EA014985B1

EA014985B1 - Способ ферментативного рафинирования пищевых масел гидратацией и применение липидацилтрансферазы для осуществления способа

Info

Publication number: EA014985B1
Application number: EA200700040A
Authority: EA
Inventors: Йорн Борк Сое; Марк Тёрнер
Original assignee: Даниско А/С
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2011-04-29
Also published as: US20120064192A1; EP1791933A1; AU2005264077B2; AU2010214723A1; WO2006008653A3; US8535900B2; JP2008506381A; CN102533440A; NZ551378A; JP5604032B2; AU2010214721B2; DK1791933T3; CN102277231A; AU2005263954A1; US8927036B2; CN101818177A; US20110086131A1; EA200700040A1; MX2007000626A; PL1776455T3

Abstract

Изобретение относится к способу ферментативного рафинирования гидратацией пищевых масел, заключающемуся в обработке пищевого масла липидацилтрансферазой для того, чтобы перенести ацильную группу с основной части фосфолипида на один или более акцепторов ацила, в котором акцептор ацила представляет собой один или более стеринов и/или станолов и в котором липидацилтрансфераза отличается следующим: (а) липидацилтрансфераза обладает активностью ацилтрансферазы, которую определяют как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной сложно-эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового сложного эфира; и (б) фермент включает мотив последовательности аминокислот GDSX, в котором X представляет собой один или более из следующих остатков аминокислот: L, А, V, I, F, Y, H, Q, T, N, М или S, причем липидацилтрансфераза при сравнительном анализе первичной структуры либо с консенсусной последовательностью SEQ ID NO:2, либо с SEQ ID NO:37, либо с обеими указанными последовательностями включает блок GANDY. Кроме того, в изобретении раскрыто применение указанной липидацилтрансферазы для осуществления способа.

Description

Ссылка на родственные заявки

Делают ссылку на следующие родственные заявки: заявка США № 09/750990, поданная 20 июля 1999 г., заявка США № 10/409391, №0 2004/064537, №0 2004/064987, РСТ/1В 2004/004378 и РСТ/1В 2004/004374. Каждая из данных заявок и каждый из документов, приведенных в каждой из данных заявок (документы, приведенные в заявке), и каждый документ, на который ссылаются или приводят в документах, приведенных в заявке, как в тексте, так и во время ведения дела по данным заявкам, а также все аргументы в поддержку патентоспособности, выдвигаемые во время данного ведения дела, включены таким образом в данном контексте в виде ссылки. В данном тексте также приведены различные документы (документы, приведенные в данном контексте). Каждый из приведенных в данном контексте документов и каждый документ, приведенный или на который ссылаются в данном контексте, включены таким образом в данном контексте в виде ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного рафинирования пищевых масел гидратацией с использованием липидацилтрансферазы.

Кроме того, настоящее изобретение далее относится к применению липидацилтрансферазы для рафинирования пищевых масел гидратацией.

Предшествующий уровень техники

Традиционно для рафинирования масла гидратацией использовали два способа, которые представляют собой способы физического рафинирования гидратацией и химического рафинирования гидратацией. Ранее в 1990-е годы был разработан ферментативный способ рафинирования гидратацией на основе использования фосфолипазы поджелудочной железы. Поскольку данный фермент некошерный, фосфолипазу со временем заменили микробной фосфолипазой А1 (Ьесйахе ИИта™ - Νονοζνιηοδ. Дания). Ферментативный способ имеет некоторые преимущества относительно химического или физического способов рафинирования гидратацией, включая снижение себестоимости, повышенный выход и процесс, более благоприятный для окружающей среды.

Краткое изложение аспектов настоящего изобретения

Термин липидацилтрансфераза, как используют в данном контексте, означает фермент, который обладает активностью ацилтрансферазы (как правило, классифицируемой как Е.С. 2.3.1.x), причем фермент, который способен переносить ацильную группу с липида на один или более акцепторных субстратов, таких как один или более из следующих: стерин, станол, углевод, белок, белковая субъединица, глицерин, предпочтительно стерин и/или станол.

Фермент липидацилтрансфераза, представленный в настоящем изобретении или предназначенный для использования в способах и/или вариантах применения настоящего изобретения, может быть охарактеризован с помощью следующих критериев:

(ΐ) фермент обладает активностью ацилтрансферазы, которую можно определить как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового сложного эфира; и (й) фермент включает мотив последовательности аминокислот ΟΌ8Χ, в котором X означает один или более следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8, причем липидацилтрансфераза при сравнительном анализе первичной структуры с консенсусной последовательностью либо 8ЕО Ш N0: 2, либо 8ЕС Ш N0: 37, либо с обеими указанными последовательностями включает блок ΟΑΝΏΥ.

Предпочтительно, когда X мотива ΟΌ8Χ представляет собой Ь или Υ. Более предпочтительно, когда X мотива ΟΌ8Χ представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно, когда фермент, представленный в настоящем изобретении, включает мотив последовательности аминокислот СО8Б.

Мотив ΟΌ8Χ состоит из четырех консервативных аминокислот. Предпочтительно, когда серин в мотиве представляет собой каталитический серин фермента липидацилтрансферазы. Соответственно серин мотива ΟΌ8Χ может находиться в положении, соответствующем 8ег16 в липолитическом ферменте Аеготопах йубторййа, описанном в статье Втишйк & Виск1еу (1оитпа1 оГ Вас1етю1оду Арг. 1996, ν. 178, №. 7, р. 2060-2064).

Для того чтобы определить, включает ли белок мотив ΟΌ8Χ, представленный в настоящем изобретении, последовательность сравнивают с профилями скрытой модели Маркова (профилями НММ) базы данных рГат согласно методам, описанным в заявке №0 2004/064537 или №0 2004/064987.

РГат является базой данных семейств белковых доменов и включает скорректированные элайнменты множества последовательностей для каждого семейства, а также профили скрытых моделей Маркова (профиль НММх) для идентификации данных доменов в новых последовательностях. Введение в рГат можно найти в статье Ва1ешап А. е1 а1. (2002), №с1е1с Аабх Вех. 30; 276-280. Скрытые модели Маркова используют в ряде баз данных, целью которых является классификация белков, в качестве обзора см. статью Ва1ешап А. апб Най Ό.Η. (2002), ВпеГ ВюшРотш, 3; 236-245.

1Шр://\\л\лу.псЫ.п11п.т11.8о\7еп1п^/с.|ие1у.Гсщ?с1пб=Ве1пе\'е&бЬ=РиЬМеб&Нх1_шбх=12230032&бор1 = Реферат.

1Шр://\\л\лу.псЫ.п11п.т11.8о\7еп1п^/с.|иегу .ГсД?стб=Ве1пе\'е&бЬ=РиЬМеб&Нх1_шбх= 11752314&бор1 =

- 1 014985

Реферат.

В плане подробного объяснения скрытых моделей Маркова и того, как их применяют в базе данных рГат, см. монографию ОигЫп В., Еббу 8. апб КгодП А. (1998), Βίοίο^ίοαΐ 5сс.|испес аиа1у818; ртоЬаЬШШс тобек оГ рто1еш8 апб иис1е1с аабк. СатЬгйдс Ишуегайу Ргс55. Ι8ΒΝ 0-521-62041-4. Пакет программ Наттег можно получить в ХАа^ипдЮп итуегайу, 81. Ьоик, И8А.

Альтернативно, мотив ΟΏ8Χ можно идентифицировать с использованием пакета программ Наттег 5оП\гаге раскаде, инструкции представлены в монографии ОигЬт В., Еббу 8. апб КгодП А. (1998), Вю1одюа1 5ес.|иепсе апаЕтк; ртоЬаЬйкйс тобек оГ рто1еш8 апб пис1е1с ас1б§. СатЬпбде ип1уег8Йу Ргекк, Ι8ΒΝ 0-521-62041-4 и в ссылках в данной работе, и профиль НММЕВ2 приведен в данном описании.

К базе данных рГат можно получить доступ, например, через ряд серверов, которые в настоящее время находятся на следующих веб-сайтах:

й11р://^^^.8аиде^.ас.ик/8οй^а^е/рГат/^ибеx.8Й1т1;

1Шр://рГат.\\п511.еби/;

1Шр://рГат.)оиу.тга.Гг/;

111р://рГат. сдЬ.ккке/.

База данных обеспечивает возможность поиска, при котором можно войти в последовательность белка. Используя заданные по умолчанию параметры базы данных, затем анализируют последовательность белка на присутствие доменов рГат. Домен ΟΏ8Χ является широко известным доменом в базе данных, и вследствие этого его присутствие будет распознано в любой запрашиваемой последовательности. База данных даст ответ относительно сравнительного анализа консенсусной последовательности рГат00657 с запрашиваемой последовательностью.

Фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения изобретения, может быть подвергнут сравнительному анализу с использованием консенсусной последовательности рГат00657 (в плане полного объяснения см. заявку XVО 2004/064537 или АО 2004/064987).

Предпочтительно, когда положительное соответствие с профилем скрытой модели Маркова (профиль НММ) семейства домена рГат00657 указывает на присутствие домена СО8Б или ΟΏ8Χ, соответствующего настоящему изобретению.

Предпочтительно, когда остатки мотива ΟΑΝΏΥ выбраны из ΟΑΝΏΥ, ΟΟΝΏΑ, ΟΟΝΏΕ, наиболее предпочтительно ΟΑΝΏΥ.

Предпочтительно, когда подвергнутый сравнительному анализу с консенсусной последовательностью рГат00657 фермент, предназначенный для использования в способах и вариантах применения изобретения, имеет по меньшей мере 1, предпочтительно более чем 1, предпочтительно более чем 2, предпочтительно более чем 3, предпочтительно более чем 4, предпочтительно более чем 5, предпочтительно более чем 6, предпочтительно более чем 7, предпочтительно более чем 8, предпочтительно более чем 9, предпочтительно более чем 10, предпочтительно более чем 11, предпочтительно более чем 12, предпочтительно более чем 13, предпочтительно более чем 14 следующих остатков аминокислот по сравнению с эталонной полипептидной последовательностью А.йубторЫйа, а именно: 8ЕО ΙΏ ΝΟ: 1: Н1б28, Н1б29, Н1б30, Н1б31, О1у32, Аяр33, 8ег34, Н1б35, Н1б130, О1у131, Н1б132, А8п133, Аяр134, Н1б135, Нк309.

Домен рГат00657 ΟΏ8Χ является уникальным идентификатором, который отличает белки, имеющие данный домен, от других ферментов.

Консенсусная последовательность рГат00657 представлена на фиг. 12 как 8ЕО ΙΏ ΝΟ: 2. Она получена при идентификации семейства рГат 00657, база данных уегаюп 6, которая также может быть обозначена в данном контексте как рГат00657.6.

Консенсусную последовательность можно обновить, используя следующие выпуски базы данных рГат (см., например, заявки АО 2004/064537 или АО 2004/064987).

Присутствие блока ΟΛΝΩΥ обнаруживают в семействе 00657 рГат из обоих выпусков базы данных. Дальнейшие выпуски базы данных рГат можно использовать для идентификации семейства 00657 рГат.

В одном варианте осуществления фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения изобретения, может быть охарактеризован с использованием следующих критериев:

(ί) фермент обладает активностью ацилтрансферазы, которую можно определить как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового эфира;

(ίί) фермент включает мотив последовательности аминокислот ΟΏ8Χ, в котором X означает один или более следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, I, Е, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8;

(ш) фермент включает Нк309 или включает остаток гистидина в положении, соответствующем Нк309 в ферменте липидацилтрансферазе Аетошопак ПубгорПИа, показанном на фиг. 11 и 13 (8ЕО ΙΏ 1 или 8ЕО ΙΏ 3).

- 2 014985

Предпочтительно, когда остатком аминокислоты мотива ΟΌ8Χ является Ь.

В 8ЕО ΙΌ N0: 3 или 8Е0 ΙΌ N0: 1 первые 18 остатков аминокислот образуют сигнальную последовательность. Ηίκ309 последовательности полной длины, которая представляет собой белок, включающий сигнальную последовательность, приравнивают к Ηίκ291 зрелой части белка, т.е. последовательности без сигнальной последовательности.

В одном варианте осуществления фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, включает следующую каталитическую триаду: 8ет34, Акр134 и Ηίκ309 или содержит остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина соответственно в положениях, соответствующих 8ет34, Акр134 и Ηίκ309 в ферменте липидацилтрансферазе Аеготопак ЬубторЫ1а, представленном на фиг. 13 (8Е0 ΙΌ N0: 3) или фиг. 11 (8Е0 ΙΌ N0: 1). Как определено выше, в последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8 ЕС ΙΌ N0: 1, первые 18 остатков аминокислот образуют сигнальную последовательность. 8ет34, Акр134 и Ηίκ309 последовательности полной длины, которая представляет собой белок, включающий сигнальную последовательность, приравнивают к 8ет16, Акр116 и Ηίκ291 зрелой части белка, т.е. последовательности без сигнальной последовательности. В консенсусной последовательности рЕат00657, как приводят на фиг. 12 (8Е0 ΙΌ N0: 2), остатки активного центра соответствуют 8ет7, Акр157 и Ηίκ348.

В одном варианте осуществления фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, можно охарактеризовать, используя следующие критерии:

(ί) фермент обладает активностью ацилтрансферазы, которую можно определить как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной эфирной связи первого липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового эфира;

(и) фермент включает, по меньшей мере, С1у32, Акр33, 8ет34, Акр134 и Ηίκ309 или содержит остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих С1у32, Акр33, 8ет34, Акр 134 и Ηίκ309 соответственно, в ферменте липидацилтрансферазе Аеготопак ЬубторЫ1а, приведенном на фиг. 13 (8Е0 ΙΌ N0: 3) или фиг. 11 (8Е0 ΙΌ N0: 1).

Соответственно фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, включает одну или более следующих последовательностей аминокислот:

(ί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 3 (см. фиг. 13);

(ίί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 4 (см. фиг. 14);

(ш) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 5 (см. фиг. 15);

(ίν) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 6 (см. фиг. 16);

(ν) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 7 (см. фиг. 17);

(νί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 8 (см. фиг. 18);

(νίί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 9 (см. фиг. 19); (νίίί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 10 (см. фиг. 20); (ίχ) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 11 (см. фиг. 21); (х) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 12 (см. фиг. 22); (χί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 13 (см. фиг. 23); (χίί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 14 (см. фиг. 24); (χίίί) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 1 (см. фиг. 11); (χίν) последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 15 (см. фиг. 25) или последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 75% или более с любой из последовательностей, показанных как 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 3, 8ЕС ΙΌ N0: 4, 8ЕС ΙΌ N0: 5, 8 ЕС) ΙΌ N0: 6, 8 ЕС) ΙΌ N0: 7, 8 ЕС) ΙΌ N0: 8, 8 ЕС) ΙΌ N0: 9, 8 ЕС) ΙΌ N0: 10, 8 ЕС) ΙΌ N0: 11, 8ЕС) ΙΌ N0: 12, 8ЕС) ΙΌ N0: 13, 8ЕС) ΙΌ N0: 14 или 8ЕС) ΙΌ N0: 15.

Соответственно фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, включает либо последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 3, или 8Е0 ΙΌ N0: 4, или 8Е0 ΙΌ N0: 1, или 8Е0 ΙΌ N0: 15, либо включает последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 75% или более, предпочтительно 80% или более, предпочтительно 85% или более, предпочтительно 90% или более, предпочтительно 95% или более с последовательностью аминокислот, показанной как 8 ЕС ΙΌ N0: 3, или последовательностью аминокислот, показанной как 8Е0 ΙΌ N0: 4, или последовательностью аминокислот, показанной как 8Е0 ΙΌ N0: 1, или последовательностью аминокислот, показанной как 8Е0 ΙΌ N0: 15.

Соответственно фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, включает последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более и еще более предпочтительно 95% или более с любой из последовательностей, показанной как 8ЕС) ΙΌ N0: 3, 8ЕС) ΙΌ N0: 4, 8ЕС) ΙΌ N0: 5, 8ЕС) ΙΌ N0: 6, 8ЕС) ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 8, 8ЕС) ΙΌ N0: 9, 8ЕС) ΙΌ N0: 10, 8ЕС) ΙΌ N0: 11, 8ЕС) ΙΌ N0: 12, 8 ЕС) ΙΌ N0: 13, 8ЕС) ΙΌ N0: 14, 8ЕС) ΙΌ N0: 1 или

- 3 014985

8ЕО ΙΌ N0: 15.

(а) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 1-100 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(б) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 101-200 8Е0 Ш N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(в) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 201-300 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8Е0 ΙΌ N0: 1; либо (г) последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более с любой из последовательностей аминокислот, определенных в (а)-(с) выше.

(а) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 28-39 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(б) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 77-88 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(в) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 126-136 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(г) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 163-175 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(д) последовательность аминокислот, показанную как остатки аминокислот 304-311 8Е0 Ш N0: 3 или 8Е0 ΙΌ N0: 1; или (е) последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более с любой из последовательностей аминокислот, определенных в (а)-(е) выше.

В одном аспекте липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой липидацилтрансферазу из СаиФба рагар8110818, как описано в заявке ЕР 1275711. Таким образом, в одном аспекте липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способе и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую одну из последовательностей аминокислот, описанных в 8Е0 ΙΌ N0: 17 (см. фиг. 28) или 8Е0 ΙΌ N0: 18 (см. фиг. 29).

Более предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способе и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 16 (см. фиг. 10), или последовательность аминокислот, которая имеет идентичность 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 98% или более либо еще более предпочтительно 99% или более с 8Е0 ΙΌ N0: 16. Данный фермент можно рассматривать как вариант фермента.

В одном аспекте липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способе и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой лецитин: холестеринацилтрансферазу (ЬСАТ) или ее вариант (например, вариант, полученный путем молекулярной эволюции).

Подходящие ЬСАТ известны в области техники, и их можно получить из одного или более следующих организмов, например млекопитающих, крыс, мышей, кур, ЭгокорЕйа те1аиода81ег, растений, в том числе АгаЫборкщ и 0гу/а кайуа, нематод, грибов и дрожжей.

В одном варианте осуществления фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой липидацилтрансферазу, получаемую и предпочтительно полученную из штаммов Е.со11 ТОР 10, несущих рРс112аА11у6го и рРе112аА8а1то, депонированных фирмой Эап15со А/8 о! БапдсЬгодабс 1, ΌΚ-1001, Копенгаген К, Дания, согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ЛСГМВ), 23 81. Масйаг 81гее1, Абердин, Шотландия, ОВ, 22 декабря 2003 г. под регистрационными номерами ШСМВ 41204 и NСIМВ 41205 соответственно.

Весьма предпочтительные липидацилтрансферазы, предназначенные для использования в способах, предложенных в настоящем изобретении, включают выделенные из Аеготопак крр., предпочтительно Аеготопак йу6горЫ1а или А.8а1тошс16а, наиболее предпочтительно А.8а1тошс16а. Наиболее предпочтительные липидацилтрансферазы, предназначенные для применения в настоящем изобретении, кодируются 8Е0 Ш N0: 1, 3, 4, 15, 16. Компетентный специалист признает, что предпочтительно, чтобы сигнальные пептиды ацилтрансферазы отщеплялись в процессе экспрессии трансферазы. Сигнальный пептид

- 4 014985

8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 3, 4, 15 и 16 представляет собой аминокислоты 1-18. Вследствие этого наиболее предпочтительными участками являются аминокислоты 19-335 для 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 (Л.йубгорЫНа) и аминокислоты 19-336 для 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 8ЕЦ ΙΌ N0: 15 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 16. (Л.8а1тошс16а). При использовании для определения гомологии или идентичности последовательностей аминокислот предпочтительно, чтобы при сравнительном анализе, как описано в данном контексте, использовали зрелую последовательность.

Вследствие этого наиболее предпочтительными участками для определения гомологии (идентичности) являются аминокислоты 19-335 для 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 3 (Л.йубгорйШа) и аминокислоты 19-336 для 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 15 и 16. (Л.8а1тошсИа). 8ЕЦ ΙΌ N0: 34 и 35 являются последовательностями зрелого белка весьма предпочтительных липидацилтрансфераз из Л.йубгорйШа и Л.8а1тошс16а соответственно.

Липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в изобретении, может быть также выделена из ТйеттоЫМа, предпочтительно Т.Гикса, наиболее предпочтительной является кодируемая 8ЕО ΙΌ N0: 28.

Липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в изобретении, может быть также выделена из 81тер1отусе8, предпочтительно З.ауеттйтк, наиболее предпочтительной является кодируемая 8Е0 ΙΌ N0: 32. Другие возможные ферменты из 81тер1отусе8, предназначенные для использования в настоящем изобретении, включают кодируемые 8ЕЦ ΙΌ N0: 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31, 33. Примеры показывают, что фермент, кодируемый 8ЕЦ ΙΌ N0: 33, высокоэффективен при ферментативном рафинировании гидратацией.

Фермент, предназначенный для использования в изобретении, может быть также выделен из СотуиеЬас1егшт, предпочтительно С.еГДшеик, наиболее предпочтительным является кодируемый 8ЕО ΙΌ N0: 29.

Соответственно липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую любую из последовательностей аминокислот, показанную как 8Е0 ΙΌ N0: 37, 38, 40, 41, 43, 45 или 47, либо последовательность аминокислот, которая идентична указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% или кодируется любой из нуклеотидных последовательностей, показанных как 8Е0 ΙΌ N0: 36, 39, 42, 44, 46 или 48, либо нуклеотидными последовательностями, которые идентичны указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%.

Предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, представляет собой липидацилтрансферазу, способную гидролизовать, по меньшей мере, галактолипиды и/или способную переносить ацильную группу, по меньшей мере, из галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем получаемый фермент предпочтительно получен из 81гер1отусе8 креаек.

В одном варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой липидацилтрансферазу, способную гидролизовать, по меньшей мере, галактолипиды и/или способную переносить ацильную группу, по меньшей мере, из галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем фермент кодируется нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из:

(а) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ N0: 36;

(б) нуклеиновой кислоты, которая является родственной нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 36 вследствие вырождения генетического кода, и (в) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 70% с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 36.

В одном варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 37, или последовательность аминокислот, которая идентична ей по меньшей мере на 60%.

В другом варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой липидацилтрансферазу, способную гидролизовать, по меньшей мере, галактолипид и/или способную переносить ацильную группу, по меньшей мере, с галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем фермент включает последовательность аминокислот, как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 37, или последовательность аминокислот, которая идентична ей по меньшей мере на 60%.

Предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, представляет собой липидацилтрансферазу, способную гидролизовать, по меньшей мере, галактолипиды, и/или способна переносить ацильную группу, по меньшей мере, с галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем получаемый фермент предпочтительно получен из ТйеттоЬйИа крешек, предпочтительно

- 5 014985

ТйегтоЬШБа Гикса.

Предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать, по меньшей мере, галактолипиды и/или способный переносить ацильную группу, по меньшей мере, с галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем получаемый фермент предпочтительно получен из СогупеЬас1егшт креаек, предпочтительно СогупеЬаСегшш еГйшепк.

В следующем варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую любую из последовательностей аминокислот, показанных как 8Еф ΙΌ N0: 37, 38, 40, 41, 43, 45 или 47, или последовательность аминокислот, которая идентична указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%, либо кодируемую любой из нуклеотидных последовательностей, показанных как 8Еф ΙΌ N0: 39, 42, 44, 46 или 48, либо нуклеотидной последовательностью, которая идентична указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%.

В следующем варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую любую из последовательностей аминокислот, показанную как 8Еф ΙΌ N0: 38, 40, 41, 45 или 47, либо последовательность аминокислот, которая идентична указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%, предназначенную для вариантов применения, описанных в данном контексте.

В следующем варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую любую из последовательностей аминокислот, показанную как 8Еф ΙΌ N0: 38, 40 или 47, либо последовательность аминокислот, которая идентична указанным по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%, предназначенную для вариантов применения, описанных в данном контексте.

Более предпочтительно, когда в одном варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, показанную как 8Еф ΙΌ N0: 47, или последовательность аминокислот, которая идентична указанной по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%.

В другом варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, показанную как 8Еф ΙΌ N0: 43 или 44, либо последовательность аминокислот, которая идентична указанным по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%.

В другом варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, показанную как 8Еф Ш N0: 41, или последовательность аминокислот, которая идентична указанной по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%.

В одном варианте осуществления липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, может представлять собой липидацилтрансферазу, способную гидролизовать, по меньшей мере, галактолипиды и/или способную переносить ацильную группу, по меньшей мере, с галактолипида на один или более субстратов акцептора ацила, причем фермент кодируется нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из:

а) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, показанную в 81+) ΙΌ N0: 36;

б) нуклеиновой кислоты, которая является родственной нуклеотидной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 36 вследствие вырождения генетического кода; и

в) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 70% с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Еф ΙΌ N0: 36.

В одном варианте осуществления липидацилтрансфераза, соответствующая настоящему изобретению, может представлять собой получаемую липидацилтрансферазу, предпочтительно полученную из штаммов 8йер1отусе5 Ь130 или Ь131, депонированных фирмой Эапйсо А/8 оГ БапдеЬгодаБе 1, ΌΚ-1001 Копенгаген К, Дания согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ЦШМВ), 23 81. Масйаг 8(гее(, Абердин, Шотландия, СВ, 25 июня 2004 г. под регистрационными номерами NСIМВ 41226 и NСIМВ 41227 соответственно.

- 6 014985

Подходящие липидацилтрансферазы, предназначенные для использования в соответствии с настоящим изобретением и/или в способах, представленных в настоящем изобретении, могут включать любую из следующих последовательностей аминокислот и/или кодироваться следующими нуклеотидными последовательностями:

полинуклеотидом, кодирующим липидацилтрансферазу, соответствующую настоящему изобретению (8ЕС ΙΌ N0: 16);

последовательностью аминокислот липидацилтрансферазы, соответствующей настоящему изобретению (8Е0 ΙΌ N0: 17).

Подходящий фермент липидацилтрансфераза, предназначенный для использования в способах, соответствующих изобретению, можно также идентифицировать посредством элайнмента с последовательностью Ь131 (8Е0 ΙΌ N0: 37) с помощью Айдп X, алгоритма попарного элайнмента С1ийа1 V Уее1ог№П при использовании установок, заданных по умолчанию.

Сравнительный анализ Ь131 и гомологов из 8.ауегтй11щ и Т.Гшеа иллюстрирует консервацию мотива 0Ό8Χ (0Ό8Υ в Ь131, а также 8.ауегтй11щ и Т.Гикеа), бокса ΟΑΝΏΥ, который представляет собой либо ΟΟΝΌΑ, либо ΟΟΝΏΕ (является, как считают, консервативным каталитическим гистидином). Данные три консервативных блока выделены на фиг. 61.

Соответственно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах или вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой вариант липидацилтрансферазы, в таком случае фермент можно охарактеризовать тем, что он включает мотив последовательности аминокислот 0Ό8Χ, в котором X означает один или более следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, I, Е, Υ, Η, О. Τ, Ν, М или 8, причем при сравнительном анализе первичной структуры этого фермента с консенсусной последовательностью либо 8Е0 ΙΌ N0: 2, либо 8Е0 ΙΌ N0: 37, либо с обеими указанными последовательностями включает блок СΑN^Υ. Этот вариант фермента может включать одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в любом из одного или более остатков аминокислот, определенных в группе 2, или группе 4, или группе 6, или группе 7 (определено ниже).

Например, вариант фермента липидацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, можно охарактеризовать тем, что фермент включает мотив последовательности аминокислот 0Ό8Χ, в которой X означает один или более следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, Ι, Е, Υ, Η, О, Τ, N М или 8, причем вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в любом из одного или более остатков аминокислот, подробно описанных в группе 2, или группе 4, или группе 6, или группе 7 (определено ниже), идентифицированных с помощью указанной исходной последовательности, подвергнутой сравнительному анализу структуры со структурной моделью Р10480, определенной в данном контексте, которая предпочтительно получена путем структурного элайнмента координат кристаллической структуры Р10480 с ПУКРЭВ и/или 1ΌΕ0.ΡΌΒ, как представлено в данном контексте. В следующем варианте осуществления вариант фермента липидацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, можно охарактеризовать тем, что фермент включает мотив последовательности аминокислот 0Ό8Χ, в которой X означает один или более следующих остатков аминокислот: Ь, Α, V, Ι, Е, Υ, Η, О, Τ, N М или 8, причем вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в любом из одного или более остатков аминокислот, описанного в группе 2, идентифицированных при структурном анализе исходной последовательности с консенсусной последовательностью рГат (8Е0 ΙΌ N0: 2 - фиг. 12) и модифицированных согласно структурной модели Р10480, чтобы обеспечить наилучшим образом соответствующее перекрывание (см. фиг. 30), как описано в данном контексте.

Соответственно вариант фермента липидацилтрансферазы может включать последовательность аминокислот, которая показана как 8Е0 ΙΌ N0: 34, 8ЕС ΙΌ N0: 3, 8ЕС ΙΌ N0: 4, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8 ЕС) ΙΌ N0: 6, 8 ЕС) ΙΌ N0: 7, 8 ЕС) ΙΌ N0: 8, 8 ЕС) ΙΌ N0: 19, 8 ЕС) ΙΌ N0: 10, 8 ЕС) ΙΌ N0: 11, 8 ЕС) ΙΌ N0: 12, 8 ЕС) ΙΌ N0: 13, 8 ЕС) ΙΌ N0: 14, 8 ЕС) ΙΌ N0: 1, 8 ЕС) ΙΌ N0: 15, 8 ЕС) ΙΌ N0: 25, 8ЕС) ΙΌ N0: 26, 8ЕС) ΙΌ N0: 27, 8ЕС) ΙΌ N0: 28, 8ЕС) ΙΌ N0: 29, 8ЕС) ΙΌ N0: 30, 8ЕС) ΙΌ N0: 32 или 8Е0 ΙΌ N0: 33, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом одном или более остатков аминокислот, определенных в группе 2, или группе 4, или группе 6, или группе 7 (определенных ниже), идентифицированных с помощью элайнмента последовательности с 8Е0 ΙΌ N0: 34.

Альтернативно, вариант фермента липидацилтрансферазы может представлять собой вариант фермента, включающий последовательность аминокислот, которая показана как 8ЕС ΙΌ N0: 34, 8ЕС) ΙΌ N0: 3, 8ЕС) ΙΌ N0: 4, 8ЕС) ΙΌ N0: 5, 8ЕС) ΙΌ N0: 6, 8ЕС) ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 8, 8ЕС) ΙΌ N0: 19, 8 ЕС) ΙΌ N0: 10, 8 ЕС) ΙΌ N0: 11, 8 ЕС) ΙΌ N0: 12, 8 ЕС) ΙΌ N0: 13, 8 ЕС) ΙΌ N0: 14, 8 ЕС) ΙΌ N0: 1, 8ЕС) ΙΌ N0: 15, 8ЕС) ΙΌ N0: 25, 8ЕС) ΙΌ N0: 26, 8ЕС) ΙΌ N0: 27, 8ЕС) ΙΌ N0: 28, 8ЕС) ΙΌ N0: 29, 8Е0 ΙΌ N0: 30, 8Е0 ΙΌ N0: 32 или 8Е0 ΙΌ N0: 33, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом одном или более остатков аминокислот, определенных в группе 2, или группе 4, или группе 6, или группе 7 (определенных ниже), идентифицированных с помощью указанной исходной последовательности, подвергнутой сравнительному анализу структуры со структурной моделью Р10480,

- 7 014985 определенной в данном контексте, которая предпочтительно получена путем структурного элайнмента координат кристаллической структуры Р10480 с ΙίνΝ.ΡΌΒ и/или 1ΌΕΘ.ΡΌΒ, как представлено в данном контексте.

Альтернативно, вариант фермента липидацилтрансферазы может представлять собой вариант фермента, включающий последовательность аминокислот, которая показана как 8ΕΟ ГО N0: 34, 8ΕΟ ГО N0: 3, 8ΕΟ ГО N0: 4, 8ΕΟ ГО N0: 5, 8ΕΟ ГО N0: 6, 8ΕΟ ГО N0: 7, 8ΕΟ ГО N0: 8, 8ΕΟ ГО N0: 19, 8 НО ГО N0: 10, 8 НО ГО N0: 11, 8 НО ГО N0: 12, 8 НЕ) ГО N0: 13, 8 НЕ) ГО N0: 14, 8 НЕ) ГО N0: 1, 8ΕΕ) ГО N0: 15, 8ΕΕ) ГО N0: 25, 8ΕΕ) ГО N0: 26, 8ΕΕ) ГО N0: 27, 8ΕΕ) ГО N0: 28, 8ΕΕ) ГО N0: 29, 8Ε0 ГО N0: 30, 8Ε0 ГО N0: 32 или 8Ε0 ГО N0: 33, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом одном или более остатков аминокислот, определенных в группе 2, идентифицированных при структурном анализе исходной последовательности с консенсусной последовательностью рЕат (8Ε0 ГО N0: 2) и модифицированных согласно структурной модели Р10480, чтобы обеспечить наилучшим образом соответствующее перекрывание (см. фиг. 30), как описано в данном контексте.

Термин модификация, как используют в данном контексте, означает добавление, замену и/или удаление. Предпочтительно, когда термин модификация означает замена.

Чтобы избежать неопределенности при замене аминокислоты в исходном ферменте, ее предпочтительно заменяют аминокислотой, которая отличается от исходно обнаруженной в данном положении в исходном ферменте, чтобы, таким образом, получить вариант фермента. Другими словами, термин замена не предусматривает покрытие замены аминокислоты такой же аминокислотой.

Предпочтительно, когда исходный фермент представляет собой фермент, который включает последовательность аминокислот, показанную как 8Ε0 ГО N0: 34, и/или 8Ε0 ГО N0: 15, и/или 8Ε0 ГО N0: 35.

Предпочтительно, когда вариант фермента представляет собой фермент, который включает последовательность аминокислот, которая показана как 8Ε0 ГО N0: 34 или 8Ε0 ГО N0: 35, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом из одного или более остатков аминокислот, определенных в группе 2, или группе 4, или группе 6, или группе 7.

В одном варианте осуществления предпочтительно, когда вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью по меньшей мере в одном из остатков аминокислот, определенных в группе 4.

Соответственно вариант фермента включает один или более следующих модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом: 83Ε, А, 6, К, Μ, Υ, К, Р, N Т или 6; Ε309Ο. К или А, предпочтительно О или К; -318Υ, Н, 8 или Υ, предпочтительно Υ.

Предпочтительно, когда X мотива 0Ό8Χ представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно, когда исходный фермент включает аминокислотный мотив С08Б.

Предпочтительно, когда способ получения варианта фермента липидацилтрансферазы далее включает одну или более следующих стадий:

1) картирование структурной гомологии или

2) сравнительный анализ гомологии последовательностей.

Соответственно картирование структурной гомологии может включать одну или более следующих стадий:

ί) проведение элайнмента исходной последовательности со структурной моделью (1 ШИРОВ), представленной на фиг. 46;

ίί) выбор одного или более остатков аминокислот в сферической области 10 А, центром которой является центральный атом углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47) (такой как один или более остатков аминокислот, определенных в группе 1 или группе 2); и ϊϊΐ) модификация одной или более аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (и), в указанной исходной последовательности.

В одном варианте осуществления выбранный остаток аминокислоты может находиться в сферической области 9, предпочтительно в сферической области 8, 7, 6, 5, 4 или 3 А, центром которой является центральный атом углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47).

ίί) выбор одной или более аминокислот в сферической области 10 А, центром которой является центральный атом углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47) (такой как один или более остатков аминокислот, определенных в группе 1 или группе 2);

ϊϊΐ) определение, является ли один или более остатков аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (и), высококонсервативным (особенно остатки активного центра и/или часть мотива С08Х тойЕ и/или часть мотива 6АN^Υ); и ίν) модификация одной или более аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ίί), за исключением консервативных участков, идентифицированных в соответствии со стадией (ϊϊϊ), в указанной исходной последовательности.

- 8 014985

В одном варианте осуществления выбранный остаток аминокислоты может находиться в сферической области 9, предпочтительно 8, 7, 6, 5, 4, или 3 А, центром которой является центральный атом углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47).

Альтернативно или в сочетании с вышеописанным картированием структурной гомологии может быть проведено картирование структурной гомологии путем выбора специфических участков петли (ЬКл) или промежуточных участков (1УКл), выделенных при сравнении первичной структуры р1ат (сравнение первичной структуры 2, см. фиг. 48), перекрывающихся с моделью Р10480 и ΙίνΝ. Участки петли (ЬКл) или промежуточные участки (ΐνκ.8) определены в нижеприведенной таблице.

	Положения аминокислоты Р10480 (8Е<2 ГО N034)
ινκι	1-19
Петля 1 (ЬК1)	20-41
1УК.2	42-76
Петля 2 (ЬК.2)	77-89
1УКЗ	90-117
Петля 3 (ЬКЗ)	118-127
1УК.4	128-145
Петля 4 (ЬК.4)	146-176
1УК.5	177-207
Петля 5 (ЬК5)	208-287
1УК6	288-317

В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения вариант фермента ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, не только включает модификации аминокислоты в одной или более аминокислот, определенных в любой из групп 1-4 и 6-7, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в одном или более из определенных выше промежуточных участков (ΐνΚ.1-6) (предпочтительно в одном или более из ΐνκ.δ3, 5 и 6, более предпочтительно в ΐνΚ5 или ΐνΚ6) и/или в одном или более определенных выше участков петли (ЬК.1-5) (предпочтительно в одном или более из ЬК.1, Ι.Κ2 или ЬК.5, более предпочтительно в ЬВ5).

В одном варианте осуществления вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая не только определена одной или более групп 2, 4, 6 и 7, но также находится в одном или более из ГУКл 1-6 (предпочтительно в ΐνΚ3, 5 или 6, более предпочтительно в ΐνΚ5 или ΐνΚ6) или в одном или более из ЬК.81-5 (предпочтительно в ЬВ1, Ι.Κ2 или ЬВ5, более предпочтительно в ЬВ5).

Соответственно, вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая находится не только в группе 1 или 2, но также в ΐνκ3.

Соответственно, вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая находится не только в группе 1 или 2, но также в ΐνκ5.

Соответственно, вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая находится не только в группе 1 или 2, но также в ΐνκ6.

Соответственно, вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая находится не только в группе 1 или 2, но также в ЬВ1.

Соответственно, вариант ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, может включать одну или более модификаций аминокислоты, которая находится не только в группе 1 или 2, но также в Ι.Κ2.

Аналогично в ряде вариантов осуществления настоящего изобретения вариант фермента ацилтрансферазы, предназначенный для использования в способах и вариантах применения настоящего изобретения, не только включает модификацию аминокислоты в одном или более остатков аминокислот, которые находятся в сферической области 10, предпочтительно в 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 А, центр которой находится на центральном атоме углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47), но также включает модификацию по меньшей мере одной аминокислоты в одном или более определенных выше промежуточных участков (ΐνΚ1-6) (предпочтительно в одном или более ΐνΚδ3, 5 и 6, более предпочтительно в ΐνΚ5 или ΐνΚ6) и/или в одном или более из вышеопределенных участков петли (ЬК.1-5) (предпочтительно в одном или более из ЬВ1, Ι.Κ2 или ЬВ5, более предпочтительно в ЬВ5).

В одном варианте осуществления предпочтительно, когда модификация аминокислоты представляет собой модификацию в одном или более остатков аминокислот, который находится в сферической области 10 А, а также в Ι.Κ5.

- 9 014985

Таким образом, картирование структурной гомологии может включать одну или более следующих стадий:

ί) проведение элайнмента исходной последовательности со структурной моделью (1ΐνΝ.ΡΌΒ), показанной на фиг. 46;

ίί) выбор одного или более остатков аминокислот в сферической области 10 А, центр которой находится на центральном атоме углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47) (таком как один или более остатков аминокислот, определенных в группе 1 или группе 2); и/или выбор одного или более остатков аминокислот в ΐνΚ1-6) (предпочтительно в ΐνΚ3, 5 или 6, более предпочтительно в ΐνΚ5 или ΐνΚ6); и/или выбор одного или более остатков аминокислот в ЬК.1-5 (предпочтительно в ЬВ1, ЬВ2 или ЬВ5, более предпочтительно в ЬВ5) и ϊϊΐ) модификация одной или более аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ίί) в указанной исходной последовательности.

В одном варианте осуществления выбранный остаток аминокислоты может находится в сферической области 9 А, предпочтительно в сферической области 8, 7, 6, 5, 4 или 3 А, центр которой находится на центральном атоме углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47).

Соответственно, картирование структурной гомологии может включать одну или более следующих стадий:

ίί) выбор одного или более остатков аминокислот в сферической области 10 А, центр которой находится на центральном атоме углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47) (таком как один или более остатков аминокислот, определенных в группе 1 или группе 2); и/или выбор одного или более остатков аминокислот в ΐνΚ1-6) (предпочтительно в 1УК3, 5 или 6, более предпочтительно в ΙΥΚ.5 или ΐνΚ6); и/или выбор одного или более остатков аминокислот в ЬК.1-5 (предпочтительно в ЬВ1, ЬВ2 или ЬВ5, более предпочтительно в ЬВ5);

ϊϊΐ) определение, являются ли один или более остатков аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ίί), высококонсервативными (особенно остатки активных центров, и/или часть мотива, и/или часть мотива ΟΆΝΌΥ); и модификацию одной или более аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ίί), за исключением консервативных участков, идентифицированных в соответствии со стадией (ш) в указанной исходной последовательности.

Соответственно, одна или более аминокислот, выбранных в способах, подробно описанных выше, находятся не только в сферической области 10 А, центр которой расположен на центральном атоме углерода молекулы глицерина в активном центре (см. фиг. 47) (например, один или более остатков аминокислот, определенных в группе 1 или группе 2), но также в одном или более ΐνΚ§1-6 (предпочтительно в ΐνΚ3, 5 или 6, более предпочтительно в ΐνΚ5 или ΐνΚ6) или в одном или более ЬК.81-5 (предпочтительно в ЬВ1, ЬВ2 или ЬВ5, более предпочтительно в ЬВ5).

В одном варианте осуществления предпочтительно, когда одна или более модификаций аминокислот находится/находятся в ЬВ5. В случае когда модификация(и) находится в ЬВ5, модификация не является той, которая определена в группе 5. Соответственно, одна или более модификаций аминокислот не только расположены в области, определенной Ш5. но также включают аминокислоту в одной или более из группы 2, группы 4, группы 6 или группы 7.

Соответственно, сравнительный анализ гомологии последовательностей может включать одну или более следующих стадий:

ί) выбор первой исходной липидацилтрансферазы;

ίί) идентификация второй родственной липидацилтрансферазы, обладающей требующейся активностью;

ϊϊΐ) проведение элайнмента указанной первой исходной липидацилтрансферазы и второй родственной липидацилтрансферазы;

ίν) идентификация остатков аминокислот, которые отличаются в двух последовательностях; и

ν) модификация одного или более остатков аминокислот, идентифицированных в соответствии со стадией (ίν) в указанной исходной липидацилтрансферазе.

Соответственно, структурный анализ гомологии последовательностей может включать одну или более следующих стадий:

ίν) идентификация остатков аминокислот, которые отличаются в двух последовательностях;

ν) определение, является ли один или более остатков аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ίν), высококонсервативными (особенно остатки активного центра, и/или часть мотива ΟΌ8Χ,

- 10 014985 и/или часть мотива ΟΆΝΌΥ); и νί) модификация одного или более остатков аминокислот, идентифицированных в соответствии со стадией (ίν), за исключением консервативных участков, идентифицированных в соответствии со стадией (ν) в указанной исходной последовательности.

Соответственно, указанная первая исходная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕР ГО N0: 34, 8ЕР ГО N0: 3, 8ЕР ГО N0: 4, 8Ер ГО N0: 5, 8Ер ГО N0: 6, 8Ер ГО N0: 7, 8Ер ГО N0: 8, 8Ер ГО N0: 19, 8Ер ГО N0: 10,

8Ер ГО N0: 11, 8Ер ГО N0: 12, 8Ер ГО N0: 13, 8Ер ГО N0: 14, 8Ер ГО N0: 1, 8Ер ГО N0: 15,

8Ер ГО N0: 25, 8Ер ГО N0: 26, 8Ер ГО N0: 27, 8Ер ГО N0: 28, 8Ер ГО N0: 29, 8Ер ГО N0: 30,

8Ер ГО N0: 32 или 8Ер ГО N0: 33.

Соответственно, указанная вторая родственная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕР ГО N0: 3, 8ЕР ГО N0: 34, 8ЕР ГО N0: 4, 8Ер ГО N0: 5, 8Ер ГО N0: 6, 8Ер ГО N0: 7, 8Ер ГО N0: 8, 8Ер ГО N0: 19, 8Ер ГО N0: 10,

8Ер ГО N0: 32 или 8Ер ГО N0: 33.

Вариант фермента может включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с исходным ферментом. В ряде вариантов осуществления вариант фермента может включать по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, предпочтительно по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 7, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 9, предпочтительно по меньшей мере 10 модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом.

Что касается специфических остатков аминокислот, то в данном контексте нумерация такая, как получена при структурном анализе варианта последовательности с эталонной последовательностью, показанной как 8ЕР ГО N0: 34 или 8ЕР ГО N0: 35.

В одном аспекте предпочтительно, когда вариант фермента включает одну или более следующих замен аминокислот:

83А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, Т, V, V/, или Υ; и/или

Ы7А, С, Ώ, Е, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или

818А, С, ϋ, Е, Р, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, Т, XV, или Υ; и/или К22А, С, О, Е, Р, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V. XV, или Υ; и/или М23А, С, О, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Υ30Α, С, Ώ, Е, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, или XV; и/или Θ40Α, С, ϋ, Е, Р, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ν80Α, С, О, Е, Р, 6, Η, I, К, Г, Μ, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Р81А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или К82А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ν87Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ν88Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или XVI11 А, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV или Υ; и/или VI12А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, XV, или Υ; и/или А114С, О, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Υ117А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, или XV; и/или Ь118А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Р156А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ц157А, С, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или О159А, С, Ό, Е, Р, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или 0160А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ν161Α, С, О, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Р162А, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или 8163А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, Т, V, XV, или Υ; и/или А164С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или К.165 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или 8166А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, Т, V, XV, или Υ; и/или 0167А, С, О, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или К168А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или νΐ69Α, С, В, Е, Е, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, XV, или Υ; и/или У170А, С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, XV, или Υ; и/или Е171А, С, Ώ, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К., 8, Т, V, XV, или Υ; и/или А172С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Υ179Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, или XV; и/или Н180А, С, ϋ, Е, Р, О, I, К, Ь, Μ, Р, О, К., 8, Т, V, XV, или Υ; и/или Ν181Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, О, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или

- 11 014985

()182 А, С, ϋ, Е, Г, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, \Υ, или Υ, предпочтительно

К; и/или

М209А, С, ϋ, Ε, Р, 6, Η, I, К, Ь, Ν, Р, К, 8, Т, V, V/, или Υ; и/или

Ь210 А, С, ϋ, Ε, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, V, ΧΥ, или Υ; и/или

К211 А, С, ϋ, Ε, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, V, ΑΥ, или Υ; и/или

N215 А, С, О, Ε, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, V, ΑΥ, или Υ; и/или

Υ226Α, С, О, Ε, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (2, К, 8, Т, V, или Ψ; и/или

Υ230Α, С, ϋ, Ε, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, V или Ψ; и/или

К284А, С, О, Ε, Р, О, Η, I, к, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, V, ΑΥ, или Υ; и/или

М285А, С, Ό, Ε, Р, О, Η, I, К, к, Ν, Р, 0, К, 8, Т, V, V/, или Υ; и/или О289А, С, ϋ, Ε, Р, 6, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, V/, или Υ; и/или У290А, С, ϋ, Ε, Р, 6, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (), К, 8, Т, Ψ, или Υ; и/или Е309А, С, ϋ, Р, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, λΥ, или Υ; и/или 8310А, С, Ό, Ε, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, 9, К, Т, V, \Υ, или Υ.

В дополнение или альтернативно этому может иметься одно или более С-концевых удлинений. Предпочтительно, когда дополнительное С-концевое удлинение состоит из одной или более алифатических аминокислот, предпочтительно неполярной аминокислоты, более предпочтительно из I, Р, V или О. Таким образом, настоящее изобретение далее представляет вариант фермента, включающий одно или более следующих С-концевых удлинений: 3181, 318Ь, 318ν, 318О.

В случае когда остатки в исходном скелете отличаются от находящихся в Р10480 (8ЕР ГО N0: 2), как определяют посредством гомологичного элайнмента и/или структурного элайнмента с Р10480 и/или 1ΐνΝ, может потребоваться заменить остатки, которые выравниваются с любым одним или более следующим остатков аминокислот в Р10480 (8ЕР ГО N0: 2): 8ег3, Ьеи17, Ьуз22, Ме123, О1у40, Αδπ80, Рго81, Ьуз82, Αδπ87, Αδπ88, Тгр111, να1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, О1у159, О1п160, Αδπ161, Рго162, 8ег163, Α1α164, Αγ§165, 8ег166, О1п167, Ьуз168, να1169, να1170, О1и171, Α1α172, Туг179, Ηΐδ180, Αδπ181, О1п182, Ме1209, Ьеи210, Αγ§211, Αδπ215, Ьуз284, Ме1285, О1п289, να1290, О1и309 или 8ег310, остатком, обнаруженным в Р10480, соответственно.

Варианты фермента, которые имеют пониженную гидролитическую активность в отношении фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (ФХ), могут также иметь повышенную активность трансферазы, переносящей группу из фосфолипида.

Варианты фермента, которые обладают повышенной активностью трансферазы, переносящей группы из фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (ФХ), могут также иметь повышенную активность в отношении фосфолипида.

Соответственно, один или более следующих центров могут быть включены в связывание субстрата:

Ьеи17; Α1α114; Туг 179; Ηΐδ180; Α8η181; Ме1209; Ьеи210; Αγ§211; Αδ^^; Ьуз284; Ме1285; О1п289; να1290.

Модификация одного или более следующих остатков может привести в результате к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной активностью трансферазы в отношении фосфолипида:

83, Ό157, 8310, Е309, Υ179, N215, К22, р289, М23, Н180, М209, Ь210, К211, Р81, ν112, N80, Е82, N88; N87.

- 12 014985

Специфические модификации, которые могут дать вариант фермента, обладающий улучшенной активностью трансферазы в отношении фосфолипида, могут быть выбраны из одной или более следующих модификаций:

83А, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, Т, V, λΥ или Υ; предпочтительно Ν,

Е, К, К, А, Р или М, наиболее предпочтительно 83А ϋ157Α, С, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, V/ или Υ; предпочтительно

Ό1578, К, Е, Ν, О, Т, V, К или С

8310А, С, ϋ, Е, Р, Ο, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (у К, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

ЮТ

-318 Е

Е309А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (^, К., Т, V, XV или Υ; предпочтительно

Е309 К, Е, Е, К или А

Υ179Α, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, 9, К, 8, Т, V или XV; предпочтительно

Υ179 ϋ, Т, Е, К, Ν, V, К, ζ) или 8, более предпочтительно Е, К., Ν, V, К или (9

N215А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Р, ζ), К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

N215 8, Ь, Кили Υ .

К22А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, ζ), К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно К22 Е, К, С или А (^289А, С, ϋ, Е, Р, Ο, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно <3289 К, Е, О, Р или N

М23А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е Ν, Р, 9, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

М23 К, (}, Е, О, Т или 8

Н180А, С, ϋ, Е, Р, (3, I, К, Е, Μ, Р, (А К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Н180 ζ), К или К

М209 А, С, Э, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

М209 (}, 8, К, А, Ν, Υ, Е, V или Ь

Б210А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Ь210 К, А, V, 8, Т, I, XV или М

К211А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, (}, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

К211Т

Р81А, С, ϋ, Е, Р, Ο, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, (}, К, 8, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно

Р81О

VI12А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (?, К, 8, Т, XV или Υ; предпочтительно

У112С

Ν80Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, ζ), К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

N80 К, С, Ν, ϋ, Р, Т, Е, V, А или О

Ь82А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Ε82Ν, 8 или Е

Ν88Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

N880

Ν87Α, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно

Ν87Μ или О

- 13 014985

Модификация одного или более следующих остатков приводит в результате к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной активностью трансферазы в отношении фосфолипида:

Ν, К, А, О

М23 К, ζ), Ь, О, Т, 8

Н180 К

Ь82 О

Υ179 Е, К, Ν, V, К или р Е309 К, 8, Ь или А

Одной из предпочтительных модификаций является Ν80Ό. Это, в частности, тот случай, когда используют эталонную последовательность 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 35. Вследствие этого в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липидацилтрансфераза, соответствующая настоящему изобретению, включает 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 35.

Как отмечено выше относительно специфических остатков аминокислот в данном контексте, нумерация такая, как получена при сравнительном анализе варианта последовательности с эталонной последовательностью, показанной как 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34 или 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 35.

Во многом предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в способе и вариантах применения настоящего изобретения, может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую последовательность аминокислот, показанную как 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 16 (см. фиг. 10), или последовательность аминокислот, которая идентична на 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 98% или более либо еще более предпочтительно 99% или более 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 16. Данный фермент можно считать вариантом фермента.

Чтобы избежать неопределенности, когда конкретную аминокислоту описывают, например, в специфическом положении, например Ь118, это относится к специфической аминокислоте с номером остатка 118 в 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34, пока не указывают иначе. Однако остаток аминокислоты в положении 118 в другом исходном ферменте может быть отличным от лейцина.

Таким образом, когда указывают заменить аминокислоту остатка 118, хотя ссылка может быть сделана на Ь118, компетентный специалист легко поймет, что, если исходный фермент отличен от приведенного в 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34, замещаемая аминокислота может не быть лейцином. Вследствие этого возможно, что при замене последовательности аминокислот в исходном ферменте, который не является ферментом, имеющим последовательность аминокислот, показанную как 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34, новая (заменяющая) аминокислота может быть такой же, как указано в 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34. Это может быть в случае, например, когда аминокислота указанного остатка 118 не является лейцином и вследствие этого отлична от аминокислоты остатка 118 в 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 34.

Другими словами, в остатке 118, например, если исходный фермент имеет в данном положении аминокислоту, отличную от лейцина, данная аминокислота может быть заменена лейцином в соответствии с настоящим изобретением.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности основана на числе элементов последовательности, которые являются одинаковыми. Степень идентичности в соответствии с настоящим изобретением может быть, соответственно, определена с помощью компьютерных программ, известных в области техники, таких как ОЛР, представленная в пакете программ ОСО (Ргодгат Мапиа1 Гог Изе Ш1зеопзт Раекаде, Уегзюп 8, Аидиз! 1994, Оепейез СотрШег Огоир, 575 8е1епее Бпуе, МаШзоп, Ш1зеопзт, И853711) (см. статью №ей1етап & ШипзеН (1970), I. оГ Мо1ееи1аг ВЫоду, 48, 443-45) с использованием следующих установок для сравнения последовательностей полипептидов: формирования ОАР образование потерь 3.0 и дополнительные потери ОАР 0,1. Соответственно, степень идентичности касательно последовательности аминокислот определяют по меньшей мере для 20 следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно по меньшей мере для 30 следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно по меньшей мере для 40 следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно по меньшей мере для 50 следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно по меньшей мере для 60 следующих друг за другом аминокислот.

Соответственно, фермент липидацилтрансфераза, представленный в настоящем изобретении, можно получить и предпочтительно получают из организмов из одного или более следующих родов: Аеготопаз, 81гер1отуеез, Заеейаготуеез, ЕаеШеоееиз, МуеоЬае1епит, 81гер1оеоееиз, ЕаеШЬаеШиз, Оези1£йоЬае1епит, ВаеШиз, Сатру1оЬае1ег, УФпопаееае, Ху1е11а, 8и1Го1оЬиз, АзрегдШиз, ЗеЫ/озаеейаготуеез, Ыз^епа, №1ззепа, МезогШ/оЬшт, Ка1з1ота, ХапШотопаз, СапйМа, ТйегтоЬШйа и СогупеЬае1епит.

Соответственно, фермент липидацилтрансферазу, представленный в настоящем изобретении, можно получить и предпочтительно получают из организмов из одного или более следующих организмов: Аеготопаз йуйгорййа, Аеготопаз за1тотеМа, 81гер1отуеез еоейео1ог, 81гер1отуеез птозиз, МуеоЬае1епит, 81гер1оеоееиз руодепез, ЕаеШеоееиз 1аейз, 81гер1оеоееиз руодепез, 81гер1оеоееиз ШегторйПиз, 81гер1отуеез Шегтозаеейап, 81гер1отуеез ауегтйШз, ЕаеШЬаеШиз Некейеиз,

- 14 014985

Пеки1ГйоЬас1егшт БеМодепапк, ВасШик кр, Сатру1оЬас1ег |е|ип1, У1Ьгюпасеае, Ху1е11а Гакййока, 8и1£о1оЬик ко1£а1айсик, 8ассйаготусек сегеуШае, ЛкрегдШик 1еггеик, 8с1ихокасс11аготусек ротЬе, Ык1епа шпосиа, Ык(ег1а топосу1одепек, №1ккейа тешпфййк, МекогЫхоЬшт 1ой, КаШоша ко1апасеагит, ХапПютопак сатрек1г1к, ХапБютопак ахопоройк, СапйБа рагарк11ок1к, ТНегтоЫПБа Гикса и СогупеЬас1егшт еГПаепк.

В одном аспекте предпочтительно, когда получаемый фермент липидацилтрансфераза, представленный в настоящем изобретении, предпочтительно получен из одного или более Аеготопак ЬуБгорЬйа или Аеготопак ка1тошсИа.

В одном варианте осуществления, соответственно, стерин и/или станол может включать один или более следующих структурных признаков:

ί) 3-в-гидроксильную группу или 3-а-гидроксильную группу и/или ίί) циклы А:В в цис-положении или циклы А:В в транс-положении или С₅-С₆ является ненасыщенным.

Подходящие стериновые акцепторы ацила включают холестерин и фитостерины, например α-ситостерин, β-ситостерин, стигмастерин, эрогостерин, кампестерин, 5,6-дигидростерин, брассикастерин, α-спинастерин, β-спинастерин, γ-спинастерин, δ-спинастерин, фукостерин, димостерин, аскостерин, себеристерин, эпистерин, анастерин, гипостерин, хондрилластерин, десмостерин, халиностерин, пориферастерин, клионастерин, стериновые гликозиды, токоферол, токотриенол и другие природные или синтетические изомерные формы и производные.

Преимущественно в одном варианте осуществления стериновый акцептор ацила представляет собой токоферол. Соответственно, токоферол может являться одним или более из γ-, δ-, β- или ά-α-токоферолов, включая, например, кислый сукцинат ά-α-токоферола. В одном варианте осуществления предпочтительно, когда стериновый акцептор ацила представляет собой α-токоферол.

В одном варианте осуществления предпочтительно, когда способ, представленный в настоящем изобретении, включает стадию добавления к маслу токоферола, предпочтительно α-токоферола.

В одном аспекте предпочтительно, когда стериновый акцептор ацила представляет собой холестерин.

В одном аспекте предпочтительно, когда стериновый и/или станоловый акцептор ацила представляет собой стерин и/или станол, отличный от холестерина.

В одном аспекте настоящего изобретения, соответственно, в качестве акцептора ацила может действовать больше одного стерина и/или станола, соответственно, в качестве акцептора ацила может действовать больше двух стеринов и/или станолов. Другими словами, в одном аспекте настоящего изобретения, соответственно, может быть получено больше одного сложного стеринового эфира и/или сложного станолового эфира. Соответственно, когда холестерин является акцептором ацила, один или более других стеринов или один или более станолов также могут действовать как акцептор ацила. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение представляет способ получения ίπ кйн как сложного эфира токоферола, так и по меньшей мере одного из сложных эфиров другого стерина или станола в комбинации. Другими словами, липидацилтрансфераза для некоторых аспектов настоящего изобретения может переносить ацильную группу с липида на оба, токоферол и по меньшей мере один из других стеринов и/или по меньшей мере один станол.

Масло, полученное согласно настоящему изобретению, можно использовать для снижения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, в частности для снижения уровня холестерина сыворотки крови и/или для снижения уровня липопротеина низкой плотности. Как холестерин сыворотки крови, так и липопротеины низкой плотности ассоциированы с рядом заболеваний человека, таких как атеросклероз и/или, например, сердечное заболевание. Таким образом, предполагают, что масла, полученные согласно настоящему изобретению, можно использовать для уменьшения риска развития данных заболеваний.

Стериновый акцептор ацила может представлять собой акцептор, обнаруженный в естественных условиях в пищевом или растительном маслах.

Альтернативно или дополнительно стериновый акцептор ацила может представлять собой акцептор, добавленный к пищевому или растительному маслу.

В случае когда стерин и/или станол добавляют к пищевому маслу, стерин и/или станол могут быть добавлены перед, одновременно и/или после добавления липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении. Соответственно, настоящее изобретение может охватывать добавление экзогенных стеринов/станолов, особенно фитостеринов/фитостанолов, к пищевому или растительному маслу перед или одновременно с добавлением фермента, представленного в настоящем изобретении.

Для некоторых аспектов один или более стеринов, присутствующих в пищевом масле, можно превратить в один или более станолов перед тем или в то же самое время, когда добавляют липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением. Можно использовать любой подходящий способ превращения стеринов в станолы. Например, превращение может быть осуществлено, в частности, путем химического гидрирования. Превращение можно провести перед добавлением липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением или одновременно с добавлением липидацилтрансферазы в со

- 15 014985 ответствии с настоящим изобретением. Соответственно, ферменты для превращения стеринов в станолы описаны в заявке А0 00/061771.

Соответственно, настоящее изобретение можно использовать для получения сложных фитостаноловых эфиров ίη δίίη в пищевом масле. Фитостаноловые эфиры обладают повышенной растворимостью в липидных мембранах, биодоступностью и повышенным благоприятным эффектом на состояние здоровья (см., например, заявку А0 92/99640).

Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что сложные стериновые или станоловые эфиры получают в пищевом масле в процессе его рафинирования гидратацией. Следующее преимущество состоит в том, что фермент обеспечивает рафинирование гидратацией без повышения или существенного повышения содержания свободных жирных кислот в пищевом масле. Образование свободных жирных кислот в пищевом масле может быть вредным. Предпочтительно, когда способ, представленный в настоящем изобретении, в результате приводит к рафинированию пищевого масла гидратацией, при котором накопление свободных жирных кислот понижено и/или исключено. Не намереваясь связывать себя теорией, в соответствии с настоящим изобретением жирная кислота, которая удаляется из липида, переносится липидацилтрансферазой на акцептор ацила, например стерин и/или станол. Таким образом, общий уровень свободных жирных кислот в пищевом продукте не повышается или повышается только до несущественного уровня. Это прямо противоположно ситуации, когда при ферментативном рафинировании пищевых масел гидратацией используют фосфолипазы, такие как Ьесйаке И11га™. В частности, применение данных фосфолипаз может привести к образованию повышенного количества свободных жирных кислот в пищевом масле, что может быть вредным. Согласно настоящему изобретению накопление свободных жирных кислот понижено и/или исключено по сравнению с количеством свободных жирных кислот, которое накапливалось бы при использовании фермента фосфолипазы, такой как Ьесйаке ЦЦга™, вместо липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении.

Липидацилтрансфераза, представленная в настоящем изобретении, может подходить для использования в ферментативном рафинировании растительных или пищевых масел гидратацией. При переработке растительного или пищевого масла данное пищевое или растительное масло обрабатывают липидацилтрансферазой, представленной в настоящем изобретении, чтобы гидролизовать большую часть фосфолипида. Предпочтительно, когда жирные ацильные группы переносятся из полярных липидов на акцептор ацила. Способ рафинирования, как правило, приводит в результате к уменьшению содержания полярных липидов, особенно фосфолипидов, в пищевом масле вследствие гидролиза основной части (т.е. больше 50%) фосфолипида. Как правило, водную фазу, включающую гидролизованный фосфолипид, отделяют от масла. Соответственно, пищевое или растительное масло может изначально (предварительная обработка ферментом, представленным в настоящем изобретении) иметь содержание фосфора 50-250 промиль.

Как известно компетентному специалисту, термин рафинирование гидратацией, как используют в данном контексте, означает рафинирование масла путем превращения фосфатидов (таких как лецитин, фосфолипиды и сорбированное масло) в гидратируемые фосфатиды. Масло, которое рафинировано гидратацией, является более текучим и, таким образом, имеет улучшенные технологические свойства по сравнению с маслом, не подвергнутым рафинированию гидратацией.

Термин трансферазы, как используют в данном контексте, является взаимозаменяемым с термином липидацилтрансфераза.

Соответственно, липидацилтрансфераза, как определено в данном контексте, катализирует одну или более из следующих реакций: интерэстерификация, трансэстерификация, алкоголиз, гидролиз.

Термин интерэстерификация относится к ферментативно катализируемому переносу ацильных групп между липидным донором и липидным акцептором, причем липидный донор не является свободной ацильной группой.

Термин трансэстерификация, как используют в данном контексте, означает ферментативно катализируемый перенос ацильной группы от липидного донора (отличного от свободной жирной кислоты) на акцептор ацила (отличный от воды).

Как используют в данном контексте, термин алкоголиз относится к ферментативному расщеплению ковалентной связи кислотного производного путем реакции со спиртом ΚΌΗ, так что один из продуктов связывается с Н спирта, а другой продукт связывается с группой 0Я спирта.

Как используют в данном контексте, термин спирт относится к алкильному соединению, включающему гироксильную группу.

Как используют в данном контексте, термин гидролиз относится к ферментативно катализируемому переносу ацильной группы с липида на группу ОН молекулы воды.

Термин без повышения или без существенного повышения уровня свободных жирных кислот, как используют в данном контексте, означает, что предпочтительно, когда липидацилтрансфераза, представленная в настоящем изобретении, имеет 100% активность трансферазы (т.е. переносит 100% ацильных групп с донора ацила на акцептор ацила при отсутствии гидролитической активности); однако фермент может переносить менее чем 100% ацильных групп, присутствующих в липидном доноре ацила, на ак

- 16 014985 цептор ацила. В таком случае предпочтительно, когда ацилтрансферазная активность составляет по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 98% общей активности фермента. Процент трансферазной активности (т.е. трансферазная активность как доля общей ферментативной активности) можно определить с помощью следующего протокола.

Фермент, подходящий для использования в способах, представленных в изобретении, предпочтительно обладает активностью фосфолипазы в стандартном анализе активности фосфолипазы, описанном ниже.

Определение активности фосфолипазы (анализ активности фосфолипазы (РЬи-7)).

Субстрат.

0,6% Ь-α фосфатидилхолина растительного 95% (фирмы Ауапй #441601), 0,4% Тритон-Х100 (фирмы 81§ша Х-100) и 5 мМ СаС1₂ диспергируют в 0,05 М буфере НЕРЕ8 рН 7.

Методика анализа.

400 мкл субстрата вносят в эппендорфовскую пробирку объемом 1,5 мл и помещают в термосмеситель Еррепйог! при 37°С на 5 мин. В точке времени 1=0 мин добавляют 50 мкл раствора фермента. Кроме того, анализируют контроль с водой вместо фермента. Образец перемешивают при 10x100 об/мин в термосмесителе ЕррепйогГ при 37°С в течение 10 мин. В точке времени 1=10 мин эппендорфовскую пробирку помещают в другой термосмеситель при 99°С на 10 мин, чтобы остановить реакцию.

Свободную жирную кислоту в образцах анализируют с использованием набора ΝΡΡΑ С фирмы \АКО ОшЬН.

Активность фермента ΡΕϋ-7 при рН 7 рассчитывают как количество микромолей жирной кислоты, образующееся в минуту в условиях анализа.

Более предпочтительно, когда липидацилтрансфераза будет также обладать активностью трансферазы, как определено нижеприведенной методикой.

Протокол определения активности ацилтрансферазы, %.

Пищевое масло, к которому добавлена липидацилтрансфераза, представленная в настоящем изобретении, можно экстрагировать после ферментативной реакции с СНС1₃:СН₃ОН, 2:1 и органическую фазу, включающую липидный материал, выделяют и анализируют посредством ГЖХ (газожидкостной хроматографии) и ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) согласно методике, подробно описанной ниже. На основании анализов ГЖХ и ВЭЖХ определяют количество свободных жирных кислот и одного или более сложных стериновых/станоловых эфиров. Контрольное пищевое масло, к которому не добавляют фермент, представленный в настоящем изобретении, анализируют аналогичным методом.

Расчет.

На основании результатов анализов ГЖХ и ВЭЖХ можно рассчитать повышение уровня свободных жирных кислот и сложных стериновых/станоловых эфиров:

Δ% жирной кислоты = % жирной кислоты(фермент) - % жирной кислоты(контроль);

Мв жирной кислоты = среднемассовая молекулярная масса жирных кислот;

А = Δ% стеринового эфира/Мв стеринового эфира (где Δ% стеринового эфира = % стеринового/станолового эфира(фермент) - % стеринового/станолового эфира(контроль) и Мв стеринового эфира = среднемассовая молекулярная масса стериновых/станоловых эфиров);

Трансферазную активность рассчитывают как процент общей ферментативной активности % трансферазной активности =__А χ 100___________________

Α+Δ% жирной кислоты/(Мв жирной кислоты)

Если в пищевом масле повышено содержание свободных жирных кислот, предпочтительно, чтобы оно не было повышено в существенной степени, т.е. до значительного уровня. Под этим имеют в виду, что повышение содержания свободной жирной кислоты не влияет неблагоприятным образом на качество пищевого масла.

Пищевое масло, используемое для анализа активности ацилтрансферазы, предпочтительно является соевым маслом, в которое добавлены растительный стерин (1%) и фосфатидилхолин (2%), используемым в способе, представленном в примере 3. Для анализа доза используемого фермента предпочтительно составляет 0,2 ΡΕϋ-7/г масла, более предпочтительно 0,08 ΡΕϋ-7/г масла. Уровень фосфолипида, присутствующего в масле, и/или % превращения стерина предпочтительно определяют через 4 ч, более предпочтительно через 20 ч.

В ряде аспектов настоящего изобретения термин без существенного повышения содержания свободных жирных кислот, как используют в данном контексте, означает, что количество свободной жирной кислоты в пищевом масле, обработанном липидацилтрансферазой, представленной в настоящем изобретении, меньше, чем количество свободной жирной кислоты, образованной в пищевом масле, когда используют фермент, отличный от липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении,

- 17 014985 как, например, по сравнению с количеством свободной жирной кислоты, образованной, когда используют принятый фермент фосфолипазу, например Ьесйаке ИЙга™ (фирмы Νονοζνιηοδ А/8, Дания).

Дополнительно или вместо оценки % трансферазной активности в масле (см. выше) для идентификации ферментов липидацилтрансфераз, наиболее предпочтительных для использования в способах, представленных в изобретении, можно использовать следующий анализ, названный Протокол идентификации липидацилтрансфераз, предназначенных для использования в настоящем изобретении.

Протокол идентификации липидацилтрансфераз.

Липидацилтрансфераза, соответствующая настоящему изобретению, представляет собой приводящую к следующему результату:

ί) удаление фосфолипида, присутствующего в соевом масле с добавлением растительного стерина (1%), фосфатидилхолина (2%), при использовании способа, описанного в примере 3; и/или ίί) превращение (% превращения) добавленного стерина в сложный стериновый эфир при использовании способа, описанного в примере 3.

Можно использовать способ ГЖХ для определения уровня стерина и сложных стериновых эфиров, как описано в примере 5.

Для анализа доза используемого фермента может составлять 0,2 РЬИ-7/г масла, предпочтительно 0,08 РЬИ-7/г масла. Уровень фосфолипида, присутствующего в масле, и/или превращения (% превращения) стерина предпочтительно определяют через 4 ч, более предпочтительно через 20 ч.

В протоколе идентификации липидацилтрансфераз после обработки ферментом предпочтительно добавляют 5% воды и тщательно перемешивают с маслом. Затем масло разделяют на масляную и водную фазу при использовании центрифугирования (см. монографию Εηζуте-саΐа1уζеά йедитттд о£ уеде1аЫе οίΠ. Висйо1й Н. и Ьаигд1 А.-6., Еей ^188еи8сйай Тесйпо1од1е (1993), 95(8), 300-4, ΐδδΝ: 0931-5985) и затем масляную фазу можно проанализировать на содержание фосфора, используя следующий протокол (Анализ на содержание фосфора).

Анализ на содержание фосфора.

Уровень фосфолипида, имеющийся в масле после рафинирования гидратацией, определяют, получая сначала образец масла в соответствии с получением образца, описанного в АОАС официальном методе 999.10 (>свинца, кадмия, цинка, меди и железа в атомно-абсорбционной спектрофотометрии пищевых продуктов после микроволнового разложения, метод ΝΜΚΕ-АОАС первое действие 1999). Затем количество фосфолипидов в масле измеряют посредством анализа содержания фосфора в образце масла после рафинирования гидратацией согласно АОАС официальному методу 985.01 (>металлов и других элементов в растениях и кормах для домашних животных, способ спектроскопии с индуктивносвязанной плазмой первое действие 1985, окончательное действие 1988).

Количество фосфора, присутствующее в масле после рафинирования гидратацией, составляет предпочтительно менее чем 50 промиль, предпочтительно менее чем 40 промиль, предпочтительно менее чем 30 промиль, предпочтительно менее чем 20 промиль, предпочтительно менее чем 10 промиль, предпочтительно менее чем 5 промиль. Масло после рафинирования гидратацией, как проиллюстрировано в примерах, может быть в существенной степени свободным от фосфолипида, т.е. содержать менее чем 1 промиль фосфолипида.

Процент превращения стерина, присутствующего в масле, составляет по меньшей мере 1%,

предпочтительно	по	меньшей	мере	5%,	предпочтительно	по	меньшей	мере	10%,
предпочтительно	по	меньшей	мере	20%,	предпочтительно	по	меньшей	мере	30%,
предпочтительно	по	меньшей	мере	40%,	предпочтительно	по	меньшей	мере	50%,
предпочтительно	по	меньшей	мере	60%,	предпочтительно	по	меньшей	мере	70%,
предпочтительно	по	меньшей	мере	80%,	предпочтительно	по	меньшей	мере	90%,
предпочтительно по меньшей мере 95%.

В одном варианте осуществления % превращения стерина, присутствующего в масле, составляет по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 20%.

Рафинирование при низком содержании воды.

Неожиданно обнаружено, что при использовании липидацилтрансферазы в способе ферментативного рафинирования гидратацией пищевого масла ферментативное рафинирование гидратацией можно осуществить в среде с очень низким содержанием воды. Может потребоваться еще немного воды, например при добавлении фермента к маслу фермент может быть добавлен в небольшом количестве воды, таком как менее чем 1%, предпочтительно 0,5%, более предпочтительно менее чем 0,2%, более предпочтительно менее чем 0,1%.

Предпочтительно, когда содержание воды в пищевом масле в способах и вариантах применения, представленных в настоящем изобретении, составляет менее чем 1%, предпочтительно менее чем 0,5%, более предпочтительно менее чем 0,2%, более предпочтительно менее чем 0,1%.

Таким образом, одно из преимуществ настоящего изобретения состоит в том, что, когда при ферментативном рафинировании гидратацией используют только небольшое количество воды (т.е. <5%, предпочтительно <1%, предпочтительно <0,5%, предпочтительно <0,2%), клейкие вещества (т.е. фосфорсодержащая часть) выделяются из масла, например, в форме твердого осадка. Твердый осадок легко

- 18 014985 можно удалить из рафинированного гидратацией масла такими способами, как, например, простая декантация масла или удаление клейких веществ фильтрацией.

Это прямо противоположно принятым способам ферментативного рафинирования гидратацией, в которых к маслу добавляют значительное количество воды. Это обусловлено тем, что в принятых способах ферментативного рафинирования гидратацией после рафинирования получают водный слой, который включает фосфорсодержащую часть (например, ту часть, которая включает лизофосфолипиды). Данный водный слой можно удалить, например, центрифугированием. Однако удаление водного слоя значительно сложнее, чем удаление твердого осадка, полученного при использовании способа, представленного в настоящем изобретении.

Вследствие этого способ ферментативного рафинирования гидратацией, представленный в настоящем изобретении, мог рассматриваться как способ рафинирования гидратацией при низком содержании воды.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения клейкое вещество можно удалить доведением содержания воды в масле до 5% с последующим центрифугированием масла, (см. статью Επζνιηο-οαίαΐνζοά бедитттд оГ \'сдс1аЫс οίΐδ, ВисйоИ Н. и Ьаигд1 А.-6., ЕсП \У155СП5с11аГ1 Тес11по1ощс (1993), 95(8), 300-4).

Вследствие этого изобретение представляет способ рафинирования гидратацией пищевого масла, такого как неочищенное пищевое масло (например, неочищенное соевое масло), без необходимости включения либо стадии предварительного промывания перед рафинированием гидратацией и/либо стадии удаления воды, добавленной в процессе рафинирования гидратацией, которое требуется при использовании принятых фосфолипаз, таких как фосфолипаза поджелудочной железы и Ьес11а8С ЦЕЕга™.

Предпочтительно, когда пищевое масло имеет содержание воды менее чем 4,5%, более предпочтительно менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2%, менее чем 1%, менее чем 0,5%.

Соответственно, пищевое масло может включать по меньшей мере 0,1% воды, например по меньшей мере 0,3, 0,4 или 0,5%.

Предпочтительные липидацилтрансферазы, предназначенные для использования в настоящем изобретении, идентифицированы как обладающие высокой активностью, такой как высокая гидролитическая активность в отношении фосфолипидов или высокая активность фосфолипидтрансферазы в отношении фосфолипидов в масляной среде, наиболее предпочтительно, когда липидацилтрансферазы, предназначенные для использования в ферментативном рафинировании гидратацией, обладают высокой активностью фосфолипид-стерин-трансферазы.

Как подробно описано выше, другие ацилтрансферазы, подходящие для использования в способах, представленных в изобретении, можно определить путем идентификации присутствия блоков 6Ό8Χ, 6АN^Υ и НРТ либо посредством элайнмента с консенсусной последовательностью рГат00657 (8ΕΟ ΙΌ N0: 1) и/или элайнмента с ацилтрансферазой 6Ό8Χ, например 8Ε0 ΙΌ N0: 28. Для того чтобы оценить их пригодность для рафинирования гидратацией, т. е. идентифицировать те ферменты, которые обладают трансферазной активностью по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 98% от общей активности фермента, данные ацилтрансферазы тестируют с использованием анализа Протокол определения процента ацилтрансферазной активности, подробно описанного выше.

Настоящее изобретение относится к применению липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении, в рафинировании гидратацией пищевых растительных масел и/или пищевых масел и к способам рафинирования пищевых или растительных масел.

В одном аспекте настоящее изобретение может представлять способ, включающий применение липидацилтрансферазы для удаления доли негидратируемого фосфора (NНΡ) в масле, включающем относительно высокое количество NНΡ.

Термин пищевое масло, как используют в данном контексте, может охватывать растительные масла.

Предпочтительно, когда пищевое масло перед обработкой в соответствии с настоящим изобретением включает долю негидратируемого фосфора 50-250 промиль, предпочтительно по меньшей мере 60 промиль, более предпочтительно по меньшей мере 100 промиль и еще более предпочтительно по меньшей мере 200 промиль, еще более предпочтительно выше 250 промиль.

Более предпочтительно, когда пищевое масло перед обработкой в соответствии с настоящим изобретением включает долю негидратируемого фосфора в интервале 60-500 промиль, более предпочтительно в интервале 100-500 промиль и еще более предпочтительно в интервале 200-500 промиль.

Пищевое масло, как называют в данном контексте, может представлять собой любое масло, содержащее относительно высокое количество негидратируемого фосфора, оно может включать рафинированное водой масло или более предпочтительно оно представляет собой неочищенное масло или полуочищенное масло.

- 19 014985

В одном аспекте неочищенное пищевое масло имеет перед осуществлением способа, представленного в изобретении, содержание фосфора выше 350 промиль, более предпочтительно выше 400 промиль, еще более предпочтительно выше 500 промиль и наиболее предпочтительно выше 600 промиль.

Масла, охватываемые способом, представленным в настоящем изобретении, включают, но без ограничения перечисленным, одно или более из соевого масла, масла канолы, кукурузного масла, хлопкового масла, пальмового масла, кокосового масла, арахисового масла, оливкового масла, масла сафлора, косточкового пальмового масла, рапсового масла и подсолнечного масла.

Предпочтительно, когда масло представляет собой одно или более из соевого масла, подсолнечного масла и рапсового масла (иногда называемого маслом канолы).

Более предпочтительно, когда масло представляет собой одно или более из соевого масла, подсолнечного масла и рапсового масла.

Наиболее предпочтительно, когда масло представляет собой соевое масло.

Данные масла могут находиться в форме неочищенного масла, полуочищенного масла или масла, рафинированного водой.

Как используют в данном контексте, неочищенное масло (называемое в данном контексте также масло, нерафинированное гидратацией) может представлять собой масло, полученное отжимом, или экстрагированное масло либо их смесь, например из рапса, сои или подсолнечника. Содержание фосфатидов в неочищенном масле может варьировать от 0,5 до 3% мас./мас., соответствуя содержанию фосфора в интервале 200-1200 промиль, более предпочтительно в интервале 250-1200 промиль. Кроме фосфатидов, неочищенное масло содержит также маленькие концентрации углеводов, соединений сахаров и комплексы металл/фосфатидная кислота Са, Мд и Бе.

Как используют в данном контексте, термин полуочищенное масло относится к любому маслу, которое не является неочищенным маслом, но содержание фосфатидов в котором составляет выше 250 промиль, более предпочтительно выше 500 промиль. Такое масло можно было бы получить, например, обработкой неочищенного масла способом, аналогичным нижеописанному способу рафинирования водой.

Как используют в данном контексте, масло, рафинированное водой, как правило, можно получить способом рафинирования водой, заключающимся в смешивании 1-3% мас./мас. горячей воды с теплым (60-90°С) неочищенным маслом. Обычно периоды обработки составляют 30-60 мин. На стадии рафинирования водой удаляют фосфатиды и вязкие клейкие вещества, которые становятся нерастворимыми в масле при гидратации. Гидратированные фосфатиды и клейкие вещества можно отделить от масла посредством отстаивания, фильтрации или центрифугирования - центрифугирование является более распространенным способом. Основной целью в данном способе рафинирования водой является отделение гидратированных фосфатидов от масла. Вышеописанное вмешивание горячей воды в масло следует в данном контексте понимать в широком смысле как вмешивание водного раствора в масло в соответствии со стандартными способами рафинирования водой в области техники.

Преимущественно способ и варианты применения настоящего изобретения обеспечивают возможность рафинирования пищевых масел гидратацией в среде с низким содержанием воды (<5%, предпочтительно менее чем 2%, более предпочтительно менее чем 1%). Вследствие этого рафинирование гидратацией можно осуществить при добавлении меньшего количества воды, чем при использовании принятых ферментов. Следующим преимуществом настоящего изобретения является образование сложных стериновых эфиров (в частности, сложных эфиров токоферола) в масле. Еще одно преимущество настоящего изобретения состоит в удалении (предпочтительно полном удалении) фосфолипидов. Следующим преимуществом настоящего изобретения является удаление (предпочтительно полное удаление) фосфолипидов без удаления фитостерина и, в частности, токоферола. Предпочтительно, чтобы вследствие эстерификации фитостерина не происходило существенного удаления фитостеринов, таких как токоферол, из масла и вместо этого они бы просто эстерифицировались. Однако в одном варианте осуществления количество фитостерина, такого как токоферол, может быть уменьшено. В данных вариантах осуществления абсолютные уровни фитостерина, такого как токоферол, могут понизиться предпочтительно не более чем на 10%, альтернативно не более чем на 25%, альтернативно не более чем на 50%, альтернативно не более чем на 75%. Еще одно преимущество настоящего изобретения состоит в удалении (предпочтительно полном удалении) фосфолипидов без гидролиза триглицеридов. Для простоты ссылки данные и последующие аспекты настоящего изобретения теперь обсуждают под соответствующими названиями разделов. Однако описания в каждом из разделов не являются обязательно ограниченными каждым конкретным разделом.

- 20 014985

Определение групп.

Группа аминокислот 1.

Группа аминокислот 1 представляет собой О1у8, Ахр9, 8ег10, Ьеи11, 8ег12, Туг15, О1у44, Ахр45, Т1ч46, О1и69, Ьеи70, О1у71, О1у72, Ахп73, Ахр74, О1у75, Ьеи76, О1п106, 11е107, Агд108, Ьеи109, Рго110, Туг113, Р1е121, Р1е139, Р1е140, Ме1141, Туг145, Ме1151, Ахр154, ΗΪ8157, О1у155, 11е156, Рго158.

Выбор высококонсервативных мотивов, таких как ΘΏ8Χ и каталитические остатки, из группы 1 отменен (остатки подчеркнуты). Чтобы избежать неопределенности, группа 1 определяет остатки аминокислот в радиусе 10 А от центрального атома углерода глицерина в активном центре модели 1ΐνΝ.

Группа аминокислот 2.

Группа аминокислот 2 (заметим, что нумерация аминокислот относится к аминокислотам в зрелой последовательности Р10480):

Ьеи17, Ьу822, Ме123, О1у40, Ахп80, Рго81, Ьу882, Ахп87, Ахп88, Тгр111, ν^Π, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, О1у159, О1п160, Ахп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Агд165, 8ег166, О1п167, Ьу8168, ν^169, Vа1170, О1и171, А1а172, Туг179, Ηΐδ180, Ахп181, Ме1209, Ьеи210, Аг§211, Ахп215, Ьу8284, Ме1285, О1п289 и ν^290.

Таблица выбранных остатков в группе 1 по сравнению с группой 2

Модель 1ΥΝ

Гомолог А.пуа

РЕАМ

Структура

АзрЗЗ

Ьеи35

Н я 98

А8П233

1гр129

Уа 130

Р 0480

Номер остатка зрелой последовательности

Ст п289

Уа1290

Азп98

Рго99

ЬузЮО

Ьуз82

Азп87

Азп88

Рпе139

Рпе140

Ме1141

Туг145

Ме115

А8р154

Сг1у155

Не 156

Н я 57

Ме1227

Ьеи228

Азп215

Ьуз284

Ме1285

А1а132

А8П133

Азр134

Туг135

Ьеи136

Ьеи 7

8ег18

Ьуз22

Ме123

Ст1у40

Азп80

Ме1303

АзрЗОо п307

Уа 308

Н 8309

Азр45

Тпг46

Н18180

Азп18

Ме1209

Ееи210

Ееи76

С η 06

11е107

Аге108

Ееи109

Ст и69

Ьеи70

Туг 197

Н18198

Азп199

Рго174

С1у177

Ст п 178

Азп179

С1у72

Азп73

Рго 156

Сг1у159

Ст п 60

Азп!61

Рго162 лег 63

А1а164

Аг§165

8ег 66

О п167

Еуз168

Уа 169

Уа 170

Ст и 171

А 1а172

- 21 014985

Группа аминокислот 3.

Группа аминокислот 3 идентична группе 2, но относится к кодирующей последовательности Аеготопак ка1тошс1ба (8ЕО ΙΌ N0: 28), т.е. номера остатков аминокислот в группе 3 на 18 больше, поскольку это отражает разницу между нумерацией аминокислот в зрелом белке (8Е0 ΙΌ N0: 2) по сравнению с белком, включающим сигнальную последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 28).

Зрелые белки 0Ό8Χ Аеготопак ка1тошс1ба (8Е0 ΙΌ N0: 28) и 0Ό8Χ Аеготопак ЬубгорЫ1а (8Е0 ΙΌ N0: 26) различаются по пяти аминокислотам. Они представляют собой ТЬт38ет, О1п182Ьук, О1и309А1а, 8ег310Акп, О1у318-, когда остаток ка1тошс1ба приведен в перечислении первым и остаток ЬубгорЫ1а приведен последним (см. фиг. 59). Белок ЬубгорЫ1а имеет длину всего 317 аминокислот и у него отсутствует остаток в положении 318. 0Ό8Χ Аеготопак ка1тошс1бае обладает значительно более высокой активностью в отношении полярных липидов, таких как галактолипидные субстраты, чем белок Аеготопак ЬубгорЫ1а. Проводят сканирование центра по всем пяти положениям аминокислот.

Группа аминокислот 4.

Группа аминокислот 4 представляет собой 83, 0182, Е309, 8310 и -318.

Группа аминокислот 5.

Группа аминокислот 5 представляет собой Г138, 015^ 8180, 818У, Υ30Γ, 0116^ Ό116Β, 0157^ Υ226Γ, 0228^ Υ230Γ.

Группа аминокислот 6.

Группа аминокислот 6 представляет собой 8ег3, Ьеи17, Ьук22, Ме(23, О1у40, Акп80, Рго81, Ьук82, Акп87, Акп88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, 01у159, 01п160, Акп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Агд165, 8ег166, 01п167, Ьук168, Уа1169, Уа1170, 01и171, А1а172, Туг179, Шк180, Акп181, 01п182, Ме(209, Ьеи210, Аг§211, Акп215, Ьук284, Ме(285, О1п289, Уа1290, О1и309, 8ег310, -318.

Нумерация аминокислот в группе 6 относится к остаткам аминокислот в Р10480 (8Е0 ΙΌ N0: 2) соответствующие аминокислоты в других скелетах последовательностей можно определить с помощью элайнмента гомологии и/или структурного элайнмента с Р10480 и/или НУИ.

Группа аминокислот 7.

Группа аминокислот 7 представляет собой 8ег3, Ьеи17, Ьук22, Ме(23, О1у40, Акп80, Рго81, Ьук82, Акп87, Акп88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, 01у159, 01п160, Акп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Агд165, 8ег166, 01п167, Ьук168, Уа1169, Уа1170, 01и171, А1а172, Туг179, Шк180, Акп181, 01п182, Ме(209, Ьеи210, Аг§211, Акп215, Ьук284, Ме(285, О1п289, Уа1290, О1и309, 8ег310, -318, Υ30Χ (где X выбрано из А, С, Ό, Е, Ο, Η, Ι, К, Ь, М, N Р, О, Я, 8, Т, У или Α), Υ226Χ (где Χ выбрано из А, С, Ό, Е, Ο, Η, Ι, К, Ь, М, N Р, О, Я, 8, Т, У или Α), Υ230Χ (где Χ выбрано из А, С, Ό, Е, Ο, Η, Ι, К, Ь, М, N Р, О, Я, 8, Т, У или Α), 818Χ (где Χ выбрано из А, С, Ό, Е, Г, Η, Ι, К, Ь, М, N Р, О, Я, Т, Α или Υ), Ό157Χ (где Χ выбрано из А, С, Е, Г, Ο, Η, Ι, К, Ь, М, Р, О, Я, 8, Т, У, Α или Υ).

Нумерация аминокислот в группе 7 относится к остаткам аминокислот в Р10480 (8Е0 ΙΌ N0: 2) соответствующие аминокислоты в других скелетах последовательностей можно определить с помощью элайнмента гомологии и/или структурного элайнмента с Р10480 и/или НУЫ.

Выделенный.

В одном аспекте предпочтительно, когда полипептид или белок, предназначенный для использования в настоящем изобретении, находится в выделенной форме.

Термин выделенный означает, что последовательность, по меньшей мере, в существенной степени свободна по меньшей мере от одного из других компонентов, с которыми последовательность по природе связана в естественных условиях или как она обнаружена в естественных условиях.

Очищенный.

В одном аспекте предпочтительно, когда полипептид или белок, предназначенный для использования в настоящем изобретении, находится в очищенной форме.

Термин очищенный означает, что последовательность находится в относительно очищенном состоянии - например по меньшей мере приблизительно 51% чистоты, или по меньшей мере приблизительно 75%, или по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, или по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, или по меньшей мере приблизительно 98% чистоты.

Клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, представленный в настоящем изобретении.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая либо полипептид, который имеет специфические свойства, как определено в данном контексте, либо полипептид, который пригоден для модификации, может быть выделена из любой клетки или организма, продуцирующего данный полипептид. В области техники хорошо известны различные методы выделения нуклеотидных последовательностей.

Например, геномную ДНК и/или библиотеку кДНК можно сконструировать, используя хромосомную ДНК или информационную РНК из организма, продуцирующего полипептид. Если последовательность аминокислот полипептида известна, можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и использовать для идентификации клонов, кодирующих полипептид из геномной библиотеки, полученной из организма. Альтернативно, для идентификации клонов, кодирующих полипептид, можно было бы

- 22 014985 использовать меченый олигонуклеотидный зонд, включающий последовательности, гомологичные другому известному гену полипептида. В последнем случае используют условия гибридизации и промывания более низкой жесткости.

Альтернативно, клоны, кодирующие полипептид, можно было бы идентифицировать путем инсерции фрагментов геномной ДНК в экспрессирующий вектор, такой как плазмида, трансформации фермент-отрицательной бактерии полученной библиотекой геномной ДНК и затем помещения трансформированной бактерии на агаризованную среду, содержащую фермент, ингибируемый полипептидом, чтобы получить возможность идентифицировать клоны, экспрессирующие полипептид.

В еще одном альтернативном варианте нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, можно получить синтетически с помощью разработанных стандартных методов, например фосфороамидитного метода, описанного в статье Веисаде 8.Ь. с1 а1. (1981), Те1гайейгоп Ьейетк, 22, р. 1859-1869, или метода, описанного в статье Маййек е1 а1. (1984), ЕМВО 1. 3, р. 801-805. В фосфороамидитном методе олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящие векторы.

Нуклеотидная последовательность может быть смешанной геномной и синтетической природы или смешанной геномной и кДНК природы, полученной лигированием фрагментов синтетической, геномной или ДНК природы (как требуется) в соответствии со стандартными методиками. Каждый лигированный фрагмент соответствует различным частям полной нуклеотидной последовательности. Последовательность ДНК можно получить также с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании специфических праймеров, например, как описано в и8 4683202 или в статье 8а1к1 В.К. е1 а1. (8с1епсе (1988), 239, р. 487-491).

Нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение охватывает также нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, имеющие специфические свойства, как определено в данном контексте.

Термин нуклеотидная последовательность, как используют в данном контексте, относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и ее вариантам, гомологам, фрагментам и производным (таким как ее части). Нуклеотидная последовательность может быть геномной или синтетической либо рекомбинантной природы, которая может быть двунитевой или однонитевой, представляя либо смысловую, либо антисмысловую нить.

Термин нуклеотидная последовательность в контексте настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Он предпочтительно означает ДНК, более предпочтительно кДНК кодирующей последовательности.

В предпочтительном варианте осуществления сама по себе нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, не покрывает нативную нуклеотидную последовательность в ее естественной среде, когда она связана с естественно ассоциированной с ней последовательностью(ями), которая(ые) также находится в своей естественной среде. Для простоты ссылки данный предпочтительный вариант осуществления называют ненативной нуклеотидной последовательностью. В связи с этим термин нативная нуклеотидная последовательность означает полную нуклеотидную последовательность, которая находится в своей естественной среде, и если она функционально связана с полным промотором, с которым она ассоциирована естественным образом, то данный промотор также находится в своей естественной среде. Таким образом, полипептид, представленный в настоящем изобретении, может экспрессироваться нуклеотидной последовательностью в своем нативном организме, но когда нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она естественным образом ассоциирована в данном организме.

Предпочтительно, когда полипептид не является нативным полипептидом. В этом плане термин нативный полипептид означает полный полипептид, который находится в своей нативной среде и когда он экспрессирован своей нативной нуклеотидной последовательностью.

Как правило, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном контексте, получают, используя технологии рекомбинантной ДНК (т.е. рекомбинантную ДНК). Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения нуклеотидную последовательность можно было бы синтезировать полностью или частично, используя химические методы, хорошо известные в области техники (см. статьи СатиГйегк М.Н. е1 а1. (1980), Ыис. Ас1йк Век. 8утр. 8ет. 215-23 и Ногп Т. е1 а1. (1980), Ыис. Ас1йк Век. 8утр. 8ет. 225-232).

Молекулярная эволюция.

После выделения кодирующей фермент нуклеотидной последовательности или идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей данный фермент, может потребоваться модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например может потребоваться подвергнуть последовательность мутации с целью получения фермента, соответствующего настоящему изобретению.

Мутации можно индродуцировать, используя синтетические олигонуклеотиды. Данные олигонуклеотиды включают нуклеотидные последовательности, фланкирующие требующиеся мутационные сайты.

- 23 014985

Подходящий метод описан в статье Могшада е1 а1. (В|о1ес11по1оду (1984), 2, р. 646-649). Другой метод интродукции мутаций в кодирующие фермент нуклеотидные последовательности описан в статье №коп и Ьопд (Апа1уйса1 ВюсйеткРу (1989), 180, р. 147-151).

Вместо сайт-направленного мутагенеза, как описано выше, можно интродуцировать мутации неспецифическим образом, например используя коммерческий набор, такой как набор для ПЦР-мутагенеза ОепеМогрй фирмы 81га1адепе или набор для множественного неспецифического ПЦР-мутагенеза фирмы С1оп1ес11. Заявка ЕР 0583265 относится к методам оптимизации мутагенеза на основе ПЦР, которые можно также сочетать с использованием мутагенных аналогов ДНК, таких как описаны в заявке ЕР 0866796. Способствующие ошибкам ПЦР-технологии подходят для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. Заявка АО 0206457 относится к молекулярной эволюции липазы.

Третий способ получения новых последовательностей представляет собой фрагментацию неидентичных нуклеотидных последовательностей либо при использовании любого числа рестрикционных ферментов, либо такого фермента, как ДНКаза Ι, и повторную сборку полных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки. Альтернативно можно использовать одну или множество неидентичных нуклеотидных последовательностей и интродуцировать мутации во время повторной сборки полной нуклеотидной последовательности. Технологии тасования ДНК и тасования семейств подходят для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. Подходящие способы осуществления тасования можно найти в заявках ЕР 0752008, ЕР 1138763, ЕР 1103606. Тасование можно также сочетать с другими формами ДНК-мутагенеза, как описано с заявках И8 6180406 и АО 01/34835.

Таким образом, имеется возможность получить множество сайт-направленных или неспецифических мутацией в нуклеотидной последовательности как ш у1уо, так и ш νίΙΐΌ и затем провести скрининг на повышенную функциональность кодируемого полипептида различными способами. Используя ш кШсо и экзоопосредованные методы (см. заявки АО 00/58517, И8 6344328, И8 6361974), например, можно осуществить молекулярную эволюцию, при которой полученный вариант сохраняет очень низкую гомологию с известными ферментами или белками. Данные варианты, полученные таким путем, могут обладать существенной структурной аналогией с известными ферментами трансферазами, но иметь очень низкую гомологию последовательности аминокислот.

В качестве неограничивающего примера, кроме того, мутации или природные варианты полинуклеотидной последовательности могут быть подвергнуты рекомбинации либо с диким типом, либо с другими мутациями с целью получения новых вариантов. Данные новые варианты также можно подвергнуть скринингу на повышенную функциональность кодируемого полипептида.

Применение вышеупомянутых и аналогичных методов молекулярной эволюции дает возможность идентификации и селекции вариантов ферментов, представленных в настоящем изобретении, которые обладают предпочтительными характеристиками, без предварительного знания структуры или функции белка и обеспечивает продукцию непредсказанных, но полезных мутаций и вариантов. Имеется множество примеров применения молекулярной эволюции в области оптимизации или изменения активности фермента, данные примеры включают, но не ограничены одним или более из следующих: оптимизированная экспрессия и/или активность в клетке-хозяине или ш уйго; повышенная ферментная активность; измененная специфичность в отношении субстрата и/или продукта; повышенная или пониженная ферментативная или структурная стабильность; измененная ферментативная активность/специфичность в предпочтительных условиях окружающей среды, например температуры, рН и/или субстрата.

Как будет очевидно компетентному специалисту в данной области, при использовании инструментов молекулярной эволюции можно изменить фермент с целью повышения функциональности фермента.

Соответственно, липидацилтрансфераза, используемая в изобретении, может представлять собой вариант, т.е. может включать по меньшей мере одну замену, делецию или добавление аминокислоты по сравнению с исходным ферментом. Варианты фермента сохраняют по меньшей мере 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 99% гомологию с исходным ферментом. Подходящие исходные ферменты могут включать любой фермент с активностью эстеразы или липазы. Предпочтительно, когда исходный фермент выравнивают с консенсусной последовательностью рГат00657.

В предпочтительном варианте осуществления вариант фермента липидацилтрансферазы сохраняет или включает по меньшей мере один или более остатков аминокислот консенсусной последовательности рГат00657, обнаруженных в блоках ΟΌ8Χ, ОАкЭУ и НРТ.

Ферменты, такие как липазы, с отсутствующей или с низкой активностью липидацилтрансферазы в водной среде можно подвергнуть мутированию, используя инструменты молекулярной эволюции для интродукции или усиления трансферазной активности, получая при этом фермент липидацилтрансферазу с существенной трансферазной активностью, подходящий для использования в композициях и способах, представленных в настоящем изобретении.

Соответственно липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в изобретении, может представлять собой вариант с повышенной ферментативной активностью в отношении фосфолипидов по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно, когда данные варианты также имеют низкую или не имеют активности в отношении лизополярных липидов. Повышенная активность в отношении фос

- 24 014985 фолипидов может также являться результатом гидролиза и/или трансферазной активности или комбинации обоих факторов.

Вариант липидацилтрансферазы, предназначенный для использования в изобретении, может иметь пониженную активность в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов по сравнению с исходным ферментом.

Соответственно вариант фермента может не обладать активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов.

Альтернативно, вариант фермента, предназначенный для использования в изобретении, может иметь повышенную активность в отношении триглицеридов и/или может также иметь повышенную активность в отношении одного или более из следующих соединений: полярных липидов, фосфолипидов, лецитина, фосфатидилхолина.

Известны варианты липидацилтрансферазы, и один или более данных вариантов могут подходить для использования в способах и вариантах применения, соответствующих настоящему изобретению, и/или в композициях ферментов, соответствующих настоящему изобретению. Только в качестве примера варианты липидацилтрансфераз, описанные в следующих ссылках, могут быть использованы согласно настоящему изобретению: см. статьи Ηί1!οη & Виск1еу ί. Βίο1. Скет. 15 1апиагу, 1991; 266(2): 997-1000; КоЬеПьоп е! а1. I. Вю1. Скет. 21 1апиагу, 1994; 269(3): 2146-50; Вгиткк е! а1. I. Вас!ег1о1, Арп1 1996; 178(7): 2060-4; Рее1тап е! а1. Рго!еш 8с1. Магск 1998; 7(3): 587-99.

Последовательности аминокислот.

Настоящее изобретение охватывает также последовательности аминокислот полипептидов, обладающих специфическими свойствами, как определено в данном контексте.

Как используют в данном контексте, термин последовательность аминокислот является синонимом термина полипептид и/или термина белок. В ряде случаев термин последовательность аминокислот является синонимом термина пептид.

Последовательность аминокислот можно получить/выделить из подходящего источника, или она может быть создана синтетическим путем, или может быть получена с использованием технологий рекомбинантной ДНК.

Соответственно последовательности аминокислот можно получить из выделенных полипептидов, описанных в данном контексте, с помощью стандартных методик.

Одним из подходящих методов определения последовательностей аминокислот из выделенных полипептидов является следующий.

Очищенный полипептид может быть лиофилизирован и 100 мкг лиофилизированного материала растворяют в 50 мкл смеси 8 М мочевины и 0,4 М гидрокарбоната аммония, рН 8,4. Растворенный белок можно денатурировать и восстановить в течение 15 мин при 50°С после покрытия слоем азота и добавления 5 мкл 45 мМ динитротрейтола. После охлаждения до комнатной температуры можно добавить 5 мкл 100 мМ йодацетамида для того, что дериватизировать цистеиновые остатки в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте под азотом.

К вышеуказанной реакционной смеси можно добавить 135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Ьук-С в 5 мкл воды и можно осуществить разложение при 37°С под азотом в течение 24 ч.

Полученные в результате пептиды можно разделить обращено-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) на колонке УУОАС С18 (0,46x15 см; 10 мкм; Тке 8ерага!юп Огоир, СаНГогша, И8А) при использовании растворителя А: 0,1% ТФУК (трифторуксусная кислота) в воде и растворителя В: 0,1% ТФУК в ацетонитриле. Отобранные пептиды можно повторно хроматографировать на колонке ЭеуекхП С18, используя ту же систему растворителей, перед ^концевым секвенированием. Секвенирование можно осуществить с помощью секвенатора Арркеб ВюхуДепъ 476А при использовании быстрых циклов с импульсным введением жидкости согласно инструкциям изготовителя (фирма АррНеб Вюкуйетк, СаНГогша, И8А).

Идентичность последовательности или гомология последовательности.

Настоящее изобретение охватывает также использование последовательностей, имеющих степень гомологии последовательности с последовательностью(ями) аминокислот полипептида, обладающего специфическими свойствами, определенными в данном контексте, или любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей данный полипептид (далее обозначают как гомологичная последовательность^)). В данном случае термин гомолог означает элемент, имеющий некоторую гомологию с данными последовательностями аминокислот и данными нуклеотидными последовательностями. В данном случае термин гомология может быть приравнен к термину идентичность.

Гомологичная последовательность аминокислот и/или нуклеотидная последовательность должна давать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или повышает активность фермента.

В настоящем контексте предусматривают, что гомологичная последовательность включает последовательность аминокислот, которая может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95 или 98% идентичной заданной последовательности. Как правило, гомологи будут включать такие же активные центры и т.п., как заданная последовательность аминокис

- 25 014985 лот. Хотя гомологию можно также рассматривать в терминах близости (т.е. остатков аминокислот, имеющих близкие химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно, когда гомологию выражают в терминах идентичности последовательности.

В настоящем контексте предусматривают, что гомологичная последовательность включает нуклеотидную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95 или 98% идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, представленный в изобретении (заданная последовательность). Как правило, гомологи будут включать одинаковые последовательности, которые кодируют такие же активные центры и т.п., как заданная последовательность. Хотя гомологию можно также рассматривать в терминах близости (т. е. остатков аминокислот, имеющих близкие химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно, когда гомологию выражают в терминах идентичности последовательности.

Сравнения гомологии можно проводить визуально или, более обыкновенно, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Данные коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитать % гомологии между двумя или более последовательностями.

Процент гомологии можно рассчитать относительно соседних последовательностей, т. е. одну последовательность выравнивают с другой последовательностью и каждую аминокислоту в одной последовательности непосредственно сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за один раз. Это называют сравнительный анализ без гэпов. Как правило, данные сравнительные анализы без гэпов проводят только при относительно маленьком числе остатков.

Хотя это очень простой и совместимый метод, в нем не принимают во внимание, что, например, в идентичной в других отношениях паре последовательностей одна инсерция или делеция будет вызывать выпадение следующих остатков аминокислот из элайнмента, таким образом потенциально приводя в результате к большому снижению % гомологии при проведении общего элайнмента. Впоследствии разрабатывают большинство методов сравнения последовательностей, чтобы получить оптимальные элайнменты, в которых принимают во внимание возможные инсерции и делеции без неправильного определения штрафа для всего результата гомологии. Это достигается введением гэпов в сравниваемые последовательности для того, чтобы попытаться довести до максимума локальную гомологию.

Однако в данных более сложных методах устанавливают штрафы за гэпы за каждый гэп, который появляется при сравнительном анализе, так что за одинаковое число идентичных аминокислот при сравнительном анализе последовательности с насколько это возможно маленьким числом гэпов (отражающим более высокое родство между двумя сравниваемыми последовательностями) будут получать более высокое значение, чем результат элайнмента с множеством гэпов. Как правило, используют выражение аффинные цены гэпов, которое отражает относительно высокую цену наличия гэпа и меньший штраф за каждый последующий остаток в гэпе. Это представляет собой наиболее широко используемую систему подсчета гэпов. Высокие штрафы за гэпы, конечно, будут давать оптимизированные элайнменты с меньшим числом гэпов. Большинство программ элайнмента допускают модификацию штрафов за гэпы. Однако предпочтительно, когда используют значения, заданные по умолчанию, при использовании данных программ для сравнений последовательностей. Например, при использовании пакета ССС Аксопкт Век1П( штраф за гэп по умолчанию для последовательностей аминокислот составляет -12 за гэп и -4 за каждое удлинение.

Вследствие этого для вычисления максимального % гомологии необходимо получение оптимального элайнмента, учитывающего штрафы за гэпы. Подходящей компьютерной программой для осуществления данного элайнмента является пакет программ ССС А1ксоик1и Век1П( (см. статью Эеуегеих е1 а1. 1984, Уис. Лайк Векеагсй, 12, р. 387). Примеры других программ, которые могут проводить сравнения последовательностей, включают, но без ограничения перечисленным, пакет программ ВЬЛ8Т (см. монографию ЛикиЬе1 е1 а1. 1999, 81юй Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 4-е изд., глава 18), БЛ8ТЛ (см. статью Л11кс1и.11 е1 а1. 1990, ί. Мо1. Вю1. 403-410) и набор инструментов для сравнения СЕХЕА0ВК8. Обе программы, ВЬЛ8Т и БЛ8ТЛ, доступны для поиска в автономном и неавтономном режимах (см. ЛикиЬе1 е1 а1. 1999, р. 7-58 - 7-60). Однако для некоторых вариантов применения предпочтительно использование программы ССС. Новый инструмент, названный ВЬЛ8Т 2 8едиепсек, также доступен для сравнения белковой и нуклеотидной последовательности (см. БЕМ8 МюгоЬю1. Ьей. 1999, 174(2): 247-50; БЕМ8 МюгоЬю1. Ьей. 1999, 177(1): 187-8 и 1айапа@псЬ1.п1т.шй.доу).

Хотя конечный % гомологии можно измерить в терминах идентичности, сам процесс элайнмента, как правило, не основан на сравнении пар по принципу все или ничего. Вместо этого в основном используют масштабную матрицу для подсчета подобия, которая устанавливает результаты для каждого попарного сравнения на основе химической близости или эволюционного расстояния. Примером такой обычно используемой матрицы является матрица ВЬ08ИМ62 - матрица, заданная по умолчанию для пакета программ ВЬЛ8Т. В программах ССС А1ксопк1п, как правило, используют либо общедоступные значения, заданные по умолчанию, либо заказную таблицу сравнения символов, если она прилагается (дальнейшие подробности см. в руководстве для пользователя). Для ряда приложений предпочтительно использовать для пакета ССС общедоступные значения, заданные по умолчанию, или в случае другой программы - заданную по умолчанию матрицу, такую как ВЬ08ИМ62.

- 26 014985

Альтернативно, процент гомологии можно рассчитать, используя функцию множественного элайнмента в программе ^NΑ8I8™ (НЛасЫ 8оГ1маге), основанной на алгоритме, аналогичном С^υ8ТΑ^ (см. статью Н1§дп8 Э.О. & 8Багр Р.М. (1988), Оепе 73(1), 237-244).

После того как программа даст оптимальный сравнительный анализ, возможно рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Программа, как правило, делает это как часть сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения используют следующую программу и установки для расчета процента гомологии/идентичности. Для последовательностей аминокислот процент идентичностей (гомологии) или положительные результаты вычисляют с помощью ΑΠ^Χ Vес1огNТI ^ес!ог КП Αάνаηсе 9.1 фирмы 1пуйго§еп СогрогаЛоп, СагкЬаД СаНогша, υ8Α), причем для каждой возможной пары последовательностей аминокислот установки представляют собой параметры, заданные по умолчанию (штраф за открытие гэпа составляет 10, штраф за удлинение гэпа - 0,1).

Последовательности могут также иметь делеции, инсерции или замены остатков аминокислот, которые образуют молчащее изменение и в результате приводят к образованию функционально эквивалентной субстанции. Преднамеренные замены аминокислот можно сделать на основе близости полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, пока сохраняется вторичная связывающая активность субстанции. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие близкие значения гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.

Консервативные замены можно сделать, например, согласно нижеприведенной таблице. Аминокислоты из одного блока во второй колонке и предпочтительно из одной строки в третьей колонке можно заменять одна другой.

Настоящее изобретение также охватывает гомологичную замену (оба термина, замена и замещение, используют в данном контексте для обозначения взаимообмена имеющихся остатков аминокислот с альтернативным остатком), которая может существовать, т.е. замена подобного на подобное, например основной на основную, кислой на кислую, полярной на полярную и т.п. Может также происходить негомологичная замена, т. е. остатка из одного класса на другой или, альтернативно, предусматривающая включение неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначают как Ζ), диаминомасляная кислота (далее обозначают как В), норлейцин (далее обозначают как О), пиридилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.

Могут быть также проведены замещения неприродными аминокислотами.

Варианты последовательностей аминокислот могут включать подходящие спейсерные группы, которые могут быть введены между двумя остатками аминокислот последовательности, в том числе алкильные группы, такие как метильная, этильная или пропиловая группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Следующая форма вариации, которая включает присутствие остатков аминокислот в пептоидной форме, будет хорошо понятна компетентным специалистам в данной области. Чтобы избежать неопределенности, термин пептоидная форма используют для ссылки на остатки вариантов аминокислот, в которых α-углеродная замещающая группа находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Методы получения пептидов в пептоидной форме известны в области техники, например, см. статьи 81топ Κ.Ι. е1 а1., РNΑ8 (1992), 89(20), 9367-9371 и НогмеИ Э.С., Тгепёз Бю1есЬпо1. (1995), 13(4), 132-134.

Нуклеотидные последовательности, предназначенные для применения в настоящем изобретении или кодирующие полипептид, обладающий специфическими свойствами, описанными в данном контексте, могут включать в своей структуре синтетические или модифицированные нуклеотиды. В области техники известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонатные и фосфоротиоатные скелеты и/или введение акридиновых или полилизиновых цепей в 3'- и/или 5'-концы молекулы. Для целей настоящего изобретения следует иметь в виду, что нуклеотидные последовательности, описанные в данном контексте, можно модифицировать любым из методов, имеющихся в области техники. Данные модификации могут быть проведены с целью повышения активности т у1уо или продолжительности существования нуклеотидных последовательностей.

- 27 014985

Настоящее изобретение также охватывает использование нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны последовательностям, представленным в данном контексте, или любое производное, фрагмент или его производное. Если последовательность комплементарна ее фрагменту, то данную последовательность можно использовать в качестве зонда для идентификации близких кодирующих последовательностей в других организмах и т. п.

Полинуклеотиды, которые не являются на 100% гомологичными последовательностям, присутствующим в настоящем изобретении, но входят в объем изобретения, можно получить рядом способов. Другие варианты последовательностей, описанные в данном контексте, можно получить, например, зондированием библиотек ДНК, полученных у ряда субъектов, например субъектов из различных популяций. Кроме того, можно получить другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, особенно клеточные гомологи, обнаруженные в клетках млекопитающих (например, в клетках крысы, мыши, крупного рогатого скота и приматов), и данные гомологи и их фрагменты, как правило, будут способны к селективной гибридизации с последовательностями, показанными в перечне последовательностей, приведенном в данном материале. Данные последовательности можно получить зондированием библиотек кДНК, полученных из/или библиотек геномных ДНК других видов животных, и зондированием данных библиотек зондами, включающими полностью или часть любой из последовательностей в прилагаемых перечнях последовательностей в условиях сред высокой жесткости. Аналогичные рассуждения используют для получения видовых гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных последовательностей, представленных в изобретении.

Варианты и штаммовые/видовые гомологи можно также получить, используя ПЦР с вырожденными праймерами, в которой будут использованы праймеры, созданные для получения направленности на последовательности в вариантах и гомологах, кодирующие консервативные последовательности аминокислот в последовательностях, представленных в настоящем изобретении. Консервативые последовательности можно предсказать, например, посредством элайнмента последовательностей аминокислот из нескольких вариантов/гомологов. Элайнменты последовательности можно провести, используя компьютерные программы, известные в области техники. Например, широко используют программу ОСО Аксопкт Р11еИр.

Праймеры, используемые в вырожденной ПЦР, будут включать одно или более вырожденных положений и будут использованы в условиях жесткости ниже тех, которые используют для клонирования последовательностей с праймерами одной и той же последовательности относительно известных последовательностей.

Альтернативно, данные полинуклеотиды можно получить сайт-направленным мутагенезом охарактеризованных последовательностей. Это может быть использовано, когда, например, требуются изменения последовательности молчащего кодона с целью оптимизации предпочтительности кодонов для определенной клетки-хозяина, в которой экспрессируются полинуклеотидные последовательности. Другие изменения последовательности могут потребоваться для интродукции сайтов распознавания рестрикционного полипептида или для изменения свойства или функции полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности), представленные в изобретении, можно использовать для получения праймера, например ПЦР-праймера, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного уходящей меткой, принятыми средствами с использованием радиоактивных или нерадиоактивных меток либо полинуклеотиды можно клонировать в векторы. Данные праймеры, зонды и другие фрагменты будут иметь длину по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 20, например по меньшей мере 25, 30 или 40 нуклеотидов, и они также охватываются термином полинуклеотиды, представленные в изобретении, как используют в данном контексте.

Полинуклеотиды, такие как ДНК-полинуклеотиды и зонды, представленные в изобретении, можно получить рекомбинантно, синтетическим или любыми средствами, доступными компетентным специалистам в данной области. Их можно также клонировать стандартными методами.

Как правило, праймеры будут получать синтетическими средствами, включая постадийное получение требующейся последовательности нуклеиновой кислоты по одному нуклеотиду за один раз. Методики осуществления этой цели с использованием автоматизированных технологий легко доступны в области техники.

Более длинные полинуклеотиды, как правило, будут получать с использованием рекомбинантных средств, например при использовании методик клонирования с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). Данные методики будут включать получение пары праймеров (например, приблизительно из 15-30 нуклеотидов), фланкирующих направленную на липид последовательность, которую требуется клонировать, осуществление контакта праймеров с мРНК или кДНК, полученных из клетки животного или человека, проведение полимеразной цепной реакции в условиях, которые приводят к амплификации требующегося участка, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и выделение амплифицированной ДНК. Можно сконструировать праймеры, включающие подходящие сайты распознавания рестриктазами, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий клонирующий вектор.

- 28 014985

Гибридизация.

Настоящее изобретение охватывает также последовательности, которые комплементарны последовательностям, представленным в настоящем изобретении, или последовательности, которые способны гибридизоваться либо с последовательностями, представленными в настоящем изобретении, либо с последовательностями, которые им комплементарны.

Термин гибридизация, как используют в данном контексте, будет включать способ, посредством которого нить нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной нитью посредством спаривания оснований, а также способ амплификации, осуществляемый в технологиях полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Настоящее изобретение охватывает также применение нуклеотидных последовательностей, которые способны гибридизоваться с последовательностями, которые комплементарны заданным последовательностям, обсуждаемым в данном контексте, или любому производному, фрагменту или его производному.

Настоящее изобретение охватывает также последовательности, которые комплементарны последовательностям, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте.

Условия гибридизации основаны на температуре плавления (Тп) нуклеотид-связывающего комплекса, как описано в монографии Вегдег и К1тте1 (1987), Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд Тсс11пк|иск. МеШобк ίη Епгуто1оду, νο1. 152, Лсабетю Ргекк, 8ап Э|едо СА), и обеспечивают определенную жесткость, как объясняют ниже.

Максимальная жесткость, как правило, имеет место приблизительно при Тп 5°С (5°С ниже Тп зонда); высокая жесткость приблизительно при 5-10°С ниже Тп; средняя жесткость приблизительно при 10-20°С ниже Тп и низкая жесткость приблизительно при 20-25°С ниже Тп. Как будут иметь в виду компетентные специалисты в области техники, гибридизацию максимальной жесткости можно использовать для идентификации или детекции нуклеотидных последовательностей, тогда как гибридизацию средней (или низкой) жесткости можно использовать для идентификации или детекции близких или родственных полинуклеотидных последовательностей.

Предпочтительно, когда настоящее изобретение охватывает последовательности, которые комплементарны последовательностям, которые способны гибридизоваться в условиях высокой жесткости или условиях средней жесткости с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном контексте.

Более предпочтительно, когда настоящее изобретение охватывает последовательности, которые комплементарны последовательностям, которые способны гибридизоваться в условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1х88С {1х88С=0,15 М ЫаС1, 0,015 М цитрат Ыа, рН 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном контексте.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте (включая последовательности, комплементарные обсуждаемым в данном контексте).

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны последовательностям, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте (включая последовательности, комплементарные обсуждаемым в данном контексте).

В объем настоящего изобретения включены также полинуклеотидные последовательности, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте, в условиях средней до максимальной жесткости.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение покрывает нуклеотидные последовательности, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте, или их комплементом в жестких условиях (например, 50°С и 0,2х88С).

В более предпочтительном аспекте настоящее изобретение покрывает нуклеотидные последовательности, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном контексте, или их комплементом в условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1х88С).

Экспрессия полипептидов.

Нуклеотидная последовательность, предназначенная для использования в настоящем изобретении или для кодирования полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данном контексте, может быть включена в рекомбинантный реплицирующийся вектор. Вектор можно использовать для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме полипептида в и/или из совместимой клетки-хозяина. Экспрессию можно контролировать, используя контролирующие последовательности, которые включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Могут быть использованы прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Можно использовать тканеспецифические или специфические в отношении стимулов промото

- 29 014985 ры. Могут быть также использованы химерные промоторы, включающие элементы последовательностей из двух или более различных промоторов, описанных выше.

Полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином посредством экспрессии нуклеотидной последовательности, может секретироваться или содержаться внутри клетки в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Можно создать кодирующие последовательности с сигнальными последовательностями, которые направляют секрецию последовательностей, кодирующих субстанцию, через мембрану определенной прокариотической или эукариотической клетки.

Экспрессирующий вектор.

Термин экспрессирующий вектор означает конструкцию, способную в экспрессии ίη νίνο или ίη νίΐτο.

Предпочтительно, когда экспрессирующий вектор инкорпорирован в геном организма. Термин инкорпорированный предпочтительно покрывает стабильную инкорпорацию в геном.

Нуклеотидная последовательность, представленная в настоящем изобретении или кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, находится в векторе, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями, так что регуляторные последовательности способны обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности подходящим организмом-хозяином, т.е. вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

Векторами, представленными в настоящем изобретении, можно трансформировать подходящую клетку-хозяин, как описано ниже, чтобы получить экспрессию полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данном контексте.

Выбор вектора, например плазмиды, космиды, вирусного или фагового вектора, будет часто зависеть от клетки-хозяина, для интродукции в которую он предназначен.

Векторы могут содержать один или более генов селективных маркеров, таких как ген, который обусловливает антибиотикоустойчивость, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Альтернативно, селекцию можно осуществлять путем котрансформации (как описано в заявке \О 91/17243).

Векторы можно использовать ίη νίίτο, например для продукции РНК, или использовать для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.

Так, в следующем варианте осуществления изобретение представляет собой способ получения нуклеотидных последовательностей, представленных в настоящем изобретении, или нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как описано в данном контексте, путем интродукции нуклеотидной последовательности в реплицирующийся вектор, интродукции вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивание клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают репликацию вектора.

Вектор может, кроме того, включать нуклеотидную последовательность, дающую возможность вектору реплицироваться в данной клетке-хозяине. Примерами данных последовательностей являются точки начала репликации плазмид рИС19, рЛСУС177, рИВ110, рЕ194, рАМВ1 и рИ702.

Регуляторные последовательности.

В ряде вариантов использования нуклеотидная последовательность, предназначенная для использования в настоящем изобретении, или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий специфическими признаками, как описано в данном контексте, может быть функционально связана с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, например, выбранной клеткой-хозяином. В качестве примера настоящее изобретение покрывает вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в настоящем изобретении, функционально связанную с данной регуляторной последовательностью, т.е. вектор является экспрессирующим вектором.

Термин функционально связанный относится к расположению рядом, при котором описанные компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать предназначенным им образом. Регуляторная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Термин регуляторные последовательности включает промоторы и энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии.

Термин промотор используют в нормальном смысле, принятом в области техники, например сайт связывания РНК-полимеразы.

Повышенный уровень экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, может также достигаться путем отбора гетерологичных регуляторных участков, например промотора, лидера секреции и терминаторных участков.

Предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность, представленная в настоящем изобретении, может быть функционально связана, по меньшей мере, с промотором.

- 30 014985

Примеры подходящих промоторов, чтобы направлять транскрипцию нуклеотидной последовательности в бактериальном, грибном или вирусном хозяине, хорошо известны в области техники.

Конструкции.

Термин конструкция, который является синонимом таких терминов, как конъюгат, кассета и гибрид, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как описано в данном контексте, предназначенный для использования согласно настоящему изобретению, непосредственно или опосредованно присоединенную к промотору. Примером опосредованного присоединения является наличие подходящей спейсерной группы, такой как последовательность интрона, такая как 8й1-интрон или интрон АОН, находящийся между промотором и нуклеотидной последовательностью, представленной в настоящем изобретении. Это относится также к термину слитый в связи с настоящим изобретением, который включает непосредственное или опосредованное присоединение. В ряде случаев термины не покрывают природную комбинацию нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обычно ассоциированной с промотором гена дикого типа, и когда они оба находятся в своей естественной среде.

Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, который дает возможность селекции генетической конструкции.

Для ряда вариантов применения предпочтительно, когда конструкция включает, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, представленную в настоящем изобретении, или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как описано в данном контексте, функционально связанную с промотором.

Клетки-хозяева.

Термин клетка-хозяин в связи с настоящим изобретением включает любую клетку, которая содержит либо нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как описано в данном контексте, либо экспрессирующий вектор, как описано выше, и которую используют в рекомбинантной продукции полипептида, обладающего специфическими свойствами, как описано в данном контексте.

Таким образом, следующий вариант осуществления настоящего изобретения представляет клеткихозяева, трансформированные или трансфицированные нуклеотидной последовательностью, представленной в настоящем изобретении, или нуклеотидной последовательностью, которая экспрессирует полипептид, обладающий специфическими свойствами, как описано в данном контексте. Клетки будут выбраны так, чтобы они были совместимы с указанным вектором, и могут, например, быть прокариотическими (например, бактериальными), грибными, дрожжевыми или растительными клетками. Предпочтительно, когда клетки-хозяева не являются клетками человека.

Примерами подходящих бактериальных организмов-хозяев являются грамотрицательная бактерия или грамположительные бактерии.

В зависимости от природы нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как описано в данном контексте, и/или необходимости дальнейшего процессинга экспрессированного белка могут быть предпочтительными эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы. В общем дрожжевые клетки предпочтительны относительно грибных клеток, поскольку ими легче манипулировать. Однако некоторые белки либо слабо секретируются из дрожжевой клетки, либо в ряде случаев не процессируются должным образом (например, гипергликозилирование в дрожжах). В ряде случаев следует выбрать другой грибной организм-хозяин.

Использование подходящих клеток-хозяев, таких как дрожжевые, грибные и растительные клеткихозяева, может привести к пост-трансляционным модификациям (например, миристоилированию, гликозилированию, укорочению, липидизации и фосфорилированию тирозина, серина или треонина), как может потребоваться для обеспечения оптимальной биологической активности продуктов экспрессии, представленных в настоящем изобретении.

Клетка-хозяин может представлять собой штамм с дефицитом протеазы или протеаза(-)-штамм. Организм.

Термин организм в связи с настоящим изобретением включает любой организм, который мог бы включать нуклеотидную последовательность, представленную в настоящем изобретении, или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, и/или полученные из него продукты.

Подходящие организмы могут включать прокариоты, гриб, дрожжи или растение.

Термин трансгенный организм касательно настоящего изобретения включает любой организм, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, и/или полученные из него продукты, и/или в котором промотор может обеспечить возможность экспрессии в организме нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте.

- 31 014985

Предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность инкорпорирована в геном организма.

Термин трансгенный организм не покрывает нативный нуклеотид, кодирующий последовательности в их естественной среде, когда они находятся под контролем своего естественного промотора, который также находится в своей естественной среде.

Вследствие этого трансгенный организм, представленный в настоящем изобретении, включает организм, содержащий любую из или комбинации нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, конструкции, как определено в данном контексте, векторы, как определено в данном контексте, плазмиды, как определено в данном контексте, клетки, как определено в данном контексте, или их продукты. Например, трансгенный организм может также включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, под контролем гетерологичного промотора.

Трансформация клеток-хозяев/организма.

Как указано ранее, организм-хозяин может быть прокариотическим или эукариотическим организмом. Примеры подходящих прокариотических хозяев включают Е.сой и ВасШик кнЫШк.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой бактерии, предпочтительно грамположительные бактерии, предпочтительно клетка-хозяин выбрана из АсЕпоЬас1спа, такой как ВюЕЕоЬас1спа и Асготопак, особенно предпочтительно Асготопак ка1тошс1Еа. Еще более предпочтительными являются АсЕпотюсШск, такие как СогупсЬас1спа, в особенности СогупсЬас1сгшт д1и1атюит и №сагФа. Особенно предпочтительны 81гср1отусс1ассас, такие как 8Еср1отусск, в особенности 8.1МЕапк.

Микробный хозяин может быть использован для экспрессии гена галактозидазы, например ΕиЬасΐсπа, АгсНса или Еипд1, в том числе дрожжи. Предпочтительными являются ΕиЬасΐсπа, например ЕигаюШск (грамположительные бактерии с низким содержанием ГЦ), такие как ВасШик киЬЕЕк и другие виды ВасШик, молочно-кислые бактерии, такие как виды рода ЬасШЬасШик и ЬасШсоссик.

Предпочтительны также грамотрицательные Рго1соЬас1спа, в частности 6аттарго1соЬас1спа, такие как виды хозяев, принадлежащие к роду РксиЕотопак, ХапШотопак, СЕгоЬас1сг и ВксЕсг1сЫа, особенно БксЕспсШа сой.

Предпочтительно, когда вид хозяина является грамположительным экспрессирующим хозяином, таким как Асготопак ка1тошс1Еа, 81гср1отусск 1МЕапк или СогупсЬайсгшт д1Шатюит, как подробно описано в заявке 6В № 0513859.9.

В другом варианте осуществления клетка-хозяин относится к тому же роду, что нативный вид хозяина, т. е. рекомбинантный ген интродуцируют и экспрессируют в виде того же рода, что и вид, из которого выделен рекомбинантный ген.

В другом варианте осуществления клетка-хозяин относится к нативному виду хозяина, т. е. рекомбинантный ген реинтродуцируют и экспрессируют в том же виде, из которого выделен рекомбинантный ген.

Описание трансформации прокариотических хозяев хорошо обосновано в области техники, например см. 8атЬгоок с! а1. (Мо1сси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаШгу Мапиа1, 2-е изд., 1989, Со1Е 8рппд НагЬог ЬаЬогаШгу Ргскк). При использовании прокариотического хозяина может потребоваться, чтобы нуклеотидная последовательность была соответствующим образом модифицирована перед трансформацией, например, посредством удаления интронов.

В другом варианте осуществления трансгенный организм может быть представлен дрожжами.

Клетки филаментозных грибов можно трансформировать, используя различные методы, известные в области техники, например способом, включающим образование протопластов и трансформацию протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки известным путем. Использование АкрсгдШик в качестве микроорганизма-хозяина описано в заявке ЕР 0238023.

Другим организмом-хозяином может быть растение. Обзор основных методик, используемых для трансформации растений, можно найти в статьях РоЕукик (Аппи. Ест. Р1ап1. РЕукю1. Р1ап1. Мо1. Вю1. (1991), 42: 205-225) и ОшкЮн (Адго-ЕооЕ-1пЕикЕу Ηί-ТссЕ, МагсЕ/Аргй 1994, 17-27). Дополнительные данные по трансформации растений можно найти в ЕР-А-0449375.

Основные данные по трансформации грибов, дрожжей и растений представлены в следующих разделах.

Трансформированный гриб.

Организм-хозяин может представлять собой гриб, такой как филаментозный гриб. Примеры данных подходящих хозяев включают любого представителя, принадлежащего родам Тйсгтотусск, Асгстошит, АкрсгдШик, РсшсШшт, Мисог, №игокрога, ТпсЕоЕсгта и т.п.

Обзор данных по трансформации филаментозных грибов приведен в И8-А-5741665, где указывают, что стандартные методики трансформации филаментозных грибов и культивирования грибов хорошо известны в области техники. Расширенный обзор методик применительно к Исгакка находится, например, в статье Эат18 и Ес 8сггск, МсШоЕк Вηζуто1 (1971), 17А: 79-143.

- 32 014985

Дополнительные данные по трансформации филаментрозных грибов приведены в виде обзора в И8-А-5674707.

В одном аспекте организм-хозяин может быть из рода АкрегдШик, например АкрегдШик шдег.

Трансгенный АкрегдШик, представленный в настоящем изобретении, можно также получить следующим образом, например согласно данным Титег 6. 1994 (УесЮгк Гог депейс ташри1а!юп, монография под ред. МагйпеШ 8.Ό., Ктдйот ТВ. АкрегдШик: 50 уеагк оп. Ргодгекк ш тйик1па1 тюгоЬю1оду, уо1. 29. Е1кеу1ег Атк!егйат, 1994, р. 641-666).

Обзор по экспрессии генов в филаментозных грибах приведен в статьях Рип! е! а1. (2002). Тгепйк В1о!есНпо1. Мау 2002; 20(5): 200-6, АгсНег & РеЬегйу Сгй. Веу. В1о!есЬпо1. (1997), 17(4): 273-306.

Трансформированные дрожжи.

В другом варианте осуществления трансгенный организм может представлять собой дрожжи.

Обзор принципов экспрессии гетерологичных генов в дрожжах представлен, например, в МеШойк Мо1. Вю1. (1995), 49: 341-54 и Сигг Орт. Вю!есйпо1. Ос!оЬег, 1997; 8(5): 554-60.

В этом плане дрожжи, такие как виды Зассйаготусек сегеуыае или РюЫа рак!опк (см. ТЕМ8 МюгоЬю1. Веу. 2000, 24(1): 45-66), можно использовать как носитель экспрессии гетерологичного гена.

Обзор принципов экспрессии гетерологичных генов в Зассйаготусек сегеуыае и секреции продуктов генов приведен Е. Н1псНс11ГГе. Е. Кеппу (1993, монография Уеак! ак а уеЫс1е Гог (Не ехргеккюп оГ Не!его1одоик депек, Уеак!к, уо1. 5, Ей. АпШопу Н. Воке и 1. 8!иаЛ Наткоп, 2-е изд., Асайетю Ргекк Ь!й.).

Для трансформации дрожжей разработан ряд протоколов. Например, трансгенный Зассйаготусек, соответствующий настоящему изобретению, можно получить согласно данным, представленным в статьях Н1ппеп е! а1. (1978, Ргосеейшдк оГ (Не Ыа!1опа1 Асайету оГ Зс1епсек оГ (Не ИЗА, 75, 1929); Веддк ΤΌ. (1978, Уинге. Ьопйоп, 275, 104) и 1!о Н. е! а1. (1983, I. Вас!епо1оду, 153, 163-168).

Трансформированные дрожжевые клетки можно отобрать с использованием различных селективных маркеров, таких как ауксотрофные маркеры, доминантные маркеры устойчивости к антибиотикам.

Подходящий дрожжевой организм-хозяин можно выбрать из биотехнологически соответствующих видов дрожжей, таких как, но без ограничения перечисленным, видов дрожжей, выбранных из Р1сЫа крр., Напкепи1а крр., К1иууеготусек, УаггоМша крр., Зассйаготусек крр., в том числе З.сегеуШае, или ЗсЫхокассНаготусек крр., в том числе ЗсЫхокассНаготусек ротЬе.

Штамм метилотрофных дрожжей вида Р1сЫа рак!опк можно использовать в качестве организмахозяина.

В одном варианте осуществления организм-хозяин может представлять Напкепи1а крес1ек, такой как Н.ро1утогрНа (как описано в \УО 01/39544).

Трансформированные растения/клетки растений.

Организм-хозяин, соответствующий настоящему изобретению, может представлять собой растение. Обзор по основным методикам можно найти в статьях Ройукик (Аппи. Веу. Р1ап!. РНукю1. Р1ап!. Мо1. Вю1. (1991), 42: 205-225) и СНпк!ои (Адго-Еоой-1пйикйу Н1-ТесН, МагсН/Аргй, 1994, 17-27) или в \УО 01/16308.

Секреция.

Часто требуется, чтобы полипептид секретировался из экспрессирующего хозяина в культуральную среду, из которой фермент легко можно выделить. Согласно настоящему изобретению лидерную последовательность секреции можно выбрать на основе желательного экспрессирующего хозяина. Гибридные сигнальные последовательности также можно использовать в контексте настоящего изобретения.

Типичными примерами гетерологичных лидерных последовательностей секреции являются последовательности, происходящие из грибного гена амилоглюкозидазы (АГ) (д1аА - оба варианта из 18 и 24 аминокислот, например из АкрегдШик), гена α-фактора (из дрожжей, например, Зассйаготусек, К1иууеготусек и Напкепи1а) или гена α-амилазы (ВасШик).

Детекция.

В области техники известен ряд протоколов детекции и измерения экспрессии последовательности аминокислот. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (В1А) и сортинг клеток по интенсивности флуоресценции (ЕАС8).

Широкий ряд меток и методик конъюгирования известен компетентным специалистам в области техники и может быть использован в различных анализах нуклеиновых и аминокислот.

Ряд фирм, таких как РНагтааа Вю!есй (Р1кса!а^ау, N1), Рготеда (МаШкоп, XVI) и ИЗ Вюсйетюа1 Согр (С1еуе1апй, ОН), поставляют коммерческие наборы и протоколы для данных методов.

Подходящие сигнальные молекулы или метки включают данные радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемолюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т. п. Патенты, представляющие применение данных меток, включают И8-А-3817837; И8-А-3850752; И8-А-3939350; И8-А-3996345; И8-А-4277437; ИЗ-А-4275149 и иЗ-А-4366241.

Кроме того, могут быть получены рекомбинантные иммуноглобулины, как показано в ИЗ-А-4816567.

- 33 014985

Слитые белки.

Полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном контексте, можно получить в виде слитого белка, например, чтобы способствовать его экстракции и очистке. Примеры партнеров слитого белка включают глутатион-8-трансферазу (О8Т), 6хН1з, ОАЬ4 (ДНК-связывающие домены и/или домены транскрипционной активации) и β-галактозидазу. Может также быть удобным включить центр протеолитического расщепления между партнером слитого белка и белковой последовательностью, представляющей интерес, чтобы получить возможность удаления последовательности слитого белка. Предпочтительно, когда слитый белок не будет препятствовать активности белковой последовательности.

Системы экспрессии слияния генов в Е.ео11 описаны в обзоре в Сигг. Ομίπ. Вю1ееНпо1. (1995), 6(5): 501-6.

В другом варианте осуществления изобретения последовательность аминокислот полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данном контексте, можно лигировать с гетерологичной последовательностью, чтобы кодировать слитый белок. Например, для скрининга пептидных библиотек в плане агентов, способных воздействовать на активность субстанции, может быть полезным кодировать химерную субстанцию, экспрессирующую гетерологичный эпитоп, который распознается коммерчески доступным антителом.

Теперь изобретение будет описано только в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.

На фиг. 1 показан профиль активности липидацилтрансферазы (анализ с РИР-каприлатом), полученный после анионообменной хроматографии (АОХ).

На фиг. 2 показаны результаты анализа δΌδ-РАОЕ (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) очищенных фракций липидацилтрансферазы (4-12% Мез, +ΌΤΤ, на гель наносят 40/10 мкл образца):

дорожка 1 - образец липидацилтрансферазы после обессоливания, на гель наносят 40 мкл; дорожка 2 - образец липидацилтрансферазы после обессоливания, на гель наносят 10 мкл;

дорожка 3 - очищенная липидацилтрансфераза липаза после АОХ (объединенные фракции 27-39), на гель наносят 40 мкл;

дорожка 4 - очищенная липидацилтрансфераза липаза после АОХ (объединенные фракции 27-39, на гель наносят 10 мкг.

На фиг. 3 показаны результаты ТСХ (растворитель 4) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой образцов соевого масла согласно табл. 2. В качестве контроля анализируют также фосфатидилхолин (ФХ).

На фиг. 4 показаны результаты ТСХ (растворитель 1) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой образцов соевого масла согласно табл. 2. В качестве контроля анализируют также свободную жирную кислоту (СЖК) и моно-ди-триглицерид (ΤΚΙ/ΌΙ/ΜΟΝΟ).

На фиг. 5 показаны результаты ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой образцов соевого масла согласно табл. 2. В качестве контроля анализируют также холестерин (СНЬ) и холестериновый эфир (СНЬ-эфир).

На фиг. 6 показаны результаты ТСХ (растворитель 4) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой или Ьеейазе ИИга™ образцов соевого масла согласно табл. 3 в течение 20 ч.

На фиг. 7 показаны результаты ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой или Ьеейазе ИИга™ образцов соевого масла согласно табл. 3 в течение 20 ч. В качестве контролей анализируют также холестериновый эфир (СНЬ-эфир); моно-ди-триглицерид (ΜΟΝΟ/ΏΙ/ΤΚΙ) и растительный стерин. Указана также идентификация свободной жирной кислоты (СЖК).

На фиг. 8 показаны результаты ТСХ (растворитель 4) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой или Ьеейазе ИИга™ образцов соевого масла согласно табл. 3 в течение 4 ч.

На фиг. 9 показаны результаты ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой или Ьеейазе ИИга™ образцов соевого масла согласно табл. 3 в течение 4 ч. В качестве контролей анализируют также холестериновый эфир (СНЬ-эфир); моно-ди-триглицерид (ΜΟΝΟ/ΏΙ/ΤΚΙ) и растительный стерин. Указана также идентификация свободной жирной кислоты (СЖК).

На фиг. 10 показана последовательность аминокислот зрелой липидацилтрансферазы (Όί.ΆΤ) мутантного Аеготопаз за1тоше1ба с мутацией Азп80Азр (а именно, аминокислоты 80 в зрелой последовательности).

На фиг. 11 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1) липидацилтрансферазы и Аеготопаз НубгорНба (АТСС #7965).

На фиг. 12 показана консенсусная последовательность рГат00657 из базы данных уегзюп 6 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2).

- 34 014985

На фиг. 13 показана последовательность аминокислот (8ЕО Аеготопак ЬубгорЫ1а (Р10480; ΟΙ:121051).

На фиг. 14 показана последовательность аминокислот (8ЕО Аеготопак ка1тошс1ба (ΑΑΟ098404; ΟΙ:9964017).

На фиг. 15 показана последовательность аминокислот (8ЕО

ΙΌ

3),

4),

5), полученная полученная полученная полученная полученная полученная из из из из из из организма организма организма организма организма организма

81гер1отусек соеНсо1ог А3(2) ^с^апк, регистрационный номер ΝΡ 631558).

На фиг. 16 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 6), 81гер1отусек соеНсо1ог А3(2) ^с^апк, регистрационый номер САС42140).

На фиг. 17 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 7), 8асс11аготусек сегеуыае ^с^апк, регистрационый номер Р41734).

На фиг. 18 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 8), Ва1к1оша ^с^апк, регистрационый номер АЙ646052).

На фиг. 19 показана 8ЕО ΙΌ NΟ: 9. Белок 8сое1 NСΒI, регистрационный код САВ39707.1, консервативный гипотетический белок ΟΙ:4539178 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 20 показана последовательность аминокислот, представленная как 8ЕО ΙΌ NΟ: 10. Белок 8сое1 NСΒI, регистрационный код САВ39707.1, консервативный гипотетический белок ΟΙ:4539178 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 21 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 11). Белок 8сое3 NСΒI, регистрационный код САВ88833.1. Предполагаемый секретируемый белок ΟΙ:7635996 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 22 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 12). Белок 8сое4 NСΒI, регистрационный код САВ89450.1 Предполагаемый секретируемый белок ΟΙ:7672261 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 23 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 13). Белок 8сое5 NСΒI, регистрационный код САВ62724.1, предполагаемый липопротеин ΟΙ:6562793 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 24 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 14). Белок 8гпп1 NСΒI, регистрационный код ААК84028.1 Ο^8^-липаза ΟΙ:15082088 |81гер1отусек г1шокик].

На фиг. 25 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 15) липидацилтрансферазы из Аеготопак ка1тотс1ба киЬ кр.ка1тотс1ба (АТСС#14174).

На фиг. 26 показаны результаты ТСХ (растворитель 4) образцов 1-10 неочищенного соевого масла, обработанного в течение 20 ч ферментами согласно табл. 4. ФХ означает фосфатидилхолин, добавленный в 5 различных концентрациях (контрольный материал).

На фиг. 27 показаны результаты ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке липидацилтрансферазой или Ьесйаке ИЙга™ неочищенного соевого масла согласно табл. 4 (20 ч). В качестве контролей анализируют также холестериновый эфир (СНЬ-эфир); моно-ди-триглицерид (МОНО/ЭкТЕ!) и растительный стерин. Указана также идентификация свободной жирной кислоты (СЖК).

На фиг. 28 показана 8ЕО ΙΌ NΟ: 17, которая представляет собой последовательность аминокислот липидацилтрансферазы из Сапб1ба рагаркйокк.

На фиг. 29 показана 8ЕО ΙΌ NΟ: 18, которая представляет собой последовательность аминокислот липидацилтрансферазы из Сапб1ба рагаркйокк.

На фиг. 30 показан сравнительный анализ 1.

На фиг. 31 показана 8ЕО ΙΌ NΟ: 19. Белок 8сое1 NСΒI, регистрационный код САВ39707.1 Консервативный гипотетический белок ΟΙ:4539178 |81гер1отусек соеНсо1ог А3(2)].

На фиг. 32 показана последовательность аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 25) слитой конструкции, используемой для мутагенеза гена липидацилтрансферазы Аеготопак йубгорИ1а. Подчеркнутые аминокислоты представляют собой сигнальный пептид ксиланазы.

На фиг. 33 показана последовательность полипептида фермента липидацилтрансферазы из 81гер1отусек (8ЕО ΙΌ NΟ: 26).

На фиг. 34 показана последовательность полипептида фермента липидацилтрансферазы из ТЬегтоЫйба (8ЕО ΙΌ 27).

На фиг. 35 показана последовательность полипептида фермента липидацилтрансферазы

Т11еппоЬ1Гк1а (8ЕО ΙΌ 28).

На фиг. 36 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из СогупеЬас1епит еГйсхепк, ΟΌ8Χ, 300 аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 29).

На фиг. 37 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из №уокр1ипдоЬппп агатаЕ^ого^, ΟΌ8Χ, 284 аминокислоты (8ЕО ΙΌ NΟ: 30).

На фиг. 38 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81гер1отусек соейсо1ог, ΟΌ8Χ, 269 аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 31).

На фиг. 39 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81гер1отусек ауегтйШк, ΟΌ8Χ, 269 аминокислот (8ЕО ΙΌ NΟ: 32).

На фиг. 40 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81гер1отусек (8ЕО ΙΌ NΟ: 33).

- 35 014985

На фиг. 41 показано изображение в виде ленты кристаллической структуры ПУИ.РПВ, которая содержит глицерин в активном центре. Фиг. 41 получена с использованием программы отображения Пеер У1ете 8те1кк-РЛВ.

На фиг. 42 показана кристаллическая структура ПУКРЭВ, вид сбоку, получено при использовании программы отображения Пеер У1ете 8те1кк-РЛВ, с молекулой глицерина в активном центре - остатки глицерина активного центра в радиусе 10 А представлены черным цветом.

На фиг. 43 показан сравнительный анализ 2.

На фиг. 44 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 34), полученная из организма Аеготопак НуБгорНйа (Р10480; 61:121051) (а именно, представляющая собой зрелую последовательность).

На фиг. 45 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 35) зрелой липидацилтрансферазы (ССАТ) мутантного Аеготопак ка1тошсИа (а именно, представляющая собой зрелую последовательность).

На фиг. 46 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 36) из 8(герЮтусек (НегтокассНап.

На фиг. 47 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 37) из 8(герЮтусек (НегтокассНап.

На фиг. 48 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 38) из ТНегтоЫПБа Гикса/СЛ8Х, 548 аминокислот.

На фиг. 49 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 39) из ТНегтоЫПБа Гикса.

На фиг. 50 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 40) из ТНегтоЫПБа Гикса/СЛ8Х.

На фиг. 51 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 41) из СогупеЬас1егшт еГйс1епк/СЛ8Х, 300 аминокислот.

На фиг. 52 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 42) из СогупеЬас1егшт еГйтепк.

На фиг. 53 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 43) из 8.соейсо1ог/СЛ8Х, 268 аминокислот.

На фиг. 54 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 44) из 8.соейсо1ог.

На фиг. 55 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 45) из 8.ауегтйШк.

На фиг. 56 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 46) из 8.ауегтй111к.

На фиг. 57 показана последовательность аминокислот (8Еф ГО N0: 47) из ТНегтоЫПБа Гикса/СЛ8Х.

На фиг. 58 показана нуклеотидная последовательность (8Еф ГО N0: 48) из ТНегтоЫПБа Гикса/СЛ8Х.

На фиг. 59 показаны результаты ТСХ (растворитель 4) продуктов реакции, полученных при обработке ферментом образцов неочищенного соевого масла согласно табл. 6. В качестве контролей анализируют также фосфатидилхолин (ФХ). Указаны также фосфатидилэтаноламин (ПЭ) и лизофосфатидилхолин (ЛФХ).

На фиг. 60 показаны результаты ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке ферментом образцов неочищенного соевого масла согласно табл. 6. Контроли: холестериновый эфир, моно-ди-триглицерид и растительный стерин. Указана также свободная жирная кислота (СЖК).

На фиг. 61 показан сравнительный анализ Ь131 и гомологов из 8.ауегтйШк и Т.Гикса, который иллюстрирует, что имеется консервативность мотива СЭ8Х (СЭ8У в Ь131 и 8.ауегтйШк и Т.Гикса), бокса САХЛУ, который представляет собой либо ССИЛА, либо ССИЛЬ, и блока НРТ (считают, что он является консервативным каталитическим гистидином). Данные три консервативных блока выделены.

Примеры

Целью данного исследования является изучить возможное применение липидацилтрансферазы (в некоторых случаях обозначаемой в данном контексте как глицерофосфолипидхолестеринацилтрансфераза (ССАТ)) для рафинирования гидратацией растительного масла, например соевого масла, подсолнечного масла и рапсового масла.

Одной из целей данного исследования является изучить, является ли, в частности, мутант липидацилтрансферазы (N800) более подходящим ферментом для рафинирования гидратацией. Из более ранних исследований известно, что липидацилтрансферазы (особенно ССАТк) катализируют перенос ацила жирной кислоты с фосфолипид на стерины с образованием лизолецитина и сложных стериновых эфиров.

Настоящее исследование проводят на модели, основанной на рафинированном соевом масле, в которое добавляют фосфатидилхолин и растительные стерины. Данную модель выбирают, поскольку легче анализировать продукт реакции в модельной системе вместо использования неочищенного соевого масла.

Ферментативные способы рафинирования гидратацией растительных масел, включая соевое масло и рапсовое масло, в последние годы расширяются, поскольку данный способ является более дешевым и более подходящим способом удаления лецитинов из масла. Фермент, используемый для рафинирования масла гидратацией, представляет собой фосфолипазу А1 (Ьесйаке ИИга™ или фосфолипазу поджелудочной железы А2 - №уохутек А/8, Дания).

- 36 014985

Одним из преимуществ фермента, представленного в настоящем изобретении, при использовании в рафинировании гидратацией по сравнению с фосфолипазой А1, соответствующей предшествующему уровню техники, является то, что фермент, представленный в настоящем изобретении, способствует образованию сложных стериновых эфиров в процессе рафинирования гидратацией и участвует в накоплении сложных стериновых эфиров, которое не достигается с используемой в настоящее время фосфолипазой А1 (Ьесйаке ИИга™).

Материалы и способы.

Ферменты.

Липидацилтрансфераза, представленная в настоящем изобретении: фермент Аеготопак ка1тошс16ае с мутацией Акп80Акр (аминокислота 80 зрелого фермента) (8ЕО ΙΌ N0: 16 (см. фиг. 10)); Ьесйаке И11га (#3108) фирмы №уо/утек, Дания.

Соевое масло: масло соевое ΙΡ (соответствующее Международной фармакопее) (номер продукта: 005018/партия № Т-618-4).

Лецитин: Ь-а-фосфатидилхолин 95% растительный (фирмы ΛνηηΙί № 441601).

Растительный стерин: генерол 122 N фирмы Непке1, Германия.

Токоферол: α-токоферол (номер продукта: 050908/партия № 4010140554).

Активность фосфолипазы.

Субстрат.

0,6% Ь-а-фосфатидилхолин 95% растительный (фирмы АуапЬ № 441601), 0,4% Тритон-Х100 (фирмы 81дта Х-100) и 5 мМ СаС1₂ растворяют в 0,05 М буфера НЕРЕ8, рН 7.

Способ анализа.

400 мкл субстрата вносят в эппендорфовскую пробирку объемом 1,5 мл и помещают в термосмеситель ЕррепбогГ при 37°С в течение 5 мин. В точке времени 1=0 мин добавляют 50 мкл раствора фермента. Анализируют также контроль с добавлением воды вместо фермента. Образец смешивают при 10x100 об/мин в термосмесителе ЕррепбогГ при 37°С в течение 10 мин. В точке времени 1=10 мин эппендорфовскую пробирку помещают в другой термосмеситель при 99°С на 10 мин, чтобы остановить реакцию.

Свободную жирную кислоту в образцах анализируют с использованием набора ИБЕА С фирмы ААК0 ОтЬН.

Активность фермента РЬи-№ЕЕА рН 7 рассчитывают как микромоли жирной кислоты, образующейся в минуту в условиях анализа.

ВЭТСХ (высокоэффективная тонкослойная хроматография).

Устройство для нанесения: автоматический дозатор для ТСХ 4, САМАО.

Пластинка для ВЭТСХ: 20x10 см, Мегск № 1.05641. Перед использованием активируют в течение 30 мин при 160°С.

Нанесение: 1 мкл 8% раствора масла в буфере наносят на пластинку для ВЭТСХ, используя автоматическое устройство для нанесения.

Подвижный буфер 1: Р-эфир:метил-трет-бутиловый эфир: уксусная кислота 60:40:1.

Подвижный буфер 4: хлороформ:метанол:вода 75:25:4.

Подвижный буфер 5: Р-эфир:метил-трет-бутиловый эфир:уксусная кислота 70:30:1.

Время нанесения/элюции:

подвижный буфер 1 - 12 мин;

подвижный буфер 4 - 20 мин;

подвижный буфер 5 - 10 мин.

Проявление.

Пластинку сушат в сушильном шкафу при 160°С в течение 10 мин, охлаждают и погружают в 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄. Дополнительно сушат в течение 10 мин при 160°С и непосредственно анализируют.

Пример 1. Очистка фермента.

Образец: образец липидацилтрансферазы (Акп80Акр) (8ЕО ΙΌ N0: 16) фильтруют через фильтр 0,8/0,22 мкм. Собирают 510 мл фильтрата.

Стадия 1. Обессоливание, 8ерЬа6ех 25 О, 3,2 л геля (10 см ст ίά).

Колонку 8ерйа6ех готовят, как описано изготовителем (АтегкЬат ЬюкОепсек). Колонку уравновешивают 20 мМ №-Р-буфера, рН 8,0. Образец (510 мл) наносят на колонку при скорости потока 25 мл/мин. Собирают 815 мл обессоленного образца и хранят при 4°С.

- 37 014985

Стадия 2. Анионообменная хроматография, Р-ЗерЕагозе ЕЕ 300 мл геля (ХК 50).

Колонку С)-8ер11аго8е ЕЕ готовят, как описано изготовителем (АшегзЕаш ЬюзОепеез). Колонку уравновешивают 20 мМ №-Р-буфера, рН 8,0. Обессоленный образец наносят на колонку при скорости потока 15 мл/мин. Затем колонку промывают буфером А. Липазу элюируют линейным градиентом 0-0,4 М №С1 в 20 мМ №-Р-буфера (рН 8,0, буфер В). За время полного прохождения колонки собирают фракции по 15 мл. Липазу элюируют приблизительно при 0,2 М №С1 и при просмотре фракций активность липазы не определяют.

Анализ фермента на основе Р№-каприлата.

Анализ осуществляют при использовании Р№-каприлата в качестве субстрата следующим образом.

мг субстрата растворяют в 1 мл этанола и смешивают с 9 мл 50 мМ буфера Трис-НС1 (рН 7,3), содержащего 0,4% ТХ100.

240 мкл субстрата предварительно инкубируют при 35°С. Реакцию инициируют добавлением 25 мкл образца/контроля. Смесь инкубируют при 35°С в течение 5 мин при встряхивании. С помощью спектрофотометра непрерывно измеряют образование Р№ при длине волны 410. Контрольный образец включает все компоненты с буфером вместо образца.

Одну единицу активности липазы определяют как количество фермента, высвобождающего 1 мкл свободной каприловой кислоты в минуту при 35°С.

Определение молекулярной массы и чистоты.

δΌδ-РАОЕ (гель-электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) проводят на 4-12% геле Νπ-РАОЕ (+ΌΤΤ) и окрашивают кумасси согласно инструкциям изготовителя (Nονеx, Е8А). Стандартным маркером является 8ее В1ие Р1из2, полученный от фирмы Nονеx, Е8А.

Результаты.

Хроматограмма, полученная при очистке ионообменной хроматографией (АОХ) мутанта Ν80Ό липидацилтрансферазы, представлена на фиг. 1. Собранные фракции анализируют на активность липазы (на основе анализа Р№-каприлата). Активность фракций иллюстрируют на фиг. 1а.

Фракции, содержащие активность липидацилтрансферазы (27-39, 195 мл), объединяют. Конечное выделение частично очищенной липидацилтрансферазы составляет приблизительно 80% (на основе анализа Р№-каприлата).

Фракции очищенной липидацилтрансферазы подвергают гель-электрофорезу δΌδ-РАОЕ.

Гель 8О8-РА6Е показывает белок липидацилтрансферазы молекулярной массы приблизительно 28 кД. Частично очищенная липидацилтрансфераза включает минорную примесь молекулярной массы приблизительно 10 кД (см. фиг. 2).

Объединенные фракции липидацилтрансферазы 27-39 после АОХ анализируют на активность фосфолипазы, получая результат 20,4 РБи-7/мл.

Полная схема очистки представлена в табл. 1, в которой липидацилтрансфераза частично очищена с выходом 80%.

Таблица 1

Очистка липидацилтрансферазы

Образец	Объем	V Мах	Разведение	Общ. кол- во единиц	Выход, %
Неочищенный	510	1,150	100	58650	100
(03+(^4)
Обессоленный	815	0,697	100	56806	97
неочищенный
Объед. фракции	195	1,203	200	46898	80

27-39 О-8ер.

Пример 2. Эксперимент по рафинированию гидратацией.

Образец липидацилтрансферазы из примера 1 используют для исследований по рафинированию гидратацией в препаратах, представленных в табл. 2.

Растительный стерин, α-токоферол и фосфатидилхолин растворяют в соевом масле нагреванием масла до 90°С. Затем масло охлаждают приблизительно до 40°С и добавляют фермент. Образец помещают при 40°С в течение 17 ч при перемешивании и затем образец берут для анализа ВЭТСХ путем растворения образца в смеси хлороформ:метанол 2:1.

- 38 014985

Таблица 2

Модели соевого масла с α-токоферолом и растительным стерином, используемые для тестирования липидацилтрансферазы.

123456789 10

Соевое масло %9897979697 9696959692 а-токоферол

Растительный стерин

Фосфатидилхолин

Объед. фракции липидацилтрансферазы 27-39%

Результаты анализа ВЭТСХ представлены на фиг. 3 и 4.

Результаты ТСХ, представленные на фиг. 3, ясно показывают, что фосфатидилхолин удаляется почти на 100% при добавлении к маслу липидацилтрансферазы. Только образец 10 включает небольшое количество фосфатидилхолина. Образец 10 имеет самое высокое количество воды, которое указывает на то, что в плане рафинирования гидратацией фермент может работать лучше в составах с низким содержанием воды или это можно объяснить тем фактом, что, поскольку образец 10 включает 5% воды, образуется двухфазная система, которая могла бы привести к меньшей степени контакта реагентов и фермента.

Из результатов, приведенных на фиг. 4, видно, что образуется небольшое количество жирных кислот, но, когда стерин или α-токоферол также имеются в масле, количество свободных жирных кислот ниже, поскольку жирные кислоты из фосфатидилхолина переносятся на стерин или токоферол с образованием сложных стериновых эфиров и сложных эфиров токоферола.

Образование сложных стериновых эфиров ясно видно из результатов ТСХ, представленных на фиг. 5. Следует отметить, что в используемом ссылочном материале сложный холестериновый эфир имеет такое же время удержания, как сложные эфиры растительных стеринов.

Пример 3. Эксперимент по рафинированию гидратацией (2).

В другом эксперименте объединенные фракции липидацилтрансферазы 27-39, полученные при АОХ хроматографии, тестируют с различными дозами фермента и концентрациями воды в соевом масле с фосфатидилхолином и растительным стерином. В данном эксперименте тестируют также коммерческую фосфолипазу ЬесИазе ИИга™ в концентрации, рекомендованной изготовителем для рафинирования гидратацией. Состав образцов для данного эксперимента приведен в табл. 3.

Таблица 3

Модель соевого масла с растительным стерином, используемая для тестирования липидацилтрансферазы и ЬесИазе ИИга™

		1 2	3	4	5	6	7	8	9	10
Соевое масло	%	96,696,6	96	92	96	92	95	92	96	92
Растительный стерин	%	1 1	1	1	1	1	1	1	1	1
Фосфатидилхолин	%	2 2	2	2	2	2	2	2	2	2
Объед. фракции липидацилтрансферазы	%	0,4	0,4	0,4	1	1	2	2
27-39
ЕесЛазе ЕГЕга™, 1% раствор	%								0,3	0,3
АУа1ег		0,4	0,6	4,6	0	4	0	3	0,7	4,7

Единиц/г масла (РЬи-7/г) 0 0,080,080,080,20,20,40,41,031,03

Растительный стерин и фосфатидилхолин растворяют в соевом масле нагреванием до 95°С при перемешивании. Затем масло охлаждают до 40°С и добавляют ферменты. Образец поддерживают при 40°С при перемешивании с помощью магнитной мешалки и отбирают образцы через 4 и 20 ч и анализируют с помощью ТСХ. Результаты анализа ВЭТСХ образцов, взятых через 4 и 20 ч, представлены на фиг. 6-9.

Результаты ВЭТСХ показывают, что самая низкая доза липидацилтрансферазы (0,4%, соответствующие 0,08 РЬИ-7/г масла) достаточна для удаления фосфатидилхолина в соевом масле через время реакции 20 ч. Показывают также, что самая высокая доза воды (5%), по-видимому, оказывает вредное воздействие на липидацилтрансферазу в плане гидролиза фосфатидилхолина в масле. Вследствие этого предполагают, что самая низкая степень гидролиза в образце с самым высоким уровнем липидацилтрансферазного превращения объясняется тем фактом, что в образец добавляют также больше воды. Напротив, показано, что ЬесИаке ИИга™ имеет более низкую степень гидролиза фосфатидилхолина при более низкой дозе воды (1%), тогда как ЬесИаке ИИга™ почти полностью удаляет фосфатидилхолин в образце с 5% воды.

- 39 014985

Результаты, представленные на фиг. 7, также показывают, что основная часть растительного стерина превращается в сложный эфир растительного стерина в образцах, обработанных липидацилтрансферазой, тогда как в образцах, обработанных Бесйазе и11га™, не образуется никаких сложных стериновых эфиров. На фиг. 7 показано, что Бесйазе и11га™ дает больше свободных жирных кислот (СЖК), чем липидацилтрансфераза.

Заключение.

Эксперименты по рафинированию на модели соевого масла, включающего фосфатидилхолин, растительный стерин и токоферол, показывают, что частично очищенный фермент липидацилтрансфераза способен удалять все примеси фосфатидилхолина с образованием сложных эфиров растительного стерина с образованием только маленьких количеств свободных жирных кислот.

Одним из дополнительных преимуществ липидацилтрансферазы является образование сложных стериновых эфиров и, в частности, сложного эфира токоферола, поскольку сложные стериновые эфиры (в том числе сложный эфир токоферола) обладают благоприятным воздействием на состояние здоровья. При обычной переработке пищевого масла после рафинирования гидратацией водную фазу, включающую гидролизованный полярный липид (например, фосфолипид и/или гликолипид), отделяют от масла. Как принято, стерины удаляют из пищевого масла в процессе рафинирования масла (это иногда называют дезодорацией). Однако сложные стериновые эфиры (и сложный эфир токоферола) устойчивы к дезодорации и, таким образом, остаются в масле. Накопление сложных стериновых эфиров в масле является привлекательным моментом, поскольку показано, что повышенный уровень поглощения сложных эфиров растительных стеринов снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний у человека.

Эксперимент также показывает, что липидацилтрансфераза способна к образованию сложных эфиров токоферола, которые будут накапливаться в масле.

Данный факт вносит вклад в повышение стабильности масла к окислению и, таким образом, представляет собой дополнительное преимущество использования липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении, для рафинирования гидратацией.

Пример 4. Эксперимент по рафинированию гидратацией неочищенного масла.

В другом эксперименте объединенные фракции липидацилтрансферазы 27-39, полученные при АОХ хроматографии, тестируют при различных дозах фермента и концентрациях воды в неочищенном соевом масле (перед рафинированием гидратацией), полученном от фирмы Тке 8о1ае Сотрапу, Аагкиз, Дания. В данном эксперименте тестируют также коммерческую фосфолипазу Бесйазе Ш1га™ в концентрации, рекомендованной изготовителем для рафинирования гидратацией. Состав образцов для данного эксперимента представлен в табл. 4.

Образцы помещают в нагревательное устройство при 40°С при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Образцы вынимают через 20 ч для проведения анализа.

Таблица 4

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Неочищенное соевое масло	%	99,5	99,5	99	98	97	98	95	99,7	99	95
Липидацилтрансфераза	%		0,5	1	1	1	2	5
Ьесйазе 1Л1га™ #3108, 1% раствор	%								0,3	0,3	0,3
Вода	%	0,5	0	0	1	2	0	0	0	0,7	4,7

Образцы масла анализируют ВЭТСХ, получая результаты, представленные на фиг. 26 и 27.

Анализ ТСХ, приведенный на фиг. 26, показывает, что липидацилтрансфераза эффективно удаляет фосфолипиды в неочищенном соевом масле, не оставляя в образце лизолецитин (см. образец 3, 4, 6 и 7). Бесйазе и11га™ также удаляет фосфолипид (ФХ), но на хроматограмме остаются некоторые полосы, которые, как предполагают, представляют собой лизолецитин. Показано также, что липидацилтрансфераза работает в среде с очень низким содержанием воды, но для действия Бесйазе и11га™ требуется содержание воды 1-5%.

Результаты на фиг. 27 подтверждают, что липидацилтрансфераза превращает свободный стерин в сложные стериновые эфиры и Бесйазе Ш1га™ не оказывает воздействия на стерины. На фиг. 27 также показано, что некоторые свободные жирные кислоты образуются в обоих образцах, с липидацилтрансферазой и Бесйазе и11га™. Причину образования свободных жирных кислот с липидацилтрансферазой объясняют тем фактом, что не имеется достаточно доступного донора ацила (стерина) и, вследствие этого, происходит также гидролиз.

Образцы 1, 2, 3, 6, 8 и 10 из табл.4 анализируют с помощью ГЖХ и определяют количество стеринов и сложных стериновых эфиров. Результаты представлены в табл. 5.

- 40 014985

Таблица 5

Анализ ГЖХ стеринов и сложных стериновых эфиров в неочищенном соевом масле, обработанном ферментом (см. табл. 4)

Образец	Фермент	Стерин	Стериновый эфир
№		%	%

1	Контроль	0,25	0,07
2	0,5% объед. фракций липидацилтрансферазы 27-39	0,13	0,13
3	1% объед. фракций липидацилтрансферазы 27- 39	0	0,26
6	2% объед. фракций липидацилтрансферазы 27- 39	0	0,22
8	0,3% Ьесйазе иИга™, 1% раствор	0,25	0,03
10	0,3% ЬесНазе иИга™, 1% раствор + 5% воды	0,27	0,05

Результаты, приведенные в табл. 5, подтверждают способность липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении, превращать весь стерин в неочищенном соевом масле в сложный стериновый эфир, и коммерческая фосфолипаза Ьесйазе и11га ™ не показывает действия на стерин.

Заключение.

Действие липидацилтрансферазы, представленной в настоящем изобретении, на неочищенное соевое масло, подтверждает, что липидацилтрансфераза, представленная в настоящем изобретении, эффективно удаляет фосфолипиды в неочищенном соевом масле с одновременным образованием сложных стериновых эфиров.

Пример 5.

В другом эксперименте фосфолипазу из 81гер1отусез 1йегто§ассйал Ь131 тестируют в неочищенном соевом масле.

Результаты подтверждают, что фосфолипаза 81гер1отусез 1йегто8ассйап Ь131 эффективно гидролизует фосфолипиды в неочищенном соевом масле и представляет собой подходящий альтернативный фермент для рафинирования растительных масел гидратацией.

Способы ферментативного рафинирования гидратацией растительных масел, в том числе соевого масла и рапсового масла, в настоящее время расширяются, поскольку данный способ является менее дорогим и более подходящим способом удаления лецитинов из растительных масел. Фермент, коммерчески используемый для рафинирования масла гидратацией, представляет собой микробную фосфолипазу А1 или фосфолипазу А2 животного происхождения.

(Фосфо)липидацилтрансфераза 81гер1отусез 1йегто§ассйап К131 представляет собой другой фермент, который можно использовать для рафинирования гидратацией.

Введение.

Целью настоящего исследования является изучить возможное применение липидацилтрансферазы из 81гер1отусез 1йегто§ассйап Ь131 для рафинирования гидратацией растительного масла, например соевого масла, подсолнечного масла и рапсового масла.

Традиционно для рафинирования масел гидратацией используют два способа, физическое рафинирование гидратацией и химическое рафинирование гидратацией. Ранее в 1990-е гг. разработан ферментативный способ рафинирования гидратацией на основе использования фосфолипазы поджелудочной железы. Поскольку данный фермент некошерный, фосфолипазу заменяют микробной фосфолипазой А1. Ферментативный способ имеет некоторые преимущества относительно химического или физического способов рафинирования гидратацией, включая снижение себестоимости, повышенный выход и процесс, более благоприятный для окружающей среды.

Целью настоящего исследования является изучить, может ли липидацилтрансфераза из 81гер1отусез 1йегто§ассйап Ь131 быть подходящим ферментом для рафинирования гидратацией. Из вышеописанных исследований известно, что 81гер1отусез 1йегто§ассйап Ь131 обладает гидролитическими свойствами в отношении галактолипидов и фосфолипидов, не проявляя какой-либо активности в отношении триглицеридов, и предполагают, что данный фермент способствует также реакциям трансферазы в некоторых средах с низким содержанием воды. Данное исследование проводят в неочищенном соевом масле с естественным содержанием фосфолипидов.

Материалы и способы.

Фермент.

К371(]оиг 2390-30): 81гер1отусез 1йегто§ассйап Ы31/8.1Мйап8, лиофилизированный на крахмале.

(Активность: 108 РЬи-7/г).

Ьесйазе и11га (#3108) фирмы Nονοζуте8, Дания.

Сложный эфир холестеразы, фирма Ника 26950.

Растительный стерин: Оепего1 122 N фирмы Непке1, Германия.

Неочищенное соевое масло фирмы Тйе 8о1ае Сотрапу, Орхус, Дания.

- 41 014985

Лецитин: Ь-α фосфатидилхолин 95%, растительный (фирмы Ανοιιΐί Ж 441601).

Активность фосфолипазы.

Субстрат.

0,6% Ь-α фосфатидилхолина растительного 95% (фирмы Ανοιιΐί Ж 441601), 0,4% Тритон-Х100 (фирмы 81дта Х-100) и 5 мМ СаС1₂ растворяют в 0,05 М буфере НЕРЕ8, рН 7.

Методика анализа.

400 мкл субстрата вносят в эппендорфовскую пробирку объемом 1,5 мл и помещают в термосмеситель Еррепдог! при 37°С на 5 мин. В точке времени !=0 мин добавляют 50 мкл раствора фермента. Кроме того, анализируют контроль с водой вместо фермента. Образец перемешивают при 10x100 об/мин в термосмесителе Еррепдог! при 37°С в течение 10 мин. В точке времени 1=10 мин реакцию останавливают, помещая эппендорфовскую пробирку в другой термосмеситель при 99°С на 10 мин.

Содержание свободной жирной кислоты в образцах анализируют с использованием набора N1:1·% С фирмы \\ \КО ОтЬН.

Активность фермента Р1 .ΡΆΊΕΑ рН 7 рассчитывают как количество микромолей жирной кислоты, образующейся в минуту в условиях реакции.

ГЖХ (газовая хроматография).

Капиллярный газовый хроматограф Регкт Е1тег 8420, снабженный слитой силикагелевой колонкой \\'СОТ 12,5 мх0,25 мм ΙΌχ0,1 мкм 5% фенил-метил-силикон (СР 811 8 СВ фирмы Сготраск).

Носитель: гелий.

Инжекция: 1,5 мкл с разъемом.

Детектор: РЮ. 385°С.

Программа печи:

Температура печи [°С] Изотермический режим, время [мин.]

Температурный режим [°С/мин.]

1	2	3	4
80	200	240	360
2	0	0	10
20	10	12

Получение образца.

Липид, экстрагированный из 0,2 г образца, растворяют в 2 мл смеси гептан:пиридин 2:1, включающей внутренний стандарт гептадекан, 2 мг/мл. 500 мкл образца переносят в изогнутую пробирку. Добавляют 100 мкл М8ТΡΑ (Кметил-Ктриметилсилил-трифорацетамид) и инкубируют реакцию в течение 15 мин при 90°С.

ВЭТСХ.

Устройство для нанесения: автоматический дозатор для ТСХ 4, СΑМΑО.

Пластинка для ВЭТСХ: 20x10 см, Мегск Ж 1.05641. Перед использованием активируют в течение 30 мин при 160°С.

Нанесение: 1 мкл 8% раствора масла в буфере наносят на пластинку для ВЭТСХ, используя автоматическое устройство для нанесения для ТСХ.

Время нанесения/эволюции: подвижный буфер 4 - 20 мин; подвижный буфер 5 - 10 мин. Проявление.

Пластинку сушат в сушильном шкафу при 160°С в течение 10 мин, охлаждают и погружают в 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄. Дополнительно сушат в течение 10 мин при 160°С и непосредственно анали зируют.

Результаты.

Эксперимент по рафинированию гидратацией.

Для исследований по рафинированию гидратацией используют 81гер1отусез Шегтозассйап 1.131 в составах, приведенных в табл. 6.

Образцы помещают при 40°С в течение 18 ч при перемешивании, после чего отбирают образец для анализа ВЭТСХ посредством растворения образца в смеси хлороформ: метанол 2:1.

- 42 014985

Таблица 6

Рафинирование гидратацией неочищенного соевого масла с использованием 81гер1отусе§ Шегтозассйап Ь131 и Ьесйазе ийга

Неочищенное соевое масло %9999989799,7 99

К371, 10% в воде

Ьесйазе икга™ #3108, 1% в воде%

0,3 0,3

Вода % 1 0 0 0 0,7

Результаты анализа ВЭТСХ приведены на фиг. 59 и 60.

На фиг. 59 показана ТСХ (растворитель 4) продуктов реакции, полученных при обработке ферментом образцов неочищенного соевого масла согласно табл. 6. В качестве контроля анализируют также фосфатидилхолин (ФХ). Указаны также фосфатидилэтаноламин (ПЭ) и лизофосфатидилхолин (ЛФХ).

На фиг. 60 показана ТСХ (растворитель 5) продуктов реакции, полученных при обработке ферментом образцов неочищенного соевого масла согласно табл. 6. Контроля: сложный эфир холестерина, моноглицерид, диглицерид, триглицерид и растительный стерин. Указана также свободная жирная кислота (СЖК).

Результаты ТСХ на фиг. 59 ясно показывают, что фосфатидилхолин полностью удаляется при добавлении к маслу 81гер1отусе§ Фегтозассйап 1431. Только самая низкая доза (образец 2) не полностью гидролизует фосфолипиды. Ьесйазе и11га™ также гидролизует фосфолипиды в масле, когда имеется 5% воды (образец 6), но без добавления дополнительного количества воды (образец 5) гидролизуется только часть фосфолипидов.

Результаты, приведенные на фиг. 60, показывают, что гидролиз фосфолипидов сопровождается образованием свободной жирной кислоты.

Заключение.

Липидацилтрансфераза из 81гер1отусе§ Фегтозассйал 1431 эффективно гидролизует фосфолипиды в неочищенном соевом масле во время образования свободных жирных кислот.

Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данном контексте в виде ссылки. Компетентным специалистам будут очевидны различные модификации и варианты описанных способов и системы, представленных в настоящем изобретении, не выходя из объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует иметь в виду, что изобретение, как оно заявлено, не следует ненадлежащим образом ограничивать данными конкретными вариантами осуществления. В действительности предусматривают, что различные модификации описанных путей реализации изобретения, которые очевидны для компетентных специалистов в области биохимии и биотехнологии или близких областях, входят в объем следующей формулы изобретения.

- 43 014985

Перечень последовательностей <110> ДАНИСКО А/С <120> ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ РАФИНИРОВАНИЯ МАСЛА ГИДРАТАЦИЕЙ <130> РО23О2ОШ <140> РСТ/СВ2ОО5/ОО2823 <141> 2005-07-18 <150> СВ 0416035.4 <151> 2004-07-16 <150> и5 60/591,185 <151> 2004-07-26 <150> СВ 513859.9 <151> 2005-07-07 <160>53 <170> Рагепгш νθΓδϊοη 3.3 <210> 1 <211>335 <212> РИТ <213> Аегошопаз НуйгорННа <400>1

мег Буз 1

Буз

тгр

РНе 5

Уа1

Суз Беи Беи С1у 10

Беи

Уа1

А1а Беи тНг 15

Уа1

С1 η

А1а

Азр 20

Бег

Агд

Рго

А1а

РНе 25

Бег

Агд

Не

Уа1

мег 30

РНе С1у

Азр

Бег

Беи

Бег

Азр

ТНг

С1у

Буз

мег

Туг

Бег

Буз

мег

Агд

С1у

туг

35

40

45

Беи

Рго

Бег

Рго

Туг

с1и

С1у

Агд

РНе

Бег

А5П

С1у

Рго

50

55

60

Уа1

Тгр

Беи

с1и

С1п

Беи

ТНг

Буз

с1п

РНе

РГО

С1у

Беи

ТНг

Не

А1а

65

70

75

80

АЗП

С1и

А1а

С1и

С1у С1у 85

А1а

тНг

А1а

Уа1 90

А1а

Туг

Азп

Буз

11е 95

Бег

Тгр

АЗП

Рго

Буз 100

Туг

С1п

Уа1

Не

А5П 105

АЗП

Беи

Азр

туг

С1и 110

Уа1

тНг

С1п

РНе

Беи

С1п

Буз

А5р

Бег

РНе

Буз

РГО

Азр

Беи

Уа1

11е

Беи

115

120

125

тгр

Уа1 130

С1у

А1а

АЗП

Азр

Туг 135

Беи

А1а

Туг

С1у

тгр 140

Азп

тНг

С1и

С1п

Азр

А1а

Вуз

Агд

Уа1

Агд

АЗр

А1а

11 е

Бег

Азр

А1а

АЗП

Агд

Мег

- 44 014985

145 150 155 160

Уа1

ьеи

А5П

С1у

А1а

ьуз

С1п

И е

Ьеи

1_еи

РЬе

АЗП

ьеи

Рго

Азр

Теи

165

170

175

С1у

С1п

АЗП

Рго

Бег

А1а

Агд

Бег

61 η

1_уз

Уа1

61 и

А1а

Уа1

Бег

180

185

190

ΗΊ5

Уа1

Бег

А1а

туг

ΗΪ5

АЗП

61 η

1_еи

Азп

Ьеи

А1а

Агд

61 п

195

200

205

|_еи

А1а

Рго

тЬг

61 у

мет

Уа1

ЬУ5

Теи

РЬе

61 и

11е

Азр

ЬУ5

61 п

РЬе

210

215

220

А1а

с1и

мет

|_еи

Агд

Азр

РГО

61 η

АЗП

РЬе

61 у

Теи

Бег

Азр

Уа1

61 и

225

230

235

240

АЗП

РГО

суз

Туг

А5р

С1у

Туг

Уа1

Тгр

1_уз

Рго

РЬе

А1а

тЬг

Агд

245

250

255

Бег

Уа1

Бег

тЬг

Азр

Агд

61 η

Ьеи

Бег

А1а

РЬе

Бег

Рго

61 п

61 и

Агд

260

265

270

1_еи

А1а

И е

А1а

С1у

Азп

Рго

Ьеи

1_еи

А1а

61 η

А1а

Уа1

А1а

Бег

Рго

275

280

285

мет

А1а 290

Агд

Бег

А1а

Бег 295

Рго

Ьеи

АЗП

суз

61 и 300

61 у

туз

мет

РЬе

тгр

Азр

С1п

Уа1

Н1 5

Рго

тЬг

Уа1

Н15

А1а

1_еи

Бег

61 и

305

310

315

320

Агд

А1а

тЬг

РЬе

11е

А1а

АЗП

61 η

туг

61 и

РЬе

беи

А1а

нтз

325 330 335 <210> 2 <211> 361 <212> РИТ <213> искусственная <22О>

<223> РТаш00657 консенсусная последовательность из базы данных версия 6 <400> 2

11 е

Уа1

А1а

РЬе

61 у

Аэр

Бег

|_еи

тЬг

Азр

61 у

61 и

А1а

туг

61 у

1

5

10

15

Азр

Бег

Азр

61 у

Тгр

61 у

А1а

61 у

Ьеи

А1а

Азр

Агд

Теи

тЬг

20

25

30

А1а

1_еи

теи

Агд

1_еи

Агд

А1а

Агд

рго

Агд

61 у

Уа1

Азр

Уа1

РЬе

Азп

35

40

45

- 45 014985

Агд с!у 11е 50

Бег

б!у Агд

ТЬг Бег Азр 55

б!у Агд

ьеи 60

11е

Уа1

Азр А1а

Ьеи

Уа1

А1а

ьеи

РЬе

Ьеи

А1а

61 п

Бег

Ьеи

61 у

ьеи

Рго

Азп

ьеи

65

70

75

80

Рго

Туг

ьеи

Бег

61 у

Азр

РЬе

Ьеи

Агд

61 у

А1а

АЗП

РЬе

А1а

Бег

85

90

95

А1а

61 у

А1а

тНг

11 е

Ьеи

Рго

ТЬг

Бег

61 у

Рго

РЬе

ьеи

11е

61 п

Уа1

100

105

110

61 η

РЬе

ЬУ5

А5р

РЬе

ьуз

Бег

61 п

Уа1

Ьеи

61 и

Ьеи

Агд

61 п

А1а

ьеи

115

120

125

61 у

Ьеи

1_еи

61 П

61 и

Ьеи

ьеи

Агд

ьеи

РГО

Х/а1

Ьеи

Азр

А1а

Ьуз

130

135

140

Бег

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

11е

Ме1

11е

61 у

тЬг

Азп

Азр

ьеи

11е

тЬг

145

150

155

160

Бег

А1а

РЬе

РКе

61 у

Рго

ьуз

Бег

тЬг

61 и

Бег

Азр

Агд

Азп

Уа1

Бег

165

170

175

Уа1

рго

61 и

РЬе

ьуз

АЗр

Азп

Ьеи

Агд

61 п

Ьеи

11 е

Ьуз

Агд

ьеи

Агд

180

185

190

Бег

АЗП

61 у

А1а

Агд

Не

11е

Уа1

Ьеи

11е

тЬг

Ьеи

Уа1

11 е

ьеи

195

200

205

А5П

Беи

61 у

Рго

ьеи

61 у

Суз

Ьеи

Рго

ьеи

ьуз

ьеи

А1а

Ьеи

А1а

ьеи

210

215

220

Д1а

Бег

Ь_У5

Азп

Уа1

Азр

А1а

Бег

61 у

Суз

Ьеи

61 и

Агд

Ьеи

Азп

225

230

235

240

61 и

А1а

Уа1

А1а

Азр

РЬе

АЗП

61 и

А1а

Ьеи

Агд

61 и

ьеи

А1а

11е

Бег

245

250

255

Ь_У5

ьеи

61 и

Αδρ

61 п

Ьеи

Агд

ьуз

Азр

61 у

ьеи

Рго

Азр

Уа1

ьуз

61 у

260

265

270

А1а

Азр

Уа1 275

РГО

Туг

Уа1

Азр

ьеи 280

Туг

Бег

11е

РЬе

61 п 285

Азр

Ьеи

Азр

61 у

11 е

61 η

А5П

Рго

Бег

А1а

туг

Уа1

туг

61 у

РЬе

61 и

тЬг

тНг

ьуз

290

295

300

А1а

С_У5

б1у

туг

61 у

Агд

туг

АЗП

туг

Азп

Агд

Уа1

Суз

61 у

305

310

315

320

- 46 014985

Азп

А1а

61 у

Ьеи

Суз 325

АЗП

Уа!

ТЬг

А1а

ьуз А1а 330

Суз

Азп

Рго

зег 335

Зег

туг

ьеи

Ьеи

Зег 340

РЬе

Ьеи

РЬе

Тгр

Азр 345

б!у рЬе

Н13

Рго

Зег 350

61 и

Ьуз

61 у

Туг

Ьуз

А1а

Уа!

А1а

61 и

А1а

ьеи

355

360

<210> 3 <211> 335 <212> ΡΚΤ <213> Аеготопаз ЬубгорЫ1а

Азр Зег ьеи Зег Азр ТЬг 61_У ьуз меь Туг Зег Ьуз МеТ Агд с!у Туг 40 45 ьеи рго зег зег Рго рго туг Туг С1и С1у Агд РНе зег Азп <31_У Рго Э Э АО

Уа! 65

Тгр

Ьеи

61 и

61 п

Ьеи 70

ТЬг

Азп

61 и

РЬе

Рго 75

61 у

Ьеи

ТЬг

11 е

А1 а 80

Азп

61 и

А1а

61 и

61 у 85

61 у

Рго

ТЬг

а! а

Уа1 90

А1а

Туг

АЗП

ьуз

Не 95

зег

Тгр

Азп

Рго

Ьуз 100

Туг

61 п

Уа1

Не

Азп 105

Аэп

Ьеи

Азр

Туг

61 и 110

Уа!

ТЬг

61 п

РЬе

Ьеи 115

61 п

ьуз

Азр

Зег

РЬе 120

ЬУ5

Рго

Азр

ьеи 125

Уа!

Не

ьеи

Тгр

Уа! 130

61 у

А1а

АЗП

Азр

Туг 135

Ьеи

А1а

Туг

О1у

Тгр 140

АЗП

ТЬг

61 и

61 п

Азр 145

А1а

ьуз

Агд

Уа1

Агд 150

Азр

А1а

Не

Зег

Азр 155

А1а

Азп

Агд

Мес 160

/а!

ьеи

АЗП

61 у

А1а 165

Ьуз

61 и

11е

Ьеи

ьеи 170

РЬе

Азп

Ьеи

Рго

Азр 175

Ьеи

51У

61η

Азп

Рго 180

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п 185

ьуз

Уа!

61 и

А1а 190

А1а

Зег

- 47 014985

Н15

Уа1

Зег 195

А1а Туг

Н15

Азп

61 п 200

Ьеи

Ьеи Ьеи Азп ьеи 205

А1а

Агд

61 п

ьеи

А1а

Рго

ТЬг

61 у

мег

Уа1

Ьуз

ьеи

РЬе

61 и

11 е

Азр

ьуз

61 п

РЬе

210

215

220

А1а

С1и

мег

ьеи

Агд

Азр

Рго

61 п

Азп

РЬе

61 у

Ьеи

Зег

Азр

61 п

Агд

225

230

235

240

АЗП

А1а

Суз

туг

61 у

Зег

Туг

Уа1

тгр

ьуз

РГО

РЬе

А1а

Зег

Агд

245

250

255

5ег

А1а

Зег

тЬг

Азр

Зег

61 п

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

А5П

рго

61п

61 и

Агд

260

265

270

|_еи

А1а

11е

А1а

61 у

Азп

Рго

Ьеи

ьеи

А1а

61 п

А1а

Уа!

А1а

Зег

Рго

275

280

285

мег

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

ьеи

Азп

Суз

61 и

61 у

ьуз

мес

РЬе

290

295

300

тгр

А8р

61 п

Уа1

НТЗ

Рго

тЬг

ТЬг

Уа1

Нтз

А1а

Ьеи

Зег

61 и

305

310

315

320

Рго

А1а

тЬг

РЬе

11е

61 и

Зег

61 п

туг

61 и

РЬе

ьеи

А1а

нтз

325 330 335 <210> 4 <211> 336 <212> ΡΚΤ <213> Аеготопаз за1тотстс1а

<400> 4

Мес

ьуз

тгр

РЬе

Уа1

Суз

Ьеи

ьеи

61 у

Ьеи

11е

А1а

ьеи

ТЬг

Уа1

1

5

10

15

61 п

А1а

АЗр

тЬг

Агд

РГО

А1а

РЬе

Зег

Агд

11 е

Уа1

мес

РЬе

61 у

20

25

30

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

тЬг

61 у

ьуз

мес

туг

Зег

ьуз

мес

Агд

61 у

туг

35

40

45

Ьеи

Рго 50

Зег

Рго

туг 55

туг

61 и

61 у

Агд

РЬе 60

Зег

АЗП

61 у

Рго

Уа1

тгр

ьеи

61 и

61 п

ьеи

ТЬг

ьуз

61 п

РЬе

Рго

61 у

ьеи

тЬг

И е

А1а

65

70

75

80

АЗП

61 и

А1а

61 и

61 у

А1а

тЬг

А1а

Уа!

А1а

туг

Азп

ьуз

11е

Зег

85

90

95

тгр

Азп

РГО

ьуз

Туг

61 п

Уа!

туг

АЗП

Ьеи

Азр

туг

61 и

Уа!

тЬг

- 48 014985

100

105

110

С1п

РЬе

Ьеи

61 η

1_уз

Азр

Зег

РЬе

1_уз

Рго

А5р

Азр

ьеи

Уа!

11 е

ьеи

115

120

125

тгр

Уа!

с! у

а! а

АЗП

Азр

туг

ьеи

А1а

туг

61 у

Тгр

АЗП

тЬг

61 и

61 η

130

135

140

Азр

А! а

|_уз

Агд

Уа!

Агд

Азр

А1 а

Не

Зег

Азр

А1а

АЗП

Агд

Μθΐ

145

150

155

160

Уа!

Ьеи

А5П

с! у

А1а

ьуз

61 п

11 е

ьеи

Ьеи

РЬе

АЗП

Ьеи

Рго

Азр

ьеи

165

170

175

с! у

61 η

АЗП

рго

зег

А1а

Агд

Зег

61 п

ьуз

Уа!

Уа1

61 и

А1а

Уа1

Зег

180

185

190

НТ 5

Уа!

Зег

а! а

туг

Н15

АЗП

ьуз

ьеи

Ьеи

ьеи

АЗП

Ьеи

А1а

Агд

61 η

195

200

205

Ьеи

А1а

Рго

тЬг

С1 у

мег

Уа!

ьуз

ьеи

РЬе

61 и

11 е

Азр

ьуз

61 п

РЬе

210

215

220

а! а

с! и

Μθΐ

ьеи

Агд

Азр

РГО

61 п

АЗП

РЬе

61 у

ьеи

Зег

Азр

Уа1

61 и

225

230

235

240

АЗП

РГО

Суз

туг

Азр

61 у

Туг

уа!

тгр

ьуз

Рго

РЬе

А1а

тЬг

Агд

245

250

255

Зег

Уа!

Зег

тЬг

Азр

Агд

61 п

Ьеи

Зег

а! а

Рбе

зег

Рго

61 п

61 и

Агд

250

265

270

ьеи

д! а

11 е

А1 а

с! у

Азп

Рго

ьеи

Ьеи

А1а

61 η

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

275

280

285

Мет

д! а

Агд

Зег

А1а

5ег

рго

Ьеи

АЗП

Суз

61 и

61 у

Ьуз

Μθΐ

РЬе

290

295

300

тгр

Азр

с!п

Уа!

Н1з

Рго

тЬг

Уа!

НТЗ

А1а

Ьеи

Зег

61 и

305

310

315

320

Агд

а! а

А! а

тЬг

РЬе

Не

61 и

тЬг

61 η

Туг

61 и

РЬе

ьеи

А1а

НТ 5

61 у

325 330 335 <210>5 <211>295 <212> РКТ <213> 31гер1отусез сое1тсо1ог <400>5

Мег Рго ьуз Рго А1а ьеи Агд Агд Уа! Μθΐ тЬг А1а тЬг Уа1 А1а А1а 15 1015

- 49 014985

Уа1

б1у

ТЬг

Ьеи 20

А1а Ьеи 61 у

Ьеи

ТЬг 25

Азр

А1а

ТЬг

А1а

Нтз 30

А1а А1а

Рго

А1а

61 η

А1а

тЬг

Рго

ТЬг

Ьеи

Азр Туг

уа!

А1а

ьеи

61 у

Азр

Бег

35

40

45

туг

Бег

А1а

61 у

Бег

61 у

Уа1

Ьеи

РГО

Уа1

Азр

Рго

А1а

Азп

ьеи

50

55

60

Суз

!_еи

Агд

Бег

ТЬг

А1а

АЗП

Туг

РГО

Нтз

Уа!

11 е

А1а

Азр

ТЬг

65

70

75

80

61 у

А1а

Агд

Ьеи

ТЬг 85

Азр

Уа!

ТЬг

суз

61 у 90

А1а

61 п

ТЬг

А1а 95

Азр

РЬе

тЬг

Агд

А1а

61 п

туг

РГО

61у

Уа1

А1а

Рго

61 п

ьеи

АЗр

А1а

Ьеи

100

105

но

61 у

тЬг

61 у

ТЬг

Азр

ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

тЬг

11 е

б!у

61 у

АЗП

Азр

АЗП

115

120

125

5ег

тЬг

РЬе

Не

Азп

А1а

11е

ТЬг

А1а

суз

61 у

ТЬг

А1а

61 у

Уа1

Ьеи

130

135

140

Бег

61 у 61 у

ьуз

61 у

Бег

РГО

Суз

ьуз

Азр Агд

НТЗ

61 у

ТЬг

Бег

РЬе

145

150

155

160

А5р

61 и

Не

61 и

А1а

АЗП

ТЬг

туг

РГО

А1а

ьеи

ьуз

61 и

А1а

ьеи

165

170

175

1_еи

61 у

Уа1

Агд

А1а

Агд

А1а

РГО

нтз

А1а

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

61у

180

185

190

Туг

Рго

Тгр

Не

ТЬг

РГО

А1а

ТЬг

А1а

Азр

РГО

Бег

Суз

РЬе

Ьеи

ьуз

195

200

205

Ьеи

РГО

ьеи

А1а

61 у

Азр

Уа1

РГО

туг

Ьеи

Агд

А1а

11 е

61 п

А1а

210

215

220

НТЗ

|_еи

Азп

Азр

А1а

Уа1

Агд

А1а

61 и

тЬг

61 у

А1а

тЬг

225

230

235

240

туг

Уа1

Азр

РЬе

Бег

61 у

уа!

Бег

Азр

61 у

НТЗ

Азр

А1а

Суз

61 и

А1а

245

250

255

РГО

61 у

тЬг

Агд

тгр

11 е

61 и

Рго

ьеи

Ьеи

РЬе

61 у

нтз

Бег

Ьеи

Уа1

260

265

270

РГО

Уа1

Нтз

Рго

АЗП

А1а

Ьеи

61 у

61 и

Агд

меь

А1а

61 и

нтз

тЬг

275 280 285

- 50 014985 мет Азр Уа1 кеи

290

кеи

295

<210> 6 <211> 295 <212> РКТ <213> Зкгеркотусез сое!тсо1ог <400> 6

Мек 1

Рго куз Рго

А1а 5

кеи

Агд

Агд Уа1

мек 10

тИг

А1а тНг

Уа1

А1а 15

А1а

Уа1

61 у

ТЬг

кеи

А1а

кеи

61 у

кеи

ТЬг

АЗр

А1а

тЬг

А1а

нтз

А1а

20

25

30

Рго

А1а

С1п 35

А1а

ТНг

Рго

ТНг

кеи 40

АЗр

туг

Уа1

А1а

кеи 45

61 у

Азр

зег

туг

Зег

А1а

61 у

Зег

61 у

Уа1

кеи

рго

Уа1

Азр

Рго

А1а

Азп

кеи

50

55

60

Суз

кеи

Агд

Зег

ТНг

А1а

АЗП

Туг

РГО

Нтз

Уа1

11 е

А1а

Азр

ТЬг

Т1тг

65

70

75

80

61 у

А1а

Агд

кеи

тИг

АЗр

Уа1

тНг

суз

61 у

А1а

61 п

ТНг

А1а

А5р

85

90

95

РИе

тНг

Агд

А1а

61 η

туг

РГО

б!у

Уа1

А1а

РГО

61 п

кеи

Азр

А1а

кеи

100

105

но

С1у

тИг

С1у

тИг

Азр

кеи

УаТ

тЬг

кеи

тНг

Не

61 у 61 у

Азп

Азр

А5П

115

120

125

Зег

тНг

рНе

11е

Азп

А1а

11 е

ТЬг

А1а

Суз

61 у

тНг

А1а

61 у

Уа1

кеи

130

135

140

Зег

С1у

61 у

куз

61 у

Зег

Рго

Суз

куз

Азр

Агд

НТЗ

61 у

Тпг

5ег

РКе

145

150

155

160

Азр

61 и

Не

61 и

А1а

АЗП

тИг

туг

Рго

А1а

кеи

куз

61 и

А1а

кеи

165

170

175

кеи

61 у

Уа1

Агд

А1а

Агд

А1а

Рго

НТВ

А1а

Агд

Уа1

А1а

кеи

61 у

180

185

190

туг

Рго

тгр

Не

тНг

Рго

А1а

ТЬг

А1а

Азр

Рго

Зег

Суз

РИе

кеи

куз

195

200

205

кеи

Рго

кеи

А1а

61 у

Азр

Уа1

Рго

Туг

кеи

Агд

А1а

Не

61 п

А1а

210

215

220

- 51 014985

НТЗ 225

Беи

А5П

Азр А1а

Уа1 230

Агд Агд А1а

А1а

С1и 235

61 и

ткг

61у

А1а

Ткг 240

Туг

Уа1

Αδρ

Рке

Зег 245

б1у

Уа1

Зег

Азр

С1у 250

Нт 5

Азр

А1а

Суз

61 и 255

А1а

Рго

С1у

Ткг

Агд 260

Тгр

11 е

С1и

Рго

Беи 265

Беи

Рке

61 у Нтз

Зег 270

Беи

Уа1

Рго

Уа1

НТ 5 275

Рго

АЗП

А1а

1_еи

С1у 280

61 и

Агд

Мег

А1а 285

61 и

Нтз

Ткг

мег Азр Уа1 ьеи С1у !__еи дзр /уи эрг

<210> <211> <212> <213>	7 238 РКТ Засскагошусез сегеутзтае
<400>	7

мет 1

: Азр туг С1и 1_уз

Рке

: 1_еи

ι ьеи

Рке

! б!у 10

Азр

• Зег Не

ι ткг

61 и 15

Рке

А1а

Рке

! АЗП

Ткг 20

Агд

Рго

Не

61 и

Азр 25

61у

ЬУЗ

Азр

61 п

Туг 30

А1а

Ьеи

61 у

А1а

А1а 35

Ьеи

Уа1

Азп

61 и

Туг 40

Ткг

Агд

ьуз

мет

Азр 45

Не

Беи

61 п

Агд

б!у 50

Рке

Ьуз

61 у

Туг

Ткг 55

Зег

Агд

Тгр

А1а

Ьеи 60

ьуз

Не

1_еи

Рго

61 и 65

Не

Ьеи

Ьуз

НТЗ

б!и 70

Зег

Азп

Не

Уа1

Мет 75

А1а

Ткг

Не

Рке

Ьеи 80

С1 у

А1а

Азп

Азр

А1а 85

Суз

Зег

А1а

61у

Рго 90

61 п

Зег

Уа1

Рго

Ьеи 95

Рго

61 и

Рке

Не

Азр 100

АЗП

Не

Агд

61 п

Мет 105

Уа1

Зег

1_еи

Мет

ЬУЗ НО

Зег

Туг

Нтз

11 е

Агд 115

Рго

Не

С1у 120

Рго

61 у

1_еи

Уа1

Азр 125

Агд ,

61 и

ЬУЗ

Тгр

61 и 130

ЬУЗ

61 и

Ьуз

Зег

61 и 135

61 и

Не

А1а

Теи

61 у 140

Туг

Рке

Агд

Ткг

Азп 145

61 и

АЗП

Рке

А1а

Не 150

Туг

Зег

Азр

А1а

Ьеи 155

А1а

ЬУЗ

1_еи

А1а

Азп 160

- 52 014985

С1и

сЧи ьуз

УаЧ

Рго 165

РЬе

УаЧ АЧа

ьеи

Азп Ьуз АЧа 170

РНе

СЧп

сЧп 175

СЧи

СЧу сЧу

Азр

АЧа 180

Тгр

сЧп

Ьеи

Ьеи 185

ТЬг

Азр

СЧу

Беи

НТ 5 190

РНе

Зег

СЧу

ьуз

СЧу

Туг

ьуз

14 е

РЬе

Нт 5

АЗр

СЧи

ьеи

Ьеи

ьуз

УаЧ

1Че

сЧи

195

200

205

тЬг

РЬе

туг

Рго

сЧп

туг

НТЗ

Рго

ьуз

АЗП

МеТ

СЧп

Туг

ьуз

ьеи

ьуз

210

215

220

Азр

Тгр

Агд

Азр

УаЧ

ьеи

Азр

СЧу

8ег

Азп

1Че

мет

Зег

225

230

235

<210> 8 <211> 347 <212> РИТ <213> КаЧзтопта зр <400> 8

мет 1

А5П

ьеи

Агд сЧп тгр 5

МеТ сЧу АЧа АЧа 10

ТЬг

АЧа АЧа

Ьеи

АЧа 15

ьеи

СЧу

ьеи

АЧа

суз

сЧу СЧу сЧу СЧу

ТЬг

Азр

сЧп

Зег

сЧу

А5П

Рго

20

25

30

АЗП

УаЧ

АЧа

ьуз

УаЧ

сЧп

Агд

Мет

УаЧ

РЬе

СЧу

Азр

Зег

Ьеи

Зег

35

40

45

АЗр

1Че 50

СЧу

тЬг

туг

ТЬг

Рго 55

УаЧ

АЧа

СЧп

АЧа

УаЧ 60

СЧу

СЧу СЧу

ьуз

РЬе

ТЬг

тЬг

АЗП

Рго

СЧу

Рго

1Че

Тгр

АЧа

СЧи

ТЬг

УаЧ

АЧа

СЧп

65

70

75

80

ьеи

СЧу

УаЧ

тЬг

ьеи

ТЬг

Рго

АЧа

УаЧ

мет

СЧу

Туг

АЧа

ТЬг

Зег

УаЧ

85

90

95

СЧп

Азп

Суз

Рго

ьуз

АЧа

сЧу

Суз

РЬе

Азр

Туг

АЧа

сЧп

СЧу

сЧу

Зег

100

105

110

Агд

УаЧ

ТЬг

Азр

Рго

АЗП

сЧу

1Че

СЧу

НТ 5

Азп

СЧу

АЧа

СЧу

АЧа

115

120

125

ьеи

ТЬг

Туг

рго

УаЧ

СЧп

сЧп

СЧп

Ьеи

АЧа

Азп

РЬе

туг

АЧа

Зег

130

135

140

АЗП

тЬг

РЬе

АЗП

СЧу

Азп

Азр

УаЧ

РЬе

УаЧ

Ьеи

АЧа

СЧу

145

150

155

160

Зег

АЗП

Азр

1Че

РЬе

Тгр

ТЬг

АЧа

тНг

5ег

сЧу

зег

- 53 014985

165 170 175

01 у

Уа1

тНг Рго 180

А1а 11 е

А1а ТНг А1а 185

01 η Уа1 01 η 01 η

А1а 190

А1а

тНг

Азр

1_еи

Уа1

С1у

Туг

\/а1

Буз

Аэр

мет

11 е

А1а

ьуз

01 у

А1а

ТНг

01 п

195

200

205

Уа1

туг

Уа1

РНе

АЗП

|_еи

рго

Азр

зег

5ег

ьеи

тНг

рго

Азр

01 у

Уа1

210

215

220

А1а

Зег

С1у

тНг

С1 у

01 η

А1а

ьеи

юз

А1а

ьеи

Уа1

01 у

тНг

225

230

235

240

РНе

АЗП

тНг

1_еи

С1 п

Зег

С1 у

ьеи

А1а

01 у

тНг

Зег

А1а

Агд

11е

245

250

255

11 е

Азр

РНе

АЗП

А1а

С1п

ьеи

ТНг

А1а

11е

01 η

АЗП

01 у

А1а

Зег

260

265

270

рНе

С1у

рНе

А1а

АЗП

тНг

Зег

А1а

Агд

А1а

Суз

Азр

А1а

ТНг

ьуз

Не

275

280

285

АЗП

А1а

ьеи

Уа1

РГО

Зег

А1а

01 у

Зег

зег

ьеи

РНе

Суз

Зег

А1а

290

295

300

АЗП

тНг

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

С1у

А1а

Азр

01 η

Зег

туг

Ьеи

РНе

А1а

Азр

305

310

315

320

С1у

Уа1

Н15

Рго

тНг

А1а

01 у

ΗΊ5

Агд

Ьеи

11е

А1а

Зег

Азп

Уа1

325

330

335

Ьеи

А1а

Агд

ьеи 340

1_еи

А1а

Аэр

АЗП

Уа1 345

А1а

ΗΊ5

<210>

9

<211>

261

<212>

РКТ

<213>

зггерТотусез

соеП со!ог

<400>

9

мег

11е

01 у

Зег

туг

Уа1

А1а

Уа1

01 у

АЗр

Зег

РНе

тНг

01 и

01 у

Уа1

1

5

10

15

с1у

А5р

Рго

01 у 20

Рго

Азр

О1 у

А1а

РНе 25

Уа1

01 у

тгр

А1а

Азр 30

Агд

ьеи

А1а

Уа1

Ьеи

1_еи

А1а

Азр

Агд

Рго

01 и

01 у

Азр

РНе

ТНг

Туг

тНг

35

40

45

АЗП

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

01 у

Агд

1_еи

ьеи

Азр

01 η

11 е

Уа1

А1а

01 и

01 п

55 60

- 54 014985

УаЧ 65

Рго Агд

УаЧ УаЧ СЧу 1_еи АЧа Рго Азр ьеи УаЧ 5ег

РЬе

АЧа

АЧа 80

70

75

СЧу

АЗП

Азр

14 е

Агд

Рго

СЧу

тЬг

АЗр

Рго

Азр

СЧи

УаЧ

АЧа

85

90

95

СЧи

Агд

РЬе

СЧи

Ьеи

АЧа

УаЧ

АЧа

ьеи

ТЬг

АЧа

СЧу

ТЬг

100

105

110

УаЧ

Ьеи

УаЧ 115

тЬг

ТЬг

СЧу

РЬе

АЗр 120

тЬг

Агд

С 4 у

УаЧ

рго 125

УаЧ

Ьеи

ьуз

НТЗ

Ьеи

Агд

сЧу

ьуз

14 е

АЧа

ТЬг

туг

АЗП

СЧу

нтз

УаЧ

Агд

АЧа

1Че

130

135

140

АЧа

А5р

Агд

туг

СЧу

суз

Рго

УаЧ

ьеи

Азр

Ьеи

Тгр

5ег

Ьеи

Агд

8ег

145

150

155

160

УаЧ

СЧп

АЗр

Агд

АЧа

Тгр

Азр

АЧа

Азр

Агд

Ьеи

Нт 5

ьеи

8ег

Рго

165

170

175

сЧи

сЧу

НТ 5

тЬг 180

Агд

УаЧ

АЧа

Ьеи

Агд 185

АЧа

сЧу

сЧп

АЧа

ьеи 190

СЧу

ьеи

Агд

УаЧ

РГО 195

АЧа

Азр

Рго

Азр

СЧп 200

Рго

Тгр

Рго

Ьеи 205

Рго

РГО

Агд

СЧу

ТЬг

ьеи

Азр

УаЧ

Агд

Азр

УаЧ

нтз

тгр

АЧа

Агд

СЧи

Туг

210

215

220

Ьеи

УаЧ

Рго

тгр

1Че

сЧу

Агд

ьеи

Агд

СЧу

сЧи

5ег

Зег

СЧу

Азр

225

230

235

240

НТВ

УаЧ

тЬг

АЧа

ьуз

сЧу

тЬг

ьеи

8ег

РГО

Азр

АЧа

14 е

ьуз

ТЬг

Агд

245

250

255

1Че

АЧа

УаЧ

АЧа

260 <210> 10 <211> 260 <212> РКТ <213> ЗТгерТотусез соеЧтсоЧог <400>10

МеТ СЧп ТЬг Азп Рго АЧа Туг ТЬг 8ег 1_еи УаЧ АЧа УаЧ бЧу А5р 8ег

1015

РЬе тЬг сЧи сЧу мет 8ег Азр ьеи ьеи Рго Азр сЧу 8ег туг Агд сЧу

2530

- 55 014985

Тгр А1а

Азр 35

ьеи

ьеи А1а тИг

Агд Мет А1а А1а Агд Зег

Рго

01 у

рКе

40

45

Агд

туг

А1а

Азп

Ьеи

А1а

Уа!

Агд

01 у

ьуз

ьеи

11 е

01 у

01 п

11 е

Уа!

50

55

60

Азр

01 и

01 η

Уа1

Азр

Уа1

А1а

мет

01 у

А1а

Азр

Уа1

Не

тЬг

65

70

75

80

|_еи

Уа1

01 у

С1у

Ьеи 85

АЗП

Азр

тНг

ьеи

Агд 90

РГО

ьуз

Суз

Азр

мет 95

А1а

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ьеи

тИг

С1 п

А1а

Уа!

01 и

Агд

ьеи

А1а

РГО

НТВ

100

105

110

Суз

С1и

01 η

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ме1

Агд

Зег

Рго

С1у Агд

01 п

01 у

Рго

Уа1

115

120

125

Беи

С1и

Агд

Рпе

Агд

Рго

Агд

Мет

01 и

А1а

Ьеи

РЬе

А1а

Уа1

11 е

А5р

130

135

140

Азр

ьеи

А1а

01 у

Агд

НТ 5

01 у

А1а

Уа!

Азр

Ьеи

туг

С1у

А1 а

145

150

155

160

01 η

Зег

Ьеи

А1а

Азр

Рго

Агд

мет

тгр

Азр

Уа1

АЗр

Агд

ьеи

нтз

Ьеи

165

170

175

ТНг

А1а

01 и

01 у

НТ 5

Агд

Уа1

А1а

01 и

А1а

Уа1

тгр

С1 п

Зег

Ьеи

180

185

190

01 у

НТВ

С1и

Рго

01 и

Азр

РГО

01 и

Тгр

Нтз

А1а

РГО

11 е

Рго

А1 а

ТНг

195

200

205

Рго

01 у

Тгр

Уа1

тНг

Агд

тИг

А1а

Азр

Уа!

Агд

РЬе

А1а

210

215

220

Агд

01 η

нт з

Ьеи

РГО

Тгр

Не

01 у

Агд

ьеи

ТЬг

01 у

Агд

Зег

225

230

235

240

Зег

С1у

Азр

С1у

ьеи

РГО

А1а

ьу₅

Агд

Рго

Азр

ьеи

Ьеи

Рго

туг

01 и

245 250 255

Азр Рго А1а Агд

260

<210> <211> <212> <213>	11 454 РКТ зтгертотусез сое1тсо1ог
<400>	11

- 56 014985

мег 1

ТЬг Агд

61 у

Агд

Азр

С1у С1у А1а

С1у А1а 10

Рго

ТЬг

Буз 15

Н15

Агд

А1а Беи

Беи 20

А1а

Не

Уа1

ТЬг 25

Беи

11е

Уа1

А1а

Не 30

Бег

А1а

11е туг 35

А1а

С1у

А1а

Бег

А1а 40

Азр

61 у

Бег

Агд 45

Азр

НТЗ

А1а

геи

С1п А1а 50

б!у

С1у

Агд

Беи 55

Рго

Агд

61 у

Азр

А1а 60

А1а

Рго А1а

Бег

ТЬг 61 у А1а тгр \/а1

Рго

| 61 у

ТЬг

61 и

ТЬг 85

ТЬг

С1у

Беи

А1а

61у 90

Агд

5ег Уа1

Агд

АЗП 95

Уа1

НТЗ

ТЬг

Бег 100

Уа1

61 у

61у

ТЬг

61у 105

А1а

Агд

Не ТЬг

Беи 110

Бег

Азп

Беи

Туг

61 у 115

61 η

Бег

Рго

Беи

ТЬг 120

Уа1

ТЬг

Нтз

А1а Бег 125

Не

А1а

Беи

А1а

А1а 130

С1у

Рго

Азр

ТЬг

А1а 135

А1а

Не

А1а

Азр ТЬг 140

мег

Агд

Беи 145

ТЬг

РЬе

61 у

61у

Бег 150

А1а

Агд

Уа1

Не

Не 155

Рго А1а

61 у

61 п 160

Уа1

мег

Бег

Азр

ТЬг 165

А1а

Агд

Беи

А1а

Не 170

Рго

Туг б1у

А1а

Азп 175

Уа1

Беи

Уа1

ТЬг

ТЬг 180

Туг

Бег

Рго

Не

Рго 185

Бег

61у

Рго Уа1

ТЬг 190

Туг

Нтз

Рго	61 п	А1а 195	Агд	61 п	ТЬг Бег	Туг 200	Беи	А1а	Азр
Азр	Уа1 210	ТЬг	А1а	Уа1	А1а Туг 215	ТЬг	ТЬг	Рго	ТЬг
Беи 225	ТЬг	А1а	Беи	Азр	Уа1 Беи 230	Бег	Ηί 5	61 и	А1а 235
А1а	РЬе	б1у	Азр	Бег 245	Не ТЬг	Азр	61 у	А1а 250	Агд
\зп	Нтз	Агд	Тгр 260	ТЬг	Азр Уа1	Беи	А1а 265	А1а	Агд

61 у	Азр 205	Агд	ТЬг	А1а
Рго 220	Туг	Тгр	Агд	Туг
Азр	61 у	ТЬг	Уа1	Уа1
				240
Бег	61 п	Бег	Азр 255	А1 а
Беи	НТ 5	61 и	А1а	А1а
		270

- 57 014985

С1У АЗР С1у Агд Аар ТЬг Рго Аг_§ туг Зег Уа] Уа] Азп С] и ₆₁у _11езег 61у азп Агд Ьеи Ьеи ТЬг зег Агд рго С1у Агд Рго А1а Азр Азп

Рго 305

Зег

С1у

Ьеи

Зег

Агд 310

РЬе

61 п

Агд

Азр

Уа1 315

Ьеи

61 и

Агд

ТЬг

Азп 320

Уа!

Ьуз

А1а

Уа!

Уа! 325

Уа!

кеи

61 у

Уа! 330

АЗП

Азр

Уа!

Ьеи

Азп 335

Зег

Рго

61 и

Ьеи

А1а 340

Азр

Агд

Азр

А1а

Не 345

1_еи

ТЬг

б1у

Ьеи

Агд 350

ТЬг

Ьеи

Уа!

Азр

Агд 355

А1а

Н15

А1а

Агд

61 у 360

Ьеи

Агд

Уа!

61 у 365

А1а

ТЬг

Не

ТЬг

Рго 370

РЬе

б!у

61 у

Туг

61у 375

С1у

туг

ТЬг

61 и

А1а 380

Агд

61 и

ТЬг

Мет

Агд 385

61 п

61 и

Уа!

Азп

61 и 390

61 и

Не

Агд

Зег

61 у 395

Агд

Уа!

РЬе

Азр

ТЬг 400

Уа!

Азр

РЬе

Азр 405

ЬУ5

А1 а

1_еи

Агд

Азр 410

Рго

Туг

Азр

Рго

Агд 415

Агд

Мет

Агд

Зег

Азр 420

Туг

Азр

Зег

61 у

Азр 425

Н15

Ьеи

Н13

Рго

61у 430

Азр

ЬУ5

61у

Туг

А1а 435

Агд

мет

61у

А1а

Уа! 440

Не

Азр

Ьеи

А1а

А1а 445

Ьеи

Ьуз

61 у

^А1а А1а Рго Уа1 ьу₅ д]_а <210> 12 <211> 340 <212> ррт <213> ЗТгертотусез сое11со1ог <400> 12

мет тЬг 1

Зег

Мет

Зег 5

Агд

А1а Агд

Уа!

А1а 10

Агд

Не

А1а

А1а 15

61у

А1а А1а

Туг

61 у 20

61у

С1у Не

61у 25

1_еи

А1а

61у

А1а

А1а 30

А1а

Уа1

С1у ьеи

Уа! 35

Уа1

А1а

61 и

Уа! 61п 40

1_еи

А1а

Агд

Агд 45

Уа1

61 у

Уа1

б!у тЬг

Рго

ТЬг

Агд

Уа!

РГО А5П

А1а

61 п

61 у

1_еи

Туг

С1у

б!у

ТЬг

- 58 014985

50

55

60

ьеи

Рго

ТЬг

А1а

61 у

Азр

Рго

ьеи

Агд

ьеи

Ме1

ме!

ьеи

61 у

Азр

65

70

75

80

Бег

ТЬг

А1а

61 у

61 η

61 у

Уа1

НТ 5

Агд

А1а

61 у

61 п

тЬг

РГО

61 у

85

90

95

А1а

ьеи

А1а

Бег

61 у

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

61 и

Агд

РГО

Уа1

Агд

100

105

110

ьеи

61 у

Бег

Уа1

А1а

61 η

Рго

61 у

А1а

суз

Бег

Азр

Ьеи

Азр

Агд

115

120

125

61 η

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

61 и

РГО

Азр

Агд

Уа1

Рго

Азр

11е

Суз

130

135

140

Уа1

Не

мег

Уа1

61 у

А1а

А5П

Азр

Уа1

ТЬг

НТ 5

Агд

ме!

Рго

А1а

тНг

145

150

155

160

Агд

Бег

\/а1

Агд

НТ 5

Ьеи

Бег

А1а

Уа1

Агд

ьеи

Агд

тЬг

А1а

165

170

175

61 у

А1а

61 и

Уа1

61 у

тНг

Суз

РГО

Азр

ьеи

б!у

тЬг

11 е

61 и

180

185

190

Агд

Уа1

Агд

61 η

РГО

ьеи

Агд

тгр

ьеи

А1а

Агд

А1а

Бег

Агд

61 п

195

200

205

Ьеи

А1а

61 η

тЬг

11 е

61 у

А1а

Уа1

61 и

61 п

61 у

Агд

ТЬг

210

215

220

Уа1

Бег

ьеи

61 у

Азр

Ьеи

ьеи

61 у

РГО

61 и

РЬе

А1а

61 п

АЗП

РГО

Агд

225

230

235

240

61 и

ьеи

РЬе

61 у

Рго

Аэр

Азп

Туг

НТ 5

Рго

Бег

А1а

61 и

61 у

туг

А1а

245

250

255

ТНг

А1а

мег

А1а

Уа1

ьеи

РГО

Бег

Уа1

Суз

А1а

ьеи

61 у

Ьеи

260

265

270

тгр

Рго

А1а

Азр

61 и

НТ 5

Рго

Азр

А1а

ьеи

Агд

61 и

61 у

РИе

275

280

285

ьеи

Рго

Уа1

А1а

Агд

А1а

61 и

А1а

Бег

61 и

А1а

61 у

тЬг

290

295

300

61 и

Уа1

А1а

мег

Рго

Т1тг

61 у

РГО

Агд

61 у

Рго

Тгр

А1а

ьеи

305

310

315

320

Ьеи

ьуз

Агд

Уа1

Бег

61 и

А1а

61 и

РГО

Бег

- 59 014985

325 330335

Рго Зег 61 у Уа1

340 <210>13 <211>305 <212> РКТ <213> 3!гер!отусег соеИсо!ог <400>13

мег 61 у

Агд б!у ТЬг Азр 61 η 5

Агд тЬг Агд Туг 10

61 у Агд Агд Агд 15

А1а Уа1

Агд

Уа1

А1а геи 20

А1а А1а

1_еи

ТЬг

А1а 25

А1а

Уа1

ьеи 61 у

Уа1 30

61у

А1а

61 у

Суз

А$р

зег

Уа1

61 у

Азр

Зег

Рго

А1а

Рго

Зег

61 у

8ег

35

40

45

рго

Зег

ьуз

Агд

тЬг

Агд

ТЬг

А1а

Рго

А1а

тгр

Азр

ТЬг

Зег

Рго

А1а

50

55

60

зег 65

Уа1

А1а

Уа1

61 у 70

Азр

Зег

11е

тЬг

Агд 75

61 у

РЬе

АЗр

А1а

Суз 80

А1а

Уа1

ьеи

Зег

Азр 85

Суз

Рго

61 и

Уа1

Зег 90

тгр

А1а

ТЬг

61 у

зег 95

Зег

А1а

ЬУ5

Уа1

Азр

Зег

ьеи

А1а

Уа1

Агд

ьеи

б!у

ьуз

А1а

Азр

А1а

100

105

110

А1а

61 и

Н15

Зег

тгр

АЗП

Туг

А1а

Уа1

ТЬг

61 у

А1а

Агд

Ме!

А1а

Азр

115

120

125

ьеи

ТЬг

А1а

61 η

Уа1

тЬг

Агд

А1а

61 η

Агд

61 и

Рго

61 и

ьеи

Уа1

130

135

140

А1а

Уа1

ме!

А1а

61 у

А1а

АЗП

Азр

А1а

суз

Агд

Зег

ТЬг

Зег

А1а

145

150

155

160

ме!

тЬг

Рго

Уа1

А1а

АЗр

РЬе

Агд

А1а

61 η

РЬе

61 и

А1а

ме!

А1а

165

170

175

тЬг

ьеи

Агд

ьуз

1_еи

Рго

Ьуз

А1а

61 η

УаТ

Туг

Уа1

Зег

11е

180

185

190

РГО

Азр

ьеи

1_уз

Агд

ьеи

Тгр

Зег

61 η

61 у

Агд

ТЬг

АЗП

Рго

ьеи

61 у

195

200

205

ьуз

61 η

Уа1

тгр

куз

ьеи

61 у

ьеи

суз

РГО

Зег

Ме!

ьеи

61 у

Азр

А1а

210 215 220

- 60 014985

Азр Зег 1_еи Азр Зег А1а А1а тНг ьеи Агд Агд Азп тНг Уа1 Агд Азр

225 230 235 240

Агд

Уа1

А1а Азр Туг 245

Азп

01 и

Уа1

ьеи Агд 01 и 250

Уа1

суз

А1а

Ьуз 255

Азр

Агд

Суз

Агд

Зег

Азр

01 у

А1а

Уа1

Н1 3

01 и

РНе

Агд

рИе

01 у

260

265

270

тНг

Азр

01 п

Ьеи

Зег

Н1 5

Тгр

Азр

Тгр

РЬе

ΗΊ 5

РГО

Зег

Уа1

Азр

01 у

275

280

285

01 п

А1а

Агд

Ьеи

А1а

01 и

11е

А1а

туг

Агд

А1а

Уа!

ТЬг

А1а

ьуэ

Азп

290 295 300

Рго

305 <210> 14 <211> 268 <212> РКТ

<213> зггерготусез

п’тозиз

<400> 14

мег

Агд

ьеи

зег

Агд

А1а

тЬг

А1а

Зег

А1а

ьеи

ьеи ьеи

тЬг

1

5

10

15

Рго

А1а

ьеи

А1а

Ьеи

РЬе

С1у

А1а

Зег

А1а

Уа1

Зег

А1а Рго

Агд

20

25

30

11е

01 п

А1а

ТЬг

Азр

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

01 у

Азр

Зег

Туг

Зег Зег

01 у

35

40

45

Уа1

01 у

А1а

01 у

зег

Туг

Азр

Зег

01 у

Зег

Суз

Ьуз Агд

Зег

50

55

60

тНг

ьуз

Зег

туг

РГО

А1а

ьеи

тгр

А1а

Зег

Н1 5

тЬг

С1у тЬг

Агд

65

70

75

80

рИе

АЗП

РНе

тНг

А1а

Суз

5ег

01 у

А1а

Агд

тЬг

01 у

Азр

Уа1 ьеи

А1а

85

90

95

ьуз

01 п

ьеи

тЬг

РГО

Уа1

АЗП

Зег

01 у

тЬг

Азр

ьеи

Уа1

Зег 11е

тЬг

100

105

110

11е

01 у

Азп

Азр

А1а

01 у

РЬе

А1а

Азр

тЬг

мег

тЬг

тЬг суз

АЗП

115

120

125

ьеи

01 п

01 у

01 и

5ег

А1а

Суз

Ьеи

А1а

Агд

11 е

А1а

Ьуз

А1а Агд

А1а

130 135 140

- 61 014985

Туг 145

11 е 61 η

61 η

тЬг

ьеи Рго А1а 61η ьеи Азр

61 п Уа1

туг

АЗр

А1а 160

150

155

11 е

Азр

Бег

Агд

А1а

Рго

А1а

61 п

Уа1

Ьеи

61 у

туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

туг

Ьу5

ьеи

61 у

Бег

суз

А1а

Уа1

61 у

ьеи

Бег

61 и

Ьу5

180

185

190

Бег

Агд

А1а

а! а

Не

АЗП

А1 а

А1а

Азр

11е

Азп

А1а

Уа1

Тпг

195

200

205

А1 а

1_уз

Агд

А1а

Азр

НТ 5

61 у

РЬе

А1а

РНе

б1у

Азр

Уа1

Азп

тЬг

210

215

220

ТЬг

РЬе

А1а

61 у

Н1 5

61 и

ьеи

Суз

Бег

61 у

А1а

Рго

тгр

ьеи

НТ 8

Бег

225

230

235

240

Уа1

тЬг

1_еи

РГО

Уа1

61 и

Агп

Бег

туг

НТ 8

Рго

тЬг

А1а

Азп

61 у

61 п

245

250

255

Бег

ьуз

61 у

Туг

беи

Рго

Уа1

Ьеи

Азп

Бег

А1а

тНг

260

265

<210>15 <211>336 <212> РКТ <213> Аеготопа5 за1топтстда зиЬ5р.5а1топтстба <400>15

Мег

ьуз

Ьуз

тгр

РНе

Уа1

суз

ьеи

Ьеи

61у

ьеи

11 е

А1а

ьеи

ТЬг

Уа1

1

5

10

15

61 п

А1а

Азр

тЬг

Агд

Рго

А1а

рЬе

Бег

Агд

11е

Уа1

мет

РЬе

61 у

20

25

30

Азр

Бег

ьеи

Бег

Азр

тЬг

61 у

ьуз

Мет

Туг

Бег

ьуз

мет

Агд

61 у

Туг

35

40

45

Ьеи

Рго

Бег

Рго

РГО

Туг

туг

61 и

61 у

Агд

РЬе

Бег

Азп

б1у

Рго

50

55

60

Уа1

Тгр

Ьеи

61 и

61 п

Ьеи

ТЬг

Ьуз

61 п

РЬе

Рго

б1у

Ьеи

ТЬг

11 е

А1а

65

70

75

80

АЗП

61 и

А1а

61 и

61 у

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

туг

АЗП

ьуз

11 е

Бег

85

90

95

тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

61 п

Уа1

11 е

АЗП

ьеи

Азр

туг

61 и

Уа1

ТЬг

100

105

110

- 62 014985

61η

ι РЬе Ьеи 115

ι 61 п

ι Ьуз

Азр

' Бег

' РЬе 120

ьуз

. Рго

> Азр

• Азр

> Ьеи 125

Уа1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1 130

61у

А1а

. Азп

Азр

Туг 135

Ьеи

А1а

Туг

61 у

Тгр 140

Азп

ТЬг

61 и

61 п

Азр 145

А1а

ьуз

Агд

Уа1

Агд 150

Азр

А1а

11 е

Бег

Азр 155

А1а

Азп

Агд

Μθΐ 160

Уа!

Ьеи

АЗП

61 у

А1а 165

Ьуз

61 п

Не

Ьеи

Ьеи 170

РЬе

Аэп

ьеи

Рго

Азр 175

Ьеи

б1у

61 п

АЗП

Рго 180

Бег

А1а

Агд

Бег

61 п 185

Уа!

61 и

А1а 190

Уа1

Бег

Нтз

Уа!

Бег 195

А1а

Туг

Нтз

Азп

ьуз 200

Ьеи

ьеи

АЗП

Ьеи 205

А1а

Агд

61 п

Ьеи

А1а 210

Рго

ТЬг

61 у

Μθΐ

Уа! 215

ьуз

ьеи

РЬе

61 и

Не 220

АЗр

ьуз

61п

РЬе

А1а 225

61 и

Мег

Ьеи

Агд

Азр 230

Рго

61 п

А5П

РЬе

61 у 235

ьеи

Бег

Азр

Уа!

61 и 240

АЗП

Рго

суз

туг

Азр 245

б!у

61 у

туг

Уа1

тгр 250

Ьуз

Рго

РЬе

А1а

тЬг 255

Агд

Бег

Уа1

Бег

тЬг 260

Азр

Агд

61 п

ьеи

Бег 265

А1а

РЬе

Бег

Рго

61 п 270

61 и

Агд

Ьеи ,

А1а

Не 275

А1а

61 у

Азп

Рго

Ьеи 280

Ьеи

А1а

61 п

А1а

Уа1 285

А1а

Бег

РГО

Мег А1а , 290

Агд ,

Агд

Бег ,

А1а

Бег 295

Рго

Ьеи

Азп

Суз

С1и 300

61 у

Ьуз

мет

РЬе

20

25

30

Зег

РГО

Рго туг

туг

61 и

61у

Агд

РНе

Зег

АЗП

01 у

РГО

Уа1

Тгр

35

40

45

ьеи

61 и

01 п

ьеи

тЬг

ьуз

61 п

РЬе

Рго

61 у

Ьеи

ТНг

11е

А1а

АЗП

01 и

50

55

60

А1 а

61 и

61 у 61 у

А1а

тНг

А1 а

Уа1

А1а

туг

Азп

ьуз

11е

Зег

тгр

Азр

65

70

75

80

Рго

ьуз

Туг

61 п

Уа1

11е

Азп

ьеи

Азр

туг

61 и

Уа!

тНг

61 п

РНе

85

90

95

ьеи

61 п

ьуз

Азр

Зег

РНе

ьуз

Рго

Азр

ьеи

Уа1

11 е

Ьеи

тгр

Уа1

100

105

110

01 у

А1а

АЗП

Азр

Туг

ьеи

А1а

Туг

01 у

тгр

Азп

ТНг

61 и

61 п

Азр

А1а

115

120

125

ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

11 е

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

мес

Уа1

Ьеи

130

135

140

АЗП

61 у

А1а

ьуз

01 п

11е

ьеи

РНе

Азп

ьеи

рго

Азр

ьеи

61 у

61 п

145

150

155

160

АЗП

РГО

Зег

А1а

Агд

Зег

61 п

ьуз

Уа!

Уа1

61 и

А1а

Уа1

Зег

НТ 5

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Туг

Нт 5

А5П

Ьуз

ьеи

А5П

Ьеи

А1а

Агд

01 п

Ьеи

А1а

180

185

190

РГО

ТЬг

61 у

мес

Уа1

ьуз

ьеи

РНе

61 и

11е

Азр

ьуз

01 п

РНе

А1а

01 и

195

200

205

мес

ьеи

Агд

Азр

РГО

61 п

АЗП

РЬе

О1у

ьеи

Зег

Азр

Уа1

61 и

Азп

Рго

210

215

220

Суз

Туг

Азр

61 у 61 у

туг

Уа1

Тгр

ьуз

Рго

РНе

А1а

Т1тг

Агд

Зег

Уа1

225

230

235

240

Зег

ТНг

Азр

Агд

61 п

Ьеи

Зег

А1а

РНе

Зег

Рго

61 п

61 и

Агд

ьеи

А1 а

245

250

255

11е

А1 а

61 у

АЗП

РГО

ьеи

А1а

01 п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мес

А1а

260

265

270

Агд

Зег

А1а

Зег

РГО

ьеи

АЗП

суз

61 и

61 у

ьуз

Мес

РНе

тгр

Азр

275

280

285

01 п

Уа!

Н1 5

Рго

тЬг

тНг

Уа!

Нт 5

А1а

ьеи

Зег

01 и

Агд

А1а

- 64 014985

290 295 300

А1а

тЬг

РЬе

14 е

СЧи

тЬг

СЧп

Туг

СЧи

РЬе

ьеи

АЧа

Нт 8

сЧу

305

310

315

<210> 17

<211> 465

<212

!> РКТ

<213

>> сапсН

сЧа р

>агар

15Т1с

• 8Ί 5

<400> 17

Ме1

Агд

туг

РЬе

АЧа

13 е

АЧа

РЬе

Ьеи

ьеи

13 е

Азп

ТЬг

13 е

Зег

АЧа

1

5

10

15

РЬе

УаЧ

ьеи

АЧа

Рго

ьуз

Рго

зег

СЧп

Азр

РЬе

туг

тЬг

РГО

20

25

30

РГО

СЧп

СЧу

туг

СЧи

АЧа

сЧп

Рго

Ьеи

СЧу

Зег

13 е

ьеи

ьуз

тЬг

Агд

35

40

45

А5П

УаЧ

Рго

Азп

Рго

Ьеи

тЬг

АЗП

УаЧ

РЬе

тЬг

Рго

УаЧ

ьуз

УаЧ

СЧп

50

55

60

АЗП

АЧа

Тгр

СЧп

Ьеи

УаЧ

Агд

Зег

СЧи

Азр

тЬг

РЬе

СЧу

А5П

Рго

65

70

75

80

АЗП

АЧа

14 е

УаЧ

тЬг

1Че

СЧп

РГО

РЬе

Азп

АЧа

ьуз

АЗр

85

90

95

ьуз

Ьеи

УаЧ

Зег

туг

сЧп

ТЬг

РЬе

СЧи

Азр

Зег

СЧу

ьуз

Ьеи

АЗр

су 5

100

105

110

А1а

Рго

Зег

туг

АЧа

1Че

сЧп

туг

СЧу

Зег

Азр

1Че

Зег

ТЬг

Ьеи

тЬг

115

120

125

ТЬг

сЧп

СЧу

сЧи

мет

туг

14 е

Зег

АЧа

ьеи

АЗр

СЧп

сЧу

туг

130

135

140

туг

УаЧ

тЬг

Рго

Азр

туг

сЧи

СЧу

Рго

ьуз

Зег

тЬг

РЬе

тЬг

УаЧ

145

150

155

160

С1у

Ьеи

СЧп

Зег

СЧу

Агд

АЧа

тЬг

ьеи

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

АЧа

тЬг

ьеи

165

170

175

ьуз

Зег

СЧу

Азп

ьеи

ТЬг

СЧу

УаЧ

Зег

Азр

АЧа

СЧи

тЬг

ьеи

180

185

190

тгр

СЧу

туг

Зег

сЧу

СЧу

зег

ьеи

АЧа

Зег

сЧу

Тгр

АЧа

13 е

195

200

205

СЧп

ьуз

СЧи

Туг

АЧа

Рго

СЧи

Ьеи

Зег

ьуз

Азп

Ьеи

сЧу

аЧ а

АЧа

210 215 220

- 65 014985

ьеи 61 у 225

61 у РЬе

Уа1

тЬг Азп 11е ТЬг а!а ТЬг

А1а 61 и

А1а

Уа!

Азр 240

230

235

5ег

61у

Рго

РЬе

А1а

61 у

11е

Зег

АЗП

А1а

Ьеи

А1а

61 у

11е

61 у

245

250

255

АЗП

61 и

туг

Рго

А5р

РЬе

ьуз

А5П

туг

Ьеи

ьеи

ьуз

Уа1

Зег

Рго

260

265

270

Ьеи

ьеи

Зег

11е

ТЬг

Туг

Агд

ьеи

61 у

АЗП

тЬг

Нт 3

Суз

ьеи

Ьеи

Азр

275

280

285

61 у 61 у

11е

А1а

туг

РЬе

61 у

Ьуз

Зег

РЬе

Зег

Агд

11е

Агд

290

295

300

Туг

РЬе

РГО

Азр

61 у

тгр

АЗр

Ьеи

Уа1

АЗП

61 п

61 и

Рго

11 е

ьуз

тЬг

305

310

315

320

11е

ьеи

61 η

Азр

А5П

61 у

Ьеи

Уа!

туг

61 п

РГО

Ьу5

Азр

ьеи

ТЬг

Рго

325

330

335

61 η

11 е

Рго

ьеи

РЬе

11 е

туг

НТ 5

61 у

ТЬг

ьеи

Азр

А1а

11 е

Уа1

Рго

340

345

350

11е

Уа1

Азп

Зег

Агд

Ьуз

ТЬг

РЬе

61 п

тгр

суз

Азр

тгр

61 у

Ьеи

355

360

365

ьуз

зег

61 у

61 и

Туг

Азп

61 и

Азр

Ьеи

тЬг

Азп

61 у

НТЗ

11е

ТЬг

61 и

370

375

380

зег

11 е

Уа!

61 у

А1а

Рго

А1а

Ьеи

ТЬг

Тгр

11е

11 е

А5П

Агд

РЬе

385

390

395

400

АЗП

61 у

61 п

Рго

Уа!

Азр

61 у

Суз

б1п

НТ 5

Азп

Уа1

Агд

А1а

Зег

405

410

415

АЗП

Ьеи

61 и

Туг

РГО

61 у

тЬг

Рго

61 η

зег

11 е

ьуз

АЗП

туг

РЬе

61 и

420

425

430

А1а

Ьеи

Н1 5

А1а

11 е

Ьеи

61 у

РЬе

Азр

Ьеи

61 у

Рго

Азр

Уа!

ьуз

435

440

445

Агд

Азр

Ьуз

Уа1

ТЬг

ьеи

61 у

б!у

ьеи

ьуз

ьеи

61 и

Агд

РЬе

А1а

450 455 460

РЬе

465 <210> 18 <211> 471

- 66 014985 <212> РЯТ <213> СапсНОа рагарзтЧозЧз <400> 18

мет

Агд

Туг

РЬе

АЧа

14 е

АЧа

РЬе

ьеи

Ьеи

14 е

Азп

тЬг

14 е

Зег

АЧа

1

5

10

15

РЬе

Уа1

1_еи

АЧа

Рго

ьуз

Рго

Зег

СЧп

Азр

РЬе

туг

тЬг

Рго

20

25

30

Рго

С1п

СЧу

Туг

СЧи

АЧа

сЧп

Рго

1_еи

СЧу

Зег

14 е

|_еи

ьуз

тЬг

Агд

35

40

45

Азп

УаЧ

Рго

Азп

РГО

ьеи

тЬг

АЗП

УаЧ

РЬе

тЬг

РГО

УаЧ

ьуз

УаЧ

сЧп

50

55

60

АЗП

АЧа

тгр

СЧп

ьеи

Ьеи

УаЧ

Агд

Зег

СЧи

Азр

тЬг

РЬе

СЧу

АЗП

РГО

65

70

75

80

Азп

АЧа

1Че

УаЧ

тЬг

ТЬг

1Че

сЧп

Рго

РЬе

АЗП

АЧа

ьуз

АЗр

85

90

95

ьуз

Ьеи

УаЧ

Зег

Туг

СЧп

тЬг

РЬе

СЧи

Азр

зег

сЧу

1_уз

Ьеи

Азр

суз

100

105

110

А1а

Рго

Зег

Туг

АЧа

14 е

СЧп

Туг

СЧу

Зег

Азр

14 е

Зег

ТЬг

Ьеи

тЬг

115

120

125

тЬг

сЧп

СЧу

сЧи

мет

туг

14 е

Зег

аЧ а

ьеи

Азр

СЧп

СЧу

туг

130

135

140

туг

УаЧ

тЬг

РГО

Азр

туг

СЧи

СЧу

Рго

ьуз

Зег

тЬг

РЬе

ТЬг

УаЧ

145

150

155

160

С1у

Ьеи

сЧп

Зег

сЧу

Агд

АЧа

тЬг

1_еи

Азп

Зег

ьеи

Агд

АЧа

тЬг

Ьеи

165

170

175

ьуз

Зег

сЧу

АЗП

Ьеи

тЬг

СЧу

УаЧ

Зег

Азр

АЧа

сЧи

тЬг

Ьеи

180

185

190

Тгр

СЧу

туг

Зег

ОЧу

сЧу

Зег

ьеи

аЧ а

5ег

СЧу

тгр

АЧа

1Че

195

200

205

С1п

Ьуз

СЧи

Туг

АЧа

Рго

СЧи

ьеи

Зег

Ьуз

АЗП

Ьеи

ьеи

СЧу

АЧа

210

215

220

ьеи

СЧу

сЧу

РЬе

УаЧ

тЬг

Азп

1Че

тЬг

АЧ а

тЬг

АЧа

сЧи

АЧ а

УаЧ

Азр

225

230

235

240

Зег

ОЧу

РГО

РЬе

АЧа

СЧу

14 е

Зег

Азп

АЧа

Ьеи

АЧа

сЧу

1Че

СЧу

245 250 255

- 67 014985

Азп 61 и туг Рго Азр

РЬе куэ Азп

Туг кеи 265

кеи куз

куз

Уа1 270

Зег

Рго

260

кеи

Зег

Не

ТЬг

Туг

Агд

кеи

61 у

Азп

ТЬг

Нтз

Суз

кеи

Азр

275

280

285

б!у

61 у

11 е

А1а

туг

РЬе

61 у

куз

Зег

РЬе

Зег

Агд

Не

11е

Агд

290

295

300

туг

рпе

Рго

АЗр

61 у

Тгр

АЗр

кеи

уа!

АЗП

61 п

61 и

Рго

11 е

куз

тпг

305

310

315

320

11 е

кеи

61 п

Азр

АЗП

61 у

кеи

Уа1

туг

61 п

РГО

куз

Азр

кеи

тЬг

РГО

325

330

335

61 п

11е

Рго

кеи

РЬе

Не

Туг

нт 3

61 у

ТЬг

кеи

Азр

А1а

11 е

Уа!

РГО

340

345

350

11 е

Уа1

Азп

Зег

Агд

куз

ТЬг

РЬе

61 п

Тгр

Суз

Азр

Тгр

61 у

кеи

355

360

365

куз

Зег

61 у

61 и

туг

Азп

61 и

Азр

кеи

ТЬг

Азп

61 у

НТ 5

11 е

ТЬг

61 и

370

375

380

зег

Не

Уа1

61 у

А1а

РГО

А1а

кеи

ТЬг

Тгр

11е

АЗП

Агд

РЬе

385

390

395

400

Азп

61 у

61 п

Рго

Уа1

Азр

61 у

Суз

61 п

НТ 8

Азп

Уа1

Агд

А1а

Зег

405

410

415

Азп

кеи

61 и

туг

Рго

61 у

тЬг

РГО

61 п

зег

11е

куз

АЗП

Туг

РЬе

61 и

420

425

430

А1а

кеи

Н1 5

А1а

Не

кеи

61 у

РЬе

Азр

кеи

61 у

РГО

Азр

Уа1

куз

435

440

445

Агд

Азр

куз

Уа1

тЬг

кеи

61 у

кеи

куз

кеи

61 и

Агд

РЬе

А1а

450

455

460

РЬе

Н1 5

НТ 5

Н15

Ηί 5

Н15

465

470

<210>19 <211> 261 <212> РКТ <213> Зкгеркотусез сое!тсо1ог <400>19 мек 11е б1у зег туг Уа1 А1а Уа1 О1у Азр Зег РЬе тЬг е!и С1у Уа1

1015

- 68 014985

01 у

АЗр

рго

01 у

Рго

Азр

01 у

А1а

Рке

Уа1

61 у

тгр

А1 а

А5р

Агд

ьеи

20

25

30

А1а

Уа1

ьеи

1_еи

А1а

Азр

Агд

Рго

61 и

61 у

Азр

Рке

Ткг

Туг

ткг

35

40

45

АЗП

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

61 у

Агд

Ьеи

Беи

Азр

61 п

11е

Уа1

А1а

61 и

61 п

50

55

60

Уа1

Рго

Агд

Уа1

61 у

Беи

А1 а

РГО

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рке

А1 а

А1а

65

70

75

80

61 у

Азп

Азр

Не

Агд

Рго

61 у

ткг

Азр

Рго

Азр

61 и

Уа1

А1а

85

90

95

61 и

Агд

Рке

61 и

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

1_еи

ткг

А1а

61 у

ткг

100

105

110

Уа1

1_еи

Уа1

ткг

01 у

Рке

Азр

Ткг

Агд

61 у

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

ьуз

115

120

125

НТ 5

|_еи

Агд

61 у

ЬУЗ

Не

А1 а

Ткг

туг

Азп

61 у

нтз

Уа1

Агд

А1а

11 е

130

135

140

А1а

Азр

Агд

Туг

01у

суз

Рго

УаТ

1_еи

Азр

ьеи

тгр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

145

150

155

160

Уа1

61 п

А5Р

Агд

А1а

Тгр

Азр

А1а

Азр

Агд

1_еи

Нтз

ьеи

Зег

Рго

165

170

175

61 и

01 у

Нт 5

ткг

Агд

Уа1

А1а

1_еи

Агд

А1а

61 у

61 п

А1а

ьеи

61 у

ьеи

180

185

190

Агд

Уа1

Рго

А1а

Азр

РГО

Азр

61 п

Рго

Тгр

Рго

1_еи

рго

Рго

Агд

195

200

205

01 у

ткг

ьеи

Азр

Уа1

Агд

Азр

Уа1

Нтз

тгр

А1 а

Агд

01 и

Туг

210

215

220

1_еи

Уа1

Рго

тгр

Не

61 у

Агд

|_еи

Агд

61 у

61 и

Зег

61 у

Азр

225

230

235

240

ΗΊ 5

Уа1

ткг

А1а

ьуз

61 у

ткг

1_еи

Зег

Рго

Азр

А1а

11 е

ьуз

ткг

Агд

245 250 255 е А1а А1а Уа1 А1а

260

<210>	20
<400>	20
000

- 69 014985 <210> 21 <400>21

ООО <210> 22 <400>22

ООО <210>23 <400>23

ООО <210>24 <400>24

ООО <210>25 <211>347 <212> РЯТ <213> Аеготопаэ ЬуйгорЫ1а <400>25

мег РЬе 1_у5 1

РЬе

Буз Буз Азп РЬе Беи Уа1

61 у Беи

Бег

А1а

А1а 15

Беи

5

10

мег

Бег

11 е

Бег

Беи

РЬе

Бег

А1а

ТЬг

А1а

Бег

А1а

Бег

А1а

Азр

20

25

30

Бег

Агд

РГО

А1а

РЬе

Бег

Агд

11е

Уа1

мег

РЬе

61 у

Азр

Бег

Беи

Бег

35

40

45

А их

“Г к ν-ι

/~Ί % /

1 к //-

ΚΛζι+-

ТЧ , ГЧ

Буз

/~Ί »,

Г» к-1 л

мэр

1111

кэ 1 у

иуэ

ι*ιο и

•У»

Бег

ПСБ

АГу

чз |у

туг

ьей

ΓΙ V

8еГ

Бег

50

55

60

РГО

Рго

туг

Туг

61 и

61 у

Агд

РЬе

Бег

А5П

61 у

РГО

Уа1

тгр

Ьей

61 и

65

70

75

80

61 η

геи

тЬг

Буз

61 η

РЬе

РГО

б!у

Беи

ТЬг

11е

А1а

А5П

61 и

А1а

61 и

85

90

95

61 у

А1 а

тЬг

А1а

Уа1

А1а

туг

АЗП

Буз

11 е

Бег

Тгр

АЗП

Рго

Буз

100

105

110

Туг

61 η

Уа1

11 е

АЗП

Азп

Беи

Агр

Туг

61 и

\/а1

ТЬг

61 п

РЬе

Беи

61 п

115

120

125

гуз

Азр

Бег

РЬе

Буз

Рго

Азр

Беи

Уа1

11е

Беи

Тгр

уа!

61 у

А1а

130

135

140

АЗП

Азр

Туг

Беи

А1а

туг

61 у

Тгр

АЗП

ТЬг

61 и

61 п

Аэр

А1а

Буз

Агд

145

150

155

160

- 70 014985

Уа1

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

АЗП

Агд

Мет

Уа1

ьеи

Азп

01 у

165

170

175

А1а

ьуз

01 η

11 е

ьеи

рНе

Азп

ьеи

рго

Азр

ьеи

01 у

01 п

АЗП

Рго

180

185

190

Зег

А1а

Агд

Зег

01 п

ьуз

Уа1

01 и

А1а

Уа1

Зег

ΗΊ 8

Уа1

Зег

А1а

195

200

205

туг

ΗΊ 5

АЗП

01 п

ьеи

Ьеи

АЗП

Ьеи

А1а

Агд

01 п

Ьеи

А1а

РГО

тНг

210

215

220

01 у

мет

Уа1

Ьуз

ьеи

РНе

01 и

11е

Азр

ьуз

01 п

рНе

А1а

01 и

мет

ьеи

225

230

235

240

Агд

АЗр

Рго

01 п

Азп

РНе

01 у

ьеи

Зег

Азр

Уа1

01 и

Азп

Рго

суз

туг

245

250

255

Азр

01 у

Туг

Уа1

тгр

ьуз

Рго

РНе

А1а

тНг

Агд

Зег

Уа1

Зег

тНг

260

265

270

Азр

Агд

01 п

Ьеи

Зег

А1а

РНе

зег

Рго

01 п

01 и

Агд

Ьеи

А1а

11е

А1а

275

280

285

01 у

АЗП

Рго

ьеи

Ьеи

А1а

01 п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

мет

А1а

Агд

290

295

300

Зег

А1а

Зег

РГО

ьеи

Азп

Суз

01 и

С1у

ьуз

мет

рНе

тгр

Азр

01 п

Уа1

305

310

315

320

Н1 з

РГО

тНг

Уа1

Н1 8

А1а

ьеи

зег

01 и

Агд

А1а

ТНг

325

330

335

РНе

11е

А1а

Азп

01 п

Туг

01 и

РНе

ьеи

А1а

Н1 5

340

345

<210> :

26

<211> :

267

<212>

РКТ

<213> :

зтгертотусез

зр.

<400>

26

мет

Агд

Ьеи

ТНг

Агд

зег

1_еи

Зег

А1а

зег

Уа1

11 е

Уа1

РНе

А1а

1

5

10

15

ьеи

А1а

1_еи

ьеи

01 у

11е

зег

Рго

А1а

01 п

А1а

01 у

Рго

20

25

30

А1а

туг

Уа1

А1а

ьеи

01 у

Азр

зег

Туг

Зег

зег

01 у

Азп

01 у

А1а

С1у

35

40

45

Зег

туг

11 е

Азр

зег

01 у

Азр

суз

ΗΊ 8

Агд

Зег

Азп

А1а

Туг

- 71 014985

55 60

Рго 65

А1а Агд

Тгр

А1а

А1а А1а Азп А1а Рго Зег Зег РЬе тЬг

РЬе

А1а 80

70

75

А1а

Суз

Зег

О1 у

А1а

Уа1

тЬг

А5р

Уа1

11 е

Азп

61 п

ьеи

61 у

85

90

95

А1а

ьеи

Азп

А1а

Зег

тЬг

61 у

ьеи

Уа1

5ег

11е

тЬг

11 е

61 у

Азп

100

105

110

Азр

А1а

61 у

РЬе

А1а

Азр

А1а

мет

ТЬг

тЬг

Суз

Уа!

тЬг

Зег

Азр

115

120

125

Зег

тЬг

Суз

Ьеи

Азп

Агд

Ьеи

А1а

тЬг

А1а

тЬг

АЗП

Туг

11е

АЗП

ТЬг

130

135

140

ТЬг

ьеи

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Азр

А1а

Уа1

Туг

Зег

61 п

11е

ьуз

А1а

Агд

145

150

155

160

А1а

РГО

Азп

А1а

Агд

Уа!

Уа1

Уа!

ьеи

61 у

Туг

Рго

Агд

мет

туг

ьеи

165

170

175

А1а

Зег

Азп

Рго

Тгр

туг

Суз

ьеи

61 у

Ьеи

Зег

Азп

тЬг

ьуз

Агд

А1а

180

185

190

А1а

И е

Азп

тЬг

А1а

Аэр

тЬг

ьеи

А5П

Зег

Уа1

11 е

Зег

Агд

195

200

205

А1а

тЬг

А1а

Нт 5

61 у

РЬе

Агд

РЬе

61 у

Азр

Уа1

Агд

Рго

тЬг

РЬе

АЗП

ЭЛЛ л- и-м

*)1 С

э эл 4-4-ν

Азп

ΗΪ 5

01 и

ьеи

РЬе

О1у

А5П

Азр

Тгр

ьеи

НТ 5

Зег

Ьеи

ТЬг

ьеи

225

230

235

240

РГО

Уа1

тгр

О1 и

Зег

туг

НТ 5

Рго

тЬг

Зег

тЬг

61 у

нт 3

61 п

Зег

61 у

245

250

255

туг

ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

АЗП

А1а

Азп

Зег

тЬг

260

265

<210>

27

<211>

548

<212>

РЕТ

<213>

тЬегшоЫ Тт с!а

зр

<400>

27

МеТ

ьеи

Рго

НТ 5

Рго

А1а

61 у

61 и

Агд

61 у

61 и

Уа1

61 у

А1а

РЬе

1

5

10

15

А1а

Ьеи

ьеи

Уа1

С1 у

тЬг

РГО

61 п

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

01 и

Суз

20

25

30

- 72 014985

НТ 5

61 и тНг 35

Агд

Рго

Ьеи Агд

61 у Агд 40

суз 61 у

суз

61 у 45

61 и

Агд

Уа1

Рго

ьеи

тНг

Ьеи

рго

61 у

Азр

61 у

Уа1

Ьеи

Суз

тНг

ТНг

Бег

50

55

60

Бег

тНг

Агд

АЗр

А1а

61 и

ТНг

Уа!

тгр

Агд

ьуз

ΗΪ 5

Ьеи

61 п

Рго

Агд

65

70

75

80

Рго

Азр

61 у

РНе

Агд

РГО

НТ 5

ьеи

61 у

Уа!

61 у

Суз

ьеи

А1а

85

90

95

61 у

С1п

б!у

Бег

Рго

61 у

Уа1

ьеи

тгр

суз

61 у

Агд

61 и

61 у

суз

Агд

100

105

110

РНе

С1и

Уа1

суз

Агд

АЗр

ТНг

Рго

61 у

Ьеи

Бег

Агд

тНг

Агд

Азп

115

120

125

61 у

Азр

Бег

Рго

РНе

Агд

А1а

61 у

Тгр

Бег

Ьеи

Рго

Ьуз

130

135

140

Суз

61 у

61 и

11 е

Бег

61 п

Бег

А1а

Агд

ьуз

тНг

Рго

А1а

уа!

Рго

Агд

145

150

155

160

Туг

Бег

Ьеи

ьеи

Агд

ТНг

Азр

Агд

РГО

Азр

61 у

РГО

Агд

61 у

Агд

РНе

165

170

175

Уа!

61 у

Бег

61 у

Рго

Агд

А1а

тНг

Агд

Ьеи

РНе

Ьеи

61у

180

185

190

11 е

Рго

А1а

ьеи

Уа1

Ьеи

Уа!

тНг

А1а

Ьеи

тНг

Ьеи

Уа1

ьеи

А1а

Уа1

195

200

205

Рго

ТНг

61 у

Агд

61 и

тНг

ьеи

тгр

Агд

мет

тгр

суз

61 и

А1а

тНг

61 п

210

215

220

Азр

Тгр

суз

ьеи

61 у

Уа1

рго

Уа!

Азр

Бег

Агд

61 у

61 п

Рго

А1а

61 и

225

230

235

240

АЗр

61 у

61 и

РНе

ьеи

Ьеи

ьеи

Бег

Рго

Уа!

61 п

А1а

ТНг

Тгр

61 у

245

250

255

АЗП

Туг

туг

А1а

Ьеи

61 у

АЗр

Бег

туг

Бег

61 у

А5р

61 у

А1а

Агд

260

265

270

Азр

туг

Туг

РГО

61 у

тНг

А1а

Уа1

ьуз

61 у

Суз

тгр

Агд

Бег

А1а

275

280

285

АЗП

А1а

Туг

Рго

61 и

ьеи

уа!

А1а

61 и

А1а

Туг

Азр

РНе

А1а

61 у

Нт 5

290

295

300

- 73 014985

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Суз

Зег

01 у

01 п

Агд

01 у

Туг

А1а

мег

Ьеи

Азр

305

310

315

320

А1а

Не

Азр

01 и

Уа1

01 у

зег

01 п

ьеи

Азр

Тгр

Азп

Зег

рго

Нтз

тЬг

325

330

335

Зег

ьеи

Уа1

ТЬг

Не

01 у

Не

01 у

АЗП

Азр

ьеи

01 у

РЬе

Зег

тЬг

340

345

350

Уа!

Ьеи

ьуз

ТЬг

суз

мег

Уа1

Агд

Уа1

Рго

ьеи

Α5Ρ

Зег

ьуз

А1а

355

360

365

суз

тЬг 370

Азр

01 η

01 и

Азр

А1а 375

11е

Агд

ьуз

Агд

мег 380

А1а

Ьуз

РЬе

01 и

тЬг

РЬе

01 и

ьеи

11е

Зег

01 и

Уа!

Агд

ТЬг

Агд

А1а

РГО

Азр

385

390

395

400

А1а

Агд

Не

Ьеи

Уа1 405

Уа!

01 у

туг

Рго

Агд 410

11 е

РЬе

Рго

01 и

01 и 415

РГО

ТЬг

01 у

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

01 п

Агд

Тгр

ьеи

АЗП

420

425

430

01 и

тЬг

11 е

01 η

01 и

РЬе

АЗП

01 п

Ьеи

А1а

01 и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

435

440

445

ΗΊ5

Азр

01 и

Не

А1а

Зег

01 у

Уа!

01 у

Зег

Уа!

01 и

РЬе

450

455

460

Уа1

Азр

Уа1

Туг

ΗΊ3

А1а

Ьеи

Азр

С1у

Нтз

01 и

Не

01 у

Зег

Азр

01 и

465

470

475

480

Рго

Тгр

Уа1

Азп

01 у

Уа1

01 п

ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

01 у

Уа1

ТЬг

485

490

495

Уа!

Азр

Агд

Зег

ТЬг

РЬе

Н18

Рго

Азп

А1а

01 у

нтз

Агд

А1а

Уа1

500

505

510

01 у

01 и

АГЦ

Уа1

Не

01 и

01 п

11 е

01 и

ТЬг

01 у

Рго

01 у

Агд

Рго

Ьеи

515

520

525

Туг

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

А1а

01 у

А1а

ТЬг

Уа!

Азр

ТЬг

Ьеи

А1а

530 535 540 у 01 и Уа1 01 у

545 <210> 28 <211> 372

- 74 014985 <212> РКТ <213> тЬегтоЬ1бтс1а 5р <400> 28

мет

б!у

Зег

61у

РГО

Агд

А1а

ТЬг

Агд

ьеи

РЬе

ьеи

61 у

1

5

10

15

11е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

рго

тЬг

61 у

Агд

61 и

тЬг

ьеи

тгр

Агд

мет

Тгр

суз

61 и

А1а

тЬг

61 п

35

40

45

Азр

тгр

Суз

Ьеи

61 у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

8ег

Агд

61 у

61 п

РГО

А1а

61 и

50

55

60

Азр

61 у

61 и

РЬе

ьеи

Ьеи

ьеи

Зег

РГО

Уа1

61 п

А1а

тЬг

тгр

61 у

65

70

75

80

АЗП

Туг

А1а

ьеи

61 у

Азр

зег

Туг

Зег

61 у

Азр

61 у

А1а

Агд

85

90

95

Азр

туг

Туг

Рго

61 у

ТЬг

А1а

Уа!

ьуз

61 у

Суз

Тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

АЗП

А1а

Туг

РГО

61 и

Ьеи

Уа1

а! а

61 и

А1а

Туг

Азр

РЬе

А1а

61 у

Н15

115

120

125

Ьеи

Зег

РЬе

ьеи

А1а

суз

зег

61 у

61 п

Агд

61 у

Туг

А1а

МеТ

Ьеи

Азр

130

135

140

А1а

11е

Азр

61 и

Уа!

С1у

Зег

61 п

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

зег

Рго

НТ 5

тЬг

145

150

155

160

Зег

Ьеи

Уа1

тЬг

11 е

61 у

И е

61 у

А5П

А5р

ьеи

61 у

РЬе

Зег

ТЬг

165

170

175

Уа1

ьеи

1_уз

тЬг

Суз

МеТ

Уа1

Агд

Уа!

РГО

ьеи

Ьеи

Азр

Зег

ьуз

А1а

180

185

190

Суз

ТЬг

АЗР

61 η

61 и

Азр

А1а

11е

Агд

ьуз

Агд

Мет

А1а

ьуз

РЬе

61 и

195

200

205

тЬг

ТЬг

РЬе

61 и

ьеи

11 е

зег

61 и

УаТ

Агд

тЬг

Агд

А1а

РГО

Азр

210

215

220

А1а

Агд

11е

ьеи

Уа1

61 у

туг

РГО

Агд

11е

РЬе

Рго

61 и

РГО

225

230

235

240

ТЬг

61 у

А1а

туг

ТЬг

Ьеи

тЬг

А1а

зег

АЗП

61 п

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

245 250 255

- 75 014985

СЧи тЬг тЧе сЧп

СЧи

РЬе А5п

СЧп

СЧп ьеи 265

АЧа СЧи

АЧа

УаЧ 270

АЧа

УаЧ

260

НТЗ

Азр

СЧи

14 е

АЧа

Зег

СЧу СЧу

УаЧ

СЧу

Зег

УаЧ

СЧи

РЬе

275

280

285

УаЧ

АЗр

УаЧ

Туг

НТЗ

АЧа

Ьеи

Аэр

сЧу

Н1 8

СЧи

13 е

сЧу

зег

Азр

СЧи

290

295

300

РГО

Тгр

УаЧ

Азп

СЧу

УаЧ

СЧп

ьеи

Агд

Азр

Ьеи

АЧа

тЬг

СЧу

УаЧ

тЬг

305

310

315

320

УаЧ

Азр

Агд

Зег

тНг

РЬе

НТЗ

Рго

Азп

АЧа

СЧу

НТ 8

Агд

АЧа

УаЧ

325

330

335

СЧу

СЧи

Агд

УаЧ

13 е

СЧи

СЧп

1Че

СЧ и

тЬг

СЧу

РГО

СЧу

Агд

РГО

Ьеи

340

345

350

Туг

АЧа

тЬг

РЬе

АЧа

УаЧ

АЧа

СЧу

АЧа

тЬг

УаЧ

Азр

тЬг

ьеи

АЧа

355

360

365

С1у СЧи Уа1 СЧу

370 <210>29 <211>300 <212> РЯТ <213> СогупеЬасТегтиш еТТтстепз <400>29

Мет

Агд

ТЬг

УаЧ

14 е

АЧа

Зег

АЧа

Ьеи

ьеи

АЧа

СЧу

1

5

10

15

Суз

АЧа

Азр

сЧу 20

АЧа

Агд

СЧи

тЬг 25

АЧа

сЧу

АЧа

Рго

Рго 30

СЧу

сЧи

зег

Зег

сЧу

1Че

Агд

СЧи

сЧу

АЧа

сЧи

АЧа

зег

тЬг

Зег

14 е

35

40

45

тЬг

Азр

УаЧ

туг

1Че

АЧа

Ьеи

СЧу

Азр

Зег

туг

АЧа

мет

сЧу

СЧу

50

55

60

Агд 65

А5р

сЧп

Рго

Ьеи

Агд 70

СЧу

СЧи

Рго

РЬе

Суз 75

Ьеи

Агд

зег

Зег

сЧу 80

АЗП

туг

Рго

СЧи

ьеи

Ьеи

НТ 8

АЧа

сЧи

УаЧ

тЬг

Азр

ьеи

тЬг

Суз

СЧп

85

90

95

сЧу

АЧа

УаЧ

тЬг

СЧу

Азр

ьеи

сЧи

РГО

Агд

тЬг

ьеи

СЧу

СЧи

Агд

100 105 110

- 76 014985

тНг

ьеи

Рго

А1а

61 η

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

тНг

61 и

Азр

тНг

ТНг

Ьеи

Уа1

115

120

125

тНг

ьеи

Бег

11 е

61 у

Азп

Азр

Ьеи

61 у

РНе

61 у

61 и

Уа1

А1а

61 у

130

135

140

Суз

Не

Агд

61 и

Агд

11е

А1а

61 у

61 и

АЗП

А1а

Аэр

Азр

Суз

Уа1

Агр

145

150

155

160

ьеи

б!у

61 и

ТНг

Не

61 у

61 и

61 п

ьеи

Азр

61 п

ьеи

РГО

Рго

61 п

165

170

175

ьеи

Азр

Агд

Уа1

НТ 8

61 и

А1а

Не

Агд

Азр

Агд

А1а

61 у

Азр

А1а

61 п

180

185

190

Уа1

\/а1

Уа1

ТНг

61 у

туг

Ьеи

РГО

Ьеи

Уа1

Бег

А1а

61 у

Азр

Суз

Рго

195

200

205

61 и

ьеи

б1у

Азр

Уа1

Бег

61 и

А1а

Аэр

Агд

Тгр

А1а

Уа1

61 и

ьеи

210

215

220

тНг

61 у

61 η

11 е

Азп

61 и

ТНг

Уа1

Агд

61 и

А1а

61 и

Агд

НТ 8

А5р

225

230

235

240

А1а

ьеи

РНе

Уа1

Ьеи 245

РГО

Азр

А1а

АЗр 250

61 и

НТ 5

ТНг

Бег

Суз 255

А1а

РГО

Рго

61 η

61 η 260

Агд

тгр

А1а

Азр

11е 265

61 п

61 у

61 п

тНг 270

Азр

А1а

туг

Рго

ьеи

НТ 8

РГО

тНг

Бег

А1а

61 у

НТ 8

61 и

А1а

мег

А1а

275

280

285

Уа1

Агд

Азр

А1а

ьеи

61 у

Ьеи

61 и

Рго

Уа1

61 п

Рго

290 295 300 <210>30 <211>284 <212> РЯТ <213> моуозрНтпдоЬтит аготаТтстуогапз <400>30

мет 1

61у

61 п

Уа1

ьуз 5

Ьеи

РНе

А1а

Агд

Агд 10

суз

А1а

РГО

Уа1

Ьеи 15

ьеи

А1а

Ьеи

А1а

61 у 20

Ьеи

А1а

Рго

А1а

А1а 25

ТНг

Уа1

А1а

Агд

61 и 30

А1а

Рго

Ьеи

А1а

61 и 35

61 у

А1а

Агд

туг

Уа1 40

А1а

ьеи

61 у

Бег

Бег 45

РНе

А1а

61 у

Рго

61 у

Уа1

61 у

РГО

АЗП

А1а

Рго

61 у

Бег

РГО

61 и

Агд

суз

61 у

- 77 014985

50

55

60

Агд

61 у

ТЬг

ьеи

АЗП

туг

Рго

ΗΪ 3

ьеи

Ьеи

А1а

61 и

А1а

ьеи

ьуз

Ьеи

65

70

75

80

Азр

ьеи

Уа1

Азр

А1а

тЬг

Суз

Зег

С1у

А1а

тЬг

Н1 5

Н1 3

Уа1

ьеи

85

90

95

61 у

Рго

тгр

АЗП

61 и

Уа1

РГО

Рго

61 η

11е

Азр

Зег

Уа1

Азп

61 у

Азр

100

105

110

тЬг

Агд

ьеи

Уа1

тНг

ьеи

тЬг

11е

61 у

АЗП

Азр

Уа1

Зег

РЬе

Уа1

115

120

125

61 у

АЗП

11 е

РЬе

А1а

Суз

61 и

ьуз

Ме!

А1а

Зег

Рго

Азр

РГО

130

135

140

Агд

Суз

61 у

ьуз

тгр

Агд

61 и

11е

тЬг

61 и

тгр

61 η

А1а

Азр

145

150

155

160

61 и

Агд

ме!

Агд

Зег

11 е

Уа1

Агд

61 η

11 е

ΗΊ 5

А1а

Агд

А1а

РГО

165

170

175

ьеи

А1а

Агд

Уа1

Азр

Туг

11 е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

Зег

180

185

190

61у

тЬг

Суз

А1а

ме!

А1а

11е

зег

Рго

Агр

Агд

ьеи

А1а

61 η

Зег

195

200

205

Агд

Зег

А1а

ьуз

Агд

ьеи

А1а

Агд

11 е

тЬг

А1а

Агд

Уа1

А1а

Агд

210

215

220

61 и

61 у

А1а

Зег

ьеи

ьуз

РЬе

Зег

Н1 5

11е

Зег

Агд

ΗΊ 3

225

230

235

240

Н15

РГО

суз

Зег

А1а

ьуз

Рго

Тгр

Зег

Азп

61 у

ьеи

Зег

А1а

Рго

А1а

245

250

255

Азр

61 у

11 е

Рго

Уа1

ΗΊ5

Рго

Азп

Агд

Ьеи

61 у

Н1 5

А1а

61 и

А1а

260

265

270

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ме!

Ьуз

275 280 <210>31 <211> 268 <212> РЕТ <213> 3!гер!отусез соеНсоТог <400>31

Ме! Агд Агд РЬе Агд Ьеи Уа1 б1у РНе Ьеи Зег Зег Ьеи Уа1 Ьеи А1а 15 1015

- 78 014985

А1а

61 у

А1а А1а 20

ьеи тНг

61 у А1а А1а 25

ТНг А1а 61п А1а

А1а 30

61 п

Рго

А1а

Азр

61 у

Туг

Уа1

А1а

ьеи

61 у

Азр

Бег

туг

Бег

61 у

35

40

45

Уа1

61 у

А1а

61 у

Бег

туг

11 е

Бег

61 у

Азр

Суз

ьуз

Агд

Бег

50

55

60

тНг

Ьуз

А1а

Нт 3

Рго

Туг

Ьеи

Тгр

А1а

НТ 5

Бег

Рго

Бег

ТНг

65

70

75

80

РНе

Азр

рНе

тНг

А1а

Суз

Бег

61 у

А1а

Агд

тЬг

61 у

Азр

Уа1

ьеи

Бег

85

90

95

61 у

61 η

ьеи

61 у

РГО

ьеи

Бег

61 у

тНг

61 у

ьеи

Уа1

Бег

11 е

Бег

100

105

110

11е

61 у

АЗП

Азр

А1а

61 у

РНе

А1а

Азр

тНг

ме!

тНг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

61 η

Бег

61 и

Бег

Суз

Ьеи

Бег

Агд

11е

А1а

тНг

А1а

61 и

А1а

130

135

140

Туг

Уа1

Азр

Бег

тНг

ьеи

рго

61 у

ьуз

ьеи

Азр

61 у

Уа1

Туг

Бег

А1а

145

150

155

160

11е

Бег

Азр

ьуз

А1а

Рго

Азп

А1а

НТ 5

Уа1

11 е

61 у

Туг

Рго

165

170

175

Агд

РНе

Туг

ьуз

Ьеи

61 у

тНг

ТНг

Суз

11 е

61 у

Ьеи

Бег

61 и

тНг

ьуз

180

185

190

Агд

тЬг

А1а

11 е

АЗП

ьуз

А1а

Бег

АЗр

нтз

Ьеи

АЗП

тНг

Уа1

Ьеи

А1а

195

200

205

61 η

Агд

А1 а

А1а

нт з

61 у

РНе

тНг

РНе

61 у

Азр

Уа1

Агд

тНг

210

215

220

РЬе

тНг

61 у

Нт 5

61 и

ьеи

Суз

Бег

61 у

Бег

Рго

тгр

Ьеи

Нт 5

Бег

Уа1

225

230

235

240

АЗП

Тгр

Ьеи

Азп

11 е

61 у

61 и

Бег

Туг

НТ 5

Рго

тНг

А1а

61 у

61 п

245

250

255

Бег

61 у

Туг

Ьеи

Рго

Уа1

ьеи

Азп

61 у

А1а

260 265 <210> 32 <211> 269

- 79 014985 <212> РКТ <213> зггерготусез ауегтт!т1тз <400> 32

Μθΐ Агд 1

Агд

Зег

Агд 5

11 е

тЬг А1а туг Уа1 10

тЬг Зег

Ьеи

ьеи

ьеи 15

А1а

Уа1

61 у

Суз

А1а

Ьеи

ТЬг

61 у

А1а

тЬг

А1а

61 п

А1а

Зег

РГО

А1а

20

25

30

А1а

тЬг

61 у

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

61 у

Аэр

Зег

туг

Зег

61 у

35

40

45

Уа1

61 у

А1а

61 у

Зег

Туг

Ьеи

Зег

61 у

Азр

Суз

ьуз

Агд

Зег

50

55

60

зег

Ьуз

А1 а

туг

РГО

туг

Ьеи

тгр

61 η

А1а

Ηί 5

зег

РГО

зег

65

70

75

80

РЬе

Зег

РЬе

ме!

А1а

Суз

Зег

61 у

А1а

Агд

тЬг

61 у

Азр

Уа1

ьеи

А1а

85

90

95

АЗП

61 η

Ьеи

61 у

ТЬг

ьеи

АЗП

Зег

ТЬг

61 у

ьеи

Уа!

зег

ьеи

тЬг

100

105

110

11е

61 у 61 у

АЗП

Азр

А1а

61 у

РЬе

Зег

А5р

Уа1

Μθΐ

тЬг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

61 η

Зег

АЗР

Зег

А1а

Суз

Ьеи

Зег

Агд

11 е

А5П

ТЬг

А1а

ьуз

А1а

130

135

140

туг

Уа!

Азр

Зег

ТЬг

ьеи

рго

61 у

61 η

ьеи

Азр

Зег

Уа!

туг

тЬг

А1а

145

150

155

160

11е

Зег

тЬг

ьуз

А1а

РГО

Зег

А1а

НТ 5

Уа!

А1а

Уа1

Ьеи

61 у

туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

ьуз

Ьеи

61 у

Зег

Суз

Ьеи

А1а

61 у

Ьеи

Зег

61 и

тЬг

180

185

190

ЬУ5

Агд

Зег

А1а

11е

АЗП

Азр

А1а

Азр

туг

ьеи

АЗП

зег

А1а

11е

195

200

205

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Азр

НТЗ

61 у

РЬе

ТЬг

РЬе

б!у

Азр

Уа1

Ьуз

Зег

210

215

220

тЬг

РЬе

тЬг

61 у

Ηΐ в

61 и

11 е

Суз

Зег

зег

Зег

ТЬг

тгр

ьеи

НТЗ

зег

225

230

235

240

ьеи

Азр

Ьеи

ьеи

Азп

11 е

61 у

61 η

зег

туг

НТ 5

РГО

тЬг

а! а

А1а

61 у

245 250 255

- 80 014985

61η Зег С1у 61 у Туг ьеи Рго Уа1 Мет Азп Зег Уа1 А1а

260265 <210>33 <211>267 <212> РКТ <213> ЗГгертотусеэ 5р <400>33

мет 1

Агд Ьеи

тЬг

Агд 5

Зег

ьеи

Зег А1а

А1а Зег 10

Уа1

11 е

Уа1

РЬе 15

А1а

ьеи

А1 а

ьеи

61 у

11 е

Зег

Рго

А1а

61 п

А1а

61 у

Рго

20

25

30

А1а

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

61 у

Азр

Зег

Туг

Зег

61 у

Азп

61 у

А1а

61 у

35

40

45

Зег

Туг

11 е

Азр

Зег

61 у

Азр

Суз

ΗΊ 8

Агд

Зег

АЗП

Азп

А1а

Туг

50

55

60

Рго

А1а

Агд

тгр

А1а

АЗП

А1а

Рго

Зег

РЬе

ТЬг

РЬе

А1а

65

70

75

80

А1а

Суз

Зег

61 у

А1а

Уа1

тЬг

ТЬг

Азр

Уа1

11 е

АЗП

Азп

61 п

ьеи

61 у

85

90

95

А1а

Ьеи

Азп

А1а

Зег

тНг

С1у

Ьеи

Уа1

Зег

11е

тНг

11 е

61 у

Азп

100

105

110

Азр

А1а

61 у

рпе

А1а

Азр

А1а

мет

ТЬг

Суз

Уа1

тЬг

Зег

Азр

115

120

125

Зег

тЬг

Суз

ьеи

Азп

Агд

ьеи

А1а

ТЬг

А1а

тЬг

Азп

Туг

Не

АЗП

тЬг

130

135

140

тЬг

Ьеи

1_еи

А1 а

Агд

Ьеи

Азр

А1а

Уа1

туг

Зег

61 п

11е

1_уз

А1а

Агд

145

150

155

160

А1 а

Рго

Азп

А1 а

Агд

Уа1

1_еи

61 у

Туг

Рго

Агд

мет

туг

1_еи

165

170

175

А1а

Зег

А5П

Рго

тгр

туг

Суз

1_еи

61 у

Ьеи

Зег

Азп

тЬг

Ьуз

Агд

А1а

180

185

190

А1а

11 е

Азп

тЬг

А1а

Азр

тЬг

ьеи

А5П

Зег

Уа1

11е

Зег

зег

Агд

195

200

205

А1а

ТЬг

А1а

Н1 5

61 у

РЬе

Агд

РЬе

61 у

Азр

Уа1

Агд

Рго

тЬг

РЬе

Азп

210

215

220

- 81 014985

АЗП

НТ 5

61 и

ьеи

рКе

РНе

61 у

АЗП

А5р

тгр

ьеи

Н15

Зег

ьеи

тНг

Ьеи

225

230

235

240

РГО

Уа1

тгр

61 и

Зег

туг

Нт 5

Рго

тНг

5ег

тНг

01 у

НТ 5

61 п

Зег

О1у

245

250

255

туг

ьеи

РГО

Уа1

ьеи

А5П

А1а

А5П

Зег

тНг

260 265 <210> 34 <211> 317 <212> РИТ

<213> Аеготопаз

ΙτορΙι

|Па

<400> 3

14

А1а

Азр

Зег

Агд

РГО

А1а

РНе

Зег

Агд

11 е

Уа1

Мес

РНе

61 у

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Зег

Азр

тНг

01 у

Ьуз

Мес

Туг

Зег

Ьуз

Мес

Агд

01 у

туг

ьеи

РГО

20

25

30

Зег

РГО

туг

61 и

61 у

Агд

РКе

Зег

Азп

61 у

Рго

Уа1

тгр

35

40

45

ьеи

61 и

61 п

ьеи

тНг

Азп

61 и

Рпе

РГО

01 у

ьеи

ТНг

11 е

А1а

Азп

01 и

50

55

60

А1а

61 и

61 у

01 у

РГО

тЬг

А1а

Уа1

А1а

туг

АЗП

Ьуз

11 е

зег

тгр

Азп

65

70

75

80

РГО

Ьуз

Туг

61 п

Уа1

11е

Азп

АЗП

Ьеи

Азр

туг

01 и

Уа1

тНг

61 п

РНе

85

90

95

ьеи

01 п

ьуз

Азр

зег

РНе

ьуз

Рго

Азр

ьеи

Уа1

11е

ьеи

тгр

Уа1

100

105

110

61 у

А1а

АЗП

АЗр

туг

ьеи

А1а

туг

61 у

Тгр

АЗП

тНг

61 и

01 п

Азр

А1а

115

120

125

ьуэ

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

АЗП

Агд

МеС

Уа1

Ьеи

130

135

140

АЗП

61у

А1а

Ьуз

61 и

11 е

ьеи

РНе

Азп

ьеи

РГО

Азр

ьеи

61 у

61 п

145

150

155

160

Азп

РГО

Зег

А1а

Агд

Зег

01 п

ьуз

уа!

Уа1

61 и

А1а

зег

НТ 5

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

туг

ΗΊ 5

АЗП

/оПт

\еи

ьеи

Ьеи

Азп

Ьеи

А1а

Агд

61 п

Ьеи

А1а

180

С

185

190

Рго

тНг

61 у

мес

Уа!

ьуз

ьеи

РНе

61 и

Не

А5р

ьуз

01 п

РНе

А1а

61 и

- 82 014985

195

200

205

мес

|_еи

Агд

Азр

Рго

61 п

Азп

РЬе

61 у

кеи

Зег

Азр

61 п

Агд

Азп

А1а

210

215

220

Суз

Туг

61 у

Зег

туг

Уа1

тгр

куз

Рго

РЬе

А1а

Зег

Агд

Зег

А1а

225

230

235

240

зег

тЬг

Азр

Зег

61 п

1_еи

зег

А1а

РЬе

АЗП

Рго

61 п

61 и

Агд

кеи

А1а

245

250

255

Не

А1а

61 у

Азп

РГО

кеи

А1а

61 п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

мег

А1а

260

265

270

А1а

Агд

Зег

А1а

зег

тЬг

кеи

Азп

Суз

61 и

61 у

куз

мек

РЬе

тгр

Азр

275

280

285

61 η

Уа1

НТ 5

РГО

тЬг

Уа1

нтз

А1а

кеи

Зег

61 и

РГО

А1а

290

295

300

А1а

тЬг

РЬе

11 е

61 и

зег

61 п

Туг

61 и

РЬе

кеи

А1а

НТ 5

305

310

315

<210> 35 <211> 318 <212> РКТ <213> Аеготопаз заТтоптст да <400> 35

А1а

Азр

(тН г

)хгд

рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

11 е

Уа1

Мек|

²рЬе'

)61у

Азр

зег

1

5

10

15

кеи

Зег

Азр

ТЬг

61 у

куз

мек

туг

Зег

куз

мек

Агд

61 у

Туг

кеи

РГО

20

25

30

Зег

Рго

Туг

туг

61 и

61 у

Агд

РЬе

зег

Азп

61 у

Рго

Уа1

тгр

35

40

45

кеи

61 и

61 п

кеи

тЬг

куз

61 п

РЬе

РГО

61 у

кеи

тЬг

11е

А1а

Азп

61 и

50

55

60

А1а

61 и

61 у

А1а

тЬг

А1а

Уа1

А1а

туг

АЗП

куз

Не

Зег

тгр

АЗП

65

70

75

80

Рго

куз

Туг

61 п

Уа1

Не

Азп

АЗП

кеи

Азр

Туг

61 и

Уа1

тЬг

61 п

РЬе

85

90

95

кеи

61 п

куз

Азр

Зег

РЬе

куз

РГО

Азр

кеи

Уа1

Не

кеи

Тгр

уа!

100

105

110

61 у

А1 а

Азп

Аэр

Туг

кеи

А1 а

туг

61 у

Тгр

Азп

тЬг

61 и

61 п

Азр

А1а

115

120

125

- 83 014985

ЬУ5

Агд

Уа1

Агд

Аэр

А1а

11 е

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

мет

Уа1

Ьеи

130

135

140

А5П

61 у

А1а

1_уз

61 п

11 е

Ьеи

ьеи

Рке

Азп

Ьеи

Рго

Азр

ьеи

61 у

61 п

145

150

155

160

А5П

Рго

5ег

А1а

Агд

Зег

61 п

ьуз

Уа1

61 и

А1а

Уа1

Зег

НТЗ

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Туг

нтз

АЗП

|_уз

Ьеи

1_еи

ьеи

А5П

ьеи

А1а

Агд

61 п

Ьеи

А1а

180

185

190

Рго

Ткг

01 у

мег

Уа1

ьуз

1_еи

Рке

01 и

Не

Азр

ьуз

61 п

Рке

А1а

61 и

195

200

205

Мег

1_еи

Агд

Азр

Рго

61 п

АЗП

Рке

01 у

ьеи

Зег

Азр

Уа1

01 и

Азп

Рго

210

215

220

суз

туг

Азр

61 у

Туг

Уа1

Тгр

ьуз

рго

Рке

А1а

Ткг

Агд

Зег

Уа1

225

230

235

240

Зег

Ткг

Азр

Агд

61 п

|_еи

Зег

А1а

Рке

Зег

Рго

61 п

61 и

Агд

ьеи

А1а

245

250

255

11 е

А1а

61 у

Азп

Рго

Ьеи

1_еи

А1а

61 п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

МеТ

А1а

260

265

270

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

61 и

01 у

ьуз

мег

Рке

Тгр

Азр

275

280

285

61 п

Уа1

ΗΊ5

Рго

Ткг

Уа1

нтз

А1а

Ьеи

Зег

61 и

Агд

А1а

290

295

300

А1а

Ткг

Рке

11 е

61 и

Ткг

01 п

Туг

01 и

Рке

ьеи

А1а

нтз

61 у

305 310 315 <210> 36 <211> 1371 <212> ϋΝΑ <213> ЗТгерготусеэ Ткегтозасскагт <400> 36

асаддссдаТ	дсасддаасс	дТассТТТсс	дсадТдаадс	дстстссссс	сагсдттсдс	60
сдддасггса	тссдсдаттт	ТддсаТдаас	астгссгтса	асдсдсдтад	сТТдсТасаа	120
дТдсддсадс	адасссдсТс	дттддаддст	садТдадаТТ	дасссдатсс	сТдТсддссд	180
сатссдтсат	сдгстгсдсс	стдсгдсгсд	сдстдстддд	сатсадсссд	дсссаддсад	240
ссддсссддс	сгатдТддсс	стдддддагт	сстастсстс	дддсаасддс	дссддаадгг	300
асатсдагтс	дадсддТдас	ТдТсассдса	дсаасаасдс	дгассссдсс	сдстдддсдд	360

- 84 014985

сддссаасдс	ассдтсстсс	ттсасстгсд	сддссгдстс	дддадсддгд	ассасддагд	420
тдагсаасаа	ТсадсТдддс	дсссТсаасд	сдтссассдд	ссТддТдадс	аТсассаТсд	480
дсддсаагда	сдсдддсггс	дсддасдсда	гдассассгд	сдтсассадс	гсддасадса	540
ссгдссТсаа	ссддсгддсс	ассдссасса	астасаТсаа	сассассстд	сгсдсссддс	600
гсдасдсддТ	сТасадссад	аТсааддссс	дТдсссссаа	сдсссдсдгд	дтсдгсстсд	660
дсТасссдсд	саТдтассТд	дссгсдаасс	сстддгастд	сстдддссгд	адсаасасса	720
адсдсдсддс	саТсаасасс	ассдссдаса	сссТсаасгс	ддТдаТсТсс	гсссдддсса	780
ссдсссасдд	аТТссдаТТс	ддсдаТдТсс	дсссдассТТ	саасаассас	даастдггст	840
гсддсаасда	сТддсТдсас	тсасгсассс	гдссддтдгд	ддадТсдтас	сассссасса	900
дсасдддсса	гсададсддс	татстдссдд	Тссгсаасдс	саасадсТсд	ассгдатсаа	960
сдсасддссд	Тдсссдсссс	дсдсдТсасд	сгсддсдсдд	дсдссдсадс	дсдтгдагса	1020
дсссасадТд	ссддгдасдд	гсссассдгс	асддтсдадд	дТдТасдТса	сддгддсдсс	1080
дсТссадаад	тддаасдтса	дсаддассдТ	ддадссдгсс	сгдассгсдг	сдаадаасгс	1140
сддддтсадс	дтдатсассс	стсссссдта	дссдддддсд	ааддсддсдс	сдаастссгг	1200
дтаддасдгс	садгсдтдсд	дсссддсдТТ	дссассдТсс	дсдтадассд	сттссагддг	1260
сдссадссдд	Тссссдсдда	асгсддтддд	датдтссдгд	сссааддгдд	тсссддтддг	1320
дтссдададс	ассдддддст	сдгассддаг	дагдтдсада	тссааадааг	ΐ	1371

<210> 37 <211> 267 <212> РКТ <213> БТгерТотусез гНегтозассИагт

<400> 37

меТ

Агд

Ьеи

тНг

Агд

Бег

Ьеи

Бег

А1а

Бег

Уа!

11е

Уа1

РНе

А1а

1

5

10

15

ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

61 у

11е

Бег

РГО

А1а

61 η

А1а

61 у

Рго

20

25

30

А1а

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

61 у

Азр

Бег

Туг

Бег

61 у

Азп

61 у

А1а

61 у

35

40

45

Бег

Туг

11 е

Азр

Бег

61 у

Азр

Суз

ΗΊ 5

Агд

Бег

АЗП

Азп

А1а

Туг

50

55

60

Рго

А1а

Агд

Тгр

А1а

Азп

А1а

Рго

Бег

РЬе

ТНг

РНе

А1а

65

70

75

80

А1а

Суз

Бег

61 у

А1а

Уа1

тНг

ТНг

Азр

Уа1

11е

Азп

61 п

Ьеи

б!у

85

90

95

А1а

ьеи

АЗП

А1а

Бег

ТЬг

61 у

ьеи

Уа!

Бег

11е

ТНг

И е

61 у

Азп

100 105 110

- 85 014985

А5р

А1а 61 у 115

РЬе А1а

Азр

А1а

мег 120

ТЬг

тЬг Суз Уа1

тЬг Бег 125

Бег Аэр

Бег

ТЬг

Суз

Беи

Азп

Агд

Беи

А1а

тЬг

А1а

тЬг

Азп

Туг

11е

Азп

ТЬг

130

135

140

тЬг

Беи

А1а

Агд

Беи

Азр

А1а

Уа1

туг

Бег

61 п

11 е

Буз

А1а

Агд

145

150

155

160

А1 а

Рго

АЗП

А1а

Агд

Уа1

Беи

61 у

туг

Рго

Агд

мег

Туг

Беи

165

170

175

А1а

Бег

Азп

Рго

тгр

Туг

Суз

Беи

61 у

Беи

Бег

АЗП

ТЬг

Буз

Агд

А1а

180

185

190

А1а

11е

Азп

ТЬг

тЬг

А1а

Азр

тЬг

Беи

Азп

Бег

Уа1

11е

Бег

Агд

195

200

205

А1 а

тНг

А1а

Нтз

61 у

РЬе

Агд

РЬе

61 у

Азр

7а1

Агд

РГО

тЬг

РЬе

АЗП

210

215

220

АЗП

НТ 5

61 и

Беи

РЬе

61 у

Азп

Азр

тгр

Беи

Нтз

Бег

Беи

тЬг

Беи

225

230

235

240

Рго

Уа1

тгр

61 и

Бег

Туг

Нт з

Рго

тЬг

Бег

ТЬг

61 у

нт з

61 п

Бег

61 у

245

250

255

туг

Беи

РГО

Уа1

Беи

Азп

А1а

Азп

Бег

ТЬг

260

265

<210>

38

<211>

548

<212>

ΡΚΤ

<213>

тЬегтоЬтТтйа

Тизса

<400>

38

мег

Беи

Рго

НТ 5

Рго

А1а

61 у

61 и

Агд

61 у

61 и

Уа1

61 у

А1а

РЬе

1

5

10

15

А1а

Беи

Уа1

61 у

тЬг

Рго

61 п

Азр

Агд

Беи

Агд

Беи

61 и

Суз

20

25

30

Нтз

61 и

тЬг

Агд

Рго

Беи

Агд

61у

Агд

Суз

61 у

Суз

61 у

61 и

Агд

35

40

45

Уа1

РГО

Рго

Беи

ТЬг

Беи

Рго

61у

Азр

61 у

Уа1

Беи

Суз

ТЬг

Бег

50

55

60

Бег

тЬг

Агд

Азр

А1а

61 и

ТЬг

Уа1

тгр

Агд

Буз

нтз

Беи

61 п

Рго

Агд

65

70

75

80

- 86 014985

РГО Азр

01 у 01 у

РНе Агд 85

Рго нт з ьеи 01у 90

Уа1

01 у суз

Ьеи

ьеи 95

А1а

01 у

01 η

01 у

Зег

Рго

01 у

Уа1

ьеи

тгр

Суз

С1у

Агд

01 и

С1у

Суз

Агд

100

105

110

РНе

01 и

Уа1

Суз

Агд

Азр

ТНг

РГО

01 у

ьеи

Зег

Агд

ТНг

Агд

АЗП

115

120

125

01 у

Азр

Зег

Рго

рНе

Агд

А1а

01 у

Тгр

Зег

Ьеи

Рго

ьуз

130

135

140

суз

01 у

01 и

Не

Зег

01 η

Зег

А1а

Агд

ьуз

тНг

РГО

А1а

Уа1

Рго

Агд

145

150

155

160

Туг

Зег

Ьеи

ьеи

Агд

тНг

Азр

Агд

Рго

Азр

С1у

Рго

Агд

01 у

Агд

РНе

165

170

175

Уа1

01 у

Зег

С1у

Рго

Агд

А1а

тНг

Агд

ьеи

РНе

Ьеи

01 у

180

185

190

11 е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

ьеи

Уа1

ТНг

А1а

ьеи

ТНг

ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

195

200

205

РГО

тНг

01 у

Агд

01 и

ТНг

Ьеи

Тгр

Агд

Мет

Тгр

суз

01 и

А1а

тНг

01 η

210

215

220

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

01 у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

зег

Агд

01 у

01 η

Рго

А1а

01 и

225

230

235

240

Азр

01 у

01 и

РНе

ьеи

Ьеи

ьеи

Зег

РГО

Уа1

01 η

А1 а

А1а

тНг

тгр

01 у

245

250

255

АЗП

туг

Туг

А1а

Ьеи

С1у

Азр

Зег

Туг

зег

Зег

С1у

Азр

01 у

А1а

Агд

260

265

270

Азр

туг

Туг

РГО

01 у

тНг

А1а

Уа1

ьуз

01 у

Суз

Тгр

Агд

зег

А1а

275

280

285

АЗП

А1а

Туг

РГО

01 и

ьеи

Уа1

А1а

01 и

А1а

Туг

АЗр

РНе

А1а

01 у

Нт 8

290

295

300

Ьеи

Зег

РНе

ьеи

А1а

Суз

Зег

01 у

01 η

Агд

01 у

Туг

А1а

мет

ьеи

Азр

305

310

315

320

А1а

Не

Азр

01 и

Уа1

01 у

Зег

01 η

ьеи

Азр

Тгр

АЗП

Зег

Рго

Н1 5

ТНг

325

330

335

Зег

Ьеи

Уа1

тНг

11е

01 у

11е

01 у

А5П

Азр

ьеи

01 у

РНе

зег

ТНг

340 345 350

- 87 014985

Уа1

Ьеи

Ьуг

ТЬг

Суз

МеТ

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Зег

ьуз

А1а

355

360

365

Суз

тЬг

Азр

61 η

61 и

Азр

А1а

11 е

Агд

Ьу5

Агд

мет

А1а

ьуэ

РНе

01 и

370

375

380

ТЬг

РЬе

61 и

Ьеи

11 е

Зег

61 и

Уа1

Агд

тЬг

Агд

А1а

РГО

Азр

385

390

395

400

А1а

Агд

Не

ьеи

Уа1

61 у

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

РГО

61 и

Рго

405

410

415

тНг

О1у

А1 а

туг

тЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

61 п

Агд

тгр

Ьеи

АЗП

420

425

430

С1и

тЬг

11е

61 η

61 и

рКе

Азп

61 п

Ьеи

А1а

61 и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

435

440

445

НТ 5

Азр

01 и

Не

А1а

Зег

61 у

Уа1

61 у

Зег

Уа!

61 и

РНе

450

455

460

Уа!

А5р

Уа!

Туг

Н1 5

А1а

ьеи

Азр

61у

Нт 3

01 и

11 е

61 у

Зег

Азр

61 и

465

470

475

480

РГО

Тгр

Уа1

Азп

01 у

Уа!

61 п

Ьеи

Агд

Азр

ьеи

А1а

тНг

01 у

Уа1

ТНг

485

490

495

Уа!

Азр

Агд

Зег

ТНг

РЬе

НТ 5

Рго

АЗП

А1а

61 у

НТ 5

Агд

А1а

Уа1

500

505

510

С1у

01 и

Агд

Уа1

11е

61 и

61 п

Не

61 и

тЬг

61 у

РГО

61 у

Агд

Рго

Ьеи

515

520

525

туг

А1 а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа!

Уа1

А1 а

61 у

А1 а

тНг

Уа!

Азр

ТЬг

ьеи

А1а

530 535 540

С1у С1и Уа1 С1у

545 <210>39 <211>3000 <212> ΟΝΑ <213> тИегтоЬт'-ртйа кизса <400>39 ддтддтдаас садаасассс ддТсдТсддс дтдддсдтсс аддтдсаддт дсаддТГсТТ60 саастдстсс адсаддаТдс сдссдгддсс дтдсасдатд дссТТдддса ддсстдтддт120 ссссдасдад Тасадсассс атадсддагд дТсдаасддс адсддддтда асгссадТТс180 сдсдссттсд сссдсддстт сдаастссдс ссаддасадд дтдтсддсда садддссдса240 дсссаддтас ддсаддасда сддГдТдстд саддсТдддс атдссдтсдс дсадддсгтт300

- 88 014985

дадсасдгса сддсддтсда адтссгтасс дссдтадсдд тадссдтсса сддссадсад	360
састгтсддт тсдатстдсд сдаассддтс даддасдстд сдсассссда адТсддддда	420
асаддасдас саддтсдсас сдатсдсддс дсаддсдадд аатдсддссд тсдсстсддс	480
датдттсддс аддтаддсса сдасссддтс дссддддссс ассссдаддс тдсддадддс	540
сдсадсдатс дсддсддгдс дддгссдсад ТТсгссссад дтссастсдд тсаасддссд	600
дадттсддас дсдтдссдда тсдссасддс тдатдддтса сддтсдсдда адатдтдстс	660
ддсдтадттд адддтддсдс сддддаасса дасддсдссд ддсаГддсдТ сддаддсдад	720
састдтддтд ТасддддТдд сддсдсдсас ссддтадтас тсссадатсд сддассадаа	780
тсстгсдадд гсддггассд ассадсдсса садтдсстсд Тадгссддтд сдтссасасс	840
дсддтдстсс сдсасссадс дддтдаасдс ддтдаддттд дсдсдттстт тдсдстсстс	900
дтсдддастс сасаддатсд дсддстдсдд сттдадтдтс атдааасдсд ассссгтсдт	960
ддасддТдсд датдсддтда дсдтсдддтд сстссссгаа сдстссссдд тдасддадтд	1020
ттдгдсасса сатстадсас дсдддасдсд дааассдтат ддадааааса сстасаассс	1080
сддссддасд дтдддтггсд дссасасгта ддддтсдддт дссгдсттдс сдддсадддс	1140
адТсссдддд тдсгдтддтд сдддсдддад ддстдтсдст тсдаддтдтд ссддсдддас	1200
астссдддсс гсадссдтас ссдсаасддд дасадттстс стсссттссд ддстддатдд	1260
тсссттсссс сдааатдсдд сдадатстсс садтсадссс ддаааасасс сдстдтдссс	1320
аддТасТсТТ ТдсТТсдаас адасаддссд дасддтссас дддддаддтт тдгдддсадс	1380
ддассасдтд сддсдассад асдасддттд гтссгсддта гссссдстст тдгасттдтд	1440
асадсдстса сдсгддТсТТ ддсгдТсссд асддддсдсд адасдстдтд дсдсатдтдд	1500
тдтдаддсса сссаддасТд дтдсстдддд дтдссддтсд астсссдсдд асадссгдсд	1560
даддасддсд адтттстдст дстттстссд дтссаддсад сдасстдддд даастаттас	1620
дсдстсдддд аТТсдТасгс ГТсдддддас ддддсссдсд асгастатсс сддсассдсд	1680
дтдаадддсд дттдстддсд дтссдсгаас дссгатссдд адстддтсдс сдаадссгас	1740
дасттсдссд дасасгтдгс дттсстддсс тдсадсддсс адсдсддсга сдссатдстт	1800
дасдстатсд асдаддТсдд сгсдсадстд дастддааст ссссГсасас дтсдстддтд	1860
асдаТсддда Тсддсддсаа сдаТсТдддд ТТсТссасдд ТТТТдаадас сТдсаТддТд	1920
сдддТдссдс тдстддасад сааддсдтдс асддассадд аддасдстат ссдсаадсдд	1980
атддсдааат Тсдадасдас дтттдаадад стсатсадсд аадтдсдсас ссдсдсдссд	2040
дасдсссдда Гссттдтсдт дддсгасссс сддаТТТГГс сддаддаасс дассддсдсс	2100
тастасасдс тдассдсдад саассадсдд гддсгсаасд ааассагтса ддадттсаас	2160
садсадсТсд ссдаддстдт сдсддтссас дасдаддада ттдссдсдтс дддсддддтд	2220
ддсадсдтдд адттсдтдда сдтстассас дсдттддасд дссасдадат сддсгсддас	2280
дадссдгддд Тдаасддддт дсадТТдсдд дасстсдсса ссддддтдас ТдТддассдс	2340

- 89 014985

адтассттсс	ассссаасдс	сдстдддсас	сдддсддтсд	дрдадсдддт	саТсдадсад	2400
аТсдааассд	дсссдддссд	тссдстстат	дссастттсд	сддтддтддс	дддддсдасс	2460
дТддасасТс	тсдсдддсда	ддтддддтда	сссддсттас	сдтссддссс	дсаддтстдс	2520
дадсастдсд	дсдатстддт	ссастдссса	дтдсадттсд	тсттсддтда	тдассадсдд	2580
сддддададс	сддатсдттд	адссдтдсдт	дтстттдасд	адсасасссс	дсТдсаддад	2640
ссдттсдсас	адттстсттс	сддтддссад	адтсдддтсд	асдтсдатсс	садсссасад	2700
дссдатдстд	сдддссдсда	ссасдссдтт	дссдассадт	ТддТсдаддс	дддсдсдсад	2760
сасдддддсд	адддсдсдда	сатддтссад	дтаадддссд	тсдсддасда	ддстсассас	2820
ддсадтдссд	ассдсдсадд	сдадддсдтт	дссдссдаад	дтдстдссдт	дсТддссддд	2880
дсддатсасд	тсдаадастт	ссдсдтсдсс	тассдссдсс	дссасдддса	ддатдссдсс	2940
дсссадсдст	ТТдссдааса	ддтадататс	ддсдТсдасТ	ссдстдтддт	сдсаддсссд	3000

<210> 40 <211> 372 <212> РКТ <213> тЬегтоЬтСтйа Сизса <400> 40

Уа1 61 у

Зег

б1у РГО 5

Агд

А1а

А1а тЬг

Агд Агд 10

Агд ьеи

РЬе

ьеи 15

61 у

11 е

Рго

А1а

ьеи

Уа1

ьеи

Уа1

тНг

А1а

Ьеи

тНг

Ьеи

Уа1

ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

рго

тЬг

61 у 35

Агд

С1и

тЬг

ьеи

тгр 40

Агд

мет

Тгр

Суз

61 и 45

А1а

тЬг

61 п

Азр

тгр 50

Суз

ьеи

С1у

Уа1

РГО 55

Уа1

Азр

зег

Агд

61 у 60

61 п

Рго

А1а

61 и

АЗр

С1у

61 и

РЬе

ьеи

зег

Рго

Уа1

61 п

А1а

тНг

тгр

61 у

65

70

75

80

АЗП

Туг

А1а

ьеи 85

61 у

Азр

Зег

Туг

Зег 90

Зег

61 у

Азр

61 у

А1а 95

Агд

Азр

туг

РГО

61 у

тЬг

А1а

Уа1

ьуз

61 у

суз

тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

Азп

А1а

туг

Рго

61 и

ьеи

Уа1

А1а

61 и

А1а

Туг

АЗр

РКе

А1а

61 у

НТЗ

115

120

125

ьеи

зег

РЬе

ьеи

А1а

суз

Зег

61 у

61 п

Агд

61 у

Туг

А1а

мет

ьеи

Азр

130

135

140

А1а

Не

Азр

61 и

Уа1

С1у

Зег

61 п

Ьеи

Азр

тгр

Азп

зег

РГО

Н1 8

тЬг

- 90 014985

145

150

155

160

Зег

ьеи

Уа1

тЬг

11 е

61 у

11 е

61 у

01 у

Азп

Азр

Ьеи

61 у

РЬе

Зег

тЬг

165

170

175

Уа1

ьеи

ьуз

тНг

Суз

мег

Уа!

Агд

уа!

РГО

Ьеи

ьеи

Азр

зег

ьуз

А1а

180

185

190

Суз

тЬг

А5р 195

61 η

61 и

Азр

А1а

11е 200

Агд

ьуз

Агд

мег

А1а 205

Ьуз

РЬе

61 и

тЬг

ТВ г

РЬе

61 и

Ьеи

11 е

Зег

61 и

Уа1

Агд

тЬг

Агд

А1а

рго

Азр

210

215

220

А1а

Агд

Не

Ьеи

Уа!

Уа1

61 у

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

Рго

61 и

Рго

225

230

235

240

тЬг

61 у

А1а

туг

Туг

ТВ г

Ьеи

тЬг

А1а

Зег

АЗП

61 п

Агд

Тгр

ьеи

Азп

245

250

255

61 и

тЬг

Не

61 η

01 и

РЬе

Азп

61 п

01 п

Ьеи

А1а

61 и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

260

265

270

НТЗ

Азр

61 и

11 е

А1а

Зег

61 у

Уа1

61 у

5ег

Уа1

61 и

РЬе

275

280

285

Уа1

Азр

Уа!

туг

Нт 5

А1а

Ьеи

Азр

61 у

Н15

61 и

Не

61 у

Зег

Азр

61 и

290

295

300

РГО

Тгр

Уа1

АЗП

61 у

Уа!

61п

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТВ г

61 у

Уа!

тЬг

305

310

315

320

Уа1

А5р

Агд

Зег

тЬг

РЬе

Н15

РГО

Азп

А1а

61 у

Нтз

Агд

А1а

Уа1

325

330

335

61 у

61 и

Агд

Уа1

Не

61 и

61 п

Не

61 и

тЬг

61 у

Рго

61 у

Агд

Рго

ьеи

340

345

350

Туг

А1а

тЬг

РЬе

А1а

Уа!

А1а

С1у

А1а

ТЬг

Уа!

Азр

ТЬг

ьеи

А1а

355 360 365 у 61 и Уа1 61 у

370 <210>41 <211>300 <212> РКТ <213> СогупеЬасгегтиш еТТтстепэ <400>41 мег Агд тЬг тЬг Уа1 11е А1а А1а Зег А1а ьеи ьеи ьеи ьеи А1а 01у

1015

- 91 014985

суз

А1а

Азр

б1у

А1а

Агд

61 и

тНг

А1а

61 у

А1а

Рго

61 у

61 и

20

25

30

Бег

С1у

61 у

11е

Агд

61 и

61 у

А1а

61 и

А1 а

Бег

тНг

Бег

11е

35

40

45

тНг

Азр

Уа1

Туг

11е

А1а

ьеи

61 у

Азр

Бег

Туг

А1а

ме!

61 у

50

55

60

Агд

Азр

61 η

Рго

ьеи

Агд

61 у

61 и

РГО

РНе

Суз

ьеи

Агд

Бег

61 у

65

70

75

80

АЗП

Туг

Рго

61 и

ьеи

нтз

А1а

61 и

Уа1

ТНг

Азр

ьеи

тНг

Суз

61 п

85

90

95

С1у

А1а

Уа1

тНг

61 у

Азр

Ьеи

61 и

РГО

Агд

тНг

ьеи

61 у

61 и

Агд

100

105

110

ТНг

Ьеи

Рго

А1а

61 η

Уа1

Азр

А1 а

Ьеи

тНг

61 и

Азр

тНг

ТНг

Ьеи

Уа1

115

120

125

ТНг

Ьеи

Бег

11 е

61 у

б1у

Азп

Азр

ьеи

б!у

РНе

61 у

61 и

Уа1

А1а

61 у

130

135

140

Суз

11 е

Агд

61 и

Агд

11е

А1а

61 у

61 и

Азп

А1а

Азр

Суз

Уа1

Азр

145

150

155

160

Ьеи

61 у

61 и

ТНг

11е

61 у

61 и

61 п

ьеи

Азр

61 п

Ьеи

Рго

РГО

61 п

165

170

175

ьеи

Азр

Агд

Уа1

нтз

61 и

А1а

11 е

Агд

Азр

Агд

А1а

61 у

Азр

А1а

61 п

180

185

190

Уа1

ТНг

61 у

Туг

ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

Бег

А1а

61 у

Азр

Суз

Рго

195

200

205

61 и

ьеи

61 у

Азр

Уа1

Бег

61 и

А1 а

Азр

Агд

тгр

А1а

Уа1

61 и

ьеи

210

215

220

тНг

С1у

61 η

11е

Азп

61 и

ТНг

Уа1

Агд

61 и

А1а

61 и

Агд

нт з

Азр

225

230

235

240

А1а

ьеи

РНе

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

А1а

Азр

61 и

Нтз

тНг

Бег

Суз

А1а

245

250

255

РГО

Рго

61 η

Агд

тгр

А1а

Азр

11 е

61 п

61 у

61 п

тНг

Азр

А1а

260

265

270

Туг

РГО

Ьеи

Нт з

Рго

тНг

Бег

А1а

61 у

Нт 5

61 и

А1 а

ме!

А1а

275 280 285

- 92 014985

Уа1 Агд Азр А1а Ьеи 61 у ьеи 61 и Рго \/а1 61 η Рго 290 295300 <210>42 <211>3000 <212> ϋΝΑ <213> СогупеЬас!ег1ит еТЕтстепз <400> 42

!!с!дддд!д	!Га!дддд!!	д!!а!сддс!	сд!сс!ддд!	ддагсссдсс	аддгддддга	60
«сасддддд	асГ!!!д!д!	ссаасадссд	адаагдадтд	сссгдадсдд	!дддаа!дад	120
дгдддсдддд	с!д!д!сдсс	агдадддддс	ддсдддсГс!	д!дд!дсссс	дсдасссссд	180
дссссдд!да	дсдд!даа!д	ааагссддс!	дгаагсадса	гсссдгдссс	ассссдгсдд	240
ддаддгсадс	дсссддад!д	!с!асдсад!	сдда!сс!с!	сддас!сддс	са!дс!д!сд	300
дсадса!сдс	дсгсссддд!	с!!ддсд!сс	с!сддс!д!!	с!дсс!дс!д	гсссгддаад	360
дсдааагда!	сассддддад	!да!асассд	д!ддгс!саг	сссдда!дсс	сасггсддсд	420
ссаиссддса	а!!сдддсад	с!ссддд!дд	аад!адд!дд	сагссдагдс	д!сдд!дасд	480
сса!ад!ддд	сдаада!с!с	а!сс!дс!сд	аддд!дс!са	ддссас!с!с	сдда!сда!а	540
гсдддддсд!	ссмдагддс	д!сс!!дс!д	ааассдадд!	дсадс!!д!д	ддсггссаа!	600
исдсассас	ддадсдддас	даддсгддаа	гдасддссда	ададсссдгд	д!ддасс!са	660
асдааддгдд	д!ад!сссд!	д!са!са!!д	аддаасасдс	сс!ссассдс	асссадс!!д	720
Гддссддад!	!д!сд!аддс	дс!ддса!сс	адаадддааа	сда!сгса!а	!!!д!сдд!д	780
!дс!садаса	!да!с!!сс!	«дс!д!сдд	!д!с!дд!ас	!ассасдд!а	дддсгдаагд	840
саас!д!!а!	!!!!С!д!!а	!!!!аддаа!	!дд!сса!а!	сссасаддс!	ддс!д!дд!с	900
ааа!сд!са!	саад!аа!сс	с!д!сасаса	ааа!ддд!дд	Гдддадссс!	ддисдсдд!!	960
ссдтдддадд	сдссд!дссс	сдсаддагсд	!сддса!сдд	сдда!с!ддс	сддгассссд	1020
сддгдаагаа	аа!са!!с!д	!аасс!!са!	сасдд!!дд!	!!!адд!а!с	сдсссс!!!с	1080
дгссгдассс	сдиссссддс	дсдсдддадс	ссдсдддид	сдд!адасад	дддадасд!д	1140
дасассагда	ддасаасдд!	сагсдсадса	адсдсаггас	!сс!!с!сдс	сдда!дсдсд	1200
дагддддссс	дддаддадас	сдссдд!дса	ссдссдддгд	ад!сс!ссдд	дддсагссдд	1260
даддаддддд	сддаддсд!с	дасаадсагс	ассдасд!с!	асатсдссс!	сддддатсс	1320
гагдсддсда	гдддсдддсд	ддагсадссд	«асддддЬд	адссд!!с!д	сс!дсдс!сд	1380
!ссдд!аа!!	асссддаасг	ссиссасдса	даддгсассд	агсгсассгд	ссадддддсд	1440
дгдассдддд	а!с!дс!сда	асссаддасд	сгдддддадс	дсасдс!дсс	ддсдсаддгд	1500
да!дсдс!да	сддаддасас	сассс!дд!с	ассс!с!сса	Ссдддддсаа	!дасс!сдда	1560
ΐ-ьсддддадд	!ддсддда!д	са!ссдддаа	сддаисдссд	дддадаасдс	!да!да!!дс	1620
д!ддасс!дс	Гдддддааас	сахсддддад	садс!сда!с	адсггссссс	дсадсгддас	1680

- 93 014985

сдсдЬдсасд	аддстатссд	ддассдсдсс	ддддасдсдс	аддттдтддт	сассддттас	1740
стдссдстсд	тдтстдссдд	ддастдсссс	даастддддд	атдтстссда	ддсддатсдт	1800
сдгтдддсдд	ттдадстдас	сдддсадатс	аасдадассд	Тдсдсдаддс	ддссдаасда	1860
сасдатдссс	гстттдтсст	дсссдасдат	дссдатдадс	асассадттд	тдсассссса	1920
садсадсдст	дддсддатат	ссадддссаа	садассдатд	сстатссдст	дсасссдасс	1980
Тссдссддсс	атдаддсдат	ддссдссдсс	дтссдддасд	сдсТдддссТ	ддаассддтс	2040
садссдтадс	дссдддсдсд	сдсттдгсда	сдассаассс	атдссаддст	дсадтсасат	2100
ссдсасагад	сдсдсдсддд	сдаТддадТа	сдсассаТад	аддаГдадсс	сдаТдссдас	2160
датдатдадс	адсасастдс	сдаадддТТд	ТТссссдадд	дтдсдсадад	ссдадтссад	2220
асстдсддсс	гдстссддат	сатдддссса	ассддсдатд	асдатсааса	сссссаддат	2280
сссдааддсд	атассасддд	сдасатаасс	ддстдттссд	дтдатдатда	тсдсддтссс	2340
дасстдссст	дассссдсас	ссдсстссад	агсстсссдд	ааагсссддд	тддссссстт	2400
ссададдттд	тадасасссд	сссссадтас	сассадсссд	дсдассасаа	ссадсассас	2460
ассссадддт	гдддатадда	сддтддсддг	дасатсддрд	дсддтстссс	сатсддаддт	2520
дстдссдссс	сдддсдаадд	тддаддтддт	сассдссадд	дадаадгада	ссагддссат	2580
дассдссссс	ттддсссттт	ссттдаддгс	сгсдсссдсс	адсадстддс	тсааттдсса	2640
дадтсссадд	дссдссаддд	сдатдасддс	аасссасадд	аддаастдсс	сасссддадс	2700
стссдсдатд	дгддссаддд	сасстдаатт	сдаддсстса	Гсасссдаас	сдссддатсс	2760
адтддсдагд	сдсассдсда	тссасссдаг	даддатдгдс	адтатдссса	ддасааГдаа	2820
ассасстстд	дссадддтдд	тсадсдсддд	дтддгсстсд	дссгддгсдд	садсссдттс	2880
датсдтссдт	гтсдсддагс	тддтдтсдсс	стьатссата	дстсссаттд	аассдссттд	2940
аддддтдддс	ддссастдтс	адддсддагт	дрдаТсТдаа	стдтдатдтт	ссаТсаассс	3000

<210> 43 <211> 268 <212> РИТ <213> ЗТгерТотусез сое1тсо1ог <400> 43

мет

Агд

РЬе

Агд

Ьеи

Уа1

61 у

РЬе

ьеи

Зег

ьеи

Уа1

ьеи

А1а

1

5

10

15

А1а

61 у

А1а

Ьеи

тЬг

61 у

А1а

тЬг

А1а

61 η

А1а

61 η

Рго

20

25

30

А1а

Азр

61 у

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

61 у

Азр

Зег

туг

Зег

61 у

35

40

45

Уа1

61 у

А1а

61 у

Зег

туг

11 е

Зег

61 у

Азр

Суз

ьуз

Агд

Зег

50

55

60

- 94 014985

тЬг ьуз А1а 65

Нтз Рго Туг 70

ьеи тгр А1а А1а

А1а 75

НТ 5

Зег

Рго

Зег

ТЬг 80

РЬе

Азр

РЬе

ТНг

А1а

суз

зег

61у

А1а

Агд

ТЬг

б!у

Азр

Уа!

Ьеи

зег

85

90

95

61 у

61 η

ьеи

61 у

Рго

Ьеи

Зег

61 у

ТЬг

61 у

ьеи

Уа1

Зег

11 е

Зег

100

105

110

11е

бТу

61 у

Азп

Азр

А1а

61 у

РЬе

А1а

Азр

ТЬг

Μθΐ

ТЬг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

61 η

Зег

61 и

зег

суз

ьеи

зег

Агд

11 е

А1а

тЬг

А1а

61 и

А1а

130

135

140

туг

Уа1

Азр

Зег

ТЬг

ьеи

Рго

61 у

ьуз

Ьеи

Азр

61 у

Уа1

Туг

Зег

А1а

145

150

155

160

11 е

Зег

Азр

ьуз

А1а

РГО

АЗП

А1а

НТ 3

Уа1

Не

61 у

туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

61 у

ТЬг

Суз

Не

61 у

Ьеи

Зег

61 и

ТЬг

Ьуз

180

185

190

Агд

ТЬг

А1а

Не

Азп

ьуз

А1а

Зег

Азр

НТЗ

Ьеи

Азп

тЬг

Уа!

ьеи

А1а

195

200

205

61 η

Агд

А1а

НТ 5

61у

РЬе

тЬг

РЬе

61 у

АЗр

Уа1

Агд

тЬг

ТЬг

210

215

220

РЬе

ТЬг

61 у

НТ 5

61 и

ьеи

Суз

зег

61 у

Зег

Рго

тгр

ьеи

нтз

Зег

Уа1

225

230

235

240

АЗП

Тгр

ьеи

АЗП

11 е

61 у

61 и

Зег

Туг

НТ 5

Рго

тЬг

А1а

А1 а

61 у

61 п

245

250

255

Зег

61у 61у

Туг

ьеи

РГО

Уа1

Ьеи

Азп

61у

А1а

260 265 <210>44 <211> 2000 <212> ϋΝΑ <213> 51гер1отусез сое!тсо1ог <400>44 сссддсддсс сдгдсаддад садсадссдд сссдсдагдг ссгсдддсдг сдгсггсагс60 аддссдгсса 1сдсд1сддс дассддсдсс дгдгадггдд сссддассгс дгсссаддгд120 сссдсддсда гсгддсдддг ддгдсддгдс дддссдсдсс даддддадас дгассадаад180 ссса1сд1са сд«с1ссдд с1дсдд11сд ддсгсдгссд ссдсгссдгс сд1сдсс1сд240 ссдадсассг 1с1сддсдад дЬсддсдсТд дгсдссдгса ссдхдасдсс ддсдссссдд300

- 95 014985

стссадсдсд	адатсадсад	сдтссадссд	тсдсссгссд	ссадсдтсдс	дсТдсддгсд	360
гсдТсдсддд	сдатссдсад	сасдсдсдсд	ссдддсддса	дсадсдтддс	дссддассдт	420
асдсддтсда	тдттсдссдс	дтдсдадтас	ддстдстсас	ссдтддсдаа	асддссдадд	480
аасадсдсдт	сдасдасдтс	ддасддддад	тсдстдгсдт	ссасдттдад	ссддатсддс	540
адддсттсдт	дсдддттсас	ддасатдтсд	ссатдатсдд	дсасссддсс	дссдсдгдса	600
сссдстттсс	сдддсасдса	сдасаддддс	тттстсдссд	ТсТТссдТсс	даасТТдаас	660
дадтдтсадс	сатттсттдд	сатддасаст	тссадтсаас	дсдсдтадст	дстассасдд	720
ТТдТддсадс	аатсстдста	адддаддттс	сатдадасдт	ттссдасттд	тсддсттсст	780
дадттсдстс	дтссгсдссд	ссддсдссдс	сстсассддд	дсадсдассд	сссаддсддс	840
ссаасссдсс	дссдссдасд	дстатдтддс	ссгсддсдас	тсстастсст	ссддддтсдд	900
адсдддсадс	Тасагсадст	сдадсддсда	стдсаадсдс	адсасдаадд	сссатссста	960
ссгдтдддсд	дссдсссаст	сдсссгссас	дттсдастгс	ассдсстдтт	ссддсдсссд	1020
тасдддтдаг	дттстстссд	дасадстсдд	сссдсгсадс	тссддсассд	дсстсдтстс	1080
датсадсатс	ддсддсаасд	асдссддттт	сдссдасасс	атдасдасст	дтдгдсгсса	1140
дтссдададс	тсстдсстдт	сдсддатсдс	сассдссдад	дсдтасдтсд	астсдасдст	1200
дсссддсаад	стсдасддсд	тстастсддс	аатсадсдас	ааддсдссда	асдсссасдт	1260
сдтсдтсатс	ддсТасссдс	дсттстасаа	дстсддсасс	асстдсатсд	дсстдтссда	1320
дассаадсдд	асддсдатса	асааддсстс	сдассассТс	аасассдтсс	гсдсссадсд	1380
сдссдссдсс	сасддсттса	ссТТсддсда	сдтасдсасс	ассттсассд	дссасдадст	1440
дтдстссддс	адсссстддс	Тдсасадсдт	саастддстд	аасатсддсд	адтсдтасса	1500
ГГГГ^СГГСГУ	ЛГГПЛГГЗЛ-(·	лллл+-ллл^-а	ЛЛ+-ЛЛЛЛЛ1-Л	г+таэ ΓΉ/ΊΓΤ1	Г Г ГУ Г Л1-ЛЯГГ 4..-4,4.4. 4.4,44 4.4.	1560
44-44-44343		'-ЭИ'-	— ч. -₃44₃₃ ^4.
тсаддсддаа	ддадаадаад	ааддадсдда	дддадасдад	дадтдддадд	ссссдсссда	1620
сддддтсссс	дтссссдтст	ссдтстссдт	сссддтсссд	саадтсассд	адаасдссас	1680
сдсдтсддас	дтддсссдса	ссддастссд	сасстссасд	сдсасддсас	тстсдаасдс	1740
дссддтдгсд	тсдтдсдтсд	Тсассассас	дссдтсстдд	сдсдадсдст	сдссдсссда	1800
сдддааддас	адсдтссдсс	ассссддаТс	ддадассдас	ссдтссдсдд	Тсасссассд	1860
дтадссдасс	тссдсдддса	дссдсссдас	сдтдаасдТс	дссдтдаасд	сдддтдсссд	1920
дтсдтдсддс	ддсддасадд	сссссдадТа	дтдддтдсдс	дадсссасса	сддтсассгс	1980
сассдасТдс	дстдсддддс					2000

<210>45 <211>269 <212> РЯТ <213> БТгерТотусез ауегппТтНз <400>45 мег Агд Агд Бег Агд 11е ТЬг А1а Туг Уа1 ТНг Бег ьеи ьеи Ьеи А1а 15 1015

- 96 014985

Уа1

01 у

Суз А1а 20

ьеи

тНг

01 у

А1а

А1а тНг А1а 61 п А1а Зег

РГО

А1а

25

30

А1а

тНг

61 у

туг

Уа1

А1а

Ьеи

61у

А5р

зег

Туг

Зег

О1у

35

40

45

Уа1

01 у

А1а

61 у

Зег

туг

ьеи

Зег

61 у

Аэр

Суз

ьуз

Агд

Зег

50

55

60

Зег

ьуэ

А1а

туг

РГО

туг

ьеи

тгр

01 п

А1а

НТ 5

зег

РГО

Зег

зег

65

70

75

80

РНе

5ег

РНе

Мес

А1а

суз

Зег

61 у

А1а

Агд

ТНг

61 у

Азр

Уа1

ьеи

А1а

85

90

95

Азп

61 п

ьеи

О1у

тНг

Ьеи

АЗП

зег

Зег

тНг

01 у

Ьеи

Уа1

зег

Ьеи

тНг

100

105

110

11 е

61 у

А8П

Азр

А1а

61 у

РНе

зег

Азр

Уа1

мес

тНг

Суз

Уа1

115

120

125

ьеи

61 п

Зег

Азр

Зег

А1а

Суз

ьеи

зег

Агд

11е

Азп

ТНг

А1а

Ьуз

А1а

130

135

140

Туг

Уа1

Азр

Зег

ТНг

Ьеи

РГО

01у

01 п

ьеи

Азр

зег

Уа1

Туг

ТНг

А1а

145

150

155

160

11е

зег

тНг

ьуз

А1а

Рго

Зег

А1а

НТ 5

уа!

А1а

Уа1

ьеи

61 у

Туг

РГО

165

170

175

Агд

РНе

туг

ьуз

Ьеи

61 у

Зег

Суз

Ьеи

А1а

01 у

ьеи

зег

61 и

тНг

180

185

190

ьуз

Агд

зег

А1а

11 е

АЗП

Азр

А1а

Азр

Туг

ьеи

АЗП

Зег

А1а

11е

195

200

205

А1а

ьуз

Агд

А1а

Азр

Нт 5

О1у

РНе

тНг

РНе

О1у

Азр

Уа1

ьуз

зег

210

215

220

ТНг

РНе

тНг

61 у

Η1 5

61 и

11е

Суз

зег

Зег

ТНг

Тгр

ьеи

НТ 8

зег

225

230

235

240

ьеи

Азр

ьеи

Азп

11 е

61 у

61 п

5ег

туг

Нтз

Рго

тНг

А1а

А1 а

61 у

245

250

255

61 п

Зег

О1у

61 у

туг

Ьеи

Рго

Уа1

мес

АЗП

зег

Уа1

А1а

260 265 <210> 46 <211> 1980

- 97 014985 <212> ϋΝΑ <213> Зкгеркотусез ауегт1кт'1т5 <400> 46

ссассдссдд	дксддсддсд	адксксскдд	ссксддксдс	ддададдккд	дссдкдкадс	60
сдкксадсдс	ддсдссдаас	дкскксккса	ссдкдссдсс	дкасксдккд	аксаддссск	120
кдсссккдск	сдасдсддсс	ккдаадссдд	кдсссккскк	дадсдкдасд	акдкадскдс	180
ссккдаксдс	ддкдддддад	ссддсддсда	дсассдкдсс	сксддссддд	дкддсскддд	240
сдддсадкдс	ддкдаакссд	сссасдаддд	сдссддксдс	сасддсддкк	аксдсддсда	300
кссддакскк	сккдскасдс	адскдкдсса	касдадддад	кссксскскд	ддсадсддсд	360
сдсскдддкд	дддсдсасдд	скдкдддддд	кдсдсдсдкс	аксасдсаса	сддссскдда	420
дсдксдкдкк	ссдссскддд	ккдадкааад	ссксддссак	скасдддддк	ддсксааддд	480
адккдадасс	скдксакдад	кскдасакда	дсасдсаакс	аасддддссд	кдадсасссс	540
ддддсдассс	сддааадкдс	сдадаадкск	кддсакддас	аскксскдкс	аасасдсдка	600
дскддкасда	сддккасддс	ададаксскд	скааадддад	дккссакдад	асдкксссда	660
аккасддсак	асдкдасскс	аскссксскс	дссдксддск	дсдсссксас	сддддсадсд	720
асддсдсадд	сдкссссадс	сдссдсддсс	асдддскакд	кддсссксдд	сдасксдкас	780
ксдкссддкд	ксддсдссдд	садскасскс	адскссадсд	дсдаскдсаа	дсдсадкксд	840
ааддсскакс	сдкасскскд	дсаддссдсд	сакксассск	сдксдкксад	ккксакддск	900
кдсксдддсд	сксдкасддд	кдакдксскд	дссааксадс	ксддсассск	даасксдксс	960
ассддсскдд	ксксссксас	саксддаддс	аасдасдсдд	дсккскссда	сдксакдасд	1020
асскдкдкдс	кссадкссда	садсдсскдс	сксксссдса	ксаасасддс	дааддсдкас	1080
дксдасксса	ссскдсссдд	ссаасксдас	адсдкдкаса	сддсдаксад	сасдааддсс	1140
ссдксддссс	акдкддссдк	дскдддскас	ссссдсккск	асаааскддд	сддсксскдс	1200
сксдсдддсс	ксксддадас	саадсддксс	дссаксаасд	асдсддссда	скакскдаас	1260
адсдссаксд	ссаадсдсдс	сдссдассас	ддскксасск	ксддсдасдк	саададсасс	1320
кксассддсс	акдадакскд	скссадсадс	асскддскдс	асадксксда	сскдскдаас	1380
аксддссадк	сскассассс	дассдсддсс	ддссадкссд	дсддскакск	дссддксакд	1440
аасадсдкдд	сскдадсксс	сасддсскда	акккккаадд	сскдаакккк	кааддсдаад	1500
дкдаассдда	адсддаддсс	ссдкссдксд	дддкскссдк	сдсасаддкс	ассдадаасд	1560
дсасддадкк	ддасдксдкд	сдсассдддк	сдсдсасскс	дасддсдакс	ксдкксдада	1620
ксдккссдск	сдкдксдкас	дкддкдасда	асасскдскк	скдскдддкс	кккссдссдс	1680
ксдссдддаа	ддасадсдкс	ккссадсссд	дакссдддас	сксдсссккс	ккддксассс	1740
адсддкаскс	сассксдасс	ддсасссддс	ссассдкдаа	ддксдссдкд	аасдкдддсд	1800
сскдддсддк	дддсддсддд	саддсассдд	адкадксддк	дкдсасдссд	дкдассдкса	1860
сскксасдда	скдддссддс	ддддксдксд	кассдссдсс	дссассдссд	ссксссддад	1920

- 98 014985 тддадсссда дстдтддтсд сссссдссдт сддсдттдтс дтсстсдддд дттттсдаас 1980 <210> 47 <211> 372 <212> РКТ <213> тНегтоЫЕтБа -ризса <400> 47

мет

61 у

Зег

61 у

Рго

Агд

А1а

тНг

Агд

теи

РНе

Ьеи

61 у

1

5

10

15

11е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

ьеи

Уа1

тНг

А1а

Ьеи

тНг

Ьеи

Уа1

ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

РГО

тНг

61 у

Агд

61 и

ТНг

ьеи

тгр

Агд

мет

тгр

Суз

61 и

А1 а

тНг

61 η

35

40

45

Азр

тгр

Суз

Ьеи

61 у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

Зег

Агд

61 у

61 η

РГО

А1а

61 и

50

55

60

Азр

61 у

61 и

РНе

ьеи

Зег

РГО

Уа1

61 η

А1а

тНг

тгр

61 у

65

70

75

80

А5П

Туг

туг

А1а

ьеи 85

С1у Азр Зег

туг зег зег О1у 90

Азр

61 у

А1а 95

Агд

Азр

туг

Рго

61 у

ТНг

А1а

Уа1

ЬУ5

61 у 01 у

суз

тгр

Агд

зег

А1а

100

105

110

АЗП

А1а

Туг

Рго

01 и

Ьеи

Уа1

А1а

01 и

А1а

Туг

АЗр

РНе

А1а

01 у

Н1 5

115

120

125

1_еи

зег

РНе

ьеи

А1а

суз

Зег

61 у

61 η

Агд

61 у

Туг

А1а

мет

теи

Азр

130

135

140

А1а

11е

Азр

61 и

Уа1

61 у

Зег

61 η

ьеи

Азр

тгр

АЗП

зег

РГО

Н1 5

тНг

145

150

155

160

Зег

ьеи

Уа1

тНг

11е

01 у

11 е

61 у

А5П

Аэр

Ьеи

61 у

РНе

Зег

ТНг

165

170

175

Уа1

Теи

туз

тНг

Суз

Мет

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Теи

Азр

Зег

туз

А1а

180

185

190

суз

ТНг

Азр

01 η

61 и

Азр

А1а

11е

Агд

ьуз

Агд

мет

А1а

туз

РНе

61 и

195

200

205

тНг

РНе

01 и

61 и

Ьеи

11е

Зег

61 и

уа!

Агд

тНг

Агд

А1а

РГО

Азр

210

215

220

А1а

Агд

11е

Ьеи

Уа1

61 у

туг

РГО

Агд

11 е

РНе

РГО

01 и

РГО

225 230 235 240

- 99 014985

тНг

61 у

А1а

Туг

туг

тНг

Беи

тНг

А1а

Бег

АЗП

61 η

Агд

тгр

Беи

АЗП

245

250

255

61 и

тНг

11е

61 η

61 и

РНе

А5П

61 η

Беи

А1а

61 и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

260

265

270

НТ 5

А5р

61 и

11 е

А1а

А1 а

Бег

61 у

Уа1

61 у

Бег

Уа1

61 и

РЬе

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

Туг

НТ 8

А1а

Беи

Азр

61 у

НТ 5

61 и

11е

61 у

Бег

Азр

61 и

290

295

300

РГО

тгр

Уа1

АЗП

61 у

Уа1

61 η

Беи

Агд

Азр

Беи

А1а

тЬг

61 у

Уа1

тЬг

305

310

315

320

Уа1

Азр

Агд

Бег

тЬг

РЬе

Нт 8

Рго

АЗП

А1а

61 у

Нт 8

Агд

А1а

Уа1

325

330

335

61 у

61 и

Агд

Уа1

11е

61 и

61 η

11 е

61 и

ТНг

61 у

Рго

61 у

Агд

Рго

Беи

340

345

350

туг

А1а

ТНг

РЬе

А1а

Уа1

А1а

61 у

А1а

тНг

Уа1

Азр

ТНг

Беи

А1а

355

360

365

у 61 и Уа1 61 у

370 <210> 48 <211> 968 <212> ϋΝΑ <213> тИегшоЫ'Ртйа Еизса <400> 48

сБдсадасас	ссдссссдсс	ББсБсссдда	БсдБсаБдББ	сддсдасБсс	сБсадсдаса	60
ссддсаадаБ	дБасБссаад	аБдсдсддсБ	ассБдссдБс	сБссссдссд	БасБасдадд	120
дссдсББсБс	даасддсссд	дБсБддсБдд	адсадсБдас	даадсадББс	сссддссБда	180
сдаБсдссаа	сдаддссдад	дддддсдсда	ссдсадБсдс	сБасаасаад	аБсБссБдда	240
асссдаадБа	ссаддБсаББ	аасаассБсд	асБасдаддБ	сасссадББс	ББдсадаадд	300
асБсдББсаа	дсссдасдас	сБддБсаБсс	БдБдддБддд	сдссаасдас	БассБддссБ	360
асддББддаа	сасддадсад	дасдссаадс	дддБдсдсда	сдссаБсБсд	дасдсддсаа	420
ассдсаБддБ	ссБдаасддс	дсдаадсада	БссБдсБдББ	саассБдссс	дассБдддсс	480
адаасссдБс	сдсссдсБсс	садааддБсд	БсдаддссдБ	сБсдсасдБд	БссдссБасс	540
асаасаадсБ	дсБссБсаас	сБсдсссддс	адсБсдсссс	дасдддсаБд	дБсаадсБдБ	600
БсдадаБсда	саадсадББс	дсддадагдс	Бдсдсдассс	ссадаасББс	ддссБдадсд	660
асдБддадаа	сссдБдсБас	дасддсддсБ	асдБдБддаа	дссдББсдсс	асссддБссд	720

- 100 014985 тстсдассда ссддсадстд тсддссттст сдссссадда дсдсстддсд атсдстддса 780 асссдстсст ддсасаддсд дТадсТТсдс сдаТддсссд ссдстсддсс тсдсссстса 840 астдсдаддд саадатдттс тдддассадд тссассссас сассдтддтс сасдссдссс 900 тстсддадсд сдссдссасс ттсатсдада сссадтасда дттсстсдсс састадтста 960 даддатсс 968 <210> 49 <211> 232 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> структурная модель полследовательности для гомологичного картирования <400> 49

Ткг

ткг

Уа1

туг

ьеи

А1а

61 у

Азр

зег

Ткг

мет

А1а

ьуз

АЗП

61 у

1

5

10

15

61 у

Зег

61 у

Ткг

АЗП

61 у

тгр

61 у

61 и

Туг

ьеи

А1а

зег

Туг

ьеи

Зег

20

25

30

А1а

ткг

Уа1

Азп

Азр

А1а

Уа1

А1а

61 у

Агд

зег

А1а

Агд

зег

туг

35

40

45

Ткг

Агд

61 и

С1у

Агд

Рке

61 и

Азп

Не

А1а

АЗр

Уа1

ткг

А1а

61 у

50

55

60

А5р

Туг

Уа1

Не

Уа1

61 и

рке

61 у

ΗΪ5

Азп

АЗр

61 у

Зег

ьеи

зег

65

70

75

80

Ткг

Азр

Азп

61 у

Агд

Ткг

Азр

Суз

Зег

61 у

Ткг

61 у

А1а

61 и

Уа1

Суз

85

90

95

Туг

зег

Уа1

Туг

Азр

61 у

Уа1

АЗП

61 и

ткг

11е

ьеи

ткг

Рке

рго

А1а

100

105

110

Туг

ьеи

01 и

А5П

А1а

ьуз

ьеи

Рке

ткг

А1а

ьуз

61 у

А1а

ьуз

Уа1

115

120

125

11 е

ьеи

Зег

61 п

ткг

РГО

АЗП

Рго

Тгр

61 и

Ткг

61 у

ткг

Рке

130

135

140

Уа1

А5П

Зег

Рго

Ткг

Агд

Рке

Уа1

61 и

Туг

А1а

61 и

ьеи

А1а

61 и

145

150

155

160

Уа1

А1 а

61 у

Уа1

61 и

туг

Уа1

Азр

Н1 5

Тгр

Зег

туг

Уа1

Азр

зег

Не

165

170

175

Туг

61 и

ткг

ьеи

01 у

А5П

А1а

ткг

Уа1

АЗП

Зег

туг

Рке

Рго

11 е

Азр

180

185

190

- 101 014985

тНг

Ηί 5

ТНг

Бег

Рго

А1а

61 у

А1а

61 и

Уа1

А1а

61 и

А1а

РНе

195

200

205

ьуз

А1а

Уа1

суэ

ТНг

б1у

тНг

Бег

ьеи

ьуз

Бег

Уа1

Ьеи

тНг

210

215

220

тНг

Бег

РЬе

61 и

61 у

тНг

Суз

225 230 <210> 50 <211> 184 <212> РКГ <213> Искусственная <220>

<223> структрная модель для гомологичного картирования <400> 50

А1а

Азр

ТНг

Ьеи

11 е

Ьеи

61у

АЗр

Бег

ьеи

Бег

А1а

61у

Туг

Агд

1

5

10

15

ме!

Бег

А1а

Бег

А1а

тгр

Рго

А1а

ьеи

Ьеи

А5П

Азр

Ьуз

тгр

61 п

20

25

30

Бег

Ьуз

тЬг

Бег

Уа1

Азп

А1а

Бег

Не

Бег

61 у

Азр

ТЬг

Бег

61 п

35

40

45

61 η

61 у

ьеи

А1а

Агд

Ьеи

РГО

А1а

ьеи

Ьеи

ьуз

61 п

Нтз

61 п

РГО

Агд

50

55

60

Тгр

Уа1

ьеи

Уа1

61 и

ьеи

61 у

Азп

Азр

61 у

ьеи

Агд

61 у

РНе

61 п

65

70

75

80

Рго

61 η

ТНг

61 и

61 п

ТНг

ьеи

Агд

61 п

Не

Ьеи

61 п

Азр

7а1

Ьуз

85

90

95

А1а

Азп

А1а

61 и

РГО

ьеи

Ме!

61 п

Не

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Азп

100

105

110

туг

61 у

Агд

туг

Азп

61 и

А1а

РЬе

Бег

А1а

Не

Туг

Рго

ьуз

Ьеи

115

120

125

А1а

ьуз

61 и

РЬе

Азр

Уа1

РГО

Ьеи

Рго

РЬе

ме!

61 и

Уа1

130

135

140

туг

Ьеи

ьуз

РГО

61 п

Тгр

ме!

61 п

Азр

Аэр

61 у

Не

нтз

Рго

АЗП

Агд

145

150

155

160

Азр

А1а

61 п

Рго

р|те

11е

А1а

Азр

тгр

ме!

А1а

ьуз

61 п

Ьеи

61 п

Рго

165

170

175

ьеи

Уа1

АЗП

Н1 3

АЗр

Бег

ьеи

61 и

- 102 014985

180 <210> 51 <211> 225 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> консеснуя последовательность <400> 51

мет

Агд

зег

Агд Р(те Ьеи

А1а

ьеи

11е

Ьеи

ьеи

тНг

ьеи

А1а

1

5

10

15

А1а

ьеи

61 у

А1а

А1а А1а Агд

А1а

Рго

А1а

Туг

Уа1

А1а

ьеи

20

25

30

61 у

Азр

Зег

Туг

Зег Зег О1у

61 у

А1а

61 у

Зег

Туг

Зег

зег

61 у

Азр

35

40

45

Суз

Агд

Зег

ТЬг

ьуз А1а туг

РГО

А1а

Ьеи

тгр

А1а

НТВ

а! а

50

55

60

Зег

РНе

Зег

РНе А1а суз

зег

61 у

А1а

Агд

тНг

Туг

Азр

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

А1а

61п

ьеи

Азп зег тЬг

ьеи

Уа1

зег

Не

ТНг

Не

61 у

О1у

А5П

85

90

95

Азр

А1а

61 у

РНе

А1а Азр мет

тНг

суз

Уа1

Ьеи

Зег

Азр

Зег

А1а

100

105

110

Суз

ьеи

Агд

Не

А1а А1а ьуз

туг

11 е

тНг

|_еи

Рго

А1а

Агд

Ьеи

Азр

115

120

125

5ег

Уа1

туг

Зег

А1а 11 е тНг

Агд

А1а

Рго

А1а

Агд

Уа!

ьеи

130

135

140

61 у

туг

Рго

Агд

11е туг зег

01 у

1_еи

61 у

|_еи

Зег

ТНг

Ьуз

Агд

А1а

145

150

155

160

А1а

11 е

АЗП

Азр

А1а А1а А5р

ьеи

АЗП

Зег

Уа1

11е

А1а

Ьуз

Агд

А1а

165

170

175

А1а

Азр

Н1 5

61 у

РНе тНг рНе

61 у

Азр

Уа1

ТЬг

РЬе

61 у

НТ 5

61 и

Ьеи

180

185

190

Суз

зег

А1а

рго

тгр ьеи нтз

зег

ьеи

тНг

ьеи

РГО

Уа1

Зег

Туг

Нт 5

195

200

205

РГО

ТНг

А1а

61 у

нт з А1а А1а

61 у

туг

Ьеи

РГО

Уа1

1_еи

А5П

Зег

Не

210 215 220

- 103 014985 тЬг

225

<210> <211> <212> <213>	52 4 РКТ искусственная
<220> <223>	последовательность мотив

<220> <221> <222> <223>	сайт (4). . (4) Ьеи, А1а, Уа1, 11е, РЬе, Туг, нтз, О1п, тНг, Азп, Мег ог Зег
<400>	52

у Азр Зег хаа

<210> <211> <212> <213>	53 5 РКТ Искусственная
<220> <223>	последовательность мотив

<220> <221> <222> <223>	сайт ¢2)..(2) А1а ог 61 у.
<22О> <221> <222> <223>	сайт (5)..(5) туг, А1а ог Ьеи.
<400>	53

у А1а Азп Азр Туг

5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ ферментативного рафинирования пищевых масел гидратацией, заключающийся в обработке пищевого масла липидацилтрансферазой для того, чтобы перенести ацильную группу с основной части фосфолипида на один или более акцепторов ацила, в котором акцептор ацила представляет собой один или более стеринов и/или станолов и в котором липидацилтрансфераза отличается следующим:

(а) липидацилтрансфераза обладает активностью ацилтрансферазы, которую определяют как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной сложно-эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового сложного эфира; и (б) фермент включает мотив последовательности аминокислот ΟΌ8Χ, в котором X представляет собой один или более из следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, I, Ε, Υ, Н, О. Т, N М или 8, причем липидацилтрансфераза при сравнительном анализе первичной структуры либо с консенсусной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, либо с 8ЕЦ ΙΌ N0: 37, либо с обеими указанными последовательностями включает блок СΑN^Υ.
2. Способ по п.1, в котором в масле повышается уровень сложного стеринового эфира или сложного станолового эфира.
3. Способ по п.2, в котором акцептор ацила представляет собой стерин.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором фосфолипид представляет собой лецитин.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором липидацилтрансфераза дополнительно переносит ацильную группу с липида по меньшей мере на один углевод, белок, субъединицу белка и глицерин.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет собой природную липидацилтрансферазу.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет модифицированный вариант природной липидацилтрансферазы.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная липидацилтрансфераза получена из организма, принадлежащего одному из следующих родов: Αе^отоηак. 81гер1отусек, 8ассБаготусек, Ьас1ососсик, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсик, Ьас1оЬасШик, Пеки1Г11оЬас1егшт, ВасШик, Сатру1оЬас1ег, ^Ьгюпасеае, Ху1е11а, 8и1Го1оЬик, Α^Γ§ί11πδ, 8сЫ/окассЬаготусек, Ык1ег1а, №1ккепа, МекогЫ/оЬшт, Ва1к1оша, ХапИотопак, СапдИа, ТНегтоЫПба и СогупеЬас1епит.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная липидацилтрансфераза получена из одного или более организмов, выбранных из группы, включающей Αе^отоηак БудгорЫ1а, Αе^отоηак ка1тошсИа, 81гер1отусек соеБсо1ог, 81гер1отусек птокик, 81гер1отусек ИегтокассБап, 81гер1отусек ауегтИШк, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсик руодепек, БасЮсосснк 1асБк, 81гер1ососсик руодепек, 81гер1ососсик 1БегторЫ1ик, БасЮЬасШнк БекеИсик, Пеки1Г11оЬас1егшт деНа1одепапк, ВасШик кр, Сатру1оЬас1ег |е1ипЕ V^Ь^^опасеае. Ху1е11а ГакИШока, 8и1Го1оЬик ко1Га1апсик, 8ассНаготусек сегеу1к1ае, Α!^Γ8ί11ιΐ8 1еггеик, 8с1нхокасс11аготусек ротЬе, Ык1епа 1ппосиа, Б1к1епа топосу1одепек, №1ккепа тешпдШШк, МекогЫхоЬшт 1о(Е Ва1к1оша ко1апасеагит, ХаШНотопак сатрек1пк, ХаШНотопак ахопороШк, СапШда рагаркНощк, ТНегтоЫГШа Гикса и СогупеЬас1егшт еГПаепк.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Х мотива СИ8Х представляет собой Ь.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 8ЕО ΙΌ N0: 4, 8ЕО ΙΌ N0: 5, 8ЕО ΙΌ N0: 6, 8ЕО ΙΌ N0: 7, 8ЕО ΙΌ N0: 8, 8ЕО ΙΌ N0: 9, 8ЕО ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 11, 8ЕО ΙΌ N0: 12, 8ЕО ΙΌ N0: 13, 8ЕО ΙΌ N0: 14 или 8ЕО ΙΌ N0: 15, 8ЕО ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 17, 8ЕО ΙΌ N0: 18, 8ЕО ΙΌ N0: 36, 8ЕО ΙΌ N0: 38, 8ЕО ΙΌ N0: 40, 8ЕО ΙΌ N0: 41, 8ЕЦ ΙΌ N0: 45, 8ЕЦ ΙΌ N0: 47, 8ЕЦ ΙΌ N0: 50 или последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность75% или более.
12. Способ по п.11, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 15 либо последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность 75% или более.
13. Способ по п.11, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕЦ ΙΌ N0: 36, 8ЕЦ ΙΌ N0: 38, 8ЕС) ΙΌ N0: 40, 8ЕО ΙΌ N0: 41, 8ЕО ΙΌ N0: 45, 8ЕО ΙΌ N0: 47, 8ЕО ΙΌ N0: 50 или последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность 70% или более.
14. Способ по п.11, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из 8ЕЦ ΙΌ N0: 17 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 либо последовательность аминокислот, гомологичную указанным на 70% или более.
15. Способ по п.11, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 или последовательность аминокислот, гомологичную указанной на 75% или более.

- 105 014985
16. Способ по п.11, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 16.
17. Способ по п.7, в котором вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот сравнительно с исходной последовательностью по крайней мере в одном из остатков аминокислот 8ег3; РЬе138ег; Ахр15Ахп, Ьеи17; 8ег18х (где х выбирают из А1а, Сух, Ахр, С1и, РЬе, С1у, Ηίχ, 11е, Ьух, Ьеи, Ме1, Ахп, Рго, С1п, Агд, ТЬг, Тгу или Туг), Ьух22, Ме123, Туг30х (где х выбирают из А1а, Сух, Ахр, С1и, РЬе, С1у, Н1х, 11е, Ьух, Ме1, Ахп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТЬг, Vа1 или Тгу); С1у40; Ахп80; Рго81; Ьух82, Ахп87; Ахп88; Тгр111; νίΐ1112; А1а114; Ахр116Ахп или 61и; Туг117; Ьеи118; Рго156; Ахр157Ахп; 61у159; С1п160; Ахп161; Рго162; 8ег163; А1а164; Агд165; 8ег166; 61п167; Ьух168; Vа1169; Vа1170; С1п171; А1а172; Туг179; Н1х180; Ахп181; С1п182; Ме1209; Ьеи210; Агд211; Ахп215; Туг226х (где х выбирают из А1а, Сух, Ахр, С1и, РЬе, С1у, Н1х, 11е, Ьух, Ьеи, Ме1, Ахп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТЬг, Vа1 или Тгу); Ахр228Ахп; Тгу230х (где х выбирают из А1а, Сух, Ахр, С1и, РЬе, С1у, Н1х, 11е, Ьух, Ьеи, Ме1, Ахп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТЬг, Vа1 или Тгу); Ьух284; Ме1285; 61п289; Vа1290; 61и309; 8ег310 и 318.
18. Способ по п.7 или 17, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 16 или последовательность аминокислот, гомологичную указанной на 75% или более.
19. Способ по п.7 или 17, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8ЕР ΙΌ N0: 16.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевое масло во время обработки включает менее чем 1% воды.
21. Способ по п.20, в котором масло включает менее чем 0,5% воды.
22. Способ по п.21, в котором масло включает менее чем 0,1% воды.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, который включает удаление лизофосфолипидов, образующихся под действием липидацилтрансферазы, посредством фильтрования.
24. Применение липидацилтрансферазы, отличающейся тем, что:

(а) липидацилтрансфераза обладает активностью ацилтрансферазы, которую определяют как активность переноса сложного эфира, причем ацильная часть исходной сложно-эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового сложного эфира; и (б) фермент включает мотив последовательности аминокислот 0Ό8Χ, в котором Χ представляет собой один или более из следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, р, Т, N М или 8, причем липидацилтрансфераза при сравнительном анализе первичной структуры либо с консенсусной последовательностью 8ЕР ΙΌ N0: 2, либо с 8 Ер ΙΌ N0: 37, либо с обеими указанными последовательностями включает блок ΟΑN^Υ, в рафинировании пищевых масел гидратацией для удаления фосфолипидов и повышения уровня образования сложных стериновых эфиров и/или сложных станоловых эфиров в масле.
25. Применение по п.24, при котором не происходит существенного повышения уровня свободных жирных кислот в масле после обработки.
26. Применение по п.24 или 25, в котором фосфолипид представляет собой лецитин.
27. Применение по любому из пп.24-26, в котором липидацилтрансфераза представляет собой природную липидацилтрансферазу.
28. Применение по любому из пп.24-27, в котором липидацилтрансфераза представляет модифицированный вариант природной липидацилтрансферазы.
29. Применение по любому из пп.24-28, в котором указанная липидацилтрансфераза получена из организма, принадлежащего к одному из следующих родов: Аеготопах, 81гер1отусех, 8ассЬаготусех, Еас1ососсих, МусоЬас1епит, 81гер1ососсих, Еас1оЬасШих, Оехи1й1оЬас1егшт, ВасШих, Сатру1оЬас1ег, V^Ь^^опасеае, Xу1е11а, 8и1Го1оЬих, АхрегдШих, 8сЬ^ζоχассЬа^отусеχ, Ых1ег1а, №1ххейа, Меχо^Ь^ζоЬ^ит, Ва1х1оша, XапΐЬотопаχ, Сапб1ба, ТЬегтоЬШба и СогупеЬас1егшт.
30. Применение по любому из пп.24-29, в котором липидацилтрансфераза получена из одного или более организмов, выбранных из группы, включающей Аеготопах ЬубгорЬйа, Аеготопах ха1тошс1ба, 81гер1отусех соеЬсо1ог, 81гер1отусех птохих, 81гер1отусех ШегтохассЬай, 81гер1отусех аνе^тШ1^χ, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсих руодепех, Еас1ососсих 1асИх, 81гер1ососсих руодепех, 81гер1ососсих 1ЬегторЫ1их, Еас1оЬасШих Ьейейсих, Оехи1й1оЬас1егшт беЬа1одепапх, ВасШих хр, Сатру1оЬас1ег |е|ип1, V^Ь^^опасеае, Xу1е11а ГахИбюха, 8и1Го1оЬих хо1Га1апсих, 8ассЬаготусех се1^1х1ае, АхрегдШих 1еггеих, 8сЬ^ζоχассЬа^отусеχ ротЬе, Ых1ег1а 1ппосиа, Ых1ег1а топосу!одепех, №1ххепа тешпдШШх, МехогЬшоЬшт 1ой, Ра1х1оша хо1апасеагит, XапШотопаχ сатрехЬгх, XапίЬотопаχ ахопороШх, СапШба рагарх11ох1х, ТЬегтоЬШба Гихса и СогупеЬас1егшт еГйаепх.
31. Применение по любому из пп.24-30, в котором Χ мотива 0Ό8Χ представляет собой Ь.
32. Применение по любому из пп.24-31, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну из следующих последовательностей аминокислот: 8ЕР ΙΌ N0: 1, 8ЕР ΙΌ N0: 3, 8ЕР ΙΌ N0: 4, 8Ер ΙΌ N0: 5, 8Ер ΙΌ N0: 6, 8Ер ΙΌ N0: 7, 8Ер ΙΌ N0: 8, 8Ер ΙΌ N0: 9, 8Ер ΙΌ N0: 10, 8ЕР ΙΌ N0: 11, 8Ер ΙΌ N0: 12, 8Ер ΙΌ N0: 13, 8Ер ΙΌ N0: 14 или 8Ер ΙΌ N0: 15, 8Ер ΙΌ N0: 16, 8ЕР ΙΌ N0: 17, 8Ер ΙΌ N0: 18, 8Ер ΙΌ N0: 36, 8Ер ΙΌ N0: 38, 8Ер ΙΌ N0: 40, 8Ер ΙΌ N0: 41,

- 106 014985

8РО ΙΌ N0: 45, 8ΡΟ ΙΌ N0: 47, 8ΡΟ ΙΌ N0: 50 или последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность 75% или более.
33. Применение по п.32, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из следующих последовательностей аминокислот: 8РО ΙΏ N0: 3, 8 НО ΙΏ N0: 4, 8НО ΙΏ N0: 1 или 8НО ΙΏ N0: 14 либо последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность 75% или более.
34. Применение по п.32, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из следующих последовательностей аминокислот: 8НО ΙΙ) N0: 36, 8НО ΙΙ) N0: 38, 8Е9 ΙΏ N0: 40, 8НО ΙΏ N0: 41, 8НО ΙΏ N0: 45, 8НО ΙΏ N0: 47, 8НО ΙΏ N0: 50 или последовательность аминокислот, которая имеет с ними идентичность 75% или более.
35. Применение по п.32, в котором липидацилтрансфераза включает по меньшей мере одну последовательность из 8НО ΙΙ) N0: 17 или 8НО ΙΙ) N0: 18 либо последовательность аминокислот, гомологичную указанным на 75% или более.
36. Применение по п.32, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8НО ΙΏ N0: 16 или последовательность аминокислот, гомологичную указанным на 75% или более.
37. Применение по п.32, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8НО ΙΏ N0: 16.
38. Применение по п.28, в котором липидацилтрансфераза отличается тем, что фермент включает мотив последовательности аминокислот ΘΏ8Χ, в котором X представляет собой один или более из следующих остатков аминокислот: Ь, А, V, Ι, Р, Υ, Н, 9, Т, N М или 8 и в котором вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот сравнительно с исходной последовательностью в любом одном или более остатков аминокислот: 8ег3; РНе138ег; Азр15Азп, Ьеи17; 8ег18х (где х выбирают из А1а, Суз, Азр, С1и, РНе, С1у, Н1з, Не, Ьуз, Ьеи, Мер Азп, Рго, С1п, Агд, ТНг, Тгу или Туг), Ьуз22, Ме123, Туг30х (где х выбирают из А1а, Суз, Азр, С1и, РНе, С1у, Н1з, Не, Ьуз, Мер Азп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТНг, Vа1 или Тгу); С1у40; Азп80; Рго81; Ьуз82, Азп87; Азп88; Тгр111; νπ1112; А1а114; Азр116Азп или С1и; Туг117; Ьеи118; Рго156; Азр157Азп; С1у159; С1п160; Азп161; Рго162; 8ег163; А1а164; Агд165; 8ег166; С1п167; Ьуз168; ν^169; ν^170; С1п171; А1а172; Туг179; Н1з180; Азп181; С1п182; Ме1209; Ьеи210; Агд211; Азп215; Туг226х (где х выбирают из А1а, Суз, Азр, С1и, РНе, С1у, Н1з, Не, Ьуз, Ьеи, Мер Азп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТНг, Vа1 или Тгу); Азр228Азп; Тгу230х (где х выбирают из А1а, Суз, Азр, С1и, РНе, С1у, Н1з, Не, Ьуз, Ьеи, Мер Азп, Рго, С1п, Агд, 8ег, ТНг, νπΐ или Тгу); Ьуз284; Ме1285; С1п289; ν^290; С1и309; 8ег310 и 318.
39. Применение по п.28, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8НО ΙΙ) N0: 16 или последовательность аминокислот, гомологичную указанной на 75% или более.
40. Применение по п.39, в котором липидацилтрансфераза включает последовательность аминокислот 8НО ΙΏ N0: 16.
41. Применение по любому из пп.24-40, в котором пищевое масло во время обработки включает менее чем 1% воды.
42. Применение по п.41, в котором масло включает менее чем 0,5% воды.
43. Применение по п.42, в котором масло включает менее чем 0,1% воды.