KR20030010744A

KR20030010744A - 식물 리파제 인코딩 디엔에이, 형질전환 식물 및 식물내의 노화 조절방법

Info

Publication number: KR20030010744A
Application number: KR1020027017302A
Authority: KR
Inventors: 죤 이 탐슨; 찬-웨이 왕; 카탈린 후닥; 유웬 홍
Original assignee: 세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date: 2000-06-19
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2003-02-05
Also published as: IL197268A0; IL197268A

Abstract

식물 내에서의 노화 발현의 조절은 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 유전자 또는 유전자 단편을 안티센스 방향으로 식물 게놈 내로 통합시킴으로서 달성된다. 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 카네이션 및 아라비돕시스 유전자가 확인되고, 상기 뉴클레오타이드가 형질전환 식물 내에서 노화를 변형시키는데 이용된다.

Description

식물 리파제 인코딩 디엔에이, 형질전환 식물 및 식물 내의 노화 조절방법{DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants}

노화는 식물의 수명에 있어서 생물적 발달의 말기 현상이다. 이는 죽음의 조짐이고, 전체 식물, 기관, 꽃과 열매, 조직 및 개체 세포를 포함한 생물적 조직화의 다양한 레벨에서 발생한다.

세포막 퇴화는 노화의 초기의 기본적인 형상이다. 특히 지질막에서 지질의 대사는 세포 노화의 몇가지 생화학적 징후 중의 하나이다. 예를 들어 장미 화판은 막 기능의 손실에 의해 동반되는 노화의 진행으로서 아크릴 가수분해효소 활성의 증가를 경험한다(Borochov et al., Plant Physiol., 1982, 69, 296-299). 세포막 퇴화는 증가된 투과성, 이온 기울기의 손실 및 이온 펌프와 같은 중요한 막단백질의 감소된 기능을 발생시키는 노화의 초기의 특성화된 형상이다(Brown et al., Plant Physiol. : A Trestise, Vol X. Academic Press, 1991, pp.227-275). 막의 구조적 및 기능적 보전에서의 이러한 많은 감소는 리파제-매개 인지질(phospholipid) 대사에 의한 것일 수 있다. 지질 인산의 손실은 노화 꽃 화탁, 잎, 자엽 및 숙성 열매에 대해 논의되어 왔고, 이는 세포 기능의 손상을 이끄는 노화 진행에 있어서 이중막의 분자적 조직화의 주요한 변화를 발생시키는 것으로 보인다. 특히 많은 노화 식물 조직의 연구가 이중막 내에서 지질 대사산물의 축적에 기여하는 것으로 보이는 막 내의 지질면 분리에 대한 증거로 제공되었다(McKersie and Thompson, 1979, Biochem. Biophys. Acta, 508:197-212; Chia et al., 1981, Plant Physiol., 67:415-420). 노화 조직 내의 많은 지질 대사가 유전자 발현에 있어서 노화-특이적 변화를 통화 이루어진다는 증거가 증명되고 있다(Buchanan-Wollaston, V., J. Exp. Bot., 1997, 307:181-199).

노화의 착수는 내부적 및 외부적 모두의 다른 인자에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어 에틸렌은 많은 식물에서 종자 발아, 묘목 발달, 열매 성숙 및 꽃 노화와 같은 다양한 식물 과정에 중요한 역할을 한다. 또한 식물 내에서의 에틸렌 생성은 기계적인 상처, 화학물질, 스트레스(온도 및 수분량 변화에 의해 제공된) 및 질병에 의해 유도된 외상(trauma)과 관련될 수 있다. 에틸렌은 많은 식물 내에서 잎 노화의 조절에 관련되었으나 형질전환 식물 및 에틸렌 반응 돌연변이는 에틸렌이 노화에 효과를 나타냈더라도 그 과정의 필수적인 조절자가 아니라는 것을 나타내었다. 많은 식물에서 에틸렌은 열매 성숙 또는 노화에 어떤 역할도 하지 않는 것으로 보인다. 예를 들어 딸기와 같은 비-액년기성(climacteric) 식물 열매의 성숙의 경우, 옥잠화(day lily)와 같은 일부 꽃의 노화의 경우, 아라비돕시스(Arabidopsis)와 같은 일부 식물의 잎 노화의 경우, 특히 단자엽의 경우 에틸렌 시그날링에 대한 요구가 전혀 없다(Smart, C.M., 1994, New Phytology, 126:419-448; Valpuesta et al., 1995, Plant Mol. Biol., 28:575-582).

노화의 조급한 개시를 유도하는 외부 인자는 병원균 공격뿐만 아니라 온도, 가뭄, 부족한 빛 또는 영양 공급과 같은 환경적 스트레스를 포함한다. 자연적인(연령-관련된) 노화의 경우와 같이 환경적 스트레스-유도 노화는 세포성 막 보전의 손실에 의해 특성화된다. 특히 환경적 스트레스로의 노출은 막 손상을 반영하는전해질 누출(Sharom et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308; Wright and Simon, 1973, J. Exp. Botany, 24:400-411; Wright, M., 1974, Planta, 120:63-69; and Eze et al., 1986, Physiologia Plantarum, 68:323-328), 막 인지질 레벨의 감소(Wright, M., 1974, Planta, 120:63-69) 및 지질면 변화(Sharom et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308)를 유도하고, 이들 모두는 리파제 활동에 기인할 수 있다. 또한 환경적 스트레스에 노출된 식물 조직은 통상적으로 스트레스 에틸렌으로 알려진 에틸렌을 생산한다. 상기에 주지된 바와 같이 에틸렌은 일부 식물에서 노화를 유발한다고 알려져 있다. 또한 누출을 이끄는 막 퇴화는 종자 숙성의 종자적 형상이고, 막 인지질로부터 지방산의 탈에스테르화(deesterification) 또한 반영하는 증거이다(McKersie, B.D., Senarata, T., Walker, M.A., Kendal, E.J and Hetherignton, P.R. In: Senescene and Aging in Plants, Ed. L.D. Nooden and A.C. Leoopold, Academic Press, 1988. pp. 441-464).

현재 내부적 또는 외부적, 즉 환경적 스트레스에 의해 유발된 노화 착수 조절가능한 널리 적용할 수 있는 방법이 없다. 현재 노화를 조절하고, 열매, 꽃 및 채소와 같은 신선하고 썩기 쉬운 식물의 저장-수명을 증가시키는 과학기술은 에틸렌 생합성을 감소시키는 것에 주로 영향을 받는다. 예를 들어 미국 특허 제5,824,875호는 안티센스 방향으로 3개의 1-아미노-시클로프로팥(cyclopropane)-1-카르복실화물(ACC) 합성효소 유전자 중 하나의 발현으로부터 초래된 에틸렌 레벨의 감소에 기인한 연장된 저장-수명을 나타내는 형질전환 제라늄(geranium) 식물을개시한다. 따라서 이러한 과학기술은 에틸렌-민감성인 식물에만 제한적인 범위로 적용가능하다.

또한 일부 열매의 저장-수명은 에틸렌 생합성을 감소시킴으로서 연장되고, 성숙이 더 느리게 발생하도록 한다. 이러한 열매의 노화가 성숙 후에 유도되기 때문에 저장-수명에 있어서의 감소된 에틸렌 생합성의 효과는 간접적이다. 열매 성숙을 지연시키는데 이용되는 또다른 접근은 성숙의 초기 단계 동안 합성되는 세포벽 연화(softening) 효소인 폴리갈락투로나제(polygalacturonase)의 세포적 레벨을 변화시키는 것이다. 이러한 접근은 에틸렌 생합성을 조절하는 것이 유사하고, 이러한 점에서 이는 노화에 간접적으로만 영향을 미치고, 또한 좁은 범위의 식물에만 적용가능하다.

따라서 다양한 식물에 적용가능한 식물내 노화 조절방법이 필요하다. 따라서 에틸렌 민감도에 관계없이 모든 타입의 식물에 적용가능한 노화 조절 기술을 발달시키는데 관심이 있다.

발명의 요약

본 발명은 카테이션 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 전체 길이 cDNA 클론 및 아라비돕시스 탈리아나 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 전체 길이 cDNA 클론의 발견 및 클로닝에 기초를 둔다. 노화-유도된 리파제 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열이 여기에 개시되어 있다. 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 유사하게 조절되는 일부 식물 내의 상응하는 유전자 또는 RNA 전사체를 검출하는 이형 프로브로서 성공적으로 이용되었다.

본 발명은 연령-관련된 노화 또는 환경적 스트레스-유도된 노화의 노화 착수를 조절하기 위해 식물의 유전적 변형을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 노화-유도된 리파제 뉴클레오타이드 서열, 그의 단편 또는 이러한 단편의 조합은 역방향으로 식물 세포 내로 도입되어 내생적 노화-유도된 리파제 유전자의 발현을 억제하여 내생적 노화-유도된 리파제의 레벨을 감소시키고, 형질전환된 식물 내에서 노화를 변화시킨다.

본 발명의 방법을 이용하여 형질전환 식물이 생성되고, 생장 및 발달이 모니터되었다. 노화-유도된 리파제의 레벨의 감소에 기인한 식물 생장, 개화에 있어서의 연장된 수명 또는 저장-수명, 감소된 열매 부패, 감소된 종자 숙성 및/또는 감소된 잎의 황화(yellowing)를 나타내는 식물 또는 식물의 분리된 부분(즉, 절단, 꽃, 야채, 열매, 종자 또는 잎)이 선적 및 보관 동안 감소된 잎 황화, 감소된 화탁 이탈, 감소된 열매 부패를 포함한 증가된 성질을 지닌 원하는 생성물로서 선택된다. 이러한 우수한 식물은 번식된다. 환경적 스트레스에 대한 증가된 저항성,즉 유사하게 낮은 온도(쌀쌀한), 가뭄, 감염 등에 대한 감소된 민감성을 나타내는 식물이 우수한 생성물로서 선택된다.

하나의 관점에서 본 발명은 서열번호: 1과 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 분리된 DNA 분자 또는 서열번호: 1과 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 기능적 유도체를 나타낸다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 분리된 DNA 분자는 서열번호: 1의 뉴클레오타이드 서열, 즉 서열번호: 1에 대한 100% 상보성(서열 동일성)을 지닌다. 본 발명의 이러한 관점의 또다른 실시태양에서 분리된 DNA 분자는 서열번호: 4의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

또한 본 발명은 서열번호: 18과 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 분리된 DNA 분자 또는 서열번호: 18과 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 기능적 유도체를 나타낸다. 본 발명의 이러한 관점의 실시태양에서 분리된 DNA 분자는 서열번호: 18의 뉴클레오타이드 서열, 즉 서열번호: 1에 대한 100% 상보성(서열 동일성)을 지닌다. 본 발명의 이러한 관점의 또다른 실시태양에서 분리된 DNA 분자는 서열번호: 19의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 또다른 실시태양에서 상기 기술된 바와 같이 DNA 분자에 의해 인코드된 분리된 단백질 또는 그의 기능적 유도체가 제공된다. 바람직한 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지니고, 또는 그의 기능적 유도체이다.

또한 가 RNA 전사체와 하이브리다이즈하여 내생적 노화-유도된 리파제의 발현이 변화됨을 특징으로 하는 상기에 기술된 DNA 분자의 RNA 전사체의 적어도 일부분에 상보적인 를 인코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이일 수 있고, 바람직하게는 6∼100 뉴클레오타이드를 지닌다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩 DNA 분자의 하나의 스트랜드(strand)의 상응하는 부분에 대해 실질적으로 상보적이고, 또는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분에 대해 실질적으로 상보적이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두 또는 서열번호: 1에 의해 인코드된 RNA 전사체의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 또다른 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두에 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 5' 비-코딩 부분 또는 3' 비-코딩 부분의 100∼200 뉴클레오타이드의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 또다른 실시태양에서 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 4 또는 서열번호: 4에 의해 인코드된 RNA 전사체의 하나의 스트랜드의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다.

본 발명은

(a) (1) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두에 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (2) 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(b) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 형질전화된 식물 세포 내에서 발현되도록 하는 조절 서열로 구성된 식물 세포의 형질전환을 위한 벡터를 나타낸다.

조절 서열은 형질전환된 식물 세포 내에서 기능적인 프로모터를 포함하고, 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 선택적으로 조절 서열은 폴리아데닐레이션 시그널을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 벡터로 형질전환된 식물 세포, 이러한 세포로부터 생성된 묘목 또는 식물 성체 또는 이러한 묘목 또는 식물의 식물 부분을 제공한다.

본 발명의 방법은 :

(1) 상기 기술된 벡터로 식물을 형질전환하고 ;

(2) 식물을 적어도 묘목 단계로 생장시키게 하고 ;

(3) 변화된 노화-유도된 리파제 활성 및/또는 변화된 노화 및/또는 변화된 환경적 스트레스-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화에 대한 형질전환된 식물 또는 묘목의 에세이하고 ; 및

(4) 비-형질전환된 식물과 비교하여 변화된 노화-유도된 리파제 활성 및/또는 변화된 노화 및/또는 변화된 환경적 스트레스-유도된 노화 또는 에틸렌-유도된 노화를 지닌 식물을 선택하고 생장시키는 것으로 구성된

변형되지 않은 식물과 비교하여 노화-유도된 리파제의 감소된 레벨을 지닌 식물을 생성하는 방법을 더욱 나타낸다.

상기와 같이 생성된 식물 또는 자손, 하이브리드, 클론 또는 식물 부분은 바람직하게는 감소된 노화-유도된 리파제 발현 및 지연된 노화 및/또는 지연된 스트레스-유도 노화 또는 에틸렌-유도 노화를 나타낸다.

본 발명은 :

(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도된 리파제 유전자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 발현되게 하는 조절 서열로 구성된

벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고, 전사체가 상기 내생적 RNA에 결합하여 상기 노화-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

식물 세포 내에서의 내생적 노화-유도된 리파제의 발현을 억제하는 방법을 나타낸다.

본 출원은 1998년 6월 26일 제출된 미국 특허출원 제09/105,812호의 부분계속출원(CIP)인 미국 특허출원 제09/250,280호의 부분계속출원인 미국 특허출원 제09/597,774호의 부분계속출원이고, 여기에 참조문헌으로 통합되어 있다.

본 발명은 식물 폴리펩티드를 인코드하고, 노화-유도된 발현을 나타내는 폴리뉴클레오타이드, 안티센스 방향으로 폴리뉴클레오타이드를 함유한 형질전환 식물 및 식물 내에서 노화를 조절하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게 본 발명은 노화 개시에 의해 유도된 식물 리파제(lipase) 유전자 및 식물 내에서 노화를 조절하기 위한 리파제 유전자의 이용에 관한 것이다.

도 1은 카네이션 꽃 cDNA 라이브러리(library)로부터 수득된 노화-유도된 리파제 cDNA 클론(서열번호: 1)에 의해 인코드된 유도된 아미노산 서열(서열번호: 2)를 나타낸다. 아미노산 서열 내의 컨센서스 모티프(consensus motif)는 하기와 같다 : 단일 밑줄은 아미드화 사이트; 점선 밑줄은 단백질 키나제 C 인산화 사이트; 이중 밑줄은 N-미리스토일레이션(myristoylation) 사이트; 실선 상자는 cAMP 인산화 사이트; 색칠된 상자는 카세인 키나제 Ⅱ 인산화 사이트; 빗금친 상자는 리파제 패밀리의 컨센서스 서열; 및 점선 상자는 N-글리코실레이션 사이트이다.

도 2는 리파제-유사 단백질의 일부 서열과 일직선상의 유도된 전체 길이 카네이션 화탁 노화-유도된 리파제 아미노산 서열(서열번호: 2)을 나타낸다. 칼립(carlip), 카네이션 화탁 노화-유도된 리파제의 전체 길이 서열(서열번호: 11); 알립(arlip), 아라비돕시스 탈리아나(유전자은행 접근번호 AL021710)로부터의 리파제-유사 단백질의 일부 서열(서열번호: 12); 이포립(ipolip), 이포미아(Ipomea)(유전자은행 접근번호 U55867)로부터의 리파제-유사 서열의 일부 서열(서열번호: 13); 알리피(arlipi), 아라비돕시스 탈리아나(유전자은행 접근번호 U93215)로부터의 리파제-유사 단백질의 일부 서열(서열번호: 14). 이들 서열의 3 또는 4개 중 동일한 아미노산이 박스쳐졌다.

도 3은E. coli에서 발현된 카네이션 리파제 cDNA로부터 수득된 융합 단백질 발현 생성물의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 나타낸 것이다. 웨스턴 블럿은 노화-유도된 리파제 단백질의 항체로 프로브되었다. 레인 1, 말토스 결합 단백질; 레인 2, 단백질분해성(인자 Xa) 분열 사이트를 통해 말토스 결합 단백질 cDNA에 융합된 카네이션 리파제로 구성된 융합 단백질; 레인 3, 인자 Xa에 의해 자유 리파제 단백질(50.2 kDa) 및 자유 말토스-결합 단백질로 부분적으로 분열된 융합 단백질.

도 4는 다른 발달 단계에서 카네이션 꽃 화탁으로부터 분리된 RNA의 노던 블럿(Northern blot) 분석을 나타낸 것이다. 도 4a는 총 RNA의 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색된 겔이다. 각각의 레인은 10㎍ RNA를 포함한다. 도 4b는³²P-dCTP-표지된 전체 길이 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA로 프로브된 노던 블럿의 방사능 사진이다.

도 5는 지방분해성 아크릴 가수분해효소의 인 시츄(in situ) 실연, 즉E. coli내의 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA의 과발현에 의해 수득된 단백질 생성물의 리파제 활성이다. mal, 기본 염 배지 내에 말토스 결합 단백질만을 함유한E. coli세포; mLip, 기본 염 배지 내에 말토스 결합 단백질과 융합된 카네이션 노화-유도된 리파제로 구성된 융합 단백질을 함유한E. coli세포; 40 mal/40 mLip, Tween 40으로 보충된 기본 염 배지 내에 말토스 결합 단백질 단독[mal] 또는 리파제-말토스 결합 단백질 융합 생성물[mLip]을 함유한E. coli세포; 60 mal/60 mLip, Tween 60으로 보충된 기본 염 배지 내에 말토스 결합 단백질 단독[mal] 또는 리파제-말토스 결합 단백질 융합 생성물[mLip]을 함유한E. coli세포.

도 6a는 카네이션 노화-유도된 리파제의 오픈 리딩 프레임의 제한효소 지도를 나타낸 것이다. 숫자는 오픈 리딩 프레임 내의 뉴클레오타이드를 나타낸다.

도 6b는 다양한 제한효소로 분해되고, 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA로 프로브된 카네이션 게놈 DNA의 서던 블럿(Southern blot) 분석이다.

도 7은 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 1)이다. 밑줄쳐 있는 것은 노화-유도된 리파제 cDNA의 비-코딩 서열; 밑줄쳐 있지 않은 것은 오픈 리딩 프레임이다.

도 8은 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA의 아미노산 서열(서열번호: 2)이다.

도 9a는 15시간 동안 0.5ppm 에틸렌에 노출된 단계 Ⅱ 화탁 내의 카네이션 리파제의 발현을 나타내는 노던 블럿 분석이다. 도 9a는 각 레인이 카네이션 RNA의 일정한 양으로 로드되었음을 나타내는 에티듐 브로마이드 염색된 겔이다(화탁: 레인 1 및 2; 잎: 레인 3 및 4; +, 에틸렌 처리됨; -, 비처리됨). 도 9b는 전체 길이 카네이션 화탁 노화-유도된 리파제 cDNA로 표지도어 프로브된 도 9a의 겔의 노던 블럿의 방사능 사진이다.

도 10은 토마토 잎 게놈 노화-유도된 리파제의 일부 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 6)이고, 상응하는 추론된 아미노산 서열(서열번호: 17)이다. 보존된 리파제 컨센서스 모티프는 색칠되어 있고; 게놈 단편을 생성하는데 이용되는 프라이머의 서열은 각각 밑줄 쳐있다.

도 11은 막 누출 상의 칠링(chilling) 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 토마토 식물은 48시간 동안 8℃에서 칠드되었고, 그후 상온으로 다시 데워졌다. 잎 디스크(disk)로부터의 투석물 누출(μMhos)이 칠드되지 않은 대조군 식물 및 6시간 및 24시간 동안 칠드된 식물에 대해 측정되었다.

도 12는 8℃에서 48시간 동안 칠드되고, 24시간 동안 대기 온도로 다시 데워진 식물로부터 분리된 토마토 잎 RNA의 노던 블럿 분석이다. 도 12a는 총 잎 RNA의 에티듐 브로마이드 염색된 겔이다. 도 12b는³²P-dCTP-표지된 전체 길이 카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA로 프로브된 노던 블럿의 방사능 사진이다.

도 13은 카네이션 노화-유도된 리파제와 64 아미노산 구역에 걸쳐 55.5% 동일한 아라비돕시스 EST(유전자 접근번호 N38227)의 일부 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 15) 및 상응하는 추론된 아미노산 서열(서열번호: 16)이다. 보존된 리파제컨센서스 모티프는 색칠된 것이다.

도 14는 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자의 뉴클레오타이드(서열번호: 18)(상부) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호: 19)(하부)이다.

도 15는³²P-dCTP-표지된 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제로 프로브된 다양한 단계에서의 아라비돕시스 식물 잎으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다(레인 1, 2주령 식물; 레인 2, 3주령 식물; 레인 3, 4주령 식물; 레인 4, 5주령 식물; 레인 5, 6주령 식물). 방사능사진은 상부에 있고(15a), 에티듐 브로마이드 염색된 겔은 하부에 있다(15b).

도 16은 50μM 에테폰(ethephon)(에틸렌의 원료)로 처리되고,³²P-dCTP-표지된 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제로 프로브된 3주령 아라비돕시스 식물의 잎으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 방사능사진은 상부에 있고(16a), 에티듐 브로마이드 염색된 겔은 하부에 있다(16b).

도 17은 4.6주령 아라비돕시스 야생형 식물(좌측) 및 형질전환 식물 내에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 형질전환 식물(우측)의 사진이다.

도 18은 6.3주령 아라비돕시스 야생형 식물(좌측) 및 형질전환 식물 내에서 증가된 잎 크기 및 지연된 잎 노화를 나타내는 안티센스 방향으로 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 형질전환 식물(우측)의 사진이다.

도 19는 7주령 아라비돕시스 야생형 식물(좌측) 및 형질전환 식물 내에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 형질전환 식물(우측)의 사진이다.

도 20은 안티센스 방향으로 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 3개의 T₁형질전환 아라비돕시스 식물 내의 종자 산출량의 증가를 나타내는 그래프이다. 종자 산출량은 종자 부피로 표현된다. n=30에 대한 SE는 야생형 식물에 대해 나타나 있다.

도 21은 4주령 아라비돕시스 야생형 식물 및 안티센스 방향으로 전체-길이 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 상응하는 형질전환 식물의 잎으로부터 분리된 총 단백질의 웨스턴 블럿이다(레인 1 및 2는 9㎍의 단백질로 로드되었고, 레인 3 및 4는 18㎍의 단백질로 로드되었다). 블럿은 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 단백질에 대해 생성된 항체로 프로브되었다. 노화-유도된 리파제의 발현은 모든 형질전환 식물에서 감소된다.

식물 내에서 노화-유도된 리파제 유전자(들)의 발현을 변화시키기 위한 방법 및 조성이 제공된다. 식물 내에서의 노화-유도된 리파제 유전자(들)의 발현 변화는 지연된 노화의 착수 및 환경적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 초래하여 식물 저장-수명 및/또는 생장 기간을 연장시킨다.

노화-유도된 바현을 나타내는 카네이션 리파제 유전자를 인코딩하는 전체 길이 cDNA 서열은 카네이션(Dianthus caryophyllus) 꽃의 노화 화탁의 RNA로부터 제조된 cDNA로부터 분리되었다. 전체 길이 카네이션 리파제 cDNA뿐만 아니라 분리된 카테이션 꽃 리파제 cDNA 서열의 선택된 부분에 상응하는 폴리펩티드 프로브가 환경적으로 스트레스받은(칠드된) 토마토 잎뿐만 아니라 노화 카네이션 잎, 성숙 토마토 열매 및 노화 깍지콩 잎 내에서 리파제 유전자를 인코딩하는 mRNA의 존재를 결정하는데 이용되었다. 카네이션 리파제 cDNA로부터 고안된 프라이머가 주형으로 토마토 잎 게놈 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 생성물을 생성하는데 이용되었다. PCR 생성물은 보존된 리파제 켄센서스 모티프, ITFTGHSLGA(서열번호: 3)을 포함한 일부 단백질 서열을 인코드하는 오픈 리딩 프레임 일부를 함유한다. 토마토 뉴클레오타이드 서열은 카네이션 노화-유도된 리파제 서열과 53.4% 서열 동일성 및 아라비돕시스 리파제 서열과 43.5% 서열 동일성을 지닌다. 아라비돕시스 리파제 서열은 카네이션 뉴클레오타이드 서열과 44.3% 동일성을 지닌다.

본 발명의 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자는 카네이션 리파제의 근원인 세포질성 지질-단백질 입자에 대해 생성된 항체로 노화 카네이션 화탁으로부터 준비된 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝함으로서 분리되었다. 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자에 상응하는 양성 전체-길이 cDNA 클론이 수득되었고, 서열화되었다. 노화-유도된 리파제 cDNA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1에 나타나 있다. cDNA 클론은 50.2 kDa의 추산된 분자량을 지닌 447 아미노산 폴리펩티드(서열번호: 2)를 인코드한다.E. coli내의 cDNA 클론의 발현은 아크릴 가수분해효소 활성을 나타내는, 즉 발현된 단백질은 p-니트로페닐팔미테이트(nitrophenypalmitate), 인지질 및 트리아크릴글리세롤을가수분해하는 예측된 분자량의 단백질 산출한다. 발달하는 카네이션 꽃 내의 효소 발현 패턴 및 단백질의 활성에 기초하여 노화가 관련된다.

또한 본 발명의 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자는 반응 내에서 주형으로서 노화 아라비돕시스 잎 cDNA 라이브러리를 이용하여 PCR에 의해 분리되었다. 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자의 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열이 도 14내에 나타나 있다(서열번호: 14). 발달하는 식물 내의 리파제 유전자의 발현 패턴에 기초하여 노화가 관련된다.

전체 길이 카네이션 cDNA로 프로브된 카네이션 화탁 총 RNA의 노던 블럿은 노화-유도된 리파제 유전자의 발현이 자연적인 노화의 착수 바로 전에 유의적으로 유도된다는 것을 나타낸다(도 4). 또한 노던 블럿 분석은 노화-유도된 리파제 유전자가 환경적 스트레스, 즉 칠링(도 12) 및 환경적 스트레스에 반응하여 생성된다고 알려진 에틸렌(도 4 및 9)에 의해 유도됨을 논증한다. 노던 블럿 분석은 카네이션 노화-유도된 리파제 mRNA의 존재가 어린 단계 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 카네이션 화탁 보다 노화시(발달 단계 Ⅳ) 유의적으로 더 높다는 것을 나타낸다. 더욱이 에틸렌-자극된 단계 Ⅱ 꽃은 또한 더 높은 노화-유도된 리파제 유전자 발현을 나타낸다. 유사하게 칠링 온도에 노출되고, 대기 온도로 다시 데워진 식물도 또한 칠링 상처 징후(즉, 누출)의 발달과 일치한 유도된 노화-유도된 리파제 유전자의 발현을 나타낸다(도 11 및 도 12).

아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자의 발현은 유사하게 조절된다. 다양한 발단 단계에서의 아라비돕시스 식물의 잎으로부터의 총 RNA의 노던 블럿 분석은 리파데 유전자가 잎 노화의 착수와 일치하여 상향조절된다(upregulated)(도 15). 또한 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자와 유사하게 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자는 잎 노화를 유도하는 식물 호르몬인 에틸렌 처리에 의해 상향조절된다(도 16).

다양한 식물, 즉 카네이션, 깍지콩, 토마토, 아라비돕시스 및 다양한 식물 조직, 즉 잎, 열매 및 꽃 내의 유전자 발현의 전체 패턴은 본 발명의 리파제 유전자가 이들 식물 및 식물 조직 내에서의 노화 개시에 관련된다는 것을 논증한다. 따라서 식물 조직 내에서의 노화-유도된 리파제 유전자 발현을 실질적으로 억제하거나 변화시킴으로서 노화, 퇴화 및 부패가 지연될 수 있고, 썩기 쉬운 열매, 꽃 및 야채의 저장-수명의 연장시킬 수 있음이 기대된다. 이는 리파제 cDNA 또는 그의 올리고뉴클레오타이드 단편이 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성적 프로모터를 이용하거나 조직-특이적 또는 노화-유도가능한 프로모터를 이용하여 열매, 꽃, 야채, 농작 식물 및 산림종 내에서 안티센스 형상으로 발현되는 형질전환 식물을 생성함으로서 달성될 수 있다.

카네이션 노화-유도된 리파제 유전자는 단일 카피(copy) 유전자이다.노화-유도된 리파제 cDNA의 오픈 리딩 프레임 내에서 서열을 인식하지 않는 다양한 제한효소로 절단된 카네이션 게놈 DNA의 서던 블럿 분석이 수행되었다. 제한효소-분해된 리파제 cDNA는³²P-dCTP-표지된 전체 길이 cDNA로 프로브되었다(서열번호: 1). 높은 스트린젠시(stringency) 하이브리디제이션 조건 하에서 단지 하나의 제한 단편이 cDNA 클론에 하이브리다이즈된다(하이브리디제이션 및 세척 모두를 위해 68℃; 세척 완충액: 0.2% ×SSC, 0.1% SDS). 따라서 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자는 단일 카피 유전자이다(도 6). 이러한 유전자가 카네이션 내의 멀티유전자 패밀리의 일원이 아니라는 사실은 이것이 다른 식물 내에서 단일 카피 유전자라는 것을 강하게 제안한다.

카네이션 노화-유도된 리파제 유전자 또는 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열의 지식은 다양한 식물종으로부터의 노화-유도된 리파제 유전자(들)의 분리에 충분하다. 사실상 여기 논증된 바와 같이 카네이션 cDNA 서열에 기초한 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 주형으로서 토마토 잎 게놈 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 토마토 잎 노화-유도된 리파제 유전자를 생성하는데 성공적으로 이용되었다.

피그 와트(fig wart) 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 프로모터 CaMV35S 또는 MAS 프로모터와 같은 구성적 프로모터의 조절하에서 역방향으로(안티센스) 도입될 때 클론된 노화-유도된 리파제 유전자(들) 또는 그의 단편(들) 단독 또는 조합하여 식물을 유전적으로 변형시키고, 변형된 식물 내에서 서열을 변화시킬 수 있다. 카네이션 노화-유도된 리파제 유전자와 충분한 서열 동일성을 공유하는 다른 식물로부터 선택된 안티센스 서열은 유사한 유전적 변형을 달성하는데 이용될 수 있다. 유전적 변형의 하나의 결과는 내성적 번역가능한 노화-유도된 리파제-인코딩 mRNA 양의 감소이다. 따라서 식물 세포 내에서 생성된 노화-유도된 리파제의 양이 감소되어 숙성 또는 환경적 스트레스에 기인한 세포막 손상 및 세포 누출, 즉 감소된 잎, 열매 및/또는 꽃 노화 및 부패를 감소시킨다.

예를 들어 도 17 및 18에 나타난 바와 같이 이중 35S 프로모터의 조절하에서 안티센스 방향으로 전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 벡터로 형질전환된 아라비돕시스 식물은 야생형 식물과 비교하여 더 큰 잎 크기 및 전체 더 큰 식물 생장을 나타낸다. 또한 도 19에 나타난 바와 같이 이러한 식물은 지연된 잎 노화를 논증한다.

형질전환 아라비돕시스 식물 내에서 안티센스 방향으로 전체-길이 리파제 유전자를 발현함으로서 야기된 노화-유도된 리파제 유전자의 감소된 발현의 효과는 또한 형질전환된 식물 내에서 종자 산출량의 증가로서 나타난다. 전체-길이 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 아라비돕시스 식물 라인은 야생형 식물보다약 2∼3배 이상 더 많은 종자를 생산한다(도 20).

형질전환 식물 내에서 관찰된 생물량, 잎 노화 및 종자 산출량 상의 효과가 이들 식물 내의 노화-유도된 리파제의 감소에 기인한다는 것이 도 21에 나타나 있다. 본 발명의 형질전환 식물은 야생형 식물과 비교하여 노화-유도된 리파제의 유의적으로 감소된 발현을 나타낸다.

따라서 본 발명의 방법 및 서열은 생물량 및 종자 산출량뿐만 아니라 잎 또는 열매의 부패를 포함한 식물의 부패를 지연시키고, 일반적으로는 식물 내의 노화를 변화시키는데 이용될 수 있다.

본 발명의 분리된 뉴클레오타이드 서열은 다른 식물 또는 생물체로부터의 실질적으로 상보적인 노화-유도된 리파제 뉴클레오타이드 서열을 분리하는데 이용될 수 있다. 결국 이들 서열은 식물을 형질전환하는데 이용되어 여기 나타난 분리된 뉴클레오타이드 서열의 이용시 나타난 바와 동일한 방식으로 형질전환 식물의 노화를 변화시키는데 이용될 수 있다.

노화-유도된 리파제, 그의 기능적 단편 또는 그의 조합으로의 식물의 형질전환으로 관찰된 유전적 변형은 식물 내에서 노화-유도된 리파제 레벨의 영구적 변화에 영향을 미칠 수 있고, 자가 또는 다른 재생산 기구에 의해 자손 식물 내로 증식될 수 있다. 변화가 세대를 통해 안정적으로 전달되는, 유전적으로 변화된 식물은 식물의 새로운 라인을 생산하는데 이용된다. 본 발명은 처음으로 다양한 식물의 넓은 범위 내에서 노화의 안정적인 유전적 변화를 달성하는 이용되는 적당한 DNA 서열을 제공한다.

일반적으로 노화-유도된 리파제 유전자의 확인 및 분리를 위해 플라스미드 DNA의 제조, 제한효소 분해, DNA의 아가로스 겔 전기영동, 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 서던 블럿, 노던 블럿, DNA 라이게이션(ligation) 및 박테리아 형질전환이 당 분야에서 잘 알려진 통상의 방법을 이용하여 수행되었다. 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989를 참조하시오. 핵산 하이브리디제이션 기술은 Sambrook(Supra)에 의해 개시되어 있다.

여기에 이용된 바와 같이 "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 부분, 식물 세포 또는 식물 세포군을 나타낸다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 식물의 타입은 제한적이지 않고, 예를 들어 에틸렌-민감성 및 에틸렌-둔감성 식물; 살구, 사과, 오렌지, 바나나, 그레이프프루트(grapefruit), 배, 토마토, 딸기, 아보카도 등과 같은 열매를 지닌 식물; 당근, 완두콩, 상추, 양배추, 순무, 감자, 브로콜리, 아스파라커스 등과 같은 야채; 카네이션, 장미, 국화 등과 같은 꽃; 및 일반적으로 본 발명의 DNA 분자 취할 수 있고, 발현할 수 있는 어떤 식물도 포함한다. 반수체, 2배체, 4배체 및 배수체(polyploid)를 포함한 다양한 배수성 레벨의 식물을 포함한다.

형질전환 식물은 여기서 이형적 또는 상동적 노화-유도된 리파제 DNA 또는 변형된 DNA 또는 이형적 노화-유도된 리파제 DNA 또는 상동적 노화-유도된 리파제 DNA의 일부분을 게놈 내로 통합한 식물을 포함하나 이에 제한적이지 않은 일부의 방법으로 유전적으로 변형된 식물로 정의된다. 변화된 유전적 물질은 조절적 또는 제어 서열로 구성된 단백질을 인코드하거나 또는 식물의 내생적 노화-유도된 리파제 DNA 또는 그의 mRNA 서열 또는 그 부분에 안티센스인 안티센스 RNA이거나 이를 포함하거나 이를 인코드한다. "트랜스유전자" 또는 "형질전환 서열"은 형질전환 식물 내로 통합된 외부 유전자 또는 일부 서열로 정의된다.

여기에 사용된 바와 같은 "하이브리디제이션"이라는 용어는 일반적으로 프로브 서열 및 타겟 서열의 성질에 따라 다르게 당업자에게 용이하게 명백하듯이 적당한 스트린젠시의 조건에서의 핵산의 하이브리디제이션을 의미하는데 이용된다. 하이브리디제이션 및 세척의 조건은 당 분야에 잘 알려져 있고, 인큐베이션 시간, 온도 및/또는 용액의 이온강도를 변화시킴으로서 원하는 스트린젠시에 따라 다르게 조건의 조정이 용이하게 이루어진다. 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989를 참조하시오. 조건의 선택은 하이브리다이즈되는 서열의 길이, 특히 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대 G-C 함량 및 허용된 미스매치(mismatch)의 양에 의해 정해진다. 더 낮은 정도의 상보성을 지닌 스트랜드 사이에서의 부분적인 하이브리디제이션을 원하는 경우 낮은 스트린젠시 조건이 바람직하다. 완벽하거나 또는 거의 완벽한 상보성을 원하는 경우 높은 스트린젠시 조건이 바람직하다. 전형적인 높은 스트린젠시 조건의 경우 하이브리디제이션 용액은 6x S.S.C., 0.01M EDTA, 1x Denhardt's 용액 및 0.5% SDS를 함유한다. 하이브리디제이션은 68℃에서 클론된 DNA의 단편의 경우 3∼4시간 동안, 총 진핵 DNA의 경우 12∼16시간 동안 수행된다. 낮은 스트린젠시의 경우 하이브리디제이션의 온도는 약 12℃ 이하의 이중나선의 녹는점(T_M)으로 감소된다. T_M은 용액의 이온강도뿐만 아니라 G-C 함량 및 이중나선 길이의 기능으로 알려져 있다.

여기에 이용된 바와 같이 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 상동성"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 실질적으로 구조적 또는 기능적 등가성을 나타냄을 나타내는데 이용된다. 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 상동성을 지닌 서열 사이에서의 어떤 구조적 또는 기능적 차이점은 데 미니미스(de minimis)일 수 있다; 즉, 원하는 적용에 나타난 바와 같이 기능하는 서열의 능력에 어떤 영향도 미치지 않을 것이다. 차이점은 예를 들어 다른 종 사이의 코돈 용법에서의 고유의 변이에 기인한다. 구조적 차이점은 2 또는 그 이상의 다른 서열 사이에서 서열 겹침 또는 유사성은 유의적인 양이 있는 경우 또는 길이나 구조적인 면에서 서열이 다르더라도 다른 서열이 유사한 물리적 특성을 나타내는 경우 데 미니미스로 고려된다. 예를 들어 이러한 특성은 정의된 조건 하에서의 하이브리다이즈하는 능력 또는 단백질의 경우 면역적 교차반응성(crossreactivity), 유사한 효소활성 등을 포함한다.

또한 서열이 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 유사성을 지니는 경우 2개의 뉴클레오타이드 서열은 "실질적으로 상보적"이다. 폴리펩티드의 활성 부분 사이의 적어도 40% 이상, 바람직하게는 70% 이상 유사성을 지닌 겨우 2개의 아미노산 서열은 실질적으로 상동적이다.

여기에 이용된 바와 같이 DNA 또는 RNA 분자의 "상응하는 부분과의 하이브리다이즈"라는 구절은 하이브리다이즈하는 분자, 즉 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 어떤 뉴클레오타이드 서열(센스 또는 안티센스 방향)이 거의 동일한 크기의 또다른 핵산 분자의 서열을 인식하고 하이브리다이즈하여 적당한 조건하에서 하이브리디제이션 효과를 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어 카네이션 리파제의 3' 코딩 또는 비-코딩 구역으로부터의 100 뉴클레오타이드 길이 안티센스 분자는 2개의 서열 사이에 약 70% 이상의 서열 유사성을 지니는 한 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자 또는 다른 어떤 식물 노화-유도된 리파제 유전자의 3 코딩 또는 비-코딩 구역 내의 뉴클레오타이드 서열의 거의 100 뉴클레오타이드 부분을 인식하고 하이브리다이즈할 것이다. "상응하는 부분"의 크기는 하이브리디제이션시 일부 미스매치를 가능하게 하여 "상응하는 부분"이 이에 하이브리다이즈하는 분자 보다 더 작거나 더 커지고, 예를 들어 20∼30% 더 크거나 더 작게, 바람직하게는 12∼15% 이하로 더 크거나 더 작다는 것이 이해되어야 한다.

핵산의 "기능적 유도체"라는 용어는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 유전자 또는 뉴클레오타이드의 단편, 변이체, 상동체 또는 아날로그(analog)를 의미하는 것으로 사용된다. 기능적 유도체는 본 발명에 따라 그의 유용성을 가능하게 하는 노화-유도된 리파제 인코딩 DNA의 기능의 적어도 일부분을 보유한다. 이러한 기능은 고유한 카네이션 노화-유도된 리파제 또는 노화-유도된 리파제를 인코드하는 다른 식물로부터의 실질적인 상동 DNA 또는 그의 mRNA 전사체와 하이브리다이즈할 수 있거나 또는 안티센스 방향으로 노화-유도된 리파제 mRNA 또는 그와 유사한 것의 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있는 능력을 포함한다.

유전자 또는 DNA 서열의 "단편"은 분사의 어떤 서브세트(subset), 즉 더 짧은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. "변이체"는 하나 이상의 치환된 뉴클레오타이드를 지닌 뉴클레오타이드 치환 변이체와 같은 전체 유전자 또는 그의 단편을 나타내나 이는 특정한 유전자와 하이브리다이즈할 수 있고, 고유의 DNA와 하이브리다이즈하는 mRNA 전사체를 인코드할 수 있는 능력을 유지한다. "상동체"는 다른 식물속 또는 종으로부터의 단편 또는 변이체를 나타낸다."아날로그"는 실질적으로 유사하거나 또는 전체 분자, 그의 변이체 또는 단편에 대해 기능하는 비-자연적 분자를 나타낸다.

유전자, 즉 노화-유도된 리파제 유전자의 "변화된 발현" 또는 "변형된 발현"은 유전자의 일반적인 발현 예를 들어 변형되지 않은 카네이션 또는 다른 식물 내에서 발생하는 발현이 어떤 방법에 의해 변화되는 과정 또는 결과를 의미한다. 여기에 의도된 바와 같이 유전자 발현의 변화는 노화-유도된 리파제 유전자 발현의 완전한 또는 일부의 감소이나 발현 시간의 변화 또는 노화-유도된 리파제 유전자의 발현은 변형되지 않은 식물 또는 재배종 내에서 자연적으로 발생하기 쉬운 것과는 다른 또다른 상태를 포함하기도 한다. 바람직한 변화는 변형되지 않은 식물 내에서의 생산을 비교할 때 노화-유도된 리파제 생산의 감소를 초래하는 것이다.

본 발명에 따라 유전적으로 변화된 식물의 생성시 원하는 특성, 유전적으로 감소된 노화-유도된 리파제 발현 또는 생성에 의해 개별적인 묘목 또는 식물을 선택하는 것이 바람직하다. 노화-유도된 리파제의 발현은 예를 들어 여기에 기술된 바와 같이 특정한 항체를 이용한 통상의 면역분석 방법으로 정량화될 수 있다. 또한 노화-유도된 리파제 효소적 활성은 여기에 기술된 바와 같이 생화학적 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

새롭게 삽입된 유전자 또는 DNA 서열이 별현되어 인코드하는 단백질의 생산을 초래하기 위해 또는 안티센스 DNA의 경우 전사되어 안티센스 RNA 분자를 유발하기 위해 적당한 조절 요소가 유전자 또는 DNA 서열에 따라 적당한 위치 및 방향 내에 존재해야한다. 조절 구역은 인핸서(enhancer) 및 다른 조절 서열뿐만 아니라 프로모터, 5-비-번역된 리더 서열 및 3'-폴리아데닐레이션 서열을 포함한다.

유전자의 센스 또는 안티센스 전사체를 생성하는 노화-유도된 리파제 유전자와의 결합에 유용한 프로모터 조절 요소는 일반적으로 어떤 식물 프로모터 및 더욱 특별하게는 피그 와트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 이중 35S 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, CaMV35S 프로모터 또는 MAS 프로모터와 같은 구성적 프로모터 또는 카네이션 화탁 GST1 프로모터 또는 아라비돕시스 SAG12 프로모터와 같은 조직-특이적 또는 노화-유도된 프로모터를 포함한다(예를 들어 J.C. Palaqui et al., Plant Physiol., 112:1447-1456 (1996); Morton et al., Molecular Breeding, 1:123-132 (1995); Forbert et al., Plant Journal, 6:567-577 (1994); Gan et al., Plant Physiol., 113:313 (1997) 참조). 바람직하게는 본 발명에 이용된 프로모터는 구성적 프로모터이다.

본 발명에 유용한 프로모터로부터의 발현 레벨은 통상적인 발현 시스템, 예를 들어 수용체 유전자 생성물, 즉 프로모터/수용체가 도입된 형질전환 식물의 잎, 꽃, 열매 또는 다른 조직의 단백질 또는 mRNA의 레벨을 측정함으로서 시험될 수 있다.

본 발명은 카네이션 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 유전자에 상보적인, 아라비돕시스 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 유전자에 상보적인 또는 낮은 것에서부터 높은 스트린젠시 조건하에서 카네이션 또는 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자와 하이브리다이즈하는 다른 식물로부터의 유전자 또는 유전자 단편에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하이브리디제이션의 최소한의 특이성을 제공하도록 길이로 적어도 6 이상의 뉴클레오타이드여야 하고, 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA 또는 그의 일부분의 하나의 스트랜드 또는 노화-유도된 리파제 유전자 발현을 조절하는 것에 관련된 게놈 DNA 내의 측면 서열에 상보적이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 100 뉴클레오타이드 정도의 크기이고, 안티센스인 전체 코딩 서열의 길이까지 그리고 그 이상 연장된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 또는 DNA와 RNA의 키메릭(chimeric) 혼합물 또는 그의 유도체 또는 변형된 버전, 단일 나선 또는 이중 나선이 될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활동은 세포 내 노화-유도된 리파제 유전자 발현의 변화, 주로 억제를 유발한다. 안티센스의 일반적인 논의를 위해 참조 : Albert et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., Garland Publishing, Inc. New York, New York (1989, 특히 페이지 195∼196).

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도된 리파제 유전자의 어떤 부분에 상보적이다. 예를 들어 하나의 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이로 6∼100 뉴클레오타이드이고, 노화-유도된 리파제 서열의 5'-비-코딩 서열 또는 3' 말단에 상보적이다. 주로 5'-비-코딩 서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전사 인자를 인코딩하는 유전자 발현의 효과적인 억제자로 잘 알려져 있다(Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4284-4290 (1993)).

바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 mRNA의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 전체 길이 cDNA 클론의 안티센스 방향으로 식물로의 도입은 성공적인 변화된 노화-유도된 리파제 유전자 발현을 초래하는 것으로 기대된다. 더욱이 노화-유도된 리파제 유전자의 타겟된 특정한 부분인 일부 서열의 도입이 동일하게 효과적일 수 있다.

본 발명에 의해 요구되는 상동체의 최소량은 다른 RNA 또는 DNA 분자의 기능 및 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않으면서 특정한 타겟 RNA 또는 DNA의 인식 및 그의 번역 또는 기능의 억제 또는 감소를 제공하기에 충분하도록 상보적인 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 노화-유도된 리파제 유전자의 적어도 일부분 이상의 RNA 전사체에 상보적인 서열로 구성되는 반면 바람직하기는 하나 완전한 상보성이 요구되지 않는다. 하이브리다이즈하는 능력은 안티센스올리고뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 따라 다르다. 일반적으로 하이브리다이즈하는 핵산이 길수록 함유하고 더욱이 안정한 이중나선을 형성하는 노화-유도된 리파제 타겟 서열과 더 많은 염기 미스매치가 생긴다. 당업자는 예를 들어 하이브리다이즈된 복합물의 녹는점을 결정하는 표준 절차를 이용함으로서 미스매치의 허용가능 정도를 확인할 수 있다.

안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 외생적으로 도입된 핵산 서열로부터의 전사에 의해 세포내적으로 생성된다. 안티센스 분자는 프로모터를 포함한 적당한 조절 요소에 실시가능하게 연결된 안티센스 노화-유도된 리파제 서열을 인코딩하는 DNA로 통합되는 플라스미드 또는 바이러스와 같은 형질전환 또는 세포감염 또는 벡터로의 감염에 의해 세포로 전달된다. 세포 내에서 외생적 DNA 서열은 발현되어 노화-유도된 리파제 유전자의 안티센스 RNA를 생산한다.

벡터는 바람직하게는 플라스미드가 될 수 있고, 바이러스성 또는 식물 세포 또는 박테리아 세포 내에서 인코드된 유전자를 복제하고 발현하는 당 분야에 알려진 다른 벡터이다. 벡터는 염색체적으로 통합되어 원하는 안티센스 노화-유도된 리파제 RNA를 생산하도록 전사될 수 있게 된다. 이러한 플라스미드 또는 바이러스성 벡터는 당 분야에서 표준화된 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구조될 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따라 벡터는 원핵세포성 숙주 내에서 기능적인 복제 시스템 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 플라스미드벡터이다. 또한 벡터는 본 발명에 따라 아그로박테리움 내에서 기능적인 복제 시스템 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 벡터이다. 아그로박테리움 내에서 복제할 수 있는 플라스미드는 당 분야에 잘 알려져 있다. Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. B.R. Glick and J.E. Thompson. CRC Press (1993) pp.67-83 참조.

카네이션 리파제 유전자는 하기의 방법으로 플라스미드 벡터 내에 안티센스 방향으로 클론되었다. pUC18 백본(backbone)으로부터 구조되고, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터의 35S 프로모터를 함유한 pCD 플라스미드는 멀티플 클로닝 사이트에 의해 수행되고, 옥타핀(octapine) 합성효소 종결 서열이 카네이션 리파제 유전자를 클로닝하는데 이용되었다. pCd-리파제(안티센스) 플라스미드는 pC의 Hind3 사이트 및 EcoRI 사이트 내로 안티센스 방향으로 전체 길이 카네이션 리파제 유전자를 서브클로닝함으로서 구조되었다. 유사하게는 pCD△35S-GST1-리파제(안티센스) 플라스미드는 pCd 벡터의 BamH1 및 Sal1 사이트내로 카네이션 글로타티온 S 트랜스퍼라제(trnasferase) 1(GST1) 프로모터의 PCR 증폭된 단편(-703 ∼+19 bp)의 첫 번째 서브클로닝에 의해 구조되었다. 이후 전체 길이 카네이션 리파제 유전자는 구조물의 Hind3 및 EcoRI 사이트 내로 안티센스 방향으로 서브클론되었다. 또다른 플라스미드, pGd△35S-GST1-GUS 플라스미드는 pCd 벡터의 BamH1 및 Sal1 사이트 내로 카네이션 글루타티온 S-트랜스퍼라제 1(GST1) 프로모터의 PCR-증폭된 단편(-703 ∼+19 bp)의 첫 번째 서브클로닝에 의해 구조되었다. 이후 수용체 유전자 베터-글루쿠로니다제(glucuronidase)(GUS)가 Sal1 및 EcoRI 사이트 내로 서브클론되었다. pCd-35S²-리파제(안티센스) 플라스미드가 pCd 벡터의 Smal1 및 Hind3 사이트 내로 이중 35S 프로모터(세로로 일렬되어 CaMV 35S 프로모터의 2대 카피를 함유한)를 첫 번째 서브클로닝함으로서 구조되었다. 이후 전체 길이 카네이선 리파제 유전자는 구조물의 Hind3 및 EcoRI 사이트 내로 안티센스 방향으로 서브클론되었다.

올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 길이로 약 6∼100 뉴클레오타이드이고, 노화-유도된 리파제의 타겟 서열에 상보적인 것이 재조합 뉴클레오타이드 기술에 의해 제조되거나 예를 들어 단일뉴클레오타이드 또는 더 짧은 올리고뉴클레오타이드로부터 합성된다. 자동화된 합성기는 본 발명의 올리고- 및 폴리뉴클레오타이드의 화학적 합성에 적용가능하다. 본 발명에 따라 재조합 뉴클레오타이드 분자를 구조하는 절차는 Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 내에 개시되어있다. 노화-유도된 리파제 서열에 상보적인 안티센스 RNA를 인코드하는 올리고뉴클레오타이드는 당분야에 잘 알려진 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 절차에 관한 상세한 것은 Maniatis T. et al., Molecular mechanism in the Control of Gene Expression, eds., Nierlich, et al., eds., Acad. Press, N.Y.(1976)에 제공된다.

본 발명의 또다른 실시태양에서 외생적 노화-유도된 리파제의 발현의 억제는 식물 세포 내로 도입된 외생적 노화-유도된 리파제 유전자 또는 유전자 단편의 과발현을 통한 동시-억제의 결과이다. 본 발명의 이러한 실시태양에서 센스 방향으로 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 벡터는 안티센스 분자에 대해 여기 기술된 것과 동일한 방식으로 세포 내로 도입된다. 바람직하게는 노화-유도된 리파제는 예를 들어 피그 와트 모자이크 바이러스 프로모터 또는 CaMV35S와 같은 강한 구성적 프로모터에 실시가능하게 연결된다.

본 발명에 따라 제조된 형질전환 식물은 당분야에 잘 알려진 식물 형질전환의 어떤 방법을 이용한 DNA 형질전환에 의해 제조된다. 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와의 식물, 조직 또는 세포의 직접적인 동시-배양 또는 직접적인 감염(Miki et al., Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology, (1993), p.67-88); 프로토플라스트(protoplast) 내로의 직접적인 유전자 전이 또는 프로토플라스트 업테이크(uptake)(Paszkowski et al., EMBO J., 12:2717 (1984)); 일렉트로포레이션(electroporation)(Fromn et al., Mature, 319:710 (1986)); 입자 포격(particle bombardment)(Klein et al., BioTechnology, 6:559-563 (1988)); 묘목 또는 식물의 분열조직 내로의 주입(De L몌둠 et al., Nature, 325:274-276 (1987)); 배양된 세포 및 조직의 프로토플라스트 내로의 주입(Reich et al., BioTechnology, 4:1001-1004 (1986))을 포함한다.

일반적으로 완전한 식물은 형질전환 과정으로부터 수득된다. 식물은 프로토플라스트, 캘러스, 조직 부분 또는 외식편 등으로부터 재생된다. 잎, 꽃, 열매, 종자 등과 같이 노화-유도된 리파제의 발현이 변화된 재생된 식물로부터 수득된 식물부가 여기에 사용된 바와 같이 "식물"의 정의에 포함된다. 또한 재생된 식물의 자손, 변이체 및 돌연변이도 "식물"의 정의에 포함된다.

또한 본 발명은 본 발명의 cDNA 분자에 의해 인코드된 카네이션 또는 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 단백질 및 카네이션 또는 아라비돕시스 단백질에 대한 항체와 교차반응하는 단백질들을 제공한다. 이러한 단백질들은 도 1에 나타난 바와 같은 서열번호: 2 내의 아미노산 서열을 지니고, 서열번호: 2에 나타난 단백질에 대한 항체와 교차반응성을 공유하고, 서열번호: 19에 나타난 아미노산 서열을 지니고(도 14에 나타남) 또는 서열번호: 19에 나타난 단백질에 대한 항체와 교차반응성을 공유한다.

카네이션 또는 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 단백질 또는 그의 기능적인 유도체는 바람직하게는 재조합 기술에 의해 제조되고, 선택적으로는 화학적 합성 방법과 조합된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 노화-유도된 리파제는 말토스 결합 단백질에 융합된 노화-유도된 리파제로 구성된 융합 단백질로서 발현된다.재조합 융합 단백질을 인코딩하는 클론의 발현은 p-니트로페닐팔미테이트, 인지질 및 트리아크릴글리세롤과 하이브리다이즈되는 예측된 분자량의 융합 단백질을 산출하고, 이는 리파제 활성의 지표이다. 재조합 노화-유도된 리파제 단백질은 카네이션 노화-유도된 리파제에 대한 항체와의 면역블럿팅(immunoblotting)후 웨스턴 블럿 분석 내에 두드러진 밴드를 나타낸다. 또한 융합 단백질의 프로테아제(protease), 인자 Xa로의 처리에 의해 해리된 자유 노화-유도된 리파제(50.2 Kda)은 웨스턴 블럿 분석 내에서 노화-유도된 리파제 항체와 반응한다(도 3). 노화-유도된 리파제의 아미노산 서열의 모티프 검색은 아미드 연결을 통한 미리스테이트(myristate)의 공유결합성 부착에 대한 잠재적인 N-미리스토일레이션(myristoylation) 사이트의 존재를 나타낸다(Johnson et al., Ann. Rev. Bichem., 63:869-914 (1994); Towler et al., Ann. Rev. Bichem., 57:67-99 (1988); 및 R.J.A. Grand, Biochem. J., 258:625-638 (1989) 참조). 또한 단백질 모티프 검색은 카네이션 노화-유도된 리파제가 보존된 리파제 컨센서스 서열(표 1)인 서열 ITFAGHSLG(서열번호: 4)를 함유함을 나타내었다. 다양한 식물로부터의 보존된 리파제 컨센서스 서열은 하기의 표에 나타나 있다.

식물종	보존된 리파제 서열
카네이션	I T F AGHSLGA (서열번호: 4)
토마토	I T F TGHSLGA (서열번호: 3)
아라비돕시스	I T T CGHSLGA (서열번호: 9)
이포모에아 닐(Ipomoea nil)	I T V TGHSLGS (서열번호: 10)

본 발명의 노화-유도된 리파제 단백질은 실험실 내에서 및인 시츄분석 모두에서 리파제 활성을 보유한 것을 나타내었다. 실험실 내에서의 측정에 있어서, p-니트로페닐팔미테이드 및 대두 인지질(40% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 60% 다른 인지질)이 기질로서 이용되었고, 반응의 생성물인 p-니트로페놀 및 자유 지방산 각각이 분광광도계적으로 측정되었다(Pencreac'h 및 Baratti, 1996; Nixon and Chan, 1979; Lin et al., 1983). 또한 리파제 활성은 Nixon and Chan(1979) 및 Lin et al.(1983)에 의해 기술된 변형 방법을 이용한 기체 크로마토그래피에 의해 실험실 내에서 측정되었다. 반응 혼합물은 100㎕의 최종 부피 내에 100mM 트리스-HCl(pH 8.0), 2.5mM 기질(티릴리놀레인(trilinolein), 대두 인지질 또는 디리놀레일포스파티딜콜린(dilinoleylphosphatidylcholine) 및 효소 단백질(100㎍)을 함유하였다. 기질은 반응 혼합물에 먼저 첨가된 5% 검 아라빅(gum arabic) 내에 유화되었다. 이를 달성하기 위해 기질은 클로로포름 내에 용해되었고, 검 아라빅 용액 내에 첨가되었고, 30초 동안 소니피케이션(sonification)에 의해 유화되었다. 유화후 클로로포름은 N₂증기에 의해 휘발되었다. 반응은 2시간까지 시간을 변화시키면서 25℃에서 수행되었다. 이후 반응 혼합물은 지질-추출되었고, 자유 지방산은 TLC에 의해 정제되었고, 데리비타이즈되었고(derivitized), GC에 의해 정량화되었다(McKegney et al., 1995).

지방분해성 아크릴 가수분해효소 활성은 Furukwa et al.(1983)에 의해 기술되고, Tsuboi et al.(1996)에의해 변형된 바와 같이 인 시츄 내에서 측정되었다. 후자의 분석에서 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 전체 길이 cDNA 클론으로 형질전환된E. coli는 단지 탄소의 원료로서의 긴 지방산 에스테르인 Tween 40 또는 Tween 60으로 보충된 최소 염 배지 내에서 생장되었다. 따라서 지방산 에스테르가 리파제에 의해 가수분해될 때 박테리아 생장을 위한 탄소가 단지 유용하였다. 형질전환되지 않은E. coli의 대조군 배양은 생장하지 않는 반면 노화-유도된 리파제 cDNA로 형질전환된E. coli가 초기 래그 페이스(lag phase)후 Tween 40- 및 Tween 60-기초 배지 내에서 생장한다는 사실은 인코드된 재조합 단백질의 리파제 활성을 확인한다(도 5). 즉, 생장을 위한 필수적인 탄소를 수득하기 위해 노화-유도된 리파제는 스테아레이트(stearate)(Tween 60) 및 팔미테이트(Tween 40)를 해리한다.

여기 기술된 바와 같이 노화-유도된 리파제 단백질의 "기능적 유도체"는 적어도 일부분 이상의 노화-유도된 리파제 활성 또는 노화-유도된 리파제에 대해 특이적인 항체와의 면역적 교차반응성을 보유한 노화-유도된 리파제의 단편, 변이체, 아날로그 또는 화학적 유도체이다. 노화-유도된 리파제 단백질의 단편은 분자의어떤 서브세트를 나타낸다. 변이체 펩타이드는 예를 들어 당분야에 잘 알려진 방법을 이용한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조된다. 노화-유도된 리파제의 아날로그는 전체 단백질 또는 그의 단편에 실질적으로 유사한 비-자연적 단백질을 나타낸다. 노화-유도된 리파제의 화학적 유도체는 펩타이드 G38 또는 펩타이드 단편정상적인 부분인 부가적인 화학적 반족(moiety)을 정상적이지 않게 함유한다. 변형은 선택된 사이드 체인 또는 말단 잔기와 반응하는 것이 가능한 유기 유도제와 펩타이드의 타겟된 아미노산 잔기를 반응함으로서 노화-유도된 리파제 펩타이드 또는 그의 단편 내로 도입된다.

본 발명에 따른 노화-유도된 리파제 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 세포가 단백질을 합성할 수 있게 하고, 이후 사용된 클로닝 프로토콜에 따라 달리 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 자유 단백질 또는 융합 단백질로서의 단백질을 분리함으로서 생산된다. 또한 단백질은 세포-없는 시스템 내에서 생산될 수 있다(Ranu et al., Meth. Enzymol., 60:459-484 (1979)).

일반적으로 본 발명을 기술하면서 도면에 의해 제공된 하기 실시예의 참조를 통해 용이하게 이해될 것이나 본 발명에 제한적인 것은 아니다.

(실시예 1)

카네이션 노화-유도된 리파제 cDNA를 분리하는데 이용되는 식물 재료

비닐하우스 내에서 생장되고, 유지된 카네이션 식물(Dianthus caryophyllusL. cv. Improved white Sim)이 노화-유도된 리파제 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 분리하는데 이용되었다. 노화 꽃 화탁의 형태 내의 꽃 조직(다른 발달 단계로부터의)이 완충액 내에 수집되었고, 사용되기 전까지 -70℃에서 보관되었다.

세포질성 지질 입자는 노화 착수 바로 전에 수확된 카네이션 꽃 화탁으로부터 분리되었다. 카네이션 화탁(25g/150ml 완충액)은 옴니마이저(Omnimizer) 내에서 균질화 완충액(50mM Epps- 0.24M 소르비톨 pH 7.4, 10mm EDTA, 2mM EGTA, 1mM PMSF, 1mM 벤자마딘(benzamadine), 10mm 아미노-n-카프로산 및 4% 폴리비닐폴리피롤리돈) 내 4℃로 45초 동안 균질화되었고, 폴리트론(Polytron) 균질화계(homogenizer) 내에서 부가적으로 몇 분간 균질화되었다. 균질화물은 4겹의 치즈천(cheescloth)을 통해 여과되었고, 여과물은 4℃에서 20분간 10,000g로원심분리되었다. 상청액은 미립체막을 분리하기 위해 250,000g로 1시간 동안 원심분리되었다. 지질 입자는 Hudak and Thompson(1997), Physiol. Plant., 114:705-713의 방법에 의한 부유 원심분리 후 입자를 수집함으로서 후-미립체성 상청액으로부터 수득되었다. 상청액은 슈크로스로 10%(w/v)가 되었고, 23ml의 상청액이 60 Ti Beckman 원심분리관 내로 부어졌고, 1.5ml 분리 완충액으로 겹쳐졌고, 4℃에서 12시간 동안 305,000g로 원심분리되었다. 입자는 파스퇴르 피펫으로 분리 완충액 층으로부터 제거되었다. 입자 현탁액의 3ml가 멸균된 PBS(10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5 + 0.85% 염화나트륨)로 평형화된(equilibrated) Sepharose G-25 컬럼 내로 로드되었고, 현탁액은 멸균 PBS로 용출되었다. 입자를 함유한 보이드(void) 부피가 용출되었고, Centriton-10 필터(아미콘사)를 이용하여 600㎍의 단백질 농도로 농축되었다. 이후 지질 입자는 300㎍의 입자로 접종된 토끼 내에서 항체를 생성하는데 이용되었다. 혈액의 IgG 적정농도는 웨스턴 블럿 분석에 의해 시험되었다.

메신저 RNA(mRNA) 분리

총 RNA는 Chomczynski and Sachi, Anal. Biochem., 162:156-159 (1987)에 의해 기술된 바와 본질적으로 같이 단계 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 또는 Ⅳ 카네이션 꽃의 화탁으로부터 분리되었다. 간단히 15g의 화탁 조직이 액체 질소 내에서 동결되었고, 4M 구아니디늄 티오시아테이트(guanidinium thiocyanate), 25mM의 구연산나트륨, pH7.0, 0.5%의 살코실(sarkosyl) 및 0.1M β-멀캅토에탄올(mercaptoethanol)을 함유한 완충액 내에서 30초 동안 균질화되었다. 150ml의 물-포화된 페놀, 30ml의 클로로포름 및 15ml의 2M NaOAc, pH 4.0이 균질화된 표본 내에 첨가되었다. 표본은 10분간 10,000g로 원심분리되었고, 수용액 상이 제거되었고, 이로부터 핵산이 150ml의 이소프로판올로서 침전되었다. 표본은 5,000g로 10분간 원심분리되었고, 펠렛은 30ml의 4M LiCl로 1회 세척되었고, 30ml의 클로로포름으로 추출되었고, 0.2M NaOAc, pH 5.0을 함유한 30ml의 이소프로판올로 침전되었다. RNA는 DEPC-처리된 물에 용해되었고, -70℃에서 보관되었다.

폴리A⁺mRNA는 Promega사의 폴리A⁺트랙(tract) mRNA 분리 시스템을 이용하여 총 RNA로부터 분리되었다. 폴리A⁺mRN는 Stratagene(La Jolla, Calif)사의 ZAP Express^ⓡcDNA 합성 시스템을 이용하여 cDNA 합성을 위한 주형으로서 이용되었다.

카네이션 화탁 cDNA 라이브러리 스크리닝

단계 Ⅳ 카네이션 화탁으로부터 분리된 mRNA를 이용하여 제조된 cDNA 라이브러리가 약 5 ×10⁶PFU/ml로 희석되었고, 지질 입자 항혈청으로 면역스크린되었다. 양성 cDNA 클론은 ExAssist^ⓡHelper Phage/SOLR 균주 시스템을 이용하여 회복되었고, pBluescript^ⓡphagemid(Stratagene) 내에서 재순환되었다. 또한 단계 Ⅲ 카네이션 화탁 cDNA 라이브러리는³²P-표지된 19 염기쌍 프로브(5'-ACCTACTAGGTTCCGCG

TC-3')(서열번호: 5)를 이용하여 스크린되었다. 양성 cDNA 클론이 파지(phage)로부터 절제되었고, 제조사의 지침 내에 있는 방법을 이용하여 pBK-CMV^ⓡ(Stratagene) 파지미드(phagemid) 내로 재순환되었다. 전체 길이 cDNA(1.53 kb 단편)이 pBK-CMV 벡터 내로 삽입되었다.

아라비돕시스 잎 cDNA 라이브러리 스크리닝

아라비돕시스 탈리아나로부터의 노화-유도된 리파제 유전자의 전체-길이 cDNA 클론이 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로서 분리되었다. 라이브러리를 스크리닝하기 위해 이용되는 프로브는 주형으로서 노화 잎 라이브러리를 이용한 PCR에 의해 수득되었다. PCR 프라이머는 유전자 은행 내의 게놈 유전자(U93215)로부터 고안되었다. 전방 프라이머는 5' ATG TCT AGA GAA GAT ATT GCG CGC CGA 3'(서열번호: 20)를 지녔고, 역 프라이머는 5' GAT GAG CTC GAC GGA GCT GAG AGA GAT G 3'(서열번호: 21)을 지녔다. PCR 생성물은 스크리닝을 위해 Bluescript 내로 서브클론되었다. 이용된 PCR 생성물의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 도 14 내에 나타나 있다.

플라스미드 DNA 분리, DNA 서열화

Sambrook et al.,(Supra)에 의해 기술된 알칼리성 분해 방법이 플라스미드 DNA를 분리하는데 이용되었다. 전체 길이 양성 cDNA 클론은 디디옥시(dideoxy) 서열화 방법을 이용하여 서열화되었다(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467). 오픈 리딩 프레임이 편집되었고, BLAST 검색(GenBank, Bethesda, MD)을 이용하여 분석되었고, 인코드된 유전자의 유도된 아미노산 서열과의 5개의 가장 상동적인 단백질의 정렬은 BCM Search Launcher를 이용하여 이루어졌다: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890 (1987) 참조). 유도된 아미노산 서열 내에 존재하는 기능적인 모티프는 MultiFinder에 의해 확인되었다.

융합 단백질로서의 리파제의 발현

전체 길이 카네이션 노화-유도된 리파제를 함유한 파지미드 pBK-CMV는 EcoRI 및 XbaI로 분해되어 1.53 Kb 리파제 단편을 방출하고, EcoRI 및 XbaI 분해된 융합 벡터, pMalc(New England BioLabs) 내로 서브클론되었다. 노화-유도된 리파제를 함유한 pMalc 벡터가E. coliBL-21(DE3) 세포를 형질전환하는데 이용되었다.

pMLip에 의해 인코드된 융합 단백질(노화-유도된 리파제와 말토스 결합 단백질의 융합)은 Sambrook et al.,(Supra) 및 Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Insterscience, New York (1987), 16.4.1-16.4.3 내에 기술된 바와 같이 분리되었고, 정제되었다. 간단히 pMLip로 형질전환된 E. coli BL-21 세포는 50mM PMSF의 8㎕ 및 세포 g 당 20mg/ml 리소자임의 80㎕를 함유한 3ml/h의 라이세이트(lysate) 완충액(50mM 트리스, pH 8.0, 100mM NaCl 및 1mM EDTA) 내에 재현탁되었고, 상온에서 진탕하면서 20분간 인큐베이트되었다. 그후 80㎕의 5% 디옥시콜릭 애시드(deoxycholic acid) 및 40 유니트의 DNAse Ⅰ가 첨가되었고, 세포가 완전히 분해될 때까지 상온에서 진탕되었다. 세포 파편은 원심분리에 의해 펠렛화되었고, 8M 우레아(urea) 및 0.1mM PMSF가 첨가된 2 부피의 라이세이트 완충액 내에 재현탁되었다. 한 시간 후 6부피의 완충액(50mM KH₂PO₄, 1mM EDTA 및 50mM NaCl, pH 7.0)이 현탁액을 중성화하기 위해 첨가되었다. 세포 현탁액의 pH는 HCl로 pH 8.0으로 적정되었고, 세포 파편은 펠렛화되었다. 상청액은 4℃에서 오버나이트로 20mM 트리스 완충액, pH 8.0, 100mM NaCl 및 1mM EDTA에 대해 투석되었다. 말토스 결합 단백질-리파제 융합 생성물(Malip)은 아밀로스 컬럼(New England BioLab사)를 이용하여 정제되었다. 융합 단백질을 함유한 프랙션이 프로테아제 인자 Xa(1㎍/100㎍ 융합 단백질)로 분열되어 융합 생성물로부터 리파제를 분리하였다. 융합 단백질과 분열된 리파제 모두 SDS PAGE 전기영동 및 웨스턴 블럿에 의해 분석되었다. pMalc에 의해 인코드된 말토스 결합 단백질이 대조군으로 이용되었다. 결과는 도 3에 나타나있다.

카네이션 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션

단계 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서의 꽃으로부터 분리된 총 RNA의 10㎍이 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 나일론막 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer Mannuheim)을 이용하여³²P-dCTP로 표지된 1.53 Kb EcoRI-XbaI 리파제 단편이 필터를 프로브하는데 이용되었다(7 ×10⁷cpm). 필터는 상온에서 1x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 필터는 건조되었고, -70℃에서 오버나이트로 X-레이 필름에 노출되었다. 결과는 도 4에 나타나 있다.

아라비돕시스 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션

2, 3, 4, 5 및 6주 생장된 아라비돕시스 잎으로부터 분리된 총 RNA의 10㎍이 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 나일론막 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer Mannuheim)을 이용하여³²P-dCTP로 표지된 전체-길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자가 필터를 프로브하는데 이용되었다(7 ×10⁷cpm). 필터는 상온에서 1x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 필터는 건조되었고, -70℃에서 오버나이트로 X-레이 필름에 노출되었다.

게놈 DNA 분리 및 서던 블럿 하이브리디제이션

신선하게 절단된 카네이션 화탁이 액체 질소 내에서 동결되었고, 분말로 갈아지고, 추출 완충액(0.1M 트리스, pH 8.2, 50mM EDTA, 0.1M NaCl, 2% SDS 및 0.1mg/ml 프로테아제 K)으로 균질화되어 게놈 DNA를 분리하였다. 균질화된 재료는 10분간 37℃에서 인큐베이트되었고, 페놀-클로로포름-이소아밀알코올(25:24:1)로 추출되었다. DNA는 NaOAc 및 이소프로판올로 침전되었다. DNA 펠렛은 1 ×TE, pH 8.0 내에 용해되었고, 페놀에 재-추출되었고, 1 ×TE, pH 8.0 내에 재침전되고, 재현탁되었다.

게놈 DNA는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)(Bam HI, XbaI, XhoI, EcoRI, HindⅢ 및 SalI)로 개별적으로 분해되었고, 분해된 DNA는 1%의 아가로스 겔 상에서 프랙션화되었다. 분리된 DNA는 나일론막 상에서 블럿되었고,³²P-표지된 1.53 Kb 리파제 단편을 이용하여 하이브리디제이션이 수행되었다. 하이브리디제이션 및 세척은 낮은 스트린젠시 조건(하이브리디제이션 및 세척을 위해 42℃에서)(6x SSC,5x Denhardt's 시약, 0.1% SDS)뿐만 아니라 높은 스트린젠시 조건(68℃에서)(6x SSC, 2x Denhardt's 시약, 0.1% SDS)하에서 수행되었다. 결과는 도 6에 나타나 있다. 나타난 바와 같이 리파제 cDNA 프로브는 하나의 게놈 단편만을 검출하여 카네이션 유전자가 단일 카피 유전자임을 나타내었다.

리파제 효소 에세이

정제된 리파제 융합 단백질의 지방분해성 아크릴 가수분해효소 활성은 외생적 기질로서 p-니트로페닐팔미테이트와 대두 인지질을 이용하여 분광광도계적으로 분석되었다. 대조군으로 작용하는 말토스-결합 단백질 단독으로는 기질로서의 인지질과 어떤 검출가능한 리파제 활성을 지니지 않았다(표 2). p-니트로페닐팔미테이트가 말토스-결합 단백질과 함께 기질로서 이용될 때 리파제 반응의 예측되는 생성물인 적은 양의 p-니트로페놀이 검출가능하여 p-니트로페닐팔미테이트의 상업적인 제조 내의 p-니트로페놀의 백그라운드(background) 레벨을 반영한다(표 2). 그러나 정제된 리파제 융합 단백질의 존재시 인지질로부터의 자유 지방산 및 p-니트로페닐팔미테이트로부터의 p-니트로페놀의 방출로 표명된 강한 리파제 활성이 명백하였다(표 2).

E. col내에서 발현되고, 아밀로스 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 말토스-결합 단백질과 리파제 융합 단백질의 지방분해성 아크릴 가수분해효소 활성의 분광광도계적 측정

단백질 종	생성물
단백질 종	pNPPp-니트로페놀(nmol/mg/분)	자유 지방산(nmol/mg 단백질/분)
말토스-결합 단백질	0.71 ±0.02	ND*
리파제 융합 단백질	12.01 ±1.81	46.75 ±1.24
*ND, 검출되지 않음

2개의 기질, p-니트로페닐팔미테이트와 대두 인지질이 사용되었다.

활성은 형성된 생성물로서 표현된다(p-니트로페닐팔미테이트로부터의 p-니트로페놀 및 대두 인지질로부터의 지방산).

n=3 반복에 의한 평균 ±SE이 나타나 있다.

다른 실험에서 리파제 융합 단백질의 효소적 활성은 기질로부터 해리된 자유 지방산의 정량화 및 동정을 가능하게 하는 기술인 기체 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 트리리놀레인, 대두 인지질 및 디리놀레일포스파티딜콜린이 기질로서 이용되었고, 탈에스테르화된 지방산은 기체 크로마토그래피에 의해 분석되기 전에 박층(thin layer) 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 분광광도계적 분석시(표 2) 대두 인지질 또는 디리놀레일포스파티딜콜린과의 말토스-결합 단백질 단독에 대한 리파제 활성이 검출되지 않았고, 이는 이들 기질이 탈에스테르화된 지방산의 본질적으로 자유임을 나타내었다(표 3). 그러나 리파제 융합 단백질이 효소의 원료로서 이용될 때 팔미트산, 스테아르산 및 리놀렌산이 대두 인지질 추출물로부터 탈에스테르화되었고, 리놀렌산이 디리놀레일포스파티딜콜린으로부터 탈에스테르화되었다(표 3). 인지질 기질과는 대조적으로 자유 리놀렌산의 검출가능한 레벨은 트리리놀레인 내에 존재하였으나 자유 리놀렌산의 레벨은 리파제 융합 단백질의 존재시 유의적으로 증가하였으며 이는 리파제가 트리아크릴글리세롤로부터 지방산을 탈에스테르화할 수 있다는 것을 나타내었다(표 3).

E. col내에서 발현되고, 아밀로스 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 말토스-결합 단백질과 리파제 융합 단백질의 지방분해성 아크릴 가수분해효소 활성의 GC 측정

		생성물(㎍/mg 단백질)¹
기질		말토스-결합 단백질	리파제 융합 단백질
트리-리놀레인²	리놀렌산(18:2)	15.9 ±0.75	33.4 ±1.58
대두 인지질	팔미트산(16:0)	ND⁴	4.80
	스테아르산(18:0)	ND	9.68
	리놀렌산(18:2)	ND	5.80
디리놀레일포스파티딜콜린³	리놀렌산(18:2)	ND	20.00
¹반응은 2시간 동안 지속되었고, 이 기간을 넘어서 계속되지 않았음.²n=3 반복으로 평균 ±SE으로 나타냄.³단일 실험⁴검출되지 않음.

E. coli내에서의 리파제 cDNA의 발현에 의해 수득된 단백질의 리파제 활성이 Tsuboi et al., Infect. Immunol., 64:2936-2940 (1996); Wang et al., Biotech., 9:741-746 (1995); 및 G. Sierra, J. Microbiol. and Serol., 23:15-22(1997)에 기술된 바와 같이 생체 내에서 측정되었다. pMal로 형질전환된E. coliBL-21 콜로니 및 pMLip으로 형질전환된 다른E. coliBL-21 콜로니의 단일 콜로니가 기본 염 배지(pH 7.0) 내에서 인큐데이트되었다 : K₂HPO₄(4.3), KH₂PO₄(3.4), (NH₄)SO₄(2.0), MgCl₂(0.16), MnCl₂·4H₂O(0.001), FeSO₄·7H₂O(0.0006), CaCl₂·2H₂O(0.026) 및 NaMoO₄·2H₂O(0.002) 함유. 기질, Tween 40(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노팔미테이트) 또는 Tween 60(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노스테아레이트)이 1%의 농도로 첨가되었다. 37℃에서 진탕하면서 박테리아 세포의 생장이 600nm에서의 흡광도 측정에 의해 모니터되었다(도 5). 도 5에 나타난 바와 같이 pMLip로 형질전환된E. coli세포는 초기 래그(lag) 기간 후 Tween 40/Tween 60-보충된 기본 배지 내에서 생장할 수 있었다. 그러나 pMal로 형질전환된E. coli세포는 Tween-보충된 매지 내에서 생장하지 않았다.

(실시예 2)

카네이션 노화-유도된 리파제 유전자의 에틸렌 유도

단계 Ⅱ 카네이션 꽃 및 카네이션 절단이 15시간 동안 밀페된 챔버 내에서 0.5ppm 에틸렌으로 처리되었다. RNA는 하기에 기술된 바와 같이 처리되지 않은 카네이션 꽃과 절단으로부터의 꽃과 잎뿐만 아니라 에틸렌 처리된 단계 Ⅱ 꽃 화탁과 처리된 절단의 잎으로 추출되었다.

아라비돕시스 식물은 1시간, 2 또는 3일 동안 밀폐된 챔버 내에서 50μM 에테폰(ethephon)으로 처리되었다. 하기와 같이 식물의 에테폰 처리된 잎으로부터 RNA가 추출되었다.

꽃 또는 잎(1g 꽃 또는 5g 잎)이 액체 질소 내에서 갈아졌다. 갈아진 분말은 30ml의 구아니디늄 완충액(4M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 2.5mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-멀캅토에탄올)으로 혼합되었다. 혼합물은 치즈천 4겹을 통해 여과되었고, 4℃에서 30분간 10,000g로 원심분리되었다. 이후 상청액은 20시간 동안 26,000g에서 염화세슘 밀도 기울기 원심분리되었다. 펠렛화된 RNA는 75% 에탄올로 린스되었고, 600㎕ DEPC-처리된 물에 재현탁되었고, 0.75ml의 95% 에탄올 및 30㎕의 3M NaOAc로 -70℃에서 RNA가 침전되었다. 카네이션 또는 아라비돕시스 RNA의 10㎍이 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 프랙션화되었고, 나일론막으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된³²P-dCTP-표지된 전체 길이 카네이션 리파제 cDNA(서열번호: 1)가 42℃에서 오버나이트로 카네이션 RNA 함유 막을 프로브하는데 이용되었다. 무작위로 프라임된³²P-dCTP-표지된 전체 길이 아라비돕시스 리파제 cDNA가 42℃에서 오버나이트로 아라비돕시스 RNA 함유 막을 프로브하는데 이용되었다. 이후 막은 각각 0.1% SDS를 함유한 1x SSC 내에서 상온으로 15분간 1회 세척되었고, 0.1% SDS를 함한 0.2x SSC 내에서 65℃로 15분간 3회 세척되었다. 막은-70℃에서 오버나이트로 X-레이 필름에 노출되었다.

결과는 도 9(카네이션) 및 도 16(아라비돕시스; 레인 1, 1일 처리; 레인 2, 2일 처리; 레인 3, 3일 처리)에 나타나 있다. 나타나 바와 같이 카네이션 리파제 및 아라비돕시스 리파제의 전사는 에틸렌에 의해 꽃 및/또는 잎 내에서 유도된다.

(실시예 3)

카네이션 리파제 프라이머를 이용한 토마토 PCR 생성물의 생성

토마토 잎으로부터 수득된 토마토 게놈 DNA로부터의 일부 길이 노화-유도된 리파제 서열이 카네이션 노화-유도된 리파제 서열로부터 고안된 한쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 네스티드(nested) PCR에 의해 생성되었다. 5' 프라이머는 서열 5'- CTCTAGACTATGAGTGGGT(서열번호: 7)을 지닌 19-mer이고; 3' 프라이머는 서열 CGACTGGCACAACCTCCA - 3'(서열번호: 8)를 지닌 18-mer이다. 게놈 토마토 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄 반응이 하기와 같이 수행되었다 :

반응 구성성분 :

게놈 DNA 100ng

dNTP (각각 10mM) 1㎕

MgCl2 (5mM) + 10x 완충액 5㎕

프라이머 1 및 2 (각각 20㎕) 0.5㎕

Taq DNA 중합효소 1.25㎕

반응 부피 50㎕

반응 파라미터 :

3분간 94℃

45 사이클 동안 94℃/1분, 48℃/1분, 72℃/2분, 15분간 72℃

PCR에 의해 수득된 토마토 일부 길이 서열은 뉴클레오타이드 서열, 서열번호: 6(도 10) 및 도 10에 나타난 바와 같이 추론된 아미노산 서열을 지닌다. 일부 길이 서열은 2개의 코딩 서열 사이에 산재된 인트론(도 10, 하위 케이스 문자)을 함유한다. 토마토 서열은 보존된 리파제 컨센서스 서열, ITFTGHSLGA(서열번호: 3)을 함유한다.

토마토 서열은 카네이션 노화-유도된 리파제 서열과의 53.4% 및 아라비돕시스 리파제와의 43.5%의 서열 동일성을 지니고, 후자는 카네이션 서열과 44.3% 서열 동일성을 지닌다.

(실시예 4)

토마토 식물 내의 세포막 보전 상의 칠링 효과

토마토 식물은 7∼8℃에서 48시간 동안 칠드되었고, 이후 24시간 동안 상온으로 다시 돌려졌다. 잎의 칠링 효과는 전해질 누출량(μMhos)을 측정함으로서 평가되었다.

특히 1g의 잎 조직은 50ml 튜브 내로 절단되었고, 증류수로 빠르게-린스되었고, 40ml의 탈이온화된 물이 첨가되었다. 튜브는 마개로 막아졌고, 상온에서 24시간 동안 회전되었다. 전해질 누출을 반영하는 전도성(μMhos) 판독은 대조군과 냉기-손상된 잎 조직에 대해 6시간과 24시간 간격으로 취해졌다. 도 11로부터 냉기-손상된 잎 조직에서 다시 데워지는 기간 동안 막 손상을 반영하는 전해질 누출이 초래됨이 명백해졌다.

칠드된 토마토 잎으로부터 수득된 RNA의 노던 블럿 분석

총 RNA가 15g의 칠드되지 않은 토마토 식물(대조군)과 0, 6 및 24시간 동안 상온으로 다시 돌려진 칠드된 토마토 식물로부터 분리되었다. RNA 추출은 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되었다. 각 표본으로부터의 10㎍의 RNA가 1.2%의 변성 포름알데히드 겔 상에서 분리되었고, 나일론막으로 옮겨졌다. 막은³²P-dCTP-표지된 프로브(서열번호: 3)로 프로브되었고, 이후 실시예 3에 기술된 바와 같은 동일한 조건하에서 세척되었다. 결과는 도 12에 나타나 있다.

방사능사진으로부터 나타난 바와 같이(도 12b) 토마토 리파제 유전자 발현은 칠링에 의해 유도되고, 유전자 유도의 패턴은 냉기-손상된 잎 내의 증가된 전해질과 상관관계가 있다(도 11).

(실시예 5)

안티센스 방향으로 노화-유도된 리파제 유전자를 발현하는 형질전환 식물의 생성

아그로박테리아는 이중 35S 프로모터의 조절하에서 안티센스 방향으로 발현된 전체-길이 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 유전자를 함유한 이원 벡터, pKYLX71로 형질전환되었다. 아라비돕시스 식물은 진공 여과에 의해 이들 아그로박테리아로 형질전환되었고, 결과적인 T₀식물로부터의 형질전환 종자가 암피실린(ampicillin) 상에서 선택되었다.

T₁식물은 야생형 아라비돕시스 식물과 함께 비닐하우스 조건하에서 생장되었다. 형질전환 식물과 야생형 식물 사이의 잎 크기, 전체 식물 크기, 종장 산출량 및 잎 노화의 차이가 시간별로 관찰되었다. 차이는 도 17, 18, 19 및 20에 나타나 있다.

(실시예 6)

형질전환 식물 내의 감소된 노화-유도된 리파제 생산

4주령 아라비돕시스 야생형 및 실시예 5에서 제조된 상응하는 형질전환 식물의 잎으로부터 분리된 총 단백질이 나일론막으로 옮겨졌고, 아라비돕시스 노화-유도된 리파제 단백질에 대해 생성된 항체로 프로브되었다. 웨스턴 블럿은 도 21에 나타나 있다(레인 1 및 2는 단백질 9㎍으로 로드되었고, 레인 3 및 4는 단백질 18㎍으로 로드됨). 노화-유도된 리파제의 발현은 형질전환 식물에서 감소되었다.

Claims

낮은 스트린젠시 조건하에서 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 분리된 DNA 분자 또는 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이둘 모두와 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 기능적 유도체
제 1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 서열번호: 1의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 분리된 DNA 분자
제 1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 서열번호: 4의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 분리된 DNA 분자
제 1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 서열번호: 18의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 분리된 DNA 분자
낮은 스트린젠시 조건하에서 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 분리된 노화-유도된 리파제 또는 노화-유도된 리파제의 기능적 유도체
제 5항에 있어서, 상기 리파제는 서열번호: 2 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 노화-유도된 리파제
(a) 낮은 스트린젠시 조건 하에서 (1) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (2) 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(b) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 형질전화된 식물 세포 내에서 발현되도록 하는 조절 서열로

구성된 식물 세포의 형질전환을 위한 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 구역으로 구성됨을 특징으로 하는 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 식물 조직-특이적 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 노화-유도된 식물 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 바이러스성 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 벡터
제 7항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터로 구성됨을 특징으로하는 벡터
식물 유전자가 낮은 스트린젠시 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈함을 특징으로 하는, 식물 노화-유도된 리파제 유전자의 RNA 전사체의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 RNA 서열를 인코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 약 6∼100 뉴클레오타이드로 구성됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자의 코딩 구역은 서열번호: 1의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자의 코딩 구역은 서열번호: 18의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자는 카네이션 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자는 아라비돕시스 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자는 토마토 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 식물 유전자는 깍지콩 유전자임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
제 14항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 전사체의 5'-비-코딩 구역의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드
(a) 낮은 스트린젠시 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자; 및

(b) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 형질전화된 식물 세포 내에서 발현되도록 하는 조절 서열로

구성된 벡터
제 23항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포
제 7항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포
제 7항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포로부터 생성된 식물 및 그의 자손
제 26항에 따른 식물, 식물 부분 또는 식물 자손
(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도된 리파제 유전자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 발현되게 하는 조절 서열로 구성된

벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하여, 상기 노화-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

식물 내에서의 내생적 노화-유도된 리파제의 발현을 억제하는 방법
제 28항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 상기 DNA의 상응하는 부분 또는 RNA의 상응하는 부분은 5'-비-코딩서열로 구성됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 억제는 식물의 변화된 노화를 초래함을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 환경적 스트레스-유도된 노화에 대한 증가된 저항성을 초래함을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 증가된 생물량을 초래함을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물 내에서 증가된 종자 산출량을 초래함을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 식물에서 활성적인 구성적 프로모터로구성됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 이중 35S 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 식물 내에서 활성적인 조직 특이적 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 식물 내에서 활성적인 노화-유도된 프로모터로 구성됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 식물은 열매를 지닌 식물, 개화 식물, 채소, 농작식물 및 산림종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 식물은 토마토임을 특징으로 하는 방법
제 28항에 있어서, 상기 식물은 카네이션임을 특징으로 하는 방법
(1) (A) 낮은 스트린젠시 조건하에서 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이둘 모두와 하이브리다이즈하는 외생적 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 분리된 DNA 분자 또는 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이둘 모두와 하이브리다이즈하는 분리된 DNA 분자의 기능적 유도체 ; 및

(B) DNA 분자에 실시가능하게 연결되어 인코드된 외생적 노화-유도된 리파제가 발현되게 하는 조절 서열로 구성된

벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 DNA 분자가 과발현되고 내생적 노화-유도된 리파제 유전자 또는 유전자들이 외생적 노화-유도된 리파제에 의해 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

식물 세포 내에서의 내생적 노화-유도된 리파제 유전자 또는 유전자들의 발현을 억제하는 방법
제 41항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터로 구성됨을 특징으로하는 방법
(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도된 리파제 유전자에 의해 인코드된 RNA 서열의 적어도 일부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 발현되게 하는 조절 서열로 구성된

벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하여, 상기 노화-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

식물 내에서의 연령-관련된 노화 및 환경적 스트레스-관련된 노화를 변화시키는 방법
제 7항에 따른 벡터로 구성된 형질전환 식물 세포
제 23항에 따른 벡터로 구성된 형질전환 식물 세포
원핵세포성 숙주 내에서 기능적인 복제 시스템 및 제 14항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로 구성된 플라스미드
아크로박테리움 내에서 기능적인 복제 시스템 및 제 14항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로 구성된 플라스미드
상기 식물은 제 7항에 따른 벡터로 구성되고, 노화-유도된 리파제의 억제되거나 감소된 발현을 지닌 세포로부터 유도됨을 특징으로 하는 식물 및 그의 자손
(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 노화-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 노화-유도된 리파제 유전자에 의해 인코드된 RNA 서열의 상응하는 부분 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결되어 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 발현되게 하는 조절 서열로 구성된

벡터를 세포의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하여, 상기 노화-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 세포를 생장시킴

으로서 생성되고, 노화-유도된 리파제의 억제되거나 감소된 발현을 지닌 세포로부터 유도됨을 특징으로 하는 식물 또는 그의 자손
상기 식물은 토마토임을 특징으로 하는 제 49항에 따른 식물 및 자손
상기 식물은 카네이션임을 특징으로 하는 제49항에 따른 식물 및 자손
(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 숙성-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 숙성-유도된 리파제 유전자를 인코딩하는 DNA로부터 전사된 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결된 조절 서열로 구성된

벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하여, 상기 숙성-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

종자 숙성을 억제하는 방법
(1) (A) (ⅰ) 서열번호: 1, 서열번호: 18 또는 이 둘 모두와 하이브리다이즈하는 내성적 숙성-유도된 리파제를 인코딩하는 DNA 분자의 하나의 스트랜드의 상응하는 부분 또는 (ⅱ) 내생적 숙성-유도된 리파제 유전자를 인코딩하는 DNA로부터 전사된 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드 서열 ; 및

(B) 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결된 조절 서열로 구성된

벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키고 ;

(2) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열이 전사되고 상기 RNA 서열에 결합하여, 상기 숙성-유도된 리파제 유전자의 발현이 억제되도록 상기 식물을 생장시키는 것으로 구성된

종자 산출량을 증가시키는 방법