CN102533440B - 用酶使油脱胶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了食用油的酶脱胶方法，包括用脂质酰基转移酶处理该食用油，从而将酰基基团从大部分磷脂转移到一种或多种酰基受体，其中所述酰基受体是一种或多种固醇和/或甾烷醇。当该酰基受体是固醇和/或甾烷醇时，会形成酯。用于本发明方法的脂类酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示的一种或多种：SEQ ID No 1，SEQ ID No 3，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 8，SEQ ID No 9，SEQ ID No 10，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ ID No 14或SEQ ID No 15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17，SEQ ID No 18，SEQ ID No 36，SEQ ID No 38，SEQ ID No 40，SEQ ID No 41，SEQ ID No 45，SEQ ID No 47，SEQ ID No 50。还教导了一种新型脂类酰基转移酶，其具有SEQ ID No 16所示氨基酸序列。本发明还涉及由本发明的酶脱胶方法获得的食用油。

Description

用酶使油脱胶的方法

本申请是申请日为2005年7月18日，题为“用酶使油脱胶的方法”的中国专利申请200580023982.5号的分案申请。

相关申请

本申请参考了以下相关申请：1999年7月20日提交的美国申请序列号09/750,990，美国申请序请号10/409,391，WO2004/064537，WO2004/064987，PCT/IB2004/004378和PCT/IB2004/004374。每一篇申请和这些申请的每一篇中引用的每个文献(申请引用的文献)，每一篇本发明所参考和引用的每篇文献，无论在文本中或者在那些申请的诉讼(prosecution)过程中，以及在这些诉讼过程中提出的所有支持专利性的论证，都包含在本文中作为参考。本文文本也引用了各种文件(“本文引用的文件”)。每一篇“本文引用文件”和每一篇在“本文所引用文件”中引用或者参考的文献都并入本文中作为参考。

发明领域

本发明涉及使用脂质酰基转移酶(lipid acyltransferase)通过酶促反应使食用油油脱胶的方法。

本发明进一步涉及一种或多种脂质酰基转移酶。

本发明进一步涉及脂质酰基转移酶用于脱胶食用油油的应用。

技术背景

传统上有两种方法用于油类的脱胶，是物理脱胶和化学脱胶方法。在1990年代基于胰腺磷脂酶(pancreatic phospholipase)的使用出现了酶脱胶方法。由于该酶按犹太教规不是清洁可食的(non-kosher)，所以该磷脂酶最后由微生物的磷脂酶A1(LecitaseUltra^TM-Novozymes，丹麦)代替。与化学或物理脱胶方法相比，酶方法具有若干优点，包括成本节省，产率更高，更环保。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种使用如本文定义的脂质酰基转移酶对植物油或食用油进行酶脱胶的方法。

本发明还提供一种植物油或食用油的酶脱胶方法，其包括用本发明的脂质酰基转移酶处理食用油或植物油，从而去除大部分的磷脂。

本发明还提供一种植物油或食用油的酶脱胶方法，其包括用本发明的脂质酰基转移酶处理食用油或植物油，从而将来自大部分磷脂的酰基转移到一种或多种酰基受体上，例如转移到一种或多种甾醇(stenol)和/或甾烷醇(stanol)上。

另一方面，本发明提供一种或多种脂质酰基转移酶。

在一个方面，本发明提供脂质酰基转移酶，其包括SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供含有SEQ ID No 16所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或与SEQ ID No.16具有75％或更多，优选85％或更多，更优选90％或更多，还更优选95％或更多，还更优选98％或更多，或还更优选99％或更多同源性的氨基酸序列。

在又一个方面，本发明提供脂质酰基转移酶在食用油脱胶中的应用，用来(i)去除磷脂(例如磷脂酰胆碱)和/或(ii)提高固醇酯和/或甾烷醇酯在油中形成和/或(iii)去除磷脂(例如磷脂酰胆碱)和/或提高固醇酯和/或甾烷醇酯在油中形成，而不会显著增多油中的游离脂肪酸。

优选的方面

用于本发明的脂质酰基转移酶可以是天然脂质酰基转移酶，也可以是变体脂质酰基转移酶。

例如用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是如WO2004/064537或WO2004/064987，或PCT/IB2004/004378或GB0513859.9所述的脂质酰基转移酶。

本文使用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种具有酰基转移酶活性(通常分类为E.C.2.3.1.x)的酶，该酶能够将酰基从脂质转移到一个或多个受体底物，例如以下物质的一种或多种：固醇；甾烷醇；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油；优选固醇和/或甾烷醇。

优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明的方法和/或用途的脂质酰基转移酶能够将酰基从脂质(如本文定义的)转移到一种或多种下述酰基受体底物：固醇或甾烷醇，优选固醇。

在一些方面中，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基(-OH)的任何化合物，例如多价醇类包括甘油、固醇、甾烷醇、碳水化合物；羟基酸包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚基如氨基酸、蛋白质水解物和肽(部分水解的蛋白质)，及其混合物和衍生物。优选地，本发明的“酰基受体”不是水。

优选酰基受体不是甘油单酯。

在一个方面，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶既能够将酰基从脂质转移到固醇和/或甾烷醇，还能够将酰基从脂质转移到下列物质中的一种或多种：碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，甘油。

优选地，本发明脂质酰基转移酶作用的脂质底物是下列脂质中的一种或多种：磷脂例如卵磷脂(lecithin)，如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)。

该脂类底物在此可以被称为“脂质酰基供体”。这里使用的术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。

对于一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。

对于一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。

适宜地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可显示出下列脂酶的活性中的一种或多种：磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)，磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。

适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可将酰基从磷脂转移到固醇和/或甾烷醇。

对于一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可将酰基从磷脂转移到固醇和/或甾烷醇，以形成至少固醇酯和/或甾烷醇酯。

对于一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶不表现三酰甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)，或不表现显著的三酰甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)。

本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可将酰基从脂类转移到固醇和/或甾烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”既可为固醇又可为甾烷醇，或固醇和甾烷醇二者的组合。

优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可用下列标准表征：

(i)该酶具有酰基转移酶活性，该活性可定义为酯转移活性，凭借该活性，脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分被转移到酰基受体以形成新的酯；以及

(ii)该酶含有氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。

优选地，GDSX基序的X是L或Y。更优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选本发明的酶含有氨基酸序列基序GDSL。

GDSX基序由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)脂肪分解酶中与Ser-16相对应的位置，如Brumlik和Buckley(Journal ofBacteriology Apr.1996，Vol.1，No.7，p 2060-2064)的教导。

为确定蛋白质是否具有本发明所述GDSX基序，根据WO2004/064537或WO2004/064987教导的方法，将该序列优选与Pfam数据库中的隐藏markov模型图谱(modelprofile)(HMM图谱)进行比较。

Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括为每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于在新序列中鉴定这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。对Pfam的介绍可见于Bateman A等.(2002)Nucleic Acids Res，30；276-280。隐藏Markov模型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH(2002)BriefBioinform 3；236-245。

http://www.nchi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve& db＝PuhMed&list_uids＝12230032&dopt＝Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list_uids＝11752314&dopt＝Abstract

对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见DurbinR，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4。Hammer软件包可从华盛顿大学(Washington University)，St Louis，USA获得。

可选择地，GDSX基序可以使用Hammer软件包识别，说明由Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilistic models of proteinsand nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其中的参考文献，以及本说明书中提供的HMMER2的资料中提供。

PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问：

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/

数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。然后使用数据库的默认参数，对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的区域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。

优选用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以用Pfam00657共有序列进行比对(详细描述参见WO2004/064537或WO2004/064987)。

优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明的GDSL或GDSX结构域的存在。

优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，用于本发明的方法或用途的脂质酰基转移酶可具有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDSx区(block)、GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶可具有GDSx区和GANDY区。可选择地，所述酶可具有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶至少含有GDSx区。

优选地，GANDY基序的残基选自GANDY，GGNDA，GGNDL，最优选GANDY。

优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，用于本发明方法或用途中的酶与对照嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)多肽序列即SEQ ID No.1比较时具有至少一个，优选一个以上，优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二个以上，优选十三个以上，优选十四个以上下列氨基酸残基：28hid，29hid，30hid，31hid，32gly，33Asp，34Ser，35hid，130hid，131Gly，132hid，133Asn，134Asp，135hid，309His。

Pfam00657GDSX结构域是将具有该区域的蛋白与其它酶区分的独特标识。

Pfam00657共有序列，表示为图12的SEQ ID No.2。这是从Pfam00657家族第6版数据库的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。

共有序列可通过使用新版Pfam数据库来更新(如参见WO2004/064537或WO2004/064987)。

发现来自两个版本(release)的数据库的Pfam00657家族中都存在GDSx区、GANDY区和HPT区。其它版本的pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可用下列标准来表征：

(i)该酶具有转移酰基的活性，其可定义为酯转移活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；

(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S；

该酶包含His-309或包含在对应于嗜水气单胞菌脂肪分解酶的His-309位的组氨酸残基，所述嗜水气单胞菌脂肪分解酶如图11和13所示(SEQ ID No.1或SEQ ID No.3)。

优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。

在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(其为包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)中的His-291。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体：Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图13(SEQ ID No.3)或图11(SEQID No.1)所示的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His-309，等同于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His-291。在图12(SEQ ID No.2)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7，Asp-157和His-348。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：

(i)该酶具有转移酰基的活性，其可定义为酯转移活性，由此将第一脂质酰基供体原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体形成新酯；并且

(ii)该酶包含至少Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图13(SEQ ID No.3)或图11(SEQ ID No.1)所示的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一种或多种。

(i)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图13)

(ii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图14)

(iii)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图15)

(iv)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图16)

(v)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列(见图17)

(vi)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列(见图18)

(vii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列(图9)

(viii)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列(图10)

(ix)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列(图21)

(x)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列(图22)

(xi)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列(图23)

(xii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列(图24)

(xiii)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列(图11)

(xiv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列(图25)或

与SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ IDNo.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ IDNo.13，SEQ ID No.14，SEQ ID No.15所示序列中的任一个具有75％或者更高同一性的氨基酸序列。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含如SEQ ID No.3或如SEQID No.4或SEQ ID No.1或SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或SEQID No.15所示的氨基酸序列具有75％或以上，优选80％或以上，优选85％或以上，优选90％或以上，优选95％或以上同一性的氨基酸序列。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ ID No.14，SEQID No.1，SEQ ID No.15所示序列中的任一个具有80％或以上，优选85％或以上，更优选90％或以上，还更优选95％或以上的同一性。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：

(a)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列；或

(d)与上述(a)-(c)定义的氨基酸序列中的任一个具有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：

(a)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；

(d)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；

(e)如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或

(f)与上述(a)-(e)定义的氨基酸序列中任一个具有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。

在一个方面中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是如EP 1275711中教导的来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶。因此在一个方面用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No.17(图28)或SEQ ID No.18(图29)教导的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

更优选地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No.16所示氨基酸序列的脂质酰基转移酶(图10)，或与SEQ ID No.16具有75％或更多，优选85％或更多，更优选90％或更多，还更优选95％或更多，还更优选98％或更多，还更优选99％或更多同源性的氨基酸序列。该酶可以被认为是变体酶。

在一个方面中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如通过分子进化产生的变体)。

合适的LCAT是本领域公知的，并可从下列一种或多种生物体中得到，例如：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸟(chickens)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物，包括拟南芥(Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫、真菌和酵母。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为可从并优选从含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10中获得，该菌株由Langebrogade l，DK-1001 Copenhagen K，Denmark的Danisco A/S，根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Buddapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the purpose of PatentProcedure)在2003年12月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业、海洋和食品细菌保藏中心(NCIMB)(the National Collection of Industrial，Marine and FoodBacteria(NCIMB)23St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，登录号分别为NCIMB41204和NCIMB 41205。

高度优选用于本发明方法的脂质酰基转移酶包括分离自气单胞菌属(Aeromonasspp.)，优选嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选杀鲑气单胞菌。最优选用于本发明的脂质酰基转移酶由SEQ ID Nos 1，3，4，15，16编码。本领域技术人员公知优选该酰基转移酶的信号肽在转移酶表达过程中被切割。SEQ ID 1，3，4，15和16的信号肽是氨基酸1-18。因此对于SEQ ID No 1和SEQ ID No 3(嗜水气单胞菌)最优选的区域是氨基酸19-335，对于SEQ IDNo 4，SEQ ID No 15和SEQ ID No 16(杀鲑气单胞菌)最优选的区域是19-336。当用于测定氨基酸序列的同一性的同源性时，优选如本文所述使用成熟序列进行比对。

因此用于测定同源性(同一性)时，对于SEQ ID No 1和3(嗜水气单胞菌)最优选的区域是氨基酸19-335，对于SEQ ID No 4，15和16(杀鲑气单胞菌)最优选的区域是19-336。SEQ ID 34和35是高度优选的、分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白质序列。

用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自Thermobifida，优选T.fusca，最优选由SEQ ID No 28编码。

用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自链霉菌属(Streptomyces)，优选S.avermitis，最优选由SEQ ID No.32编码。其它可用于本发明的酶来自链霉菌属，包括由SEQ ID Nos 5，6，9，10，11，12，13，14，31，33编码的那些。实施例表明由SEQ ID No.33编码的酶在酶脱胶过程中非常有效。

用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自棒杆菌属(Cornebacterium)，优选C.efficiens，最优选由SEQ ID No.29编码。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是含有如下序列的脂质酰基转移酶：如SEQ ID Nos 37，38，40，41，43，45，或47所示氨基酸序列中的任一个，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同源性的氨基酸序列，或由SEQID Nos 36，39，42，44，46，或48所示核苷酸序列中的任一个或者与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同源性的核苷酸序列编码。

优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能水解至少半乳糖脂和/或能将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶可从，优选从链霉菌属菌种获得。

在一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶优选为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶是由选自下组的核酸编码：

a)含有SEQ ID No.36所示核苷酸序列的核酸；

b)依据遗传密码简并性与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和

c)含有与SEQ ID No.36所示核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶优选为含有SEQ IDNo.37所示氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

在另一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶优选为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少另一半乳糖脂转移到另一或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶含有SEQ ID No.37所示氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列。

优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中所述酶可从，优选从thermobifida菌种，优选Thermobifida fusca获得。

优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中所述酶可从，优选获自棒杆菌菌种，优选Corynebacterium efficiens。

在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有如下序列的脂质酰基转移酶：如SEQ ID Nos 37，38，40，41，43，45或47所示氨基酸序列中的任一个，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID Nos 39，42，44，46或48所示核苷酸序列中的任一个或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的核苷酸序列编码。

在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为用于本文所述用途的含有SEQ ID No 38，40，41，45或47所示氨基酸序列中的任一个或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为用于本文所述用途的含有SEQ ID No 38，40，或47所示氨基酸序列中的任一个或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

更优选在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No.47所示氨基酸序列或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ IDNo.43或44所示氨基酸序列或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ IDNo.41所示氨基酸序列或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。

在一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶可为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶可由选自下组的核酸编码：

a)含有SEQ ID No.36所示核苷酸序列的核酸；

b)依据遗传密码简并性与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和

c)含有与SEQ ID No.36所示核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。

在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶是可从，优选从链霉菌属菌株L130或L131获得的脂质酰基转移酶，该菌株由Langebrogade l，DK-1001Copenhagen K，Denmark的Danisco A/S，根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(theBuddapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the purpose of Patent Procedure)在2004年6月23日保藏于国立工业、海洋和食品微生物保藏中心(NCIMB)(23St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，登录号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。

适用于本发明和/或本发明所述方法的脂质酰基转移酶可以包含下列氨基酸序列中的任一个和/或由下列核苷酸序列编码：

编码本发明脂质酰基转移酶的多核苷酸(SEQ ID No 16)；

本发明的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No 17)；

适用于本发明方法的脂质酰基转移酶还可通过使用采用默认设定的Align X，VectorNTI的Clustal W配对比对算法与L131(SEQ ID No.37)序列进行比对而鉴定。

L131和来自除虫链霉菌(S.avermitilis)和T.fusca的同源物的比对说明了GDSx基序(在L131和除虫链霉菌和T.fusca中的GDSY)，GANDY盒，其为GGNDA或GGNDL，以及HPT区(认为是保守的催化组氨酸(histadine))的保守性。这些三个保守区在图61中突出显示。

当与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No 37)比对时，可以鉴定三个保守区域，GDSx区，GANDY区和HTP区(进一步详述参见WO04/064987)。

当与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No 37)比对时，

i)本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法的脂质酰基转移酶，优选具有GDSx基序，更优选GDSx基序选自GDSL或GDSY基序。

和/或

ii)本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法的脂质酰基转移酶，优选具有GANDY区，更优选GANDY区含有氨基GGNDx，更优选GGNDA或GGNDL。

和/或

iii)本发明的酶或用于本发明方法的酶具有优选的HTP区。

并优选地

本发明的或用于本发明方法的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶优选具有GDSx或GDSY基序，及含有氨基GGNDx的GANDY区，优选GGNDA或GGNDL，及HTP区(保守组氨酸)。

合适地，当用于本发明方法或用途的脂质酰基转移酶可为变体脂质酰基转移酶，在这样情况下该酶的特征在于所述的酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T， N，M或S，其中该变体酶与亲本序列相比较，在组2或组4或组6或组7(在下文定义)中定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰。

例如，用于本发明方法或用途的脂质酰基转移酶变体的特征可在于：该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S，并且其中所述变体酶与亲本序列相比，在组2或组4或组6或组7(在下文定义)中详述的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰通过将所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型进行比对来鉴定，其优选通过将P10480的晶体结构坐标与本文教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB进行结构比对来获得。

在进一步的实施方案中，用于本发明方法或用途的变体脂质酰基转移酶的特征可在于该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S，并且其中所述变体酶与亲本序列相比，在组2教导中的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQID No.2-图12)进行对比时被鉴定并且根据P10480的结构模型来修饰以保证最优拟合重叠(best fit overlap)(参见图30)，如本文所述。

合适地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID No.34，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQID No.19，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ ID No.14，SEQID No.1，SEQ ID No.15，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ ID No.28，SEQID No.29，SEQ ID No.30，，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.33所示，除了在组2或组4或组6或组7(在下文定义)中定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰通过与SEQ ID No.34进行序列比对来鉴定。

可选地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID No.34，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQID No.19，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ ID No.14，SEQID No.1，SEQ ID No.15，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ ID No.28，SEQID No.29，SEQ ID No.30，，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.33所示，除了在组2或组4或组6或组7定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰通过将所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型进行结构比对来鉴定，其优选地通过将P10480晶体结构坐标与如本文教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB进行结构比对而获得。

可选择地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ IDNo.34，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ IDNo.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.19，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ IDNo.14，SEQ ID No.1，SEQ ID No.15，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ IDNo.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.33所示，除了在组2教导的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2)进行对比时被鉴定，并且根据P10480的结构模型来修饰以保证最优拟合重叠(参见图30)，如在下文所教导的。

本文所用术语“修饰”指添加，取代和/或缺失。优选术语“修饰”指“取代”。

为了免除怀疑，当亲本酶中的氨基酸被取代时，优选用与亲本酶中该位置初始存在的氨基酸不同的氨基酸进行取代，由此产生变体酶。换句话说，术语“取代”的意思不包括用同样的氨基酸进行氨基酸替换。

优选地，该亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列的酶。

优选地，该变体酶是包含氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQID No.35所示，除了在组2或组4或组6或组7中定义的任何一个或多个氨基酸残基处的一种或多种氨基酸修饰。

在一个实施方案中，优选该变体酶与亲本序列相比在组4中定义的至少一个氨基酸残基处包含一种或多种氨基酸修饰。

合适地，与亲本酶相比较，该酶变体包含一种或多种下述氨基酸修饰：

S3E，A，G，K，M，Y，R，P，N，T或G

E309Q，R或A，优选Q或R

-318Y，H，S或Y，优选Y。

优选地，GDSX基序的X是L。所以，优选亲本酶包含氨基酸基序GDSL。

优选地，制备脂质酰基转移酶变体的方法进一步包含下述的一个或多个步骤：

1)结构同源性作图或

2)序列同源性比对。

合适地，结构同源性作图可包括下述的一个或多个步骤：

i)将亲本序列与图46所示的结构模型(1IVN.PDB)进行比对；

ii)在活性位点上以甘油分子的中心碳原子为圆心在范围内选择一个或多个氨基酸残基(参见图47)(例如在组1或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；和

iii)在亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，所选择的氨基酸残基可位于活性位点中以甘油分子的中心碳原子为圆心的以内，优选在8，7，6，5，4，或范围以内(参见图47)。

合适地，结构同源性作图可包括下述的一个或多个步骤：

i)将亲本序列与图46所示的结构模型(1IVN.PDB)进行比对；

ii)在活性位点上以甘油分子的中心碳原子为圆心在范围内选择一个或多个氨基酸残基(参见图47)(例如在组1或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；和

iii)确定根据步骤(ii)所选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的(具体为是否是活性位点残基和/或部分GSDx基序和/或部分GANDY基序)；以及

iv)在所述亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸，其不包括根据步骤(iii)鉴定的保守区域。

在一个实施方案中，选择的氨基酸残基可以位于以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的以内，优选8，7，6，5，4或范围以内(参见图47)。

二中择一地，或与上述的结构同源性作图相结合，结构同源性作图可如下进行：选择来源于pfam比对(比对2，图48)用P10480模型及1IVN覆盖的特异性环状区(LRs)或插入区(IVRs)。下面表中定义了环状区(LRs)或插入区(IVRs)：

	P10480氨基酸位点(SEQ ID No 34)
		IVR1	1-19
环1(LR1)	20-41
		IVR2	42-76
环2(LR2)	77-89
		IVR3	90-117
环3(LR3)	118-127
		IVR4	128-145

环4(LR4)	146-176
		IVR5	177-207
环5(LR5)	208-287
		IVR6	288-317

在本发明的一些实施方案中，用于本发明方法及用途的变体酰基转移酶不仅在组1-4及6-7中的任一组中定义的一个或多个氨基酸处含有氨基酸修饰，而且在上述定义的一个或多个插入区(IVR1-6)中(优选在IVRs 3，5和6，更优选在IVR 5或IVR 6中)和/或在上述定义的一个或多个环状区(LR1-5)中(优选在LR1，LR2或LR5，更优选在LR5中)含有至少一个氨基酸修饰。

在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅由组2，4，6和7中的一个或多个组定义，而且位于IVRs 1-6中的一个或多个之内(优选位于IVR 3，5或6之内，更优选位于IVR 5或IVR 6之内)，或位于LRs 1-5中的一个或多个之内(优选位于LR1，LR2或LR5以内，更优选位于LR5以内)。

合适地，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅在组1或2内，而且位于IVR 3之内。

合适地，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅在组1或2内，而且位于IVR 5之内。

合适地，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅在组1或2内，而且位于IVR 6之内。

合适地，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅在组1或2内，而且位于LR 1之内。

合适地，用于本发明方法和用途的变体酰基转移酶可包含一个或多个氨基酸修饰，该修饰不仅在组1或2内，而且位于LR 2之内。

同样地，在本发明的一些实施方案中，用于本发明方法及用途的变体酰基转移酶不仅在一个或多个氨基酸残基处含有氨基酸修饰，其中该氨基酸残基位于以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的以内，优选9，8，76，5，4，或范围以内，而且在上述定义的一个或多个插入区(IVR1-6)中(优选在IVRs 3，5和6中的一个或多个，更优选在IVR 5或IVR 6中)和/或上述定义的一个或多个环状区(LR1-5)中(优选在LR1，LR2或LR5中的一个或多个，更优选在LR5中)含有至少一个氨基酸修饰。

在一个实施方案中，优选该氨基酸修饰位于存在于范围内并且也在LR5之内的一个或多个氨基酸残基。

因此，该结构同源性作图可包含下列一个或多个步骤：

i)将亲本序列与图46所示结构模型(1IVN.PDB)进行比对；

ii)在以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的范围之内(参见图47)选择一个或多个氨基酸残基(例如在组1或组2定义的一个或多个氨基酸残基)；和/或在IVR1-6之内选择一个或多个氨基酸残基)(优选在IVR 3，5或6之内，更优选在IVR 5或IVR 6之内)；和/或在LR1-5之内选择一个或多个氨基酸残基(优选在LR1，LR2或LR5之内，更优选在LR5之内)；和

iii)在所述亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，选择的氨基酸残基可以位于以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的范围以内，优选8，7，6，5，4或范围以内(参见图47)。

合适地，该结构同源性作图可包含下列一个或多个步骤：

i)将亲本序列与图46所示结构模型(1IVN.PDB)进行比对；

ii)在以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的范围之内(参见图47)选择一个或多个氨基酸残基(例如组1或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；和/或在IVR1-6之内选择一个或多个氨基酸残基(优选在IVR 3，5或6之内，更优选在IVR 5或IVR 6之内)；和/或在LR1-5之内选择一个或多个氨基酸残基(优选在LR1，LR2或LR5之内，更优选在LR5之内)；

iii)测定根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸残基是否高度保守(尤其是否是活性位点残基和/或部分GDSx基序和/或部分GANDY基序)；和

在所述亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸，其不包括根据步骤(iii)鉴定的保守区域。

合适地，在上面所述方法中选择的一个或多个氨基酸不仅位于以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的范围之内(参见图47)(例如组1或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；并且位于IVR1-6中的一个或多个之内(优选在IVR 3，5或6之内，更优选在IVR5或IVR6之内)或位于LR1-5中的一个或多个之内(优选在LR1，LR2或LR5之内，更优选在LR5之内)。

在一个实施方案中，优选所述一个或多个氨基酸修饰在LR5之内。当情况是所述一个(或多个)修饰在LR5之内时，所述修饰不是组5中定义的修饰。合适地，所述一个或多个氨基酸修饰不仅落在由LR5定义的区域内，而且构成了组2，组4，组6或组7中一个或多个之内的氨基酸。

合适地，该序列同源性比对可包含下列一个或多个步骤：

i)选择第一亲本脂质酰基转移酶；

ii)鉴定具有所需活性的第二相关的脂质酰基转移酶；

iii)将所述第一亲本脂质酰基转移酶和第二相关的脂质酰基转移酶进行比对；

iv)鉴定所述两个序列间有差别的氨基酸残基；和

v)在所述亲本脂质酰基转移酶中修饰根据步骤(iv)鉴定的一个或多个氨基酸残基。

合适地，该序列同源性比对可包含下列一个或多个步骤：

i)选择第一亲本脂质酰基转移酶；

ii)鉴定具有所需活性的第二相关的脂质酰基转移酶；

iii)将所述第一亲本脂质酰基转移酶和第二相关的脂质酰基转移酶进行比对；

iv)鉴定所述两个序列间有差别的氨基酸残基；

v)确定根据步骤(iv)选择的一个或多个氨基酸残基是否高度保守(尤其是否是活性位点残基和/或部分GDSx基序和/或部分GANDY基序)；和

vi)在所述亲本序列中修饰根据步骤(iv)鉴定的一个或多个氨基酸残基，其不包括根据步骤(v)鉴定的保守区域。

合适地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可包含下列氨基酸序列中的任一个：SEQID No 34，SEQ ID No 3，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ IDNo 8，SEQ ID No 19，SEQ ID No 10，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ IDNo 14，SEQ ID No 1，SEQ ID No 15，SEQ ID No 25，SEQ ID No 26，SEQ ID No 27，SEQ IDNo 28，SEQ ID No 29，SEQ ID No 30，，SEQ ID No 32或SEQ ID No 33。

合适地，所述第二相关脂质酰基转移酶可包含下列氨基酸序列中的任一个：SEQID No 3，SEQ ID No 34，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ IDNo 8，SEQ ID No 19，SEQ ID No 10，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ IDNo 14，SEQ ID No 1，SEQ ID No 15，SEQ IDNo 25，SEQ ID No 26，SEQ ID No 27，SEQ IDNo 28，SEQ ID No 29，SEQ ID No 30，，SEQ ID No 32或SEQ ID No 33。

所述变体酶与所述亲本酶相比较必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述酶变体与所述亲本酶相比较，可包含至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，优选至少6个，优选至少7个，优选至少8个，优选至少9个，优选至少10个氨基酸修饰。

当本文提到特异性氨基酸残基时，所述编号是由变体序列与SEQ ID No.34或SEQID No.35所示参考序列进行比对而得到的。

在一个方面，优选所述变体酶含有下列一个或多个氨基酸取代：

S3A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y；和/或

L17A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

S18A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，或Y；和/或

K22A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

M23A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Y30A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；和/或

G40A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N80A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

P81A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

K82A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N87A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N88A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

W111A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或

V112A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；和/或

A114C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Y117A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；和/或

L118A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

P156A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

D157A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

G159A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Q160A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N161A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

P162A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

S163A，C，D，E，F，G， H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y；和/或

A164C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

R165A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，或Y；和/或

S166A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y；和/或

Q167A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，或Y；和/或

K168A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

V169A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；和/或

V170A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；和/或

E171A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

A172C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Y179A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；和/或

H180A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N181A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Q182A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，或Y，优选K；和/或

M209A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

L210A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

R211A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

N215A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Y226A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；和/或

Y230A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或

K284A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

M285A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

Q289A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，或Y；和/或

V290A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；和/或

E309A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或

S310A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y。

此外或可替换地可有一个或多个C末端延伸。优选附加的C末端延伸包含一个或多个脂肪族氨基酸，优选非极性氨基酸，更优选I，L，V或G。因此，本发明进一步提供含有下列一个或多个C末端延伸的变体酶：318I，318L，318V，318G。

当情况是所述亲本主链中的残基不同于来自P10480(SEQ ID No 2)的残基时，如通过与P10480和/或1IVN进行同源性比对和/或结构比对所确定的，期望分别用P10480中存在的残基替换所述残基，其中所述残基与P10480(SEQ ID No 2)中的下列任何一个或多个氨基酸残基进行对比：Ser3，Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82，Asn87，Asn88，Trp 111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159，Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168，Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Gln182，Met209，Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289，Val290，Glu309或Ser310。

对于磷脂(例如磷脂酰胆碱(PC))的水解活性降低的变体酶也可具有增加的从磷脂的转移酶活性。

从磷脂(例如磷脂酰胆碱(PC))的转移酶活性增加的变体酶也可具有增加的对磷脂的水解活性。

合适地，下列的一个或多个位点可与底物结合和相关：

Leu17；Ala114；Tyr179；His180；Asn181；Met209；Leu210；Arg211；Asn215；Lys284；Met285；Gln289；Val290。

1.下列的一个或多个残基的修饰可产生对磷脂的绝对(absolute)转移酶活性增加的变体酶：

S3，D157，S310，E309，Y179，N215，K22，Q289，M23，H180，M209，L210，R211，P81，V112，N80，L82，N88；N87

可提供从磷脂的转移酶活性提高的变体酶的具体修饰可选自下列的一种或多种：

S3A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；优选N，E，K，R，A，P或M，最优选S3A

D157A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选D157S，R，E，N，G，T，V，Q，Kor C

S310A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或YP优选S310T

-318E

E309A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；优选E309 R，E，L，R或A

Y179A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；优选Y179 D，T，E，R，N，V，K，Q或S，更优选E，R，N，V，K或Q

N215A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N215 S，L，R或Y

K22A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选K22 E，R，C或A

Q289A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；优选Q289 R，E，G，P或N

M23A，C，D，E，F，G，H，I，K，L N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选M23 K，Q，L，G，T或S

H180A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选H180 Q，R或K

M209A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选M209 Q，S，R，A，N，Y，E，V或L

L210A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选L210 R，A，V，S，T，I，W或M

R211A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；优选R211T

P81A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；优选P81G

V112A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；优选V112C

N80A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N80R，G，N，D，P，T，E，V，A或G

L82A，C，D，E，F，G，H，I，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选L82N，S或E

N88A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N88C

N87A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N87M或G

下列一个或多个残基的修饰产生对磷脂的绝对转移酶活性增加的变体酶：

S3 N，R，A，G

M23 K，Q，L，G，T，S

H180 R

L82 G

Y179 E，R，N，V，K或Q

E309 R，S，L或A

一种优选的修饰是N80D。特别是当使用所述参考序列SEQ ID No 35时的情况。因此在本发明的一个优选实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶含有SEQ ID No 35。

如上所述，当本文提到具体的氨基酸残基时，所述编号是由变体序列与SEQ IDNo.34或SEQ ID No.35所示参考序列进行比对而得到的。

更优选地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是含有SEQ ID No.16所示氨基酸序列(图10)，或与SEQ ID No.16具有75％或更多，优选85％或更多，更优选90％或更多，还更优选95％或更多，还更优选98％或更多，或还更优选99％或更多的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。该酶可以被认为是变体酶。

为免除怀疑，除非另有说明，当一个特定氨基酸被教导位于一个特定位点，例如L118时，这是指SEQ ID No 34中位于残基数118的特定氨基酸。但是，在不同亲本酶中位于118位的氨基酸残基可以不同于亮氨酸。

因此，当教导取代位于118残基的氨基酸时，尽管可以参照L118，但是本领域技术人员很容易理解当所述亲本酶不同于SEQ ID No.34所示时，所述被取代的氨基酸可以不是亮氨酸。因此，当取代亲本酶中的氨基酸序列时，所述亲本酶不是具有SEQ ID No.34所示氨基酸序列的酶，新的(取代)氨基酸可以与SEQ ID No.34中教导的氨基酸相同。这可以是这样的情况，例如，假定118残基的氨基酸不是亮氨酸因而不同于SEQ ID No.34中位于118残基的氨基酸。换句话说，例如在118残基，如果亲本酶在该位置具有不同于亮氨酸的氨基酸，则根据本发明，该氨基酸可以用亮氨酸代替。

为了本发明的目的，同一性的程度基于相同序列元件的数目。依照本发明，同一性程度可通过本领域已知的计算机程序合适地测定，所述程序诸如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman &Wunsch(1970)，J.of Molecular Biology 48，443-45)，使用下列设置进行多肽序列比较：GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。合适地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸，优选在至少30个连续的氨基酸，优选在至少40个连续的氨基酸，优选在至少50个连续的氨基酸，优选在至少60个连续的氨基酸中测定的。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可从，优选从来自下列一个或多个属的生物体中获得：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯忒氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、Mesorhizobium、Ralstonia、黄单胞菌属(Xanthomonas)、假丝酵母属(Candida)、Thermobifida和棒杆菌属(Corynebacterium)。

合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可从，优选从下列一种或多种生物体中获得：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌科(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李斯忒氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯忒氏菌(Listeria monocutogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Mesorhizobium loti、Ralstonia solanacearum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、Thermobifida fusca和Corynebacterium efficiens。

在一方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶可从，优选从一种或多种嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌获得。

在一个实施方案中，合适地，固醇和/或甾烷醇可以包括以下一种或多种结构特征：

i)3-β羟基或3-α羟基；和/或

ii)顺式位置的A:B环或反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。

适宜的固醇酰基受体包括胆固醇和植物甾醇(phytosterol)，例如α-谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)、麦角固醇(ergosterol)、油菜甾醇(campesterol)、5，6-二氢固醇、菜子固醇(brassicasterol)、α-菠菜甾醇(spinasterol)、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇(fucosterol)、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol、表甾醇(episterol)、anasterol、α-苯基丁酰胺(hyposterol)、菠菜甾醇(chondrillasterol)、链甾醇(desmosterol)、海绵甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、γ-谷甾醇(clionasterol)、固醇苷(sterol glycoside)、生育酚(tocopherol)、生育三烯酚(tocotrienol)和其它天然或合成的同分异构形式和衍生物。

有利地，在一个实施方案中，所述固醇酰基受体为生育酚。合适地，所述生育酚可以是一种或多种γ，Δ，β或d-α生育酚-包括例如琥珀酸维生素E(d-αtocopherol acidsuccinate)。在一个实施方案中固醇酰基受体优选是α-生育酚。

在一个实施方案中，本发明的方法优选包括向所述油中加入生育酚，优选α-生育酚的步骤。

在一个方面，优选地，所述固醇酰基受体是胆固醇。

在一个方面，优选地，所述固醇和/或甾烷醇酰基受体是除胆固醇之外的固醇和/或甾烷醇。

在本发明的一个方面，合适地，一种以上固醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体，合适地，两种以上固醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体。换言之，在本发明的一个方面，合适地，可以产生一种以上固醇酯和/或甾烷醇脂。合适地，当胆固醇是酰基受体时，一种或多种其他固醇和一种或多种甾烷醇也可作为酰基受体。因此，在一个方面，本发明提供了生育酚酯与至少一种其它固醇酯或甾烷醇酯组合的原位产生方法。换言之，在本发明的一些方面，脂质酰基转移酶可以将酰基从脂质上转移到生育酚与至少一种其它固醇和/或至少一种甾烷醇。

在一些方面，按照本发明方法制备的油可用于降低患心血管疾病的风险。

在一个方面，按照本发明方法制备的油可用于降低血清胆固醇和/或降低低密度脂蛋白。血清胆固醇和低密度脂蛋白均与人类某些疾病有关，诸如动脉粥样硬化和/或心脏病。因此，可以设想，按照本发明制备的油可用于降低患这些疾病的风险。

在又一个方面，本发明提供了根据本发明的食用油用于治疗和/或预防心血管疾病的用途。

因此，在一个方面，本发明提供了根据本发明的食用油用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或心脏病的用途。

在又一个方面，本发明提供了一种含有本发明食用油的药剂。

在又一个方面，本发明提供了一种治疗和/或预防人类和动物患者疾病的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的本发明的食用油。

合适地，固醇酰基受体可为天然存在于食用油或植物油中的固醇酰基受体。

可选地或此外，所述固醇酰基受体可为添加到食用油或植物油中的固醇酰基受体。

在将固醇和/或甾烷醇添加到所述食用油中的情况下，可在添加本发明的脂质酰基转移酶之前，同时，和/或之后添加固醇和/或甾烷醇。合适地，本发明可包括在添加本发明的酶之前或者同时将外源性固醇/甾烷醇，尤其是植物固醇/植物甾烷醇，添加到食用油或植物油中。

在一些方面，在添加本发明的脂质酰基转移酶之前或同时，所述食用油中存在的一种或多种的固醇可能被转化成一种或多种甾烷醇。任何将固醇转化成甾烷醇的适宜方法都可使用，例如，可以通过化学氢化作用进行所述转化。这种转化可在本发明的脂质酰基转移酶添加之前或本发明的脂质酰基转移酶添加的同时进行。将固醇转化成甾烷醇的合适的酶在WO00/061771中教导。

合适地，可将本发明应用于在食用油中原位产生植物甾烷醇酯。植物甾烷醇酯具有增加的透过类脂膜的溶解性，生物利用度，和增强的健康益处(参见例如WO92/99640)。

本发明的一个优点是在食用油脱胶过程中在其中产生了固醇和/或甾烷醇酯。另一优点是在没有提高或没有基本上提高食用油的游离脂肪酸含量的情况下将酶脱胶。游离脂肪酸的产生可对食用油有害。优选地，本发明的方法导致食用油的脱胶，其中降低和/或消除了游离脂肪酸的累积。不希望被理论束缚，根据本发明，从脂质除去的脂肪酸通过脂质酰基转移酶转移到酰基受体，例如固醇和/或甾烷醇。因此，在食品中游离脂肪酸的总水平不增加，或仅增加不显著的程度。这与将磷脂酶，如Lecitase Ultra^TM用于食用油的酶脱胶的情况形成强烈对比。特别是利用这种磷脂酶会使食用油中游离脂肪酸的量增加，这可为有害的。如果使用磷脂酶A，如Lecitase Ultra^TM代替本发明的脂质酰基转移酶，那么与已累积的游离脂肪酸的量相比，根据本发明，游离脂肪酸的累积被降低和/或消除。

本发明的脂质酰基转移酶可以适用于植物油或食用油的酶脱胶。在植物油或食用油的加工过程中，用本发明的脂质酰基转移酶处理所述食用油或植物油，以便水解较大部分的磷脂。优选地，将脂酰基从极性脂质转移到酰基受体。由于水解了大部分(即超过50％)磷脂，脱胶处理通常导致食用油中的极性脂质，尤其是磷脂含量的降低。通常，将含有水解的磷脂的水相与油分离。合适地，所述食用油或植物油起始(用本发明所述酶预处理)可具有50-250ppm的含磷量。

如本领域技术人员公知：本文所用术语“脱胶”是指通过将磷脂(例如卵磷脂，磷脂和滞留油(occluded oil))转化为能水合的磷脂而进行的油的精炼。脱胶后的油流动性更强，因此比没有脱胶的油具有更好的操作性质。

这里使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。

合适地，如本文定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或多种反应：相互酯化作用(interesterification)，转酯基作用(transesterification)，醇解作用，水解作用。

术语“相互酯化作用”指的是酰基在脂质供体与脂质受体之间的酶催化转移，其中的脂质供体不是游离的酰基。

本文术语“转酯基作用”指的是酰基从脂质供体(游离脂肪酸除外)酶催化转移到酰基受体(水除外)。

如本文使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇ROH的反应酸衍生物的共价键的酶裂解，使得产物中的一种与醇的H结合而另一种产物与醇的OR基团结合。

如本文使用的术语“醇”指的是包含羟基的烃基化合物。

如本文使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化转移。

如本文使用的术语“不增加或基本上不增加游离脂肪酸”指的是本发明的脂质酰基转移酶优选具有100％转移酶活性(即将100％的酰基从酰基供体转移到酰基受体，无水解活性)；但是此酶可将不到100％的存在于脂质酰基供体中存在的酰基转移到酰基受体。在这种情况下，优选的酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，并且更优选至少98％。所述％转移酶活性(即转移酶活性占总酶活性的百分比)可通过下列方案测定：

适用于本发明方法的酶优选具有在下文教导的标准磷脂酶活性试验中的磷脂酶活性。

测定磷脂酶活性(磷脂酶活性试验(PLU-7))：

底物

在0.05M HEPES缓冲液pH 7中分散0.6％ L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#_441601)，0.4％ Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂。

步骤

将400μL底物加到1.5ml Eppendorf管，并置于Eppendorf热混合器(thermomixer)，37℃、5分钟。在时间t＝0时，加入50μL酶溶液。也对以水代替酶的空白进行分析。以10x100rpm在Eppendorf热混合器上于37℃将所述样品混合10分钟。在时间t＝10分钟时，将Eppendorf管置于另一热混合器中，在99℃、10分钟以结束反应。

使用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。

在试验条件下，在pH7的酶活性PLU-7以每分钟产生的微摩尔脂肪酸来计算。

更优选脂质酰基转移酶还具有如下面方案所定义的转移酶活性：

测定％转移酶活性的规程：

酶促反应后，可用2∶1的CHCl3∶CH3OH提取已添加本发明的脂质酰基转移酶的食用油，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文详述的步骤通过GLC和HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种固醇/甾烷醇酯类的量。用同种方法分析不添加本发明的酶的对照食用油。

计算：

从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和固醇/甾烷醇酯的增加。

Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量；

A＝Δ％固醇酯/Mv固醇酯(其中Δ％固醇酯＝％固醇/甾烷醇酯(酶)-％固醇/甾烷醇酯(对照)，而Mv固醇酯＝固醇/甾烷醇酯的平均分子量)；

转移酶活性作为总酶活性的百分率计算：

如果食用油中的游离脂肪酸增加，优选它们基本不增加，即达不到显著水平。我们的意思是游离脂肪酸的增加不会负面影响食用油质量。

用于酰基转移酶活性试验的食用油优选豆油(soya bean oil)，所述豆油使用实施例3的方法补充植物甾醇(1％)和磷脂酰胆碱(2％)油。对于该试验所用的酶剂量优选0.2PLU-7/g油，更优选0.08PLU-7/g油。该油之中存在的磷脂水平和/或固醇的％转化率优选在4小时后，更优选在20小时后测定。

在本发明的一些方面，本文使用的术语“基本不增加游离脂肪酸”意思是用本发明脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量少于在已使用除本发明脂质酰基转移酶以外的酶时食用油中产生的游离脂肪酸的量，例如与已使用常规的磷脂酶如LecitaseUltra^TM(Novozymes A/S，丹麦)时产生的游离脂肪酸的量进行比较。

此外，或代替地，可使用下列名称为“鉴定用于本发明脂质酰基转移酶的规程”的试验，来评价油(上述)中的％转移酶活性，以鉴定最优选用于本发明方法的脂质酰基转移酶。

鉴定脂质酰基转移酶的规程

根据本发明的脂质酰基转移酶使得：

i)去除豆油中的磷脂，所述豆油使用实施例3中教导的方法补充植物甾醇

(1％)和磷脂酰胆碱(2％)油。

和/或

ii)当使用实施例3中教导的方法时将加入的固醇转化为固醇-酯(％转化)。可以使用实施例5中教导的GLC方法来测定固醇和固醇酯的水平。

对于该试验所用的酶剂量可以是0.2PLU-7/g油，更优选0.08PLU-7/g油。该油之中存在的磷脂水平和/或固醇的转化率(％转化)优选在4小时后，更优选在20小时后测定。

在鉴定脂质酰基转移酶的规程中，酶处理后，优选加入5％的水并与油彻底混合。然后使用离心将油分成油相和水相(参见Buchold，H.和Laurgi A.-G.的“Enzyme-catalyzed degumming of vegetable oils”，Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-4，ISSN：0931-5985)，然后可使用下列规程(“磷含量的测定方法″)分析油相的含磷量：

含磷量试验

脱胶后通过下述测定油中存在的磷脂水平：首先根据AOAC Official Method999.10(＞Lead，Cadmium，Zinc，Copper，and Iron in Foods Atomic AbsorptionSpectrophotometry after Microwave Digestion，First Action 1999NMKL-AOACMethod)所教导的样品制备来制备油样品。然后根据AOAC Official Method 985.01(＞Metals and Other Elements in Plants and Pet Foods Inductive Coupled PlasmaSpectroscopic Method First Action 1985 Final Action1988)，通过分析脱胶后油样品中的含磷量来测量油中磷脂的量。

脱胶后油中存在的磷的量优选小于50ppm，优选小于40ppm，优选小于30ppm，优选小于20ppm，优选小于10ppm，优选小于5ppm。如在实施例中说明的，油脱胶后可能基本上不含磷脂，也就是说含有小于1ppm的磷脂。

油中存在的固醇的％转化率为至少1％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％。

在一个实施方案中，油中存在的固醇的％转化率为至少5％，优选至少20％。

低水量(low water)脱胶

意外地发现当在食用油的酶脱胶过程中使用脂质酰基转移酶时，酶脱胶可在极低水量的环境中进行。仍可需要一些水分，例如当向油中加入酶时可以加入少量水，如小于1％，优选0.5％，更优选小于0.2％，更优选小于1％。

本发明方法和用途中食用油的含水量优选小于1％，优选小于0.5％，更优选小于0.2％，更优选小于0.1％。

因此，本发明的一个优点是当在酶脱胶过程中仅仅使用少量水(即＜5％，优选＜1％，优选＜0.5％，优选＜0.2％)时，树胶(即含磷部分)，例如以固体沉淀的形式，从油中分离出来。例如通过简单地倾析(decanting)油或过滤去除树胶的方法可容易地将该固体沉淀从脱胶的油中去除。

这和向油中加入大量水的常规酶脱胶方法形成鲜明对比。这是由于在常规的酶脱胶方法中，由于高含水率，脱胶后会得到包括含磷部分的水层(例如含有溶血磷脂的那部分)。必须去除这个水层，并可通过例如离心去除。但是，水层的去除要远远比去除使用本发明方法时产生的固体沉淀要困难得多。

因此根据本发明的酶脱胶方法可被认为是一种“低水量脱胶方法”。

在本发明的一个实施方案中，可通过将油调整为含5％的水然后将油离心来去除树胶。(参见Buchold，H.和Laurgi A.-G.的“Enzyme-catalyzed degumming of vegetableoils”，Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-4)。

因此，本发明提供将食用油，如原食用油(例如原豆油)脱胶的方法，该方法不需要在脱胶之前的预洗涤步骤和/或在脱胶过程中将加入的水去除的步骤，而当使用常规的磷脂酶如胰腺磷脂酶和Lecitase Ultra^TM时则需要这些步骤。

优选该食用油具有小于4.5％，更优选小于4％，小于3％，小于2％，小于1％，小于0.5％的水含量。

合适地，该食用油可含有至少0.1％，如至少0.3％，0.4％或0.5％的水。

用于本发明的优选的脂质酰基转移酶被确定为那些：其在油环境中对磷脂具有高活性，例如高磷脂水解活性或高磷脂转移酶活性，最优选用于酶脱胶的脂质酰基转移酶具有高的磷脂到固醇转移酶活性。

如以上详述，适用于本发明方法的其它酰基转移酶可以通过鉴定GDSx，GANDY和HPT区的存在，或者通过比对pFam00657共有序列(SEQ ID No1)，和/或与GDSx酰基转移酶，例如SEQ ID No 28比对而鉴定。为了评价它们对于脱胶的适用性，即鉴定那些酶具有总酶活性至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少98％的转移酶活性，所述转移酶活性使用在上文详述的“％酰基转移酶活性测定规程”试验进行测定。

本发明涉及在食用植物油和/或食用油脱胶中使用本发明的脂质酰基转移酶，并且涉及将食用油或植物油脱胶的方法。

在一个方面，本发明可提供一种方法，其包括使用脂质酰基转移酶去除油中不能水合的磷(NHP)含量，所述油中含有相对高含量的NHP。

本文所用术语“食用油”包含植物油。

优选地，在根据本发明的处理之前，食用油含有的不能水合的磷含量为50-250ppm，优选至少60ppm，更优选至少100ppm，还更优选至少200ppm，还更优选250ppm以上。

更优选地，在根据本发明的处理之前，食用油含有的不能水合的磷含量在60-500ppm的范围内，更优选在100-500ppm的范围内，还更优选在200-500ppm的范围内。

本文所称的食用油可以是任何具有相对较高量的不能水合的磷的油，其可包括水脱胶的油，或更优选其为原油(crude-oil)或半原油(semi-crude oil)。

在一个方面，该原食用油在实施本发明方法之前具有350ppm以上，更优选400ppm以上，还更优选500ppm以上，最优选600ppm以上的磷含量。

本发明方法包括的油可包括，但不限于，豆油，卡诺拉油(canola oil)，玉米油，棉籽油，棕榈油，椰子油，花生油，橄榄油，红花油，棕榈仁油，菜籽油和葵花油中的一种或多种。

优选地，该油是豆油，葵花油和菜籽油(有时称为卡诺拉油)中的一种或多种。

更优选地，该油是豆油，葵花油或菜籽油的一种或多种。

最优选地，该油是豆油。

这些油可以是原油，半原油或水脱胶的油的形式。

本文使用的“原油”(本文中还称为未脱胶的油)可以是从例如菜籽，大豆或葵花中压榨或提取的油或其混合物。原油中磷脂的含量可从0.5-3％ w/w变化，相当于200-1200ppm范围内，更优选250-1200ppm范围内的含磷量。除了磷脂，原油还含有低浓度的碳水化合物，糖化合物和Ca、Mg和Fe的金属/磷脂酸式复合物。

本文所用的“半原油”指任何油，其并非原油，但其具有的磷脂含量为250ppm以上，更优选500ppm以上。例如可通过使原油进行类似于“水脱胶”方法的如下所述的方法来得到这种油。

本文所用“水脱胶的油”通常可以通过“水脱胶方法”获得，其包括将1-3％w/w的热水与热的(60-90℃)原油混合。通常的处理时间是30-60分钟。水脱胶步骤去除磷脂和粘的树胶，这些物质水合时在油中变成不可溶的。水合的磷脂和树胶可通过沉淀，过滤或离心从油中分离出来，离心为更普遍的方法。在所述水脱胶方法中主要的目的是将水合的磷脂从油中分离出来。根据本领域标准的水脱胶方法，上述将热水与油混合应该在此广泛地理解为将水溶液与油混合。

有利地，本发明的方法和用途能够在低水量(＜5％，优选小于2％，更优选小于1％)环境中将食用油脱胶。因此加入比使用常规的酶时更少的水就能进行脱胶。本发明的另一优点是在油中产生了固醇酯(特别是生育酚酯)。本发明的又一优点是去除(优选完全去除)磷脂。本发明的又一优点是去除(优选完全去除)磷脂而不去除植物甾醇，特别是生育酚。由于植物甾醇的酯化作用，优选没有显著从油中去除植物甾醇，例如生育酚，而是它们被简单地酯化。但是，在一个实施方案中，植物甾醇例如生育酚的量可被减少。在这种实施方案中，植物甾醇例如生育酚的绝对水平可减少优选不超过10％，或者不超过25％，或者不超过50％，或者不超过75％。本发明的又一优点是去除(优选完全去除)磷脂而不水解甘油三酯。

为便于参照，本发明的这些和其它方面现在在适当的部分标题下论述。但是，在各部分下的教导并非必然地局限于各具体部分。

各组的定义

氨基酸组1：

氨基酸组1

Gly8，Asp9，Ser10，Leu11，Ser12，Tyr15，Gly44，Asp45，Thr46，Glu69，Leu70，Gly71，Gly72，Asn73，Asp74，Gly75，Leu76，Gln106，Ile107，Arg108，Leu109，Pro110，Tyr113，Phe121，Phe139，Phe140，Met141，Tyr145，Met151，Asp154，His157，Gly155，Ile156，Pro158

高度保守的基序，例如GDSx和催化残基，从组1中除名(加下划线的残基)。为避免引起疑问，组1定义了1IVN模型的活性位点中甘油的中心碳原子以内的氨基酸残基。

氨基酸组2：

氨基酸组2(注意氨基酸的编号是指在P10480成熟序列中的氨基酸)

Leu 17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82，Asn87，Asn88，Trp111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159，Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168，Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Met209，Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289和Val290。

组1与组2中选择的残基相比较的表：

氨基酸组3：

氨基酸组3与组2一致，除了引用杀鲑气单胞菌(SEQ ID No 28)编码序列，即，组3中那些氨基酸残基编号提高了18，这反映了成熟蛋白质(SEQ ID No.2)和包含信号序列的蛋白质(SEQ ID No.28)相比氨基酸编号之间的差异。

杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.28)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.26)的成熟蛋白质相差五个氨基酸。它们是Thr3Ser，Gln182Lys，Glu309Ala，Ser310Asn，Gly318-，其中先列出的是杀鲑气单胞菌残基，后列出的是嗜水气单胞菌残基(图59)。嗜水气单胞菌蛋白只有317个氨基酸长并在318位置缺少残基。杀鲑气单胞菌GDSX对极性脂质(例如半乳糖脂底物)的活性显著高于嗜水气单胞菌蛋白。对所有五个氨基酸位置进行位点扫描。

氨基酸组4：

氨基酸组4是S3，Q182，E309，S310和-318。

氨基酸组5：

F13S，D15N，S18G，S18V，Y30F，D116N，D116E，D157N，Y226F，D228NY230F。

氨基酸组6：

氨基酸组6是Ser3，Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82，Asn87，Asn88，Trp111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159，Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168，Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Gln182，Met209，Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289，Val290，Glu309，Ser310，-318。

组6中氨基酸的编号引用P10480(SEQ ID No.2)中的氨基酸残基——可通过与P10480和/或1IVN进行同源性比对和/或结构比对来测定在其它序列主链中的相应氨基酸。

氨基酸组7：

氨基酸组7是Ser3，Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82，Asn87，Asn88，Trp111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159，Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168，Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Gln182，Met209，Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289，Val290，Glu309，Ser310，-318，Y30X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W)，Y226X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W)，Y230X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W)，S18X(其中X选自A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W或Y)，D157X(其中X选自A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y)。

组7中氨基酸的编号引用P10480(SEQ ID No.2)中的氨基酸残基——可通过与P10480和/或1IVN进行同源性比对和/或结构比对来测定在其它序列主链中的相应氨基酸。

分离的

在一个方面，优选地，本发明使用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”意思是序列至少基本上不含有至少一种其它成分，该成分实际上(in nature)与此序列天然相结合，并在自然界存在。

纯化的

在一个方面，优选地，本发明使用的多肽或蛋白质是纯化形式的。术语“纯化的”意思是序列处于相对纯化的状态，如至少大约51％纯度、或至少大约75％、或至少大约80％、或至少大约90％纯度、或至少大约95％纯度、至少大约98％纯度。

克隆编码本发明多肽的核苷酸序列

编码具有本文定义的具体性质的多肽或适合被修饰的多肽的核苷酸序列，可以从产生上述多肽的任何细胞或生物体中分离。用于分离核苷酸序列的多种方法是本领域中公知的。

例如，可使用来自产生所述多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果多肽氨基酸序列是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针，并用于识别从生物体制备的基因组文库的编码多肽的克隆。或者，可使用包含与另一个已知的多肽基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针来识别编码多肽的克隆。在后面的例子中，使用低严格性的杂交和洗涤条件。

或者，编码多肽的克隆能够通过将基因组DNA片段插入表达载体如质粒中来进行鉴别，使用得到的基因组DNA文库转化不含酶的(enzyme-negative)细菌，然后将转化的细菌涂布于含有被多肽抑制的酶的琼脂上，从而使表达多肽的克隆得到鉴定。

作为另外的选择，编码多肽的核苷酸序列可以用确定的标准方法合成制备，该标准方法例如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869描述的亚膦酰胺(phosphoroamidite)方法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p801-805描述的方法。在亚膦酰胺方法中，寡核苷酸被合成(例如在自动DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。

核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成与cDNA来源，或混合的基因组与cDNA来源，其通过根据标准技术连接合成DNA、基因组DNA或cDNA来源(适当时)的片段来制备。每一个连接片段对应于整个核苷酸序列中不同的部分。DNA序列也可通过聚合酶链式反应(PCR)使用特异性的引物制备，例如US 4,683,202中或Saiki R K等(Science(1988)239，pp487-491)中所描述的。

核苷酸序列

本发明也包括核苷酸序列，其编码具有本文定义的具体性质的多肽。这里使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，和其变体、同源物、片段和衍生物(例如它的部分)。该核苷酸序列可以是基因组来源、合成来源、或重组来源，不论代表有义链或反义链，它可以是双链或是单链。

涉及本发明的术语“核苷酸序列”包含基因组DNA、cDNA、合成DNA，和RNA。优选地它指DNA，更优选为编码序列的cDNA。

在优选的实施方案中，当核苷酸序列与也存在它的天然环境中的、与其天然结合的序列相连时，编码具有本文定义的具体特性的多肽的核苷酸序列本身不涵盖其天然环境中的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们称这种优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。在这种情况下，术语“天然核苷酸序列”是指在其自身天然环境中的完整核苷酸序列，并且当其与其天然结合的完整启动子可操作地连接时，所述启动子也存在于其天然环境中。因此，本发明的多肽可以通过存在于自然生物体中的核苷酸序列表达，但是其中的核苷酸序列不受该生物体中与其天然结合的启动子的控制。

优选的多肽不是天然多肽。这种情况下，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中且通过其天然核苷酸序列表达时的完整多肽。

通常，编码具有本发明定义的具体性质的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术(即重组DNA)来制备。然而，在本发明的可选择的实施方案中，所述核苷酸序列的全部或部分可以使用本领域已知的化学方法合成(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

分子进化

一旦编码酶的核苷酸序列被分离，或者推定的编码酶的核苷酸序列被鉴定，修改选择的核苷酸序列是合乎需要的，例如为了制备本发明所述的酶而将序列突变是合乎需要的。

可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含位于所需的突变位点侧翼的核苷酸序列。

合适的方法在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开。另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列的方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)中描述。

作为定点突变的替代，例如上面所述，可以例如使用商业试剂盒诸如来自Stratagene的GeneMorph PCR突变试剂盒，或来自Clontech的多样化(Diversify)PCR随机突变试剂盒来随机地引入突变。EP 0 583 265涉及优化基于PCR的诱变的方法，其也可与使用突变DNA类似物(例如EP 0 866 796中描述的那些)相结合。易错PCR(Error prone PCR)技术适用于生产具有优选特性的脂质酰基转移酶的变体。WO0206457涉及脂肪酶的分子进化。

获得新序列的第三种方法是非同一的核苷酸序列的片段化，或使用任何数量的多种限制性内切酶，或一种酶如DNase I，并重新组装编码功能蛋白的全部核苷酸序列。或者，可使用一种或多种非同一的核苷酸序列，并在重新组装全部核苷酸序列的过程中引入突变。改组和家族改组(shuffling and family shuffling)技术适用于生产具有优选特性的脂质酰基转移酶的变体。合适的实施“改组”的方法可见于EP0 752 008、EP1 138 763、EP1103 606中。如US6,180,406和WO 01/34835所述，改组也可与DNA突变的其它形式组合。

因此，能在体内或在体外在核苷酸序列中产生大量的定点突变或随机突变，随后用不同的方法筛选功能改善的编码多肽。例如，使用硅(silico)和外(exo)介导的重组方法(参见WO 00/58517，US 6,344,328，US 6,361,974)，分子进化能够在产生的变体与已知的酶或蛋白保持非常低的同源性的情况下进行。由此获得的所述变体与已知的转移酶具有显著的结构近似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。

作为一个非限制的例子，另外地，可将多肽序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组以产生新的变体。也可筛选这种新的变体以改善编码多肽的功能性。

上述提到的应用和类似的分子进化方法，允许在没有任何蛋白质结构或功能的已有知识的情况下，鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶的变体，并允许产生不可预测的但有益的突变或变体。本领域中有分子进化的应用的很多实例，用于优化或改变酶活力。这些例子包括，但不限于以下一种或多种：在宿主细胞内或体外优化表达或活性，增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，提高或降低酶稳定性或结构稳定性，在优选的环境条件下(例如温度、pH和/或底物)改变酶活性/特异性。

使用分子进化工具可使酶发生改变以改善酶的功能性，这对于本领域的技术人员是显而易见的。

合适地，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是变体，即与其亲代酶比较，可以包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加。突变酶保持与其亲代酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。合适的亲代酶可包括任何具有酯酶或脂肪酶活性的酶。优选地，亲代酶与Pfam00657共有序列一致(align)。

在优选的实施方案中，变体脂质酰基转移酶保留或掺入至少一个或多个GDSx、GANDY和HPT区中存在的Pfam00657共有序列氨基酸残基。

酶，例如在水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活性的脂肪酶可使用分子进化工具进行突变，来引入或增强转移酶活性，因此产生适用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。

合适地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是变体，所述变体与其亲代酶相比对于磷脂具有增强的酶活性。优选地，这种突变体对于溶解性(lyso)极性脂类也具有低活性或没有活性。对于磷脂的增强的活性可能是水解作用和/或转移酶活性或者两者组合的结果。

与亲代酶相比，用于本发明的变体脂质酰基转移酶对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯可具有减少的活性。

合适地，变体酶可对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯不具有活性。

或者，用于本发明的变体酶对甘油三酯可具有增强的活性，和/或对下列一种或多种物质也具有增加的活性：极性脂类、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱。

脂质酰基转移酶的变体是已知的，且一种或多种所述变体可适用于本发明的方法和用途和/或用于本发明的酶组合物中。仅仅作为举例，在下列参考文献中描述的脂质酰基转移酶的变体可用于本发明：Hilton & Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998Mar；7(3)：587-99。

氨基酸序列

本发明还包括具有本文定义的具体性质的多肽的氨基酸序列。

这里使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。

氨基酸序列可从适宜的来源制备/分离，或者可以通过合成制备或可通过使用DNA重组技术制备。

合适地，氨基酸序列可通过标准技术从本文教导的分离的多肽中获得。

以下是从分离的多肽中确定氨基酸序列的一种合适的方法：

纯化的多肽可为冷冻干燥的，可将100μg冷冻干燥的原料溶于50μl的8M尿素和0.4M碳酸氢铵的混合物中，pH8.4。溶解的蛋白质在50℃变性和还原15分钟，然后以氮气覆盖，添加5μl 45mM的二硫苏糖醇。冷却至室温后，在室温，黑暗，氮气环境中加入5μl 100mM的碘乙酰胺，使半胱氨酸残基衍生(derivatize)15分钟。

将135μl的水与溶于5μl水的5μg内蛋白酶(endoproteinase)Lys-C加入上述反应混合物，消化在氮气环境中37℃进行24小时。

使用溶剂A：0.1％ TFA溶于水和溶剂B：0.1％ TFA溶于乙腈，可通过在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上反相HPLC来分离得到的多肽。在N-末端测序之前，可用相同溶液体系在Develosil碳-18柱上将选出的肽利再进行色谱。可以根据制造商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)利用脉冲液体快速循环，使用Applied Biosystems 476A序列分析仪来进行测序。

序列同一性或序列同源性

本发明还包括序列的用途，所述序列与具有本文定义的具体性质的多肽的氨基酸序列或任何编码这种多肽的核苷酸序列的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性(在下文称为“同源序列”)。这里，术语“同源物”指的是与受试氨基酸序列和受试核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源性”可与“同一性”等同。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保持功能活性和/或增强酶活性的多肽。

在本上下文中，认为同源序列包含与受试序列具有至少75、85或90％同一性，优选至少95或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物包括与受试氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。

在本上下文中，认为同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(受试序列)具有至少75，85或90％的同一性，优选95或98％的同一性的核苷酸序列。通常，同源物包括与受试序列相同的编码活性位点等的序列。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。

同源性比较可用肉眼进行，或更通常地，借助与容易获得的序列比较程序进行。这些商业上可得到的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的％同源性。

％同源性可在相邻的序列中计算，即一条序列与另一条对齐，并将一条序列中的每一个氨基酸直接与另一条序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“无间隙(ungapped)”比对。通常，这种无间隙比对只在残基数目相对较少时进行。

虽然这是一种非常简单和稳定的方法，但没有考虑到例如在序列的其他方面的同一性匹配中，一个插入和缺失将导致后面的氨基酸残基不能对齐，因此当进行总体比对时，很可能地导致％同源性大幅度下降。因此，为产生最佳排列而设计的最大序列比较方法考虑到可能的插入和缺失，而不会过分降低(penalising)整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“缺口”，使局部同源性最大化来实现的。

但是，这些更为复杂的方法将“缺口罚分”(“gap penalties”)赋予每一个在比对中出现的缺口，使得对于相同数目的同一性氨基酸，具有尽可能少的缺口数的序列比对(反映两条被比较序列之间更高的相关性)比具有很多缺口的比对可得到更高的分数。通常使用“亲和缺口成本”(“Affine gap costs”)，缺口的存在承担相对较高的成本，而对缺口中的每个后续的残基罚分较少。这是最通常使用的缺口评分系统。高缺口罚分当然产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许对缺口罚分进行更改。然而，使用这些软件进行序列比较时优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，缺省的氨基酸序列缺口罚分为每个缺口-12和每个延伸-4。

因此计算最大同源性百分比首先需要考虑到缺口罚分，产生最佳排列。进行所述比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(Devereux等1984 Nuc.AcidsResearch 12 p387)。可进行序列对比的其它软件的实例，包括但不仅限于，BLAST程序包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，4^th Ed-Chapter 18)，FASTA(Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具组。BLAST和FASTA都可以离线和在线检索(参见Ausubel等1999，pages 7-58 to 7-60)。然而，对于一些应用，优选使用GCG最佳拟合程序。一个名为BLAST 2 Sequence的新工具也可以用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。

尽管最终％同源性能够以同一性来测定，但比对方法本身通常不是基于全有或全无(all-or-nothing)的配对比较。作为替代，成比例的相似性分数矩阵是普遍应用的，该矩阵为基于化学相似性和进化距离的每个配对比较赋予分数。通常应用的这样一种矩阵的实例就是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组件的缺省矩阵。如果能提供的话(进一步的详细信息参见用户手册)，GCG Wisconsin程序通常使用公开的缺省值或使用定制的标记比较表。在一些应用中，优选使用GCG程序包的公开的缺省值，或者在其它软件的情况下，使用缺省的矩阵，如BLOSUM62。

可选择地，百分比同源性可以使用DNASIS^TM(Hitachi Software)中的多重对比特征来计算，这基于一种类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法。

一旦软件产生了最佳的比对，就能够计算％同源性，优选％序列同一性。通常软件将此作为序列比较的一部分，并产生数值结果。

在本发明的优选方面中，使用以下软件和设置来计算百分比同源性/同一性。同一性(同源性)或“阳性”氨基酸序列百分比用AlignX Vector NTI(来自USA，California，Carlsbad，Invitrogen Corporation的Vector NTI Advance 9.1)计算，对于氨基酸序列的每个可能的配对，设置是默认的参数(缺口开放罚分-10，缺口延伸罚分0.1)。

序列也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，这会产生沉默变化并得到功能上等同的物质。只要该物质保持第二结合活性，有意的氨基酸取代可以基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的近似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的具有相似亲水性值的极性头基团的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。

例如根据下表，可以进行保守取代。第二栏中同一区，优选第三栏中同一行中的氨基酸可以互相取代：

本发明也包括可发生的同源取代(本文使用的取代和置换都指用可替换的残基交换已有的氨基酸残基)即相似取代相似，例如碱性氨基酸取代碱性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸，极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基到另一类或可选择地涉及包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文中记为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文中记为B)、原亮氨酸鸟氨酸(下文中记为O)、pyriylalanine、噻嗯基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。

置换也可以通过非天然氨基酸产生。

变体氨基酸序列可以包含可插入序列的任意两个氨基酸残基间的合适的间隔基团，其除氨基酸间隔物，例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外包括烷基诸如甲基、乙基、丙基。进一步的变异形式是本领域技术人员容易理解的，该变异形式包含类肽(peptoid)形式的一种或多种氨基酸残基。为了避免产生疑问，“类肽形式”用于指代变体氨基酸残基，其中α-碳取代基团在该残基的氮原子上而非α-碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。

用于本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以包括其中合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和磷硫酰(phosphorothioate)骨架和/或在分子的3’和/或5’端附加的吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，可以理解的是可通过本领域任何可得的方法来修饰本文描述的核苷酸序列。可进行这些修饰以增强核苷酸序列在体内的活性或延长核苷酸序列的寿命(life span)。

本发明也包括核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列与本文讨论的序列，或其任何衍生物、片段或衍生物互补。如果序列与其片段互补，那么该序列可以用作探针来鉴定其它生物体等中相似的编码序列。

与本发明的序列非100％同源但落入本发明范围的多核苷酸，可以通过多种方式获得。本文描述的序列的其它变体可以例如通过探测由一定范围的个体，例如来自不同种群的个体制成的DNA文库来获得。而且，可以获得其它病毒的/细菌的，或细胞的同源物特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类动物细胞)中存在的细胞同源物，此同源物和其片段一般而言能够选择性地与本文序列表所示的序列杂交。此序列可以通过探测由其它动物物种制备的cDNA文库或来自其它动物物种的基因组DNA文库，并在中到高严格条件下用探针探测所述文库来获得，所述探针包含所附序列表中的任何一个序列的全部或部分。相似的考虑应用于获得本发明的多肽和核苷酸序列的种属同源物(species homologue)和等位基因变体。

变体和菌株/种属同源物也可以使用简并PCR获得，其使用设计用来靶向变体和同源体中编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列的引物。保守序列可以例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可使用本领域公知的计算机软件进行。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。

用于简并PCR的引物可包含一或多个简并位置并用于严格条件，该严格条件低于用针对已知序列的单个序列引物来克隆序列的那些严格条件。

或者，所述多核苷酸能够通过特征序列的定点诱变来获得。例如在需要沉默密码子序列变化来最优化其中表达多核苷酸序列的具体宿主细胞的密码子偏好时，这是有用的。为了引入限制多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能，可需要其它的序列变化。

可使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)以制备引物，例如PCR引物，用于替换扩增反应的引物，可将探针例如通过常规方法使用放射性或非放射性标记以显色(revealing)标记物标记的探针，或者多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段可以为至少15，优选至少20，例如至少25、30或40个核苷酸的长度，并且也包括在如本文所用的本发明的术语多核苷酸中。

根据本发明所述的多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可以重组地、合成地或通过本领域技术人员能够获得的任意方法来制备。它们也可以通过标准技术克隆。

一般而言，引物是用合成方法生产的，包括以一次一个核苷酸的所需核酸序列的分步制备方法。使用自动技术完成上述任务的技术是本领域容易获得的。

较长的多核苷酸通常使用重组方法制备，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这包含制备位于需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的引物对(例如大约15到30个核苷酸)，使该引物与从动物或人细胞中获得的mRNA或cDNA接触，在使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收被扩增的DNA。引物可以被设计为包含合适的限制酶识别位点，以使扩增的DNA能够被克隆到合适的克隆载体中。

杂交

本发明也包括与本发明序列互补的序列，或能够与本发明的序列或其互补序列杂交的序列。

本文使用的术语“杂交”包括“通过碱基配对将核酸链连接到互补链的方法”，以及如聚合酶链式反应(PCR)技术中实施的扩增方法。

本发明也包括核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列能够与和本文讨论的受试序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。

本发明也包括与能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。

杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，AcademicPress，San Diego CA)中所教导的，并赋予如下说明的“严格性”。

最大严格性通常发生在大约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格性发生在比Tm低大约5℃-10℃；中等严格性发生在比Tm低大约10℃-20℃；低严格性发生在比Tm低大约20℃-25℃。正如本领域技术人员理解的，最大严格性杂交能够用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交能够用于鉴定或检测类似或相关的多核苷酸序列。

优选地，本发明包含在高严格性或中等严格性条件下能够与核苷酸序列杂交的序列之互补序列，所述核苷酸序列编码具有本文定义的具体性质的多肽。

更优选地，本发明包括能够在高严格条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})下与核苷酸序列杂交的序列之互补序列，所述核苷酸序列编码具有本文定义的具体性质的多肽。

本发明也涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。

本发明也涉及和能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的序列互补的核苷酸序列。

也包括在本发明的范围中的是在中等到最大严格性条件下，能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。

在优选的方面中，本发明覆盖了能够在严格条件下(例如50℃和0.2×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或其互补体杂交的核苷酸序列。

在更加优选的方面中，本发明覆盖了能够在高严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或其互补体杂交的核苷酸序列。

多肽的表达

用于本发明的或编码具有本文限定的具体性质的多肽的核苷酸序列能够被掺入到重组的可复制载体中。该载体可用于在和/或从相容的宿主细胞中以多肽的形式复制并表达核苷酸序列。表达可使用控制序列，包括启动子/增强子和其它表达调控信号来控制。可使用原核生物的启动子和在真核细胞中具有功能的启动子。可使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。也可使用嵌合的启动子，其包含来自两种或多种上述不同启动子的序列元件。

由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的多肽可以取决于使用的序列和/或载体被分泌或被包含在细胞内。编码序列可与信号序列一起设计，该信号序列指导所述物质的编码序列分泌通过具体的原核或真核生物的细胞膜。

表达载体

术语“表达载体”的意思是能够在体内或体外表达的构建体。

优选地，将表达载体掺入到生物体基因组中。术语“掺入”优选包括稳定地掺入基因组中。

本发明的核苷酸序列或编码具有本文所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，以使得该调节序列能够通过合适的宿主生物体来提供核苷酸序列的表达，即该载体是表达载体。

本发明的载体可以被转化到如下所述的合适的宿主细胞中来表达具有本文所限定的具体性质的多肽。

载体，例如质粒、粘端质粒(cosmid)、病毒或噬菌体载体的选择，常常依赖于它被引入的宿主细胞。

载体可以包含一种或多种可选标记基因-诸如赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。或者，该选择可以通过共转化(co-transformation)完成(如WO91/17243中所描述的)。

载体可被用于体外，例如用于产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。

因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列或编码具有本文所限定具体性质的多肽的核苷酸序列的方法，所述方法是通过将核苷酸序列引入到可复制载体中，将该载体引入到相容的宿主细胞中，并在能够引起所述载体复制的条件下使所述宿主细胞生长。

载体可以进一步包含在所述宿主细胞中能使载体复制的核苷酸序列。这些序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

调控序列

在一些应用中，可将用于本发明的核苷酸序列或编码具有本文所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可操作地连接到能(如通过选择的宿主细胞)提供所述核苷酸序列表达的调控序列上。例如，本发明包括这样的载体，其包含可操作连接于所述调控序列的本发明的核苷酸序列，即该载体是表达载体。

术语“可操作连接(operably linked)”指并列(juxtaposition)，其中所述的组分为使它们以预期的方式发挥作用的关系。“可操作连接”到编码序列的调控序列以一种方式连接使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。

术语“启动子”以本领域通常的意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。

编码具有本文限定的具体性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源的调控区，例如启动子、分泌前导序列(secretion leader)和终止子区来完成。

优选地，本发明的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作连接。

指导细菌、真菌或酵母宿主中核苷酸序列转录的合适启动子的例子是本领域公知的。

构建体

术语“构建体”，其与术语如“偶联物(conjugate)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，它包括编码具有本文所限定具体性质的多肽的核苷酸序列，用于根据本发明直接或间接与启动子连接。间接连接的例子是在启动子和本发明核苷酸序列中间提供适宜的间隔基团(spacer group)，例如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。同样，与本发明有关的术语“融合”包括直接或间接连接。在一些情况中，当编码通常与野生型基因启动子连接的蛋白质的核苷酸序列都处于它们的天然环境中时，这些术语不包括所述序列的天然组合。

所述构建体甚至可以包含或表达允许选择遗传构建体的标记物。

对于一些应用，优选所述构建体包含至少本发明的核苷酸序列或编码具有本文限定的具体性质的多肽的核苷酸序列，其可操作连接到启动子。

宿主细胞

与本发明有关的术语“宿主细胞”包括任何细胞，所述细胞包含编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列，或者如上所述的用于重组制备具有本文所限定具体性质的多肽的表达载体。

因此，本发明进一步的实施方案提供了用本发明核苷酸序列或编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可选择与上述载体相容的细胞，并可以例如是原核生物(如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选的宿主细胞不是人的细胞。

合适的细菌宿主生物体的例子是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

依赖于编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列的性质，和/或进一步加工所表达蛋白质的需求，真核生物的宿主例如酵母或其它真菌可为优选的。通常，酵母细胞相对真菌细胞是优选的，因为酵母细胞较容易操纵。然而，一些蛋白质或者从酵母细胞中分泌很差，或者在一些情况中没有被恰当加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些例子中，应选择不同的真菌宿主生物体。

合适的宿主细胞，如酵母、真菌和植物宿主细胞的用途，可以提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化(myristoylation)、糖基化(glycosylation)、截短(truncation)、脂肪化(lapidation)和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为可能需要使本发明的重组表达产物具有最佳生物活性。

所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶负性的(minus)菌株。

生物体

与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，所述生物体可包含本发明所述的核苷酸序列，或编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产物。

合适的生物体可包括原核生物、真菌，酵母或植物。

与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，所述生物体包含编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产物，和/或其中的启动子能够允许在生物体中表达编码具有本文所限定具体性质的多肽的核苷酸序列。优选的核苷酸序列被掺入到生物体的基因组中。

术语“转基因生物体”不包括在天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时所述序列在同样处于其天然环境中的它们的天然启动子的控制之下。

因此，本发明的转基因生物体包括含有如下物质之一，或其组合的生物体：编码具有本文所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列，本文定义的构建体，本文限定的载体，本文限定的质粒，本文限定的细胞，或它的产物。例如，转基因生物体也可包含在异源的启动子控制下编码具有本发明所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列。

宿主细胞/生物体的转化

正如先前指出的，宿主生物体可以是原核生物体或真核生物体。合适的原核生物宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，优选革兰氏阳性细菌，优选选自放线细菌(Actinobacteria)，例如双歧杆菌属(Biofidobacteria)和气单胞菌属，特别优选杀鲑气单胞菌。更优选Actinomicetales，例如棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌和诺卡氏菌属(Nocardia)。特别优选的是链霉菌科(Streptomycetaceae)，例如链霉菌属(Streptomyces)，特别是浅青紫链霉菌(S.lividans)。

可使用微生物宿主表达半乳糖脂酶基因，例如真细菌(Eubacteria)，古细菌(Archea)或真菌，包括酵母。优选真细菌，例如厚壁菌门(Firmicutes)(低GC-革兰氏阳性细菌)，如枯草芽孢杆菌和其它芽孢杆菌菌种，乳酸细菌，如乳杆菌属和乳球菌属的菌种。

还优选革兰氏阴性细菌Proteobacteria，特别是Gammaproteobacteria，例如属于假单胞细菌属，黄单胞菌属，柠檬酸杆菌属和埃希氏菌属的菌种，尤其是大肠杆菌。

优选宿主菌种是革兰氏阳性表达宿主，例如杀鲑气单孢菌，浅青紫链霉菌或谷氨酸棒杆菌，如在GB申请号0513859.9中所详述的。

在另一个实施方案中，该宿主细胞与天然宿主菌种归于同样的属，即重组基因是再-引入的并在菌种中表达，其中所述菌种来自与由其分离该重组基因的菌种相同的属。

在另一个实施方案中，该宿主细胞是天然的宿主菌种，即重组基因是再-引入并在菌种中表达，所述菌种与由其分离该重组基因的菌种相同。

有关原核生物宿主转化的教导在本领域中被充分报道，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果使用原核生物宿主，那么核苷酸序列在转化之前需要被适当修饰-例如去除内含子。

另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

丝状真菌细胞可以使用本领域公知的各种方法转化，例如涉及原生质体形成和原生质体转化，之后用公知的方式再生细胞壁的方法。曲霉属(Aspergillus)作为宿主微生物的用途在EP 0 238 023中描述。

另一种宿主生物体可以是植物。用于转化植物的一般技术的综述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中。有关于植物转化的进一步教导可见于EP-A-0449375。

关于真菌、酵母和植物转化的一般教导见下述部分。

转化的真菌

宿主生物体可以是真菌-例如丝状真菌。合适的所述宿主的例子包括属于嗜热霉属(Thermomyces)、枝顶孢霉属(Acrenomium)、曲霉属、青霉属、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等菌属中的任意一个成员。

关于转化丝状真菌的教导在US-A-5741665中综述，它说明了转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域公知的。如应用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的技术的范围更广的综述，例如见于Davis和de Serres的Methods Enzymol(1971)17A：79-143中。

关于转化丝状真菌的进一步教导在US-A-5674707中综述。

在一个方面中，宿主生物体可以是曲霉属，例如黑曲霉。

本发明的转基因曲霉也可用以下方法制得，例如Turner G.1994(Vectors forgenetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编者)Aspergillus：50years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)的教导。

丝状真菌中的基因表达已在Punt等(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306中综述。

转化的酵母

在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

酵母中异源基因表达的原理的综述在，例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60中提供。

在这点上，酵母-例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)，可以被用作异源基因表达的载体。

酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理的综述由E Hinchcliffe EKenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，AcademicPress Ltd.)给出。

对于酵母的转化，已开发了数个转化规程。例如，本发明的转基因酵母可以通过以下Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology153，163-168)的教导制备。

转化的酵母细胞可以使用不同的选择性标记例如营养缺陷型标记显性的抗生素抗性标记来选择。

合适的酵母宿主生物体可以选自生物技术上相关的酵母菌种，例如，但不限于，选自毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、Yarrowinia spp.、酵母属(Saccharomyces spp.)包括酿酒酵母、或裂殖酵母(Schizosaccharomyce spp.)包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)的酵母菌种。

甲基营氧(methylotrophic)酵母菌种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物体。

在一个实施方案中，宿主生物体可以是汉逊酵母属，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(如在WO01/39544中描述的)。

转化的植物/植物细胞

适于本发明的宿主生物体可以是植物。一般技术的综述可见于Potrykus(AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-IndustryHi-Tech March/April 1994 17-27)的文章，或在WO01/16308中。

分泌

通常，希望使多肽从表达宿主分泌到培养基中，而酶可更容易从所述培养基中回收。根据本发明，分泌前导序列可基于所需的表达宿主进行选择。杂交信号序列也可根据本发明的上下文使用。

异源分泌前导序列的常见例子是那些源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-具有18和24氨基酸型，例如来自曲霉)，a-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的序列。

检测

多种检测和测定氨基酸序列表达的规程是本领域公知的。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和荧光活化的细胞分选法(FACS)。

多种标记和连接技术是本领域技术人员已知的，并可用于核酸和氨基酸测定中。

许多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和实验方案。

合适的报道分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光(chemiluminescent)、显色剂，以及底物、辅因子、抑制物、磁颗粒等等。教导这些标记的用途的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。

而且，重组免疫球蛋白可如US-A-4,816,567中所述来生产。

融合蛋白

具有本文所述具体性质的多肽可作为融合蛋白产生，例如有助于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以便允许去除融合蛋白序列的蛋白质序列也是方便的。优选的融合蛋白不妨碍所述蛋白质序列的活性。

大肠杆菌中的基因融合表达系统已在Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6中综述。

在本发明的另一个实施方案中，可将具有本文所述具体性质的多肽的氨基酸序列连接到异源序列以便编码融合蛋白。例如，为了筛选多肽文库寻找能够影响物质活性的药剂，编码表达由商业上可得到的抗体识别的异源表位的嵌合物质是有用的。

现在参照下面的附图和实施例(仅仅通过例举的方式)描述本发明。

图1显示阴离子交换层析法(IEC)后得到的脂质酰基转移酶的活性图谱(PNP-辛酸酯试验)；

图2显示纯化的脂质酰基转移酶级分的SDS-PAGE分析结果(4-12％Mes，+DTT，40/10μl样品施用于该凝胶)：

1泳道.脱盐后的脂质酰基转移酶样品，40μl施用于凝胶

2泳道.脱盐后的脂质酰基转移酶样品，10μl施用于凝胶

3泳道.IEC后纯化的脂质酰基转移酶脂肪酶(合并27-39)，40μl施用于凝胶

4泳道.IEC后纯化的脂质酰基转移酶脂肪酶(合并27-39)，10μl施用于凝胶；

图3显示根据表2用脂质酰基转移酶处理豆油样品后反应产物的TLC(溶剂4)。作为对照还分析了磷脂酰胆碱(PC)；

图4显示根据表2用脂质酰基转移酶处理豆油样品后反应产物的TLC(溶剂1)。作为对照还分析了游离脂肪酸(FFA)和单酸-二酸-三酸甘油酯(TRI/DI/MONO)；

图5显示根据表2用脂质酰基转移酶处理豆油样品后反应产物的TLC(溶剂5)。作为对照还分析了胆固醇(CHL)和胆固醇酯(CHL-酯)；

图6显示根据表3用脂质酰基转移酶或Lecitase Ultra^TM处理豆油样品20小时后反应产物的TLC(溶剂4)；

图7显示根据表3用脂质酰基转移酶或Lecitase Ultra^TM处理豆油样品20小时后反应产物的TLC(溶剂5)。作为对照还分析了胆固醇酯(CHL酯)；单酸-二酸-三酸甘油酯(MONO/DI/TRI)和植物甾醇。还标明了游离脂肪酸(FFA)的鉴定；

图8显示根据表3用脂质酰基转移酶或Lecitase Ultra^TM处理豆油样品4小时后反应产物的TLC(溶剂4)。

图9显示根据表3用脂质酰基转移酶或Lecitase Ultra^TM处理豆油样品4小时后反应产物的TLC(溶剂5)。作为对照还分析了胆甾醇酯(CHL酯)；单酸-二酸-三酸甘油酯(MONO/DI/TRI)和植物甾醇。还标明了游离脂肪酸(FFA)的鉴定；

图10显示带有Asn80Asp突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体的氨基酸序列(值得注意地，氨基酸80位于成熟序列中)；

图11显示来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶氨基酸序列(SEQ IDNo 1)；

图12显示来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；

图13显示从生物体嗜水气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI：121051)；

图14显示从生物体杀鲑气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI：9964017)；

图15显示从生物体天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(Genebank登录号NP_631558)；

图16显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genebank登录号CAC42140)；

图17显示从生物体酿酒酵母中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.7)(Genebank登录号P41734)；

图18显示从生物体雷尔氏菌属(Ralstonia)中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(Genebank登录号AL646052)；

图19显示SEQ ID No.9。Scoe1 NCBI蛋白质登录号CAB39707.1GI：4539178保守的假定(hypothetical)蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图20显示SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2 NCBI蛋白质登录号CAC01477.1 GI：9716139保守的假定蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图21显示氨基酸序列(SEQ ID No.11)。Scoe3 NCBI蛋白质登录号CAB88833.1 GI：7635996推定的分泌蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图22显示氨基酸序列(SEQ ID No.12)。Scoe4 NCBI蛋白质登录号CAB89450.1 GI：7672261推定的分泌蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图23显示氨基酸序列(SEQ ID No.13)。Scoe5 NCBI蛋白质登录号CAB62724.1 GI：6562793推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图24显示氨基酸序列(SEQ ID No.14)，Srim1 NCBI蛋白质登录号AAK84028.1 GI：15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)]；

图25显示来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.Salmonicida)(ATCC#_14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；

图26显示根据表4用酶处理20小时的原豆油样品1到10的TLC(溶剂4)。PC是以5种不同浓度加入的磷脂酰胆碱(对照物质)。

图27显示根据表4用脂质酰基转移酶或Lecitase Ultra^TM处理原豆油样品(20小时)的反应产物的TLC(溶剂5)。还分析了胆甾醇酯(CHL酯)，单酸-二酸-三酸甘油酯(MONO/DI/TRI)和植物甾醇作为对照。还显示了游离脂肪酸的鉴定。

图28显示SEQ ID No 17，其为来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列；

图29显示SEQ ID No 18，其为来自近平滑念珠菌的脂质酰基转移酶的氨基酸序列；

图30显示比对1；

图31显示SEQ ID No 19。Scoe1 NCBI蛋白质登录号CAB39707.1GI：4539178保守的假定蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图32显示用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。加下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；

图33显示来自链霉菌属的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.26)；

图34显示来自Thermobifida的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.27)；

图35显示来自Thermobifida的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.28)；

图36显示来自Corynebacterium efficiens GDSx 300氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.29)；

图37显示来自Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.30)；

图38显示来自天蓝色链霉菌GDSx 269 aa的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No31)

图39显示来自除虫链霉菌\GDSx 269氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No32)；

图40显示来自链霉菌属的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No 33)；

图41显示1IVN.PDB晶体结构的带状显示，该结构在活性位点具有甘油。该图是使用Deep View Swiss-PDB浏览程序获得；

图42显示使用Deep View Swiss-PDB浏览程序获得的1IVN.PDB晶体结构侧视图，该结构中在活性位点具有甘油，活性位点甘油以内的残基用黑色显示；

图43显示比对2；

图44显示获自生物体嗜水气单胞菌的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(P10480；GI：121051)(值得注意地，这是成熟序列)。

图45显示突变体杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ IDNo.35)(值得注意地，这是成熟序列)

图46显示来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ ID No.36)

图47显示来自Streptomyces thermosacchari的氨基酸序列(SEQ ID No.37)

图48显示来自Thermobifida fusca/GDSx 548氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No38)

图49显示来自Thermobifida fusca的核苷酸序列(SEQ ID No.39)

图50显示来自Thermobifida fusca/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.40)

图51显示来自Corynebacterium efficiens/GDSx 300氨基酸的氨基酸序列(SEQID No.41)

图52显示来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.42)

图53显示来自天蓝色链霉菌/GDSx 268氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.43)

图54显示来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)

图55显示来自除虫链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.45)

图56显示来自除虫链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)

图57显示来自Thermobifida fusca/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No 47)

图58显示来自Thermobifida fusca/GDSx的核苷酸序列(SEQ ID No 48)

图59显示根据表6用酶处理原豆油样品的反应产物的TLC(溶剂4)。作为对照，还分析了磷脂酰胆碱(PC)。还显示了PE(磷脂酰乙醇胺(phosphatydylethanolamine)(PE)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)(LPC)。

图60显示根据表6用酶处理原豆油样品的反应产物的TLC(溶剂5)。对照胆固醇酯，单酸-二酸-三酸甘油酯和植物甾醇。还显示了游离脂肪酸(FFA)

图61显示L131和来自除虫链霉菌和T.fusca的同源物的比对，说明GDSx基序(L131和除虫链霉菌和T.fusca中的GDSY)，GANDY盒，其为GGNDA或GGNDL，以及HPT区(认为是保守的催化组氨酸(histadine))的保守性。这三个保守区被突出显示

实施例

本研究的目的是研究脂质酰基转移酶(本文有时被称为甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT))用于植物油，如豆油，葵花油和菜籽油脱胶的可能的用途。

本研究的一个目的是研究尤其是脂质酰基转移酶突变体(N80D)是否是更适于脱胶的酶。从较早的研究已知脂质酰基转移酶(特别是GCATs)催化脂肪酸的酰基从磷脂转移到固醇以形成溶血卵磷脂和固醇酯。

本研究在以精炼豆油为基础的模型中进行，其中所述豆油中加入了磷脂酰胆碱和植物固醇。因为更容易在模型体系中分析反应产物，所以选择该模型而不是使用原豆油。

植物油包括豆油和菜籽油的酶脱胶方法近年来正在逐渐推广，因为该方法是从油中去除卵磷脂的更廉价而且更好的方法。用于油脱胶的酶是磷脂酶A1(Lecitase Ultra^TM或胰腺磷脂酶A2-Novozymes A/S，丹麦)。

与现有技术磷脂酶A1相比较，本发明的酶用于脱胶时的一个优点是本发明的酶在脱胶过程中促进固醇酯的生成并有助于累积固醇酯，这用目前使用的磷脂酶A1(LecitaseUltra^TM)无法实现。

材料与方法。

酶

·根据本发明的脂质酰基转移酶：具有Asn80Asp突变(成熟酶的氨基酸80)的杀鲑气单孢菌酶(SEQ ID No.16(参见图10))；

·来自Novozymes，丹麦的Lecitase Ultra(#_3108)

豆油：Soya olie IP(项目编号005018/批次nr T-618-4)

卵磷脂：L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#_441601)

植物固醇：来自Henkel，德国的Generol 122 N。

生育酚：α-生育酚(项目编号.050908/批nr 4010140554)

磷脂酶活性

底物

将0.6％ L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti #441601)，0.4％ Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂溶解在0.05M HEPES缓冲液pH 7中。

试验方法：

将400μl底物加到1.5ml Eppendorf管，并置于Eppendorf热混合器(thermomixer)，37℃、5分钟。在时间T＝0时，加入50μl酶溶液。也对含有水而不是酶的空白进行分析。以10*100rpm在Eppendorf热混合器上于37℃将所述样品混合10分钟。在时间T＝10分钟时，将Eppendorf管置于另一热混合器中，在99℃、10分钟以结束反应。

样品中游离脂肪酸使用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析。

酶活性PLU-7NEFA pH7以测定条件下每分钟产生的微摩尔脂肪酸来计算。

HPTLC

供料器(Applicator)：自动TLC采样器4，CAMAG

HPTLC板：20x10cm，Merck No 1.05641.使用之前在160℃激活30min。

点样(application)：利用自动TLC供料器将1μl在缓冲液中的8％油溶液点样于HPTLC板。

操作缓冲液1：P-醚∶甲基-叔-丁基-醚∶乙酸60∶40∶1

操作缓冲液4：氯仿∶甲醇∶水75∶25∶4

操作缓冲液5：P-乙醚∶甲基-叔-丁基醚∶乙酸70∶30∶1

点样/洗脱时间：操作缓冲液1：12min

操作缓冲液4：20min

操作缓冲液5：10min

展开(developing)

将该板在烘箱中160℃干燥10分钟，冷却，并浸入16％ H₃PO4中的6％醋酸铜(cupri acetate)。在160℃再干燥10分钟并直接评价。

实施例1：酶纯化

样品：通过0.8/0.22μm过滤器过滤样品脂质酰基转移酶(Asn80Asp)(SEQ IDNo.16)。采集510ml滤液。

步骤1.脱盐，Sephadex 25G，3.2l凝胶(10cm id)

如制造商(Amersham biosciences)所述制备Sephadex柱。用20mM Na-P-缓冲液，pH 8.0平衡该柱。以25ml/min的流速将样品(510ml)施用于该柱。收集815ml脱盐的样品并保存在+4℃。

步骤2.阴离子交换层析，Q-Sepharose FF 300ml凝胶(XK 50)

如制造商(Amersham biosciences)所述制备Q-Sepharose FF柱。用20mM Na-P-缓冲液，pH 8.0平衡该柱。以15ml/min的流速将脱盐的样品施用于该柱。然后用缓冲液A洗涤该柱。用20mM Na-P-缓冲液(pH 8.0缓冲液B)中0-0.4M NaCl的线性梯度洗脱该脂肪酶。在整个操作期间收集15ml级分。以大约0.2M NaCl洗脱该脂肪酶，在操作中没有通过级分检测到脂肪酶活性。

根据PNP-辛酸酯的酶测定

使用PNP-辛酸酯作为底物进行如下试验：

将10mg底物溶解于1ml乙醇中并与9ml含有0.4％ TX100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)混合。

在35℃预培养240μl底物。通过加入25μl样品/空白开始反应。将混合物在35℃振动培养5min。使用分光光度计，在410nm不断地测量PNP的形成。空白操作包含所有组分并以缓冲液代替样品。一单位的脂肪酶活性定义为在35℃每分钟释放1μl游离辛酸的酶量。

测定分子量以及纯度。

在4-12％Nu-PAGE凝胶(+DTT)上进行SDS-PAGE，根据制造商说明书(Novex，USA)进行Coomassie染色。标准标记物是See Blue Plus2，并由Novex，USA获得。

结果

离子交换层析(IEC)纯化脂质酰基转移酶突变体N80D的层析谱在图1中显示。分析收集的级分的脂肪酶活性(根据PNP-辛酸酯试验)。级分的活性在图1中说明。

收集含有脂质酰基转移酶活性的级分(27-39，195ml)。部分纯化的脂质酰基转移酶的最终回收率为大约80％(根据pNP-辛酸酯试验)。

将纯化的脂质酰基转移酶级分进行SDS-PAGE凝胶电泳。

SDS-PAGE凝胶显示脂质酰基转移酶蛋白的分子量为大约28KDa。部分纯化的脂质酰基转移酶含有大约为10KDa的少量杂质(参见图2)。

IEC之后分析脂质酰基转移酶收集物27-39的磷脂酶活性，结果为20.4PLU-7/ml。

表1介绍了全部纯化方案，其中脂质酰基转移酶是部分纯化的，回收率为80％。

表1.脂质酰基转移酶的纯化

实施例2：脱胶试验

将来自实施例1的脂质酰基转移酶样品以表2所示的配方(formulation)用于脱胶研究。

通过将豆油加热到90℃将植物固醇，α-生育酚以及磷脂酰胆碱溶解在豆油中。然后将油冷却到大约40℃，并加入酶。在搅拌过程中将样品在40℃放置17小时然后取出样品用于通过将该样品溶解于氯仿∶甲醇2∶1中来进行HPTLC分析。

表2.具有α-生育酚和植物固醇的豆油模型用于测试脂质酰基转移酶。

HPTLC分析的结果如图3和图4所示。

图3所示的TLC结果清楚地显示通过向油中加入脂质酰基转移酶几乎100％的除去了磷脂酰胆碱。只有样品No.10包含少量的磷脂酰胆碱。样品No.10具有最大量的水，这表明在低水配方中酶脱胶可以进行得更好，或者，可以用这样的事实解释：因为样品No.10含有5％的水，因此形成了二相体系，这可使反应物和酶之间的接触较少。

由图4所示的结果可以观察到形成了少量脂肪酸，但是当固醇或α-生育酚也可在油中得到时，游离脂肪酸的量较低，因为来自磷脂酰胆碱的脂肪酸转移到固醇或生育酚以形成固醇-酯和生育酚-酯。

从图5所示的TLC结果可清楚地看到固醇酯的形成。应该注意所使用的对照物质胆固醇酯与植物-固醇-酯具有相同的保留时间(retention time)。

实施例3：脱胶试验(2)

在另一试验中，在含有磷脂酰胆碱和植物固醇的豆油中以不同的酶剂量和水含量(water concentration)测试来自IEC层析的脂质酰基转移酶收集物27-39。在该试验中还以供应商推荐的脱胶浓度测试商品磷脂酶Lecitase Ultra^TM。该试验的样品组合物在表3显示。

表3.用于测试脂质酰基转移酶和Lecitase Ultra^TM的含有植物固醇的大豆油模型(model)。

在搅拌过程中通过加热到95℃来将植物固醇和磷脂酰胆碱溶解在豆油中。然后将油冷却到40℃并加入酶。用磁力搅拌将样品保持在40℃，在4和20小时后取出样品进行TLC分析。图6到9显示4和20小时后取出样品的HPTLC分析结果。

HPTLC结果表明最低剂量的脂质酰基转移酶(0.4％相应于0.08PLU-7/g油)足以在20h反应时间后去除豆油中的磷脂酰胆碱。还观察到最高剂量的水(5％)似乎对脂质酰基转移酶水解油中的磷脂酰胆碱具有不利影响。因此预期脂质酰基转移酶转化剂量最高的样品中的水解程度越低，这通过还向样品中加入更多水的事实来解释。与此相反，观察到Lecitase Ultra^TM在最低剂量的水(1％)中具有更低的磷脂酰胆碱水解度，而LecitaseUltra^TM几乎完全除去了含有5％的水的样品中的磷脂酰胆碱。

图7的结果还表明用脂质酰基转移酶处理的样品中植物固醇的主要部分被转化为植物固醇酯，而用Lecitase Ultra^TM处理的样品中则没有形成固醇酯。图7表明LecitaseUltra^TM比脂质酰基转移酶产生了更多游离脂肪酸(FFA)。

结论

含有磷脂酰胆碱，植物固醇和生育酚的模型豆油脱胶试验显示部分纯化的脂质酰基转移酶能去除全部的磷脂酰胆碱并伴随植物固醇酯的形成，并且仅仅形成少量的游离脂肪酸。

该脂质酰基转移酶的另一优点是会生成固醇酯，特别是生育酚酯，因为固醇酯(包括生育酚酯)可提供有益的健康特性。在常规食用油加工中，脱胶之后含有水解的极性脂质(如磷脂和/或糖脂)的水相与油分离。通常在炼油过程中从食用油中除去固醇(这有时被称为脱臭(deodorising))。然而，固醇酯(和生育酚酯)抗脱臭，由此残存在油中。固醇酯在油中的累积是有吸引力的，因为已经显示人类更多摄入植物固醇酯可减少患心血管疾病的风险。

实验还表明脂质酰基转移酶能生成生育酚酯，其也会在油中积累。

这对改进油的氧化稳定性有帮助，由此成为利用本发明脂质酰基转移酶进行脱胶的另一优点。

实施例4：原油的脱胶试验

在另一试验中，在获自Solae Company，Aarhus，丹麦的原豆油(脱胶之前)中以不同的酶剂量和水含量测试来自IEC层析的脂质酰基转移酶收集物27-39。在该试验中，还以供应商推荐用于脱胶的浓度测试了商品磷脂酶Lecitase Ultra^TM。该试验的样品的组成如表4所示。

样品被置于加热块(heating block)中于40℃用磁性搅拌器搅拌。20小时后取出样品进行分析。

表4

通过HPTLC分析该油样品，结果如图26和27所示。

图26的TLC分析表明脂质酰基转移酶有效去除原豆油中的磷脂，在样品(样品3，4，6和7)中不留任何溶血卵磷脂。Lecitase Ultra^TM也去除磷脂(PC)，但是某些条带残存在层析谱中，其应该是溶血卵磷脂。还观察到脂类酰基转移酶能在很低含水量的环境中起作用，但是Lecitase Ultra^TM需要1到5％的水才能起作用。

图27的结果证实脂质酰基转移酶将游离固醇转变为固醇酯，而Lecitase Ultra^TM对固醇没有作用。图27还表明在脂质酰基转移酶和Lecitase Ultra^TM的样品中都形成了一些游离脂肪酸。以脂质酰基转移酶形成游离脂肪酸的原因可通过这样的事实说明：没有足够的酰基-供体(固醇)可获得，因此还会发生一些水解。

通过GLC分析来源于表4的样品1，2，3，6，8和10并确定固醇和固醇酯的量。结果如表5所示。

表5.固醇和固醇酯的GLC分析

在用酶处理的原豆油中(表4)

表5的结果证实本发明的脂质酰基转移酶将原豆油中的全部固醇转变为固醇酯，而商品磷脂酶Lecitase Ultra^TM显示对固醇无效。

结论

本发明的脂质酰基转移酶对原豆油的效果证实本发明的脂质酰基转移酶有效去除原豆油中的磷脂，并伴随固醇酯的形成。

实施例5

在另一试验中，在原豆油中测试来自Streptomyces thermosacchari L131的磷脂酶。

结果证实磷脂酶Streptomyces thermosacchari L131有效水解原豆油中的磷脂，并且是用于植物油脱胶的合适的替代性酶。

植物油包括豆油和菜籽油的酶脱胶方法目前正在扩展，因为该方法是更廉价且更好的方法以从植物油中去除卵磷脂。商业上用于油脱胶的酶是微生物磷脂酶A1或来自动物的磷脂酶A2。

(磷酸)脂质酰基转移酶Streptomyces thermosacchari L131是另一种能用于脱胶的酶。

介绍

本研究的目的是研究来自Streptomyces thermosacchari L131的脂质酰基转移酶用于植物油，如豆油，向日葵油和菜籽油脱胶的可能的用途。

传统上有两种方法用于油脱胶，即物理脱胶和化学脱胶。在1990年代后期，以使用胰腺磷脂酶为基础，酶脱胶的方法得到发展。由于该酶是不合于犹太饮食戒律的，所以该磷脂酶由微生物的磷脂酶A1代替。与化学或物理脱胶方法相比，酶方法具有若干优点，包括节省成本，收率更高，而且更环保。

本研究的目的是研究来自Streptomyces thermosacchari L131的脂质酰基转移酶是否为适用于脱胶的酶。从上述研究中已知Streptomyces thermosacchari L131对半乳糖脂和磷脂具有水解特性，而对甘油三酯没有显示任何活性，预期该酶在某些低含水量环境中也促进转移酶反应。本研究是在具有天然磷脂含量的原豆油中进行的。

材料和方法

酶

K371(jour 2390-30)：在淀粉上冻干的Streptomyces thermosacchari L131/浅青紫链霉菌(S.lividans)。

(活性：108PLU-7/g)。

来自Novozymes，丹麦的Lecitase Ultra(#3108)

胆固醇酯，Fluka 26950

植物固醇：来自Henkel，德国的Generol 122N

来自The Solae Company，Aarhus丹麦的原豆油

卵磷脂：L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti #441601)

磷脂酶活性

底物：

将0.6％ L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti 441601)，0.4％ Triton-X 100(SigmaX-100)，和5mM CaCl₂溶解在0.05M HEPES缓冲液pH 7中。

试验方法：

将400μl底物加到1.5ml Eppendorf管，置于Eppendorf热混合器(thermomixer)，37℃、5分钟。在时间T＝0min时，加入50μl酶溶液。也分析含有水而不是酶的空白。以10*100rpm在Eppendorf热混合器上于37℃将所述样品混合10分钟。在时间T＝10分钟时，将Eppendorf管置于另一热混合器中，在99℃、10分钟以结束反应。

使用WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸含量。

测定条件下，酶活性PLU-NEFA pH7以每分钟产生的微摩尔脂肪酸来计算。

GLC(气相色谱)

Perkin Elmer 8420 Capillary Gas Chromatograph，其配备有WCOT融合的二氧化硅柱(silica column)12.5m×0.25mm ID×0.1μm 5％苯基-甲基-硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CP Sil 8 CB来自Crompack)。

载气：氦。

注射器：1.5μl，带有分流(split)。

检测器：FID.385℃。

加热炉程序(oven temperature)： 1 2 3 4

加热炉温度[℃] 80 200 240 360

等温(isothermal)，时间[分钟] 2 0 0 10

变温速率(temperature rate)[℃/min] 20 10 12

样品制备：将由0.2克样品提取的脂质溶于2ml含有内部标准十七烷2mg/ml的庚烷∶吡啶2∶1中。将500μl的样品溶液移到曲管形瓶(crimp vial)，添加100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，90℃反应15分钟。

HPTLC

点样器(Applicator)：自动TLC采样器4，CAMAG

HPTLC板：20x10cm，Merck No 1.05641。使用前在160℃活化30分钟。

点样：利用自动TLC点样器将1μl在缓冲液中的8％油溶液点样于HPTLC板。

操作缓冲液4：氯仿∶甲醇∶水75∶25∶4

操作缓冲液5：P-醚∶甲基-叔-丁基-醚∶乙酸70∶30∶1

点样/洗脱时间：

操作缓冲液4：20min

操作缓冲液5：10min

展开

将该板在烘箱中160℃干燥10分钟，冷却，并浸入在16％ H₃PO₄中的6％醋酸铜。在160℃再干燥10分钟并直接评价。

结果。

脱胶试验。

用于脱胶研究的Streptomyces thermosacchari L131的组成如表6所示。

样品在40℃带搅拌放置18小时，此后通过将样品溶解于氯仿∶甲醇2∶1中来收集样品进行HPTLC分析。

表6.用Streptomyces thermosacchari L131和Lecitase Ultra脱胶原豆油

HPTLC分析的结果如图59和60所示。

图59根据表6酶处理原豆油样品的反应产物的TLC(溶剂4)。作为对照，还分析了磷脂酰胆碱(PC)。还显示了PE(磷脂酰乙醇胺(phosphatydylethanolamine)(PE)和溶血卵磷脂(LPC)。

图60显示根据表6酶处理原豆油样品的反应产物的TLC(溶剂5)。对照为胆固醇脂，单酸甘油酯，二酸甘油酯，三酸甘油脂和植物固醇。还显示了游离脂肪酸(FFA)

图59的TLC结果清楚地显示通过向油中加入Streptomyces thermosacchari L131来彻底除去磷脂酰胆碱。只有最低的剂量(样品2)没有彻底水解磷脂。当5％水可用时Lecitase Ultra^TM也水解油中的磷脂(样品6)，但是如果没有加入额外的水(样品5)则只有部分磷脂被水解。

图60所示的结果表明在磷脂水解的同时生成了游离脂肪酸。

结论。

来自Streptomyces thermosacchari L131的脂质酰基转移酶在生成游离脂肪酸的同时有效水解原豆油中的磷脂。

上面说明书中提及的所有出版物都并入本文作为参考。本发明描述的方法和体系的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是显而易见的而不会背离本发明的范围。尽管本发明已在优选的具体实施方案方面进行了描述，但应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限定于这些具体的实施方案。事实上，对用于实现发明的所述模式的各种修饰对于生物化学领域和生物技术领域或相关领域的技术人员来说是显而易见的，意图包含在下面的权利要求的范围之内。

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

保藏人的姓名和地址

¹当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。

表BP/4(单页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

存活证明所授予一方的名称及地址

¹指的是原始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

²对于那些细则10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

³用打叉表示选定。

表BP/9(第一页)

⁴如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

表BP/9(第二页且为最后一页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

保藏人的姓名和地址

¹当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。

表BP/4(单页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

存活证明所授予一方的名称及地址

¹指的是原始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

²对于那些细则10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

³用打叉表示选定。

表BP/9(第一页)

⁴如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

表BP/9(第二页且为最后一页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

保藏人的姓名和地址

¹当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。

表BP/4(单页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

存活证明所授予一方的名称及地址

¹指的是原始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

²对于那些细则10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

³用打叉表示选定。

表BP/9(第一页)

⁴如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

表BP/9(第二页且为最后一页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

保藏人的姓名和地址

¹当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。

表BP/4(单页)

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

存活证明所授予一方的名称及地址

¹指的是原始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

²对于那些细则10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

³用打叉表示选定。

表BP/9(第一页)

⁴如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

表BP/9(第二页且为最后一页)。

Claims (12)

1.一种包含食用油的酶脱胶的方法，其包括：

向所述食用油提供一种或多种脂质酰基转移酶；

将酰基从磷脂转移到选自固醇和甾烷醇的一种或多种酰基受体以形成一种或多种酯；

其中，所述一种或多种脂质酰基转移酶具有至少5％的酰基转移酶活性，所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.16所示或者获自杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonnicida)且与SEQ ID No.16的氨基酸序列具有98％或更高同一性，其中，

(i)以没有加入酶的食用油作为对照；

(ii)在使用食用油的酶促反应中，对来自所述反应和对照的脂质物质进行分析；

(iii)使用下式将酰基转移酶活性计算为总酶活性的百分数：

(AΧ100)/((A+Δ％脂肪酸)/Mv脂肪酸)

其中，

Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)，

Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量，并且

A＝Δ％固醇酯/Mv固醇酯；

其中Δ％固醇酯＝％固醇/甾烷醇酯(酶)-％固醇/甾烷醇酯(对照)，并且

Mv固醇酯＝固醇/甾烷醇酯的平均分子量。

2.权利要求1的方法，其中形成了固醇酯和/或甾烷醇酯。

3.权利要求1或2的方法，其中所述酰基受体是固醇。

4.权利要求中1或2的方法，其中所述磷脂是卵磷脂。

5.权利要求中1或2的方法，其中所述脂质酰基转移酶是天然脂质酰基转移酶。

6.权利要求1方法，其中所述脂质酰基转移酶包含GDSX基序。

7.权利要求6的方法，其中所述GDSX基序中的X是L。

8.权利要求1的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.16。

9.权利要求中1或2的方法，其中在处理过程中所述食用油中有少于1％的水。

10.权利要求9的方法，其中有少于0.5％的水。

11.权利要求10的方法，其中有少于0.1％的水。

12.权利要求1或2的方法，其中该方法包括通过过滤去除由脂质酰基转移酶的作用而生成的溶血磷脂。