JP2003061691A - ヒトエラスターゼｉｖ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトエラスターゼＩＶポリペプチドおよびこ
のようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）お
よび組換え技術を使用してこのようなポリペプチドを生
成する方法および治療目的、例えば動脈壁の弾性の回
復、血清脂質の異常の改善および血清リポタンパク質代
謝の改善のためのこのようなポリペプチドの利用方法を
開示する。また、このようなポリペプチドに対するアン
タゴニスト／阻害剤及び炎症、関節炎、例えば慢性関節
リウマチ及び変形性関節症、膵臓炎、敗血症性ショッ
ク、潰瘍における限定的な組織の損傷の処置におけるそ
の使用を開示する。さらに、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列における突然変異の同定および本発明
のポリペプチドのレベル変化を検出するための診断アッ
セイも開示する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドおよびこのようなポリペプチドをコードする核酸。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、新規の同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオ
チド及びポリペプチド、並びにこのようなポリヌクレオ
チド及びポリペプチドの製造に関する。さらに具体的に
は、本発明のポリペプチドは、ヒトエラスターゼＩＶで
あって、時には、以下で「ＨＥ ＩＶ」と呼ぶ。本発明
はまた、このようなポリペプチドの作用の阻害に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】エラスターゼは、セリンプロテアーゼで
あり、エラスチンとして知られている繊維状不溶性タン
パク質を加水分解することができる。エラスチンは、高
等動物の、結合組織、腱、大動脈外皮及び頸の束を形成
する硬タンパク質である。エラスチンは、ペプシンやト
リプシンなどの他のプロテアーゼによって、わずかに分
解されるだけである。 【０００３】動脈硬化に関する研究のなかで、Baloら
は、動脈壁のエラスチン繊維の分解を観察し、分解酵素
の存在を仮定した［Schweiz，Ｚ.，Pathol．Bacterio
l.，12：350（1949）］。後に、１９５２年にBangaは、
エラスチンを特異的に分解する酵素を膵臓中に発見し
た。この酵素は、結晶形態で単離され、エラスターゼと
命名された［Acta．Phvsiol．Acad．Sci．Hung，3：317
（1952）］。 【０００４】エラスターゼは、ヒト、サル、ネコ、ウサ
ギ等を含む、たいていの動物の膵臓内に存在することが
確認されている。ヒトの年令におけるエラスターゼ活性
の関連性が認識されており、４０歳を越える男性及び６
０歳を越える女性の膵臓と血漿における著しいエラスタ
ーゼ活性の低下が、Loeven及びBaldwin，Gerontologi
a，17：170（1971）によって報告されている。 【０００５】動脈硬化の患者の場合においては、膵臓内
のエラスターゼ活性が健康な人々の活性よりも著しく低
くなっており、幾つかのケースでは完全に消失している
と、Balo及びBangaによって報告されている［Nature，1
78：310,（1956）］。その後の研究では、エラスターゼ
がエラスチンの加水分解を触媒しているだけでなくエラ
スチン生合成を促進していることも実証された。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】ブタエラスターゼのヒ
トへの投与は、外来のタンパク質の抗原作用のために、
抗体が産生される危険性がある。さらに、投与を反復す
ることにより、アナフィラキシーの危険もある。従っ
て、ヒトエラスターゼがヒトへの使用には好ましい。し
かし、従来の入手源、即ちヒトの膵臓から十分な量のヒ
トエラスターゼを得ることは非常に困難である。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明の１つの態様によ
れば、ＨＥ ＩＶである新規の成熟ポリペプチド、並び
にその断片、類似体及び誘導体が提供される。本発明の
ポリペプチドは、ヒト由来のものである。 【０００８】本発明の別の態様によれば、そのようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又は
ＲＮＡ）が提供される。 【０００９】本発明のさらなる態様によれば、組み換え
技術によるこのようなポリペプチドを製造するための方
法が提供される。 【００１０】本発明のさらなる別の態様によれば、その
ようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、動脈
壁の弾性の回復、血清脂質レベルの低下およびリポタン
パク質代謝の改善のために利用する方法が提供される。 【００１１】本発明のさらなる別の態様によれば、本発
明の核酸配列に特異的にハイブリダイズする、十分な長
さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。 【００１２】本発明のさらなる別の態様によれば、その
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００１３】本発明のさらなる別の態様によれば、例え
ば炎症、関節炎、例えば慢性関節リウマチ及び変形性関
節症、敗血症性ショック、膵臓炎、及び潰瘍における限
定的組織の損傷の処置において、このようなポリペプチ
ドの作用を阻害するために使用し得る、このようなポリ
ペプチドに対するアンタゴニストが提供される。 【００１４】本発明のさらなる別の態様によれば、本発
明のポリペプチドをコードする核酸配列における突然変
異に関連する疾患または疾患に対する罹患性の検出のた
めの診断アッセイが提供される。 【００１５】本発明のさらに他の態様によれば、例え
ば、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造などの科
学的研究に関連するインビトロでの目的のため、このよ
うなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを利用する方法が提供される。 【００１６】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。 【００１７】以下の図面は本発明の態様を説明するもの
であって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を
制限しようとするものではない。 【００１８】 【発明の実施の形態】本発明の一態様によれば、図１の
推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有する推定の成熟
ポリペプチド、または１９９４年４月２５日にＡＴＣＣ
受託番号第７５７５１号として寄託されたクローンのｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供され
る。 【００１９】本発明のポリヌクレオチドはヒト膵臓から
得られたｃＤＮＡライブラリー中で発見された。該ポリ
ヌクレオチドは構造的にセリンプロテアーゼファミリー
に関連する。該ポリヌクレオチドは、約２６８アミノ酸
残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含み、その最初のおよそ１６アミノ酸残基は推
定リーダー配列であり、アミノ酸１７〜２９はプロ配列
を表し、その結果、成熟タンパク質は２３９個のアミノ
酸を有する。該タンパク質はラットエラスターゼＩＶ
と、最も大きいホモロジーを示し、アミノ酸配列全長に
わたり７２％の同一性と８２％の類似性を有する。本発
明のポリペプチドはまた、他のエラスターゼポリペプチ
ドに対しても高い程度のホモロジーを有し、活性部位に
対応しているすべてのセリンプロテアーゼにみられる２
つの保存されたモチーフ、即ち、アミノ酸７６〜８１の
ＬＴＡＡＨＣ及びアミノ酸２１９〜２２３のＧＤＳＧＧ
を有している。 【００２０】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまた
はＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを
含む）の形態であってよい。該ＤＮＡは二本鎖または一
本鎖であってよく、また一本鎖であるならば、コーディ
ング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であっ
てよい。成熟ポリペプチドをコードする配列は図１に示
すコーディング配列（配列番号：１）または、寄託され
たクローンのコーディング配列に一致していてよいし、
または遺伝コードの重複（redundancy）または縮重の結
果、図１のＤＮＡ（配列番号：１）または寄託されたｃ
ＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする別のコーデ
ィング配列であってよい。 【００２１】図１の成熟ポリペプチド（配列番号：２）
または寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下のものを
含んでいてよいがこれらに限られない：成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列、および、リーダー配列または分泌配列また
はプロタンパク質配列などの別のコーディング配列；成
熟ポリペプチドのコーディング配列（および任意に別の
コーディング配列）、および成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列のイントロンまたは成熟ポリペプチドのコー
ディング配列の５'および／または３'非コーディング配
列などの非コーディング配列。 【００２２】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という語には、該ポリペプチドのコーデ
ィング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにま
た、別のコーディングおよび／または非コーデイング配
列を含むポリヌクレオチドを包含する。 【００２３】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
(配列番号:２)を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
断片、類似体および誘導体をコードする、上記のポリヌ
クレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子
変異体または該ポリヌクレオチドの天然には存在しない
変異体であってよい。 【００２４】従って、本発明は、図１に示すのと同じ成
熟ポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのよう
なポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体
は、図１のポリペプチド（配列番号：２）または寄託さ
れたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリヌク
レオチドの断片、誘導体、または類似体をコードする。
そのようなヌクレオチド変異体には欠失変異体、置換変
異体および付加または挿入変異体が含まれる。 【００２５】先に示したように、該ポリヌクレオチドは
図１（配列番号：１）に示すコーディング配列の天然に
存在する対立遺伝子変異体または寄託されたクローンの
コーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体で
あるコーディング配列を有してよい。当該技術分野にお
いて公知のように、対立遺伝子変異体は１またはそれ以
上のヌクレオチドの置換、欠失または付加（実質的には
コードするポリペプチドの機能を変えない）を有してよ
い別の形のポリヌクレオチド配列である。 【００２６】本発明はまた、ポリヌクレオチド配列をも
含む（ここで、該成熟ポリペプチドに関するコーディン
グ配列は同様のリーディンフレームにおいて、例えば宿
主細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌
配列として機能するリーダー配列などの、宿主細胞から
のポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレ
オチド配列に融合されてよい）。リーダー配列を有する
ポリペプチドはプレタンパク質であり、該リーダー配列
が宿主細胞によって開裂されて該ポリペプチドの成熟形
態を形成してよい。該ポリヌクレオチドはまた、該成熟
タンパク質およびさらに別の５'アミノ酸残基からなる
プロタンパク質をコードしていてよい。プロ配列を有す
る成熟タンパク質はプロタンパク質であり、該タンパク
質の不活性形態である。プロ配列が開裂されると活性な
成熟タンパク質が残る。 【００２７】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク
質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の
両者を有するタンパク質をコードしてよい。 【００２８】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合したコーディング配列を有してもよい。
該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融
合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ｐＱ
Ｅ−９ベクターによって与えられるヘキサ−ヒスチジン
タグであってよく、または例えば、哺乳動物宿主（例え
ば，ＣＯＳ−７細胞）を使用する場合には、マーカー配
列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。該ＨＡ
タグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質より得ら
れるエピトープに対応する（ウィルソン(Ｗilson,Ｉ.）
ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４))。 【００２９】「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖を
生成するのに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；
該セグメントには、先行するおよび後続するコーディン
グ領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコ
ーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イン
トロン）を含む。 【００３０】本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ｃ
ＤＮＡの単離および該遺伝子に高い配列類似性を有する
または類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡｓの単
離のためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用されてよい。このタイプ
のプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、
例えば５０またはそれより多くの塩基を含んでよい。該
プローブはまた、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクロ
ーンおよびゲノムクローンまたは調節およびプロモータ
ー領域、エクソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子
を含むクローンを同定するのに使用されてよい。スクリ
ーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成
するために既知のＤＮＡ配列を使用することにより遺伝
子のコーディング領域を単離することを含む。本発明の
遺伝子の配列に相補的である配列を有する標識したオリ
ゴヌクレオチドを、プローブがライブラリーのどの成員
にハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングするために使用する。 【００３１】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％、およびより好ま
しくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、本明細
書に記載の上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件
下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書で使用する場合、「ス
トリンジェント条件」という語は、配列間に少なくとも
９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性があ
る場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろ
うことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図
１のｃＤＮＡ（配列番号：１）または寄託されたｃＤＮ
Ａ（ｓ）によりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生
物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチ
ドをコードする。 【００３２】別の態様として、該ポリヌクレオチドは、
本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、上記の
ように同一性を有し、活性を保持するまたは保持してい
ない、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、およ
びより好ましくは少なくとも５０塩基を有してよい。例
えば、このようなポリヌクレオチドは配列番号：１のポ
リヌクレオチドのプローブとして、例えば、ポリヌクレ
オチドの回収のため、または診断プローブとしてまたは
ＰＣＲプライマーとして使用してよい。 【００３３】従って、本発明は配列番号：２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性
およびより好ましくは９５％の同一性を有するポリヌク
レオチドならびにその断片（該断片は少なくとも３０塩
基および好ましくは少なくとも５０塩基を有する）およ
びこのようなポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドに関する。 【００３４】本明細書で使用する寄託は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の約
定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当
業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３
５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認する
ものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、さらにまた、それによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際
は、いつでも照合している。寄託された物質を製造し、
使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得
て、またそのような実施許諾は、ここでは付与されな
い。 【００３５】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
（配列番号：２）を有する、または寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、さらにはまた、そのようなポリペプチドの断片、類
似体および誘導体に関する。 【００３６】図１のポリペプチド（配列番号：２）また
は寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
に言及する場合、「断片」、「誘導体」および「類似
体」という語は、そのようなポリペプチドと実質的に同
じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意
味する。従って、類似体には、プロタンパク質部分を切
断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチド
を製造することができるプロタンパク質が含まれる。 【００３７】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てよいが、組換えポリペプチドが好ましい。 【００３８】図１のポリペプチド（配列番号：２）また
は寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
の断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されており、
またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコ
ードされるものであってもよく、またはコードされたも
のでなくてもよいもの、または（ii）１つまたはそれ以
上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ii
i）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）の
ような他の化合物と融合しているもの、または（iv）リ
ーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精
製に使用される配列、またはプロタンパク質配列といっ
たような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合し
ているものであり得る。そのような断片、誘導体および
類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内である
と思われる。 【００３９】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。 【００４０】「単離された」という語は、物質がその元
の環境（例えば、それが天然に存在するなら、天然の環
境）から除去されていることを意味する。例えば、生き
ている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは単離されていないが、天然の系におけ
る共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。
そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であって
よく、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の一部であってよく、それでい
て、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境
の一部ではないという点で、なお単離されている。 【００４１】本発明のポリペプチドは配列番号：２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番
号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好
ましくは少なくとも７０％の同一性）を有し、およびよ
り好ましくは配列番号：２のポリペプチドに少なくとも
９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同
一性）を有し、さらにより好ましくは配列番号：２のポ
リペプチドに少なくとも９５％の類似性（さらにより好
ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプ
チドを含み、そのようなポリペプチドの部分（該部分）
は少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なく
とも５０のアミノ酸を一般に含む）をも含む。 【００４２】２つのポリペプチド間における「類似性」
は当該技術分野において公知のように、あるポリペプチ
ドのアミノ酸配列および保存されたアミノ酸置換を第２
のポリペプチドの配列と比較することにより決定され
る。 【００４３】本発明のポリペプチドの断片または一部は
ペプチド合成による対応する完全長ポリペプチドを生成
するため使用されてよい；それゆえ、該断片は完全長ポ
リペプチドを生成する中間体として使用されてよい。本
発明のポリヌクレオチドの断片または一部は本発明の完
全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用されてよい。 【００４４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。 【００４５】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される（形質導入、または形質転換、または
トランスフェクションされる）。該ベクターは、例え
ば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、または本発明の遺伝子を増幅
するのに適するよう改変された通常の栄養培地で培養す
ることができる。温度、ｐＨ等といったような培養条件
は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条
件であって、当業者に明らかであろう。 【００４６】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮ
Ａ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；
ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；
プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られ
るベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれ
る。しかしながら、他のいずれのベクターも、それが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。 【００４７】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。 【００４８】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発
現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結して、ｍ
ＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表
例として、以下のものが挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ
４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．coli）、lac、またはt
rp、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もし
くは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現
を調節することが知られている他のプロモーター。発現
ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写ターミネーターも含む。該ベクターはまた、
発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 【００４９】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるため
の、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を
含むのが好ましい。 【００５０】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その
宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができ
る。 【００５１】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓtreptomy
ces）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella t
yphimurium）といったような細菌細胞；酵母のような真
菌細胞；ドロソフィラ（Ｄrosophila）Ｓ２およびスポ
ドプテラ（Ｓpodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったよ
うな動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿
主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であ
ると思われる。 【００５２】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方
向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウ
イルスベクターといったようなベクターを含む。この実
施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの、
調節配列をさらに含む。適当なベクターおよびプロモー
ターが多数、当業者に知られていて、市販されている。
以下のベクターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７
０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑiage
n））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、
ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂ
ｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene)；ptrc９９
a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、
pＲＩＴ５(ファルマシア（Ｐharmacia）)。真核生物用:
pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、p
ＳＧ(ストラタジーン)pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、p
ＳＶＬ(ファルマシア)。しかしながら、他のいずれのプ
ラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能
であって、生存可能である限り、使用することができ
る。 【００５３】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。 【００５４】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺
乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下
等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞の
ような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレク
トロポレーションにより行うことができる。(デイビス
（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッテ
イ（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍole
cular Ｂiology）（１９８６）)。 【００５５】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。 【００５６】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambroo
k）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlo
ning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaborato
ry Ｍanual）、 第２版、コールド・スプリング・ハー
バー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１
９８９)により記載されており、この開示は、本明細書
の一部を構成する。 【００５７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。 【００５８】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子並
びにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のよ
うな解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または
熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得るこ
とができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および
終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細
胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることがで
きるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で集合す
る。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特
性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精
製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融
合タンパク質をコードすることができる。 【００５９】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
機能的なプロモーターと作動可能なリーディング相にあ
る適当な翻訳開始および終結シグナルと共に挿入するこ
とにより構築される。そのようなベクターは、ベクター
の維持を確実なものとするために、また所望により、宿
主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表
現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むであ
ろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラ
ス・サチリス（Ｂacillus subtilis）、サルモネラ・テ
ィフィムリウム、およびシュードモナス（Ｐseudomona
s）属、ストレプロマイセス属、ならびにスタフィロコ
ッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含
まれるが、他のものもまた選択可能である。 【００６０】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知のクロー
ニングベクター ｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の
遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでい
てよい。そのような市販のベクターには、例えば、pＫ
Ｋ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsal
a）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオ
テク（Ｐromega Ｂiotec）、マディソン（Ｍadison）、
ウィスコンシン、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２
２ 「骨核」 部分を適当なプロモーターおよび発現される
べき構造配列と組み合わせる。 【００６１】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロ
モーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学
誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 【００６２】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。 【００６３】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、ま
たは細胞溶解剤の使用を含むいずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。 【００６４】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢ
ＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製
開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、また
いずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化
部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写
終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含む
であろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮ
Ａ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要と
される非転写遺伝要素を与えることができる。 【００６５】ポリペプチドは、硫酸アンモニウム法又は
エタノール沈殿法、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含
む方法によって、組み換え細胞培養物から回収し、精製
し得る。必要であればタンパク質の再生（refolding）
工程を使用して、成熟タンパク質の立体配置を完成する
ことができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を最終の精製段階に使用できる。 【００６６】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００６７】本発明のＨＥ ＩＶは、大動脈壁において
脂質およびカルシウムの沈着を阻害し、動脈壁からコレ
ステロールとカルシウムを除去し、変性エラスチンを選
択的に分解し、大動脈壁においてエラスチン繊維生合成
を促進し、血清脂質を低下させ、リポタンパク質の代謝
を改善し得る。これらの能力は、大動脈壁の弾性の回
復、血清脂質異常の改善及び血清リポタンパク質代謝の
改善をもたらし、これらはすべて大動脈のコレステロー
ル障壁の減少に役立つものである。 【００６８】その遺伝的に操作された産物は、エラスタ
ーゼについてヒト膵臓の提供物への依存をなくし、ブタ
エラスターゼの使用による抗体の形成とアナフィラキシ
ーの可能性を回避できる。 【００６９】本発明のＨＥ ＩＶポリペプチドはまた、
生物工業的応用性をも有する。即ちこの酵素は洗濯洗剤
にも使用し得る。 【００７０】本発明はまた、本発明ポリペプチドのアン
タゴニスト分子、及びこのポリペプチドの機能を減少さ
せ又は失くすことにおけるその使用に関する。 【００７１】アンタゴニストの例は、抗体、又は場合に
よっては、このポリペプチドに結合するオリゴヌクレオ
チドである。あるいは、本発明ポリペプチドが本来結合
するような基質に結合する、本発明のポリペプチドに対
するアンタゴニストが使用し得る。そのアンタゴニスト
は、その天然のタンパク質の基質を認識して結合する
が、そのポリペプチドの不活性な型であって、それは基
質部位がブロックされるためにエラスターゼＩＶの作用
を阻害するような、非常に密接に関連したタンパク質で
ある。 【００７２】阻害剤の例としては、アンチセンス法を用
いて製造されるアンチセンス構築物がある。アンチセン
ス法は、３重らせん形成又はアンチセンスＤＮＡ若しく
はＲＮＡにより遺伝子発現の制御に使用でき、その方法
のいずれもＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結
合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分を
用いて、約１０から４０塩基対の長さのアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドを、転写に関与する遺伝子の領域に対して相補
的になるように設計し［３重らせん−Leeら，Nucl. Aci
ds Res.，6：3073（1979）；Cooneyら，Science，241；
456,（1988）；及びDervanら，Science，251；1360，
（1991）参照］、これにより転写とエラスターゼＩＶの
産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドは、インビボでｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮ
Ａ分子のエラスターゼＩＶへの翻訳をブロックする［ア
ンチセンス−Ｏkanoら，J．Neurochem.，56；560,（199
1）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors
of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL（19
88）］。上記のオリゴネクレオチドを細胞に移入して、
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させ
得、エラスターゼＩＶの産生を阻害することもできる。 【００７３】阻害剤の別の例は、ポリペプチドの触媒部
位に結合して占拠することにより、触媒部位が、基質に
接近できないようにし、正常な生物学的活性を阻害する
小さな分子である。小さな分子の例には、小さなペプチ
ド又はペプチド様分子が含まれるがこれに限られない。 【００７４】アンタゴニストは、炎症、関節炎、例えば
慢性関節リウマチおよび変形性関節症、敗血症性ショッ
ク、膵臓炎及び潰瘍における限定的な組織の損傷の処置
に使用し得る。このアンタゴニストは、例えば上記の薬
学的に許容し得る担体とともに組成物として使用し得
る。 【００７５】本発明はまた、ＨＥ ＩＶに特異的なアン
タゴニスト候補物を同定するためのアッセイに関する。
このようなアッセイの１つの例では、精製したＨＥ Ｉ
Ｖとアンタゴニスト／阻害剤候補物を、競合アッセイの
ための適当な条件下、エラスチンの存在下で混合する。
エラスチンは、ＨＥ ＩＶにより分解されたエラスチン
分子の数を測定してアンタゴニスト候補物の有効性を決
定できる様に放射能等により標識できる。 【００７６】本発明のポリペプチド及びアンタゴニスト
は、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することがで
きる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプ
チド又はアンタゴニスト、および薬学上許容され得る担
体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、こ
れに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤
は、投与方法に適合すべきである。 【００７７】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器には、製薬学的または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定
された形の表示を付してもよく、この表示は、ヒトへの
投与のための製造、使用または販売の、該当局による承
認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド又はアンタ
ゴニストは、他の治療化合物と共に使用することができ
る。 【００７８】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、
便利な方法で投与することができる。エラスターゼＩＶ
はまた、エラスターゼの欠損を矯正するために経口で投
与してもよい。ＨＥ ＩＶの投与量及び投与レジメ及び
患者への投与は、投与の形態、処置される状態の性質、
処方する医者の判断等の多くの因子に依存し得る。一般
的に言えば、例えば、１日当たり、少なくとも約１０μ
g／ｋg（体重）の治療上効果的な用量を投与し、たいて
いの場合、約８mg／kg(体重)を超えない量で投与される
であろう。好ましくは、投与経路および症状等を考慮に
入れて、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体
重)である。 【００７９】該ポリペプチド又はポリペプチドであるア
ンタゴニストはまた、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれ
る、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現に
より、本発明に従って使用してよい。 【００８０】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボ（ex vivo）においてＨＥ ＩＶをコードするポリ
ヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作
した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。その
ような方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本
発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウ
イルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知
の方法により操作することができる。 【００８１】同様に、例えば、当該技術分野で既知の方
法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のため
に、細胞をインビボにおいて操作することができる。当
該技術分野において知られているように、細胞をインビ
ボにおいて処理してポリペプチドをインビボにおいて発
現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲ
ＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するためのプロデ
ューサー細胞を患者に投与することができる。そのよう
な方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこ
れらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現
ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当
な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにお
いて操作するために使用することができるアデノウイル
スであってもよい。 【００８２】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００８３】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r）ら、Ｂiotechniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−
９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター
（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏ
ｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物
細胞のプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれ
る）が含まれる。使用されてよい他のウイルスプロモー
ターは、以下に限るものではないが、アデノウイルスプ
ロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターお
よびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切な
プロモーターの選択は、本明細書中の教示から当業者に
は明らかであろう。 【００８４】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００８５】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクショ
ンしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るも
のではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−
ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−
Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋
ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ（ミラー、
Ｈuman Ｇene Ｔherapy、Ｖol．１、５−１４頁（１９
９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引用す
る）。該ベクターは当該技術分野において公知の方法に
よりパッケージング細胞を形質導入する。このような方
法には、以下に限るものではないが、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、ＣａＰＯ４沈降が含まれ
る。１つの別法として、該レトロウイルスプラスミドベ
クターはリポソーム中にカプセル化して入れられてよ
く、または脂質と結合され、ついで宿主に投与されてよ
い。 【００８６】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はインビトロであれインビボであれ、真核生物細
胞を形質導入するため使用してよい。形質導入した真核
生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現
するであろう。形質導入されてよい真核生物細胞には、
以下に限られるものではないが、胎児幹細胞、胎児癌細
胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細
胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれ
る。 【００８７】本発明はまた、診断用として本発明の遺伝
子を使用することにも関する。該遺伝子の変異形態の検
出により、本発明のポリペプチドの過少発現による疾患
の診断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろう。 【００８８】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細
胞から得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用しても
よいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎatur
e、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素
的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、核酸に相補
的なＰＣＲプライマーは変異を同定し分析するのに使用
することができる。例えば、欠失および挿入は、通常の
遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変化
によって検出することができる。点突然変異は、増幅し
たＤＮＡを放射性標識したＲＮＡまたは別法として放射
性標識したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさ
せることによって同定することができる。完全にマッチ
した配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるかまたは融点にお
ける差異によってミスマッチの二本鎖から区別すること
ができる。 【００８９】参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列
の相違は、直接ＤＮＡシークエンシング方法によって明
らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡ
セグメントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプロー
ブとして使用してよい。この方法の感度はＰＣＲと組み
合わされると非常に増強される。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣ
Ｒによって生成した一本鎖鋳型分子とともに使用され
る。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチドによる
従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手
法によって行われる。 【００９０】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって
行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high
resolution）ゲル電気泳動によって可視化することが
できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断片
が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個
の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配
ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（Ｍyers）
ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。 【００９１】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。 【００９２】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ハ
イブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、
直接ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例
えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮ
Ａのサザンブロットなどの方法により行われてよい。 【００９３】一層従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシー
クエンシングに加えて、変異はまたイン・サイチュ分析
により検出することができる。 【００９４】本発明はまた、多様な組織において本発明
のポリペプチドの改変レベルを検出する診断アッセイに
も関する。宿主由来のサンプルにおける本発明のポリペ
プチドのレベルを検出するのに使用するアッセイは当業
者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結
合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくは
ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイは
最初に、ＨＥ ＩＶ抗原に特異的な抗体、好ましくはモ
ノクローナル抗体を調製することを含む。加えて、リポ
ーター抗体が、該モノクローナル抗体に対して調製され
る。リポーター抗体には放射線、蛍光またはこの例にお
いては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素など検出可能な
試薬が付着される。ついでサンプルを宿主から除去し、
該サンプル中のタンパク質を結合する固相支持体（例え
ばポリスチレンディッシュ）上でインキュベートする。
ついで、該ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位をウ
シ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質でインキュ
ベートすることによりカバーする。ついで、該モノクロ
ーナル抗体を該ディッシュでインキュベートすると、そ
の間に該モノクローナル抗体は、該ポリスチレンディッ
シュに付着したＨＥＩＶタンパク質に付着する。すべて
の結合していないモノクローナル抗体をバッファーで洗
い落とす。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポ
ーター抗体を今度はディッシュに置くと、ＨＥ ＩＶに
結合したモノクローナル抗体に該リポーター抗体が結合
することになる。ついで、付着していないリポーター抗
体を洗い落とす。ついで、ペルオキシダーゼ基質を該デ
ィッシュに添加し、所定の時間における発色量は、標準
カーブに比較して、患者のサンプルの所定量中に存在す
る本発明のポリペプチドの量の測定となる。 【００９５】本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固
相支持体に付着させ、標識したＨＥＩＶおよび宿主から
得たサンプルを該固相支持体に通し、ついで該固相支持
体に付着した標識の検出量を該サンプルにおける本発明
のポリペプチドの量に相関させることができる、競合ア
ッセイを使用してよい。 【００９６】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づ
いた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマー
クするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮ
Ａの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連
遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００９７】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子
の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲ
ノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプラ
イマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なも
のとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト
染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン
グに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む
ハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろ
う。 【００９８】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマップするのに同様に利用す
ることができる他のマッピング方法には、イン・サイチ
ュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
セレクションが含まれる。 【００９９】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程
で与えることができる。この技術は、少なくとも５０ま
たは６０塩基を有するｃＤＮＡで利用することができ
る。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒュー
マン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・
マニュアル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanua
l of Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐerg
amon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【０１００】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheri
tance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシ
ティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns
Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を
介してオンラインで利用できる)に見い出される。つい
で、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患と
の間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺
伝(coinheritance))によって確認する。 【０１０１】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。 【０１０２】現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。 【０１０３】ポリペプチド、それらの断片もしくは他の
誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発
現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗
体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さ
らにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブ
ラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々
な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用する
ことができる。 【０１０４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天
然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用す
ることができる。次いで、そのような抗体を使用して、
そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単
離することができる。 【０１０５】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilste
in）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、
トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔ
oday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造
するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）
ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・ア
ンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodie
s and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール．リス、イ
ンク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁におい
て)が含まれる。 【０１０６】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産生物に対するヒト化抗体を発
現するのに使用してよい。 【０１０７】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に
限定されないことを理解すべきである。部または量は全
て、特にことわらない限り、重量単位である。 【０１０８】以下の実施例の理解を容易にするために、
幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載
する。 【０１０９】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されている
か、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当該技術分野で公知であって、当業者に明らか
であろう。 【０１１０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。
プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的に
は、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μgを２
０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適
当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されてい
る。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常
利用されるが、供給者の指示に従って変えることができ
る。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直
接電気泳動して、所望の断片を単離する。 【０１１１】開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル
（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic ＡcidsＲes.、８：４０
５７（１９８０）により記載されている８％ ポリアク
リルアミドゲルを用いて行う。 【０１１２】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示
す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を
有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰとともに
リン酸を加えることなしには、別のオリゴヌクレオチド
にライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチド
は、脱リン酸化されていない断片にライゲーションする
であろう。 【０１１３】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう
(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４６頁)。
特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲート
させるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既
知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。 【０１１４】特にことわらない限り、形質転換は、グラ
ハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン・デル・エブ（Ｖan
der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１
９７３）の方法に記載されているようにして行った。 【０１１５】 【実施例】実施例 １ ＨＥ ＩＶの細菌での発現および精製 最初に、ＨＥ ＩＶをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
第７５７５１号を、処理した（processed）ＨＥ ＩＶタ
ンパク質の５'および配列(シグナル及び活性化ペプチド
配列なし)およびＨＥ ＩＶ遺伝子の３’末端のタンパ
ク質の配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを利用して増幅する。５'オリゴヌクレオチドプラ
イマーは、配列：５’ ＧＣＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴ
ＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＣ ３’（配列
番号：３）を有し、該配列はＳalＩ制限酵素部位、続い
て、２１ヌクレオチドの、処理したタンパク質コドンの
推定末端アミノ酸から開始するＨＥ ＩＶコーディング
配列を含む。３'オリゴヌクレオチドプライマー５’
ＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴ
ＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＴ ３’（配列番号：４）は、Ｘ
baＩ制限酵素部位に対する相補的配列を含み、およびＨ
Ｅ ＩＶ配列の２４ヌクレオチドが続く。これら制限酵
素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−９(キアゲン、イ
ンク． ９２５９イ−トン・アベニュ−（Ｅton Ａvenu
e）、チャッツワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニ
ア、９１３１１)上の制限酵素部位と調和する。pＱＥ−
９は、抗生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始点(or
i)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター
(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグ
（tag）および制限酵素部位をコードする。次いで、pＱ
Ｅ−９をＳalＩおよびＸbaＩで消化する。増幅された配
列を、ＳalＩおよびＸbaＩで消化した後にpＱＥ−９に
ライゲートして、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコード
する配列と枠内で（in frame）挿入する（第３図参
照）。ついで、そのライゲーション混合物を使用して、
Ｑｉａｇｅｎ社から、商標 Ｍ15／rep 4として入手可
能な大腸菌株を、サンブルックら、モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・
スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）に記
載の手順に従って形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はプ
ラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピ−を含んでおり、lac
Ｉリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋan'）
も与える。形質転換体を、それらがＬＢプレートで増殖
する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン
耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し
て、制限分析により確認した。所望の構築物を含むコロ
ニーを、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方
を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ
／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を
１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞を、
０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)まで増殖
させた。ついで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド)を、最終濃度が１mＭとなるまで
加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化す
ることにより、ＨＥ ＩＶ遺伝子を誘発し、Ｐ／Ｏを遺
伝子発現の増加へと導かせる。細胞をさらに３〜４時間
増殖させた。ついで、細胞を遠心分離により収集した。
細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニ
ジンＨＣl中で可溶化する。清澄後、この溶液から、６
−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を
可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロ
マトグラフィーにより、可溶化したＨＥ ＩＶを精製し
た。ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatograph
y ４１１：１７７−１８４（１９８４）。６モルのグ
アニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミ
リモルのグルタチオン(還元型)および２ミリモルのグル
タチオン(酸化型)でカラムからＨＥ ＩＶを溶出する。
この溶液中で１２時間インキュベーションした後、この
タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析し
た。 【０１１６】実施例 ２ インビトロ転写及び翻訳によるＨＥ ＩＶの発現 ＨＥ ＩＶのインビトロ転写及び翻訳は、ＴＮＴ結合網
状赤血球リゼート系（Promega，2800 Woods Hollow Roa
d，Madison，WI 53771−5399）を用いて行った。ＨＥ
ＩＶをコードするｃＤＮＡ、ＡＴＣＣ受託番号第７５７
５１号を、遺伝子の５'末端を決めているＥcoＲＩ部位
と遺伝子の３'末端を決めているＸhoＩ部位で、ＥcoＲ
ＩからＸhoＩの方向へクローニングした。この遺伝子を
Ｔ３ディレクション（direction）に挿入した。Ｔ３
は、特定のプロモーターを認識するバクテリオファージ
ＲＮＡポリメラーゼを定義し、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写
する。ウサギ網状赤血球リゼートにはＴ３ＲＮＡポリメ
ラーゼが添加されており、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを情
報の転写のために利用し、網状赤血球リゼートを未成熟
ＲＮＡへの翻訳のために利用してＴ３プロモーターでタ
ンパク質の発現を指令する。ＨＥ ＩＶ ＤＮＡを含むプ
ラスミド １μgを網状赤血球リゼート、Ｔ３ＲＮＡポリ
メラーゼ及び［３５Ｓ］−メチオニンとともに３０℃で
１時間インキュベートした。インキュベートした後、転
写産物を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により
分離した。このゲルを１０％酢酸、１５％メタノール中
で３０分間固定した後、Ｂｉｏ-Ｒａｄゲルドライヤー
により１時間乾燥した。コダック社ＸＡＲフィルムでオ
ートラジオグラフィーを行った。このフィルムを増感ス
クリーンにより−８０℃で感光させた。 【０１１７】実施例３ ヒト組織におけるＨＥ ＩＶの発現パターン ヒト組織におけるＨＥ ＩＶの発現のレベルを調べるた
めノーザンブロット分析を行った。総細胞ＲＮＡサンプ
ルをＲＮＡｚｏｌＴＭＢシステム（バイオテックス・ラ
ボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratories，Ｉn
c.）６０２３ サウス・ループ・イースト（Ｓouth Ｌoo
p Ｅast）、ヒューストン、テキサス７７０３３）によ
り単離した。特定の各ヒト組織から単離した総ＲＮＡの
約１０μgを１％ アガロースゲル上で分離し、ナイロン
フィルターにブロットした（サンブルック、フリッチュ
およびマニアチス、モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハ
ーバー・プレス、（１９８９））。該標識反応は、５０
ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム−イ
ット キットに従って行った。標識したＤＮＡをＳelect
−Ｇ−５０カラムで精製した。（５ プライム−３ プラ
イム、インク、５６０３ アラパホ・ロード、ブルダ
ー、コロラド ８０３０３）。ついで、フィルターを放
射性標識した全長ＨＥ ＩＶ遺伝子と０.５Ｍ ＮａＰＯ
４、ｐＨ７.４および７％ ＳＤＳ中で１,０００,０００
ｃｐｍ／ｍｌで６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。室
温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルターを増感スクリ
ーンで−７０℃で一晩感光した。ＨＥ ＩＶに対するメ
ッセンジャーＲＮＡは膵臓においてのみ豊富に存在す
る。 【０１１８】実施例４ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分離する。
その組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
を上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ
１２ media）を添加する。ついでこれを３７℃で約１週
間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加し
引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養に線
維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理し
ついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【０１１９】モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲによ
りフランキングされたｐＭＶ−７（キルシュメイエル
（Ｋirschmeier）ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９
８８））をＥco ＲＩおよびＨind IIIで消化し、続いて
仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをア
ガロースゲル上で分画化し、ガラスビーズを使用して精
製する。 【０１２０】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａをそれぞれ５'端および３'端配列に対応するＰＣＲプ
ライマーを使用して増幅する。５'端プライマーはＥco
ＲＩ部位を含み３'プライマーはさらにＨind III部位を
含む。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格および増
幅したＥco ＲＩ−Ｈind III断片の等量をＴ４ ＤＮＡ
リガーゼの存在下で一緒に添加する。得られた混合物を
２つの断片のライゲーションに適した条件下で維持す
る。ライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１を形質転換
するのに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に
挿入された遺伝子を有することを確認するためカナマイ
シン含有アガー上に播種する。 【０１２１】アンホトロピックｐＡ３１７またはＧｐ＋
ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有す
るダルベッコ改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodifie
d Ｅagles Ｍedium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になる
まで組織培養にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶ
ベクターをついで培地に添加し、パッケージング細胞を
該ベクターで形質導入する。今度はパッケージング細胞
は、該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パ
ッケージング細胞を以後、プロデューサー細胞とい
う）。 【０１２２】新しい培地を形質導入したプロデューサー
細胞に添加し、引き続き培地を１０ｃｍプレート全面の
プロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子
を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで濾過
して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついでこの
培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線
維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデューサ
ー細胞からの培地とすばやく取り替える。この培地を除
去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価が高い場
合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一切
必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、ｎｅｏま
たはｈｉｓなどの選択可能なマーカーを有するレトロウ
イルスベクターを使用する必要がある。 【０１２３】操作された線維芽細胞を、単独またはサイ
トデックス３ミクロキャリアビーズ（cytodex 3 microc
arrier beads）上全面に増殖した後に、宿主に注入す
る。該線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。 【０１２４】先の教示から見て、本発明の多数の変更お
よび変化が可能であることから、追記する請求の範囲内
で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができ
る。 【０１２５】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：８０７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 【表１】 配列番号：２ 配列の長さ：２６８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 【表２】

【図面の簡単な説明】 【図１】 ＨＥ ＩＶのｃＮＤＡ配列および対応する推
定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な１文
字略号を使用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/547 (72)発明者 ジョン・エム・グリーン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザースバーグ、ダイアモンド・ドライブ 872番 (72)発明者 マーク・ディ・アダムス アメリカ合衆国20997メリーランド州ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 HA14 4B050 CC03 DD11 FF14E LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ42 QR32 QR48 QR51 QR55 QR77 QS33 QS34 QS36 QX01 QX07 4C084 AA02 BA44 DC03 ZA442 ZC192 ZC332 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA74 GA26

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 明細書に記載されたいずれかの発明。