DE69528379T2

DE69528379T2 - Paraoxonase aus serum

Info

Publication number: DE69528379T2
Application number: DE69528379T
Authority: DE
Inventors: Wei Wu He; Peter L. Hudson; Steven M. Ruben
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1995-06-28
Publication date: 2003-06-12
Anticipated expiration: 2015-06-29
Also published as: EP1217007A2; AU704834B2; US5792639A; US5629193A; JPH10502255A; CA2194390A1; AU2950795A; US20050026226A1; US7026140B2; ES2180648T3; EP0804591A4; EP0804591B1; WO1996001322A1; US6140093A; JP2003088364A; DK0804591T3; ATE224953T1; DE69528379D1; KR970704887A; EP0804591A1

Description

Diese Erfindung betrifft kürzlich identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert werden, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist speziell Paraoxonase aus Serum. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung solcher Polypeptide.
Parathion (Diethyl-para-nitrophenyl-phosphothioat) und Chlorpyrifos (O, O-Diethyl- O-3,5,6-trichloro-2-pyridinol) sind häufig verwendete Organophosphor-Insektizide und sind jedes Jahr an einer großen Zahl von Vergiftungen von Landarbeitern und anderen Personen beteiligt (Hayes, W. J. Pesticides Studied in Man, Wilkins und Wilkins, Baltimore, S. 284-435 (1982)). Beide Verbindungen werden in vivo bioaktiviert, um die entsprechenden toxischen Oxon-Inhibitoren der Cholinesterase zu bilden. Dies führt zu Nervenzelltod und verwandten Nervenstörungen. Beide Oxone werden durch das Serumenzym Paraoxonase/Arylesterase hydrolysiert, das vorwiegend, wenn nicht ausschließlich, in den Lipoprotein-Partikeln hoher Dichte (HDL-Partikeln) lokalisiert ist (Mackness, M. I. et al., Biochem. Pharmacol., 32: 2291-2296 (1983)).
Beim Menschen zeigt dieses Enzym einen substratabhängigen Polymorphismus in der Aktivität (Mallinckrodt, M. G. und Diepgen, T. L., Toxicol. Environ. Chem., 18: 79-196 (1988)). Die menschliche Paraoxonase/Arylesterase aus Serum katalysiert die Hydrolyse von Organophosphaten, aromatischen Carboxylsäureestern und Carbamaten. Es scheinen zwei Allele zu existieren. Ein Allelprodukt hydrolysiert Paraoxon mit einer hohen Umsatzzahl und das andere mit einer niedrigen Umsatzzahl. Andere Substrate wie Phenylacetat, Beta- und Naphthylacetat (Gan, K. N. et al., Drug Metab. Dispos., 19: 100-106 (1991)) und Chlorpyrifosoxon (Furlong, C. E. et al., Anal. Biochem., 180: 242-247 (1989)) werden durch jedes Allelprodukt mit der gleichen oder fast der gleichen Rate hydrolysiert. Das Enzym hydrolysiert auch die Nervengifte Soman und Sarin (Gan, K. N. et al., Drug Metab. Dispos., 19: 100-106 (1991)). Die Hydrolyse neurotoxischer Organophosphate stellt eine nützliche, zufällige Aktivität der Paraoxonase dar.
Die strukturellen und biologischen Eigenschaften eines menschlichen Paraoxonasegens wurden in Hasset et al., Biochemistry, Bd. 30, S. 10141-10149, 1991; Furlong et al., Chem. Biol. Interactions, Bd. 87, S. 35-48, 1993; Adkins et al., Am. I. Hum. Genet., Bd. 52, S. 598-608, 1993; Smollen et al., Drug Metabolism and Disposition, Bd. 19, Nr. 1, S. 107-112, 1991 beschrieben. Darüber hinaus schlägt zum Beispiel Adkins et al., 1993 vor, dass es nur ein einziges Gen für die Paraoxonase im Menschen gibt. Tatsächlich schlägt keines der vorstehend zitierten Dokumente die Isolierung eines Paraoxonasegens mit unterschiedlicher Struktur aus menschlichen Geweben vor.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues reifes Polypeptid zu Verfügung gestellt, sowie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch verwendbare Fragmente, Analoga und Derivate davon. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist menschlichen Ursprungs.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich der mRNAs, der DNAs, der cDNAs, der genomischen DNAs sowie der Analoga und der biologisch aktiven und diagnostisch oder therapeutisch verwendbaren Fragmente davon zur Verfügung gestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zu Herstellung eines solchen Polypeptids durch rekombinante Techniken bereitgestellt, umfassend die Anzucht von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen, welche die Expression des Proteins und die anschließende Rückgewinnung des Proteins fördern.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung eines solchen Polypeptids oder Polynucleotids, das ein solches Polypeptid codiert, für therapeutische Zwecke bereitgestellt, zum Beispiel als ein Gegenmittel gegen Organophosphat-Toxizität (Pestizidvergiftung) und zur Verhinderung des Nervenzelltods.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls Nucleinsäuresonden bereitgestellt, umfassend Nucleinsäuremoleküle mit einer ausreichenden Länge, um spezifisch an eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Testansätze zum Nachweis von Krankheiten oder von Empfänglichkeiten für Krankheiten bereitgestellt, die mit Mutationen in den Nucleinsäuressequenzen einhergehen, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide oder Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, für in vitro-Zwecke bereitgestellt, die die wissenschaftliche Forschung betreffen, zum Beispiel die Synthese von DNA und die Herstellung von DNA-Vektoren.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten dem Fachmann aus den hierin angerührten Lehren ersichtlich sein.
Die folgenden Zeichnungen stellen Erläuterungen der Ausführungsformen der Erfindung dar, und es wird dadurch nicht beabsichtigt, den Rahmen der Erfindung, wie er durch die Patentansprüche abgesteckt ist, zu begrenzen.
Fig. 1 stellt die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des möglichen reifen Paraoxonase-Polypeptids aus Serum dar. Es wird die Ein-Buchstaben- Standardabkürzung für Aminosäuren verwendet.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) zur Verfügung gestellt, die das reife Polypeptid codiert, das die abgeleitete Aminosäuresequenz aus Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) besitzt, oder das reife Polypeptid codiert, das durch die cDNA des Clons codiert wird, der am 12. Mai 1994 mit der ATCC- Hinterlegungs-Nr. 75773 hinterlegt wurde.
Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Genbank entdeckt, die aus einem menschlichen Mandelkern erstellt wurde. Es ist mit der menschlichen Paraoxonase/Arylesterase-Proteinfamilie strukturell verwandt. Es enthält ein offenes Leseraster, das ein Protein von annähernd 356 Aminosäureresten codiert. Das Protein zeigt mit 67% Sequenzidentität und 83% Ähnlichkeit über einen Abschnitt von 249 Aminosäuren den höchsten Grad an Homologie zu der Serum-Paraoxonase aus Oryctolagus cuniculus. Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA umfaßt, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und wenn sie einzelsträngig ist, kann es sich um den codierenden oder um den nicht-codierenden (Anti- Sinn) Strang handeln. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann mit der codierenden Sequenz, die in Fig. 1 gezeigt wird (SEQ ID NO: 1) oder mit der des hinterlegten Clons identisch sein, oder es kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, wobei die codierende Sequenz aufgrund der Redundanz oder der Degeneration des genetischen Codes das gleiche reife Polypeptid codiert, wie die DNA der Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) codiert oder das reife Polypeptid, das von der hinterlegten cDNA codiert wird, codiert, kann umfassen: ausschließlich die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzliche codierende Sequenzen wie eine Leader- oder eine Sekretionssequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und wahlweise zusätzliche codierende Sequenzen) und nicht codierende Sequenzen wie Introns oder nicht codierende Sequenzen, die sich 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid befinden.
Somit umfaßt der Begriff "Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, das ausschließlich die codierende Sequenz für das Polypeptid umfaßt, sowie ein Polynucleotid, das zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenzen umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) codiert, oder des Polypeptids codiert, das durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Bei einer Variante des Polynucleotids kann es sich um eine natürlich vorkommende allelische Variante des Polynucleotids handeln oder um eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die das gleiche reife Polypeptid codieren, das in Fig. 1 (SEQ ID NO.: 2) gezeigt wird, oder das gleiche reife Polypeptid, das durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert wird, sowie Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, ein Derivat oder ein Analogen des Polypeptids der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) oder des Polypeptids codieren, das durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Solche Nucleotidvarianten umfassen Deletions- Varianten, Substitutions-varianten und Additions- oder Insertions-Varianten.
Wie hierin vorstehend gezeigt, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz besitzen, bei der es sich um eine natürlich vorkommende allelische Variante der codierenden Sequenz handeln kann, die in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, oder um die codierende Sequenz des hinterlegten Clons. Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, stellt eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz dar, die eine Substitution, eine Deletion oder eine Addition eines oder mehrerer Nucleotide besitzen kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Polynucleotide, bei denen die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im gleichen Leseraster mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft sein kann, die die Expression in und die Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle unterstützt, zum Beispiel eine Leader-Sequenz, die als Sekretionssequenz bei der Steuerung des Transport eines Polypeptids aus der Zelle wirkt. Ein Polypeptid mit einer Leader-Sequenz ist ein Präprotein, und es kann eine Leader-Sequenz besitzen, die durch die Wirtszelle abgespalten wird, um die reife Form des Polypeptid zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das aus dem reifen Protein plus zusätzlicher Aminosäurereste am 5'-Ende besteht. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz besitzt, ist ein Proprotein und stellt eine inaktive Form des Proteins dar. Nachdem die Prosequenz abgespalten ist, verbleibt ein aktives reifes Protein.
Somit kann, zum Beispiel, das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein oder ein Protein, das eine Prosequenz besitzt, oder ein Protein codieren, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leader-Sequenz) besitzt.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können die codierende Sequenz auch im Leseraster mit einer Marker-Sequenz verknüpft enthalten, die die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Bei der Marker-Sequenz kann es sich um eine Hexa-Histidin-Markierungssequenz handeln, die durch den pQE-9-Vektor bereitgestellt wird, um im Falle eines bakteriellen Wirts die Reinigung des reifen Polypeptids, das mit dem Marker verknüpft ist, zu ermöglichen, oder zum Beispiel kann die Marker-Sequenz eine Hämagglutinin (HA)-Markierungssequenz sein, wenn ein Säugerwirt, z. B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Die HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das aus dem Grippevirus-Hämagglutininprotein abgeleitet ist (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)).
Der Begriff "Gen" bezeichnet das Segment der DNA, das an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist; es umfaßt dem codierenden Bereich vorgelagerte oder nachfolgende Bereiche (Leader und Trailer) sowie intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen den individuellen codierenden Segmenten (Exons).
Fragmente des Volllängen-Gens der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Genbank verwendet werden, um die VolllängencDNA zu isolieren und um andere cDNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Die Sonden dieses Typs besitzen bevorzugt mindestens 30 Basen und können zum Beispiel 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonden können auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Volllängen- Transkript entspricht, und einen genomischen Clon oder genomische Clone, die das vollständige Gen einschließlich regulatorischer und Promotor-Bereiche, Exons und Introns enthalten, zu identifizieren. Ein Beispiel für eine Durchsuchung umfaßt die Isolierung des codierenden Bereichs des Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, die zur Synthese einer Oligonucleotid-Sonde dient. Markierte Oligonucleotide mit einer Sequenz, die zu der des Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, werden verwendet, um eine Genbank mit menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchsuchen, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Genbank die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die zu den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 70%, bevorzugt mindestens 90% und stärker bevorzugt mindestens 95% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Der Ausdruck "stringente Bedingungen", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine Hybridisierung nur dann stattfinden wird, wenn mindestens 95% und bevorzugt mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorhanden ist. Die Polynucleotide, die zu den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid, das durch die cDNAs der Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) oder die hinterlegte(n) cDNA(s) codiert wird, beibehalten.
In einer anderen Ausführungsform kann das Polynucleotid mindestens 20 Basen, bevorzugt 30 Basen und stärker bevorzugt mindestens 50 Basen besitzen, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren, wobei dieses eine wie hierin vorstehend beschriebene Identität zu jenem hat und die Aktivität beibehalten oder nicht beibehalten kann. Zum Beispiel können solche Polynucleotide als Sonden für das Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 verwendet werden, zum Beispiel zur Rückgewinnung des Polynucleotids oder als diagnostische Sonde oder als PCR-Primer.
Somit richtet sich die vorliegende Erfindung auf Polynucleotide, die mindestens 70% Identität, bevorzugt mindestens 90% und stärker bevorzugt mindestens 95% Identität zu einem Polynucleotid besitzen, das das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert, sowie Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 30 Basen und bevorzugt mindestens 50 Basen besitzen, und auf Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert werden. Die Hinterlegung(en), auf die hierin Bezug genommen wird, wird (werden) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens aufrechterhalten. Diese Hinterlegungen werden lediglich als Erleichterung für Fachleute zur Verfügung gestellt und stellen kein Eingeständnis dar, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten sind, sowie die Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die durch diese codiert werden, werden hierin durch Bezugnahme eingeschlossen und sollen im Falle irgendeines Konflikts mit irgendeiner Sequenzbeschreibung hierin als Kontrolle dienen. Es kann eine Lizenz erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und es wird hierdurch keine solche Lizenz gewährt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Paraoxonase-Polypeptid aus Serum, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) besitzt oder das die Aminosäuresequenz, die durch die hinterlegte DNA codiert wird, besitzt, sowie Fragmente, Analoga und Derivate eines solchen Polypeptids.
Die Begriffe "Fragment", "Derivat" und "Analogon" bedeuten, wenn sie sich auf das Polypeptid der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) beziehen oder das Polypeptid, das durch die hinterlegte cDNA codiert wird, ein Polypeptid, das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehält. Somit umfaßt ein Analogon ein Proprotein, das durch Abspaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Polypeptid herzustellen.
Bei dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid handeln, bevorzugt handelt es sich um ein rekombinantes Polypeptid.
Das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids der Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) oder das, das durch die hinterlegte cDNA codiert wird, kann (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste durch konservierte oder nicht konservierte Aminosäurereste (bevorzugt ein konservierter Aminosäurerest) ersetzt worden sind, und bei einem solchen ersetzten Aminosäurerest kann es sich um einen handeln, der durch den genetischen Code codiert oder nicht codiert wird, oder (ii) eines sein, bei dem eine oder mehrere der Aminosäurereste eine Sustituentengruppe umfassen, oder (iii) eines sein, bei dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung verknüpft ist, wie z. B. eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglycol, oder (iv) eines sein, bei dem zusätzliche Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid verknüpft sind, wie z. B. eine Leader- oder eine Sekretionssequenz, oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Von solchen Fragmenten, Derivaten und Analoga wird angenommen, dass sie sich innerhalb des Fachwissens der Fachleute der hier offenbarten Lehren befinden.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einer isolierten Form zur Verfügung gestellt und sind bevorzugt bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff "isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt) entfernt wird. Zum Beispiel gilt ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorliegt, als nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das von einigen oder von allen mit ihm im natürlichen System zusammen vorkommenden Materialien getrennt ist, als isoliert. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch als isoliert gelten, da ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung sind.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen die Polypeptide der SEQ ID NO: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) sowie die Polypeptide, die mindestens 70% Ähnlichkeit (bevorzugt mindestens 70% Identität) zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 und stärker bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (stärker bevorzugt mindestens 90% Identität) zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 und noch stärker bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch stärker bevorzugt mindestens 95% Identität) zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 besitzen, und umfassen ebenfalls Teile solcher Polypeptide, wobei solche Teile des Polypeptids im allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren enthalten.
Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, wird die "Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch den Vergleich der Aminosäuresequenz und ihrer konservierten Aminosäureaustausche eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt.
Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung des entsprechenden Volllängen-Polypeptids durch Peptidsynthese verwendet werden; deshalb können die Fragmente als Zwischenprodukte bei der Herstellung der Volllängen-Polypeptide verwendet werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Volllängen-Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung gentechnisch hergestellt werden, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Die Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung, wobei es sich zum Beispiel um einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor handeln kann, gentechnisch hergestellt (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen, usw. vorliegen. Die hergestellten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien angezogen werden, die je nach Bedarf zur Aktivierung von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der Serum-Paraoxonasegene modifiziert werden können. Die Anzuchtbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und ähnliche sind solche, die zuvor bei der Wirtszelle, die zur Expression ausgewählt wurde, angewendet wurden und werden dem Fachmann vertraut sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Techniken verwendet werden. Somit kann zum Beispiel das Polynucleotid in irgendeinen Expressionsvektor aus einer Vielzahl von Vektoren zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen werden. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculoviren; Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet wurden; virale DNA wie Vakziniavirus, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudorabiesvirus. Es kann jedoch jeder andere Vektor verwendet werden, solange er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist. Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor durch eine Vielzahl an Verfahren eingebaut werden. Im allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Schnittstelle(n) durch im Fachgebiet bekannte Verfahren inseriert. Von solchen und anderen Verfahren wird angenommen, dass sie sich innerhalb des Fachwissens der Fachleute befinden.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell mit (einer) geeigneten Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verbunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können erwähnt werden: LTR oder der SV40-Promotor, der lac- oder tro-Promotor aus E. coli, der PL-Promotor des Phagen Lambda und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält ebenfalls eine Ribosomenbindestelle zur Translations-Initiation und einen Transkriptions-Terminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Verstärkung der Expression enthalten.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren eines oder mehrere selektierbare Markergene, um eine phänotypische Eigenschaft zur Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie die Tetracyclin- oder die Amipicillin-Resistenz für E. coli.
Der Vektor, der, wie hierin vorstehend beschrieben, die geeigneten DNA-Sequenzen enthält, sowie einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontrollsequenz, kann benutzt werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um dem Wirt die Expression des Proteins zu ermöglichen.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können erwähnt werden:
Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium: Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen, usw. Von der Auswahl eines geeigneten Wirts wird angenommen, das sie sich innerhalb des Fachwissens der Fachleute der hier offenbarten Lehren befindet.
Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, die vorstehend ausführlich beschrieben wurden. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie einen Plasmid- oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in der Vorwärts- oder in der entgegengesetzten Richtung inseriert worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfaßt das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, umfassend zum Beispiel einem Promotor, der fünktionell mit der Sequenz verbunden ist. Den Fachleuten ist eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren bekannt, und diese sind kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele angeführt. Bakterielle: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontische: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharamacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die Promotorbereiche können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markem ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Speziell benannte bakterielle Promotoren umfassen lacI, lacZ, T3, T7, got, Lambda-Pp, pl und trp. Die eukaryontischen Promotoren umfassen den sehr frühen Promotor von CMV, den Promotor des HSV-Thymidinkinase-Gens, die frühen und die späten SV40-Promotoren, LTRs aus Retroviren, und den Promotor des Metallothinonin-I-Gens aus der Maus. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors ist im Rahmen der Erfahrung der Fachleute.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Bei den Wirtszellen kann es sich um eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle oder um eine niedere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle handeln, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie eine Bakterienzelle. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation vorgenommen werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, L, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf herkömmliche Weise verwendet werden, um das Genprodukt, das durch die rekombinante Sequenz codiert wird, herzustellen. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung durch herkömmliche Peptid-Synthesegeräte synthetisch hergestellt werden.
Die reifen Proteine können in Säugerzellen, Hefen, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle der geeigneten Promotoren exprimiert werden. Es können auch zellfreie Translationssysteme unter Verwendung von RNAs, die aus den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurden, benutzt werden, um solche Proteine herzustellen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden durch Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben, dessen Offenlegung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, in höheren Eukaryonten wird durch die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp groß sind und die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu steigern. Beispiele umfassen den 5V40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs bei den Basenpaaren 100 bis 270, einen Cytomegalievirus-Enhancer des frühen Promotors, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und die Adenovirus- Enhancer.
Allgemein umfassen rekombinante Expressionsvektoren die Replikationsursprünge und die selektierbaren Marker, welche die Transformation der Wirtszelle ermöglichen, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen aus E. coli und das TRP1-Gen aus S. cerevisiae, und einen Promotor, der von einen stark exprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern. Solche Promotoren können aus Operons, die unter anderem glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), den α- Faktor, die Saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren, abgeleitet werden. Die heterologe Struktursequenz wird in geeignetem Raster mit Translationsinitiations- und Terminations-Sequenzen und bevorzugt mit einer Leader-Sequenz, die in der Lage ist, die Sekretion eines translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium zu steueren, zusammengebaut. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, einschließlich eines N-terminalen Peptids zur Identifizierung, das gewünschte Eigenschaften verleiht, z. B. eine Stabilisierung oder eine vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Gebräuchliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden durch die Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Terminations-Signalen im funktionellen Leseraster mit einen funktionierenden Promotor konstruiert. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung umfassen, um den Erhalt des Vektors und, wenn gewünscht, die Amplifikation innerhalb des Wirtes bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte zu Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis. Salmonella typhimurium und verschiedene Arten aus den Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl wahlweise auch andere verwendet werden können.
Als repräsentatives, aber nicht begrenzendes Beispiel, können gebräuchliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet worden sind, die genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-"Gerüst"abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der Struktursequenz, die exprimiert werden soll, kombiniert.
Nach der Transformation eines passenden Wirtsstammes und der Anzucht des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte, wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel induziert (z. B. durch Temperaturerhöhung oder chemische Induktion), und die Zellen werden über einen weiteren Zeitraum angezogen.
Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, mit physikalischen oder chemischen Mitteln aufgebrochen, und der so erhaltene Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Mikrobenzellen, die zur Expression von Proteinen verwendet wurden, können durch jedes geeignete Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklen, Ultrabeschallung, mechanisches Aufbrechen oder die Verwendung von zelllysierenden Mitteln; solche Verfahren sind den Fachleuten gut bekannt.
Es können auch verschiedene Säugerzellkultursysteme verwendet werden, um rekombinante Proteine zu exprimieren. Beispiele für Säuger-Expressionssysteme umfassen die COS-7-Linien der Affennieren-Fibroblasten, die durch Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) beschrieben wurden, und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen verträglichen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Die Säuger-Expressionvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und ebenfalls alle notwendigen Ribosomen-Bindestellen, Polyadenylierungsstellen. Donor- und Akzeptor-Spleißstellen, Transkriptions-Terminationssequenzen und 5'- flankierende, nicht-transkribierte Sequenzen umfassen. Die DNA-Sequenzen, die aus den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungs-Stellen abgeleitet worden sind, können verwendet werden, um die erforderlichen, nicht-transkribierten, genetischen Elemente bereitzustellen.
Die Serum-Paraoxonase-Polypeptide können aus den rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren, die Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungs-chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit- Chromatographie und Lectin-Chromatographie umfassen, gewonnen und gereinigt werden. Wenn nötig, können Schritte zur Proteinrückfaltung bei der Fertigstellung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann die hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC) bei den abschließenden Reinigungsschritten angewendet werden.
Bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein natürliches, gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus einem chemischen Syntheseverfahren handeln, oder die Polypeptide können durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel durch Kultur von Bakterien-, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen) hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem Wirt, der bei einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendet wurde, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht glycosyliert vorliegen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch einen Initiations-Methionin- Aminosäurerest umfassen.
Die Serum-Paraoxonase-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Gegenmittel gegen Organophosphat-Vergiftung angewendet werden, da toxische Oxon- Inhibitoren der Cholinesterase durch die Serum-Paraxononase hydrolysiert werden.
Die Serum-Paraoxonase-Polypeptide können zur Verhinderung des Nervenzelltods, der auf solchen toxischen Vergiftungen basiert, benutzt werden. Wenn eine Organophosphat- Vergiftung unbehandelt bleibt, wird Nervenzelltod die Folge sein.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch bei der Identifizierung von Chromosomen nützlich. Die Sequenz wird spezifisch zu einem bestimmten Ort auf einem individuellen menschlichen Chromosom gelenkt und kann mit diesem hybridisieren. Das Gen für die Serum-Paraoxonase befindet sich nahe dem Gen für die cystische Fibrose auf dem Chromosom 7. Außerdem gibt es einen laufenden Bedarf an der Identifizierung bestimmter Stellen auf Chromosomen. Es sind nur wenige Chromosomen-Markierungsreagenzien, die auf den eigentlichen Sequenzdaten (Wiederholungssequenz-Polymorphismen) basieren, derzeit zur Markierung von Chromosomenorten verfügbar. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein erster wichtiger Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheiten verbunden sind.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger angewendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutische wirksame Menge des Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Solche Träger umfassen Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon, sind aber nicht auf diese begrenzt. Die Formulierung sollte zu der Form der Verabreichung passen.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, die oder der einen oder mehrere Behälter umfaßt, die mit einer oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung gefüllt sind. Mit einem solchen Behälter(n) kann eine Anleitung verbunden sein, deren Form durch eine Regierungsbehörde, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von pharmazeutisch wirksamen Substanzen oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschrieben wird, wobei die Anleitung die Genehmigung der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs zur Verabreichung am Menschen durch die Behörde wiedergibt. Zusätzlich können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen therapeutischen Verbindungen angewendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer geeigneten Weise wie auf oralem, lokalem, intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subcutanem, intranasalem oder intradermalem Weg verabreicht werden. Die Serum-Paraoxonase wird in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung und/oder Vorbeugung vor der speziellen Indikation wirksam ist. Im Allgemeinen wird die Serum-Paraoxonase in einer Menge von mindestens etwa 10 ug/kg Körpergewicht verabreicht, und in den meisten Fällen wird sie in einer Menge, die etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht überschreitet, verabreicht. In den meisten Fällen beträgt die tägliche Dosis etwa 10 ug/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht unter Berücksichtigung des Weges der Verabreichung, der Krankheitsanzeichen, usw.
Die Polypeptide können gemäß der vorliegenden Erfindung auch durch die in vivo- Expression solcher Polypeptide angewendet werden, was oft als "Gentherapie" bezeichnet wird.
Somit können zum Beispiel Zellen eines Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das ein Polypeptid ex vivo codiert, hergestellt werden, wobei die hergestellten Zellen anschließend einem Patienten zur Verfügung gestellt werden, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind in dem Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können die Zellen durch Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, durch die Verwendung eines Retroviruspartikels, der RNA enthält, die ein Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt werden.
In ähnlicher Weise können die Zellen in vivo für die in vivo-Expression eines Polypeptids konstruiert werden, zum Beispiel, durch Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind. Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, kann eine Produzentenzelle zur Herstellung eines Retroviruspartikels, der die RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten verabreicht werden, um die Zellen in vivo herzustellen und das Polypeptid in vivo zu exprimieren. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch solche Verfahren sollten den Fachleuten aus den Lehren der vorliegenden Erfindung ersichtlich sein. Zum Beispiel kann es sich bei dem Expressionsvehikel zur Herstellung von Zellen nicht um ein Retrovirus handeln, sondern zum Beispiel um ein Adenovirus, das verwendet werden kann, um die Zellen nach der Kombination mit einem geeigneten Vehikel zur Verabreichung in vivo herzustellen.
Retroviren, von denen die hierin vorstehend erwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, umfassen das murine Moloney-Leukämie-Virus, das Milznekrosevirus, Retroviren wie das Rous-Sarkom-Virus, das Harvey-Sarkom-Virus, das Vögel-Leukose-Virus, das Gibbonaffen-Leukämie-Virus, das menschliche Immunschwächevirus, das Adenovirus, das myeloproliferativen Sarkomvirus und das Mammakarzinomvirus, sind aber nicht auf diese beschrankt. In einer Ausführungsform wird der retrovirale Plasmidvektor aus dem murinen Moloney-Leukämie-Virus abgeleitet.
Der Vektor enthält einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen das retrovirale LTR; den SV40-Promotor und den menschlichen Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques, Bd. 7, Nr. 9, 980-990 (1989) beschrieben wurde, oder jeglichen anderen Promotor (z. B. zelluläre Promotoren wie eukaryontische Promotoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Histon-, Pol III- und β-Actin-Promotoren), sind aber nicht auf diese beschränkt. Andere virale Promotoren, die benutzt werden können, umfassen Adenovirus-Promotoren, Thymidin- Kinase (TK)-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird dem Fachmann aus den hierin enthaltenen Lehren ersichtlich sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, befindet sich unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen Promotoren aus Adenoviren wie den adenoviralen späten Haupt-Promotor oder heterologe Promotoren wie den Cytomegalievirus (CMV)- Promotor; den respiratorische Syncitial-Virus (RSV)-Promotor; induzierbare Promotoren wie den MMT-Promotor, den Metallothionein-Promotor; Hitzeschock-Promotoren; den Albumin- Promotor; den ApoAI-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; virale Thymidin-Kinase- Promotoren wie den Herpes Simplex Virus-Thymidin-Kinase-Promotor, retrovirale LTRs (einschließlich des modifizierten retroviralen LTR, das hierin vorstehend beschrieben wurde); den β-Actin-Promotor und menschliche Wachstumshormon-Promotoren, sind aber nicht auf diese beschrankt. Es kann sich auch um den nativen Promotor handeln, der das Gen kontrolliert, welches das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmidvektor wird zur Transduktion von Verpackungs-Zelllinien verwendet, um Produzenten-Zelllinien zu bilden. Beispiele für Verpackungs-Zelllinien, die transfiziert werden können, umfassen die PE501-, PA317-, ψ-2-, ψ-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, ψCRE-, ψCRIP-, GP+E-86-, GP+envAm12 und DAN-Zeillinien, die in Miller, Human Gene Therany, Bd. 1, S. 5-14 (1990) beschrieben werden, das hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschossen ist, sind aber nicht auf diese beschränkt. Der Vektor kann die Verpackungs-Zellen durch jedes Mittel transduzieren, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Solche Mittel umfassen Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO&sub4;-Fällung, sind aber nicht auf diese beschränkt. Alternativ kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom eingeschlossen werden oder mit einem Lipid verbunden werden und dann einem Wirt verabreicht werden.
Die Produzenten-Zelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel, die die Nucleinsäuresequenz(en), die die Polypeptide codiertlcodieren, umfassen. Solche retroviralen Vektorpartikel können dann benutzt werden, um eukaryontische Zellen entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, die das Polypeptid codiert/codieren. Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen embryonische Stammzellen, embryonische Krebszellen sowie hämatopoetische Stammzellen, Leberzellen, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung als ein diagnostisches Mittel. Der Nachweis einer mutierten Form des Gens wird die Diagnose einer Krankheit oder einer Empfänglichkeit für eine Krankheit, die sich durch zu niedrige Expression der Paraoxonase ergibt, ermöglichen.
Individuen, die Mutationen in dem Gen der vorliegenden Erfindung tragen, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden. Die Nucleinsäuren zur Diagnose können aus den Zellen eines Patienten, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsie-Material, erhalten werden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden oder kann durch Verwendung von PCR (Saiki et al., Nature 324: 163-166 (1986)) vor der Untersuchung enzymatisch amplifiziert werden. Die RNA oder die cDNA kann für den gleichen Zweck ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die zu der Nucleinsäure, die die Serum-Paraoxonase codiert, komplementär sind, verwendet werden, um Mutationen zu identifizieren und zu untersuchen. Zum Beispiel können Deletionen und Insertion durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zu dem normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch die Hybridisierung amplifizierter DNA mit radioaktiv markierter RNA oder alternativ mit radioaktiv markierten Antisinn-DNA- Sequenzen identifiziert werden. Genau passende Sequenzen können von falsch gepaarten Duplexmolekülen durch Verdau mit RNase A oder durch unterschiedliche Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen dem Referenzgen und Genen, die Mutationen besitzen, können durch das direkte DNA-Sequenzierungsverfahren aufgedeckt werden. Zusätzlich können clonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA- Segmente nachzuweisen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens wird stark erhöht, wenn es mit einer PCR kombiniert wird. Zum Beispiel wird ein Sequenzierungs-Primer mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder einem einzelsträngigen Matrizenmolekül, das über eine modifizierte PCR erzeugt wurde, verwendet. Die Sequenzbestimmung wird durch herkömmliche Verfahren mit radioaktiv markierten Nucleotiden oder durch automatische Sequenziemngsverfähren mit Fluoreszenz-Markierungen durchgeführt.
Genetische Untersuchungen, die auf DNA-Sequenzunterschieden basieren, können durch den Nachweis von Veränderungen der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne denaturierenden Mitteln durchgeführt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch hochauflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen, in denen die Wanderungsgeschwindigkeiten von unterschiedlichen DNA-Fragmenten im Gel bei unterschiedlichen Positionen entsprechend ihrer spezifischen oder Teil-Schmelztemperaturen verzögert sind (vergleiche z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)), unterschieden werden.
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Schutz- Testansätze wie z. B. der Schutz vor RNase und S1 oder chemische Spaltungsverfahren (z. B. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)) aufgedeckt werden.
Somit kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie Hybridisierung, Schutz vor RNase, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder Verwendung von Restriktionsenzymen (z. B. Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)) und Southern Blot-Analyse genomischer DNA erreicht werden.
Zusätzlich zu der eher herkömmlichen Gelelektrophorese und der DNA- Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Testansatz zum Nachweis von veränderten Spiegeln des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben die Anwesenheit der Serum-Paraoxonase nachweisen kann. Die Testansätze, die verwendet werden, um die Spiegel des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einer Probe, die aus einem Wirt erhalten wurde, nachzuweisen, sind den Fachleuten wohlbekannt und umfassen Radioimmun-Testansätze, kompetitive Bindungs- Testansätze, Western Blot-Analyse und bevorzugt einen ELISA-Testansatz. Ein ELISA- Testansatz umfaßt zu Beginn die Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch gegen das Serum-Paraxonoase-Antigen gerichtet ist, bevorzugt einen monodonalen Antikörper. Zusätzlich wird ein Reporter-Antikörper gegen den monodonalen Antikörper hergestellt. An den Reporter-Antikörper wird ein nachweisbares Reagenz wie Radioaktivität, Fluoreszenz, oder in diesem Beispiel das Meerettich-Peroxidase-Enzym angeheftet. Dann wird eine Probe aus einem Wirt entnommen und auf einem festen Trägermaterial inkubiert, z. B. einer Polystyrolschale, welche die Proteine der Probe bindet. Alle freien Proteinbindestellen auf der Schale werden dann durch Inkubation mit einem unspezifischen Protein wie Serumalbumin aus Rind bedeckt. Als Nächstes wird der monoclonale Antikörper in der Schale inkubiert, wobei die monodonalen Antikörper sich an jedes der Polypeptide der vorliegenden Erfindung anheften, die an der Polystyrolschale angeheftet sind. Alle ungebundenen monodonalen Antikörper werden mit Puffer ausgewaschen. Der Reporter-Antikörper, der mit Meerettich- Peroxidase verbunden ist, wird nun in die Schale gegeben, wodurch sich eine Bindung des Reporter-Antikörpers an jeden monodonalen Antikörper, der an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung gebunden ist, ergibt. Nicht gebundene Reporter-Antikörper werden dann ausgewaschen. Dann werden Peroxidase-Substrate der Schale zugegeben, und die Menge an Farbe, die sich in einem vorgegebenen Zeitraum entwickelt, stellt ein Maß für die Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung dar, das in einem vorgegebenen Volumen einer Patientenprobe vorhanden ist, wenn sie mit einer Standardkurve verglichen wird.
Es kann ein kompetitiver Testansatz verwendet werden, wobei Antikörper, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, an einen festen Träger angeheftet werden und markierte Serum-Paraoxonase und eine Probe, die aus dem Wirt erhalten wurde, werden über den festen Träger gegeben, und die Menge der nachgewiesenen Markierung, die an den festen Träger gebunden ist, kann mit der Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in der Probe korreliert werden.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zu Durchmusterung von Arzneistoffen bereit, um diejenigen zu identifizieren, die die Wechselwirkung der Serum-Paraoxonase mit ihrem Substrat verstärken (Agonisten), umfassend zum Beispiel das Inkontaktbringen einer Säugerzelle, die ein DNA-Molekül enthält, das die Serum-Paraoxonase codiert, mit einer Vielzahl von Arzneistoffen und Parathion oder Chlorpyrifos und den Nachweis der Arzneistoffe, die die Hydrolyse der toxischen Oxone durch die Serum-Paraoxonase erhöhen, und dadurch Identifizieren der Arzneistoffe, die spezifisch als Agonisten wirken. Es können verschiedene Verfahren zum Nachweis angewendet werden. Die toxischen Oxone können durch Verbindung mit einem nachweisbaren Markierungsstoff (z. B. einer radioaktiven Markierung oder einer nicht-isotopischen Markierung wie Biotin) "markiert" werden, so dass ihre Hydrolyse gemessen werden kann. Arzneistoff-Kandidaten werden durch die Auswahl von chemischen Verbindungen, die mit hoher Affinität an das exprimierte Serum- Paraononase-Polypeptid binden, in transfizierten Zellen unter Verwendung von Radioliganden-Bindungsverfahren, die in dem Fachgebiet wohlbekannt sind, identifiziert.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich zur Identifizierung von Chromosomen. Die Sequenz wird spezifisch zu einem bestimmten Ort auf einem individuellen menschlichen Chromosom geleitet und kann mit diesem hybridisieren. Darüber hinaus besteht ein laufender Bedarf an der Identifizierung bestimmter Stellen auf Chromosomen. Gegenwärtig sind wenige Reagenzien zur Chromosomenmarkierung, die auf den eigentlichen Sequenzdaten (Wiederholungssequenz-Polymorphismen) basieren, verfügbar, um chromosomale Orte zu markieren. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung stellt einen wichtigen ersten Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen dar, die mit Krankheiten verbunden sind.
Kurzgefaßt, können Sequenzen auf Chromosomen durch die Herstellung von PCR- Primem (bevorzugt 15-25 bp) aus der cDNA kartiert werden. Die Computeranalyse der nicht- translatierten 3'-Bereiche des Gens wird verwendet, um rasch Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umspannen und damit den Amplifikationsvorgang erschweren würden. Diese Primer werden dann zur PCR- Durchsuchung von somatischen Zellhybriden verwendet, die individuelle menschliche Chromosmen enthalten. Nur die Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Die PCR-Kartierung somatischer Zellhybride stellt ein schnelles Verfahren dar, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit den gleichen Oligonucleotid-Primern kann eine Sublokalisierung mit Reihen von Fragmenten aus spezifischen Chromosomen oder Sammlungen großer genomischer Clone in analoger Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um ihr Chromosomen zu kartieren, umfassen die in situ-Hybridisierung, die Vordurchsuchung mit markierten, durch Durchflußcytometrie sortierten Chromosomen und die Vorauswahl durch Hybridisierung, um chromosomenspezifische cDNA-Genbanken zu konstruieren.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons bei ausgebreiteten Metaphase-Chromosomen kann verwendet werden, um die genaue chromosomale Lokalisierung in einem Schritt zur Verfügung zu stellen. Diese Technik kann bei cDNA, die mindestens 50 oder 60 Basen enthält, angewendet werden. Zur Übersicht über diese Technik vergleiche Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Wenn eine Sequenz auf einem genauen chromosomalen Ort kartiert ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten aus der genetischen Karte korreliert werden. Solche Daten befinden sich zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (über die Welch Medical Library der John Hopkins-Universität online erhältlich). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die im gleichen chromosomalen Bereich kartiert wurden, werden dann durch Kopplungsanalyse identifiziert (gemeinsame Vererbung physikalisch benachbarter Gene).
Als nächstes ist es nötig, die Unterschiede in der cDNA oder in der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in einigen oder allen der betroffenen Individuen, aber nicht in irgendeinem normalen Individuum beobachtet wird, ist die Mutation wahrscheinlich die Ursache der Krankheit.
Bei der derzeitigen Auflösungsgenauigkeit der physikalischen Kartierungs- und der genetischen Kartierungstechniken kann eine cDNA, die präzise in einem chromosomalen Bereich lokalisiert wurde, der mit der Krankheit verbunden ist, eines von 50 bis 500 möglichen verursachenden Genen darstellen. (Dies gilt für eine Auflösungsgenauigkeit der Kartierung von 1 Megabase und einem Gen pro 20 kb).
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder die Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogene verwendet werden, um dagegen Antikörper herzustellen. Bei diesen Antikörpern kann es sich zum Beispiel um polyclonale oder um monoclonale Antikörper handeln. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch chimäre, einzelkettige und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab- Expressions-Genbank. Zur Herstellung solcher Antikörper und Fragmente können verschiedene Verfahren verwendet werden, die in dem Fachgebiet bekannt sind.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch die Verabreichung der Polypeptide an ein Tier, bevorzugt ein nicht menschliches Tier, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die das vollständige native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus einem Gewebe, das das Polypeptid exprimiert, zu isolieren.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik, die Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Kultur von Zelllinien hergestellt werden, verwendet werden. Beispiele, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole, et al., 1985, in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96), umfassen die Hybridom-Technik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik.
Die Techniken, die zur Herstellung von einzelkettigen Antikörpern beschrieben wurden (U.S.-Patent 4,946,778), können so angepaßt werden, dass durch sie einzelkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung hergestellt werden können. Es können auch transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele weiter beschrieben; es ist jedoch verständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Teil- oder Mengenangaben erfolgen gewichtsbezogen, solange nichts anderes angeführt wird.
Um das Verständnis der folgenden Beispiel zu erleichtern, werden bestimmte, häufig auftretende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
"Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die hierin verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder kommerziell erhältlich, öffentlich ohne Einschränkungen erhältlich oder können aus verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind zu den beschriebenen Plasmiden gleichwertige Plasmide im Fachgebiet bekannt und werden dem Fachmann ersichtlich sein.
"Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hierin verwendet werden, sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfordernisse wurden so verwendet, wie sie einem normalen Fachmann bekannt sind. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Zum Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Konstruktion von Plasmiden werden typischerweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezifische Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angegeben. Es werden normalerweise Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC verwendet, aber diese können gemäß den Angaben des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird das Reaktionsgemisch direkt auf einem Polyacrylamid- oder Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Eine Größentrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung von 8%-igen Polyacrylamidgelen durchgerührt, wie durch Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980) beschrieben.
"Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide besitzen keinen 5'-Phosphatrest und werden daher ohne Anhängen eines Phosphatrestes durch ein ATP in Gegenwart einer Kinase nicht mit einem anderen Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird aber mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
"Ligierung" bezieht sich auf den Vorgang der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., id., S. 146). Wenn nicht anders angeführt, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug und annähernd äquimolaren Mengen an DNA-Fragmenten, die ligiert werden sollen, durchgeführt werden.
Wenn nicht anders angeführt, wurde die Transformation, wie in dem Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973) beschrieben, durchgerührt.

Beispiel 1

Expression in Bakterien und Reinigung der Serum-Paraoxonase

Die DNA-Sequenz, die die Serum-Paraoxonase codiert, ATCC-Nr. 75773, wird zu Beginn unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primem, die dem 5'-Ende und Sequenzen des prozessierten Serum-Paraoxonaseproteins (ohne die Signalpeptidsequenz) entsprechen, und den Vektorsequenzen, die 3' des Serum-Paraoxonasegens liegen, amplifiziert. Zusätzliche Nucleotide, die der Serum-Paraoxonase entsprechen, wurden an die 5'- beziehungsweise die 3'-Sequenzen angehängt. Der 5'-Oligonucleotid-Primer besitzt die Sequenz: 5'-TCAGGATCCAGAAATCGACTTAAAGCCTCC-3'(SEQ ID NO: 3) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle, der 21 Nucleotide der codierenden Sequenz der Serum-Paraoxonase, beginnend an der vermuteten terminalen Aminosäure des prozessierten Proteincodons, folgen. Die 3'-Sequenz: 5'- TCAAAGCTTTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3' (SEQ ID NO: 4) enthält zu einer HindIII-Restriktions-Schnittstelle komplementäre Sequenzen und wird gefolgt von 21 Nucleotiden der Serum-Paraoxonase. Die Restriktionsenzym-Schnittstellen entsprechen den Restriktionsenzym-Schnittstellen in dem bakteriellen Expressionvektor PQE-9 (Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codiert die Antibiotikaresistenz (AmpR), einen bakteriellen Replikationsurspmng (Ori), einen IPTG regulierbaren Promoter/Operator (P/O), eine Ribosomenbindestelle (RBS), eine 6-His-Markierungssequenz und Restriktionsenzym-Schnittstellen. Dann wurde pQE-9 mit BamHI und HindIII verdaut. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-9 ligiert und wurden im Leseraster mit der Sequenz, die die Histidin-Markierungssequenz und die RBS codiert, inseriert. Dann wurde das Ligierungsgemisch verwendet, um den E. coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) durch das Verfahren, das in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989) beschrieben ist, zu transformieren. Die Transformanten wurden über ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsenzym- Analyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte enthielten, wurden über Nacht (O/N) in Flüssigkulturen mit LB-Medium angezogen, das sowohl mit Amp (100 ng/ml) als auch mit Kan (25 ug/ml) ergänzt worden war. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 anzuimpfen. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (O.D.&sup6;&sup0;&sup0;) zwischen 0,4 und 0,6 angezogen. Dann wurde IPTG ("Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid") bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch die Inaktivierung des lacI-Repressors, das Freiwerden des P/O fuhrt dann zu erhöhter Genexpression. Man ließ die Zellen weitere 3 bis 4 Stunden wachsen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Das Zellsediment wurde in dem chaotrophen Agens 6 molar Guanidinhydrochlorid solubilisiert. Nach der Klärung wurde die solubilisierte Serum-Paraoxonase aus dieser Lösung durch Chromatographie über eine Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung von Proteinen zulassen, die eine 6-His- Markierungssequenz besitzen (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). Die Serum-Paraoxonase wurde von der Säule mit 6 molar Guanidin-HCl, pH 5,0, eluiert und zum Zwecke der Renaturierung auf 3 molar Guanidin-HCl, 100 mmolar Natriumphosphat, 10 mmolar Glutathion (reduziert) und 2 mmolar Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach der Inkubation dieser Lösung über 12 Stunden wurde das Protein gegen 10 mmolar Natriumphosphat dialysiert.

Beispiel 2

Expression rekombinanter Serum-Paraoxonase in CHO-Zellen

Das Expressionsplasmid, das das Gen für die Serum-Paraoxonase-HA enthält, wird aus dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen) abgeleitet; dieser enthält: 1) den SV40- Replikationsursprung, 2) das Ampicillinresistenzgen, 3) den Replikationsursprung aus E. coli, 4) den CMV-Promotor, gefolgt von einem Polylinkerbereich, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den vollständigen Serum-Paraoxonase- Vorläufer und eine HA-Markierungssequenz, die im Leseraster an sein 3'-Ende fusioniert ist, codiert, wurde in den Polylinkerbereich des Vektors cloniert; daher befindet sich die Steuerung der Expression des rekombinanten Proteins unter der Kontrolle des CMV- Promotors. Die HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das aus dem Influenzavirus-Hämagglutininprotein abgeleitet wurde, wie vorher beschrieben wurde (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984, Cell 37: 767). Die Einführung einer HA-Markierungssequenz in unser Zielprotein ermöglicht den leichten Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Strategie der Plasmidkonstruktion wird wie folgt beschrieben:
Die DNA-Sequenz, die die Serum-Paraoxonase codiert, ATCC-Nr.: 75773, wurde unter Verwendung von zwei Primern durch PCR konstruiert: der 5'-Primer: 5'- CGCGGGATCCACCATGGGGGCGGCTGGTGGCTCT-3' (SEQ ID NO: 5) enthält eine BamHI-Restriktions-Schnittstelle, der 21 Nucleotide der die Serum-Paraoxonase codierenden Sequenz, beginnend am Initiationscodon, folgen; die 3'-Primersequenz: 5'- CGCGTCTAGACGGTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3' (SEQ ID NO: 6) enthält Sequenzen, die zu einer XbaI-Schnittstelle komplementär sind, und ein Translations- Stoppcodon und die letzten 18 Nucleotide der die Serum-Paraoxonase codierenden Sequenz (ausschließlich des Stopp-Codons). Daher enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Schnittstelle, die Serum-Paraoxonase codierende Sequenz, ein Translations-Terminations-Stoppcodon und eine XbaI-Schnittstelle. Das über PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E, coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert; die transformierte Kultur wurde auf Platten, die Medium mit Ampicillin enthielten, ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien selektiert. Aus den Transformanten wurde die Plasmid- DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des korrekten Fragments hin untersucht. Zur Expression der rekombinanten Serum-Paraoxonase wurden CHO-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des Serum-Paraoxonase-HA-Proteins wurde durch radioaktive Markierung und ein Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion 8 Stunden mit S-Cystein markiert. Dann wurden die Kulturmedien gesammelt, und die Zellen wurden mit Detergens lysiert (RIPA-Puffer: 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; (1% NP-40); 0,5% DOC; 50 mM Tris, pH 7,5 (Wilson, I. et al., id., 37: 767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch die Kulturmedien wurden mit einem HA-spezifischen monodonalen Antikörper inkubiert. Die ausgefällten Proteine wurden auf 15%-igen SDS-PAGE-Gelen untersucht.

Beispiel 3

Expressionsmuster der Serum-Paraoxonase in menschlichem Gewebe

Eine Northern Blot-Analyse wird durchgeführt, um die Expressionsspiegel der Serum- Paraoxonase in menschlichem Gewebe zu untersuchen. Gesamt-Zell-RNA-Proben werden mit dem RNAzol -B-System (Biotecx Laboratories, Inc., 6023 South Loop East, Houston, TX 77033) isoliert. Etwa 10 ug der Gesamt-RNA, die aus jedem angegebenen menschlichen Gewebe isoliert wurde, wurden auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt und auf einen Nylonfilter übertragen (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Die Markierungsreaktion wird gemäß dem Stratagene Prime-It-Kit mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die markierte DNA wird mit einer Select-G-50-Säule gereinigt (5 Prime - 3 Prime, Inc., 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303)). Dann wird der Filter mit dem radioaktiv markierten Volllängen-Paraoxonasegen mit 1.000.000 CpM/ml in 0,5 M NaPO&sub4;, pH 7,4 und 7% SDS über Nacht bei 65ºC hybridisiert. Nach zweimaliger Waschung bei Zimmertemperatur und zweimal bei 60ºC mit 0,5 · SSC, 0,1% SDS wird der Filter dann bei -70ºC über Nacht mit einer Verstärkerfolie exponiert.

Beispiel 4

Expression über die Gentherapie

Fibrobasten werden von einem Individuum durch Haut-Biopsie erhalten. Das so erhaltene Gewebe wird in Gewebekulturmedium gegeben und in kleine Stücke getrennt. Kleine Klumpen des Gewebes werden auf die feuchte Oberfläche einer Gewebekulturflasche plaziert, und es werden etwa zehn Teilstücke in jede Flasche gegeben. Die Flasche wird mit der Oberseite nach unten gedreht, gut verschlossen und bei Zimmertemperatur über Nacht belassen. Nach 24 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Flasche umgedreht, und die Gewebeklumpen bleiben am Boden der Flasche fixiert, und frisches Medium (z. B. Ham-F12- Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin) wird zugegeben. Dieses wird dann bei 37ºC über etwa eine Woche inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium zugegeben und danach alle paar Tage gewechselt. Nach zwei weiteren Wochen Kultur erscheint eine einzellige Schicht Fibroblasten. Diese einzellige Schicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen abgemessen.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)), das durch zwei lange terminale Wiederholungssequenzen des murinen Moloney-Sarkom-Virus flankiert wird, wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird über ein Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung von Glaskügelchen gereinigt.
Die cDNA, die eine Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5'- beziehungsweise den 3'- Endsequenzen entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Schnittstelle und der 3'-Primer enthält weiterhin eine HindIII-Schnittstelle. Gleiche Mengen des linearen Rückgrats des murinen Moloney-Sarkom-Virus und die amplifizierten EcoRI- und Hindin-Fragmente werden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase zusammengefügt. Das so erhaltene Gemisch wird unter Bedingungen gehalten, die zur Ligierung der beiden Fragmente geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um den Bakterienstamm HB101 zu transformieren, der dann auf Agar, der Kanamycin enthält, zum Zwecke der Bestätigung, dass der Vektor das Gen von Interesse korrekt inseriert hat, plattiert wird.
Die amphotropen pA317- oder GP+am12-Verpackungszellen werden bis zur Konfluenz in Gewebekultur in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin angezogen. Der MSV-Vektor, der das Gen enthält, wird dann dem Medium zugegeben, und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen stellen nun infektiöse Viruspartikel her, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden jetzt als Produzentenzellen bezeichnet).
Den transduzierten Produzentenzellen wird frisches Medium zugegeben, und anschließend wird das Medium aus einer 10 cm-Platte konfluenter Produzentenzellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen Viruspartikel enthält, wird durch einen Milliporefilter filtriert, um die abgelösten Produzentenzellen zu entfernen, und dieses Medium wird dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Das Medium wird von einer noch nicht vollständig konfluenten Platte von Fibroblasten entfernt und rasch durch das Medium der Produzentenzellen ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, werden praktisch alle Fibroblasten infiziert, und es ist keine Selektion erforderlich. Wenn der Titer sehr niedrig ist, ist es nötig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie neo oder his besitzt.
Die konstruierten Fibroblasten werden dann, entweder alleine oder nachdem sie auf Cytodex 3-Mikroträgerkügelchen bis zur Konfluenz angezogen worden waren, in den Wirt injiziert. Die Fibroblasten stellen nun das Proteinprodukt her.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER: HUDSON, ET AL.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Paraoxonase aus Serum
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN
(B) STRASSE: 6 BECKER FARM ROAD
(C) STADT: ROSELAND
(D) STAAT: NEW JERSEY
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 07068
(V) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 3/5 INCH DISKETTE
(B) COMPUTER: IBM PS/2
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS
(D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1
(Vi) DATEN ZUR VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGS-NUMMER:
(B) EINREICHUNGS-DATUM: Gleichzeitig
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) DATEN ZUR FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGS-NUMMER: 08/270,583
(B) EINREICHUNGS-DATUM: 5. JULI 1994
(viii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: FERRARO, GREGORY D.
(B) REGISTRIERUNGS-NUMMER: 36,134
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN-NUMMER: 325800-
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: 201-994-1700
(B) TELEFAX: 201-994-1744

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 1079 BASENPAARE
(B) ART: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 356 AMINOSÄUREN
(B) ART: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: PROTEIN
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 30 BASENPAARE
(B) ART: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: OLIGONUCLEOTID
TCAGGATCCA GAAATCGACT TAAAGCCTCC 30
(2) INFORMATION FUR SEQ ID NO: 4:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 30 BASENPAARE
(B) ART: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: OLIGONUCLEOTID
TCAAAGCTTT TAGAGTTCAC AATACAAGGC 30
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 34 BASENPAARE
(B) ART: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: OLIGONUCLEOTID
CGCGGGATCC ACCATGGGGG CGGCTGGTGG CTCT 34
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 34 BASENPAARE
(B) ART: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) ART DES MOLEKÜLS: OLIGONUCLEOTID
CGCGTCTAGA CGGTTAGAGT TCACAATACA AGGC 34

Claims

1. Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Polynucleotiden, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt aufweist;

(b) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuren 1 bis 356 wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, umfasst;

(c) Polynucleotiden, die die codierende Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt aufweisen, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren;

(d) Polynucleotiden, die das Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von zumindest der reifen Form des Polypeptids aufweist, das von der in ATCC 75773 enthaltenen cDNA codiert wird;

(e) Polynucleotiden, die die codierende Sequenz der in ATCC 75773 enthaltenen cDNA aufweisen, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren;

(f) Polynucleotiden, deren komplementärer Strang in der Lage ist, mit einem Polynucleotid gemäß der Definition in einem der Teile (a) bis (e) zu hybridisieren, die zumindest zu 70% identisch sind mit einem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (e) und die eine Serum- Paraoxonase codieren;

(g) einem Polynucleotid, das die codierende Sequenz der in ATCC 75773 enthaltenen cDNA umfasst;

(h) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das Aminosäuren 2 bis 356 von SEQ ID NO: 2 umfasst;

(i) einem Polynucleotid, das das Polypeptid codiert, das durch die in ATCC 75773 enthaltene cDNA codiert wird;

(j) einem Polynucleotid, das 30 zusammenhängende Nucleotide von SEQ ID NO: 1 umfasst;

(k) einem Polynucleotid, das 30 zusammenhängende Nucleotide der cDNA umfasst, die in ATCC Hinierlegungs-Nummer 75773 enthalten ist;

(l) einem Polynucleotid, das 50 zusammenhängende Nucleotide von SEQ ID NO: 1 umfasst;

(m) einem Polynucleotid, das 50 zusammenhängende Nucleotide der cDNA umfasst, die in ATCC Hinterlegungs-Nummer 75773 enthalten ist;

(n) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das 30 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 umfasst;

(o) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das 30 zusammenhängende Aminosäuren umfasst, die durch die in ATCC Hinterlegungs-Nummer 75773 enthaltene cDNA codiert werden;

(p) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das 50 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 umfasst;

(q) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das 50 zusammenhängende Aminosäuren umfasst, die durch die in ATCC Hinterlegungs-Nummer 75773 enthaltene cDNA codiert werden;

(r) einem Polynucleotid, das ein Polypeptidfragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 codiert, wobei das Polypeptidfragment die biologische Funktion und Aktivität von Paraoxonase hat;

(s) einem Polynucleotid, das ein Polypeptidfragment des Polypeptids codiert, das durch die in ATCC Hinterlegungs-Nummer 75773 enthaltene cDNA codiert wird, wobei das Polypeptidfragment die biologische Funktion und Aktivität von Paraoxonase hat;

(t) einem Polynucleotid, das ein zweites Polynucleotid umfasst, das zumindest zu 90% identisch ist mit einem der Teile (a) bis (s);

(u) einem Polynucleotid, das ein zweites Polynucleotid umfasst, das zumindest zu 95% identisch ist mit einem der Teile (a) bis (s);

(v) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 90% identisch ist mit einem der Polypeptide, die durch ein Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (c), (d), (e), (h), (i), (n) bis (s) codiert werden;

(w) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 95% identisch ist mit einem der Polypeptide, die durch ein Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (c), (d), (e), (h), (i), (n) bis

(s) codiert werden;

(x) einem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (w), das ein Polypeptid codiert, dem ein Anfangs-Methionin-Aminosäurerest fehlt;

(y) einem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (w), das ein Polypeptid mit einem Anfangs-Methionin-Aminosäurerest codiert;

(z) einem Polynucleotid, das komplementär zu dem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (y) ist.

2. Polynucleotid nach Anspruch 1, das DNA ist.

3. DNA nach Anspruch 2, die genomische DNA ist.

4. Polynucleotid nach Anspruch 1, das RNA ist.

5. Vektor, enthaltend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Vektor nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit Expressionskontrollsequenzen, die eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.

7. Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 5 oder 6, oder das Polynucleotid nach Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einer Expressionskontrollsequenz.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Serum-Paraoxonase- Aktivität, umfassend: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 und Gewinnen des Polypeptids, das durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.

9. Verfahren zur in vitro-Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid zu exprimieren, das Serum-Paraoxonase-Aktivität hat, umfassend das genetische Verändern von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.

10. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 8.

11. Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 10.

12. Nucleinsäuremolekül, das spezifisch mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.

13. Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Zelle nach Anspruch 7 oder das Polypeptid nach Anspruch 10 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder den Antikörper nach Anspruch 11.

15. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 10, der Zelle nach Anspruch 7 oder des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung von Nervenzelltod aufgrund von toxischer Vergiftung.

16. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder einer Prädisposition für eine Krankheit in Verbindung mit einer Unterexpression des Polypeptids nach Anspruch 10, umfassend die Bestimmung einer Mutation in einer Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die das Polypeptid codiert.

17. Diagnostisches Verfahren, umfassend eine Analyse auf die Anwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 10 in einer von einem Wirt stammenden Probe.

18. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die Agonisten des Polypeptids nach Anspruch 10 sind, umfassend das Inkontaktbringen eines Substrats des Polypeptids mit einer Verbindung, die überprüft werden soll, und Bestimmen, ob die Verbindung das Substrat hydrolysiert.