【発明の詳細な説明】
血清パラオキソナーゼ
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関
する。より詳しくは、本発明のポリペプチドは血清パラオキソナーゼである。本
発明はまた、このようなポリペプチドの作用を抑制することにも関する。
パラチオン（ジエチル−パラ−ニトロフェニルホスホチオエート）およびクロ
ルピリフォス（chlorpyrifos）（Ｏ,Ｏ−ジエチル−Ｏ−３,５,６−トリクロロ
−２−ピリジノール）は一般に使用される有機リン系殺虫剤であり、各年、農業
従事者およびその他の者の多数にわたる中毒に関する（ヘイズ（Ｈayes，Ｗ．Ｊ
.）、ペスタサイズ・スタディード・イン・マン（Ｐesticides Ｓtudiedin Ｍan
）、ウィルキンス・アンド・ウィルキンス（Ｗilkins and Ｗilkins）、バルチ
モア、２８４−４３５頁（１９８２））。両化合物はイン・ビボで生体内活性化
（bioactivated）されて各々コリンエステラーゼの毒性のオキソンインヒビター
を形成する。これにより、神経細胞死および関連神経障害に至る。両オキソンは
、すべてではないにせよ、その殆どが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子に存
在する血清酵素パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼによって加水分解され
る（マックネス（Ｍackness，Ｍ．Ｉ.）ら、Ｂiochem．Ｐharmacol.、３２：２
２９１−２２９６（１９８３））。
ヒトにおいて、この酵素は基質依存性の活性多型（substrate dependent acti
vity polymorphism）を示す（マリンクロット（Ｍallinckrodt，Ｍ.Ｇ.）および
ディープゲン（Ｄiepgen，Ｔ．Ｌ.）、Ｔoxicol．Ｅnviron．Ｃhem．１８：７９
−１９６（１９８８））。ヒト血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼは
、有機リン酸塩、芳香族カルボン酸エステルおよびカルバメートの加水分解を触
媒する。２つの対立遺伝子（allele）が存在しているようである。一方の対立遺
伝子産物は高いターンオーバー数（turnover number）でパラオキソンを加水分
解し、もう一方は低いターンオーバー数で加水分解する。フェニルアセテー
ト、ベータおよびナフチルアセテート（ガン（Gan，Ｋ.Ｎ.）ら、Ｄrug Ｍetab.
Ｄispos.、１９：１００−１０６（１９９１））およびクロルピリフォスオキソ
ンなどの他の基質は、同じかまたは殆ど同じ速度で、いずれかの対立遺伝子産物
により加水分解される。該酵素はまた、神経薬剤ソマンおよびサリンを加水分解
する（ガンら、Ｄrug Ｍetab．Ｄispos.、１９：１００−１０６（１９９１））
。神経毒性有機リン酸塩の加水分解は、パラオキソナーゼの有益で思いがけない
作用である。
本発明の一態様により、新規成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性で、診
断学的にまたは治療学的に有用であるその断片、類似体および誘導体を提供する
。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。
本発明の別の態様により、ｍＲＮＡｓ、ＤＮＡｓ、ｃＤＮＡｓ、ゲノムＤＮＡ
ｓを含む本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸分子ならびに類似体お
よび生物学的に活性で診断学的にまたは治療学的に有用であるその断片を提供す
る。
本発明のさらなる別の態様により、本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列を含む組換え原核および／または真核生物宿主細胞を、該タンパク質の発現お
よび引き続く回収を促進する条件下で培養することからなる、組換え技術により
このようなポリペプチドを製造するための方法を提供する。
本発明のさらなる別の態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、有機リン酸
塩毒性（殺虫剤中毒）の解毒剤としておよび神経細胞死を予防するのに利用する
ための方法を提供する。
本発明のさらなる別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提
供する。
本発明のさらなる別の態様により、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイ
ズする、十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブも提供する。
本発明のさらなる別の態様により、本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列における突然変異に関連する疾患または疾患の罹患し易さの検出に関する診断
アッセイを提供する。
本発明のさらに他の態様により、例えば、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクター
の製造などの科学的研究に関連するイン・ビトロでの目的のため、このようなポ
リペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用
するプロセスを提供する。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者には明
らかであろう。
以下の図面は本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含さ
れる本発明の範囲を制限しようとするものではない。
図１は、推定の成熟血清パラオキソナーゼポリペプチドのｃＤＮＡ配列および
推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。
本発明の一態様により、図１の推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有する成
熟ポリペプチド、または１９９４年５月１２日にＡＴＣＣ受託番号第７５７７３
号として寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。
本発明のポリヌクレオチドはヒト扁桃体から得られたｃＤＮＡライブラリー中
で発見された。該ポリヌクレオチドは構造的にヒト血清パラオキソナーゼ／アリ
ールエステラーゼファミリーに関連する。該ポリヌクレオチドは約３５６アミノ
酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。該タン
パク質はオリクトラガス・クニクラス（oryctolagus cuniculus）の血清パラオ
キソナーゼと高い程度のホモロジーを示し、２４９アミノ酸長にわたり６７％の
同一性および８３％の類似性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
および合成ＤＮＡを含む）の形態であってよい。該ＤＮＡは二本鎖または一本鎖
であってよく、また一本鎖であるならば、コーディング鎖または非コーディング
（アンチセンス）鎖であってよい。成熟ポリペプチドをコードする配列は図１に
示すコーディング配列（配列番号：１）または、寄託されたクローンのコーディ
ング配列に一致していてよいし、または遺伝コードの重複（redundancy）または
縮重の結果、図１のＤＮＡ（配列番号：１）または寄託されたｃＤＮＡと同じ成
熟ポリペプチドをコードする別のコーディング配列であってよい。
図１の成熟ポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたｃＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下のものを含ん
でいてよい：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコ
ーディング配列、および、リーダー配列または分泌配列またはプロタンパク質配
列などの別のコーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列（および
任意に別のコーディング配列）、および成熟ポリペプチドのコーディング配列の
イントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の５'および／または３'
非コーディング配列などの非コーディング配列。
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という語には、該ポ
リペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにまた、
別のコーディングおよび／または非コーデイング配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有するポリペプ
チドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断
片、類似体および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関す
る。ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺
伝子変異体または該ポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であってよい
。
従って、本発明は、図１に示すのと同じ成熟ポリペプチド（配列番号：２）ま
たは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの変異体
が含まれ、これらの変異体は、図１のポリペプチド（配列番号：２）または寄託
されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリヌクレオチドの断片、誘導
体、または類似体をコードする。そのようなヌクレオチド変異体には欠失変異体
、置換変異体および付加または挿入変異体が含まれる。
先に示したように、該ポリヌクレオチドは図１（配列番号：１）に示すコーデ
ィング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体または寄託されたクローンのコー
ディ
ング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有してよ
い。当該技術分野において公知のように、対立遺伝子変異体は１またはそれ以上
のヌクレオチドの置換、欠失または付加（実質的にはコードするポリペプチドの
機能を変えない）を有してよい別の形のポリヌクレオチド配列である。
本発明はまた、ポリヌクレオチド配列をも含む（ここで、該成熟ポリペプチド
に関するコーディング配列は同様のリーディンフレームにおいて、例えば宿主細
胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー
配列などの、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌク
レオチド配列に融合されてよい）。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタ
ンパク質であり、該リーダー配列が宿主細胞によって開裂されて該ポリペプチド
の成熟形態を形成してよい。該ポリヌクレオチドはまた、該成熟タンパク質およ
びさらに別の５'アミノ酸残基からなるプロタンパク質をコードしていてよい。
プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、該タンパク質の不活
性形態である。プロ配列が開裂されると活性な成熟タンパク質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、またはプロ配
列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両者
を有するタンパク質をコードしてよい。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合したコーディング配列を有してもよい。該マ
ーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精
製を提供するための、ｐＱＥ−９ベクターによって与えられるヘキサーヒスチジ
ンタグであってよく、または例えば、哺乳動物宿主（例えば，ＣＯＳ−７細胞）
を使用する場合には、マーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい
。該ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質より得られるエピトープ
に対応する（ウィルソン（Ｗilson，Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４
））。
「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖を生成するのに関与するＤＮＡのセグ
メントを意味する；該セグメントには、先行するおよび後続するコーディング領
域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメント（エク
ソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ｃＤＮＡの単離および該遺伝子に高い
配列類似性を有するまたは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡｓの単離の
ためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイゼーションプローブとして使
用されてよい。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し
、例えば５０またはそれより多くの塩基を含んでよい。該プローブはまた、完全
長転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンまたは調節およびプ
ロモーター領域、エクソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むクローン
を同定するのに使用されてよい。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチド
プローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を使用することにより遺伝子のコー
ディング領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的である配列
を有する標識したオリゴヌクレオチドを、プローブがライブラリーのどの成員に
ハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用する。
本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、また好ましくは少なくとも９０
％、およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、本明細書に
記載の上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドに関する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェント条件」
という語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同
一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドは、図１のｃＤＮＡ（配列番号：１）または寄託されたｃＤＮＡ（ｓ）
によりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的に
は保有するポリペプチドをコードする。
別の態様として、該ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし、上記のように同一性を有し、活性を保持するまたは保持していない
、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、およびより好ましくは少なくとも
５
０塩基を有してよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは配列番号：１のポ
リヌクレオチドのプローブとして、例えば、ポリヌクレオチドの回収のため、ま
たは診断プローブとしてまたはＰＣＲプライマーとして使用してよい。
従って、本発明は配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性およ
びより好ましくは９５％の同一性を有するポリヌクレオチドならびにその断片（
該断片は少なくとも３０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を有する）お
よびこのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
本明細書で使用する寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関する
ブダペスト条約の約定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に
要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌク
レオチドの配列、さらにまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸
配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾
する際は、いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販
売するには、実施許諾が要求され得て、またそのような実施許諾は、ここでは付
与されない。
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有する、または
寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する血清パラオキソナ
ーゼペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドの断片、類似体および誘
導体に関する。
図１のポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドに言及する場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」と
いう語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
有するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、プロタンパク質部分を切
断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができる
プロタンパク質が含まれる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。
図１のポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残
基）で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコ
ードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、
または（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、また
は（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（
例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合しているもの、ま
たは（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用さ
れる配列、またはプロタンパク質配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポ
リペプチドに融合しているものであり得る。そのような断片、誘導体および類似
体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される
のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。
「単離された」という語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在
するなら、天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されて
いないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレ
オチドはベクターの一部であってよく、および／またはそのようなポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、それでいて、そのような
ベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、なお単離さ
れている。
本発明のポリペプチドは配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド
）ならびに配列番号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましく
は少なくとも７０％の同一性）を有し、およびより好ましくは配列番号：２のポ
リペプチドに少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同
一
性）を有し、さらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドに少なくとも９
５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリ
ペプチドを含み、そのようなポリペプチドの部分（該部分）は少なくとも３０ア
ミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０のアミノ酸を一般に含む）をも含む
。
２つのポリペプチド間における「類似性」は当該技術分野において公知のよう
に、あるポリペプチドのアミノ酸配列および保存されたアミノ酸置換を第２のポ
リペプチドの配列と比較することにより決定される。
本発明のポリペプチドの断片または一部はペプチド合成による対応する完全長
ポリペプチドを生成するため使用されてよい；それゆえ、該断片は完全長ポリペ
プチドを生成する中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレオチドの断
片または一部は本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用されてよい
。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク
ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術
による製造にも関する。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本
発明のベクターで遺伝的に操作される（形質導入、または形質転換、またはトラ
ンスフェクションされる）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子
、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し
、形質転換体を選択し、または血清パラオキソナーゼ遺伝子を増幅するのに適す
るよう改変された通常の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等といっ
たような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であ
って、当業者に明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを組換え技術により製造するのに
使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。
そのようなベクターには、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成Ｄ
ＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキ
ュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせか
ら
得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病と
いったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかしながら、他のいずれのベクター
も、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することがで
きる。
適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般
には、ＤＮＡ配列を当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌクレア
ーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内である
と思われる。
発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモーター）に作動
可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例と
して、以下のものが挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（ Ｅ．coli）
、lac、またはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および原核も
しくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を調節することが知ら
れている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターも含む。該ベクターはまた、発現を増幅する
のに適当な配列も含み得る。
さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼ
またはネオマイシン耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリンま
たはアンピシリン耐性といったような、形質転換された宿主細胞の選択のための
表現型特性を与えるための１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含
むのが好ましい。
上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは調
節配列を含むベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その宿主
がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。
適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトマ イセス（Ｓtreptomyces）
、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella typhi murium）
といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ドロソフィラ（Ｄro sophila）
およびスポドプテラ（Ｓpodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫
細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノ
ウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。
とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含ん
でなる組換え構築物も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方向ま
たは逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったよう
なベクターを含む。この実施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの、調節配列をさらに含む。
適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されて
いる。以下のベクターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐ
ＱＥ−９（キアゲン（Ｑiagen））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ
ｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ
、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene
）；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(
ファルマシア（Ｐharmacia）)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、ｐ
ＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーン)pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳ
ＶＬ(ファルマシア)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも
、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することがで
きる。
プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝
子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およ
びＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには
、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後
期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−
Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ
ベルの範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。そのよ
うな宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真
核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによ
り行うことができる。(デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、
バッテイ（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂioology）（１９８６）)。
宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる
遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発
明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系も
また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・ク
ローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌab
oratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring
Ｈarbor）、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本
明細書の一部を構成する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エン
ハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、プロ
モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡ
のシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側
にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが含まれる。
通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞の形質転換を可
能にする選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子並びにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae）
ＴＲＰ１遺伝子、および下流の
構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモー
ターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ
、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘ
テロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳された
タンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリー
ダー配列と共に、適当な相(phase)で集合する。場合により、そのヘテロロガス
配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡
易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすること
ができる。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構
造ＤＮＡ配列を、機能的なプロモーターと作動可能なリーディング相にある適当
な翻訳開始および終結シグナルと共に挿入することにより構築される。そのよう
なベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿
主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカ
ーおよび複製開始点を含むであろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）
、サルモネラ・ティフィムリウム、
およびシュードモナス（Ｐseudomonas）属、ストレプロマイセス属、ならびにス
タフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、他
のものもまた選択可能である。
代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用な発現ベクタ
ーは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細
菌の複製開始点を含んでいてよい。そのような市販のベクターには、例えば、p
ＫＫ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhe
micals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バ
イオテク（Ｐromega Ｂiotec）、マデイソン（Ｍadison）、ウィスコンシン、
米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび
発現されるべき構造配列と組み合わせる。
適当な宿主株を形質転換して、その宿主株を適当な細胞密度までの増殖させた
後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)
により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により
破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処
理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれの従来法によっても破壊
でき、そのような方法は、当業者に周知である。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用
することができる。哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Ｇluzman）、Cell、
２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯ
Ｓ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例
えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺
乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、
またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド
ナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列
もまた含むであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およ
びポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることが
できる。
血清パラオキソナーゼポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、
精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク
質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマ
トグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物
であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ
とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチ
ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
本発明の血清パラオキソナーゼポリペプチドは、コリンエステラーゼの毒性オ
キソンインヒビターが血清パラオキソナーゼにより加水分解されるので、有機リ
ン酸塩中毒の解毒剤として使用してよい。
血清パラオキソナーゼポリペプチドは、このような毒性中毒による神経細胞死
を予防するのに使用されてよい。もし、有機リン酸塩中毒が処置されないままで
あるならば、神経細胞死という結果になるであろう。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色
体上の特定の位置に対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで
きる。血清パラオキソナーゼ遺伝子は、第７染色体上の膵嚢胞性線維症遺伝子の
近隣に位置する。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある
。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、染色体位
置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体への
マッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける重要な第一段階であ
る。
本発明のポリペプチドは、適当な製薬学的担体と組み合わせて使用することが
できる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および製薬学上
許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定
されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は
、投与方法に適合すべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１
つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ
のような容器には、製薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制
する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの
投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本
発明のポリペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができる。
該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または
皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。血清パラオキソ
ナーゼは、特定の適応症を治療および／または予防するのに有効な量で投与され
る。一般に、血清パラオキソナーゼは、１日当たり少なくとも約１０μg／kg(体
重)の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg(体重)を超えない量で投与さ
れるであろう。たいていの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投与量
は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。
該ポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる、そのようなポリ
ペプチドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って使用してよい。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex vivo）においてポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操
作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当該技
術分野で公知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法により操
作することができる。
同様に、例えば、当該技術分野で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビ
ボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当
該技術分野において知られているように、細胞をイン・ビボにおいて処理してポ
リペプチドをイン・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するためのプロデューサー細胞
を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを
投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明ら
かであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以
外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボに
おいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。
前記レトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、以下に
限られるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、
レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白
血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイ
ルス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。１つの態様において、
レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから得ら
れる。
該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。使用されてよい適切
なプロモーターには、以下に限られるものではないが、レトロウイルスＬＴＲ；
ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍiller）ら、Ｂiotechniques、Ｖol．
７、Ｎo．９、９８０−９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、以下に限るも
のではないが、ヒストン、ｐｏｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真
核生物細胞のプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれる）が含まれる。使
用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下に限るものではないが、アデノ
ウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パ
ルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、本明細書中の
教示から当業者には明らかであろう。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーターの調節下に
ある。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限られるものではないが
、アデノウイルス主要後期プロモーター（major late promoter）などのアデノ
ウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターな
どの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴ
プロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導可能なプロモーター；
熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモーター；ヒ
トグロブリンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどの
ウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上記の修飾
し
たレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成
長ホルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドを
コードする遺伝子を調節する本来のプロモーターであってよい。
レトロウイルスプラスミドベクターはプロデューサー細胞株を形成するためパ
ッケージング細胞株を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクションし
てよいパッケージング細胞の例には、以下に限るものではないが、ＰＥ５０１、
ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７
−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２および
ＤＡＮ細胞株が含まれ（ミラー、Ｈuman Ｇene Ｔherapy、Ｖol．１、５−１４
頁（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引用する）。該ベクター
は当該技術分野において公知の方法によりパッケージング細胞を形質導入する。
このような方法には、以下に限るものではないが、エレクトロポレーション、リ
ポソームの使用、ＣａＰＯ4沈降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイ
ルスプラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れられてよく、また
は脂質と結合され、ついで宿主に投与されてよい。
該プロデューサー細胞株は該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性
レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒
子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生物細胞を形質導入するため使
用してよい。形質導入した真核生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列
を発現するであろう。形質導入されてよい真核生物細胞には、以下に限られるも
のではないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽
細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。
本発明はまた、診断用として本発明の遺伝子を使用することにも関する。該遺
伝子の変異形態の検出により、血清パラオキソナーゼの過少発現による疾患の診
断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろう。
本発明の遺伝子における変異を有する個体は、多様な技術を用いてＤＮＡレベ
ルで検出できる。診断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血液、
尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細胞から得られる。ゲノムＤＮ
Ａを直接検出に使用してもよいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎat
ure、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素的に増幅してもよい。
同様の目的のため、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、血
清パラオキオソナーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは変異を同
定し分析するのに使用することができる。例えば、欠失および挿入は、通常の遺
伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変化によって検出することがで
きる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＲＮＡまたは別法として
放射性標識したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同
定することができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるかまた
は融点における差異によってミスマッチの二本鎖から区別することができる。
参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列の相違は、直接ＤＮＡシークエンシ
ング方法によって明らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡセグ
メントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用してよい。この
方法の感度はＰＣＲと組み合わされると非常に増強される。例えば、シークエン
シングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣＲによって生成した一
本鎖鋳型分子とともに使用される。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチド
による従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手法によって行われ
る。
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、変性剤を使用するかまたは使用しな
いゲルにおけるＤＮＡ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって行わ
れる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high resolution）ゲル電気泳動
によって可視化することができる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断
片が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速
される変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（
Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。
特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開
裂方法（例えばコットン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにされ
てよい。
従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ
保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例えば
、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの方
法により行われてよい。
一層従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまた
イン・サイチュ分析により検出することができる。
本発明はまた、通常のコントロール組織サンプルに比較したタンパク質の過剰
発現が、血清パラオキソナーゼの存在を検出することができるため、多様な組織
において本発明のポリペプチドの改変レベルを検出する診断アッセイにも関する
。宿主由来のサンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを検出するのに使
用するアッセイは当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合
アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが含ま
れる。ＥＬＩＳＡアッセイは最初に、血清パラオキソナーゼ抗原に特異的な抗体
、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。加えて、リポーター抗
体が該モノクローナル抗体に対して調製される。リポーター抗体には放射線、蛍
光またはこの例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素など検出可能な試薬
が付着される。ついでサンプルを宿主から除去し、該サンプル中のタンパク質を
結合する固相支持体（例えばポリスチレンディッシュ）上でインキュベートする
。ついで、該ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなど
の非特異的タンパク質でインキュベートすることによりカバーする。ついで、該
モノクローナル抗体を該ディッシュでインキュベートすると、その間に該モノク
ローナル抗体は、該ポリスチレンディッシュに付着した本発明のポリペプチドに
付着する。すべての結合していないモノクローナル抗体をバッファーで洗い落と
す。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を今度はディッシュ
に置くと、本発明のポリペプチドに結合したモノクローナル抗体に該リポーター
抗体が結合することになる。ついで、付着していないリポーター抗体を洗い落と
す。ついで、ペルオキシダーゼ基質を該ディッシュに添加し、所定の時間におけ
る発色
量は、標準カーブに比較して、患者のサンプルの所定量中に存在する本発明のポ
リペプチドの量の測定となる。
本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固相支持体に付着させ、標識した血
清パラオキソナーゼおよび宿主から得たサンプルを該固相支持体に通し、ついで
該固相支持体に付着した標識の検出量を該サンプルにおける本発明のポリペプチ
ドの量に相関させることができる、競合アッセイを使用してよい。
本発明はまた、例えば、血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ分子を含む
哺乳動物細胞を複数の薬剤およびパラチオンまたはクロルピリフォスと接触させ
、血清パラオキソナーゼによって毒性オキソンの加水分解を増強するそれらの薬
剤を検出し、それによりアゴニストとして特異的に作用する薬剤を同定すること
からなる、パラオキソナーゼとその基質との相互作用を増強する薬剤（アゴニス
ト）を同定するための薬剤のスクリーニング方法をも提供する。多様な検出方法
が使用されてよい。該毒性オキソンは、その加水分解が測定されるように検出で
きるマーカー基質（例えば、放射性標識またはビオチンなどの非同位体標識）と
結合させることによって「標識」されてよい。薬剤候補は、当該技術分野におい
てよく知られた放射性リガンド結合方法を使用し、トランスフェクションした細
胞において発現した血清パラオキソナーゼポリペプチドに高いアフィニティーで
結合する化学化合物を選択することによって同定する。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配列を個々のヒト染色体
上の特定の位置に対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることができ
る。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列
データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピ
ングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。
簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp)
を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子の３
'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１を越えるエ
クソンにまたがらないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑な
も
のとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイ
ブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰
属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい
ゲノムクローンのプール由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成すること
ができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピ
ング方法には、イン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、およ
び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーション
によるプレセレクションが含まれる。
ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド（spread）への蛍光イン・サイチュ
ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与
えることができる。この技術は、少なくとも５０または６０塩基を有するｃＤＮ
Ａで利用することができる。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒュー
マン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベー
シック・テクニクス（a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス
（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。
ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的
位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え
ば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・
マン(Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバー
シティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversit
y Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を介してオンラインで利用できる)に見い出され
る。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を連
鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。
次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列
の相違を決定する必要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全てにお
いて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異
は疾患の原因となるものであるらしい。
現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの解析から、疾患と関連する
染色体領域に正確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺
伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析およ
び２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。
ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ
、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を
製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、
さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含ま
れる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そのような抗体および断片の製造に
使用することができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ
ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ
トでない動物に投与することにより得ることができる。ついで、そのようにして
得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ
リペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結
合する抗体を製造するのに使用することができる。ついで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することがで
きる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗
体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法(コー
ラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２
５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(
コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、および
ヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール
（Cole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサ
ー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃａncer Ｔherapy）、アラン・
アール．リス、インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss，Ｉnc.）、７７−９６頁において)が含
まれる。
単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号)
は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合
し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明の免疫原性ポリペプチド産生
物に対するヒト化抗体を発現するのに使用してよい。
本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかしながら、本発明は、
そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、
特にことわらない限り、重量単位である。
以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および
／または用語を記載する。
「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および
／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、
限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入
手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラ
スミドは、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触
媒開裂することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており
、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう
に使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のための
ＤＮＡ断片を単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μg
を２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基
質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション
時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、
その反応物をポリアクリルアミドまたはアガロースゲルで直接電気泳動して、所
望の断片
を単離する。
開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic Ａcids
Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そ
のような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さないことから、キナーゼの
存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしには、別のオリゴヌクレオチド
にライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されてい
ない断片にライゲーションするであろう。
「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を
形成する過程をいう(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４６頁)。特に
ことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ
等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン
・デル・エブ（Ｖan der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９
７３）の方法に記載されているようにして行った。
実施例１
血清パラオキソナーゼの細菌発現および精製
最初に、血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５７７
３号を、５'および処理した血清パラオキソナーゼタンパク質の配列(シグナルペ
プチド配列なし)に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよび血清パ
ラオキソナーゼ遺伝子の３'ベクター配列を利用して増幅する。血清パラオキソ
ナーゼに対応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に加えた。５'
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素部位、続いて、２１ヌクレオチドの、処理
したタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する血清パラオキソナーゼコ
ーディング配列を含む。３'配列
は、Ｈind III制限酵素部位に対する相補的配列を含み、および血清パラオキソ
ナーゼの２１ヌクレオチドが続く。これら制限酵素部位は、細菌発現ベクターp
ＱＥ−９(キアゲン、インク．９２５９イートン・アベニュー（Ｅton Ａvenue）
、チャッツワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア、９１３１１)上の制限酵素
部位に対応する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細菌の複製開始点(ori)
、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部
位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグ（tag）および制限酵素部位をコードする。次いで、p
ＱＥ−９をＢam ＨＩおよびＨind IIIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−９
にライゲートして、ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＢＳとインフレー
ムで挿入した。ついで、そのライゲーション混合物を使用して、大腸菌株 ＳＵ
ＲＥ（ストラタジーン・クローニング・システムズ、１１０９９ノース・トレイ
・パインズ・ロード（Ｎorth Ｔorrey Ｐines Road）、ラ・ジョラ（Ｌa Ｊolla
）、カリフォルニア９２０３７から入手可能）をサンブルックら、モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボ
ラトリー・プレス、（１９８９）に記載の手順に従って形質転換した。形質転換
体を、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カ
ナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析に
より確認した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp（１００ug／ml）とＫan（
２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ
）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０の割
合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００(０.Ｄ.600)まで増殖し
た。ついで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を、最
終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化す
るこ
とにより誘発し、Ｐ／Ｏが遺伝子発現の増加を導くことを明らかにする。細胞を
さらに３〜４時間増殖させた。ついで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペ
レットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清
澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を
可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、
可溶化した血清パラオキソナーゼを精製した。ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ
．Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４）。６モルのグアニジ
ンＨＣl(pＨ ５.０)中、そのカラムから血清パラオキソナーゼを溶出し、また再
生の目的には、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０
ミリモルのグルタチオン(還元型)および２ミリモルのグルタチオン(酸化型)に調
節した。この溶液で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモ
ルのリン酸ナトリウムで透析した。
実施例２
ＣＨＯ細胞における組換え血清パラオキソナーゼの発現
プラスミドの発現、血清パラオキソナーゼＨＡは、１）ＳＶ４０複製起点、２
）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ
４０イントロンおよびポリアデニレーション部位が続くＣＭＶプロモーター、を
含むｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロゲン(Ｉnvitrogen））より得る。血清パ
ラオキソナーゼ前駆体全体およびその３'端にインフレームにて融合したＨＡタ
グをコードするＤＮＡ断片を、該ベクターのポリリンカー領域にクローニングし
、それゆえ、該組換えタンパク質の発現はＣＭＶプロモーターのもとに調節され
る。以前に記載されているように（ウィルソン（Ｉ．Ｗilson）、ナイマン（Ｈ
．Ｎiman）、ハイテン（Ｒ．Ｈeighten）、チエレンソン（Ａ Ｃherenson）、
コノリー（Ｍ．Ｃonnolly）およびラーナー（Ｒ．Ｌerner）、１９８４、Ｃell
３７、７６７）、ＨＡタグは、インフルエンザ凝血素タンパク質由来のエピトー
プに対応する。ＨＡタグの本発明者らの標的タンパク質への融合は、ＨＡエピト
ープを認識する抗体を用いて組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
該プラスミド構築方法を以下に記す：
ＡＴＣＣ受託番号第７５７７３号の血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ
配列を、２つのプライマーを使用してＰＣＲにより構築する：５'プライマー
は開始コドンから開始する血清パラオキソナーゼコーディング配列の２１ヌクレ
オチドが続くＢam ＨＩ制限部位を含む；３'配列
はＸba Ｉ部位に相補的な配列および翻訳終止コドンおよび血清パラオキソナー
ゼコーディング配列の最後の１８ヌクレオチド（終止コドンは含まない）を含む
。従って、該ＰＣＲ産物はＢam ＨＩ部位、血清パラオキソナーゼコーディング
配列、翻訳終止コドンおよびＸba Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片および
ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢam ＨＩおよびＸba Ｉ制限酵素で消化しライ
ゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（ストラタジーン・
クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems）、１１０９９ノ
ース・トレイ・パインロード、ラ・ジョラ、カリフォルニア９２０３７）に形質
転換し、形質転換した培養をアンピシリン培地プレート上に置きついで耐性コロ
ニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、正しい断片の存在
を制限分析により調べた。組換え血清パラオキソナーゼの発現のため、ＣＨＯ細
胞をＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ）法により発現ベクタ
ーでトランスフェクションした（サンブルック、フリッチュ（Ｅ．Ｆritsch）、
マニアチス、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９））。血清パラオキソ
ナーゼＨＡタンパク質の発現を放射性標識および免疫沈降法（ハーロウ（Ｅ．Ｈ
arlow）、レーン（Ｄ．Ｌane）、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュ
アル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、（１９８８）
）により検出した。細胞をトランスフェクションした２日後に８時間35Ｓ−シス
テ
インで標識した。ついで、培地を回収し、細胞を洗剤（ＲＩＰＡバッファー（１
５０ｍＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７.５）で溶菌した。（ウィルソンら、上記
、３７：７６７（１９８４））。細胞のリゼイトおよび培地はともにＨＡ特異的
モノクローナル抗体で沈降した。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル上で分析した。
実施例３
ヒト組織における血清パラオキソナーゼの発現パターン
ヒト組織における血清パラオキソナーゼの発現のレベルを調べるためノーザン
ブロット分析を行った。総細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌTMＢシステム（バ
イオテックス・ラボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratories，Ｉnc.）６
０２３サウス・ループ・イースト（Ｓouth Ｌoop Ｅast）、ヒューストン、テキ
サス７７０３３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離した総ＲＮＡの約１０
μgを１％ アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターにブロットした（サ
ンブルック、フリッチュおよびマニアチス、モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、（１９
８９））。該標識反応は、５０ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライ
ム−イットキットに従って行う。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで
精製する。（５プライム−３プライム、インク、５６０３ アラパホ・ロード、
ブルダー、コロラド８０３０３）。ついで、フィルターを放射性標識した血清パ
ラオキソナーゼ遺伝子の全長と０.５Ｍ ＮａＰＯ4、ｐＨ７.４および７％ ＳＤ
Ｓ中で１,０００,０００ｃｐｍ／ｍｌで６５℃で一晩ハイブリダイズさせる。室
温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで２回洗浄し、
ついでフィルターを増感紙で−７０℃で一晩露光する。
実施例４
遺伝子治療を介する発現
線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた組織を組織培養培地中
に置き、ついで小片に分離する。その組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表
面に置く（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコを上下ひっくり
返し、固く閉め、室温にて一晩放置する。室温で２４時間後、該フラスコを逆さ
にし、ついで組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、１０％ＦＢ
Ｓ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新しい培地（例えば、ハムＦ１
２培地（Ｈam's Ｆ１２ media）を添加する。ついでこれを３７℃で約１週間イ
ンキュベートする。このとき、新しい培地を添加し引き続き数日毎に変える。さ
らに２週間の後、培養に線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理
しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。
モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲによりフランキングされたｐＭＶ−７（
キルシュメイエル（Ｋirschmeier）ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）
）をＥco ＲＩおよびＨind IIIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラスビーズを使用して精
製する。
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡをそれぞれ５'端および３'端配列
に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。５'端プライマーはＥco ＲＩ
部位を含み３'プライマーはさらにＨind III部位を含む。モロニーマウス肉腫ウ
イルスの線形骨格および増幅したＥco ＲＩ−Ｈind III断片の等量をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼの存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２つの断片のライゲー
ションに適した条件下で維持する。ライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１を形
質転換するのに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に挿入された遺伝子
を有することを確認するためカナマイシン含有アガー上に播種する。
アンホトロピックｐＡ３１７またはＧｐ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベ
ッコ改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍedium）（ＤＭＥＭ
）中で全面密度になるまで組織培養にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベ
クターをついで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターで形質導入する
。今度はパッケージング細胞は、該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生す
る（パッケージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。
新しい培地を形質導入したプロデューサー細胞に添加し、引き続き培地を１０
ｃｍプレート全面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子を含
む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで濾過して分離したプロデューサー
細胞を除去し、ついでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を
線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデューサー細胞からの培地とす
ばやく取り替える。この培地を除去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価
が高い場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一切必要ないであろ
う。力価が非常に低い場合は、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択可能なマーカーを
有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。
操作された線維芽細胞を、単独またはサイトデックス３ミクロキャリアビーズ
（cytodex 3 microcarrier beads）上全面に増殖した後に、宿主に注入する。該
線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、追
記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができる。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(72)発明者 ヘ，ウェイ・ウ
アメリカ合衆国21045メリーランド州 コ
ロンビア、フリー・ストーン・コート6225
番
(72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム
アメリカ合衆国20832メリーランド州 オ
ルネイ、ヘリテッジ・ヒルズ・ドライブ
18528番