KR20020010119A - 식물 리파제를 엔코딩하는 디엔에이, 형질전환된 식물과식물 노화를 조절하기 위한 방법 - Google Patents

식물 리파제를 엔코딩하는 디엔에이, 형질전환된 식물과식물 노화를 조절하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

식물에서 노화 발현의 조절은 안티센스 오리엔테이션에서 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 유전자 또는 유전자 단편을 식물 게놈으로 인테그레이션(integration)함으로써 이루어진다. 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 카네이션 유전자가 확인되며 뉴클레오타이드 서열은 형질전환된 식물에서 노화를 변형하는데 사용된다.

Description

식물 리파제를 엔코딩하는 디엔에이, 형질전환된 식물과 식물 노화를 조절하기 위한 방법{DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants}
노화(senescence)는 식물체에서 생물학적 성장의 마지막 단계이다. 이는죽음의 전조가 되며 전체 식물, 기관, 꽃과 열매, 조직과 개별 세포를 포함하는 생물학적 조직의 다양한 레벨에서 발생한다.
세포막 황폐(deterioration)는 노화의 초기 기본적인 특징이다. 지질(lipid), 특별히 막 지질의 대사는 세포 노화의 여러 생화학적 징후(manifestation)중의 하나이다. 예를 들어, 막 기능의 손실을 동반하는 노화가 진행될수록 장미 꽃잎은 아실 하이드롤라제 활성도의 증가를 유지한다(Borochov, et al., Plant Physiol., 1982, 69, 296-299). 세포막 황폐는 투과성 증가, 이온 경사의 손실과 이온 펌프와 같은 중요한 막 단백질의 기능 감소를 발생시키는 노화의 초기 특징적인 특징이다(Brown, et al., Plant Physiol.: A Treatise, Vol. X. Academic Press, 1991, pp.227-275). 막 구조와 기능에서 이러한 많은 쇠퇴는 리파제-중개 인지질 대사가 원인일 수 있다. 지질 인산염의 손실은 꽃잎, 잎, 떡잎(cotyledon) 노화와 열매 숙성에 대한 증거가 되어 왔으며(Thompson, J.E., Senescene and Aging in Plants, Academic Press, San Diego, 1988, pp. 51-83), 이는 세포 기능의 손상(impairment)을 이끄는 노화를 발전시키며 막 양쪽층의 분자 조직에서 중요한 변화를 일으키는 것으로 나타난다. 특별히, 식물 조직 노화에 대한 많은 연구는 막 양쪽층에서 대사하는 지질의 축적이 원인일 수 있도록 나타나는 막에서의 지질 상 분리에 대한 증거를 제공해 왔다(McKersie and Tompson, 1979, Biochim. Biophys. Acta, 508: 197-212; Chia, et al., 1981, Plant Physiol., 67:415-420). 노화 조직에서 지질의 많은 대사가유전자 발현에서의 노화-특이 변화를 통해 이루어진다는 증거가 있다(Buchanan-Wollaston, V., J. Exp. Bot., 1997, 307:181-199).
노화의 개시는 내부와 외부 양쪽의 다른 요인에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 에틸렌은 씨 발아, 묘목 성장, 열매 숙성과 꽃 노화와 같은 많은 식물의 다양한 과정에서 역할을 한다.
식물에서 에틸렌 생산은 또한 기계적 상해, 화학물질, 스트레스(온도와 물의 양 변화에 의해 생산되는 것과 같은)와 질병에 의해 유도되는 충격(trauma)과 관련될 수 있다. 에틸렌은 많은 식물에서 잎 노화의 조절에 관련되어 왔지만, 형질전환 식물과 에틸렌 감응 돌연변이로 얻어진 증거는 에틸렌이 노화에 영향을 미치지만 과정의 필수 조절자는 아님을 나타낸다. 많은 식물에서 에틸렌은 열매 숙성 또는 노화에서 역할을 하지 않는 것 같다. 예를 들면 딸기와 같은 전환기가 없는(non-climacteric) 식물의 열매 숙성, 데이 릴리스(day lilies)와 같은 꽃의 노화, 아라비돕시스(Arabidopsis)와 같은 식물과 특별히 에틸렌 시그날링에 필요없는 단자엽식물(monocot)의 잎 노화(Smart, C.M., 1994, New Phytology, 126:419-448; Valpuesta, et al., 1995, Plant Mol. Biol., 28:575-582).
노화의 이른 개시를 유도하는 외부 요인은 온도, 건조, 약한 빛 또는 병원체 공격은 물론 영양 공급과 같은 환경 스트레스를 포함한다. 자연적(연령과 관련된) 노화의 경우와 같이, 환경 스트레스 유도 노화는 세포막의 손실로써 특징지어진다. 특히, 환경 스트레스에 대한 노출은 막 손상을 나타내는 전해질 누출(Sharom, et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308; Wright and Simon, 1973, J. Exp. Botany, 24:400-411; Wright, M., 1974, Planta, 120:63-69; and Eze et al., 1986, Physiologia Plantarum, 68:323-328), 막 인지질 레벨의 쇠퇴(Wright, M., 1974, Planta, 120:63-69)와 지질 상 전이(Sharom, et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308)를 유도하며, 모두는 리파제의 활동이 원인일 수 있다. 환경 스트레스에 노출된 식물 조직은 또한 일반적으로 스트레스 에틸렌으로 알려진 에틸렌을 생산한다(Buchanan-Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botany, 48:181-199; Wright, M., 1974, Planta, 120:63-69). 상기 나타낸 대로, 에틸렌은 몇몇 식물에서 노화를 일으키는 것으로 알려졌다. 누출을 이끄는 막 황폐는 또한 씨 성숙의 발생 특징이며, 이는 막 인지질로부터 지방산의 비에스테르화를 나타내는 증거가 있다(McKersie, B.D., Senarata, T., Walker, M.A., Kendall, E.J. and Hetherington, P.R. In: Senescence and Aging in Plants, Ed. L.D. Nooden and A.C. Leoopold, academic Press, 1988. PP 441-464).
현재, 내부 또는 외부 요인 예를 들어, 환경 스트레스에 의해 생기는 노화의 개시를 조절하기 위한 폭넓게 응용할 수 있는 방법은 없다. 현재, 노화를 조절하고 열매, 꽃과 야채와 같은 신선하고 죽기 쉬운 식물 산물의 수명을 증가시키기 위한 기술은 주로 에틸렌 생합성 감소에 달려있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,824,875호는 안티센스 오리엔테이션에서 3개의 1-아미노-시클로프로판-1-카르복실레이트(ACC) 신타제 유전자 중의 하나의 발현으로 인한 에틸렌 레벨의 감소로 연장된 수명을 나타내는 형질전환된 제라늄 식물을 개시하고 있다. 따라서, 이 기술은 에틸렌에 민감한 식물의 제한된 범위에만 응용할 수 있다.
몇몇 열매의 수명은 또한 숙성을 더 천천히 일어나게 하는 에틸렌 생합성 감소에 의해 연장될 수 있다. 이러한 열매의 노화는 숙성 후에 유도되므로, 수명에 있어서 감소된 에틸렌 생합성의 영향은 간접적이다. 열매 숙성을 지연시키기 위한 다른 접근은 숙성의 초기 단계동안 합성되는 세포벽을 부드럽게 하는 효소인 폴리갈락투로나제의 세포 레벨을 바꾸는 것이다. 이 접근은 노화에 간접적으로만 영향을 미치며 식물의 좁은 범위에만 응용할 수 있는 점에서 에틸렌 생합성을 조절하는 것과 동일하다.
그러므로, 다양한 식물에 응용할 수 있는 식물 노화를 조절하는 방법이 필요하다. 따라서, 에틸렌 민감도에 상관없이 모든 타입의 식물에 응용할 수 있는 노화 조절 기술을 개발하는 것이 관심사이다.
(발명의 요약)
본 발명은 카네이션 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 전체 길이 cDNA 클론의발견과 클로닝에 기초한 것이다. 노화-유도 리파제 유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열과 대응 아미노산 서열은 여기에 개시되었다. 카네이션 노화-유도 리파제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 동일하게 조절되는 몇몇 식물에서 대응 유전자 또는 RNA 트랜스크립트(transcript)를 검출하기 위한 이종의 프로브로 사용되어져 왔다.
본 발명은 연령-관련 노화 또는 환경 스트레스-유도 노화와 같은 노화의 개시를 조절하기 위한 식물의 유전적 변형에 대한 방법을 제공한다. 본 발명의 노화-유도 리파제 뉴클레오타이드 서열, 그의 단편, 또는 그러한 단편의 조합은 내생적(endogenous) 노화-유도 리파제 유전자의 발현을 억제하기 위해 리버스 오리엔테이션에서 식물 세포에 도입되어, 내생적 노화-유도 리파제의 레벨을 감소시키고 형질전환된 식물에서 노화를 변경하게 된다.
본 발명의 방법을 사용하여, 형질전환된 식물은 발생되고 성장과 발달에 대해 모니터된다. 노화-유도 리파제의 레벨 감소에 기인하는 식물 성장, 개화, 열매 손상 감소, 씨 숙성 감소 및/또는 잎 황화 감소에 대해 연장된 수명을 나타내는 식물 또는 식물의 분리된 부분(예를 들어 가지, 꽃, 야채, 열매, 씨 또는 잎)은 잎 황화 감소, 꽃잎 절단 감소, 선적하고 저장하는 동안 열매 손상 감소를 포함하는 향상된 성질을 갖는 바람직한 산물로써 선택된다. 이러한 우수한 식물들은 번식된다. 동일하게, 환경 스트레스 예를 들면, 낮은 온도(chilling)에 대한 감도의감소, 가뭄, 감염 등에 증가된 저항성을 나타내는 식물은 우수한 산물로써 선택된다.
한가지 측면에서, 본 발명은 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 분리된 DNA 분자, 이때 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 관능 유도체를 나타낸다. 본 발명의 한가지 실시태양에서, 분리된 DNA 분자는 서열번호 1 예를 들면 서열번호 1에 100% 상보성(서열 일치)인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 발명의 이러한 측면의 다른 실시태양에서, 분리된 DNA 분자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 기술된 DNA 분자에 의해 엔코드된 분리된 단백질 또는 그의 관능 유도체가 제공된다. 바람직한 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖거나, 그의 관능 유도체이다.
또한 상기 기술된 DNA 분자의 RNA 트랜스크립트의 적어도 한 부분과 상보적인 RNA 분자를 엔코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 여기에 제공되는데, 이때 RNA 분자는 내생적 노화-유도 리파제의 발현이 변경되는 RNA 트랜스크립트와 하이브리다이즈한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이이거나 바람직하게는 약 6 내지 100개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 분리된 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분에 상보적이거나, 이때 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 실질적으로 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 상보적이다. 본 발명의 한가지 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 뉴클레오타이드 서열번호 1 한 가닥의 적어도 한 부분 또는 서열번호 1에 의해 엔코드된 RNA 트랜스크립트에 상보적이다. 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 실질적으로 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 분리된 DNA 분자 한 가닥의 5' 논-코딩 부분의 적어도 한 부분에 상보적이며, 이때 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈한다. 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 뉴클레오타이드 서열번호 4 한 가닥의 오픈 리딩 프레임의 적어도 한 부분 또는 서열번호 4에 의해 엔코드된 RNA 트랜스크립트에 상보적이다.
본 발명은 또한 (a) 실질적으로 (1) 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (2) 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 와 (b) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 형질전환된식물 세포에서 발현되도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 효과적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 식물 세포의 형질전환에 대한 벡터를 나타낸다.
조절 서열은 형질전환된 식물 세포에서 관능 프로모터를 포함하는데, 프로모터는 유도성(inducible)이거나 구성적(constitutive)이다. 선택적으로, 조절 서열은 폴리아데닐레이션 시그널을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 벡터로 형질전환된 식물 세포, 그러한 세포로부터 발생된 묘목(plantlet) 또는 성숙한 식물, 또는 그러한 묘목 또는 식물의 식물 부분을 제공한다.
본 방법은 또한 (1) 상기 기술된 벡터로 식물을 형질전환시킴; (2) 식물을 적어도 묘목 단계까지 성장하게 함; (3) 변경된 노화-유도 리파제 활성도 및/또는 변경된 노화 및/또는 변경된 환경 스트레스-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화에 대해 형질전환된 식물 또는 묘목을 에세이함; 과 (4) 형질전환되지 않은 식물에 비해 변경된 노화-유도 리파제 활성도 및/또는 변경된 노화 및/또는 변경된 환경 스트레스-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화를 갖는 식물을 선택하여 성장시킴을 포함하는 변형되지 않은 식물에 비해 노화-유도 리파제의 감소된 레벨을 갖는 식물을 생산하는 방법을 나타낸다.
상기 생산된 식물, 또는 자손(progeny), 혼성물(hybrids), 클론 또는 식물 부분은 바람직하게는 감소된 노화-유도 리파제 발현과 지연된 노화 및/또는 지연된 스트레스-유도 노화 또는 에틸렌-유도 노화를 나타낸다.
본 발명은 또한 식물 세포에서 내생적 노화-유도 리파제의 발현을 억제하는 방법을 나타내며, 상기 방법은 (1) (A) (ⅰ) 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도 리파제 유전자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및 (B) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 식물의 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및 (2) 상기 노화-유도 리파제 유전자의 발현이 억제됨으로써 상기 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 전사되고(transcribed) 트랜스크립트는 상기 내생적 RNA에 결합함으로써 상기 식물을 성장시킴을 포함한다.
이 출원은 1998년 6월 26일에 출원된 출원번호 제09/105,812호의 부분 계속 출원이며, 참고문헌에 의해 완전히 여기에 포함된다.
본 발명은 식물 폴리펩타이드를 엔코드하고 노화-유도 발현을 나타내는 폴리뉴클레오타이드, 안티센스 오리엔테이션에서 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환된 식물과 식물 노화를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 노화의 개시로 발현이 유도되는 식물 리파제 유전자와 식물 노화를 조절하기 위한 리파제 유전자의 활용에 관한 것이다.
도 1은 카네이션 꽃 cDNA 라이브러리로부터 얻어진 노화-유도 리파제 cDNA 클론(서열번호 1)에 의해 엔코드되어 얻어진 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열 내의 콘센서스 모티프(consensus motif)는 다음과 같다: 싱글 언더라인, 아미데이션 사이트; 도티드 언더라인, 프로테인 키나제 C 포스포릴레이션(phosphorylation) 사이트; 더블 언더라인, N-미리스토일레이션(N-myristoylation) 사이트; 박스 보더, cAMP 포스포릴레이션 사이트; 새도우 박스, 카제인 키나제 Ⅱ 포스포릴레이션 사이트; 크로스-해치드 박스, 리파제 패밀리의 콘센서스 서열; 과 도티드 박스, N-글리코실레이션(N-glycosylation) 사이트.
도 2는 리파제 같은 단백질의 부분 서열 계열에서 얻어진 전체 길이 카네이션 꽃잎 노화-유도 리파제 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 카네이션 꽃잎 노화-유도 리파제의 전체 길이 서열인 칼립(carlip)(서열번호 11); 아라비돕시스 탈리아나로부터의 리파제 같은 단백질의 부분 서열인 알립(arlip)(Gen Bank Accession No. AL021710)(서열번호 12); 이포메아(Ipomea)로부터의 리파제 같은 서열의 부분 서열인 이폴립(ipolip)(Gen Bank Accession No. U55867)(서열번호 13); 아라비돕시스 탈리아나로부터의 리파제 같은 단백질의 부분 서열인 알리피(arlipi)(Gen Bank Accession No. U93215)(서열번호 14). 서열의 3개 또는 4개 중 동일한 아미노산은 박스로 나타내었다.
도 3은 E. coli에서 발현된 카네이션 리파제 cDNA로부터 얻어진 융합 단백질 발현 산물의 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 나타낸 것이다. 웨스턴 블랏은 노화-유도 리파제 단백질에 항체로 프로브된다. 레인 1, 말토오즈 결합 단백질;레인 2, 단백질 가수분해(팩터 Xa) 분열 사이트를 통해 말토오즈 결합 단백질 cDNA에 융합된(fused) 카네이션 리파제로 이루어진 융합 단백질; 레인 3, 팩터 Xa로 유리 리파제 단백질(50.2 kDa)과 유리 말토오즈-결합 단백질로 부분적으로 분열된 융합 단백질.
도 4는 다른 발달 단계에서 카네이션 꽃잎으로부터 분리된 RNA의 노던 블랏(Northern blot) 분석을 나타낸 것이다. 도 4A는 총 RNA의 에티디움 브로마이드 스테인드 겔(ethidium bromide stained gel)이다. 각 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다. 도 4B는32P-dCTP-라벨된 전체 길이 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA로 프로브된 노던 블랏의 오토라디오그래프(autoradiograph)이다.
도 5는 리폴리틱(lipolytic) 아실 하이드롤라제, 예를 들면, E. coli에서 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA의 발현을 통해 얻어진 단백질 산물의 리파제 활성도의 인 시투(in situ) 실험을 나타낸 것이다. mal, 기본 염 배지에서 말토오즈 결합 단백질만을 포함하는 E. coli 세포; mLip, 기본 염 배지에서 말토오즈 결합 단백질과 융합된 카네이션 노화-유도 리파제로 이루어진 융합 단백질을 포함하는 E. coli 세포; 40 mal/40 mLip, Tween 40으로 보충된 기본 염 배지에서 말토오즈 결합 단백질만 [mal] 또는 리파제-말토오즈 결합 단백질 융합 산물 [mLip]을 포함하는 E. coli 세포; 60 mal/60 mLip, Tween 60으로 보충된 기본 염 배지에서 말토오즈 결합 단백질만 [mal] 또는 리파제-말토오즈 결합 단백질 융합 산물 [mLip]을 포함하는 E. coli 세포.
도 6A는 카네이션 노화-유도 리파제의 오픈 리딩 프레임의 제한 효소 맵(map)을 나타낸 것이다. 숫자는 오픈 리딩 프레임에서 뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 6B는 다양한 제한 효소로 분해되고 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA로 프로브된 카네이션 게놈 DNA의 서던 블랏(Southern blot) 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. 솔리드 언더라이닝, 노화-유도 리파제 cDNA의 논-코딩 서열; 밑줄 없는 서열은 오픈 리딩 프레임.
도 8은 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이다.
도 9A는 15시간동안 0.5 ppm 에틸렌에 노출된 단계 Ⅱ 꽃잎에서 카네이션 리파제의 발현을 보여주는 노던 블랏 분석을 나타낸 것이다. 도 9A는 각 레인이 일정량의 카네이션 RNA로 로드됨을 보여주는 에티디움 브로마이드 스테인드 겔이다(꽃잎: 레인 1과 2; 잎: 레인 3과 4; +, 에틸렌 처리; -, 무처리). 도 9B는 라벨된 전체 길이 카네이션 꽃잎 노화-유도 리파제 cDNA로 프로브된 도 9A에서 겔의 노던 블랏의 오토라디오그램을 나타낸 것이다.
도 10은 토마토 잎 게놈 노화-유도 리파제의 부분 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)과 대응해서 이끌어낸 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 보존된 리파제 콘센서스 모티프는 어둡게 나타내었으며; 게놈 단편을 발생시키는 데 사용되는 프라이머의 서열은 밑줄로 나타내었다.
도 11은 막 누출(leakiness)에서 냉각(chilling)의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 토마토 식물은 8℃에서 48시간동안 냉각되고 상온에서 다시 따뜻해진다. 잎 디스크로부터의 투석물 누출량(diffusate leakage) (μMhos)은 냉각되지 않은 콘트롤 식물과, 6시간과 24시간 주기로 냉각된 식물에 대해 측정된다.
도 12는 8℃에서 48시간동안 냉각되고 상온에서 24시간동안 다시 따뜻해진 식물로부터 분리된 토마토 잎 RNA의 노던 블랏 분석을 나타낸 것이다. 도 12A는 총 잎 RNA의 에티디움 브로마이드 스테인드 겔이다. 도 12B는32P-dCTP-라벨된 전체 길이 카네이션 노화-유도 리파제 cDNA로 프로브된 노던 블랏의 오토라디오그래프이다.
도 13은 카네이션 노화-유도 리파제와 64 아미노산 영역에 걸쳐 55.5% 동일한 아라비돕시스 EST(GenBank Acc# : N38227)의 부분 뉴클레오타이드 서열(서열번호 15)과 대응해서 이끌어낸 아미노산 서열(서열번호 16)을 나타낸 것이다. 보존된 리파제 콘센서스 모티프는 어둡게 나타내었다.
(발명의 상세한 설명)
방법과 조성은 식물 세포에서 노화-유도 리파제 유전자(들)의 발현을 바꾸기 위해 제공된다. 식물에서 노화-유도 리파제 유전자의 발현 변경은 노화의 개시를 지연시키고 환경 스트레스에 대한 저항성을 향상시켜, 식물 수명 및/또는 성장 주기를 확장시킨다.
노화-유도 발현을 나타내는 카네이션 리파제 유전자를 엔코딩하는 전체 길이 cDNA 서열은 카네이션(Dianthus caryophyllus) 꽃의 꽃잎을 노화시키는 RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리로부터 분리되어졌다. 전체 길이 카네이션 리파제 cDNA는 물론 분리된 카네이션 꽃 리파제 cDNA 서열의 선택된 영역에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 프로브는 환경적으로 스트레스 받은(냉각된) 토마토 잎은 물론 카네이션 잎 노화, 토마토 열매 숙성과 그린 빈(green bean) 잎 노화에서 리파제 유전자를 엔코딩하는 mRNA의 존재를 결정하는데 사용된다. 카네이션 리파제 cDNA로부터 디자인된 프라이머는 토마토 잎 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)을 발생시키는데 사용된다. PCR 산물은보존된 리파제 콘센서스 모티프, ITFTGHSLGA(서열번호 3)를 포함하는 부분적 단백질 서열을 엔코드하는 부분적 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 토마토 뉴클레오타이드 서열은 카네이션 노화-유도 리파제 서열과 53.4% 그리고 아라비돕시스 리파제 서열과 43.5%의 동일성을 갖는다. 아라비돕시스 리파제 서열은 카네이션 뉴클레오타이드 서열과 44.3%의 동일성을 갖는다.
본 발명의 노화-유도 리파제 유전자는 카네이션 리파제의 소스인 사이토솔릭(cytosolic) 지질-단백질 입자에 대해 올려진 항체로 카네이션 꽃잎을 노화시키는 것으로부터 준비된 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝(screening) 함으로써 분리된다. 노화-유도 리파제 유전자에 대응하는 양성 전체-길이 cDNA 클론은 얻어져 서열화된다. 노화-유도 리파제 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타내었다. cDNA 클론은 50.2 kDa의 계산된 분자 질량을 갖는 447 아미노산 폴리펩타이드(서열번호 2)를 엔코드한다. E. coli에서 cDNA 클론의 발현은 아실 하이드롤라제 활성도를 나타내는 기대되는 분자량의 단백질을 만드는데, 예를 들면, 발현된 단백질은 p-니트로페닐팔미테이트, 인지질과 트리아실글리세롤을 가수분해한다. 카네이션 꽃 발달에서 효소의 발현 패턴과 단백질의 활성도에 기초하여, 이는 노화에 관련된다.
전체 길이 카네이션 cDNA로 프로브된 카네이션 꽃잎 총 RNA의 노던 블랏은 노화-유도 리파제 유전자의 발현이 노화의 개시에 앞서 중요하게 유도된다는 것을보여준다(도 4). 노던 블랏 분석은 또한 노화-유도 리파제 유전자가 환경 스트레스 조건 예를 들면, 냉각(도 12)과 환경 스트레스에 감응하여 생산되는 것으로 알려진 에틸렌(도 4와 9)에 의해 유도된다는 것을 증명한다. 노던 블랏 분석은 카네이션 노화-유도 리파제 mRNA의 존재가 카네이션 꽃잎의 어린 단계 Ⅰ, Ⅱ와 Ⅲ 에서보다 노화(발달 단계 Ⅳ)에서 중요하게 더 높다는 것을 보여준다. 게다가, 꽃의 에틸렌-자극 단계 Ⅱ는 또한 더 높은 노화-유도 리파제 유전자 발현을 보여준다. 동일하게, 냉각 온도에 노출되고 상온으로 돌아온 식물은 또한 냉각 손상 징후(예를 들면, 누출)의 발달과 일치하는 노화-유도 리파제 유전자의 유도된 발현을 보여준다(도 11과 12). 다양한 식물 예를 들면, 카네이션, 그린 빈, 토마토와 다양한 식물 조직 예를 들면, 잎, 열매와 꽃에서 유전자 발현의 전체적인 패턴은 본 발명의 리파제 유전자가 이러한 식물과 식물 조직에서 노화의 개시에 관련되어 있음을 증명한다. 따라서, 식물 조직에서 노화-유도 리파제 유전자의 발현을 실질적으로 억제하거나 변경함으로써, 죽기 쉬운 열매, 꽃과 야채의 수명을 늘리며 황폐와 손상을 지연할 수 있음이 기대된다. 이는 형질전환된 식물을 생산함으로써 이루어질 수 있는데, 그의 리파제 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드 단편은 열매, 꽃과 야채의 안티센스 컨피거레이션에서 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성적(constitutive) 프로모터를 사용하거나, 조직-특이 또는 노화-유도성 프로모터를 이용하여 발현된다.
카네이션 노화-유도 리파제 유전자는 싱글 카피 유전자이다. 노화-유도 리파제 cDNA의 오픈 리딩 프레임 내의 서열을 인식하지 않는 다양한 제한 효소로 자른 카네이션 게놈 DNA의 서던 블랏 분석이 행해졌다. 제한 효소-분해된 게놈 DNA는32P-dCTP-라벨된 전체 길이 cDNA(서열번호 1)로 프로브된다. 높은 스트린전시(stringency) 혼성 조건하에서, 단 하나의 제한 단편이 cDNA 클론에 하이브리다이즈한다(68℃에서 혼성과 세척; 세척 완충용액 : 0.2% x SSC, 0.1% SDS). 따라서, 카네이션 노화-유도 리파제 유전자는 싱글 카피 유전자이다(도 6). 이 유전자가 카네이션에서 멀티유전자 패밀리의 멤버가 아니라는 사실은 그것이 다른 식물에서 싱글 카피 유전자임을 강하게 제안한다. 따라서, 카네이션 노화-유도 리파제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열의 인지는 다른 다양한 식물 종으로부터 노화-유도 리파제 유전자를 분리하는 데 충분하다. 실제로, 여기에서 증명된 대로, 카네이션 cDNA 서열에 기초한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 토마토 잎 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 토마토 잎 노화-유도 리파제 유전자 단편을 발생시키는 데 성공적으로 사용되었다.
무화과나무 혹(fig wart) 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 같은 구성적(constitutive) 프로모터, 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 프로모터 CaMV35S 또는 MAS 프로모터 콘트롤 하에서 리버스 오리엔테이션(안티센스)으로 도입되면, 클론된 노화-유도 리파제 유전자 또는 그의 단편(들)은 유전적으로 식물을 변형하고 변형된 식물에서 노화를 바꾸는데 사용될 수 있다. 카네이션 노화-유도 리파제 유전자와 충분한 서열 동일성을 나누는 다른 식물들로부터 선택된안티센스 서열은 동일한 유전적 변형을 이루는데 사용될 수 있다. 유전적 변형의 한가지 결과는 내생적 번역가능한 노화-유도 리파제-엔코딩 mRNA 양의 감소이다. 따라서, 식물 세포에서 생산된 노화-유도 리파제의 양은 감소되어, 잎, 열매 및/또는 꽃 손상 감소와 같은 숙성 또는 환경 스트레스에 기인하는 세포막 손상과 세포 누출의 양이 감소하게 된다. 유전적 변형은 식물에서 노화-유도 리파제 레벨의 영구적인 변화에 영향을 줄 수 있으며 셀핑(selfing) 또는 다른 생식 스킴에 의해 자손에게 전달될 수 있다. 유전적으로 변경된 식물은 새로운 종류 또는 라인(line)의 식물을 생산하는데 사용되는데, 변경(alteration)은 세대에서 세대로 안정적으로 옮겨진다. 본 발명은 처음으로 다른 식물의 넓은 범위에서 노화의 안정한 유전적 변형을 이루는데 사용되는 적절한 DNA 서열을 제공한다.
노화-유도 리파제 유전자의 확인과 분리를 위해서, 일반적으로 플라스미드 DNA 제조, 제한 효소 분해, DNA의 아가로스 겔 전기영동, 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 서던 블랏, 노던 블랏, DNA 리게이션(ligation)과 박테리아성 형질전환이 이 기술에서 잘 알려진 종래의 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, Sambrook, J. et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참고. 핵산 혼성의 기술은 Sambrook(Supra)에 의해 개시되었다.
여기에 사용된 대로, 용어 "식물(plant)"은 전체 식물, 식물 부분, 식물 세포 또는 식물 세포 그룹을 나타낸다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물의 타입은 제한되지 않고 예를 들면, 에틸렌-민감한 식물과 에틸렌-민감하지 않은 식물; 살구, 사과, 오렌지, 바나나, 포도, 배, 토마토, 딸기, 아보카도 등과 같은 열매를 맺는 식물; 당근, 완두, 상추, 양배추, 무, 감자, 브로콜리, 아스파라거스 등과 같은 야채; 카네이션, 장미, 국화와 같은 꽃; 과 일반적으로, 본 발명의 DNA 분자를 차지하여 발현할 수 있는 어떠한 식물을 포함한다. 하플로이드(haploid), 디플로이드(diploid), 테트라플로이드(tetraploid)와 폴리플로이드(polyploid)를 포함하는 다양한 플로이디(ploidy) 레벨의 식물을 포함할 것이다.
형질전환된 식물은 이종의 또는 동종의 노화-유도 리파제 DNA 또는 변형된 DNA 또는 동종의 노화-유도 리파제 DNA의 어느 부분 또는 동종의 노화-유도 리파제 DNA를 게놈에 결합시킨 식물에 제한되는 것이 아니라 어떠한 방법으로 유전적으로 변형된 식물로써 여기에 규정된다. 변경된 유전적 물질은 단백질을 엔코드하거나, 조절 또는 콘트롤 서열을 포함하거나, 안티센스 서열이 되거나 포함하거나 내생적 노화-유도 리파제 DNA 또는 mRNA 서열 또는 식물의 그부분에 안티센스인 안티센스 RNA를 엔코드한다. "트랜스진(transgene)" 또는 "형질전환된 서열(transgenic sequence)"은 형질전환된 식물에 결합된 외부 유전자 또는 부분 서열로써 규정된다.
여기서 사용된 용어 "혼성(hybridization)"은 일반적으로 프로브 서열의 성질과 목표 서열에 의존하여 이 기술에 능숙한 사람들에게 명백하도록 스트린전시의 적절한 조건에서 핵산의 혼성을 의미한다. 혼성과 세척 조건은 이 기술에서 잘 알려져 있으며, 배양 시간, 온도 및/또는 용액의 이온세기를 변화시킴으로써 바람직한 스트린전시에 의존한 조건의 조정은 쉽게 이루어진다. 예를 들면, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring harbor, New York, 1989 참고. 조건의 선택은 가수분해된 서열의 길이 특별히, 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대적 G-C 함량과 허용된 미스매치(mismatch)의 양에 의해 지시된다. 낮은 스트린전시 조건은 더 낮은 정도의 상보성을 지닌 가닥간의 부분적 혼성이 바람직할 때 선호된다. 완전한 또는 거의 완전한 상보성이 바람직할 때, 높은 스트린전시 조건이 선호된다. 전형적으로 높은 스트린전시 조건하에서, 혼성 용액은 6x S.S.C., 0.01M EDTA, 1x 덴하르트 용액(Denhardt's solution)과 0.5% SDS를 포함한다. 혼성은 클론된 DNA 단편에 대해 68℃에서 약 3 내지 4시간동안 수행되며 총 성숙핵(eukaryotic) DNA에 대해 약 12 내지 16시간동안 수행된다. 더 낮은 스트린전시에서 혼성 온도는 듀플렉스(duplex)의 녹는 온도(TM) 이하로 약 12℃까지 낮춰진다. TM은 용액의 이온 세기뿐만 아니라 G-C 함량과 듀플렉스 길이의 함수로 알려져 있다.
여기에 사용된 대로, 용어 "실제 서열 동일성(substantial sequenceidentity)" 또는 "실제 상동성(substantial homology)"은 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 실제 구조적 또는 기능적으로 같음을 나타내는 것을 가리킬 때 사용된다. 실제 서열 동일성 또는 실제 상동성을 갖는 서열간의 어떠한 구조적 또는 기능적 차이는 최소가 될 것이다; 즉, 바람직한 출원에서 나타낸 대로 서열의 기능적 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. 차이는 예를 들면 다른 종들간의 코돈 사용에서 고유한 변이에 기인하는 것이다. 둘 또는 그 이상의 서열간에 서열 오버랩 또는 동일성이 있거나 길이 또는 구조가 다른 서열이 동일한 물리적 특성을 나타낼 때 구조적 차이는 최소로 여겨진다. 그러한 특성은 예를 들면 규정된 조건하에서 하이브리다이즈하는 능력, 또는 단백질의 경우, 효소 활성도와 동일한 면역학적 크로스반응성(immunological crossreactivity) 등을 포함한다.
부가적으로, 2개의 뉴클레오타이드 서열은 그들간에 적어도 70 퍼센트, 더욱 바람직하게는, 80 퍼센트 그리고 더욱 바람직하게는 90 퍼센트 서열 동일성을 가질때 "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 이다. 2개의 아미노산 서열은 그들이 폴리펩타이드의 활성 부분간에 적어도 50%, 바람직하게는 70% 동일성을 가질 때 실질적으로 동종이다.
핵산(또는 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드)의 "관능 유도체(functional derivative)" 용어는 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 유전자 또는 뉴클레오타이드서열의 단편(fragment), 변이(variant), 상동(homolog) 또는 동류(analog)를 의미하며 여기에 사용된다. 관능 유도체는 본 발명에 따라 사용되는 DNA를 엔코딩하는 노화-유도 리파제 기능의 적어도 한 부분을 유지한다. 그러한 기능은 본래 카네이션 노화-유도 리파제 또는 노화-유도 리파제를 엔코드하는 다른 식물로부터 실질적으로 동종인 DNA와 하이브리다이즈 또는 그의 mRNA 트랜스크립트와 하이브리다이즈, 또는 안티센스 오리엔테이션에서, 식물 노화-유도 리파제 mRNA의 전사 및/또는 번역 등을 억제하는 능력을 포함한다.
유전자 또는 DNA 서열의 "단편(fragment)"은 분자, 예를 들면, 더 짧은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 어떠한 서브셋(subset)을 나타낸다. "변이(variant)"는 하나 또는 그 이상의 치환된 뉴클레오타이드를 갖는 뉴클레오타이드 치환 변이와 같은 전체 유전자 또는 그의 단편에 실질적으로 동일하지만 특별한 유전자와 하이브리다이즈하거나 본래 DNA와 하이브리다이즈하는 mRNA 트랜스크립트를 엔코드하는 능력을 유지하는 분자를 나타낸다. "상동(homolog)"은 다른 식물 속 또는 종으로부터의 단편 또는 변이 서열을 나타낸다. "동류(analog)"는 전체 분자, 그의 변이 또는 단편에 실질적으로 동일하거나 관련하여 기능하는 비자연적 분자를 나타낸다.
유전자, 예를 들면, 노화-유도 리파제 유전자의 "변경된 발현(altered expression)" 또는 "변형된 발현(modified expression)"은 유전자의 정상적인 발현, 예를 들면, 변형되지 않은 카네이션 또는 다른 식물에서 일어나는 발현이 어떤 방법으로 바뀐 어떠한 과정 또는 결과를 나타낸다. 여기서 의도한 대로, 유전자 발현에서 변경은 노화-유도 리파제 유전자의 발현에서 완전하거나 부분적으로 감소하지만, 또한 발현 타이밍에서의 변화 또는 다른 상태를 포함하는데 이때 노화-유도 리파제 유전자의 발현은 변형되지 않은 식물 또는 재배종(cultivar)에서 자연적으로 일어날 것 같은 것과 다르다. 바람직한 변경은 변형되지 않은 식물에서의 생산에 비교하여 식물에 의한 노화-유도 리파제 생산의 감소를 가져온다.
본 발명에 따라 유전적으로 변경된 식물의 생산에서, 바람직한 특징, 일반적으로 감소하는 노화-유도 리파제 발현 또는 생산에 의해 묘목 또는 식물을 선택하는 것이 바람직하다. 노화-유도 리파제의 발현은 예를 들면 종래의 면역에세이 방법에서 여기에 기술된 특이 항체를 이용하여 양으로 측정될 수 있다. 또한, 노화-유도 리파제 효소 활성도는 여기에 기술된 생화학적 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
발현되어 엔코드하는 단백질의 생산을 가져오는 새로이 삽입된 유전자 또는 DNA, 또는 전사되어 안티센스 RNA 분자를 가져오는 안티센스 DNA의 경우에, 적절한 조절 요소는 유전자 또는 DNA 서열에 대해 적절한 위치와 방향에 존재해야 한다. 조절 영역은 증강자와 다른 조절 서열은 물론 프로모터, 5'-비번역된 리더 서열과 3' 폴리아데닐레이션 서열을 포함한다.
노화-유도 리파제 유전자와 결합하여 유전자의 센스 또는 안티센스 트랜스크립트를 발생시키는 유용한 프로모터 조절 요소는 일반적으로 어떠한 식물 프로모터, 더욱 상세히는, 무화과나무 혹(fig wart) 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 프로모터, CaMV35S 프로모터, 또는 MAS 프로모터, 또는 카네이션 꽃잎 GST1 프로모터 또는 아라비돕시스 SAG12 프로모터와 같은 조직-특이 또는 노화-유도 프로모터와 같은 구성적 프로모터를 포함한다(예를 들면, 참고문헌에 의해 여기에 포함된 J.C. Palaqui et al., Plant Physiol., 112:1447-1456 (1996) ; Morton et al., Molecular Breeding, 1:123-132 (1995) ; Fobert et al., Plant Journal, 6:567-577 (1994) ; and Gan et al., Plant Physiol., 113:313 (1997) 참고). 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 프로모터는 구성적 프로모터이다.
본 발명에서 유용한 프로모터의 발현 레벨은 종래의 발현 시스템을 이용하여 예를 들면, 리포터 유전자 산물 즉, 프로모터/리포터가 도입되는 형질전환된 식물의 잎, 꽃, 열매 또는 다른 조직 추출물에서 단백질 또는 mRNA의 레벨을 측정함으로써 테스트될 수 있다.
본 발명은 카네이션 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 유전자에 상보적이거나 다른 식물의 유전자 또는 유전자 단편에 상보적이며 낮거나 높은 스트린전시 조건하에서 카네이션 노화-유도 리파제 유전자와 하이브리다이즈하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 그러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 혼성화의 최소 특이성을 제공하기 위해 적어도 약 6개의 뉴클레오타이드 길이가 되어야 하며 노화-유도 리파제 또는 그의 부분을 엔코딩하는 DNA 또는 mRNA의 한 가닥 또는 노화-유도 리파제 유전자 발현 조절에 포함되는 게놈 DNA에서의 플랭킹(flanking) 서열에 상보적이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 100개의 뉴클레오타이드 만큼 크며 길이가 확장되어 안티센스에 대한 전체 코딩 서열을 넘게 된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 또는 키메릭(chimeric) 혼합물 또는 유도체 또는 그의 변형된 버전, 싱글 스트랜디드(single stranded) 또는 더블 스트랜디드(double stranded)가 될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 행동은 세포에서 노화-유도 리파제 유전자 발현의 변경, 주로 억제를 가져온다. 안티센스의 일반적 토론에 대한 참고: Alberts, et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., Garland Publishing, Inc. New York, New York (1989, 특별히 페이지 195-196, 참고문헌에 의해 여기에 포함됨).
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도 리파제 유전자의 어느 부분에 상보적으로 될 것이다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 6개와 100개 사이의 뉴클레오타이드 길이가 될 것이며, 예를 들면 노화-유도 리파제 서열의 5'-비코딩 서열에 상보적으로 될 것이다. 5'-비코딩 서열에 주로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전사 요인을 엔코딩하는 유전자 발현의 억제자에 효과적으로 알려져 있다. Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4284-4290 (1993).
바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적이다. 예를 들면, 안티센스 오리엔테이션에서 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 전체 길이 cDNA 클론을 식물에 도입하는 것은 성공적으로 변경된 노화-유도 리파제 유전자 발현을 결과로 가져올 것이 기대된다. 게다가, 노화-유도 리파제 유전자의 특이 부분에 목표된 부분 서열의 도입은 동일하게 효과적일 수 있다.
본 발명에 의해 요구되는 상동성의 최소량은 다른 RNA 또는 DNA 분자의 기능과 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않으며 특이 목표 RNA 또는 DNA의 인식과 그의 번역 또는 기능의 억제 또는 감소를 제공하기에 충분한 상보성을 결과로 가져오기에 충분하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도 리파제 유전자의 RNA 트랜스크립트의 적어도 한 부분에 상보적인 서열을 포함하지만, 절대적 상보성은 요구되지 않는다. 하이브리다이즈하는 능력은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이와 상보성 정도에 의존한다. 일반적으로, 핵산을 더 길게 하이브리다이징할수록, 염기가 노화-유도 리파제 목표 서열과 더욱 미스매치(mismatch)하여 안정한 듀플렉스를 포함하고 형성한다. 이 기술에 능숙한 사람은 예를 들면 하이브리다이즈된 화합물의 녹는점을 결정하기 위해 표준 방법을 사용하여 허용할 수 있는 미스매치 정도를 확인할 수 있다.
안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 외생적으로(exogenously) 도입된 핵산 서열로부터 전사에 의해 세포 내부로 발생된다. 안티센스 분자는 프로모터를 포함하는 적절한 조절 요소에 기능적으로 연결된 안티센스 노화-유도 리파제 서열을 엔코딩하는 DNA로 결합되는 플라스미드 또는 바이러스와 같이 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션 또는 벡터로 감염되어 세포로 전달된다. 세포 내에서 외생적 DNA 서열은 노화-유도 리파제 유전자의 안티센스 RNA를 생산하며 발현된다.
벡터는 플라스미드가 될 수 있거나, 바람직하게는, 식물 세포 또는 박테리아 세포에서 엔코드된 유전자를 복제하고 발현하기 위해 이 기술에서 알려진 바이러스 또는 다른 벡터가 될 것이다. 벡터는 바람직한 안티센스 노화-유도 리파제 RNA를 생산하기 위해 전사될 수 있도록 염색체적으로 인테그레이트된다. 그러한 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 이 기술에서 표준인 재조합 DNA 기술 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 프로카리오틱 호스트(prokaryotic host)에서 기능적인 복제 시스템과 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 벡터가 될 것이다. 대신으로, 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 기능적인 복제 시스템과 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 벡터가 될 것이다. 아그로박테리움에서 복제할 수 있는 플라스미드는 이 기술에서 잘 알려져 있다. Miki, et al., Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,, Eds. B.R. Glick and J.E. Thompson. CRC Press (1993), PP. 67-83 참고.
카네이션 리파제 유전자는 안티센스 오리엔테이션에서 플라스미드 벡터로 다음과 같이 클론된다. pUC18 백본으로 제조되고 다중 클로닝 사이트와 옥타파인(octapine) 합성효소 종결 서열이 따르는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터 35S 프로모터를 포함하는 pCD 플라스미드는 카네이션 리파제 유전자를 클로닝하는데 사용된다. pCd-리파제 (안티센스) 플라스미드는 안티센스 오리엔테이션에서 전체 길이 카네이션 리파제 유전자를 pCd의 Hind3 사이트와 EcoR1 사이트로 서브클로닝함으로써 제조된다. 동일하게, pCDΔ35S-GST1-리파제 (안티센스) 플라스미드는 카네이션 글루타싸이온 S 트랜스퍼라제 1(Glutathione S Transferase 1, GST1) 프로모터의 PCR 증폭된 단편(-703 to +19 bp)을 pCd의 BamH1과 Sal1 사이트로 처음 서브클로닝함으로써 제조된다. 전체 길이 카네이션 리파제 유전자는 안티센스 오리엔테이션에서 컨스트럭트(construct)의 Hind3와 EcoR1 사이트로 서브클론된다. 다른 플라스미드, pGdΔ35S-GST1-GUS 플라스미드는 카네이션 글루타싸이온 S 트랜스퍼라제 1(GST1) 프로모터의 PCR 증폭된 단편(-703 to+19 bp)을 pCd의 BamH1과 Sal1 사이트로 처음 서브클로닝함으로써 제조된다. 리포터 유전자 베타-글루쿠로니다제(GUS)는 컨스트럭트의 Sal1과 EcoR1 사이트로 서브클론된다. pCd-35S2-리파제 (안티센스) 플라스미드는 더블 35S 프로모터(탠덤에서 CaMV 35S 프로모터의 2개의 카피를 포함하는)를 pCd 벡터의 Sma1과 Hind3 사이트로 처음 서브클로닝함으로써 제조된다. 전체 길이 카네이션 리파제 유전자는 안티센스 오리엔테이션에서 컨스트럭트의 Hind3과 EcoR1 사이트로 서브클론된다.
바람직하게는 약 6개와 100개 사이의 뉴클레오타이드 길이이며, 노화-유도 리파제 서열의 목표 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 재조합 뉴클레오타이드 기술로 제조되거나 모노뉴클레오타이드 또는 더 짧은 올리고뉴클레오타이드로부터 합성될 것이다. 자동화된 합성기는 본 발명의 올리고- 와 폴리뉴클레오타이드의 화학적 합성에 응용 가능하다. 본 발명에 따라 재조합 뉴클레오타이드 분자를 제조하는 과정은 Sambrook, et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 개시되어 있으며, 완전히 여기에 포함된다. 노화-유도 리파제 서열에 상보적인 안티센스 RNA를 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드는 이 기술에서 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 그 방법에 대한 상세한 것은 Maniatis, T. et al., Molecular mechanisms in the Control of Gene expression, eds., Nierlich, et al., eds., Acad. Press, N.Y. (1976)에 제공된다.
본 발명의 대체 실시태양에서, 내생적 식물 노화-유도 리파제의 발현 억제는 식물 세포로 도입된 외생적 노화-유도 리파제 유전자 또는 유전자 단편의 발현 전반에 걸쳐 코-억제(co-suppression)의 결과이다. 본 발명의 이 실시태양에서, 센스 오리엔테이션에서 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 벡터는 안티센스 분자에 대해 여기 기술된 동일한 방법으로 세포로 도입된다. 바람직하게는, 노화-유도 리파제는 예를 들면 무화과나무 혹 모자이크 바이러스 프로모터 또는 CaMV35S와 같은 강한 구성적 프로모터에 기능적으로 연결된다.
본 발명에 따라 만들어진 형질전환된 식물은 이 기술에서 알려진 식물 형질전환의 어떤 방법을 이용한 DNA 형질전환에 의해 제조된다. 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumerfaciens)로 식물, 조직 또는 세포의 직접 코-배양(co-cultivation) 또는 직접 감염(Miki, et al., Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology, (1993), p. 67-88); 원형질 또는 원형질 업테이크(protoplast uptake)로 직접 유전자 전달(Paszkowski, et al., EMBO J., 12:2717 (1984)); 일렉트로포레이션(electroporation)(Fromm, et al., Nature, 319:719 (1986)); 입자 충격(Klein et al., BioTechnology, 6:559-563 (1988)); 묘목과 식물의 분열조직으로 주입(De LaPena, et al., Nature, 325:274-276 (1987)); 배양된 세포와 조직의 원형질로 주입(Reich, et al., BioTechnology, 4:1001-1004 (1986))을 포함한다.
일반적으로 완전한 식물은 형질전환 과정으로 얻어진다. 식물은 원형질, 칼루스(callus), 조직 파트 또는 체외이식조직(explant) 등으로부터 재생된다. 노화-유도 리파제의 발현이 변경되어 재생된 식물로부터 얻어진 잎, 꽃, 열매, 씨 등의 식물 부분은 여기에 사용된 "식물(plant)"의 정의에 포함된다. 재생된 식물의 자손(progeny), 변이와 돌연변이 또한 "식물(plant)"의 정의에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 cDNA 분자로 엔코드된 카네이션 노화-유도 리파제 단백질과 카네이션 단백질에 대한 항체와 교차-반응하는 단백질을 제공한다. 그러한 단백질은 서열번호 2, 도 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 2에 나타낸 단백질에 대한 항체와 교차 반응성을 분담한다.
카네이션 노화-유도 리파제 단백질 또는 그의 관능 유도체는 바람직하게는 재조합 기술로, 선택적으로 화학적 합성 방법과 결합하여 생산된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 노화-유도 리파제는 말토오즈 결합 단백질로 융합된 노화-유도 리파제로 이루어진 융합 단백질로 발현된다. 재조합 융합 단백질을 엔코딩하는 클론의 발현은 리파제 활성도의 지시약인 p-니트로페닐팔미테이트, 인지질과 트리아실글리세롤을 가수분해하는 기대되는 분자량의 융합 단백질을 가져온다. 재조합 노화-유도 리파제 단백질은 카네이션 노화-유도 리파제에 대한 항체와 임뮤노블랏팅(immunoblotting) 후 웨스턴 블랏 분석에서 우세한 밴드를 보여준다. 프로테아제, 팩터 Xa로 융합 단백질을 처리하여 방출된 유리 노화-유도 리파제(50.2 Kda)또한 웨스턴 블랏 분석에서 노화-유도 리파제 항체와 반응한다(도 3). 노화-유도 리파제 아미노산 서열의 모티프 검색은 아미드 결합에 대한 미리스테이트(myristate)의 공유 결합에 대한 잠재적 N-미리스토일레이션(N-myristoylation) 사이트(도 1)의 존재를 보여준다(Johnson, et al., Ann. Rev. Biochem., 63:869-914 (1994); Towler, et al., Ann. Rev. Biochem., 57:67-99 (1988); and R.J.A. Grand, Biochem. J., 258:625-638 (1989)). 단백질 모티프 검색은 또한 카네이션 노화-유도 리파제가 보존된 리파제 콘센서스 서열인 ITFAGHSLGA 서열(서열번호 4)을 포함함을 보여준다(표 1). 다양한 식물로부터 보존된 리파제 콘센서스 서열을 하기 표에 나타내었다.
식물 종 보존된 리파제 서열
카네이션 I T F AGHSLGA (서열번호 4)
토마토 I T F TGHSLGA (서열번호 3)
아라비돕시스 I T T CGHSLGA (서열번호 9)
이포모에아 닐 I T V TGHSLGS (서열번호 10)
본 발명의 노화-유도 리파제 단백질은 인 비트로(in vitro)와 인 시투(in situ) 에세이 양쪽에서 리파제 활성도를 갖는 것으로 나타난다. 인 비트로 측정을 위해서, p-니트로페닐팔미테이트와 콩 인지질(40% 포스파티딜콜린과 60% 다른 인지질)은 기질로써 사용되고, 반응의 산물인 p-니트로페놀과 유리 지방산은 각각 분광학적으로 측정된다(Pencreac'h and Baratti, 1996; Nixon and Chan, 1979; Lin et al., 1983). 리파제 활성도는 또한 Nixon 과 Chan (1979) 그리고 Lin et al이 기술한 방법의 변형을 이용하여 가스 크로마토그래피로 인 비트로 측정된다. 반응 혼합물은 최종 100 ㎕ 부피에 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 2.5 mM 기질(트리리놀레인, 콩 인지질과 디리놀레일포스파티딜콜린)과 효소 단백질(100 ㎍)을 포함한다. 기질은 반응 혼합물에 첨가되기 전에 5% 검 아라빅(gum arabic)에서 유화된다. 이렇게 하기 위해서, 기질은 클로로포름에 용해되고, 검 아라빅 용액에 첨가되어 30초 동안 초음파 처리로 유화된다. 유화 후, 클로로포름은 N2흐름으로 증발시킨다. 반응은 2시간까지 시간 주기를 변화시키며 25℃에서 수행된다. 반응 혼합물은 지질-추출되며, 유리 지방산은 TLC로 정제되며, GC로 유도체화되고 정량화된다(McKegney et al., 1995).
리폴리틱 아실 하이드롤라제 활성도는 Furukawa et al.(1983)이 기술하고 Tsuboi et al.(1996)이 변형한 대로 인 시투 측정된다. 후자의 에세이에서, 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 전체 길이 cDNA 클론으로 형질전환된 E. coli는 탄소 소스만으로 긴 체인 지방산 에스터인 Tween 40 또는 Tween 60으로 보충된 최소 염 배지에서 성장한다. 따라서, 박테리아 성장에 대한 탄소는 지방산 에스터가 리파제로 가수분해될 때만 응용가능하다. 노화-유도 리파제 cDNA로 형질전환된 E. coli가 초기 lag 단계 후에 Tween 40- 과 Tween 60- 염기 배지에서 성장하는 반면, 형질전환되지 않은 E. coli의 대조군 배양이 성장하지 않는 발견은 엔코드된 재조합 단백질의 리파제 활성도를 확인시켜 준다(도 5). 즉, 노화-유도 리파제는 성장을 위해 필요한 탄소를 얻기 위해 스테아레이트(Tween 60)와 팔미테이트(Tween40)를 방출한다.
여기에 기술된 노화-유도 리파제 단백질의 "관능 유도체(functional derivatives)"는 노화-유도 리파제의 단편, 변이, 동류, 또는 화학적 유도체를 나타내는데, 노화-유도 리파제 활성도 또는 노화-유도 리파제에 특이한 항체와 면역학적 교차 반응성의 적어도 한 부분을 유지한다. 노화-유도 리파제 단백질의 단편은 분자의 어떠한 서브셋(subset)을 나타낸다. 변이 펩타이드는 이 기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여, 예를 들면, 직접적 화학 합성으로 제조된다. 노화-유도 리파제의 동류는 전체 단백질 또는 그의 단편에 실질적으로 동일한 비자연적 단백질을 나타낸다. 노화-유도 리파제의 화학적 유도체는 부가적 화학 모이어티 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 부분을 비정상적으로 포함한다. 변형은 펩타이드의 목표 아미노산 잔기를 선택된 사이드 체인 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 노화-유도 리파제 펩타이드 또는 그의 단편에 도입된다.
본 발명에 따른 노화-유도 리파제 단백질 또는 펩타이드는 본 발명(센스 오리엔테이션에서)의 뉴클레오타이드로 형질전환된 세포를 배양하고, 세포가 단백질을 합성하게 하고, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터, 사용된 클로닝 프로토콜에 의존하여, 유리 단백질 또는 융합 단백질로써, 단백질을 분리함으로써 생산된다. 대안으로, 단백질은 세포-유리 시스템에서 생산될 수 있다. Ranu, et al., Meth.Enzymol., 60:459-484, (1979).
이제 일반적으로 기술된 본 발명을 가지고, 참고문헌을 통해 도식으로 제공된 다음의 실시예들까지 더 쉽게 이해될 것이며, 기술되지 않았다면, 본 발명에 한정하려고 의도한 것은 아니다.
(실시예 1) 카네이션 리파제 cDNA 분리에 사용된 식물재료
온실에서 성장하고 유지된 카네이션 식물(Dianthus caryophyllusL. cv. Improved white Sim)이 노화-유도 리파제 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 분리하기 위해 사용되었다. 노화 꽃잎형으로 꽃조직을(상이한 발전 단계로부터) 완충액 속에서 수집하여 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
사이토솔릭(Cytosolic) 리피드 입자를 노화되기 바로 직전에 수확한 카네이션 꽃잎으로부터 분리하였다. 카네이션 꽃잎(25 g/150 ml 완충액)을 4℃에서 균질화 완충액 (50 mM Epps-0.25 M 솔비톨 pH 7.4, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM 벤즈아마딘, 10 mM 아미노-n-카프로익산 및 4% 폴리비닐폴리피롤리돈)에서 45초동안 옴니마이저(Omnimizer)로 균질화시키고 더욱 폴리트론(Polytron) 호모게나이저로 균질화시킨다. 균질화물은 4층 치즈클로스(cheesecloth)를 통해 여과시키고, 여과물은 4℃에서 10,000 g로 20분간 원심분리시킨다. 상등액에서 마이크로소멀 멤브레인을 분리하기 위해 250,000 g로 1시간동안 원심분리시킨다. 지질 입자가 Hudak and Thompson(Physiol. Plant., 114:705-713(1997)) 방법에 의해 부유물 원심분리후 입자를 수집함으로써 포스트-마이크로소멀 상등액으로부터 얻어진다. 상등액을 10%(w/v)의 설탕에 녹이고 23 ml의 상등액을 퍼서 60 Ti Beckman 원심분리 튜브에 넣고, 1.5 ml의 분리 완충액을 넣은 후 4℃에서 305,000g로 12시간동안 원심분리시킨다. 입자들을 Pasteur 피펫을 사용하여 분리 완충액으로부터 제거시킨다. 3 ml의 입자현탁액을 멸균된 PBS(10 mM 황산나트륨 완충액 pH 7.5와 0.85%의 염화나트륨)로 평형화된 Sepharose G-25 컬럼에 넣고, 현탁액을 멸균 PBS로 용리시킨다. 입자를 포함하는 보이드 볼륨(void volume)은 용리시키고, 단백질 농도가 600 ㎍ 되도록 Centricon-10 필터(아미콘사 제조)를 이용하여 농축시킨다. 지질 입자는 300 ㎍을 토끼에 접종시켜 항체를 생성할 수 있도록 사용된다. 혈액내의 IgG 타이터는 웨스턴 블랏 분석법으로 시험하였다.
메신저 RNA (mRNA) 분리
총 RNA는 카네이션 꽃을 스테이지 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 또는 Ⅳ의 꽃잎으로부터 Chomczynski and Sachi(Anal, Biochem., 162:156-159(1987))의 방법으로 분리되었다. 즉, 15 g의 꽃잎 조직은 액체질소 속에서 냉동시키고 4 M 구아니디움 티오시아네이트, 25 mM 구연산나트륨, pH 7.0, 0.5% 사르코실과 0.1 M β-머캅토에탄올을 함유하는 완충액에서 30초동안 균질화시킨다. 150 ml의 물-포화된 페놀, 30 ml의 클로로포름 및 15 ml의 2 M NaOAc, pH 4.0을 균질화된 샘플에 첨가시켰다. 샘플은 10,000 g에서 10분간 원심분리시키고, 수용액상을 제거한 후, 150 ml의 이소프로판올을 넣어 핵산을 침전시킨다. 샘플을 5,000 g에서 10분간 원심분리시키고 펠렛을 30 ml의 4 M LiCl로 세척하고, 30 ml 클로로포름으로 추출한 후 0.2 M NaOAc, pH 5.0을 함유하는 30 ml 이소프로판올로 침전시킨다. RNA는 DEPC-처리된 물로 녹이고 -70℃에서 보관한다.
폴리A+ mRNA가 Promega로부터 구입한 폴리A+트랩 mRNA 분리 시스템을 이용하여 총 RNA로부터 분리된다. 폴리A+mRNA는 Stratagene사 제조(캘리포니아주 라 졸라) ZAP Express cDNA 합성 시스템을 이용하여 cDNA 합성에 주형으로 사용된다.
카네이션 꽃잎 cDNA 라이브러리 스크리닝
카네이션 꽃잎의 Ⅳ단계에서 분리된 mRNA를 이용하여 만들어진 cDNA 라이브러리를 약 5×106PFU/ml로 희석시키고, 리피드 입자 안티세럼으로 임뮤노스크리닝 시켰다. 양성 cDNA 클론을 ExAssist Helper Phage/SOLR 스트레인 시스템을 이용하여 회수하고, pBluescript phagemid(스트라타진사 제조)로 재순환시킨다. Ⅲ단계 카네이션 꽃잎 cDNA 라이브러리 역시32P-라벨 19 베이스 페어 프로브(5'-ACCTACTAGGTTCCGCGTC-3')(서열번호 5)를 이용하여 스크리닝시킨다. 양성 cDNA 클론은 파지(phage)로부터 분리되고, 제조자 지시사항에 따른 방법을 이용하여 pBK-CMV (Stratagene) phagemid로 재순환시킨다. 전체길이의 cDNA(1.53kb 단편)를 pBK-CMV 벡터에 삽입시킨다.
플라스미드 DNA 분리, DNA 시퀀싱
Sambrook 등의 방법(Supra)에 의한 알칼라인 라이시스 방법이 플라스미드 DNA 분리를 위해 사용되었다. 전체길이 양성 cDNA 클론은 디데옥시 시퀀싱 방법(Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467)을 이용하여 서열분석하였다. 오픈 리딩 프레임은 BLAST 검색(GenBank, Bethesda, MD)을 이용하여 편집하고 분석하였으며, 유전자의 암호화로부터 유래된 아미노산 서열을 지닌 5개의 가장 상동적인 단백질의 배열이 다수 시퀀스 배열법으로 유도된 다수 시퀀스 배열패턴인 BCM Search Launcher를 사용하여 판독되었다(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16: 10881-10890,(1987) 참조). 유래된 아미노산 서열 중에서 존재하는 기능적인 모티프를 MultiFinder에 의해 증명하였다.
융합 단백질로서 리파제의 발현
전체 길이 노화-유도 리파제를 포함하는 파지미드(phagemid) pBK-CMV를 EcoRⅠ과 XbaⅠ으로 분해하였고, 이는 1.53kb 리파제 단편을 방출하고 EcoRⅠ과 XbaⅠ 분해 융합 벡터 pMalc(뉴잉글랜드 바이오랩)으로 서브클론되었다. 노화-유도 리파제를 함유하는 pMalc 벡터, 지정된 pMLip가 대장균 BL-21(DE3)세포의 형질전환에 사용되었다.
pMLip에 의해 엔코드된 융합 단백질(노화-유도 리파제와 말토오즈 결합 단백질의 융합)이 Sambrook 등과 Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, (1987), 16.4.1-16.4.3)의 방법에 의해 분리되고 정제되었다. 간단히 설명하면 pMLip에 의해 형질전환된 대장균 BL-21 세포가 세포 1 g당 8 ㎕의 50 mM PMSF와 80 ㎕의 20 mg/ml 라이소자임을 함유하는 3 ml/g 라이세이트 완충액(50 mM 트리스, pH 8.0, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA)에 재현탁시키고, 흔들면서 실온에서 20분간 배양시킨다. 그리고 80 ㎕의 5% 데옥시콜린산과 40 유니트의 DNAse Ⅰ을 첨가하고, 세포가 완전히 용해될 때까지 실온에서 흔든다. 세포 파편은 원심분리에 의해 펠렛화 되고 8 M 요소 및 0.1 mM PMSF가 첨가된 2배 용량의 용해완충액에 의해 재현탁된다. 1시간 후에 7배 용량의 완충액(50 mM KH2PO4, 1 mM EDTA 및 50 mM NaCl, pH 7.0)을 현탁액의 중화를 위해 첨가한다. 세포현탁액의 pH는 HCl로 pH 8.0으로 조정하고 세포파편을 펠렛화 시킨다. 상등액을 4℃에서 하룻밤 20 mM 트리스 완충액 pH 8.0, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA에 대해 투석시킨다. 말토오즈 결합 단백질 리파제 융합 산물(Malip)을 아밀로오즈 컬럼(뉴잉글랜드 바이오랩에서 이용가능)을 이용하여 정제시킨다. 융합 단백질을 포함하는 획분을 융합 산물로부터 리파제를 분리하기 위해 프로테아제 팩터 Xa(1 ㎍/100 ㎍ 융합 단백질)을 사용하여 분열시켰다. 융합 단백질과 분열된 리파제 모두를 SDS PAGE 전기 영동법 및 웨스턴 블랏법에 의해 분석하였다. pMalc에 의해 엔코드된 말토오즈 결합 단백질을 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 3에 나타난 바와 같다.
카네이션 RNA의 노던 블랏 하이브리다이제이션
단계 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ의 꽃으로부터 분리된 10 ㎍의 총 RNA를 1% 변성 포름알데하이드 아가로즈 겔상에서 분리하고 나일론 막 위에 고정화시켰다. 베링거사의 랜덤 프라이머 키트를 이용하여32P-dCTP로 라벨된 1.53kb EcoRⅠ-XbaⅠ 리파제 단편을 필터(7 ×107cpm)를 프로브 하는데 사용하였다. 필터는 실온에서 한번 1x SSC, 0.1% SDS로 세척하고 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 세 번 세척하였다. 필터는 건조시키고 -70℃에서 하룻밤 X-레이 필름에 노출시켰다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
게놈 DNA 분리 및 서던 블랏 하이브리다이제이션
싱싱하게 자른 카네이션 꽃잎을 액체 질소하에서 냉동시키고, 분말화한 후 게놈 DNA를 분리하기 위해 추출 완충액(0.1 M 트리스, pH 8.2, 50 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 2% SDS 및 0.1 mg/ml 프로테이나제 K)으로 균질화(2 ml/g)시켰다. 균질화물을 37℃에서 10분간 배양시키고, 페놀-클로로포름-이소아밀알코올(25:24:1)로 추출하였다. DNA는 NaOAc와 이소프로판올로 침전되었다. DNA 펠렛은 1 ×TE, pH 8.0 에 용해되었고, 페놀로 재추출하였으며, 1 ×TE, pH 8.0으로 재침전 및 재현탁시켰다.
게놈 DNA는 각각의 제한 엔도뉴클레아제(Bam HⅠ, XhoⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ 및 SalⅠ)들로 분해하였고, 분해된 DNA는 1% 아가로즈 겔 위에 분별하였다. 분리된 DNA를 나일론 막에 블랏시키고32P-dCTP가 라벨된 1.53kb 리파제 단편을 이용하여 하이브리다이제이션을 수행하였다. 하이브리다이제이션과 세척은 매우 가혹한 조건(68℃)(6XSSC, 2X Denhardt's 시약, 0.1% SDS) 뿐만 아니라 가혹하지 않은 조건(42℃)(6XSSC, 5X Denhardt's 시약, 0.1% SDS)에서도 하이브리다이제이션과 세척을 행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도면에 나타난 바와 같이, 리파제 cDNA 프로브는 오직 한 곳의 게놈 단편으로부터만 검출되었으며 이는 카네이션 리파제 유전자가 단일 카피 유전자임을 나타낸다.
리파제 효소 에세이
정제된 리파제 융합 단백질의 리폴리틱 아실 하이드롤라제 활성도는 외생적 기질로서 p-니트로페닐팔미테이트와 콩 인지질을 사용하여 분광학적으로 분석하였다. 대조군으로 사용된 말토오즈-결합 단백질 단독으로는 기질인 인지질로부터 리파제 활성을 검출할 수 없었다(표 2). p-니트로페닐팔미테이트를 말토오즈-결합 단백질의 기질로 사용할 때에는 리파제 반응의 예기된 산물인 적은 양의 p-니트로페놀이 p-니트로페닐팔미테이트의 상업적 제조가 가능한 최소한의 수준으로 p-니트로페놀이 검출됨을 발견하였다. 그러나 정제된 리파제 융합 단백질의 존재하에서는 인지질로부터 유리 지방산의 방출과 p-니트로페닐팔미테이트로부터 p-니트로페놀의 방출을 통해 강한 리파제 활성이 명백하여졌다(표 2).
대장균에 의해 발현되고 아밀로오즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 말토오즈-결합 단백질과 리파제 융합 단백질의 리폴리틱 아실 하이드롤라제 활성도를 분광학적으로 측정한다. p-니트로페닐팔미테이트와 콩 인지질 등의 두 개의 기질이 사용되었다. 활성도는 형성된 산물의 조건으로 표현한다(p-니트로페닐팔미테이트로부터 p-니트로페놀 그리고 콩 인지질로부터 유리 지방산). n을 세 번 반복한 경우 평균 ±SE를 나타내었다.
단백질 종류 산물
pNPP p-니트로페놀(nmol/mg/min) 유리 지방산(nmol/mg protein/min)
말토오즈-결합 단백질 0.71 ±0.02 ND
리파제 융합단백질 12.01 ±1.81 46.75 ±1.24
* ND : 검출되지 않음
다른 실험에서, 리파제 융합 단백질의 효소 활성도를 기질로부터 방출된 유리 지방산의 정량과 확인을 가능하게 하는 기술인 가스 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 트리리놀레인, 콩 인지질 및 디리놀레일포스파티딜콜린이 기질로 사용되었고, 가스 크로마토그래피에 의해 분석되기 전에 박막 크로마토그래피에 의해 디에스테르화된 지방산이 정제되었다. 스펙트로포토메트릭 에세이(표 2)에 상응하여 말토오즈-결합 단백질 단독 또는 콩 인지질 또는 디리놀레일포스파티딜콜린 등에 의해서도 리파제 활성은 측정되지 않았다. 이는 이들 기질이 실질적으로 디에스테르화 지방산이 존재하지 않는다는 것이다(표 3). 그러나 리파제 융합 단백질을 효소 소스로 사용했을 때, 팔미틱, 스테아릭 및 리놀레익산은 콩 인지질 추출물로부터 디에스테르화 되었고, 리놀레익산은 디리놀레일포스파티딜콜린으로부터 디에스테르화되었다(표 3). 인지질 기질에 대조적으로 검출할 수 있는 수준의 유리 리놀레익산이 트리리놀레인에 존재하였으나, 유리 리놀레익산의 수준은 리파제 융합 단백질의 존재하에서 상당히 증가하였으며 이는 리파제가 트리아실글리세롤로부터 지방산을 디에스테르화시킬 수 있음을 나타낸다(표 3).
E. coli에서 발현되고 아밀로오즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 말토오즈-결합 단백질과 리파제 융합 단백질의 리폴리틱 아실 하이드롤라제 활성도를 가스 크로마토그래피로 측정한다.
리파제 기질 융합 단백질 말토오즈-결합 단백질
트리리놀레인2 리놀레익산(18:2) 15.9 ±0.75 33.4 ±1.58
콩 인지질3 팔미틱산(16:0) ND4 4.80
스테아릭산(18:0) ND 9.68
리놀레익산(18:2) ND 5.80
디리놀레일포스파티딜콜린 리놀레익산(18:2) ND 20.0
산물 (㎍/mg 단백질)1부호설명 :
1. 반응은 두시간 동안 진행하도록 하며 이 기간을 넘지 않도록 한다.
2. 세 번 반복 시험한 평균치이다.
3. 단일실험
4. 검출할 수 없음
대장균의 리파제 cDNA 발현으로 인해 얻어진 단백질의 리파제 활성이 생체 내에서 다음 문헌들에 의해 기재된 방법으로 측정되었다(Tsuboi, et al., Infect. Immunol., 64:2936-2940(1996); Wang, et al., Biotech., 9:741-746(1995); and G. Sierra, J. Microbiol. and Serol., 23:15-22(1957)). pMal에 의해 형질전환된 E. coli BL-21 세포의 단일 콜로니와 pMLip에 의해 형질전환된 대장균 B-21의 또다른 콜로니를 K2HPO4(4.3 g/L), KH2PO4(3.4), (NH4)SO4(2.0), MgCl2(0.16), MnCl2·4H2O(0.001), FeSO4·7H2O(0.0006), CaCl2·2H2O(0.026) 및 NaMoO4·2H2O(0.002) 등이 포함된 기초 염 배지에 접종하였다. 기질로서 트윈 40(폴리옥시에틸렌솔비탄 모노팔미테이트) 또는 트윈 60(폴리옥시에틸렌솔비탄 모노스테아레이트)를 1% 농도로 첨가하였다. 37℃에서 박테리아 세포의 성장을 흔들면서 600nm 흡광도로 모니터하였다(도 5). 도 5에 나타난 바와 같이 pMLip로 형질전환된 대장균 세포는 초기 래그 단계후에는 트윈 40/트윈 60이 보강된 기초 배지에서 성장함을 알 수 있다. 그러나 pMal로 형질전환된 대장균 세포는 트윈이 보강된 배지에서 성장하지 않았다.
(실시예 2) 카네이션 노화-유도 리파제 유전자의 에틸렌 유도
단계 Ⅱ 카네이션 꽃과 카네이션 커팅을 밀봉된 챔버에서 0.5 ppm 에틸렌으로 15시간동안 처리하였다. 처치하지 않은 카네이션 꽃과 커팅으로부터 아래방법으로 꽃 및 잎으로부터 뿐만 아니라, 처치된 단계 Ⅱ의 꽃잎 및 처치된 커팅의 잎으로부터 에틸렌을 통하여 RNA가 추출되었다.
꽃 또는 잎(하나의 꽃 또는 5g 잎)을 액체 질소하에서 분말화시킨다. 분말화된 파우더는 30 ml의 구아니디움 완충액(4 M 구아니디움이소티오시아네이트, 2.5 mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-머캅토에탄올)에 혼합시킨다. 혼합액을 치즈크로스의 4단계 층을 통해 여과시키고 4℃에서 10,000 g로 30분간 원심분리시킨다. 상등액을 26,000 g에서 20시간동안 세슘클로라이드 밀도 구배 원심분리시킨다. 펠렛화된 RNA를 75% 에탄올로 세척하고, 600 ㎕의 DEPC 처리된 물로 재현탁시키고 RNA를0.75 ml의 95% 에탄올과 30 ㎕의 3 M NaOAc로 -70℃에서 침전시킨다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데하이드 아가로즈 겔 상에 분별시키고, 나일론 막에 전이시킨다. 무작위로 프라임화된32P-dCTP-라벨 전체 길이 카네이션 리파제 cDNA(서열번호 1)를 42℃에서 하룻밤 멤브레인 프로브를 위해 사용하였다. 그리고, 멤브레인을 실온에서 15분간 0.1% SDS를 포함하는 1X SSC로 한번 세척하고, 0.1% SDS를 포함하는 0.2X SSC로 65℃에서 15분간 세 번 세척한다. 멤브레인을 -70℃에서 X-레이 필름에 하룻밤 노출시킨다.
결과를 도 9에 나타내었다. 도면에 나타난 바와 같이 카네이션 리파제의 전사는 에틸렌에 의해 꽃과 잎으로부터 유도된 것이다.
(실시예 3) 카네이션 리파제 프라이머를 이용한 토마토 PCR 산물의 생성
토마토 잎으로부터 얻어진 토마토 게놈 DNA로부터 노화-유도 리파제 서열의 일부를 카네이션 노화-유도 리파제 서열로부터 제작된 한 쌍의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR 함으로써 생성하였다. 5' 프라이머는 다음 서열 5'-CTCTAGACTATGAGTGGGT (서열번호 7)을 지닌 19-머이고, 3' 프라이머는 다음 서열 CGACTGGCACAACCTCCA-3' (서열번호 8)을 지닌 18-머이다. 중합효소 연쇄 반응은 토마토의 게놈 DNA를 이용하여 다음과 같이 수행되었다.
반응 성분
게놈 DNA 100 ng
dNTP(각각 10 mM) 1 ㎕
MgCl2(5 mM)+10x 완충액 5 ㎕
프라이머 1 및 2(각각 20 μM) 0.5 ㎕
Taq DNA 폴리머라제 1.25 U
반응용량 50 ㎕
반응 계수
94℃ 3분, 94℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 2분(45 사이클), 72℃ 15분
PCR에 의해 얻어진 토마토 서열 일부는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)을 가지며, 이로 인해 유추된 아미노산 서열을 도 10에 나타내었다. 서열일부는 인트론(도 10의 소문자)을 단백질 코딩서열 사이에 포함하고 있었다. 토마토 서열은 보존된 리파제 콘센서스 서열인 ITFTGHSLGA(서열번호 3)을 포함하고 있었다.
토마토 서열은 카네이션 노화-유도 리파제 유전자와 53.4%의 일치를 나타내었고, 아라비돕시스(Arabidopsis) 리파제와 43.5% 일치를 나타내었다. 아라비돕시스 리파제는 카네이션 서열과 44.3% 서열일치를 나타내었다.
(실시예 4) 토마토 식물 내의 셀 멤브레인 인테그리티의 냉각 효과
토마토 식물을 7℃ 내지 8℃에서 48시간동안 냉장시키고 24시간동안 실온으로 복귀시켰다. 잎을 냉장시킨 효과를 전해질 누출( μMhos)양을 통해 측정하였다.
특히, 1 g의 잎 조직을 잘라 50 ml 튜브에 넣고, 증류수로 즉시 세척한 후, 40 ml의 이온 제거수를 가한다. 튜브를 밀봉하고 24시간동안 실온에서 회전시킨다. 전해질 누출을 반영하는 전기전도도(μMho)의 판독을 6시간과 24시간 간격으로 대조군과 냉각시켰던 잎 조직간에 수행하였다. 도 11로부터 멤브레인 손상을 나타내는 전해질 누출이 냉장시켜 상처받은 잎조직 내에서 다시 복귀하는 동안에 나타남이 명백하였다.
냉장시킨 토마토 잎으로부터 얻어진 RNA로부터 노던 블랏 분석
15 g의 냉장시키지 않은 토마토 식물(대조군)의 잎으로부터 총 RNA를 분리하였고, 냉각 후 다시 실온으로 6시간 및 24시간 복귀시킨 냉각 토마토 식물로부터도 총 RNA를 분리하였다. RNA 추출은 실시예 3에 기재된 방법으로 수행하였다. 각각의 샘플로부터 10 ㎍의 RNA가 1.2% 변성 포름알데하이드 겔상에서 분리되었고 나일론 멤브레인에 전이되었다. 멤브레인은32P-dCTP-라벨 프로브(서열번호 3)에 의해 추적되었으며 실시예 3에서 기재된 동일한 조건에서 세척되었다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
오토라디오그래프(도 12b)로부터 토마토 리파제 유전자의 발현은 냉장에 의해 유도되고 유전자 유도의 패턴은 냉장 상처받은 잎의 전해질 유출의 증가와 상관관계가 있었다(도 11).

Claims (47)

  1. 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 DNA 분자이거나, 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 관능 유도체임을 특징으로 하는 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 분리된 DNA 분자
  2. 제 1항에 있어서, DNA 분자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 분리된 DNA 분자
  3. 제 1항에 있어서, 분리된 DNA 분자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 분리된 DNA 분자
  4. 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 뉴클레오타이드서열 또는 노화-유도 리파제의 관능적 유도체 서열에 의해 엔코드된 분리된 노화-유도 리파제
  5. 제 4항에 있어서, 리파제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 노화-유도 리파제
  6. (a) (1) 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자인 DNA 분자의 적어도 한 가닥의 한 부분, 또는 (2) 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 형질전환된 식물 세포에서 발현할 수 있도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함함을 특징으로 하는 식물 세포 형질전환용 벡터
  7. 제 6항에 있어서, 조절 서열은 프로모터와 전사 터미네이션 영역을 지님을 특징으로 하는 벡터
  8. 제 6항에 있어서, 조절 서열은 구성적 프로모터를 지님을 특징으로 하는 벡터
  9. 제 6항에 있어서, 조절 서열은 식물 조직-특이 프로모터를 지님을 특징으로 하는 벡터
  10. 제 6항에 있어서, 조절 서열은 노화-유도 식물 프로모터를 지님을 특징으로 하는 벡터
  11. 제 6항에 있어서, 조절 서열은 바이러스 프로모터를 지님을 특징으로 하는 벡터
  12. 제 11항에 있어서, 조절서열은 구성적 프로모터를 지님을 특징으로 하는 벡터
  13. 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 식물 노화-유도 리파제 유전자 RNA 트랜스크립트의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적인 RNA 분자를 엔코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  14. 제 13항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 약 6개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  15. 제 13항에 있어서, 식물 유전자의 코딩 영역은 뉴클레오타이드 서열번호 1을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  16. 제 13항에 있어서, 식물 유전자는 카네이션 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  17. 제 13항에 있어서, 식물 유전자는 토마토 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  18. 제 13항에 있어서, 식물 유전자는 그린 빈(green bean) 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  19. 제 13항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 트랜스크립트의 5'-비코딩 영역의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
  20. (a) 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자; 및
    (b) DNA 분자가 형질전환된 식물 세포에서 발현할 수 있도록 DNA 분자에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함함을 특징으로 하는 벡터
  21. 제 20항에 따른 벡터로 형질전환된 박테리아 세포
  22. 제 6항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포
  23. 제 6항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포로부터 발생한 식물과 그의 자손
  24. 제 23항에 따른 식물, 식물 부분 또는 식물 자손
  25. (1) (A) (ⅰ) 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도 리파제 유전자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및 (B) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 식물의 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및
    (2) 상기 노화-유도 리파제 유전자의 발현이 억제됨으로써 상기 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 상기 RNA 서열에 결합함으로써 상기 식물을 성장시킴을 포함함을 특징으로 하는 식물에서 내생적 노화-유도 리파제의 발현을 억제하는 방법
  26. 제 25항에 있어서, 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 실질적으로 상보적인 DNA 부분 또는 RNA 부분은 5'-비코딩 서열을 지님을 특징으로 하는 방법
  27. 제 25항에 있어서, 상기 억제는 식물의 변경된 노화를 가져옴을 특징으로 하는 방법
  28. 제 25항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 환경 스트레스-유도 노화에 대한 증가된 저항성을 가져옴을 특징으로 하는 방법
  29. 제 25항에 있어서, 조절 서열은 식물에서 활성인 구성적 프로모터를 지님을 특징으로 하는 방법
  30. 제 25항에 있어서, 조절 서열은 구성적 프로모터를 지님을 특징으로 하는 방법
  31. 제 25항에 있어서, 조절 서열은 식물에서 활성인 조직 특이 프로모터를 지님을 특징으로 하는 방법
  32. 제 25항에 있어서, 조절 서열은 식물에서 활성인 노화-유도 프로모터를 지님을 특징으로 하는 방법
  33. 제 25항에 있어서, 상기 식물은 열매 맺는 식물, 꽃피는 식물과 야채로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  34. 제 25항에 있어서, 식물은 토마토임을 특징으로 하는 방법
  35. 제 25항에 있어서, 식물은 카네이션임을 특징으로 하는 방법
  36. (1) (A) 낮은 스트린전시 조건하에서 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 DNA분자이거나, 서열번호 1과 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 관능 유도체인 외생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 분리된 DNA 분자; 및 (B) 엔코드된 외생적 노화-유도 리파제가 발현되도록 DNA 분자에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 적어도 하나의 식물 세포 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및
    (2) 상기 DNA 분자가 과-발현되고 내생적 노화-유도 리파제 유전자가 외생적 노화-유도 리파제에 의해 억제됨으로써 상기 식물을 성장시킴을 포함함을 특징으로 하는 식물 세포에서 내생적 노화-유도 리파제 유전자의 발현을 억제하는 방법
  37. 제 36항에 있어서, 조절 서열은 구성적 프로모터를 지님을 특징으로 하는 방법
  38. (1) (A) (ⅰ) 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도 리파제 유전자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및 (B) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 식물의 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및
    (2) 상기 노화-유도 리파제 유전자의 발현이 억제됨으로써 상기 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 상기 RNA 서열에 결합함으로써 상기 식물을 성장시킴을 포함함을 특징으로 하는 식물에서 연령-관련 노화와 환경 스트레스-관련 노화를 변경하는 방법
  39. 제 6항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환된 식물 세포
  40. 제 20항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환된 식물 세포
  41. 프로카리오틱 호스트(prokaryotic host)에서 기능적인 복제 시스템과 제 13항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드
  42. 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 기능적인 복제 시스템과 제 13항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드
  43. 노화-유도 리파제가 억제되거나 감소되어 발현되는, 제 6항에 따른 벡터를 지니는 세포로부터 얻어진 식물과 그의 자손
  44. (1) (A) (ⅰ) 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 내생적 노화-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도 리파제 유전자에 의해 엔코드된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및 (B) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 식물의 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및
    (2) 상기 노화-유도 리파제 유전자의 발현이 억제됨으로써 상기 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 상기 RNA 서열에 결합함으로써 상기 식물을 성장시킴으로써 생산되고, 노화-유도 리파제가 억제되거나 감소되어 발현되는 세포로부터 얻어진 식물과 그의 자손
  45. 제 44항에 있어서, 식물은 토마토임을 특징으로 하는 식물과 자손
  46. 제 44항에 있어서, 식물은 카네이션임을 특징으로 하는 식물과 자손
  47. (1) (A) (ⅰ) 내생적 숙성-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자 한 가닥의 적어도 한 부분, 이때 내생적 숙성-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA는 서열번호 1과 하이브리다이즈, 또는 (ⅱ) 내생적 숙성-유도 리파제를 엔코딩하는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 서열의 적어도 한 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드; 및 (B) 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 식물의 게놈으로 인테그레이팅(integrating); 및
    (2) 상기 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하고 상기 숙성-유도 리파제 유전자의 발현이 억제됨으로써 상기 식물을 성장시킴을 포함함을 특징으로 하는 씨 숙성 억제 방법
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