CN108196064A - 一种牛pon1蛋白的双抗夹心elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。ELISA检测方法包括以下步骤：包被、封闭、加样、添加捕获抗体、显色和终止。该检测方法采用抗体技术制备牛PON1蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体，以制备的牛PON1多克隆抗体为包被抗体，制备的牛PON1单克隆抗体为捕获抗体，从而建立牛PON1的双抗夹心ELISA检测方法，其检测结果准确可靠，可为诊断牛脂肪肝和酮病提供依据。
Description
技术领域
本发明属于ELISA检测方法技术领域，具体涉及一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法。
背景技术
对氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)是动物循环脂蛋白中高密度脂肪酸和低密度脂肪酸的抗氧化蛋白，防止脂肪酸进入细胞被氧化或脂化，防止脂肪酸被氧化后沉积于血管壁而形成血管阻塞。该酶主要由脂肪细胞、肝细胞和肾脏组织合成，然后被释放入血循环，结合在毛细血管内皮细胞表面的高密度脂肪酸上，或储存于脂肪组织中。PON1在脂蛋白的抗氧化过程和能量代谢方面发挥着重要作用，PON1缺乏或活性下降会引起脂代谢障碍。
脂肪肝是反刍动物围产期的主要营养代谢病，在我国一直处于高发状态。迄今为止，牛脂肪肝诊断的金标准依然是肝脏活体穿刺，存在多个弊端，不宜用于快速检测。因此，建立牛脂肪肝的一种快速、准确、实用的监测和诊断方法已成为现代集约化牛场急需解决的问题。酮病也是牛围产期常见的危害较为严重的营养代谢病，其临床主要表现为酮血症、酮尿症和酮乳症。现阶段对于酮病的检查有酮粉，血酮仪等方法，酮粉不能精确检测，存在弊端。血酮仪检测成本高昂，不宜操作。另外，由于牛脂肪肝和酮病都与机体能量代谢障碍有关，二者常相伴发生，牛脂肪肝不仅有酮病的症状，而且症状重，危害更大，故常将二者合称为“酮病-脂肪肝综合征”。因此，需要建立一种既快速，准确，性价比高，又能同时检测脂肪肝和酮病的检测方法。牛PON1活性与肝脂沉积程度成负相关，当肝脏损伤时，肝脏合成PON1减少，血中PON1活性会下降。牛血中PON1含量或活性的降低可作为牛酮病及脂肪肝的诊断指标。鉴于国内目前尚无牛专用的PON1的双抗夹心ELISA检测方法。因此，提供一种可同时诊断牛脂肪肝和酮病的牛PON1的检测方法是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，该检测方法采用抗体技术制备牛PON1蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体，以制备的牛PON1多克隆抗体为包被抗体，制备的牛PON1单克隆抗体为捕获抗体，从而建立牛PON1的双抗夹心ELISA检测方法。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。
进一步地，包被缓冲液为0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸缓冲液；显色液为TMB显色液；终止液为3mol/L的H2SO4溶液。
进一步地，洗液由吐温-20与浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液按体积比为1:2000混合配制而成。
进一步地，封闭液是用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度为5％，制得。
进一步地，牛PON1单克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫鼠，得到达到要求效价的血清，并将其与杂交瘤细胞进行融合后，经过四次克隆筛选出的阳性细胞株，将细胞株注入鼠腹腔，经大量培养后收集，纯化，制得。
进一步地，牛PON1多克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫兔，得到达到要求效价的多抗血清，然后进行纯化，制得。
进一步地，牛PON1蛋白通过以下方法制备得到：提取牛DNA，利用双酶切法对DNA进行剪切，获得目的基因，用T4连接酶将目的基因与质粒连接，同时制备感受态细胞，然后将感受态细胞进行转化，将转化后的感受态细胞进行扩大培养，在扩大培养过程中加入IPTG进行诱导表达，最后收集细菌，进行纯化，制得。
一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，首先要制备上述的试剂盒，然后再进行如下操作：
(1)包被：用包被缓冲液将牛PON1多克隆抗体稀释后加入酶标板孔内，每孔加100μl进行包被，包被完成后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(2)封闭：向步骤(1)拍干的酶标板孔内加入100μl封闭液进行封闭，封闭完成后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(3)加样：将牛血清样品按照每孔100μl的量加入步骤(2)拍干后的酶标板孔中，置于37℃保温1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(4)添加捕获抗体：将牛PON1单抗用1×PBS溶液稀释，然后加入步骤(3)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(5)添加酶标抗体：用1×PBS溶液稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，然后加入步骤(4)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(6)显色：向步骤(5)拍干后的酶标板中加入显色液，每孔100μl，置于37℃避光显色10min；
(7)终止：向酶标板孔中加入50μl终止液终止显色反应。
进一步地，步骤(1)中用包被缓冲液将牛PON1多克隆抗体稀释800倍，包被条件为4℃过夜；步骤(2)中封闭条件为4℃过夜。
进一步地，步骤(4)中将牛PON1单抗用1×PBS溶液稀释为3.2μg/ml，步骤(5)中用1×PBS溶液将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG稀释40000倍。
本发明提供的一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，具有以下效果：
该检测方法采用抗体技术制备牛PON1蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体，以制备的牛PON1多克隆抗体为包被抗体，制备的牛PON1单克隆抗体为捕获抗体，从而建立牛PON1的双抗夹心ELISA检测方法，其检测结果准确可靠，可为诊断牛脂肪肝和酮病提供依据。
附图说明
图1为牛PON1基因质粒双酶切后电泳图。
图2为酶切回收后的电泳图。
图3为牛PON1蛋白表达电泳图(1：诱导的菌；2，阴性对照；M：蛋白Marker)。
图4为牛PON1蛋白表达位置电泳图(4：包涵体；3：上清；M：蛋白Marker)。
图5为牛PON1蛋白western-blot验证图。
图6为AKTA纯化单抗图。
图7为单抗SDS-PAGE电泳验证图。
图8为单抗western-blot验证图，从左到右依次为天然蛋白、天然蛋白、重组蛋白、重组蛋白。
图9为AKTA纯化多抗图。
图10为ELISA方法标准曲线。
具体实施方式
实施例1制备牛PON1蛋白
(1)合成目的基因即牛PON1基因：
设计酶切位点，上游为Nco I CATGCCATGG，下游为Xho I CTCGAGCGG，根据酶切位点进行基因序列优化，具体为根据GENBANK中查询的牛PON1的基因序列(XP616349)并利用大肠杆菌偏爱密码子host organism:E.coil strain K12进行优化，最终得到优化后的基因序列，其序列如SEQ.ID.NO：1所示，最后合成目的基因。
利用双酶切法对目的基因进行剪切，双酶切结果见图1，然后使用AXYGEN胶回收试剂盒进行胶回收，其酶切回收后的电泳图见图2。
(2)用T4连接酶将目的基因与质粒连接，同时制备感受态细胞，然后将感受态细胞进行转化。
(3)将转化后的感受态细胞进行扩大培养，在扩大培养过程中加入IPTG进行诱导表达，最后收集细菌，对表达的蛋白进行SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，检验菌株是否正确表达，其检测结果见图3，由图3可知，成功获得目的蛋白，其大小为37KD。对表达的蛋白进行超声离心，分别检测上清液和包涵体，检测蛋白表达位置，其结果见图4。用重力柱纯化蛋白，得到的蛋白用western-blot验证，其结果见图5。
实施例2单抗和多抗的制备
1、牛PON1单克隆抗体的制备
采用纯化的牛PON1蛋白免疫鼠，当血清稀释浓度为1：16000时，P/N大于2.0，即可得到达到要求效价的血清，并将其与杂交瘤细胞进行融合后，经过四次克隆筛选出的阳性细胞株，将细胞株注入鼠腹腔，经大量培养后收集，用AKTA仪器进行纯化，其结果见图6；用SDS--PAGE凝胶蛋白电泳对纯化后的单抗进行验证，其结果见图7；对单抗与天然蛋白和重组蛋白进行western-blot验证，其结果见图8。
2、牛PON1多克隆抗体的制备
采用牛PON1蛋白免疫兔，得到达到要求效价的多抗血清，将多抗血清用AKTA仪器进行纯化，其结果见图9；
实施例3牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法的建立
1、包被温度和时间的确定
分别在37℃包被2h和4℃过夜进行包被实验，选择P/N值大的为最优包被条件，其最优包被条件为4℃过夜。
2、封闭条件的确定
封闭液：用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度分别为5％、1％，选择P/N值大的为最优封闭液，其最优封闭液为用1×PBS溶液稀释得到的5％脱脂奶粉。
封闭温度和时间：分别在37℃封闭2h和4℃过夜进行封闭实验，选择P/N值大的为最优封闭温度和时间，其最优封闭温度和时间为4℃过夜。
3、单抗和多抗最佳浓度的确定
用1×PBS溶液稀释纯化后的单抗，使其浓度为0.2、0.6、0.8、1.6、3.2、6.4μg/ml。
用1×PBS溶液稀释纯化后的多抗，分别稀释100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍和12800倍。
利用棋盘法确定单抗和多抗最佳浓度，当OD值接近1，P/N值最大时为最佳浓度，其最佳单抗浓度为3.2μg/ml，最佳多抗浓度为稀释800倍。
根据上述优化过程可得：
牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。
其中，包被缓冲液为0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸缓冲液。
洗液：将吐温-20与浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液按体积比为1:2000混合配制而成。
封闭液：用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度为5％，制得封闭液。
显色液为TMB显色液；终止液为3mol/L的H2SO4溶液。
牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
(1)包被：用包被缓冲液将牛PON1多克隆抗体稀释800倍后加入酶标板孔内，每孔加100μl，置于4℃过夜，取出后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(2)封闭：向步骤(1)拍干的酶标板孔内加入100μl封闭液，置于4℃过夜，取出后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(3)加样：将经过离心的牛血清样品按照每孔100μl的量加入步骤(2)拍干后的酶标板孔中，置于37℃保温1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(4)添加捕获抗体：将牛PON1单抗用1×PBS溶液稀释为3.2μg/ml，然后加入步骤(3)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(5)添加酶标抗体：用1×PBS溶液稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG溶液，按照体积比为1:40000稀释，然后加入步骤(4)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(6)显色：向步骤(5)拍干后的酶标板中加入TMB显色液，每孔100μl，置于37℃避光显色10min；
(7)终止：向酶标板孔中加入50μl 3mol/L的H2SO4终止液终止显色反应，然后在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。
实施例4奶牛血清中PON1含量的测定
1、绘制ELISA标准曲线
利用优化好的条件绘制ELISA标准曲线：用1×PBS溶液将纯化的PON1蛋白稀释不同浓度，即25000，12500，6250，3125，1562.5，780，390，190，90，48，24，12ng/ml，然后绘制标准曲线，其绘制的标准曲线见图10，由结果可知，最终ELISA检测试剂盒最低检测限为90ng/ml。
2、用上述建立的ELISA检测方法分别检测患酮病奶牛血清和未患酮病奶牛血清中PON1的含量，同时用血酮仪分别检测患酮病奶牛和未患酮病奶的情况。其结果表明，用本发明建立的ELISA检测方法检测的患酮病奶牛血清中PON1的含量明显低于未患酮病奶牛血清中PON1的含量，且与血酮仪检测结果相同，说明本发明提供的检测方法灵敏，结果准确可靠。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1050
<212> DNA
<213> Bovine
<400> 1
catgccatgg actaccgttc ttcttacctg gctcgtatga acgcttctcg tgaagttaaa 60
tctgttgaac tgccgaactg caaactgatc aaaggtatcg aaaccggtgc tgaagacctg 120
gaaatcctgc cgaacggtct ggctttcatc tcttctggtc tgcgttaccc gggtgttaaa 180
tctttcgaac cggacaaacc gggtaaaatc ctgctgatgg acctgaacaa agaagacccg 240
accgttctgg aactgaaaat gaccggttct aacttcgacg cttcttcttt caacccgcac 300
ggtatctcta ccttcaccga cgaagacaac accgtttacc tgctggttgt ttctcacccg 360
gacgttaaat ctaccgttga actgttcaaa ttccaggaag aagaaaaatc tctgctgcac 420
ctgaaaacca tcaaacacga actgctgccg aacctgaacg acctggttgc tgttggtcgt 480
gaacacttct acgctaccaa cgaccactac ttcgttgacc agtacatgcg ttcttgggaa 540
ctgtacctgg gtctggcttg gtctaacgtt gtttactact ctccggacga cgttcgtgtt 600
gttgcttctg gtttcgactt cgctaacggt atctctatgt ctccggaccg taaatacgtt 660
tacatcgctg aactgctggc tcacaaaatc cacgtttacg aaaaacacgc taactggacc 720
ctgaccccgc tgaaatctct ggactgcgac accctggttg acaacatctc tgttgacccg 780
gttaccggtg acctgtgggt tggttgccac ccgaacggta tgaaaatctt ctcttacgac 840
ccggaaaacc cgccgggttc tgaagttctg cagatccaga acatcctggc tgaagaaccg 900
aaagttaccg ttgtttacgc tgaagacggt aaagttctgc acggttctac cgttgcttct 960
gtttacaaag gtaaaatgct ggttggtacc gttttccaga aagctctgta ctgcgaattc 1020
catcatcacc atcaccattg actcgagcgg 1050
Claims (10)
1.一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：酶标板、包被缓冲液、洗液、封闭液、牛PON1单克隆抗体、牛PON1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、显色液和终止液。
2.根据权利要求1所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，包被缓冲液为0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸缓冲液；显色液为TMB显色液；终止液为3mol/L的H2SO4溶液。
3.根据权利要求1所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，洗液由吐温-20与浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液按体积比为1:2000混合配制而成。
4.根据权利要求1所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，封闭液是用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度为5％，制得。
5.根据权利要求1所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，牛PON1单克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫鼠，得到达到要求效价的血清，并将其与杂交瘤细胞进行融合后，经过四次克隆筛选出的阳性细胞株，将细胞株注入鼠腹腔，经大量培养后收集，纯化，制得。
6.根据权利要求1所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，牛PON1多克隆抗体通过以下方法制备得到：采用纯化的牛PON1蛋白免疫兔，得到达到要求效价的多抗血清，然后进行纯化，制得。
7.根据权利要求5或6所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，牛PON1蛋白通过以下方法制备得到：提取牛DNA，利用双酶切法对DNA进行剪切，获得目的基因，用T4连接酶将目的基因与质粒连接，同时制备感受态细胞，然后将感受态细胞进行转化，将转化后的感受态细胞进行扩大培养，在扩大培养过程中加入IPTG进行诱导表达，最后收集细菌，进行纯化，制得。
8.一种牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行如下操作：
(1)包被：用包被缓冲液将牛PON1多克隆抗体稀释后加入酶标板孔内，每孔加100μl进行包被，包被完成后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(2)封闭：向步骤(1)拍干的酶标板孔内加入100μl封闭液进行封闭，封闭完成后用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(3)加样：将牛血清样品按照每孔100μl的量加入步骤(2)拍干后的酶标板孔中，置于37℃保温1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复冲洗3-5次，拍干酶标板；
(4)添加捕获抗体：将牛PON1单抗用1×PBS溶液稀释，然后加入步骤(3)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(5)添加酶标抗体：用1×PBS溶液稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，然后加入步骤(4)拍干后的酶标板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液冲洗酶标板2-3min，重复3-5次，拍干酶标板；
(6)显色：向步骤(5)拍干后的酶标板中加入显色液，每孔100μl，置于37℃避光显色10min；
(7)终止：向酶标板孔中加入50μl终止液终止显色反应。
9.根据权利要求8所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于，步骤(1)中用包被缓冲液将牛PON1多克隆抗体稀释800倍，包被条件为4℃过夜；步骤(2)中封闭条件为4℃过夜。
10.根据权利要求8所述的牛PON1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于，步骤(4)中将牛PON1单抗用1×PBS溶液稀释为3.2μg/ml，步骤(5)中用1×PBS溶液将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG稀释40000倍。
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