JP5926801B2 - プラスマローゲンの加水分解方法、プラスマローゲンの測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な作用を有するホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する方法、また上記のホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンを測定する方法、また上記のホスホリパーゼを含有する加水分解用又は測定用の組成物、また上記のホスホリパーゼを製造する方法に関する。本発明が利用可能な技術分野は、例えばプラスマローゲン及び／又はリゾプラスマローゲンが関連する疾病等の診断技術、プラスマローゲン及び／又はリゾプラスマローゲンを含有する食料・食品の生産技術などである。

公知のホスホリパーゼＡ２（ＥＣ ３．１．１．４）は、カルシウムイオンの存在下、リン脂質のｓｎ−２位を加水分解してリゾリン脂質とする作用を示す分子量１４〜１８．５ｋＤａの酵素である（非特許文献１）。

プラスマローゲンはリン脂質の１つであるので、プラスマローゲンのｓｎ−２位を加水分解してリゾプラスマローゲンとする作用を有する酵素は、ホスホリパーゼＡ２であると考えられてきた（非特許文献２）。

リン脂質のｓｎ−２位を加水分解してリゾリン脂質とする作用を有するその他の公知の酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＥＣ ３．１．１．３２）がある。ホスホリパーゼＡ１はリン脂質のｓｎ−１位を加水分解してリゾリン脂質とする作用が主であるが、ｓｎ−２位を加水分解してリゾリン脂質とする作用も有する（非特許文献１）。微生物由来のホスホリパーゼＡ１として、作用にカルシウムイオンが必要であるホスホリパーゼＡ１（非特許文献３）と、作用がカルシウムイオンで活性化されるホスホリパーゼＡ１（非特許文献４）とが公知である。微生物由来のホスホリパーゼＡ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は３５ｋＤａであると報告されている（非特許文献４）。

酵素ハンドブック（朝倉書店、１９８４年） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０巻、２００１年、１９９−２２９頁 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０巻、１９７１年、４４４７−４４５６頁 Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４２巻、２００８年、 １８７−１９４頁

本発明の解決課題は、ホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する方法、ホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンを測定する方法、ホスホリパーゼを含有する組成物、ホスホリパーゼを製造する方法を提供することである。

本発明者らは、非特許文献２の情報に従い、ホスホリパーゼＡ２の作用によりプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンへ加水分解することを試みた。ところが、ホスホリパーゼＡ２は、カルシウムイオンの存在下でも、効率よくプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンへ加水分解する作用を有しない場合があるという、従来の常識とは異なる知見を本発明者らは見出した。

次に本発明者らは、日本農芸化学会２０１１年度大会（講演番号：２Ｃ１０ａ０５）において、ホスホリパーゼＡ１とホスホリパーゼＡ２の作用を併せもつと報告され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が約４０ｋＤａであるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＮＡ６８４由来ホスホリパーゼ（本明細書ではＰＬＢという場合がある）の作用によるプラスマローゲンのリゾプラスマローゲンへの加水分解を試みた。

ところが、ＰＬＢは、カルシウムイオンの存在下でも、効率よくプラスマローゲンを脂肪酸とリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有しない場合があることを見出した。

そこで、本発明者らは、ホスホリパーゼＡ１とホスホリパーゼＡ２の作用を併せもつが、ホスホリパーゼＡ１の作用の方がホスホリパーゼＡ２の作用より強いホスホリパーゼの作用によるプラスマローゲンのリゾプラスマローゲンへの加水分解を試みた。その結果、このホスホリパーゼは効率よくプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有するという、従来の常識からは予見不可能であった知見を本発明者らは見出した。さらにこのホスホリパーゼが、
（ｉ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、１８：１）に対する相対活性が、ジパルミトイルホスホコリンに対して、１９±５％であり、
（ｉｉ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリンに対して、２９±１３％であり、
（ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が約２５〜３０ｋＤａの範囲である、
という点で公知のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＡ２とは明確に異なることを見出した。

このようにして本発明者らは、上記のホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する新規な方法と、上記のホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンを測定する新規な方法とを見出し、さらに上記のホスホリパーゼを含有する組成物と上記のホスホリパーゼを製造する方法とを創出して本発明を完成した。

本発明によれば、効率よくプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解することができる。

新規なホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ））のプラスマローゲン（Ｐｌｓ）をリゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓ）に加水分解する作用と、公知のｌｙｓｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎａｓｅを使用する、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を測定する方法を示す簡略図である。 ＰＬ（Ａ）のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用と、Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄを使用するＰｌｓＥｔｎを測定する方法を示す簡略図である。 各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、及びＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）の活性測定方法を示す簡略図である。 ホスファチジルコリンのｓｎ−１位とｓｎ−２位に対するＰＬ（Ａ）の反応速度の比較を示すグラフである。 各ホスホリパーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動写真である。 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による、各ホスホリパーゼのブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに対する作用の比較を示す写真である。ただし、カルシウムイオンの存在下である。 ＴＬＣによる、各ホスホリパーゼのＰｌｓＥｔｎ（化１）に対する作用の比較を示す写真である。ただし、カルシウムイオンの存在下である。 ＴＬＣによる、各ホスホリパーゼのブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに対する作用の比較を示す写真である。ただし、カルシウムイオンの非存在下である。 ＴＬＣによる、各ホスホリパーゼのＰｌｓＥｔｎ（化１）に対する作用の比較を示す写真である。ただし、カルシウムイオンの非存在下である。 ＴＬＣにより、ＰＬ（Ａ）酵素量とＰｌｓＥｔｎ（化１）への作用の関係を比較した結果を示す写真である。 ＴＬＣにより、ｐＨとＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎへの作用の関係を比較した結果を示す写真である。 ＰＬ（Ａ）のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用と公知のｌｙｓｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎａｓｅを使用した、ＰｌｓＥｔｎ（化４）の検量線である。 ＴＬＣによる、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）が、ＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用することを示す写真である。ただし、カルシウムイオンの非存在下である。

本発明について、以下具体的に説明する。

本発明は、ホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する方法、ホスホリパーゼを用いて試料中の未知濃度のプラスマローゲンの含有量を測定する方法、ホスホリパーゼを含有する組成物、ホスホリパーゼを製造する方法である。

本発明のプラスマローゲン（ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ、Ｐｌｓと略す場合がある）は、公知のＰｌｓを含む。本発明の好ましいＰｌｓは、グリセロリン脂質のうち、ｓｎ−１（Ｃ１）位に脂肪酸がビニルエーテル結合したアルケニルアシル型グリセロリン脂質（アルケニルアシル型エーテルリン脂質）であり、以下の（化１）で表される。

（式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、低級若しくは高級アルキル基又はアルケニル基であり、Ｘは、水素、コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール、エタノール又はこれらの誘導体である）
本発明においては特に上記式中、Ｘがコリン又はエタノールアミンであるＰｌｓが好ましい。本明細書中において、上記式中、Ｘがコリンの場合をコリン型プラスマローゲン（ＰｌｓＣｈｏと略す場合がある）といい、Ｘがエタノールアミンの場合をエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎと略す場合がある）という。本明細書中において単にＰｌｓと記載した場合は、少なくともＰｌｓＣｈｏとＰｌｓＥｔｎを含み、本発明においてはＰｌｓＥｔｎが好ましい。

本発明のリゾプラスマローゲン（ｌｙｓｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ、ｌｙＰｌｓと略す場合がある）は、公知のｌｙＰｌｓを含む。本発明において好ましいｌｙＰｌｓは、グリセロリン脂質のうち、ｓｎ−１位に脂肪酸がビニルエーテル結合したアルケニルアシル型グリセロリン脂質（アルケニルアシル型エーテルリン脂質）であり、以下の（化２）で表される。

（式中、Ｒ_１は、低級若しくは高級アルキル基又はアルケニル基であり、Ｘは、水素、コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール、エタノール又はこれらの誘導体である）
本発明においては特に上記式中、Ｘがコリン又はエタノールアミンであるｌｙＰｌｓが好ましい。本明細書中において、上記式中、Ｘがコリンの場合をコリン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＣｈｏと略す場合がある）といい、Ｘがエタノールアミンの場合をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎと略す場合がある）という。本明細書中において単にｌｙＰｌｓと記載した場合は、少なくともｌｙＰｌｓＣｈｏとｌｙＰｌｓＥｔｎを含み、本発明においてはｌｙＰｌｓＥｔｎが好ましい。

本発明においてＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法に用いるホスホリパーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ）は、以下に示す特性や性質のいずれかを有するものであることが好ましい。すなわち、ホスホリパーゼは、リン脂質を脂肪酸とその他の親油性物質に加水分解する作用（性質）、具体的にはリン脂質のｓｎ−１位のアシル基を加水分解する作用（ホスホリパーゼＡ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ１））、リン脂質のｓｎ−２位のアシル基を加水分解する作用（ホスホリパーゼＡ２（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２））、リン脂質のｓｎ−１位及びｓｎ−２位のアシル基を加水分解する作用、リゾリン脂質のｓｎ−１位又はｓｎ−２位のアシル基を加水分解する作用（ホスホリパーゼＢ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｂ））の作用のうちのいずれか１つ以上の作用を有するものであることが好ましく、その他の特性や性質の有無は特に限定されない。また本願明細書に記載の特性や性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていればさらに好ましい。さらに好ましくは、後述する特性（ａ）から（ｃ）までを、特に好ましくは（ａ）から（ｅ）までを、さらに好ましくは（ａ）から（ｍ）までを有することであり、そのようなホスホリパーゼを、本明細書ではＰＬ（Ａ）という場合がある。

なお、本発明において実験方法は、例えば「蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂」、「バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ、編集森山達哉、羊土社、２００５年」、「バイオ実験イラストレイテッド〈５〉タンパクなんてこわくない、西山敬人、秀潤社、２００３年第１版第５刷」や、市販のキットなどに添付された手順書などに従えば実施できるものであるが、測定値は測定の条件や使用機器の精度などによりその値は変化し得る。

（ａ）ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性が０．６６±０．２Ｕ／ｍｇである。

ここで、「ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）」とは、ｓｎ−１位の脂肪酸の炭素数が１８、ｓｎ−２位の脂肪酸の炭素数が２０で二重結合の数が４であるＰｌｓＥｔｎを意味する。そのようなＰｌｓＥｔｎの一例として、１−（１Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ）−２−ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅが挙げられる（化３）。このＰｌｓＥｔｎは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．より、品番８５２４６９として購入できる。

ここで、「比活性（Ｕ／ｍｇ）」は、活性（Ｕ／ｍＬ）とタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定し、以下の（数１）で算出する。

活性（Ｕ／ｍＬ）は以下の方法で測定することができる。

＜第一反応試薬混合液＞
８０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
５０ｍＭ 塩化カルシウム
４ｍＭ ＡＴＰ
４ｍＭ ＣｏＡ
１．０６Ｕ／ｍＬ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）
＜第二反応試薬混合液＞
４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５
０．０６％ ４−ＡＡ
０．０４％ フェノール
４．５Ｕ／ｍＬ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
３０Ｕ／ｍＬ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｏｘｉｄａｓｅ
０．２％ トリトンＸ−１００
２０ｍＭ ＡＴＰ
０．１ｍＭ ＦＡＤ
Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＥＣ ６．２．１．３）及びＡｃｙｌ−ＣｏＡ Ｏｘｉｄａｓｅ（ＥＣ １．３．３．６）は旭化成ファーマ株式会社から入手することができる（品番はそれぞれＴ−１６及びＴ１７）。

＜反応停止液＞
０．５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０
＜ＰＬ（Ａ）溶解希釈用液＞
０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
＜測定操作法＞
（１）小試験管に第一反応試薬混合液０．５０ｍＬずつを正確に分注し、３７℃で予備加温する。

（２）５分経過後、適切な濃度に酵素溶解希釈緩衝液で希釈したＰＬ（Ａ）を５０μＬ正確に加えて混和し、３７℃で第一反応を開始する。盲検は酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈緩衝液５０μＬを加える。

（３）１０分経過後、２０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）溶液０．５０ｍＬを加えて混和し、１５秒後に第二反応試薬混合液０．５０ｍＬを加えて混和し、３７℃で第二反応を開始する。

（４）５分経過後、反応停止液１．５０ｍＬを加えて混和し、反応を停止する。

（５）５００ｎｍにおける吸光度を測定する。求められた吸光度を試料液についてはＡｓ、盲検液についてはＡｂとする。吸光度範囲はΔＡ＝（Ａｓ−Ａｂ）≦０．２５Ａｂｓとする。

＜計算＞
以下の（数２）に従い活性を計算する。なお、１ユニット（Ｕ）とは、上記の条件下、ＰＬ（Ａ）がＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）を加水分解する作用をして脂肪酸を１分間に１μｍｏｌ生成する酵素量とする。

タンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、例えば紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法などで測定すればよいが、手軽であるので紫外吸収法が好ましい。

本発明においてＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性は、存在すればよいので下限は設けないが、あえて設けるとすると０．１Ｕ／ｍｇであり、０．２Ｕ／ｍｇでもよく、０．３Ｕ／ｍｇでもよく、０．４Ｕ／ｍｇでもよいが、０．４６Ｕ／ｍｇが最も好ましい。本発明においてＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性は、高いほど好ましいので上限は設けないが、あえて設けるとすると２００Ｕ／ｍｇであり、１００Ｕ／ｍｇでもよく、５０Ｕ／ｍｇでもよく、１０Ｕ／ｍｇでもよく、５Ｕ／ｍｇでもよく、２Ｕ／ｍｇでもよく、１Ｕ／ｍｇでもよく、０．８６Ｕ／ｍｇが最も好ましい。

（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が約２５〜３０ｋＤａの範囲である。

本発明におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法による分子量測定とは、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ））により変性（ＳＤＳ−タンパク質複合体を形成させる）したタンパク質（ポリペプチド）に、アクリルアミドを重合させたゲル中で電圧を付加し、その移動度によってそれぞれのポリペプチドが分離できることを利用する分子量の測定方法である。

なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量測定においては、使用する分子量マーカーの種類や数、ポリアクリルアミドゲルのポリアクリルアミド含有率、大きさ、製法など、泳動ｂｕｆｆｅｒの種類、ｐＨ、濃度、電圧を付加する際の、温度、電流、時間など、ポリペプチドの染色方法、脱色方法など、によって測定値が誤差を含み得る。

本発明においてホスホリパーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は約２５〜３０ｋＤａの範囲であれば限定されないが、下限は約２５ｋＤａであり、２６ｋＤａであれば好ましく、２７ｋＤａであればさらに好ましい。上限は約３０ｋＤａであり、２９ｋＤａであれば好ましく、２８ｋＤａであればさらに好ましい。

（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。

（ｆ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ由来である。

（ｇ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来である。

本発明においてホスホリパーゼの由来は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物（放線菌）であればよいが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のホスホリパーゼであれば好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０１４）又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０（＝ＤＳＭ ４６４９２）由来であれば最も好ましい。

例えば土壌、湖沼、海、生物の表面や体腔内などから分離した菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物であるかどうかは、例えば「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ 第２版（２００１年）」、「微生物の分類・同定実験法―分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）シュプリンガー・フェアラーク東京、２００１年９月」などに記載の方法、市販の細菌同定検査用製品（例えばＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社）を使用する方法、「株式会社テクノスルガ・ラボ（静岡県静岡市）」などに委託する方法などにより同定すればよい。

さらにそれらの菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓであるかどうかは、「Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ Ｅ．、Ｅｂｅｒｓ Ｊ．： Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ： ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ， ｎｏｖ， １５２−１５５頁、２００６年」に記載の方法などで判断すればよい。すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性がある、又は１６Ｓ ｒＲＮＡが９８．５％以上同一であれば同族同種と判断できる。好ましくはＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性があれば同族同種と判断する。

（ｄ）カルシウムイオン非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）に対する相対活性が、ジパルミトイルホスホコリンに対して、１９±５％である。

ここで「ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）」とは、ｓｎ−１位の脂肪酸の炭素数が１８、ｓｎ−２位の脂肪酸の炭素数が１８で二重結合の数が１であるＰｌｓＥｔｎを意味する。そのようなＰｌｓＥｔｎの一例として、１−（１Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ）−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅが挙げられる（化４）。このＰｌｓＥｔｎは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．より、品番８５２７５８として購入できる。

ここで、「ジパルミトイルホスホコリン（ＤＰＰＣ）」とは、ｓｎ−１位の脂肪酸の炭素数が１６、ｓｎ−２位の脂肪酸の炭素数が１６であるホスファチジルコリンである。そのようなホスファチジルコリンの一例として、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが挙げられる（化５）。このＰｌｓＥｔｎは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．より、品番８５０３５５として購入できる。

ここで、相対活性とは、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）とＤＰＰＣに対するＰＬ（Ａ）の反応速度（加水分解速度（作用する速度））の相対値（％）を意味し、以下の（数３）で表される。

本発明におけるＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）の、ＤＰＰＣに対する相対活性（％）は１９±５％であるが、９％以上でもよく、１１％以上でもよく、１２％以上でもよく、１３％以上でもよく、１４％以上でもよく、１５％以上であれば好ましく、１６％以上であればさらに好ましい。相対活性は高いほどよいことはいうまでもないので上限は特に設けないが、上限を設けるとすれば１００％以下であり、８０％以下でもよく、６０％以下でもよく、４０％以下でもよく、３０％以下でもよく、２４％以下でもよく、２１％以下でも好ましく、１９％以下でもよい。

（ｅ）カルシウムイオン非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリンに対して、２９±１３％である。

ここで、「１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）」とは、ｓｎ−１位の脂肪酸の炭素数が１６、ｓｎ−２位の脂肪酸の炭素数が１８で二重結合の数が１であるホスファチジルコリンである。そのようなホスファチジルコリンの一例として、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが挙げられる（化６）。このＰＯＰＣは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．より、品番８５０４５７として購入できる。

ここで、相対活性とは、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）とＰＯＰＣに対するＰＬ（Ａ）の反応速度（加水分解速度（作用する速度））の相対値（％）を意味し、以下の（数４）で表される。

本発明におけるＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）の、ＰＯＰＣに対する相対活性（％）は２９±１３％であるが、１６％以上であれば好ましく、２０％以上であればさらに好ましい。相対活性は高いほどよいことはいうまでもないので上限は特に設けないが、上限を設けるとすれば４２％以下であり、３５％以下でも好ましく、３０％以下でもよい。

上述の（ｄ）及び（ｅ）におけるカルシウムイオンの由来は、そのカウンターイオン（対イオン）により限定されないが、例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩などが挙げられる。

本発明における「非存在」とは、カルシウムイオンを意図的に存在させないことを意味する。また、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する組成物中の、水、ｐＨ緩衝剤、Ｐｌｓ、本発明におけるホスホリパーゼや容器などにもカルシウムイオンを意図的に含有させないことを意味する。すなわち、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する組成物中に、本発明者らの過失無くカルシウムイオンが存在する場合も本発明における「非存在」に含まれる。そのようなＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する組成物中のカルシウムイオンの濃度は、１０μＭ以下であればよく、１μＭ以下であれば好ましく、０．１μＭ以下であればさらに好ましく、０μＭが最も好ましい。

（ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。

（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

（ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

（ｋ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。

（ｌ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

（ｍ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

すなわち、本発明のＰＬ（Ａ）は、例えば配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、またその他に配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に均等なアミノ酸配列や、触媒作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させ、又は各種のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、またこのアミノ酸配列は配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有するホスホリパーゼを用いることができる。そのようなアミノ酸配列の好ましい相同性は５０％以上であり、６０％であれば好ましく、７０％以上であればさらに好ましく、８０％以上であれば特に好ましく、最も好ましくは９０％以上である。

本発明のＰＬ（Ａ）のＮ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン酵素など機能性酵素やその他のアミノ酸配列からなる部分を付加したり、融合酵素としたりすることも好ましく、その付加する部分により精製や確認などをすることのできるタグと呼ばれる部分を融合させ、場合によっては、そのタグ部分を削除しても、場合によってはその全部又は一部が残る場合も例示される。例えば、本発明のＰＬ（Ａ）を菌体外やペリプラズムへ輸送するための約２０個のシグナルペプチドや、効率的な精製を行うための４〜１０個のＨｉｓの付加でもよいし、それらを直列して付加してもよい。また、それらのアミノ酸配列の間などに数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。上述の付加の例と同様に、欠失、又は置換を行うことができ、例えば、本発明のＰＬ（Ａ）の本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインが存在する場合や、配列番号１に記載のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。また、欠失、置換若しくは付加を適宜組み合わせることも可能である。その付加アミノ酸残基としてはシグナルペプチド、ＴＥＥ配列、Ｓタグ、又はＨｉｓタグなどが挙げられる。配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸を欠失する場合は、例えば、Ｎ末端側のＭｅｔ又はＣ末端側のＬｙｓから順に削除する例が挙げられる。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端のＭｅｔの欠失や、Ｎ末端がアシル基やアルキル基などによる修飾を受けるなどの翻訳後修飾されたホスホリパーゼも本発明のＰＬ（Ａ）である。また、本発明のＰＬ（Ａ）を公知の方法で無水コハク酸やＰＥＧなどにより化学修飾して、本発明のＰＬ（Ａ）の至適ｐＨや安定性などの性質を利用しやすいように変化させることも可能である。本発明のＰＬ（Ａ）の好ましいアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列である。

配列番号１の場合、本発明のＰＬ（Ａ）の分子量は２７１９９であり、配列番号２の場合、本発明のＰＬ（Ａ）の分子量は２７５６５と推定される。分子量は上述のタグ部分の付加や一部のアミノ酸の欠失などにより変化する。

本発明のＰＬ（Ａ）の塩基配列が必要となるのであれば、上述の配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を用いればよい。本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法に用いるホスホリパーゼの好ましい塩基配列は配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列であり、それぞれ配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードしている。

配列番号９及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号９及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする任意の塩基配列を遺伝子暗号表から選択すればよく、好ましい塩基配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号１１又は配列番号１２に記載の塩基配列であり、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号１３又は配列番号１４に記載の塩基配列である。

本発明のＰｌｓは試料中のＰｌｓであれば好ましい。本発明のＰｌｓの由来は特に限定されないが、試料中のＰｌｓであれば好ましい。試料としては、血漿、血清、尿、研究用試料などを挙げることができ、Ｐｌｓを含有すると予想される全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、尿などを含む生体試料や研究用試料及びそれらの抽出物などを挙げることができ、それらの試料は、Ｐｌｓを含有すると予想される試料であれば好ましい。その他の試料としては、例えば、ホヤ、オキアミ、貝、などの生物からの抽出物、海水、天然水、果汁、飲料、廃液などが挙げられる。そのような試料中のＰｌｓには、例えば（化３）や（化４）のようなＰｌｓが含まれると予想されるし、その他のＰｌｓも複数種類混合していると考えられる。

Ｐｌｓが試料中に含まれている可能性の有無の判断には、本発明の測定方法を実施する前にＰｌｓが試料中に含まれている可能性の有無が判断できる場合を含み（例えば通常ヒト血中にはＰｌｓは含まれている（Ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ− ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｇｉｎｇ．Ｍａｅｂａら、Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．２００７年１４巻１号１２−１８頁。））、ＨＰＬＣ（特開２００７−３３４１０号公報）やＬＣ−ＭＳ（特開２０１１−１３６９２６号公報）などの従来技術により可能性の有無を判断してもよい。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法において使用するＰＬ（Ａ）の量は、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できれば、及び／又はＰｌｓを測定できれば特に限定されず、試料に含まれるＰｌｓの存在量、目的とするＰｌｓを加水分解する程度、使用する装置、ＰＬ（Ａ）の純度、及び／又は経済的な事情などに応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。さらにｐＨ緩衝剤、金属イオン、界面活性剤を使用する場合、その種類と量についても同様である。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法において使用するＰＬ（Ａ）の量は、例えば、試料に含まれるＰｌｓの存在量が２μｍｏｌ以下で、その全てを３７℃、１０分間で加水分解する条件の場合、下限が０．０５ｍＵ以上、好ましくは０．１ｍＵ以上、さらに好ましくは０．５ｍＵ以上、ホスホリパーゼ量が多いほど加水分解の効率がよいことは明らかであるので上限は特に設けないが、例えば経済的な理由などで上限を設けるならば１０Ｕ以下、好ましくは５Ｕ以下、さらに好ましくは１Ｕ以下である。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法は、液体中、気相、又は固相などやそれぞれの臨界面で実施すればよいが、液体中で実施することが好ましい。液体には水溶液、有機溶媒などが考えられ、本発明の測定方法を水溶液中で実施することが好ましいが、適宜の有機溶媒を含有した水性媒体でもよく、そのような場合は適宜のｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤を使用する場合、その種類は目的のｐＨを保つことができ、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できれば、及び／又はＰｌｓを測定できれば特に限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、酢酸／ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液が例示できる。本発明を実施する際のｐＨは、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できれば、及び／又はＰｌｓを測定できれば特に限定されないが、下限としてｐＨ４以上、好ましくはｐＨ５以上、さらに好ましくはｐＨ６以上が例示され、上限としてはｐＨ１１以下、好ましくはｐＨ１０．５以下、さらに好ましくはｐＨ１０以下が例示される。ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができ、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できれば、及び／又はＰｌｓを測定できれば特に限定されないが、下限として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下、さらに好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法のその他の好ましい態様として、例えばゾル・ゲル法を用いて酵素（ＰＬ（Ａ）等）を固定化したりセンサーを作製したりすることが挙げられる。ゾル・ゲルとするためには、例えば、寒天などの多糖類を利用すればよい。ゾル・ゲルと乳濁液を区別する場合は、乳濁液として実施してもよい。乳濁液とするためには、例えば、有機溶媒などを利用すればよいし、両親媒性物質を利用すればミセルとしても実施できる。いずれの場合も、ｐＨ緩衝剤を用いる場合は上記と同様である。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法において、反応時間は、試料中のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できれば、及び／又はＰｌｓを測定できれば特に限定されないが、それぞれ、下限が１５秒以上、好ましくは１分以上、さらに好ましくは３分以上である。上限は特に設けないが、好ましくは３０分以下、さらに好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法及び／又はＰｌｓを測定する方法において、温度は、試料中のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解できる温度、及び／又はＰｌｓを測定できる温度であれば特に限定されないが、使用するホスホリパーゼの作用温度の範囲内が好ましく、下限は１０℃以上、好ましくは２０℃以上、さらに好ましくは２５℃以上、上限は７０℃以下、好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下である。

本発明のＰｌｓを測定する方法は、本明細書に記載の特性や性質を有するＰＬ（Ａ）を用いてＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する方法を含む。すなわち、本発明のＰｌｓを測定する方法は、
＜工程１＞本明細書に記載の特性や性質を有するホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ））を用いてＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する工程、
を含む。

本発明のＰｌｓを測定する方法は、さらに＜工程１＞とは別異のｌｙＰｌｓを測定するための公知の工程を含んでもよい。そのような工程の例は、
＜工程２−１＞ｌｙｓｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎａｓｅ（ＥＣ ３．３．２．２； ＥＣ ３．３．２．５、ａｌｋｅｎｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３７巻、１９９９年、１４２〜１５６頁、Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８６巻、２４９１６〜２４９３０頁、２０１１年）「ｌｙＰｌｓ ａｓｅ」と略す場合がある）を用いる方法、
＜工程２−２＞薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などを用いる方法、
＜工程２−３＞Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ（Ａｕｔｏｔａｘｉｎ，Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７巻、２００２年、３９４３６−３９４４２頁）を用いる方法、
＜工程２−４＞ＨＰＬＣを使用する方法（特開２００７−３３４１０号公報）、
＜工程２−５＞ＬＣ−ＭＳ（特開２０１１−１３６９２６号公報）を使用する方法、
などが挙げられる。

試料中にＰｌｓ以外の物質が混在してもそれを消去することなくＰｌｓを正確に測定できるという観点からは＜工程２−１＞が好ましい。測定に必要な材料が安価で手軽に入手でき、当業者なら容易に実施できるという観点からは＜工程２−２＞が好ましい。＜工程２−３＞は＜工程２−１＞に比較して使用する酵素の種類がひとつ少ないという観点で好ましい。正確に定量できるという観点からは＜工程２−４＞が好ましい。Ｐｌｓの分子種（「化１」のＲ_１）も特定できるという観点からは＜工程２−５＞が好ましい。

＜工程１＞と＜工程２−１＞を含む本発明のＰｌｓを測定する方法のうち、ＰｌｓＥｔｎを測定する方法を図１に簡略して示した。ここで使用するｌｙＰｌｓ ａｓｅは、「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３７巻、１９９９年、１４２〜１５６頁」又は「Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８６巻、２４９１６〜２４９３０頁、２０１１年」に記載の方法で製造できるラット由来のｌｙＰｌｓ ａｓｅを使用する。また、Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＧＰＣＰ、ＥＣ ３．１．４．２）は旭化成ファーマ株式会社から購入できる（品番Ｔ−３３）。Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅをＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８年、７２巻、２７３２−２７３８頁の方法で製造し、特許第４２４４１６８号公報に記載の方法で定量すればよい。なお、ＰｌｓＣｈｏを測定する場合は、上記のＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅの代わりに、Ｃｈｏｌｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅを旭化成ファーマ株式会社から購入し（品番Ｔ−０５）、特開昭５８−２８２８３号公報に記載の方法で定量すればよい。

Ｈ_２Ｏ_２はＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ、ＥＣ １．１１．１．７）、後述するフェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体などのトリンダー試薬の色原体、４−アミノアンチピリン若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどのカップラーを使用するなど公知の方法で定量できる。Ｈ_２Ｏ_２は蛍光法や電極法でも分析することができる。蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体などを、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロールなどを用いることができる。

Ｈ_２Ｏ_２を電極で測定する場合、電極にはＨ_２Ｏ_２との間で電子を授受することのできる材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金、銀などが挙げられ電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの公知の方法を用いることができ、さらにオキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流あるいはその電気量を測定してもよい。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体などの物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成するＨ_２Ｏ_２と電極の間に電子伝達体を介在させて得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定してもよい。本発明において分析用試薬には必要に応じて緩衝液、酵素の安定化剤、防腐剤などを適宜使用する。

＜工程２−１＞において使用するｌｙＰｌｓ ａｓｅの酵素の量は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３７巻、１９９９年、１４２〜１５６頁の記載と同じく、４．２Ｕ／ｍＬである。

＜工程２−１＞において使用するｌｙＰｌｓ ａｓｅは、Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８６巻、２４９１６〜２４９３０頁、２０１１年」に「Ｔｍｅｍ８６ｂ（発明者註：ｌｙＰｌｓ ａｓｅの遺伝子） ｈａｓ ｏｎｌｙ ｂｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎｓ， ｍｉｃｅ， ｒａｔｓ， ｃｏｗｓ， ｄｏｇｓ， ａｎｄ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．」と記載されているので、ヒト、マウス、ラット、牛、犬、セブラフィッシュ由来を使用する。

＜工程２−２＞のＴＬＣは、例えば「バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ、編集森山達哉、羊土社、２００５年」に記載された公知の方法を適宜組み合わせて実施すればよく、検出方法としてはＵＶランプや呈色による方法が挙げられ、呈色剤としてはアニス−硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、ニンヒドリン溶液、カメレオン溶液、２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液、ブロモクレゾールグリーン溶液、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬などの公知の試薬を目的、試料、使用する装置などに応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。

＜工程１＞と＜工程２−３＞を含む本発明のＰｌｓを測定する方法のうち、ＰｌｓＥｔｎを測定する方法を図２に簡略して示した。ここで使用するＬｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄは、例えば「Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７巻、３９４３６〜３９４４２頁、２００２年」に記載のヒト由来の酵素を使用することができる。Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅとＰｌｓＣｈｏを測定する場合については、＜工程２−１＞の場合と同様である。＜工程２−３＞において使用するＬｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄの酵素の量は、＜工程２−１＞の場合と同様である。

＜工程１＞と＜工程２−１＞、＜工程２−２＞又は＜工程２−３＞はそれぞれ別異の反応槽（相）で実施できるが、同一反応槽（相）で実施することが好ましい。また、＜工程１＞と＜工程２−１＞、＜工程２−２＞又は＜工程２−３＞は、不連続に実施できるが、連続して実施することが好ましい。また、＜工程１＞と＜工程２−１＞、＜工程２−２＞又は＜工程２−３＞は、＜工程１＞の次に＜工程１＞と＜工程２−１＞、＜工程２−２＞又は＜工程２−３＞を行ってもよく、＜工程１＞と＜工程２−１＞、＜工程２−２＞又は＜工程２−３＞を同時に行ってもよい。＜工程１＞と＜工程２−４＞又は＜工程２−５＞は通常＜工程１＞、＜工程２−４＞又は＜工程２−５＞の順で行われる。これらの反応槽（相）や実施の順序は、目的、試料、使用する装置などに応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。

＜工程２−１＞及び＜工程２−３＞のｐＨ、反応時間、反応温度などの態様は＜工程１＞と同様であるが、＜工程１＞と＜工程２−１＞又は＜工程２−２＞のｐＨ、反応時間、反応温度などの態様は必ずしも＜工程１＞と均一でなくてもよく、本明細書に記載の範囲で＜工程１＞と不均でもよい。

本発明の特性や性質を有するＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するためのＰＬ（Ａ）及び／又はＰｌｓを測定するためのＰＬ（Ａ）は、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物及び／又はＰｌｓを測定するための組成物となり得る。

本発明の組成物は下記の（Ｉ）の成分を含む組成物（ホスホリパーゼ含有組成物）であればよいが、本発明の特性や性質を有する（Ｉ）であれば好ましい。また本発明の組成物は（Ｉ）、（Ｖ）及び（ＩＶ）の成分を含む組成物でもよいが、（Ｉ）〜（ＩＶ）の成分を含む組成物がさらに好ましい。組成物はＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物、Ｐｌｓを測定するための組成物、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解してＰｌｓを測定するための組成物のいずれであってもよい。

（Ｉ）ＰＬ（Ａ）
（ＩＩ）公知のｌｙＰｌｓ ａｓｅ
（ＩＩＩ）ＧＰＣＰ
（ＩＶ）Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ
（Ｖ）Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ
これらの組成物は必要に応じて、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｃａｔａｌａｓｅ（ＥＣ １．１１．１．６）、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体などのトリンダー試薬の色原体、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどのカップラーを含有してもよい。

トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体などが使用可能であり、具体例としてＮ，Ｎジメチルアニリン、Ｎ，Ｎジエチルアニリン、２，４ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル− ３， ５ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３− スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）（以上同人化学研究所社製）などが挙げられる。また過酸化水素はパーオキシダーゼ存在下ロイコ型試薬を用いて発色することができる。この試薬の具体例としては、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３ジアミノベンジジン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（以上同人化学研究所社製）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）（以上和光純薬社製）などが挙げられる。

本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物及び／又はＰｌｓを測定するための組成物は、カルシウムイオンを含有しなくてもよい。組成物が水溶液の場合、経時的に空気中の二酸化炭素が組成物に溶解する場合がある。この際、組成物にカルシウムイオンが含有すると、カルシウムイオンは炭酸カルシウムとなり析出して組成物が白濁する場合があるが、本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物及びＰｌｓを測定するための組成物は、カルシウムイオンを含有しなくてもよいので、このような経時変化が起きにくいという利点がある。

さらに本発明の組成物は、上記成分のうち（Ｉ）及び（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）は、（Ｖ）と測定直前に合一されて本発明の組成物となることが好ましい。すなわち、測定時には必要な全ての成分を有する本発明の組成物とするにあたり、その測定以前においては、少なくとも（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）と、（Ｖ）は分離されていることが好ましい。好ましい形態は、３試薬に分けておき、第一試薬は（Ｉ）及び（ＩＩ）を含み、第二試薬は（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）を含み、第三試薬は（Ｖ）を含む。これらを測定直前に合一して組成物とする場合、合一する順序は任意であり、ひとつずつ合一してもよく同時に合一してもよい。最も好ましい形態は、２試薬に分けておき、第一試薬は（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）を含み、第二試薬は（Ｖ）を含む。測定直前まで、第一試薬と第二試薬は別々の試薬としておく。これらを測定直前に合一して組成物とする。

本発明の組成物に含まれる（Ｉ）〜（Ｖ）の成分の有効量、すなわち、組成物がＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物及び／又はＰｌｓを測定するための組成物となり得るために有効な添加量及びｐＨ緩衝剤の条件などは、上記の本発明の測定方法と同様である。

本発明の組成物は適宜ｐＨ緩衝剤を含むことも好ましい。さらに少なくとも既知量のＰｌｓを含んでなるキャリブレーション試薬を含むことも好ましい。

本発明においてキャリブレーション試薬は、少なくとも既知量のＰｌｓを含む試薬がよいが、好ましくはｐＨ緩衝剤、アジ化ナトリウムや抗生物質などの防腐剤、糖などの安定化剤を含む試薬である。ｐＨ緩衝剤を含む場合、種類や濃度などの条件などは本発明の測定方法と同様である。アジ化ナトリウムや抗生物質などを含む場合、種類や濃度は防腐効果があれば限定されないが、例えばアジ化ナトリウムの場合、下限は０．００５％以上、好ましくは０．０１％以上、さらに好ましくは０．０３％以上、上限は１％以下、好ましくは０．５％以下、さらに好ましくは０．１％以下である。例えば抗生物質の場合、下限は５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上、上限は１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは７５μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下である。安定化剤を含む場合、種類や濃度などの条件などは上記のホスホリパーゼの安定化剤と同様である。キャリブレーション方法は、一点検量の他、多点検量（折れ線やスプライン）や多点検量の直線回帰などが選択できる。

既知量は特に限定されず、試料中のＰｌｓを正確に測定するために選択すればよい。また、複数のキャリブレーション試薬を使用する場合のキャリブレーション試薬の既知量も同様である。例えばＰｌｓの場合、下限は０．００μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、さらに好ましくは５０μＭ以上、上限は５００μＭ以下、好ましくは２００μＭ以下、さらに好ましくは１５０μＭ以下である。

本発明のＰｌｓ測定用の組成物及びキャリブレーション試薬は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥などによる）として提供できる。液状品の凍結物が好ましく、液状品の凍結乾燥品がさらに好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。本発明のＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解するための組成物及び／又はＰｌｓを測定するための組成物は、一試薬の組成物としてもよいが、通常は上記のように二試薬以上に分離するのが好ましい。また、試薬の品質向上などを目的としてＮａＣｌやＫＣｌなどの塩、ＴＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤、及び／又はアジ化ナトリウムや抗生物質など防腐剤を混合してもよい。また、例えば、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）のキャピラリーへの使用、又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状組成物としたりして使用することが好ましい。塩を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は５〜２００ｍＭの範囲であり、界面活性剤を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は０．００１％〜２％であり、防腐剤を混合する場合は上記キャリブレーション試薬の場合と同様である。

本発明のホスホリパーゼの製造方法は、下記＜１＞から＜３＞までのいずれかのホスホリパーゼを製造する方法であって、ホスホリパーゼをコードする塩基配列に基づきホスホリパーゼを形成する工程と、ホスホリパーゼを取得する工程を含むホスホリパーゼの製造方法を含む。

＜１＞配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

＜２＞配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を有する。

＜３＞下記の（ａ）〜（ｄ）の特性を有する。

（ａ）カルシウムイオン非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）に対する相対活性が、ジパルミトイルホスホコリンに対して、１９±５％である。

（ｂ）カルシウムイオン非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリンに対して、２９±１３％である。

（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が約２５〜３０ｋＤａの範囲である。

（ｄ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。

ここで、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用及び（ａ）〜（ｄ）の特性については上述と同様である。すなわち、上記ホスホリパーゼの製造方法は、本発明のＰＬ（Ａ）の製造方法である。また、配列番号２、配列番号９及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列については上述と同様である。配列番号２、配列番号９及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、好ましい塩基配列である配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４に記載の塩基配列についても上述と同様である。

このような本発明のＰＬ（Ａ）を製造するに際しては、ＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列に基づきＰＬ（Ａ）を形成する工程を用いることができる。この工程としては、ＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を含む無細胞蛋白質合成系、好ましくはＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程、又は天然のＰＬ（Ａ）を形成する微生物などＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を有する微生物を用いる工程、又はＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いる工程等がそれぞれ例示される。

典型的な本発明のＰＬ（Ａ）の製造方法としては、ＰＬ（Ａ）を形成する天然の微生物を用いてＰＬ（Ａ）を形成する例が挙げられるが、本発明のＰＬ（Ａ）を調製できる天然の微生物としては、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、最も好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０（＝ＤＳＭ ４６４９２）が例示できる。これらの微生物の取得、同定及び判断方法については上述の通りである。

本発明のＰＬ（Ａ）を形成する天然の微生物は、さらにＮＴＧ等の薬剤、紫外線、及び／又は放射線で処理した変異株となすこともできる。変異株によって、本発明のＰＬ（Ａ）の生産性を向上することや、本発明のＰＬ（Ａ）の変異体を形成させることが可能であり、安定性、生産性、反応性等が優れた性質を有する変異体を形成することも可能である。本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程を採用する場合には、上述の塩基配列をベクターに挿入して宿主微生物に導入させて形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて蛋白質を形成させる工程が例示される。本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を導入した形質転換体は、塩基配列が挿入されたベクターである組換体ファージ又は組換体プラスミドを宿主に導入した細胞、又は微生物を含む。本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列は、一部又は全てを合成して使用することができ、好ましくは本発明のＰＬ（Ａ）を、コードする塩基配列を遺伝子供与体から取得して使用する。遺伝子供与体としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、最も好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０（＝ＤＳＭ ４６４９２）が例示できる。

本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を挿入するベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ系、バチラス・サチリスを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。本発明においては大腸菌及び放線菌を宿主とするプラスミドベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されるものではない。

このようなベクターを、本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列の切断に使用した制限酵素により生成する塩基配列の末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列の断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合させて本発明のＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を目的のベクターに挿入して、組換体ファージ又は組換体プラスミドとなす。組換体プラスミドを導入する宿主としては、組換体プラスミドが安定かつ自律的に増殖可能な細胞、又は微生物であればよく、大腸菌Ｂ株、Ｋ株、Ｃ株やそれらの溶原菌が利用できる。また、宿主微生物がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウム等、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４等、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１等が使用できる。本発明においては大腸菌又は放線菌を宿主微生物とすることが好ましい。

本発明のＰＬ（Ａ）は、ＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を導入した形質転換体、又はＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を有する微生物を培養することで形成してもよい。

このような微生物から、本発明のＰＬ（Ａ）を得る場合は、例えば「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ、ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９３年、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ ＳａｍｍＬｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ」や「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ＢＡＣＴＥＲＩＡ ＆ ＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨＡＧＥＳ、１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９２年、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」などに記載の方法で、それらの微生物を培養し、それらの培養液や菌体内から例えば「蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂参照）」などに記載の方法で精製又は精製することなく得ることができるが、好ましくは精製して得る。すなわち、本発明のＰＬ（Ａ）は、上記のように形成された本発明のＰＬ（Ａ）を取得する工程を含む方法によって製造できるが、簡便には殺菌、非殺菌を問わず菌体を含む細胞等のままであってもよく、培養不純物や細胞破砕物等を軽く除いた不純物が残存したままのＰＬ（Ａ）とすることも好ましい。さらに本発明の蛋白質の粗蛋白質は、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることも好ましいが、通常は、例えば５０％以上、７０％以上、９５％以上の各種の純度にすることが例示される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥやＨＰＬＣ等の公知の方法で確認すればよい。

本発明のＰＬ（Ａ）は、ＰＬ（Ａ）を形成する天然の微生物や、ＰＬ（Ａ）をコードする塩基配列を導入した形質転換体の微生物等を培養し、培養物からＰＬ（Ａ）を取得することによって製造することができる。まず、微生物等を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中にＰＬ（Ａ）を形成させ、菌体内に形成される場合には培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いで、この菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡ、及び／又は適当な界面活性剤等を添加してＰＬ（Ａ）を濃縮するか濃縮することなく、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して本発明のＰＬ（Ａ）を沈殿させ回収する。この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、本発明のＰＬ（Ａ）を得ることができる。また、これらの方法を適宜組み合わせて行うことができる。また、本発明のＰＬ（Ａ）が培養液中に形成される場合には、培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去し、培養液について、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行えばよい。

これらの方法によって得られる本発明のＰＬ（Ａ）は安定化剤として、各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形の本発明のＰＬ（Ａ）を得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５〜１０％程度添加してもよい。

配列番号４に記載の塩基配列は、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１巻，５２６−５３１頁、２００３年で明らかにされていたが、塩基配列がコードする蛋白質の性質はこれまでに解明されておらず、単にｈｙｄｒｏｌａｓｅとして予想されていた。すなわち、配列番号４に記載の塩基配列がコードする配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質が、ＰｌｓをｌｙＰｌｓへ加水分解する作用を有することなど（本発明のＰＬ（Ａ）としての性質を有することは従来全く知られていなかった。

以下、本発明を実施例などに基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例などに限定して解釈されない。なお、以下に記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）や本明細書に記載の（非）特許文献、市販の各種酵素、又はキット類に添付された手順に従えば実施できるものである。

本実施例にて使用したホスホリパーゼＡ２は次の通りである。

ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ（Ｌｏｔ １００１Ａ、旭化成ファーマ株式会社、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来、品番Ｔ−１９４）。ＰＬＡ２ナガセ（製造番号７９０７８５１、ナガセケムテックス株式会社、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来）。ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ（Ｂａｔｃｈ Ｎｏ．９０８２５４３７、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ、豚の膵臓由来、品番Ｌ６９９Ｌ）。

本実施例にて使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製などであり、市販で容易に入手できるものを使用した。

以下に示した測定値などは測定の条件、使用機器の精度、試薬のメーカーや純度などによりその値は変化し得る。

［実施例１：活性測定方法］
各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、及びＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）の活性測定方法を図１に簡略して示した。Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＥＣ ６．２．１．３）及びＡｃｙｌ−ＣｏＡ Ｏｘｉｄａｓｅ（ＥＣ １．３．３．６）は旭化成ファーマ株式会社から入手した（品番はそれぞれＴ−１６及びＴ１７）。

＜第一反応試薬混合液＞
８０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
５０ｍＭ（０ｍＭ（＊）） 塩化カルシウム
４ｍＭ ＡＴＰ
４ｍＭ ＣｏＡ
１．０６Ｕ／ｍＬ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
２ｍＭ ジパルミトイルホスホコリン（ＤＰＰＣ）
（＊）他の実施例では０ｍＭの場合もある。

＜第二反応試薬混合液＞
４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５
０．０６％ ４−ＡＡ
０．０４％ フェノール
４．５Ｕ／ｍＬ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
３０Ｕ／ｍＬ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｏｘｉｄａｓｅ
０．２％ トリトンＸ−１００
２０ｍＭ ＡＴＰ
０．１ｍＭ ＦＡＤ
＜反応停止液＞
０．５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０
＜酵素溶解希釈用液＞
０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
＜測定操作法＞
（１）小試験管に第一反応試薬混合液０．５０ｍＬずつを正確に分注し、３７℃で予備加温する。

（２）５分経過後、適切な濃度に酵素溶解希釈緩衝液で希釈した酵素試料液（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ又はＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）５０μＬを正確に加えて混和し、３７℃で第一反応を開始する。盲検は酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈緩衝液５０μＬを加える。

（３）１０分経過後、２０ｍＭ ＮＥＭ溶液０．５０ｍＬを加えて混和し、１５秒後に第二反応試薬混合液０．５０ｍＬを加えて混和し、３７℃で第二反応を開始する。

（４）５分経過後、反応停止液１．５０ｍＬを加えて混和し、反応を停止する。

（５）５００ｎｍにおける吸光度を測定する。求められた吸光度を試料液についてはＡｓ、盲検液についてはＡｂとする。吸光度範囲は△Ａ＝（Ａｓ−Ａｂ）≦０．２５Ａｂｓとする。

＜計算＞
以下の（式５）に従い活性を計算する。なお、１ユニット（Ｕ）とは、本実施例の条件下、各ホスホリパーゼが基質（実施例１においてはＤＰＰＣ）を加水分解する作用をして脂肪酸を１分間に１μｍｏｌ生成する反応速度とした。

＜結果＞
図１で示したように、本実施例の活性測定方法は各ホスホリパーゼの作用により生成した脂肪酸を測定する方法である。したがって、本実施例の活性測定方法でＰＬ（Ａ）の活性が測定できたことは、ＰＬ（Ａ）は他のＰＬＡ２と同様に、ＤＰＰＣに作用して少なくとも脂肪酸を生成していることを示している。

実施例１にて測定した各ホスホリパーゼの活性を表１に示した。

本実施例では表１の各ホスホリパーゼを適宜希釈して用いた。すなわち、各ホスホリパーゼの表示活性は本実施例では採用しなかった。

［参考例１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ由来ＰＬ（Ａ）の調製方法］
［参考例１−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７の染色体ＤＮＡの分離］
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７をＹＥＭＥ培地（０．３％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、１％グルコース、３４％シュークロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５％グリシン）５０ｍＬを用いて２８℃で４日間培養し集菌した。次いで、この菌体を７５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液５ｍＬに懸濁し、３７℃で一晩処理した。これに１０％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを７５０μＬ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを５ｍｇ添加し５５℃で２時間処理した。この溶液にクロロホルム７．５ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離により水相５ｍＬを分取した。この水相に３ｍＬのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡ画分を回収し、１０ｍＭ 卜リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μＬに溶解した。これにＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加え攪拌し、遠心分離により、水相を５００μＬ分取した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μＬを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を５００μＬ分取した。この水相に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２） ５０μＬ及びエタノール１ｍＬを添加混合しＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２００μＬに溶解し、鋳型染色体ＤＮＡとした。

［参考例１−２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７ＰＬ（Ａ）遺伝子を含む組換えプラスミドの作製］
ＰＣＲ用のオリゴとして、センスプライマー「ｐｒｉｍｅｒ Ｓ」（配列番号５）及びアンチセンスプライマーとして「ｐｒｉｍｅｒ ＡＳ」（配列番号６）を合成した。参考例１−１で得た鋳型染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、プライマー各１２００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ各０．３ｍＭ、ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ、ＤＭＳＯ ４％、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５ユニット、蒸留水を全量２５μＬとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。

ステップ１：９８℃、２分；
ステップ２：９８℃、１５秒；
ステップ３：７２℃、１５秒；
ステップ４：７４℃、６０秒；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５：７４℃、４分。

このＰＣＲにより約９００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。増幅産物中の^６８９ＡＧＡＴＣＴ^６９４配列は、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ.Ａ．（１９８５）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，８２巻、４８８−４９２頁）により^６８９ＡＡＡＴＣＴ^６９４とした。

この増幅された断片をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩで消化し、発現ベクターである放線菌プラスミド（ｐＭＤ２０−Ｔベクター（ＴａＫａＲａ製））のＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。

［参考例１−３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７由来ＰＬ（Ａ）遺伝子を発現する組換え放線菌の作製］
参考例１−２で得た組換えプラスミドを用いて、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹ ＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌を得た。

［参考例１−４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ ＮＡ２９７由来ＰＬ（Ａ）遺伝子を発現する組換え放線菌の培養］
参考例１−３で得た組換え放線菌を、１２μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含む１００ｍＬ×４本のトリプチックソイ培地（ペクトン・ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液３４０ｍＬから遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、硫酸アンモニウム分画にて、沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭ 卜リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を外液として透析して酵素溶液を得た。得られたＰＬ（Ａ）の濃度は約２．５Ｕ／ｍＬで、適宜１０−ｋＤａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅ（ミリポア社製）などで濃縮して実施例１〜実施例１１で本発明のＰＬ（Ａ）として使用した。

［参考例２：ＰＬＢの調製方法］
日本農芸化学会２０１１年度大会の講演番号：２Ｃ１０ａ０５（２０１１年３月２３日９：４４〜）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＮＡ６８４由来新規ホスホリパーゼＢの大量発現とその特性解析（松本優作、杉森大助（福島大院・理工））によって公開された方法で調製して実施例で使用した。

（ａ）培養
ＮＢ培地「１％ペプトン（べクトン・ディンキンソン社製）、１％肉エキス（極東製薬工業（株）製）、０．５％ 塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）、ｐＨ７．２」３００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチンと０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。予め平板培地に生育したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で１０８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。

（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。

（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム」（内径２６ｍｍ、高さ５５ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｄ）ＨｉＴｒａｐ Ｑカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｅ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した「ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｆ）Ｍｏｎｏ Ｓカラムクロマトグラフィー
上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭメス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。２０ｍＭメス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ Ｓ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した。

以上のようにして、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４株より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。

［実施例２：ＰＬ（Ａ）の基質特異性１］
本実施例では、ホスファチジルコリンのｓｎ−１位とｓｎ−２位に対するＰＬ（Ａ）の反応速度（加水分解速度）を比較した。

＜反応液＞
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）
０．５０％ ホスファチジルコリン（ナカライテスク、品番２０３４２−５２）
２５ｍＭ ＥＤＴＡ
１％ トリトンＸ−１００
０．９ｍＵ／ｍＬ ＰＬ（Ａ）
反応は３７℃で行った。反応開始０、５、１０、２０、３０分後に＜反応液＞を５０μＬずつ取り出して、この＜反応液＞にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を５０μＬ加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリゾリン脂質の量をＨＰＬＣで測定した。

＜ＨＰＬＣ条件＞
Ｓｙｓｔｅｃｈ社、Ａｌｌｔｉｍａ Ｓｉｌｉｃａ ３μｍ、１００ｍｍ×４．６ｍｍ
溶離液Ａ：ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（８０／１８／２）
溶離液Ｂ：ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（６０／３４／６）
グラジエント：０ｍｉｎ、１００％Ａから１５ｍｉｎで１００％Ｂのリニアグラジエント
検出器：ＥＬＳＤ
流速：１ ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
＜結果＞
３７℃、２０分間の加水分解反応で、収率約１６．５％でリゾリン脂質を得ることができた。その内訳は、２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２−Ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）が約８割、１−アシル−ｓｎ−グリセ口−３−ホスホコリン（１−ＡｃｙＬ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）が約２割であり、その比率は少なくとも反応開始後５分から３０分の間は一定であった（図４）。

したがって、ホスファチジルコリンのｓｎ−１位とｓｎ−２位に対するＰＬ（Ａ）の反応速度比は約４：１であることが示された。

［実施例３：ＰＬ（Ａ）の基質特異性２と比活性］
本実施例では、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）とＤＰＰＣに対するＰＬ（Ａ）の反応速度（加水分解速度）を比較し、比活性を測定した。

＜第一反応試薬混合液２＞
８０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
５又は０ｍＭ 塩化カルシウム
４ｍＭ ＡＴＰ
４ｍＭ ＣｏＡ
１．０６Ｕ／ｍＬ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）
まず実施例１の方法でＰＬ（Ａ）の活性を測定した。次に０ｍＭ塩化カルシウム（カルシウムイオン非存在）の＜第一反応試薬混合液＞を調製し、実施例１の方法でＰＬ（Ａ）の活性を測定した。次に＜第一反応試薬混合液＞の代わりに＜第一反応試薬混合液２＞を用いて、それ以外は実施例１の方法と同様にしてＰＬ（Ａ）の活性を測定した。最後に０ｍＭ塩化カルシウム（カルシウムイオン非存在）の＜第一反応試薬混合液２＞を用いて、それ以外は実施例１の方法と同様にしてＰＬ（Ａ）の活性を測定した。そして相対活性を（式３）で計算した。ｎ＝５で実施した。

＜結果＞

表２で示したように、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、１８：１）に対するＰＬ（Ａ）の相対活性はＤＰＰＣに対して１９±５％（平均±ＳＤ）であった。

［実施例４：ＰＬ（Ａ）の基質特異性３］
本実施例では、ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）とＰＯＰＣに対するＰＬ（Ａ）の反応速度（加水分解速度）を比較した。

＜反応液１＞
１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）
２．５％ ＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）
１ｍＭ ＥＤＴＡ
１％ トリトンＸ−１００
＜反応液２＞
１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）
２．５％ ＰＯＰＣ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
１％ トリトンＸ−１００
５０℃にした１００μＬの＜反応液１＞及び＜反応液２＞に、５ｍＵ／ｍＬのＰＬ（Ａ）を５μＬ添加して反応を開始した。反応開始後５分後に、＜反応液１＞及び＜反応液２＞を煮沸して反応を停止した。＜反応液１＞及び＜反応液２＞に含まれる遊離脂肪酸の生成量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ Ｃテストワコー」（和光純薬工業社製）で測定した。相対活性は（式４）で計算した。ｎ＝５で実施した。

＜結果＞
ＰＬ（Ａ）はＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に作用して脂肪酸を生成していることが明らかになった。また、本発明のＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎ（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性は、ＰＯＰＣに対して、２９±１３％（平均±ＳＤ）であった。

［実施例５：各ホスホリパーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量測定］
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー＞
１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）
４（Ｗ／Ｖ）％ ＳＤＳ
１０（Ｗ／Ｖ）％ シュークロース
０．０１（Ｗ／Ｖ）％ ブロモフェノールブルー
１０（Ｗ／Ｖ）％ ２−メルカプトエタノール
＜泳動ｂｕｆｆｅｒ＞
３ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１４．４ｇ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ
１ｇ／Ｌ ＳＤＳ
各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、及びＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ））溶液を２８０ｎｍにおける吸光度が約１．０になるように蒸留水で希釈し、各ホスホリパーゼ水溶液とした。次に各ホスホリパーゼ水溶液２０μＬと＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー＞を２０μＬとを混合して、９９℃で２０分間加熱して変性した。変性した各ホスホリパーゼを室温まで冷却して、１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量測定した。分子量マーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＢｒｏａｄ ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ ＲＡＤ、品番１６１−０３１７）を使用した。ポリアクリルアミドゲルはｅ−ＰＡＧＥＬ（アトー株式会社、品番Ｅ−Ｔ１５Ｓ）を使用した。泳動ｂｕｆｆｅｒは上記の通りである。泳動は室温、定電流（２０ｍＡ）にて約６０分間行った。ポリペプチドの染色はＥｚ Ｓｔａｉｎ Ａｑｕａ（アトー株式会社、品番ＡＥ−１３４０）を使用した。脱色は純水を使用した。

＜結果＞
図５のレーン１と７はマーカーである。レーン２〜６は各ホスホリパーゼで、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ法による分子量は、
レーン２ ＰＬ（Ａ） 約２５〜３０ｋＤａの範囲
レーン３ ＰＬＢ 約４３〜４５ｋＤａの範囲
レーン４ ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ 約１２〜１４ｋＤａの範囲
レーン５ ＰＬＡ２ナガセ 約１２〜１４ｋＤａの範囲
レーン６ ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ 約１２〜１４ｋＤａの範囲
となった。

ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ及びＰＬＩＰＯＭＯＤ ６９９ＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は公知のホスホリパーゼＡ２と同様であった。一方、ＰＬ（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は約２５〜３０ｋＤａの範囲であり、ホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＡ２とは明確に異なっていた。

［実施例６−１：ＰｌｓＥｔｎに対する各ホスホリパーゼの作用（カルシウムイオンの存在下）］
本実施例では、各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）のブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに対する作用をカルシウムイオンの存在下比較した。

なお、ブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎ（Ｂｒａｉｎ，Ｐｏｒｃｉｎｅ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．、品番８４００２２）は、天然物であるので（化３）や（化４）を含む複数のＰｌｓＥｔｎが混在していると考えられる。すなわち、各ホスホリパーゼにより作用されやすい分子種のＰｌｓＥｔｎと作用されにくい分子種のＰｌｓＥｔｎが混在していると考えられる。

＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎ（又はｌｙＰｌｓ（化７））
２ｍＭ ＣａＣｌ_２
１０Ｕ／ｍＬ 各ホスホリパーゼ
＜反応液＞を３７℃で反応し、反応開始１０分後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と等量加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。盲検は各ホスホリパーゼを＜反応液＞に加えなかった。

＜ＴＬＣの方法＞
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ＴＬＣ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０、ＭＥＲＣＫ社）に３μＬスポットし、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：蒸留水＝６５：２５：４）で約２〜３時間展開した。展開したＴＬＣにニンヒドリンスプレー（和光純薬工業株式会社、品番１４５−０８６０１）を適量噴霧して１００℃で約１５〜３０秒間乾熱オーブンで熱してｌｙＰｌｓＥｔｎやＰｌｓＥｔｎを検出した。なお、他の実施例におけるＴＬＣの条件も本実施例と同様である。

ここで、ｌｙＰｌｓＥｔｎの標品として使用した１−Ｏ−１’−（Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（（化７）Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．品番８５２４７１）である。

＜結果＞
図６のレーン１〜７は次の通りである。

レーン１はブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はＰＬ（Ａ）をブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はＰＬＢをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はＰＬＡ２ ＩＩ Ｌをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン６はＰＬＡ２ナガセをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

ＴＬＣのスポットを、デンシトメーターで定量した結果を表３に示した。

ブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎが消失し、ｌｙＰｌｓＥｔｎ（レーン２）と同じ位置に移動度が変化する作用を強く示したのはレーン３（ＰＬ（Ａ））であった。レーン６（ＰＬＡ２ナガセ）とレーン７（ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）も同様の作用を示したが、その程度はＰＬ（Ａ）より弱かった。

［実施例６−２：各ホスホリパーゼのＰｌｓＥｔｎへの作用（カルシウムイオンの存在下）］
本実施例では、各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）のＰｌｓＥｔｎ（化１）に対する作用を、カルシウムイオンの存在下、比較した。

＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（化１）（又はｌｙＰｌｓ（化７））
２ｍＭ ＣａＣｌ_２
１０Ｕ／ｍＬ 各ホスホリパーゼ
＜反応液＞を３７℃で反応し、反応開始１０分後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と同じ量加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。

＜結果＞
図７のレーン１〜７は次の通りである。

レーン１はＰｌｓＥｔｎ（化４）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はＰＬＢをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はＰＬＡ２ ＩＩ ＬをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン６はＰＬＡ２ナガセをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はＬＩＰＯＭＯＤ ６９９ＬをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

ＴＬＣのスポットを、デンシトメーターで定量した結果を表４に示した。

ＰｌｓＥｔｎ（化４）が消失し、ｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）と同じ位置に移動度が変化する作用を強く示したのはレーン３（ＰＬ（Ａ））であった。レーン６（ＰＬＡ２ナガセ）とレーン７（ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）も同様の作用を示したが、その程度はＰＬ（Ａ）より弱かった。

［実施例７−１：各ホスホリパーゼのＰｌｓへの作用（カルシウムイオンの非存在下）］
本実施例では、各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）のブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに対する作用をカルシウムイオンの非存在下比較した。

＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ブタ脳から抽出したＥｔｎＰｌｓ（又はｌｙＰｌｓ（化７））
１０Ｕ／ｍＬ 各ホスホリパーゼ
＜反応液＞を３７℃で反応し、反応開始１０分後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と同じ量加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。盲検は各ホスホリパーゼを＜反応液＞に加えなかった。

＜結果＞
図８のレーン１〜７は次の通りである。

レーン１はブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はＰＬ（Ａ）をブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はＰＬＢをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はＰＬＡ２ ＩＩ Ｌをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン６はＰＬＡ２ナガセをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌをブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎに作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

ＴＬＣのスポットを、デンシトメーターで定量した結果を表５に示した。

ＰＬ（Ａ）はカルシウムの非存在下においてもブタ脳から抽出したＰｌｓＥｔｎが消失し、ｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）と同じ位置に移動度が変化する作用を強く示した（レーン３）。

［実施例７−２：各ホスホリパーゼのＰｌｓＥｔｎへの作用（カルシウムイオンの非存在下）］
本実施例では、各ホスホリパーゼ（ＰＬ（Ａ）、ＰＬＢ、ＰＬＡ２ ＩＩ Ｌ、ＰＬＡ２ナガセ、ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）のＰｌｓＥｔｎ（化４）に対する作用を、カルシウムイオンの存在下、比較した。

＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（化４）（又はｌｙＰｌｓ（化７））
１０Ｕ／ｍＬ 各ホスホリパーゼ
＜反応液＞を３７℃で反応し、反応開始１０分後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と同じ量加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。盲検は各ホスホリパーゼを＜反応液＞に加えなかった。

＜結果＞
図９のレーン１〜７は次の通りである。

レーン１はＰｌｓＥｔｎ（化４）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）に各ホスホリパーゼを作用させなかった＜反応液＞（盲検）から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はＰＬＢをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はＰＬＡ２ ＩＩ ＬをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン６はＰＬＡ２ナガセをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はＬＩＰＯＭＯＤ ６９９ＬをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

ＴＬＣのスポットを、デンシトメーターで定量した結果を表６に示した。

カルシウムの非存在下においてもＰｌｓＥｔｎ（化４）が消失し、ｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）と同じ位置に移動度が変化する作用を強く示したのはレーン３（ＰＬ（Ａ））であった。レーン７（ＬＩＰＯＭＯＤ ６９９Ｌ）も同様の作用を示したが、その程度はＰＬ（Ａ）より弱かった。

［実施例８：ＰＬ（Ａ）をＰｌｓへ作用させたときの生成物］
実施例６−２及び実施例７−２において、ＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させたときの生成物（すなわち図７及び図９の矢印の物質）をＬＣ／ＭＳによって確認した。

＜ＬＣの条件＞
装置 Ｗａｔｅｒｓ，ＵＰＬＣ
カラム Ｗａｔｅｒｓ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ １．８μｍ
（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍ）
カラム温度 ４０℃
検出 ２２０ｎｍ
移動相 Ａ＝水（０．１％ ＨＣＯＯＨ） Ｂ＝イソプロピルアルコール
グラジェント ０分 Ａ ８０％ Ｂ ２０％
１０分 Ａ ０％ Ｂ １００％
１３分 Ａ ０％ Ｂ １００％
１３．１分 Ａ ８０％ Ｂ ２０％
１５分 Ａ ８０％ Ｂ ２０％
注入量 １μＬ
＜ＭＳの条件＞
装置 Ｗａｔｅｒｓ，Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２
イオン化 ＥＳＩ＋
スキャンレンジ ｍ／ｚ １００〜１５００
＜結果＞
ＭＳではＰｌｓＥｔｎ（化４）と考えられるイオンが１種類（ｍ／ｚ ７３０．５５）、ｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）と考えられるイオンが１種類（ｍ／ｚ ４６６．３１）検出され、標品のＰｌｓＥｔｎ（化４）及びｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）と一致した。したがって、ＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させたときの生成物はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）であることを確認した。

［実施例９：ＰＬ（Ａ）酵素量とＰｌｓへの作用の関係］
＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（化４）（又はｌｙＰｌｓ（化７））
０〜０．５Ｕ／ｍＬ ＰＬ（Ａ）
０、０．００５、０．００６７、０．０１、０．０２、０．０５、０．５Ｕ／ｍＬのＰＬ（Ａ）を含む＜反応液＞を各１ｍＬ調製した。これらの＜反応液＞を３７℃で１０分間反応した後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と１ｍＬ加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。

＜結果＞
図１０のレーン１〜８は次の通りである。

レーン１はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．５Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．０５Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．０２Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．０１Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．００６７Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン６はＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を０．００５Ｕ／ｍＬ作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はｌｙＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン８はＰｌｓにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞からから有機相に抽出したリン脂質である。

本実施例から、少なくとも０．５Ｕ／ｍＬのＰＬ（Ａ）が２ｍＭのＰｌｓＥｔｎを３７℃、１０分間でｌｙＰｌｓに加水分解できることが分かった。すなわち、少なくとも０．５ｍＵのＰＬ（Ａ）が２μｍｏｌのＰｌｓＥｔｎを３７℃、１０分間でｌｙＰｌｓに加水分解できることが分かった。

［実施例１０−１：ｐＨとＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎへの作用の関係］
＜反応液＞
５０ｍＭ 各緩衝液
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（化４）（又はｌｙＰｌｓ（化７））
０又は０．５Ｕ／ｍＬ ＰＬ（Ａ）
各緩衝液として、クエン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４、５、６）、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、９）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０を含む＜反応液＞を調製した。これらの＜反応液＞を室温で１０分間反応した後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と１ｍＬ加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。

＜結果＞
図１１のレーン１〜１８は次の通りである。

レーン１〜３は、順に、クエン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ４、５、６の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４は、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５〜７は、順に、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５、８、９の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン８は、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン９〜１１は、順に、クエン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ４、５、６の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン１２は、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン１３〜１５は、順に、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５、８、９の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン１６は、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン１７は、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５の＜反応液＞中のｌｙＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン１８は、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５の＜反応液＞中のＰｌｓＥｔｎにＰＬ（Ａ）を作用させなかった（０Ｕ／ｍＬ）＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

図１１から、本実施例の条件下、ｐＨ４〜１０の範囲でＰＬ（Ａ）はＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓに加水分解できることが分かった。そしてその作用はｐＨが高いほど強いことが分かった。なお、レーン１から８で明らかなように、ＰｌｓＥｔｎはｐＨ変化により自発的にｌｙＰｌｓに変化することはなかった。

［実施例１１：試料中のＰｌｓ測定］
試料中のＰｌｓ測定は図１の方法で測定した。

＜反応液１＞
５０ｍＭ ＢＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
５０Ｕ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ
５Ｕ／ｍＬ ＧＰＣＰ
１Ｕ／ｍＬ ＰＬ（Ａ）
＜反応液２＞
５０ｍＭ ＢＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．５
４．２Ｕ／ｍＬ ｌｙＰｌｓ ａｓｅ
１２μＭ ＤＡ６７
ここで、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅはＳＩＧＭＡより品番Ｐ８３７５として購入した。Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅはＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８年、７２巻、２７３２−２７３８頁の方法で製造した。ＧＰＣＰ（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は旭化成ファーマ株式会社より品番Ｔ−３３として入手した。ｌｙＰｌｓ ａｓｅはＴｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１年、２８６巻、２４９１６〜２４９３０頁に記載の方法でラット由来のｌｙＰｌｓ ａｓｅを大腸菌組換体として製造した。ＤＡ６７は和光純薬工業株式会社より品番０４６−２２３４１として購入した。

＜試料＞
１０％ドデシルマルトシド水溶液（同仁化学研究所、品番３４７−０６１６３）にＰｌｓＥｔｎ（化４）を０〜２００μＭになるように添加して調製した。

＜測定＞
日立７０８０形自動分析機を使用して測定した。サンプル量は１２μＬ、＜反応液１＞の量は１８０μＬ、＜反応液２＞の量は４５μＬ、反応温度は３７℃、１ポイントエンドアッセイとして６６０ｎｍ（副波長７５０ｎｍ）の吸光度差を測定した。

＜結果＞
図１２は１０％ドデシルマルトシド水溶液にＰｌｓＥｔｎ（化４）を０〜２００μＭになるように添加して調製した試料の検量線を示す。検量線は相関式Ｙ＝２．２７２４Ｘ−５２．９６２で表され、Ｒ^２＝０．９９９１であった。試料中のＰｌｓＥｔｎが本実施例にて測定できたことが示された。なお、切片が−５３となったのは、＜反応液１＞及び＜反応液２＞が着色・懸濁しているためである。

［実施例１２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）の調製方法］
［実施例１２−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０の染色体ＤＮＡの分離］
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０を５ｍＬのＬＢ培地で用いて２８℃で２日間培養し集菌した。次いで、この菌体をＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＰ１ ｂｕｆｆｅｒ ２５０μＬで懸濁し、２５０μＬのＰ２ ｂｕｆｆｅｒを加えて５回転等攪拌して鋳型染色体ＤＮＡとした。

［実施例１２−２:Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）遺伝子を含む組換えプラスミドの作製］
ＰＣＲ用のオリゴとして、センスプライマー「ｐｒｉｍｅｒ Ｓ」（配列番号７）及びアンチセンスプライマーとして「ｐｒｉｍｅｒ ＡＳ」（配列番号８）を合成した。実施例１２−１で得た鋳型染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、プライマー各１２００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ各０．３ｍＭ、ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ、ＤＭＳＯ ４％、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５ユニット、蒸留水を全量２５μＬとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。

ステップ１：９８℃、２分；
ステップ２：９８℃、１５秒；
ステップ３：７２℃、１５秒；
ステップ４：７４℃、６０秒；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５：７４℃、４分。

このＰＣＲにより約８１０ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（＋）及びｐＥＴ２４ａ（＋）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。

［実施例１３−３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）遺伝子を発現する組換え大腸菌の作製］
実施例１２−２で得た組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、組換え大腸菌を得た。

［実施例１３−４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）遺伝子を発現する組換え放線菌の培養］
実施例１３−３で得た組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ｐＥＴ２１ａ（＋）を形質転換した大腸菌の場合）又は３０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｐＥＴ２４ａ（＋）を形質転換した大腸菌の場合）を含む１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）で、３４℃、２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁した後、超音波破砕し、遠心上清をそのまま実施例１４で使用した（約０．１Ｕ／ｍＬ）。形質転換していない大腸菌を培養（抗生物質は加えない）・超音波破砕して得た遠心上清をネガティブコントロールとした。

［実施例１４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）のＰｌｓＥｔｎへの作用（カルシウムイオンの非存在下）］
本実施例では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）が、カルシウムイオンの非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用することをＴＬＣで確認した。

＜反応液＞
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５
２ｍＭ ＰｌｓＥｔｎ（化４）（又はｌｙＰｌｓ（化７））
培養可溶化遠心上清
＜反応液＞を２５℃又は３０℃で反応し、反応開始１０分後にＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（体積比２：１）の溶液を＜反応液＞と同じ量加えて混合し反応を停止した。有機相に抽出されたリン脂質をＴＬＣのサンプルとした。

＜結果＞
図１３のレーン１〜８は次の通りである。

レーン１はＰｌｓＥｔｎ（化４）にＰＬ（Ａ）を作用させなかった＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン２はｌｙＰｌｓＥｔｎ（化７）にＰＬ（Ａ）を作用させなかった＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン３はｐＥＴ２１ａ（＋）を形質転換した大腸菌由来のＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に２５℃で作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン４はｐＥＴ２４ａ（＋）を形質転換した大腸菌由来のＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に２５℃で作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン５はネガティブコントロールをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に２５℃で抽出したリン脂質である。

レーン６はｐＥＴ２１ａ（＋）を形質転換した大腸菌由来のＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に３０℃で作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン７はｐＥＴ２４ａ（＋）を形質転換した大腸菌由来のＰＬ（Ａ）をＰｌｓＥｔｎ（化４）に３０℃で作用させた＜反応液＞から有機相に抽出したリン脂質である。

レーン８はネガティブコントロールをＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用させた＜反応液＞から有機相に３０℃で抽出したリン脂質である。

ＴＬＣのスポットを、デンシトメーターで定量した結果を表７に示した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＪＣＭ ５０７０由来ＰＬ（Ａ）が、カルシウムイオンの非存在下、ＰｌｓＥｔｎ（化４）に作用することが確認できた。

本発明により、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する方法、プラスマローゲンを測定する方法、加水分解用及び／又は測定用の組成物、ホスホリパーゼの製造方法を提供できる。

［Streptomyces albidoflavus ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０１４）］
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０１４
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。
［Streptomyces sp. ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０１５）］
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０１５
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。

配列番号１：ＰＬ（Ａ）のアミノ酸配列の全長
配列番号２：他のＰＬ（Ａ）のアミノ酸配列の全長
配列番号３：ＰＬ（Ａ）遺伝子の塩基配列
配列番号４：他のＰＬ（Ａ）遺伝子の塩基配列
配列番号５：プライマーＳ
配列番号６：プライマーＡＳ
配列番号７：他のプライマーＳ
配列番号８：他のプライマーＡＳ
配列番号９：ＰＬ（Ａ）のアミノ酸配列の一部
配列番号１０：他のＰＬ（Ａ）のアミノ酸配列の一部
配列番号１１：配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２：配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列
配列番号１３：配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４：配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列

Claims (14)

1. 少なくとも下記（ａ）から（ｃ）までの特性を有し、さらに下記（ｈ）から（ｊ）までのいずれかの特性を有するホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解することを特徴とするプラスマローゲンの加水分解方法。
   （ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性が０．６６±０．２Ｕ／ｍｇである。
   （ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が２５〜３０ｋＤａの範囲である。
   （ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。
   （ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
   （ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
   （ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
2. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｄ）及び（ｅ）の特性を有することを特徴とする請求項１に記載のプラスマローゲンの加水分解方法。
   （ｄ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、１８：１）に対する相対活性が、ジパルミトイルホスホコリンに対して、１９±５％である。
   （ｅ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリンに対して、２９±１３％である。
3. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｆ）の特性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のプラスマローゲンの加水分解方法。
   （ｆ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ由来である。
4. 少なくとも下記（ａ）から（ｃ）までの特性を有し、さらに下記（ｋ）から（ｍ）までのいずれかの特性を有するホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解することを特徴とするプラスマローゲンの加水分解方法。
   （ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性が０．６６±０．２Ｕ／ｍｇである。
   （ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が２５〜３０ｋＤａの範囲である。
   （ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。
   （ｋ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
   （ｌ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
   （ｍ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
5. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｇ）の特性を有することを特徴とする請求項４に記載のプラスマローゲンの加水分解方法。
   （ｇ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来である。
6. 前記プラスマローゲンがエタノールアミン型プラスマローゲンであり、前記リゾプラスマローゲンがエタノールアミン型リゾプラスマローゲンであることを特徴とする請求項１から５までのいずれか一項に記載のプラスマローゲンの加水分解方法。
7. 前記プラスマローゲンが試料中のプラスマローゲンであることを特徴とする請求項１から６までのいずれか一項に記載のプラスマローゲンの加水分解方法。
8. 少なくとも下記（ａ）から（ｃ）までの特性を有し、さらに下記（ｈ）から（ｊ）までのいずれかの特性を有するホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンを測定することを特徴とするプラスマローゲンの測定方法。
   （ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性が０．６６±０．２Ｕ／ｍｇである。
   （ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が２５〜３０ｋＤａの範囲である。
   （ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。
   （ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
   （ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
   （ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
9. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｄ）及び（ｅ）の特性を有することを特徴とする請求項８に記載のプラスマローゲンの測定方法。
   （ｄ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、１８：１）に対する相対活性が、ジパルミトイルホスホコリンに対して、１９±５％である。
   （ｅ）カルシウムイオン非存在下、エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する相対活性が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスホコリンに対して、２９±１３％である。
10. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｆ）の特性を有することを特徴とする請求項８又は９に記載のプラスマローゲンの測定方法。
    （ｆ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ由来である。
11. 少なくとも下記（ａ）から（ｃ）までの特性を有し、さらに下記（ｋ）から（ｍ）までのいずれかの特性を有するホスホリパーゼを用いてプラスマローゲンを測定することを特徴とするプラスマローゲンの測定方法。
    （ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（Ｃ１８、２０：４）に対する比活性が０．６６±０．２Ｕ／ｍｇである。
    （ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が２５〜３０ｋＤａの範囲である。
    （ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する放線菌由来である。
    （ｋ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
    （ｌ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
    （ｍ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列を有し、さらに配列番号９に記載のアミノ酸配列及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、プラスマローゲンをリゾプラスマローゲンに加水分解する作用を有する。
12. 前記ホスホリパーゼが、さらに下記（ｇ）の特性を有することを特徴とする請求項１１に記載のプラスマローゲンの測定方法。
    （ｇ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来である。
13. 前記プラスマローゲンがエタノールアミン型プラスマローゲンであり、前記リゾプラスマローゲンがエタノールアミン型リゾプラスマローゲンであることを特徴とする請求項８から１２までのいずれか一項に記載のプラスマローゲンの測定方法。
14. 前記プラスマローゲンが試料中のプラスマローゲンであることを特徴とする請求項８から１３までのいずれか一項に記載のプラスマローゲンの測定方法。

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