, 포워드(forward) 및 리버스(reverse) 각각을 10ul를 섞는다. 상기 혼합물(mixture)을 PCR에서 95℃에서 5분, 55℃에서 5분, 37℃에서 10분, 20℃에서 20분으로 1 사이클(cycle) 반응시킨다. 상기 반응액을 주형으로 PCR 반응을 하는데, 그 조건은 95℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 55℃에서 30초 동안 풀림(annealing), 72℃에서 45초 동안 신장(extension)으로, 30 사이클을 하였고, 마지막 연장(elongation)은 72℃에서 7분 동안 하였으며, 2.5 유닛(unit) pfu 폴리머라제, 5㎕ 2.5mM dNTP, 2ul 주형, 각 100pM 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10㎕ 10X pfu 폴리머라제 완충용액을 넣고, 멸균된 3차 증류수로 최종 부피(final volume)를 100㎕로 맞춘 후 반응하였다. 이때 반응물을 아가로즈(agarose) 전기 영동으로 크기를 확인 후, PCR 정제 키트(purification kit)(Bioprogen)를 이용하여 용리(elution) 하였다. 이렇게 용리(elution)한 PCR 산출물(product)에 6H-MBP PCR 산출물(product)은 제한효소 Nde I 및 Nco I으로, EK-TYR 30aa 및 EK-TYR 11aa는 Nco I/Xho I으로 37℃에서 3시간 동안 절단(digestion)한 후, 전기영동으로 크기를 확인하고, 겔 용리(gel elution) 하였다.
상기 각각의 PCR 산출물(product)을 먼저 제조한 pET 21a와 T4 DNA 리가제(ligase)를 이용하여 16℃에서 4시간 동안 3 조각(piece)을 리게이션(ligation)한 후, 리게이션 혼합물(ligation mixture)을 DH5α에 전환(transformation)하여 콜로니(colony)를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 콜로니(colony)를 LB/amp 3ml에 접종 후 밤새(overnight) 배양하여, 플라스미드 정제 키트(Plasmid purification kit)(Bioprogen)를 이용하여 플라스미드를 준비한 후 클로닝(cloning)에 사용한 Nde I 및 Xho I으로 절단(digestion)하여, 6H-MBP-ek-TYR30aa 및 6H-MBP-ek-TYR11aa가 제대로 삽입(insertion)되어 있는 크기의 유전자를 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하여 찾을 수 있었으며, MBP 내부 서열 프라이머를 이용한 서열결정을 통해 정확히 확인된 재조합 유전자를 얻었다(도 2 내지 도 7 참조).
<2-4> 재조합 균주의 제조
상기 제조한 pET21a-6HMBP-ek-TYR30aa 및 pET21a-6HMBP-ek-TYR11aa 벡터를 단백질 발현 균주인 BL21(DE3) 100ul에 1ug을 삽입하고, 얼음에서 30분간 배양한 후, 42℃에서 90초 동안 열 충격(heat shock)을 가하고, LB 배지 100ul를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨다. 그리고 앰피실린(ampicillin)을 함유한 LB 아가 플레이트(agar plate)에 도말한 후, 37℃에서 배양하여 pET21a-6HMBP-ek-TYR30aa 및 pET21a-6HMBP-ek-TYR11aa로 형질전환된 재조합 균주를 얻었다.
<
실시예
3>
MBP
-
TYR
재조합 융합 단백질 발현 및 분리
<3-1> 단백질의 발현
LB/amp 배양액 3ml에 pET21a-6HMBP-ek-TYR30aa 또는 pET21a-6HMBP-ek-TYR11aa로 형질전환된 재조합 균주 1 콜로니(colony)를 접종하여 비유도(uninduction) 또는 유도(induction)시켜 발현을 확인한다. 각 관(tube)에 콜로니(colony)를 접종한 후, 600nm에서 O.D.가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. O.D.가 0.6이 되면, 1mM 이소프로필-1-티오-베타-디-갈락토피라노사이드(Isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다.
<3-2> 단백질의 분리
최종 O.D.가 ＞3이 되었을 때, 각 배양액을 1ml씩 취해 12,000rpm에서 1분간 원심분리하여 펠릿(pellet)을 얻는다. 이렇게 얻은 펠릿(pellet)에 DW 1ml씩을 넣어 잘 현탁시킨 후, 초음파 분해(sonication)를 30초 동안하여 파쇄시킨다. 1ml의 파쇄액 중 총 분획물(Total fraction)을 얻고, 12,000rpm에서 1분간 원심 분리하여 가용성 분획물(soluble fraction) 및 불용성 분획물(insoluble fraction)으로 분리하였다. 상기 분획물(fraction) 80ul에 5X 라이시스 완충용액(lysis buffer) 20ul를 첨가하고 100℃에서 5분간 가열한 후 얼음으로 식힌 다음 1mm 두께의 5% 축적 겔(stacking gel)에 로딩(loading)하였고, 12%의 분리 겔(separating gel)에서 분리하였다. 로딩이 완료된 PAGE 겔은 150V, 25mA로 전기영동하였고, 전기영동 후 겔을 쿠마실 브릴리언트 블루-R(coomassie brilliant blue-R) 용액으로 염색하여 6H-MBP-ek-TYR30aa 및 6H-MBP-ek-TYR11aa의 발현 정도를 확인할 수 있었다(도 8 참조).
<
실시예
4> 단백질 칩(
Protein
chip
)의 제작
칩은 에폭시 슬라이드(epoxy slide)(VEPO-25C, CEL associate) 제품을 사용하였으며, 접착식 스티커에 직경 1.5mm의 구멍을 뚫어 슬라이드 위에 붙여 웰(well)을 형성하도록 제작하였다. 기질은 20%의 글리세롤(glycerol)이 포함된 농도 0.5mg/ml을 각각의 웰(well)에 스포팅(spotting)하여 30℃에서 밤새 두어 칩에 어레이(array)하였다. 세척 용액(washing solution)(0.5% Tween-20를 포함하는 PBS(pH7.4))으로 20분간 흔들며(shaking) 세척한 후 증류수로 거품이 일어나지 않을 때까지 짧게 세척한 후 3% BSA로 1시간 30분 동안 블로킹(blocking)을 하였다. 상기와 같이, 세척 용액(washing solution)(0.5% Tween-20를 포함하는 PBS(pH7.4))으로 20분간 흔들며 세척한 후 증류수로 거품이 일어나지 않을 때까지 짧게 세척한 후 질소가스로 건조를 하고 각각의 웰에 100uL PKC 용액(20mM HEPES(pH 7.4), 0.1mM CaCl2, 10μM Mg/ATP 칵테일(Upstate), 10% 지질 혼합물(100ug/ml 포스파티딜-세린(phosphatidyl-serine)(Sigma), 20ug/ml 디아실글리세롤(Diacylglycerol)(Sigma), 1mM HEPES(pH 7.4), 0.03% Triton X-100, 1.2ug/ml PKC βⅡ(Calbiochem))을 스포팅하여 30℃에서 반응시켰다. 20분간 세척과 건조 후 항체 희석 용액(antibody diluting solution)(30% 글리세롤을 포함하는 PBS(pH7.4)에서 10% BSA)로 마우스 항-포스포 세린/쓰레오닌(Mouse anti-phosphoSer/Thr)을 10ug/ml 농도에 맞게 희석하여 스포팅한 후 1시간 동안 반응시켰다. 20분간 세척과 건조 후 항체 희석 용액으로 Cy5-라벨링한 염소 항-마우스 항체(Goat anti-mouse Ab)를 20ug/ml 농도로 희석하여 스포팅한 후 30분간 반응시켰다. 20분간 세척과 건조 후 형광스캐너(Axon)로 스캐닝(scanning)하였다(도 9 참조).
<
실험예
1> 기질에 따른 인산화의 정도를 측정
상기 제작한 MBP-11aa 및 MBP-30aa이 PKC β의 기질로써 사용이 가능한지를 판단하기 위해 양성 대조군으로 히스톤(Histone)(Sigma)을, 음성 대조군으로 MBP와 융합되어 있지만 다른 서열을 가진 MBP-c2X(NEB)와 차단제(Blocking agent)인 BSA를 이용하였다. 반응조건은 ATP 10uM, 2시간 반응하였으며, 각각의 웰을 PKC β의 처리 유무, 항체 처리의 유무로 나누어 실제로 탐색(detection)되는 결과가 인산화에 의한 것인지를 확인하였다.
상기 결과, 양성 대조군인 히스톤(Histone)과 제작한 MBP-30aa에서만이 신호(signal)가 강하게 보였다. MBP-11aa도 인산화 부위(phosphorylation site)를 가지고 있긴 하지만 MBP와 융합된 부분이 PKC β와 반응하기에 너무 짧아 입체 장애(steric hindrance)를 가진 것을 알 수 있었다. 또한, PKC β를 처리하지 않거나 포스포세린(phsphoserine)을 탐색하는 항체를 처리하지 않았을 경우, 신호가 보이지 않으므로 이는 항체가 PKC β에 의해 인산화된 세린(serine)만을 탐색되었음을 알 수 있다(도 10 참조).
<
실험예
2>
PKC
β 및
ATP
농도변화에 따른 인산화의 정도를 측정
실제로 <실험예 1>의 인산화가 PKC β에 의해 일어나는지 확인하기 위해 상기 <실시예 4>의 단백질 칩에 PKC β 및 ATP의 농도 및 반응시간별로 다르게 처리하였다.
상기 결과, PKC β 또는 ATP 농도가 올라갈수록 인산화가 증가하였으며, 이로써 인산화가 PKC β와 ATP에 의한 기작임을 확인할 수 있었다(도 11 및 도 12 참조).
<
실험예
3> 저해제 농도변화에 따른 인산화의 정도를 측정
<3-1>
티로시나제를
모방 단백질(
Tyrosinase
mimetic
peptide
) 처리
상기 <실시예 4>의 단백질 칩에 인산화 서열을 가진 11개의 펩타이드(peptide)를 합성한 티로시나제 모방 단백질을 처리하여 인산화의 저해 정도를 확인하였다.
상기 결과, 티로시나제 모방 단백질의 처리농도가 올라갈수록 인산화의 정도가 낮아지는 것을 확인하였다(도 13 참조).
<3-2>
비스인돌릴말레이미드
(
Bisindolylmaleimide
) I 처리
상기 <실시예 4>의 단백질 칩에 PKC β의 선택적 기질로 알려진 비스인돌릴말레이미드 I를 처리하여 인산화의 저해 정도를 확인하였다.
그 결과, 비스인돌릴말레이미드 I의 처리농도가 올라갈수록 인산화의 정도가 낮아지는 것을 확인하였다(도 14 참조).
도 1은 유전자 재조합에 사용되는 pET 21a(+) 벡터맵을 나타내는 그림이고,
도 2는 pET 21a-6H-MBP-EK-TYR30aa의 벡터맵을 나타내는 그림이고,
도 3은 재조합 벡터 내에 6H-MBP-EK-TYR30aa가 삽입되어 있음을 확인하는 전기영동 결과를 나타내는 그림이고,
도 4는 6H-MBP-EK-TYR30aa의 서열결정(sequencing)의 결과를 나타내는 그림이고,
도 5는 pET 21a-6H-MBP-EK-TYR11aa의 벡터맵을 나타내는 그림이고,
도 6은 재조합 벡터 내에 6H-MBP-EK-TYR11aa가 삽입되어 있음을 확인하는 전기영동 결과를 나타내는 그림이고,
도 7은 6H-MBP-EK-TYR11aa의 서열결정(sequencing)의 결과를 나타내는 그림이고,
도 8은 재조합 대장균에서 6H-MBP-EK-TYR30aa 및 6H-MBP-EK-TYR11aa의 발현 정도를 나타내는 전기영동 결과를 나타내는 그림이고,
도 9는 단백질 칩의 제작 과정을 나타내는 개략도이고,
도 10은 단백질 칩에서 기질에 따른 인산화 정도를 나타내는 그래프이고,
도 11은 단백질 칩에서 PKC β 농도에 따른 인산화 정도를 나타내는 그래프이고,
도 12는 단백질 칩에서 ATP 농도에 따른 인산화 정도를 나타내는 그래프이고,
도 13은 단백질 칩에서 TMP 처리 농도에 따른 인산화 정도를 나타내는 그래프이고,
도 14는 단백질 칩에서 비스인돌릴말레이미드 I의 처리 농도에 따른 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
<110> Inha Univ.
<120> The protein chip for screening inhibitors of tyrosinase
phosphorylation and the screening method using it
<130> 7p-10-15
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1101
<212> DNA
<213> nucleotide sequence of MBP(Maltose binding protein)
<400> 1
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc gaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac t 1101
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> amino acid sequence of Tyrosinase(TYR)
<400> 2
Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys
35 40 45
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr
50 55 60
Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr Ala
85 90
<210> 3
<211> 54
<212> PRT
<213> 6H-MBP forward primer
<400> 3
Gly Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr
20 25 30
Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly
35 40 45
Gly Thr Ala Ala Thr Cys
50
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> 6H-MBP reverse primer
<400> 4
Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr
1 5 10 15
Gly Cys Gly Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys
20 25 30
Thr Thr Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys
35 40
<210> 5
<211> 69
<212> PRT
<213> TYR template forward primer
<400> 5
Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys
1 5 10 15
Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys
20 25 30
Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala
35 40 45
Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr
50 55 60
Thr Gly Thr Ala Thr
65
<210> 6
<211> 69
<212> PRT
<213> TYR template reverse primer
<400> 6
Cys Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala
20 25 30
Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr
35 40 45
Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys
50 55 60
Thr Thr Thr Cys Thr
65
<210> 7
<211> 48
<212> PRT
<213> ek-TYR 30aa forward primer
<400> 7
Gly Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly
1 5 10 15
Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala
20 25 30
Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr
35 40 45
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> ek-TYR 30aa reverse primer
<400> 8
Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys
20 25 30
Thr
<210> 9
<211> 39
<212> PRT
<213> ek-TYR 11aa forward primer
<400> 9
Gly Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly
1 5 10 15
Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ala
20 25 30
Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr
35
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> ek-TYR 11aa reverse primer
<400> 10
Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala
20 25
Claims (8)
- 티로시나제(Tyrosinase)의 시토졸 도메인(cytosolic domain) 및 막통과 도메인(transmembrane domain)을 합친 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 말토즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP)에 융합시킨 융합단백질이 고체 기판에 고정된 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 단백질 칩.
- 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
- 제 1항의 단백질 칩을 포함하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색용 키트.
- 1) 제 1항의 단백질 칩에 티로시나제 인산화 저해제 후보물질을 PKC (Protein Kinase C)와 함께 첨가하는 단계;2) 항-인산화 티로시나제 또는 항-포스포 세린 특이적 항체를 처리하는 단계;3) 상기 단백질 칩에 결합한 항체의 양을 확인하는 단계; 및4) 상기 저해제 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 항체 결합 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 티로시나제 인산화 저해제 탐색방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 1)의 PKC는 PKC βⅡ인 것을 특징으로 하는 탐색방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 2)의 항체는 마우스 항-포스포 세린/쓰레오닌(Mouse anti-phosphoSer/Thr)인 것을 특징으로 하는 탐색방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 3)의 단백질 칩에 결합한 항체의 양은 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법에 의해 수행되거나 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 탐색방법.
- 제 7항에 있어서, 형광표지는 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티 오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형광물질인 것을 특징으로 하는 탐색방법.
Priority Applications (1)
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