JP2003088364A - 血清パラオキソナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト血清パラオキソナーゼ酵素およびこのよ
うな血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）を開示する。また、組換え技術を使用してこのよう
なポリペプチドを生成する手順も開示する。 【解決手段】 このようなポリペプチドの使用には有機
リン酸塩中毒の解毒剤としての使用および神経細胞死の
回避のための使用を含む。本発明のポリペプチドをコー
ドする核酸配列における突然変異を同定するための診断
アッセイ、および本発明のポリペプチドの変化レベルの
検出するための診断アッセイも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より詳
しくは、本発明のポリペプチドは血清パラオキソナーゼ
である。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用
を抑制することにも関する。 【０００２】 【従来の技術】パラチオン（ジエチル−パラ−ニトロフ
ェニルホスホチオエート）およびクロルピリフォス（ch
lorpyrifos）（Ｏ,Ｏ−ジエチル−Ｏ−３,５,６−トリ
クロロ−２−ピリジノール）は一般に使用される有機リ
ン系殺虫剤であり、各年、農業従事者およびその他の者
の多数にわたる中毒に関する（ヘイズ（Ｈayes，Ｗ.
Ｊ.）、ペスタサイズ・スタディード・イン・マン（Ｐe
sticides Ｓtudied in Ｍan）、ウィルキンス・アンド
・ウィルキンス（Ｗilkins and Ｗilkins）、バルチモ
ア、２８４−４３５頁（１９８２））。両化合物はイン
・ビボで生体内活性化（bioactivated）されて各々コリ
ンエステラーゼの毒性のオキソンインヒビターを形成す
る。これにより、神経細胞死および関連神経障害に至
る。両オキソンは、すべてではないにせよ、その殆どが
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子に存在する血清酵
素パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼによって加
水分解される（マックネス（Ｍackness，Ｍ.Ｉ.）ら、
Ｂiochem．Ｐharmacol.、３２：２２９１−２２９６
（１９８３））。 【０００３】ヒトにおいて、この酵素は基質依存性の活
性多型（substrate dependent activity polymorphis
m）を示す（マリンクロット（Ｍallinckrodt，Ｍ.Ｇ.）
およびディープゲン（Ｄiepgen，Ｔ．Ｌ.）、Ｔoxico
l．Ｅnviron．Ｃhem．１８：７９−１９６（１９８
８））。ヒト血清パラオキソナーゼ／アリールエステラ
ーゼは、有機リン酸塩、芳香族カルボン酸エステルおよ
びカルバメートの加水分解を触媒する。２つの対立遺伝
子（allele）が存在しているようである。一方の対立遺
伝子産物は高いターンオーバー数（turnover number）
でパラオキソンを加水分解し、もう一方は低いターンオ
ーバー数で加水分解する。フェニルアセテート、ベータ
およびナフチルアセテート（ガン（Ｇan，Ｋ.Ｎ.）ら、
Ｄrug Ｍetab．Ｄispos.、１９：１００−１０６（１９
９１））およびクロルピリフォスオキソンなどの他の基
質は、同じかまたは殆ど同じ速度で、いずれかの対立遺
伝子産物により加水分解される。該酵素はまた、神経薬
剤ソマンおよびサリンを加水分解する（ガンら、Ｄrug
Ｍetab．Ｄispos.、１９：１００−１０６（１９９
１））。神経毒性有機リン酸塩の加水分解は、パラオキ
ソナーゼの有益で思いがけない作用である。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明の一態様により、
新規成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性で、診断
学的にまたは治療学的に有用であるその断片、類似体お
よび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドはヒト起
源のものである。本発明の別の態様により、ｍＲＮＡ、
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む本発明のポリペ
プチドをコードする単離した核酸分子ならびに類似体お
よび生物学的に活性で診断学的にまたは治療学的に有用
であるその断片を提供する。 【０００５】本発明のさらなる別の態様により、本発明
のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核
および／または真核生物宿主細胞を、該タンパク質の発
現および引き続く回収を促進する条件下で培養すること
からなる、組換え技術によりこのようなポリペプチドを
製造するための方法を提供する。本発明のさらなる別の
態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療目
的、例えば、有機リン酸塩毒性（殺虫剤中毒）の解毒剤
としておよび神経細胞死を予防するのに利用するための
方法を提供する。本発明のさらなる別の態様により、そ
のようなポリペプチドに対する抗体を提供する。 【０００６】本発明のさらなる別の態様により、本発明
の核酸配列に特異的にハイブリダイズする、十分な長さ
の核酸分子を含む核酸プローブも提供する。本発明のさ
らなる別の態様により、本発明のポリペプチドをコード
する核酸配列における突然変異に関連する疾患または疾
患の罹患し易さの検出に関する診断アッセイを提供す
る。本発明のさらに他の態様により、例えば、ＤＮＡの
合成およびＤＮＡベクターの製造などの科学的研究に関
連するイン・ビトロでの目的のため、このようなポリペ
プチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを利用するプロセスを提供する。本発明の
これらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から
当業者には明らかであろう。 【０００７】本発明の一態様により、図１〜２の推定ア
ミノ酸配列（配列番号：２）を有する成熟ポリペプチ
ド、または１９９４年５月１２日にＡＴＣＣ受託番号第
７５７７３号として寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離さ
れた核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のポ
リヌクレオチドはヒト扁桃体から得られたｃＤＮＡライ
ブラリー中で発見された。該ポリヌクレオチドは構造的
にヒト血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼフ
ァミリーに関連する。該ポリヌクレオチドは約３５６ア
ミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを含む。該タンパク質はオリクトラガス・
クニクラス（oryctolagus cuniculus）の血清パラオキ
ソナーゼと高い程度のホモロジーを示し、２４９アミノ
酸長にわたり６７％の同一性および８３％の類似性を有
する。 【０００８】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまた
はＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを
含む）の形態であってよい。該ＤＮＡは二本鎖または一
本鎖であってよく、また一本鎖であるならば、コーディ
ング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であっ
てよい。成熟ポリペプチドをコードする配列は図１〜２
に示すコーディング配列（配列番号：１）または、寄託
されたクローンのコーディング配列に一致していてよい
し、または遺伝コードの重複（redundancy）または縮重
の結果、図１〜２のＤＮＡ（配列番号：１）または寄託
されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする別
のコーディング配列であってよい。 【０００９】図１〜２の成熟ポリペプチド（配列番号：
２）または寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下のも
のを含んでいてよい：成熟ポリペプチドのコーディング
配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、およ
び、リーダー配列または分泌配列またはプロタンパク質
配列などの別のコーディング配列；成熟ポリペプチドの
コーディング配列（および任意に別のコーディング配
列）、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイ
ントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の
５'および／または３'非コーディング配列などの非コー
ディング配列。従って、「ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド」という語には、該ポリペプチドのコー
ディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらに
また、別のコーディングおよび／または非コーデイング
配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 【００１０】本発明はさらに、図１〜２の推定アミノ酸
配列（配列番号：２）を有するポリペプチドまたは寄託
されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドの断片、類似体および誘導体をコードする、上記の
ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチド
の変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立
遺伝子変異体または該ポリヌクレオチドの天然には存在
しない変異体であってよい。従って、本発明は、図１〜
２に示すのと同じ成熟ポリペプチド（配列番号：２）ま
たは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされ
る同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの変異体が含
まれ、これらの変異体は、図１〜２のポリペプチド（配
列番号：２）または寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
ってコードされるポリヌクレオチドの断片、誘導体、ま
たは類似体をコードする。そのようなヌクレオチド変異
体には欠失変異体、置換変異体および付加または挿入変
異体が含まれる。 【００１１】先に示したように、該ポリヌクレオチドは
図１〜２（配列番号：１）に示すコーディング配列の天
然に存在する対立遺伝子変異体または寄託されたクロー
ンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異
体であるコーディング配列を有してよい。当該技術分野
において公知のように、対立遺伝子変異体は１またはそ
れ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加（実質的
にはコードするポリペプチドの機能を変えない）を有し
てよい別の形のポリヌクレオチド配列である。 【００１２】本発明はまた、ポリヌクレオチド配列をも
含む（ここで、該成熟ポリペプチドに関するコーディン
グ配列は同様のリーディンフレームにおいて、例えば宿
主細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌
配列として機能するリーダー配列などの、宿主細胞から
のポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレ
オチド配列に融合されてよい）。リーダー配列を有する
ポリペプチドはプレタンパク質であり、該リーダー配列
が宿主細胞によって開裂されて該ポリペプチドの成熟形
態を形成してよい。該ポリヌクレオチドはまた、該成熟
タンパク質およびさらに別の５'アミノ酸残基からなる
プロタンパク質をコードしていてよい。プロ配列を有す
る成熟タンパク質はプロタンパク質であり、該タンパク
質の不活性形態である。プロ配列が開裂されると活性な
成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリ
ヌクレオチドは成熟タンパク質、またはプロ配列を有す
るタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダ
ー配列）の両者を有するタンパク質をコードしてよい。 【００１３】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合したコーディング配列を有してもよい。
該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融
合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ｐＱ
Ｅ−９ベクターによって与えられるヘキサ−ヒスチジン
タグであってよく、または例えば、哺乳動物宿主（例え
ば，ＣＯＳ−７細胞）を使用する場合には、マーカー配
列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。該ＨＡ
タグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質より得ら
れるエピトープに対応する（ウィルソン（Ｗilson，
Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。「遺伝
子」という語は、ポリペプチド鎖を生成するのに関与す
るＤＮＡのセグメントを意味する；該セグメントには、
先行するおよび後続するコーディング領域（リーダーお
よびトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメン
ト（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。 【００１４】本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ｃ
ＤＮＡの単離および該遺伝子に高い配列類似性を有する
または類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡｓの単
離のためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用されてよい。このタイプ
のプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、
例えば５０またはそれより多くの塩基を含んでよい。該
プローブはまた、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクロ
ーンおよびゲノムクローンまたは調節およびプロモータ
ー領域、エクソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子
を含むクローンを同定するのに使用されてよい。スクリ
ーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成
するために既知のＤＮＡ配列を使用することにより遺伝
子のコーディング領域を単離することを含む。本発明の
遺伝子の配列に相補的である配列を有する標識したオリ
ゴヌクレオチドを、プローブがライブラリーのどの成員
にハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングするために使用する。 【００１５】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％、およびより好ま
しくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、本明細
書に記載の上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件
下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書で使用する場合、「ス
トリンジェント条件」という語は、配列間に少なくとも
９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性があ
る場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろ
うことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図
１〜２のｃＤＮＡ（配列番号：１）または寄託されたｃ
ＤＮＡ（ｓ）によりコードされる成熟ポリペプチドと同
じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペ
プチドをコードする。 【００１６】別の態様として、該ポリヌクレオチドは、
本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、上記の
ように同一性を有し、活性を保持するまたは保持してい
ない、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、およ
びより好ましくは少なくとも５０塩基を有してよい。例
えば、このようなポリヌクレオチドは配列番号：１のポ
リヌクレオチドのプローブとして、例えば、ポリヌクレ
オチドの回収のため、または診断プローブとしてまたは
ＰＣＲプライマーとして使用してよい。従って、本発明
は配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも９０％の同一性およびより好ましくは９５％
の同一性を有するポリヌクレオチドならびにその断片
（該断片は少なくとも３０塩基および好ましくは少なく
とも５０塩基を有する）およびこのようなポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチドに関する。 【００１７】本明細書で使用する寄託は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の約
定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当
業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３
５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認する
ものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、さらにまた、それによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際
は、いつでも照合している。寄託された物質を製造し、
使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得
て、またそのような実施許諾は、ここでは付与されな
い。 【００１８】本発明はさらに、図１〜２の推定アミノ酸
配列（配列番号：２）を有する、または寄託されたｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する血清パラ
オキソナーゼペプチド、さらにはまた、そのようなポリ
ペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。図１〜
２のポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及する場
合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という語
は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機
能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従っ
て、類似体には、プロタンパク質部分を切断することに
より活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造するこ
とができるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペ
プチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまた
は合成ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチ
ドが好ましい。 【００１９】図１〜２のポリペプチド（配列番号：２）
または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは
それ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残
基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されてお
り、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによ
りコードされるものであってもよく、またはコードされ
たものでなくてもよいもの、または（ii）１つまたはそ
れ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または
（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような他の化合物と融合しているもの、または
（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプ
チドの精製に使用される配列、またはプロタンパク質配
列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチド
に融合しているものであり得る。そのような断片、誘導
体および類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲
内であると思われる。 【００２０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に
存在するなら、天然の環境）から除去されていることを
意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在す
るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
ないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全
てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは
ベクターの一部であってよく、および／またはそのよう
なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部
であってよく、それでいて、そのようなベクターまたは
組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、な
お単離されている。 【００２１】本発明のポリペプチドは配列番号：２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番
号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好
ましくは少なくとも７０％の同一性）を有し、およびよ
り好ましくは配列番号：２のポリペプチドに少なくとも
９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同
一性）を有し、さらにより好ましくは配列番号：２のポ
リペプチドに少なくとも９５％の類似性（さらにより好
ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプ
チドを含み、そのようなポリペプチドの部分（該部分）
は少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なく
とも５０のアミノ酸を一般に含む）をも含む。２つのポ
リペプチド間における「類似性」は当該技術分野におい
て公知のように、あるポリペプチドのアミノ酸配列およ
び保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列
と比較することにより決定される。 【００２２】本発明のポリペプチドの断片または一部は
ペプチド合成による対応する完全長ポリペプチドを生成
するため使用されてよい；それゆえ、該断片は完全長ポ
リペプチドを生成する中間体として使用されてよい。本
発明のポリヌクレオチドの断片または一部は本発明の完
全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用されてよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベ
クター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細
胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製
造にも関する。 【００２３】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される（形質導入、または形質転換、または
トランスフェクションされる）。該ベクターは、例え
ば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、または血清パラオキソナーゼ
遺伝子を増幅するのに適するよう改変された通常の栄養
培地で培養することができる。温度、ｐＨ等といったよ
うな培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使
用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 【００２４】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮ
Ａ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；
ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；
プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られ
るベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれ
る。しかしながら、他のいずれのベクターも、それが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。 【００２５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモータ
ー）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。
そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが
挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸
菌（Ｅ．coli）、lac、またはtrp、ファージラムダＰ_L
プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれ
らのウイルスでの遺伝子の発現を調節することが知られ
ている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開
始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネータ
ーも含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当
な配列も含み得る。 【００２６】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるための
１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む
のが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらに
はまた、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベク
ターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、そ
の宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることがで
きる。 【００２７】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ドロソフィラ（Drosophila）およびスポドプテラ
（Spodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物
細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択
は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思わ
れる。 【００２８】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方
向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウ
イルスベクターといったようなベクターを含む。この実
施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの、
調節配列をさらに含む。適当なベクターおよびプロモー
ターが多数、当業者に知られていて、市販されている。
以下のベクターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７
０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑiage
n））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、phagescript、ｐｓｉＸ１７
４、pbluescript SK、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ
１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン
（Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ
２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(ファルマシア
（Ｐharmacia）)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２
ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーン)p
ＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファルマシ
ア)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベ
クターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可
能である限り、使用することができる。 【００２９】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初期(immediate e
arly)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ
４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメ
タロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよび
プロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内
である。 【００３０】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺
乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下
等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞の
ような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレク
トロポレーションにより行うことができる。(デイビス
（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッテ
イ（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍole
cular Ｂiology）（１９８６）)。宿主細胞中の構築物
を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされ
る遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、
本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置によ
り合成的に製造することができる。 【００３１】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambroo
k）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlo
ning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaborato
ry Ｍanual）、 第２版、コールド・スプリング・ハー
バー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１
９８９)により記載されており、この開示は、本明細書
の一部を構成する。 【００３２】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。 【００３３】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子並
びにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ. cerevisiae）
ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせ
るために高度に発現される遺伝子から得られるプロモー
ターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、
とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)の
ような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、また
は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得る
ことができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始およ
び終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の
細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることが
できるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で集合す
る。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特
性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精
製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融
合タンパク質をコードすることができる。 【００３４】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
機能的なプロモーターと作動可能なリーディング相にあ
る適当な翻訳開始および終結シグナルと共に挿入するこ
とにより構築される。そのようなベクターは、ベクター
の維持を確実なものとするために、また所望により、宿
主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表
現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むであ
ろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・テ
ィフィムリウム、およびシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプロマイセス属、ならびにスタフィロコ
ッカス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含ま
れるが、他のものもまた選択可能である。 【００３５】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知のクロー
ニングベクター ｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の
遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでい
てよい。そのような市販のベクターには、例えば、pＫ
Ｋ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsal
a）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオ
テク（Ｐromega Ｂiotec）、マディソン（Ｍadison）、
ウィスコンシン、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２
２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべ
き構造配列と組み合わせる。 【００３６】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロ
モーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学
誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的ま
たは化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製
の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の
発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、
超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
むいずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法
は、当業者に周知である。 【００３７】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢ
ＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製
開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、また
いずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化
部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写
終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含む
であろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮ
Ａ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要と
される非転写遺伝要素を与えることができる。 【００３８】血清パラオキソナーゼポリペプチドは、硫
酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオ
ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞
培養物から回収して、精製することができる。必要に応
じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体
配置を完成するのに使用することができる。最後に、高
性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程
に使用することができる。 【００３９】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明の血清パラオキ
ソナーゼポリペプチドは、コリンエステラーゼの毒性オ
キソンインヒビターが血清パラオキソナーゼにより加水
分解されるので、有機リン酸塩中毒の解毒剤として使用
してよい。血清パラオキソナーゼポリペプチドは、この
ような毒性中毒による神経細胞死を予防するのに使用さ
れてよい。もし、有機リン酸塩中毒が処置されないまま
であるならば、神経細胞死という結果になるであろう。 【００４０】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。血清パラオキソナーゼ遺伝子は、第７染色体
上の膵嚢胞性線維症遺伝子の近隣に位置する。そのう
え、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要があ
る。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マ
ーキング試薬は、染色体位置をマークするのにはほとん
ど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ
ピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける
重要な第一段階である。 【００４１】本発明のポリペプチドは、適当な製薬学的
担体と組み合わせて使用することができる。そのような
組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および製薬
学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。その
ような担体には、これに限定されるものではないが、生
理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グ
リセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが
含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。 【００４２】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器には、製薬学的または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定
された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの
投与のための製造、使用または販売の、該当局による承
認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治
療化合物と共に使用することができる。 【００４３】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。血清パラオ
キソナーゼは、特定の適応症を治療および／または予防
するのに有効な量で投与される。一般に、血清パラオキ
ソナーゼは、１日当たり少なくとも約１０μg／kg(体
重)の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg(体
重)を超えない量で投与されるであろう。たいていの場
合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投与量は、
毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。 【００４４】該ポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子
治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・ビ
ボにおける発現により、本発明に従って使用してよい。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex
vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細
胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような
方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明の
ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス
粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法
により操作することができる。 【００４５】同様に、例えば、当該技術分野で既知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。 【００４６】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００４７】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r）ら、Biotechniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−
９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター
（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏ
ｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物
細胞のプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれ
る）が含まれる。使用されてよい他のウイルスプロモー
ターは、以下に限るものではないが、アデノウイルスプ
ロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターお
よびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切な
プロモーターの選択は、本明細書中の教示から当業者に
は明らかであろう。 【００４８】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００４９】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクショ
ンしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るも
のではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−
ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−
Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋
ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ（ミラー、
Human Gene Therapy、Ｖol．１、５−１４頁（１９９
０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引用す
る）。該ベクターは当該技術分野において公知の方法に
よりパッケージング細胞を形質導入する。このような方
法には、以下に限るものではないが、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈降が含まれ
る。１つの別法として、該レトロウイルスプラスミドベ
クターはリポソーム中にカプセル化して入れられてよ
く、または脂質と結合され、ついで宿主に投与されてよ
い。 【００５０】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞を形質導入するため使用してよい。形質導入した
真核生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列を
発現するであろう。形質導入されてよい真核生物細胞に
は、以下に限られるものではないが、胎児幹細胞、胎児
癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋
芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が含
まれる。本発明はまた、診断用として本発明の遺伝子を
使用することにも関する。該遺伝子の変異形態の検出に
より、血清パラオキソナーゼの過少発現による疾患の診
断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろう。 【００５１】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細
胞から得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用しても
よいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎatur
e、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素
的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、血清パラオ
キオソナーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーは変異を同定し分析するのに使用することができ
る。例えば、欠失および挿入は、通常の遺伝子型に比較
して増幅した産物の大きさにおける変化によって検出す
ることができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを放射
性標識したＲＮＡまたは別法として放射性標識したアン
チセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによっ
て同定することができる。完全にマッチした配列は、Ｒ
ＮアーゼＡ消化によるかまたは融点における差異によっ
てミスマッチの二本鎖から区別することができる。 【００５２】参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列
の相違は、直接ＤＮＡシークエンシング方法によって明
らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡ
セグメントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプロー
ブとして使用してよい。この方法の感度はＰＣＲと組み
合わされると非常に増強される。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣ
Ｒによって生成した一本鎖鋳型分子とともに使用され
る。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチドによる
従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手
法によって行われる。 【００５３】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって
行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high
resolution）ゲル電気泳動によって可視化することが
できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断片
が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個
の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配
ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（Ｍyers）
ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。 【００５４】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（ＲＦＬ
Ｐ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの方法
により行われてよい。一層従来のゲル電気泳動およびＤ
ＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイン・サイ
チュ分析により検出することができる。 【００５５】本発明はまた、通常のコントロール組織サ
ンプルに比較したタンパク質の過剰発現が、血清パラオ
キソナーゼの存在を検出することができるため、多様な
組織において本発明のポリペプチドの改変レベルを検出
する診断アッセイにも関する。宿主由来のサンプルにお
ける本発明のポリペプチドのレベルを検出するのに使用
するアッセイは当業者によく知られており、ラジオイム
ノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分
析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。Ｅ
ＬＩＳＡアッセイは最初に、血清パラオキソナーゼ抗原
に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製
することを含む。加えて、リポーター抗体が該モノクロ
ーナル抗体に対して調製される。リポーター抗体には放
射線、蛍光またはこの例においては西洋ワサビペルオキ
シダーゼ酵素など検出可能な試薬が付着される。ついで
サンプルを宿主から除去し、該サンプル中のタンパク質
を結合する固相支持体（例えばポリスチレンディッシ
ュ）上でインキュベートする。ついで、該ディッシュ上
の遊離タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの
非特異的タンパク質でインキュベートすることによりカ
バーする。ついで、該モノクローナル抗体を該ディッシ
ュでインキュベートすると、その間に該モノクローナル
抗体は、該ポリスチレンディッシュに付着した本発明の
ポリペプチドに付着する。すべての結合していないモノ
クローナル抗体をバッファーで洗い落とす。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を今度はデ
ィッシュに置くと、本発明のポリペプチドに結合したモ
ノクローナル抗体に該リポーター抗体が結合することに
なる。ついで、付着していないリポーター抗体を洗い落
とす。ついで、ペルオキシダーゼ基質を該ディッシュに
添加し、所定の時間における発色量は、標準カーブに比
較して、患者のサンプルの所定量中に存在する本発明の
ポリペプチドの量の測定となる。 【００５６】本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固
相支持体に付着させ、標識した血清パラオキソナーゼお
よび宿主から得たサンプルを該固相支持体に通し、つい
で該固相支持体に付着した標識の検出量を該サンプルに
おける本発明のポリペプチドの量に相関させることがで
きる、競合アッセイを使用してよい。本発明はまた、例
えば、血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ分子を
含む哺乳動物細胞を複数の薬剤およびパラチオンまたは
クロルピリフォスと接触させ、血清パラオキソナーゼに
よって毒性オキソンの加水分解を増強するそれらの薬剤
を検出し、それによりアゴニストとして特異的に作用す
る薬剤を同定することからなる、パラオキソナーゼとそ
の基質との相互作用を増強する薬剤（アゴニスト）を同
定するための薬剤のスクリーニング方法をも提供する。
多様な検出方法が使用されてよい。該毒性オキソンは、
その加水分解が測定されるように検出できるマーカー基
質（例えば、放射性標識またはビオチンなどの非同位体
標識）と結合させることによって「標識」されてよい。
薬剤候補は、当該技術分野においてよく知られた放射性
リガンド結合方法を使用し、トランスフェクションした
細胞において発現した血清パラオキソナーゼポリペプチ
ドに高いアフィニティーで結合する化学化合物を選択す
ることによって同定する。 【００５７】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づ
いた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマー
クするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮ
Ａの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連
遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００５８】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子
の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲ
ノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプラ
イマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なも
のとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト
染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン
グに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む
ハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろ
う。 【００５９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマップするのに同様に利用す
ることができる他のマッピング方法には、イン・サイチ
ュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
セレクションが含まれる。 【００６０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程
で与えることができる。この技術は、少なくとも５０ま
たは６０塩基を有するｃＤＮＡで利用することができ
る。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒュー
マン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・
マニュアル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanua
l of Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐerg
amon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【００６１】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ. ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheri
tance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシ
ティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns
Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を
介してオンラインで利用できる)に見い出される。つい
で、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患と
の間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺
伝(coinheritance))によって確認する。 【００６２】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。 【００６３】ポリペプチド、それらの断片もしくは他の
誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発
現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗
体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さ
らにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブ
ラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々
な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用する
ことができる。 【００６４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天
然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用す
ることができる。ついで、そのような抗体を使用して、
そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単
離することができる。 【００６５】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilste
in）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、
トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔ
oday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造
するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）
ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・ア
ンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodie
s and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール．リス、イ
ンク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁におい
て)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されてい
る技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免
疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造する
のに適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本
発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対するヒト化抗体
を発現するのに使用してよい。 【００６６】 【実施例】本発明をさらに、以下の実施例に関して記載
する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に限
定されないことを理解すべきである。部または量は全
て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実
施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てく
る方法および／または用語を記載する。「プラスミド」
は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字
および／または数字により示す。本明細書中の出発プラ
スミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に
公に入手可能であるか、または公開された方法により入
手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載した
プラスミドと同等のプラスミドは、当該技術分野で公知
であって、当業者に明らかであろう。 【００６７】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。
プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的に
は、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μgを２
０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適
当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されてい
る。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常
利用されるが、供給者の指示に従って変えることができ
る。消化後、その反応物をポリアクリルアミドまたはア
ガロースゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離す
る。 【００６８】開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル
（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic ＡcidsＲes.、８：４０
５７（１９８０）により記載されている８％ ポリアク
リルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」
は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキ
シヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌク
レオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチド
は５'リン酸を有さないことから、キナーゼの存在下、
ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしには、別のオリ
ゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリ
ゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片にライ
ゲーションするであろう。 【００６９】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう
(マニアチス（Ｍaniatis, Ｔ.）ら、同上、１４６頁)。
特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲート
させるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既
知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Ｇ
raham,Ｆ.）およびファン・デル・エブ（Ｖan der Ｅb,
Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）
の方法に記載されているようにして行った。 【００７０】実施例１ 血清パラオキソナーゼの細菌発現および精製 最初に、血清パラオキソナーゼをコードするＤＮＡ配
列、ＡＴＣＣ第７５７７３号を、５'および処理した血
清パラオキソナーゼタンパク質の配列(シグナルペプチ
ド配列なし)に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーおよび血清パラオキソナーゼ遺伝子の３'ベクタ
ー配列を利用して増幅する。血清パラオキソナーゼに対
応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に
加えた。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： 5' TCAGGATCCAGAAATCGACTTAAAGCCTCC 3' （配列番号：３）を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素
部位、続いて、２１ヌクレオチドの、処理したタンパク
質コドンの推定末端アミノ酸から開始する血清パラオキ
ソナーゼコーディング配列を含む。３'配列 5' TCAAAGCTTTTAGAGTTCACAATACAAGGC 3' （配列番号：４）は、Ｈind III制限酵素部位に対する
相補的配列を含み、および血清パラオキソナーゼの２１
ヌクレオチドが続く。これら制限酵素部位は、細菌発現
ベクター pＱＥ−９(キアゲン、インク． ９２５９ イ
ートン・アベニュー（Ｅton Ａvenue）、チャッツワー
ス（Ｃhatsworth）、カリフォルニア、９１３１１)上の
制限酵素部位に対応する。 【００７１】pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌
の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモータ
ーオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢ
Ｓ)、６−Ｈisタグ（tag）および制限酵素部位をコード
する。次いで、pＱＥ−９をＢamＨＩおよびＨind IIIで
消化した。増幅された配列をpＱＥ−９にライゲートし
て、ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＢＳとイ
ンフレームで挿入した。ついで、そのライゲーション混
合物を使用して、大腸菌株 ＳＵＲＥ（ストラタジーン
・クローニング・システムズ、１１０９９ ノース・ト
レイ・パインズ・ロード（Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoa
d）、ラ・ジョラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア ９２
０３７から 入手可能）をサンブルックら、モレキュラ
ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８
９）に記載の手順に従って形質転換した。形質転換体
を、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定し
て、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択し
た。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認
した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp（１００ug
／ml）とＫan（２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中
での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ
培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２
５０の割合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密
度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖した。 【００７２】ついで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−Ｂ−Ｄ
−チオガラクトピラノシド)を、最終濃度が１mＭとなる
まで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性
化することにより誘発し、Ｐ／Ｏが遺伝子発現の増加を
導くことを明らかにする。細胞をさらに３〜４時間増殖
させた。ついで、細胞を遠心分離により収集した。細胞
ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジン
ＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒ
スチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能
にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマト
グラフィーにより、可溶化した血清パラオキソナーゼを
精製した。ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromat
ography ４１１：１７７−１８４（１９８４）。６モル
のグアニジンＨＣl(pＨ ５.０)中、そのカラムから血清
パラオキソナーゼを溶出し、また再生の目的には、３モ
ルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、
１０ミリモルのグルタチオン(還元型)および２ミリモル
のグルタチオン(酸化型)に調節した。この溶液で１２時
間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモル
のリン酸ナトリウムで透析した。 【００７３】実施例２ ＣＨＯ細胞における組換え血清パラオキソナーゼの発現 プラスミドの発現、血清パラオキソナーゼＨＡは、１）
ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）
大腸菌複製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イン
トロンおよびポリアデニレーション部位が続くＣＭＶプ
ロモーター、を含むｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロ
ゲン（Ｉnvitrogen））より得る。血清パラオキソナー
ゼ前駆体全体およびその３'端にインフレームにて融合
したＨＡタグをコードするＤＮＡ断片を、該ベクターの
ポリリンカー領域にクローニングし、それゆえ、該組換
えタンパク質の発現はＣＭＶプロモーターのもとに調節
される。以前に記載されているように（ウィルソン
（Ｉ．Ｗilson）、ナイマン（Ｈ．Ｎiman）、ハイテン
（Ｒ．Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ Ｃherenson）、
コノリー（Ｍ．Ｃonnolly）およびラーナー（Ｒ．Ｌern
er）、１９８４、Ｃell３７、７６７）、ＨＡタグは、
インフルエンザ凝血素タンパク質由来のエピトープに対
応する。ＨＡタグの本発明者らの標的タンパク質への融
合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いて組換えタ
ンパク質の容易な検出を可能にする。 【００７４】該プラスミド構築方法を以下に記す：ＡＴ
ＣＣ受託番号第７５７７３号の血清パラオキソナーゼを
コードするＤＮＡ配列を、２つのプライマーを使用して
ＰＣＲにより構築する：５'プライマー 5' CGCGGGATCCACCATGGGGGCGGCTGGTGGCTCT 3' （配列番号：５）は開始コドンから開始する血清パラオ
キソナーゼコーディング配列の２１ヌクレオチドが続く
Ｂam ＨＩ制限部位を含む；３'配列 5' CGCGTCTAGACGGTTAGAGTTCACAATACAAGGC 3' （配列番号：６）はＸba Ｉ部位に相補的な配列および
翻訳終止コドンおよび血清パラオキソナーゼコーディン
グ配列の最後の１８ヌクレオチド（終止コドンは含まな
い）を含む。従って、該ＰＣＲ産物はＢam ＨＩ部位、
血清パラオキソナーゼコーディング配列、翻訳終止コド
ンおよびＸba Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片お
よびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢam ＨＩおよび
Ｘba Ｉ制限酵素で消化しライゲーションした。ライゲ
ーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（ストラタジーン・
クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓy
stems）、１１０９９ ノース・トレイ・パインロード、
ラ・ジョラ、カリフォルニア９２０３７）に形質転換
し、形質転換した培養をアンピシリン培地プレート上に
置きついで耐性コロニーを選択した。 【００７５】プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離
し、正しい断片の存在を制限分析により調べた。組換え
血清パラオキソナーゼの発現のため、ＣＨＯ細胞をＤＥ
ＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ）法に
より発現ベクターでトランスフェクションした（サンブ
ルック、フリッチュ（Ｅ．Ｆritsch）、マニアチス、モ
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ
アル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、
（１９８９））。血清パラオキソナーゼＨＡタンパク質
の発現を放射性標識および免疫沈降法（ハーロウ（Ｅ．
Ｈarlow）、レーン（Ｄ．Ｌane）、アンチボディーズ：
ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、（１９８８））に
より検出した。細胞をトランスフェクションした２日後
に８時間³⁵Ｓ−システインで標識した。ついで、培地を
回収し、細胞を洗剤（ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ
ＮaＣl 、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７.
５）で溶菌した。（ウィルソンら、上記、３７：７６７
（１９８４））。細胞のリゼイトおよび培地はともにＨ
Ａ特異的モノクローナル抗体で沈降した。沈降したタン
パク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。 【００７６】実施例３ ヒト組織における血清パラオキソナーゼの発現パターン ヒト組織における血清パラオキソナーゼの発現のレベル
を調べるためノーザンブロット分析を行った。総細胞Ｒ
ＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌ^TMＢシステム（バイオテッ
クス・ラボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratori
es，Ｉnc.）６０２３ サウス・ループ・イースト（Ｓou
th Ｌoop Ｅast）、ヒューストン、テキサス７７０３
３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離した総ＲＮ
Ａの約１０μgを１％ アガロースゲル上で分離し、ナイ
ロンフィルターにブロットした（サンブルック、フリッ
チュおよびマニアチス、モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング
・ハーバー・プレス、（１９８９））。該標識反応は、
５０ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム
−イット キットに従って行う。標識したＤＮＡをＳele
ct−Ｇ−５０カラムで精製する。（５ プライム−３ プ
ライム、インク、５６０３ アラパホ・ロード、ブルダ
ー、コロラド ８０３０３）。ついで、フィルターを放
射性標識した血清パラオキソナーゼ遺伝子の全長と０.
５Ｍ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７.４および７％ＳＤＳ中で１,０
００,０００ｃｐｍ／ｍｌで６５℃で一晩ハイブリダイ
ズさせる。室温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×Ｓ
ＳＣ、０.１％ ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルター
を増感紙で−７０℃で一晩露光する。 【００７７】実施例４ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分離する。
その組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
を上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ
１２ media）を添加する。ついでこれを３７℃で約１週
間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加し
引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養に線
維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理し
ついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【００７８】モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲによ
りフランキングされたｐＭＶ−７（キルシュメイエル
（Ｋirschmeier）ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９
８８））をＥco ＲＩおよびＨind IIIで消化し、続いて
仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをア
ガロースゲル上で分画化し、ガラスビーズを使用して精
製する。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを
それぞれ５'端および３'端配列に対応するＰＣＲプライ
マーを使用して増幅する。５'端プライマーはＥco ＲＩ
部位を含み３'プライマーはさらにＨind III部位を含
む。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格および増幅
したＥco ＲＩ−Ｈind III断片の等量をＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２
つの断片のライゲーションに適した条件下で維持する。
ライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１を形質転換する
のに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に挿入
された遺伝子を有することを確認するためカナマイシン
含有アガー上に播種する。 【００７９】アンホトロピックｐＡ３１７またはＧｐ＋
ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有す
るダルベッコ改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodifie
d Ｅagles Ｍedium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になる
まで組織培養にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶ
ベクターをついで培地に添加し、パッケージング細胞を
該ベクターで形質導入する。今度はパッケージング細胞
は、該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パ
ッケージング細胞を以後、プロデューサー細胞とい
う）。 【００８０】新しい培地を形質導入したプロデューサー
細胞に添加し、引き続き培地を１０ｃｍプレート全面の
プロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子
を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで濾過
して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついでこの
培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線
維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデューサ
ー細胞からの培地とすばやく取り替える。この培地を除
去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価が高い場
合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一切
必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、ｎｅｏま
たはｈｉｓなどの選択可能なマーカーを有するレトロウ
イルスベクターを使用する必要がある。操作された線維
芽細胞を、単独またはサイトデックス３ミクロキャリア
ビーズ（cytodex 3 microcarrier beads）上全面に増殖
した後に、宿主に注入する。該線維芽細胞はタンパク質
産物を産生する。先の教示から見て、本発明の多数の変
更および変化が可能であることから、追記する請求の範
囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことがで
きる。 【００８１】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Serum Paraoxonase <130> 184425 <160> 6 <210> 1 <211> 1079 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cccatggggc ggctggtggc tgtgggcttg ctggggatcg ccctggccct cctgggcgag 60 aggcttctgg cactcagaaa tcgacttaaa gcctccagag aagtagaatc tgtagacctt 120 ccacactgcc acctgattaa aggaattgaa gctggctctg aagatattga catacttccc 180 aatggtctgg cttttttaag tgtgggtcta aaattcccag gactccacag ctttgcacca 240 gataagcctg gaggtatact aatgatggtt ctaaaagaag caaaaccaag gggacgggaa 300 ttaagaatca gtcgtgggtt tgatttggcc tcattcaatc cacatgggat cagcactttc 360 atagacaacg atgacacagt ttatctcttg gttgtaaacc acccagaatt caagaataca 420 gtggaaattt ttaatttgga agaagcagaa aattctctgt tgcatctgaa aacagtcaaa 480 catgagcttc ttccaagtgt gaatgacatc acagctgttg gaccggcaca tttctatgcc 540 acaaatgacc actacttctc tgatcctttc ttaaagtatt tagaaacata cttggaatta 600 cactgggcaa atgttgttta ctacaggcca aatgaagtta aaggtggtag caggaaggat 660 ttggattcag caaatgggat caatatttca cctggatgga taagtttttc tatgttggct 720 gacatattgg ctcatgaaat tcatgtttgg ggaaaacaca ctaatatgaa tttaactcag 780 ttgaaggtac ttgagctgga tacactggtg gataatttat ctattgatcc ttcctcgggg 840 gacatctggg taggctgtca tcctaatggc cagaagctct tcgtgtatga cccgaacaat 900 cctccctcgt cagaggttct ccgcatccag aacattctat ctgagaagcc tacagtgact 960 acagtttatg ccaacaatgg gtctgttctc caaggaagtt ctgtaggctc agtgtatgat 1020 gggaagctgc tcataggcac tttataccac agagccttgt attgtgaact ctaaattgt 1079 <210> 2 <211> 356 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Gly Arg Leu Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ala 5 10 15 Leu Leu Gly Glu Arg Leu Leu Ala Leu Arg Asn Arg Leu Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro His Cys His Leu Ile 35 40 45 Lys Gly Ile Glu Ala Gly Ser Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Asn 50 55 60 Gly Leu Ala Phe Leu Ser Val Gly Leu Lys Phe Pro Gly Leu His 65 70 75 Ser Phe Ala Pro Asp Lys Pro Gly Gly Ile Leu Met Met Val Leu 80 85 90 Lys Glu Ala Lys Pro Arg Gly Arg Glu Leu Arg Ile Ser Arg Gly 95 100 105 Phe Asp Leu Ala Ser Phe Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile 110 115 120 Asp Asn Asp Asp Thr Val Tyr Leu Leu Val Val Asn His Pro Glu 125 130 135 Phe Lys Asn Thr Val Glu Ile Phe Asn Leu Glu Glu Ala Glu Asn 140 145 150 Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Val Lys His Glu Leu Leu Pro Ser 155 160 165 Val Asn Asp Ile Thr Ala Val Gly Pro Ala His Phe Tyr Ala Thr 170 175 180 Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr Leu Glu Thr 185 190 195 Tyr Leu Glu Leu His Trp Ala Asn Val Val Tyr Tyr Arg Pro Asn 200 205 210 Glu Val Lys Gly Gly Ser Arg Lys Asp Leu Asp Ser Ala Asn Gly 215 220 225 Ile Asn Ile Ser Pro Gly Trp Ile Ser Phe Ser Met Leu Ala Asp 230 235 240 Ile Leu Ala His Glu Ile His Val Trp Gly Lys His Thr Asn Met 245 250 255 Asn Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Glu Leu Asp Thr Leu Val Asp 260 265 270 Asn Leu Ser Ile Asp Pro Ser Ser Gly Asp Ile Trp Val Gly Cys 275 280 285 His Pro Asn Gly Gln Lys Leu Phe Val Tyr Asp Pro Asn Asn Pro 290 295 300 Pro Ser Ser Glu Val Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Ser Glu Lys 305 310 315 Pro Thr Val Thr Thr Val Tyr Ala Asn Asn Gly Ser Val Leu Gln 320 325 330 Gly Ser Ser Val Gly Ser Val Tyr Asp Gly Lys Leu Leu Ile Gly 335 340 345 Thr Leu Tyr His Arg Ala Leu Tyr Cys Glu Leu 350 355 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tcaggatcca gaaatcgact taaagcctcc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tcaaagcttt tagagttcac aatacaaggc 30 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cgcgggatcc accatggggg cggctggtgg ctct 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cgcgtctaga cggttagagt tcacaataca aggc 34

【図面の簡単な説明】 【図１】 推定の成熟血清パラオキソナーゼポリペプチ
ドのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。 【図２】 推定の成熟血清パラオキソナーゼポリペプチ
ドのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター・エル・ハドソン アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ ーマンタウン、ハイストリーム・ドライブ 19041番 (72)発明者 ヘ・ウェイ・ウ アメリカ合衆国21045メリーランド州コロ ンビア、フリー・ストーン・コート6225番 (72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン アメリカ合衆国20832メリーランド州オル ネイ、ヘリテッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA17 4B050 CC03 DD11 FF14E LL01 LL03 4C084 AA02 AA07 BA44 DC22 NA14 ZB212 ZC372

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 明細書に記載の血清パラオキソナーゼ。