MXPA05011421A - Fosfolipasa y metodo para producirla. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para producir una fosfolipasa procesando un peptido fungico expresado y a ciertas fosfolipasas especificadas. Ademas, la invencion proporciona un metodo para producir queso con una fosfolipasa.

Description

FOSFOLIPASA Y METODO PARA PRODUCIRLA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para hidrolizar un fosfolípido, un método para producir una fosfolipasa, un método para elaborar queso y a una fosfolipasa. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Soragni, et al. (2001) EMBO J. 20: 5079-5090, describe una fosfolipasa (TbSPl) a partir de Tuher borchii y la secuencia de nucleótido de ADNc de un gen que la codifica. Las siguientes secuencias peptidicas son publicadas en fuentes indicadas, derivadas del organismo de fuente indicado: • COGEME Base de datos EST Hongo Fitopatogénico y Oomiceto, Unisecuencia ID: VD0100C34, Verticillium dahliae • Base de datos de Proteina NCBI, gi: 18307435, Neurospora crassa • Base de datos de Proteina NCBI, gi: 16519372, Helicosporum sp. HN1 • WO 0056762, SEC ID NO: 5954, Aspergillus oryzae • Base de datos de Proteína TREMBL, EAA28927, Neurospora crassa El documento US 6399121 describe el uso de fosfolipasa en la elaboración de queso. REP: 167277 SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores han analizado los datos de secuencia conocida para fosfolipasas A2 del Grupo XIII fúngico, y han identificado secuencias adicionales, ya sea a partir de los datos de secuencia publicada o seleccionadas para determinar secuencias relevantes a partir de fuentes naturales . Expresando genes que codifican fosfolipasas A2 del Grupo XIII fúngico en un organismo hospedero adecuado, se ha encontrado que las secuencias expresadas consisten de un péptido nuclear acoplado a una secuencia peptidica en el lado N o C-terminal o en ambos, y que tal expresión del gen en un organismo adecuado puede conducir al desdoblamiento del péptido expresado para obtener el péptido nuclear sin alguna extensión peptidica en el N- o C-terminal. Además, se encuentra que el péptido nuclear sin alguna(s) extensión (es) peptidicas, tiene una actividad de fosfolipasa significantemente superior que el péptido nuclear ligado a la(s) extensión (es) peptidicas. Finalmente, se encuentra que el péptido nuclear descubierto por este método es similar en longitud y secuencia a un péptido maduro conocido a partir de Helicosporium sp. (Wakatsuki, S. et al. (2001) Biochim. Biophys . Acta 1522:74-81) de función desconocida, y a fosfolipasas A2 del Grupo XIII bacteriano, las cuales carecen de extensiones peptidicas distintas de las señales de secreción (Sugiyama, M. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:20051-20058).

Los inventores adicionalmente encuentran que las fosfolipasas que portan la similitud de secuencia de sitio activo y conservación de residuo cisteína de fosfolipasa A2 de Grupo XIII fúngico, son útiles en la elaboración de queso. Adicionalmente, los inventores descubrieron y aislaron un gen que codifica una nueva fosfolipasa a partir de Fusarium venenatum A3/5, la cual fue originalmente depositada como Fusarium graminearvm ATCC 20334 y recientemente reciasificada como Fusarium venenatum por Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23:62-80; y O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23:57-67. Las fosfolipasas pertenecen al grupo fúngico/bacteriano XIII PLA2 como se define por Soragni et al., The EMBO Journal, 20 (2001), 5079-5090. Los inventores también clonaron la nueva fosfolipasa que codifica el gen en una cepa E. coli, y usaron el gen clonado para hacer un constructo para expresar el gen de fosfolipasa de Fusarium en Aspergillus oryzae. Los inventores Aspergillus oryzae son transformados con este constructo, y aislada la fosfolipasa a partir de células Aspergillus transformadas. Por consiguiente, la invención proporciona un método para producir una fosfolipasa, el cual comprende procesar un péptido fúngico expresado para desdoblar un péptido a partir del extremo C-terminal y/o un péptido a partir del extremo N-terminal para obtener un péptido nuclear, en donde el péptido nuclear comprende : a) la secuencia de aminoácido dada por los aminoácidos 146-153 de la SEC ID N0:1, aminoácidos 87-94 de la SEC ID NO: 3, o aminoácidos 79-86 de la SEC ID NO: 12, o una secuencia idéntica a cualquiera de estas secuencias de aminoácido, excepto por la sustitución de un aminoácido único con otro aminoácido; y b) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) ; y c) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) . La invención también proporciona un método para hidrolizar un fosfollpido con una fosfolipasa de la invención. Además, la invención proporciona un método para producir queso, poniendo en contacto la leche de quesería o una fracción de leche de quesería con una fosfolipasa y producir queso a partir de la leche de quesería. Finalmente, la invención proporciona fosfolipasa la cual es un péptido que tiene una secuencia de aminoácido la cual es al menos, 80% idéntica con ciertas secuencias especificadas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácido de fosfolipasas A2 del Grupo XIII fúngico, que muestra sitios de procesamiento (|) en donde se conocen. El sitio activo consenso está subrayado. Los residuos de cisteína conservada están indicados con | bajo el consenso. La alineación se hizo con el programa AlignX del programa Vector NTI suite 8. El algoritmo usado es Clustal con la matriz blosum62mt6 y ajustes por defecto AlignX. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Péptido expresado La invención usa un péptido fúngico expresado que pertenece a un grupo definido por la similitud de secuencia de sitio activo y conservación de residuo de cisteína usado en la definición del grupo "fosfolipasa A2 del Grupo XIII fúngico/bacteriano" dado por Soragni, E. , et al. (2001) EMBO J. 20:5079-5090. El péptido es fúngico, por ejemplo, derivado de Tuber, Verticillium, Neurospora, Helicosporu o Aspergillus, particularmente G. borchii, T. albidum, V. dahliae, V. tenerum, N.crassa, Helicosporium sp. HN1 o A. oryzae . El péptido puede tener actividad de fosfolipasa, por ejemplo, actividad de fosfolipasa A, tal como fosfolipasa Al y/o actividad de fosfolipasa A2. Algunos ejemplos particulares son péptidos conocidos que tienen secuencias de aminoácido listadas en el listado de secuencia como sigue. Los organismos de la fuente y las referencias de literatura están también indicados : • SEC ID N0:1. Tuber borchii. Soragni, E. , et al. (2001) EMBO J. 20:5079-5090 • SEC ID NO: 3 Verticillium dahliae. COGEME Base de datos EST Hongo Fitopatogénico y Oomiceto, Unisecuencia ID: VD0100C34 • SEC ID NO:4 Neurospora crassa. Base de datos de Proteína NCBI, gi: 18307435. • SEC ID NO: 5 Helicosporum sp HNl. Base de datos de Proteína NCBI, gi: 16519372. • SEC ID NO: 7 Aspergillus oryzae. O 0056762, SEC ID NO: 5954. • SEC ID NO: 8. Neurospora crassa. Base de datos de Proteína TREMBL, EAA28927. Además, las siguientes fosfolipasas fúngicas que tienen las secuencias indicadas fueron aisladas por los inventores a partir de fuentes naturales adquiridas de colecciones públicas o colectadas en los países y años indicados : · SEC ID NO: 10. Tuber albidum. Adquirida de Centraalbureau voor Schimmel-cultures, Utrecht, Holanda, aislado CBS272.72. • SEC ID NO: 12. Verticillium tenerum. Irlanda, 1996. Los inventores insertaron el gen a partir de T. aldibum (SEC ID NO: 9) en E. coli y depositaron el clon bajo los términos del Tratado de Budapest el 12 de Febrero de 2003. El depósito de hizo en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) , ascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, Alemania, y fue de conformidad con el número de depósito DSM 15441. En una modalidad, la invención proporciona una fosfolipasa la cual es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido la cual es al menos, 80%, tal como al menos 85%, preferiblemente 90%, más preferiblemente al menos 95%, idéntica con los aminoácidos 91-210 en la SEC ID NO: 10 (T. albidum) , aminoácidos 92-211 en la SEC ID NO.-l (G. borchii) , aminoácidos 30-137 en la SEC ID N0:12 (V. tenerum) , aminoácidos 38-145 en la SEC ID NO:3 (V. dahliae) , aminoácidos 44-151 en la SEC ID NO:4 (N. crassa) , amino ácidos 37-157 en la SEC ID NO: 7 (A: oryzae) , o -aminoácidos 58-168 en la SEC ID NO: 8 (N. crassa) . Procesamiento peptídico Analizando las secuencias de fosfolipasa en el listado de secuencia, los inventores encontraron que cada secuencia de aminoácido expresada consiste de un péptido señal, un péptido nuclear, y adicionaIntente una secuencia peptídica con función desconocida unida al C o N-terminal, o ambos, del péptido nuclear. Péptido nuclear Los péptidos nucleares están caracterizados por la misma similitud de secuencia de sitio activo y conservación de residuo de ciste na observada por Soragni, E . , et al. (2001) EMBO J. 20:5079-5090 para la fosfolipasa A2 del grupo XIII fúngico/bacteriano . En una modalidad preferida de la invención, los péptidos nucleares comprenden: a) la secuencia dada por los aminoácidos 146-153 de la SEC ID N0:1, aminoácidos 87-94 de la SEC ID NO: 3, o aminoácidos 79-86 de la SEC ID NO: 12, o una secuencia idéntica a cualquiera de estas secuencias de aminoácido, excepto para la sustitución de un aminoácido único con otro aminoácido; y b) dos residuos de cisteína ubicados en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) ; y c) dos residuos de cisterna ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) . Uno de los residuos de cisteína ubicado en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) , puede por ejemplo, ser separado de la secuencia dada en a) por aminoácidos 0-5, tales como aminoácidos 0-3, preferiblemente aminoácidos 0-2, y aún más preferiblemente 1 aminoácido. Otro de los residuos de cisteína ubicado en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) , puede ser por ejemplo, separado de la secuencia -dada en a) por 14-20 aminoácidos, tales como aminoácidos 15-19, preferiblemente aminoácidos 16-18, y aún más preferiblemente aminoácidos 17. Uno de los residuos de cisteína ubicado en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) , puede ser por ejemplo, separado de la secuencia dada en a) por aminoácidos 22-29, tal como aminoácidos 23-28, preferiblemente aminoácidos 24-27, y aún más preferiblemente, aminoácidos 25-26. Otro de los residuos de cisteína ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) puede por ejemplo, ser separado de la secuencia dada en a) por los aminoácidos 27-49, tal como aminoácidos 29-46, preferiblemente aminoácidos 30-43, aún más preferiblemente aminoácidos 32-42, y más preferiblemente aminoácidos 35-40. En una modalidad preferida, el pépt do nuclear comprende cuatro residuos de cisteína alineados con los residuos de cisteína de la SEC ID NO:l con los números de aminoácidos 128, 144, 180, y 194, respectivamente, cuando la secuencia de fosfolipasa es expresada completa, es alineada simultáneamente con -las secuencias dadas en las SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO:4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO:10 y SEC ID N0:12. De conformidad con la invención, el polipéptido expresado es desdoblado para separar el péptido nuclear a partir- del (los) péptido (s) unidos. El desdoblamiento se puede hacer in vivo expresándolo en un hospedero fúngico filamentoso o in vitro, por ejemplo, por un tratamiento con una proteasa soluble tal como por ejemplo, Kex2. Los puntos de desdoblamiento se pueden encontrar dentro de los 11 aminoácidos de una secuencia la cual es FG o con 10 aminoácidos de una secuencia la cual es un sitio Kex2. Los sitios Kex2 son por ejemplo, RR, KR, KK, o RK. En una modalidad, el péptido nuclear tiene una longitud de 100-150 aminoácidos, tal como 110-140 aminoácidos, 115-133 aminoácidos, 118-129 aminoácidos, o 118-125 aminoácidos. En una modalidad de la invención, la fosfolipasa expresada es desdoblada dentro de aminoácidos 0-18, tal como aminoácidos 3-16, preferiblemente aminoácidos 5-14 en el extremo N-terminal de la secuencia de alineación con los aminoácidos 97-101 de la SEC ID N0:1, cuando la secuencia de fosfolipasa es expresada completa, es alineada simultáneamente con las secuencias dadas en las SEC ID N0:1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 12. En una modalidad preferida, la fosfolipasa expresada es desdoblada dentro de los aminoácidos 0-11, tal como aminoácidos 0-9, preferiblemente aminoácidos 0-7, en el extremo C-terminal de la secuencia de alineación con los aminoácidos 204-209 de la SEC ID NO:l, cuando la secuencia de fosfolipasa expresada es completa, es alineada simultáneamente con las secuencias dadas en las SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10 y SEC ID NO: 12. En una modalidad preferida, la fosfolipasa procesada tiene una actividad fosfolipasa específica, la cual es superior que la actividad del péptido expresado antes del procesamiento, por ejemplo, en una modalidad, la actividad de fosfolipasa específica es al menos, 2 veces, más preferiblemente, al menos 5 veces, más preferiblemente, al menos 10 veces, la actividad de fosfolipasa específica del péptido expresada antes del procesamiento. En una modalidad de la invención, el péptido expresado no tiene actividad de fosfolipasa medible antes del procesamiento. La actividad de fosfolipasa puede por ejemplo, ser medida en el ensayo LEU hidrolizando lecitina de soya (L-alfa-fosfatidil-colina) a pH 8.0 y 40°C por 2 minutos. La actividad de fosfolipasa es expresada como la velocidad de consumo valorador (0.1 M de NaOH) necesario para mantener el pH constante, con relación a un estándar. Expresión en células hospederas fúngicas filamentosas Las células hospederas fúngicas filamentosas pueden por ejemplo, ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Hu icola, Myceliophthora, Ne rospora, Penicillium, Rhizomucor, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, o Trichodexma, particularmente A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae. F. bactridloides, F. cereals, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminu , F. heterosporum, F. negundi, F. oxysporum, F. reticulatum, F. roseum, F. sawbucinum, F. sarcochroum, F. sporotrichioides, F. sulphureum, F. torulosum, F. trichothecioides, F. venenatum, H. insolens, M. thermophila, N. crassa, P. purpurogenum, R. miehei, Thermo yces lanuginosus, Thielavia terrestris, Trichoder a harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride . En una modalidad preferida, el organismo hospedero es una cepa de Aspergillus, Fusarium, o Trichoderma, particularmente A. niger, A. oryzae, F. venenatum, F. samlDucinum o F. cereals . La transformación, cultivación, expresión, recuperación, se pueden realizar por métodos convencionales, por ejemplo, por los métodos generales descritos en los documentos EP 238023, EP 305216, O 9600787, EP 244234 O T. Christensen et al., BioTechnology, vol. 6, Dec. 1988, 1419-22. Polipéptido de fosfolipasa y ADN En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de fosfolipasa y en donde los polipéptidos comprendidos, preferiblemente consisten de, una secuencia de aminoácido la cual tiene un grado de identidad a aminoácidos 29 a 149 de la SEC ID NO: 16 (es decir, el polipéptido maduro) de al menos 80%, tal como al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, por ejemplo, al menos 96%, tal como al menos 97% y aún más preferiblemente, al menos 98%,' tal como al menos 99%.

Preferiblemente, los polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene la actividad de fosfolipasa. En otra modalidad preferida, el polipéptido de la presente invención comprende los aminoácidos 29 a 149 de la SEC ID NO: 16. En una modalidad preferida adicional, el polipéptido consiste de aminoácidos 29 a 149 de la SEC ID NO: 16. La presente invención también se refiere a un polinucleótido comprendido, preferiblemente que consiste de una secuencia de nucleótido, la cual tiene al menos, 80% de identidad con los nucleótidos 133 a 495 de la SEC ID NO: 15. Preferiblemente, la secuencia de nucleótido tiene al menos, 85% de identidad, tal como al menos, 90% de identidad, más preferiblemente al menos, 95% de identidad, tal como al menos, 96% de identidad, por ejemplo, al menos 97% de identidad, aún más preferiblemente al menos, 98% de identidad, tal como aí menos 99% con nucleótidos 133 a 495 de la SEC ID NO.15. Preferiblemente, la secuencia de nucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa. La fosfolipasa se puede derivar de una cepa de Fusarium, particularmente, F. venenatum, usando sondas designadas en base a las secuencias de ADN en esta especificación. En una modalidad, la fosfolipasa tiene actividad de fosfolipasa A.

Las fosfolxpasas pueden ser producidas transformando una célula hospedera adecuada con una secuencia de ADN que codifica la fosfolipasa, cultivando el organismo transformado bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperando la enzima del cultivo. El organismo hospedero es preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa, tal como una cepa de Aspergillus, Fusarium, Trichoderma o Saccharomyces , particularmente A. niger, A. oryzae, F. venenatum, F. sambucinum, F. cereals o S. cerevisiae, por -ejemplo, una cepa que produce glucoamilasa de A. niger, tal como aquella descrita en el documento US 3677902 o un mutante del mismo. La producción de la fosfolipasa en tales organismos hospederos se puede hacer por los métodos generales descritos en los documentos EP 238,0283 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko) . El vector de expresión de la invención, típicamente incluye secuencias', de control que funcionan como un promotor, una señal de iniciación de traducción y, opcionalmente, un marcador seleccionable, un terminador de transcripción, un gen represor o varios genes activadores . El vector puede ser un vector de replicación autónomo, o puede ser integrado en el genoma de la célula hospedera.

Alineación e identificación de secuencia Las secuencias de nucleótido se pueden alinear con la aplicación de AlignX del Programa Vector NTI Suite 7.0, usando los ajustes por defecto, los cuales emplean un algoritmo ClustalW modificado (Thompson, J. D. , Higgins, D. G., and Gibson T. J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680), la matriz de registro swgapdnarnt, una penalización por apertura en hendidura de 15 y una penalización por extensión en hendidura de 6.66. Las secuencias de aminoácido pueden ser alineadas con la aplicación de AlignX del Programa Vector NTI Suite v8 usando ajustes por defecto, los cuales emplean un algoritmo ClustalW modificado (Thompson, J. D. , Higgins, D. G. , and Gibson T. J. 1994) , la matriz de registro blosum62mt2, una penalización por apertura en hendidura de 10 y una penalización por extensión en hendidura de 0.1. En una modalidad de la invención, las alineaciones de secuencia y cálculo de los registros de homología se hacen usando el Método Lipman-Pearson (Lipman, D. J. and W. R. Pearson (1985) Rapid and sensitive protein similarity searches . Science 227: 1435-1441), usando una tabla de peso de residuo PAM250 (Dayhoff, M. O., R. M. Schwartz, and B. C. Orcutt (1978) A model of evolutionary change in proteins. In Dayhoff, M. O. (ed.), Atlas of Protein Seguence and Structure. National Biomedical Research Foundation. Washington, D. C. Vol 5. Suppl. 3: p 345-358) y los ajustes por defecto del programa MegAlign, v .03 , en el paquete de software Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715) . Los ajustes por defecto son un K-tupia de 2, penalización en hendidura de 4, y una penalización por longitud en hendidura de 12. Hidrólisis de fosfolxpidos La invención puede ser usada en la hidrólisis de cualquier fosfolípido tal como una lecitina, una cefalina o un inositido. La invención puede ser usada en analogía con procesos de la técnica anterior reemplazando la fosfolipasa por ejemplo, en la producción de productos horneados (documentos WO 0032758, WO 9953769) , salsa de mayonesa (documentos GB 1525929, US 4034124) o tratamiento de aceite vegetal (documento US 5264367) . Uso de fosfolipasa La fosfolipasa de la invención puede ser usada en varias aplicaciones industriales de fosfolipasas, por ejemplo, como se describe abajo. Uso en Horneado La fosfolipasa de la invención puede ser usada en la preparación de pastas, panes y pasteles, por ejemplo, para mejorar la elasticidad del pan o pastel. De este modo, la fosfolipasa puede ser usada en un proceso para hacer pan, que comprende agregar la fosfolipasa a los ingredientes en una pasta, amasando la pasta y hornear la pasta para hacer el pan. Esto se puede hacer en analogía con los documentos 4567056 o WO 99/53769. Uso en detergentes La variante puede ser usada como un aditivo de detergente, por ejemplo, a una concentración (expresada como proteína de enzima pura) de 0.001-10 (por ejemplo, 0.01-1) mg por gramo de detergente o 0.001-100 (por ejemplo, 0.010-10) mg por litro de licor de lavado. La composición de detergente de la invención puede por ejemplo, ser formulada como una composición de detergente para lavandería a mano o en máquina que incluye, una composición aditiva de lavandería adecuada para el pre-tratamiento de telas teñidas y una composición suavizante de telas agregada al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para uso en las operaciones de limpieza de superficies duras domésticas en general . En un detergente de lavandería, la variante puede ser efectiva para la remoción de manchas de grasa, o mantenimiento de la blancura o para limpieza sórdida. Una composición de detergente para lavandería puede ser formulada como se describe en los documentos GB 2247025, WO 9901531 o WO 9903962. La composición detergente de la invención puede, s r particularmente formulada para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina, por ejemplo, como se describe en los documentos GB 2,247,025 (Unilever) o O 99/01531 (Procter & Gamble) . En una composición para lavavaj illas, la variante puede ser efectiva para eliminación de manchas grasosas/aceitosas, para prevención del manchado/decoloración de los componentes plásticos y desgaste de trastes de la lavavaj illas por componentes altamente coloreados y la evitación de depósitos de jabón de cal en el desgaste de trastes . Otros usos La fosfolipasa de la invención puede ser usada para mejorar la capacidad de filtración de una solución o suspensión acuosa de origen carbohidrato, tratándola con la fosfolipasa. Esto es particularmente aplicable a una solución de suspensión que contiene hidrolizado de almidón, especialmente un hidrolizado de almidón de trigo, puesto que tiende a ser difícil filtrar y dar filtrados grumosos. El tratamiento se puede hacer en analogía con el documento EP 219,269 (CPC International) . Además, la fosfolipasa de la invención puede ser usada para hidrólisis parcial de fosfolípidos, preferiblemente lecitina, para obtener emulsificadores de fosfolípidos mejorados. Esta aplicación es además descrita en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Publisher: VCH Weinheim (1996)), patente JP 2794574, y JP-B 6-087751.

Además, las fosfolipasas de la invención pueden ser usadas en un proceso para la producción de un alimento para animales, el cual comprende mezclar la fosfolipasa con sustancias alimenticias y al menos, un fosfolípido. Esto se puede hacer en analogía con el documento EP 743 017. Aún además, la fosfolipasa de_'la invención se puede usar en un proceso para reducir el contenido de fosfolípidos en un aceite comestible, que comprende tratar el aceite con la fosfolipasa para hidrolizar una parte principal del fosfolípido, y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado a partir del aceite. Este proceso es aplicable a la purificación de cualquier aceite comestible el cual contiene fosfolípidos, por ejemplo, aceite vegetal tal como aceite de soya, aceite de nabo y aceite de girasol. La fosfolipasa puede por ejemplo, ser usada en el proceso descrito en el documento JP-A-2-133997 y US 5264367. Método para producir queso La fosfolipasa de la invención puede además ser usada para producir queso en analogía con el proceso dado en el documento US 6399121. En una modalidad preferida de la invención, el queso es producido poniendo en contacto la leche de quesería o una fracción de la leche de quesería con una fosfolipasa de la invención, y producir queso a partir de la leche de quesería. En una modalidad más preferida, el queso es producido poniendo en contacto la leche de quesería o una fracción de la leche de quesería con una fosfolipasa, en donde la fosfolipasa comprende : a) la secuencia dada por los aminoácidos 146-153 de la SEC ID N0:1, aminoácidos 87-94 de la SEC ID NO: 3; o aminoácidos 79-86 de la SEC ID NO: 12; o una secuencia idéntica a cualquiera de estas secuencias de aminoácido excepto por la sustitución de un aminoácido único con otro aminoácido; y b) dos residuos de cisteína ubicados en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) ; y c) dos residuos de cisteína ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) . En el presente contexto, el término leche de quesería significa cubrir cualquiera de las composiciones a base de leche usadas para la producción de queso. Una fracción de la leche de quesería puede ser cualquier fracción de leche de quesería tal como por ejemplo, leche desnatada, leche, suero de mantequilla, mantequilla o grasa de leche. En una modalidad preferida, la leche de quesería o una fracción de la leche de quesería se ponen en contacto con una fosfolipasa de la invención, en una cantidad suficiente para disminuir el efecto de engrase en el queso y/o incremento del rendimiento del queso. El efecto de engrase es la tendencia del queso para formar aceite libre después del almacenamiento y/o fusión. En un aspecto, la invención se refiere a un proceso para producir queso que comprende, tratar una composición láctea con una fosfolipasa de la invención y producir queso a partir de la composición láctea. Otro aspecto de la invención se refiere a un proceso para producir queso que comprende, tratar una composición láctea con fosfolipasa y producir queso a partir de la composición láctea, en donde la fosfolipasa se selecciona del grupo de fosfolipasas PLA2 del grupo XIII fúngico/bacteriano. En una modalidad preferida de la invención, la PLA2 del grupo XIII fúngica/bacteriana es de un hongo, más preferiblemente de un hongo que pertenece a los Ascomycetes. Una fosfolipasa que pertenece a PLA2 del grupo XIII fúngico/bacteriano, puede ser cualquier fosfolipasa que pertenece a este grupo como se define por Soragni et al., The EMBO Journal, 20 (2001), 5079-5090, y puede ser por ejemplo, de especies Tuber, por ejemplo, T. borchii, Streptomyces, por ejemplo, S. coelicor, Verticillivm, por ejemplo, V. dahliae, Aspergí1lus, por ejemplo, A. oryzae, Neurospora, por ejemplo, N. crassa, o Helicosporum. Una composición láctea de conformidad con la invención, puede ser cualquier composición que comprende constituyentes de leche. Los constituyentes de la leche pueden ser cualquier constituyente de leche tal como grasa de leche, proteína de leche, caseína, proteína de lactosuero, y lactosa. Una fracción de leche puede ser cualquier fracción de leche tal como por ejemplo, leche desnatada, suero de mantequilla, lactosuero, crema, polvo de leche, polvo de leche entera, polvo de leche desnatada. En una modalidad preferida de la invención, la composición láctea comprende, leche, leche desnatada, suero de mantequilla, leche entera, lactosuero, crema o cualquier combinación de los mismos . En una modalidad más preferida, la composición láctea consiste de leche, tal como leche desnatada, leche entera, crema, suero de mantequilla o cualquier combinación de los mismos. El tratamiento enzimático en el proceso de la invención puede ser conducido dispersando la fosfolipasa en la composición láctea, y permitiendo que tome lugar la reacción enzimática a un tiempo de mantenimiento apropiado a una temperatura apropiada. El tratamiento con fosfolipasa se puede llevar a cabo en condiciones elegidas para adecuar la(s) enzim (s) seleccionadas de conformidad con los principios bien conocidos en la técnica. El tratamiento enzimático puede ser conducido en cualquier pH adecuado, tal como por ejemplo, en el intervalo de 2-10, tal como a un pH de 4-9, ó 5-7. En una modalidad, el tratamiento de fosfolipasa se conduce a 3-60°C, tal como a 25-45°C (por ejemplo, por al menos 5 minutos, tal como por ejemplo, por al menos 10 minutos o al menos 30 minutos, por e emplo, por 5-120 minutos) . La fosfolipasa se agrega en una cantidad adecuada para producir queso que tiene las propiedades deseadas. Preferiblemente, la fosfolipasa se agrega en una cantidad efectiva para disminuir el efecto desgrasante en queso y/o incrementar el rendimiento del queso. Una dosificación adecuada de fosfolipasa usualmente estará en el intervalo de 0.001-0.5 mg de proteína enzimática por g de grasa de leche, preferiblemente, 0.01-0.3 mg de proteína enzimática por g de grasa de leche, más preferiblemente, 0.02-0.1 mg de proteína enzimática por g de grasa de leche. Los quesos producidos por el proceso de la presente invención comprenden todas las variedades de queso, tales como por ejemplo, Campesino, Chester, Danbo, Drabant, Herregard, Manchego, Provolone, Saint Paulin, queso Soft, Svecia, Taleggio, queso White, que incluye queso de cuajo de requesón producido por la coagulación del cuajo del requesón del queso; quesos madurados tales como Cheddar, Colby, Edam, Muenster, Gruyere, Emmenthal, Camembert, Parmesano y Romano; quesos azules, tales como queso azul Danés; quesos frescos tales como Feta,- quesos ácidos coagulados tales como, queso crema, Neufchatel, Quarg, queso Cottage y Queso Blanco. En una modalidad preferida, la invención se refiere a un proceso para producir un queso pasta filata, tal como por ejemplo, queso Mozzarella y para Pizza. Los quesos pasta filata o quesillo, están normalmente distinguidos por un tratamiento de plastificado y amasado único del requesón en agua caliente, lo cual imparte al queso acabado, su estructura fibrosa característica y propiedades de fusión y estiramiento, cotéjese por ejemplo, "Mozzarella and Pizza cheese por Paul S. Kindstedt, C eese: Chemistry, physics and microbiology, Volume 2: Major Cheese groups , segunda edición, página 337-341, Chapman & Hall . Listado de Secuencia y Microorganismos Depositados La presente solicitud contiene información en la forma de un listado de secuencia, el cual es adjunto a la solicitud y también está proporcionado en un portador de datos que acompaña esta solicitud. Además, la presente invención se refiere a microorganismos depositados . Los contenidos del portador de datos y los microorganismos depositados están completamente incorporados en este documento por referencia. Depósito de Material Biológico siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con el Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Alemania, y dando el siguiente número de acceso: Depósito Número de Acceso Fecha de Depósito E. coli DSM 15441 12 Febrero de 2003 E. coli DSM 15442 12 Febrero de 2003 MATERIALES Y METODOS Medios y sustratos Medio YP+2¾G 10 g de extracto de levadura 20 g de peptona agua a 1L autoclave a 12100, 20 minutos agregar 100 mi al 20% de solución de glucosa estéril Medio de esporulación RA: 50 g de ácido succinico 12.1 g de nitrato de sodio 1 g de glucosa 20 mi de sales Vogel 50x (Davis, R.H. y F. J. de Serres (1970), Meth. Enzymol. 17A:79-143). los componentes son mezclados en un litro de agua destilada y esterilizados por filtración. Amortiguador Britton Robinson 0.023 M de ácido fosfórico 0.023 M de ácido acético 0.023 M de ácido bórico Titulado con NaOH o HCl a pH deseado Métodos Actividad de fosfolipasa (LEU) La lecitina es hidrolizada bajo pH y temperatura constante, y la actividad de fosfolipasa es determinada como la velocidad de consumo de valoración (0.1N de NaOH) durante la neutralización del ácido graso liberado. El sustrato es lecitina de soya (L-a-fosfatidil-colina) , y las condiciones son pH 8.00, 40.0°C, tiempo de reacción 2 minutos. La unidad es definida con relación a un estándar . EJEMPLOS Ejemplo 1: Expresión de fosfolipasa A2 a partir de Tuber albidum en Aspergillus oryzae La secuencia de ADN descrita en Soragni et al. (supra) , se usó para diseñar cebadores para amplificación de CP de TbSPl a partir de ADN genómico, con sitios de restricción apropiados agregados a los extremos cebadores para facilitar la clonación del producto de PCR (SEC ID NO: 12 y 14). Se obtuvo una cepa Tuber albidum, CBS 272.72 a partir de CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utecht, Holanda) , y se cultivó en agar X a 20°C, como se recomienda por la CBS en la Lista de Cultivos, 1996. Se removió el micelio de la superficie de la placa y se aisló el ADN total usando un it de Rotación FastDNA (BIO101, Inc., Vista, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó la amplificación por RCP usando Extensor de Mezcla Principal de RCP de Alta Fidelidad (ABgene, Surrey, U.K) , siguiendo las instrucciones del fabricante y usando una temperatura de templado de 52°C por los primeros 5 ciclos y 62°C por los últimos 25 ciclos. Se obtuvo un producto de RCP único, y la secuencia se determinó y se presentó como la SEC ID NO 9 que excluye los sitios de restricción sintéticos agregados . La comparación de esta secuencia genómica a la secuencia de ADNc presentada por E. Soragni et al . , reveló una intrón único . Cuando el intrón se removió, la secuencia de nucleótido a partir de G. albidum CBS272.72 es 92.5% idéntica a aquella de T. borchii ATCC 96540, la cepa se usó por E. Soeagni et al. El péptido correspondiente predic o de la secuencia del gen T. albidum CBS272.72, es 93.8% idéntico a la secuencia peptidica reportada por Soragni et al . El fragmento de PCR fue restringido con BamHI y Xhol y clonado en el vector de expresión de Aspergillus pMStr57, usando técnicas estándares. El vector de expresión pMStr57 contiene los mismos elementos como pCaHj483 (documento WO 98/00529), con modificaciones menores hechas al promotor ??2 de Aspergillus, y tiene las secuencias para la selección y propagación en E. coli, y la selección y expresión en Aspergillus. Específicamente, la selección en Aspergillus es facilitada por el gen amdS de Aspergillus nidulans, el cual permite el uso de acetamida como una fuente de nitrógeno sola. La expresión en Aspergillus es mediada por un promotor de amilasa II neutral modificada (NA2) a partir de Aspergillus niger, el cual es fusionado a la secuencia líder al 5' del gen que codifica a fosfato isomerasa (tpi) a partir de Aspergillus nidulans, y el terminador a partir del gen que codifica a amiloglucosidasa a partir de Aspergillus niger. El gen que codifica a fosfolipasa A2 del constructo de expresión de Aspergillus resultante, pMStr70, fue secuenciado y la secuencia se comparó con aquella determinada previamente por el fragmento de PCR no clonado, la SEC ID NO.9. Una mutación única T a C se encontró 52 pb corriente abajo del codon de detención. Se transformó Aspergillus oryzae con pMStr70 usando técnicas estándares descritas en Christensen, T. et al., (1988) , Biotechnology 6, 1419-1422. Los transformantes fueron cultivados en medio YP+2%G sacudido a 275 RPM a 30°C y la expresión de la fosfolipasa A2 de Tuber, TbPLA2, fue monitoreada por SDS-PAGE. Caracterización de Proteína La SDS-PAGE reveló dos bandas, con aproximadamente Pm de 25 y 16 kDa. El sobrenadante se purificó por cromatografía de intercambio iónico en una columna de Sefarosa SP equilibrada con 50 mM de amortiguador de acetato, y se eluyó con 1 M de NaCl, pH 5.0. Las dos proteínas eluyeron en dos fracciones separadas . La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteína ESL de Roché. La actividad se determinó en el ensayo LEU.

Las proteínas fueron sometidas a secuenciamiento N-terminal. La secuencia N-terminal de la combinación 1 (banda de 23-25 kDa) , se encontró corresponder a los aminoácidos 32-50 de la SEC ID NO: 10. El manchado de la combinación 2 (banda de 16 kDa) , reveló dos bandas con secuencias N-terminal que corresponden a los aminoácidos 86-98 y 91-103, respectivamente. El análisis espectral de las dos bandas mostró masas de 13934 y 14348 Da respectivamente, igualando con 5 Da de volúmenes calculados de las secuencias de aminoácidos 86-210 y 91-210 de la SEC ID NO: 10, respectivamente. Ejemplo 2 : Procedimiento de purif cación para dos formas de PLA2 de T. albldium expresada en Asperglllus oxyzae En la mayoría de las fermentaciones del transformante Aspergillus oryzae descrito en el Ejemplo 1 que produce PLA2 de T. albidum, se detectaron dos formas de la enzima durante la purificación. Una forma funcionó a 22-23 kDa en SDS-PAGE y que corresponde al péptido reportado por Soragni et al. (supra) . Adicionalmente, se detectó una nueva forma la cual funcionó a 16-17 kDa en SDS-PAGE y la cual tiene una alta actividad específica y un alto punto isoeléctrico.

Purificación del péptido de 22-23 kDa El sobrenadante de fermentación que contiene fosfolipasa de T. albidium expresado en A. or zae (preparado en el Ejemplo 1) , se filtró estéril usando filtro E S adquirido de Seitz Schenk Bad Kreunzach, Bettringerstrasse 42, Alemania D-73550, Waldstetten. El sobrenadante filtrado estéril entonces se ajustó a pH 8 y a fuerza iónica bajo 4 mSi. Cromatografía de Intercambio Aniónico Se llevó a cabo la primera etapa de purificación en cromatografía de intercambio aniónico usando 50 mi de columna sefarosa de Flujo Rápido Q™, adquirida de Amersham Pharmacia. La columna se equilibró con 50 mM de amortiguador de acetato Tris pH 8. El caldo de fermentación filtrado estéril entonces se aplicó en la columna y la columna se lavó con el mismo amortiguador hasta que todo el material no unido se lavó. Las proteínas unidas fueron eluidas con el mismo amortiguador que contiene 1M de cloruro de sodio a pH 8 con velocidad de flujo de 5 ml/minutos y a un volumen final de 500 mi de amortiguador total. Las fracciones de 5 mi cada una, fueron colectadas usando un colector de fracción y la actividad de fosfolipasa de todas las que contienen las fracciones fue ensayada usando Lecitina como sustrato usando L-a-fosfatidil colina adquirida de Sigma Producto P-5638 y la actividad se sometió a ensayo usando un kit NEFA C adquirido de Wako Chemicals GmbH, Nissan Strasse 2, 41468 Neuss, Alemania. El ensayo exacto es descrito a continuación. Las soluciones del sustrato que contienen 10 mg/ml de sustrato de Lecitina fueron preparadas en amortiguadores diferentes tales como 50 mM de acetato a pH 5 ó 50 mM de Hepes a pH 7 ó 50 mM de acetato Tris a pH 9 como amortiguadores que contienen 2 mM de CaCl2 y 0.1% Tritón X-100 adquirido de Fluka chemicals. El sustrato fue entonces emulsificado por agitación y calentamiento a 50°C y después enfriado a 40°C y se usó como sustrato. El ensayo de actividad se llevó a cabo usando 300 µ? de la emulsión del sustrato incubada con 25 µ? de las fracciones enzimáticas por 20 minutos a 40 °C, después 30 µ? de la mezcla de ensayo se transfirieron a 300 µ? del reactivo de color NEFA C A, preparado como se describe por el fabricante e incubado por 10 minutos a 37 °C y se agregó 600 µ? de solución del reactivo de color FECA C B a la mezcla y después se incubó por 10 minutos. El color azul formado fue entonces medido en un espectrofotómetro a 505 nm. Caracterización de Proteína Las fracciones que contienen la actividad fueron entonces combinadas y caracterizadas por el peso molecular usando electrofóresis SDS-PAGE usando geles pre teñidos Novex 4 a 20% de geles Tris-Glicina adquiridos de Invitrogen Life Tecnologies, Carlsbad CA 92008, USA.

La proteína de 22-23 kDa se detectó y se analizó mediante blot y se llevó a cabo el análisis N-terminal usando un secuenciador Applied Biosystem. Los primeros 19 residuos de aminoácidos a partir de N-terminal, fueron determinados y se encontraron tener la secuencia de aminoácidos 32-50 de la SEC ID NO: 10. Purificación del péptido de 16-17 kDa La fermentación filtrada estéril del sobrenadante de la fosfolipasa de T. albidu expresada en A. oryzae, se ajustó a pH 4.7 y se ajustó la resistencia iónica por debajo de 4 mSi . Cromatografía de intercambio catiónico El flujo rápido SP-sepharose™, se adquirió de Amersham Pharmacia. Se envasaron 50 mi de columna y se equilibraron con 50 m de amortiguador de acetato a pH 4.7, el sobrenadante de fermentación entonces se aplicó en la columna y el material no unido se lavó usando el mismo amortiguador. La proteína unida con pl alta, entonces se eluyó con un gradiente lineal de sal usando 50 mM de amortiguador de acetato a pH 4.7 que contiene 1 de cloruro de sodio . Las fracciones y velocidades de flujo fueron similares a aquellas usadas para el pl bajo a partir de la fosfolipasa. La actividad de fosfolipasa en las fracciones se sometió a ensayo cualitativamente usando un kit NEFA como anteriormente. Las fracciones que contienen la actividad de fosfolipasa fueron combinadas y se llevó a cabo SDS-PAGE como se describe anteriormente. Se observó la proteína de 16-17 kDa, la cual tiene un punto isoeléctrico alto, arriba de 9. El análisis N-terminal de la proteína se llevó a cabo después del análisis de blot de la proteína y usando secuenciador de Applied biosystem, el cual mostró un N-terminal el cual fue completamente diferente de un publicado en Soragni et al. (supra) . De este modo, se encontró la PLA2 de T. albidum, por tener dos formas que derivan del procesamiento N-terminal diferencial con secuencias N-terminal que corresponden a los aminoácidos 86-105 y 91-110 de la SEC ID NO: 10, respectivamente. Ejemplo 3: Elaboración de queso con fosfolipasa de T. albidum Se usó crema no homogenizada, pasteurizada (North Carolina State University Dairy Plant) , para estandarizar quinientos gramos de leche desnatada no homogenizada, pasteurizada (North Carolina State University Dairy Plant) , á 3.5% de grasa, produciendo de este modo, queso mozzarella de pura crema. La leche de quesería para cada experimento se trató con ya sea fosfolipasa de T. albidum de 16-17 kD, preparada de conformidad con el ejemplo 2, o la Lecitase® de fosfolipasa comercial 10L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) , y se colocó en baño maría a 35°C hasta equilibrar a tal temperatura. Se tomó el pH inicial de esta leche de quesería y se agregaron 0.01% (p/p) del cultivo iniciador. El H se monitoreó hasta que se alcanzó un pH de 6.4. Se diluyeron 250 µ? de cuajo (Novozym 89L) a 9 mi de solución total con agua desionizada, un mi de esta solución se agregó a la leche de quesería y la leche de quesería se agitó vigorosamente por 3 minutos . La barra de agitación se removió y la leche recuajada se dejó asentarse a 35°C. Después de los tratamientos anteriores, el requesón está listo para cortarse cuando la espátula es insertada y se observan los bordes agudos. El queso se cortó empujando el cortador hacia abajo y mientras se mantiene el vaso de precipitado rápidamente, cambiar el cortador y finalmente poniendo el cortador encima. El requesón se dejó reposar 5 minutos, después se agitó suavemente con la cuchara. La temperatura se elevó a 41°C con agitación suave intermitente por ~45 minutos o hasta que el pH cayó a 6.0-5.9. El requesón se drenó usando una gasa, después se reemplazó en el vaso de precipitado y se mantuvo a 41°C en baño maría mientras se vertía el lactosuero como sea necesario. Cuando el requesón alcanzó pH 5.3 , el tazón de acero inoxidable con el requesón se inundó en un baño maría a 69°C por 5 minutos, después que se ha estirado. El requesón se templó en agua helada con hielo por 30 minutos. El requesón del queso se secó con papel secante, se pesó y refrigeró durante la noche. Los experimentos de control para elaborar queso fueron elaborados a partir del mismo lote de leche, siguiendo los mismos procedimientos, excepto que no se agregó fosfolipasa. El rendimiento actual del queso se calculó como el peso del queso después del estiramiento, con relación al peso total de la leche de quesería. El rendimiento del queso de humedad ajustada se expresa como el rendimiento actual ajustado a un nivel estándar constante de humedad. El rendimiento de humedad ajustada se calculó multiplicando el rendimiento actual y la relación de contenido de humedad actual a la humedad estándar, de conformidad con la siguiente fórmula: Yajus = (Yact X 1-Mact) / (1-Mest) en donde Yajus = rendimiento del queso de humedad ajustada, Yact= rendimiento del queso actual, Mact = fracción de humedad actual y Mest = fracción de humedad estándar (0.48) . El rendimiento del queso de humedad ajustada de todos los experimentos y controles se muestra en la tabla 1. Tabla 1 Tictanisn FcsiapaarTigcépcte'na Renfrrfenb efei que» ajustado a la ett3TT¾ag efe grasa humedad a???-itoccnei ccrtd Ccrtd 0 10.72 PLA2ds 0.055 11.04 29% T.etüvn Ccrtd 0 1125 28% FLA2cfe 0.055 1157 T.dtUtm Ccrtd 0 922 27% 10LtfeL£dasa® 0.18 9.48 Ccrtd 0 9.62 28% lOLcfeLec-asás) 0.18 9.90 Ejemplo 4: Clonación y expresión de una fosfolipasa (FvPLA.2) a partir de Fusarium venenatum en Aspergillus oryzae Células de Fusarium venenatum A3/5 (originalmente depositadas como Fusarium graminearum ATCC 20334 y recientemente reclasificadas como Fusarium venenatum por Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23:62-80; y O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23:57-67), se hicieron crecer por dos días en medio mínimo de Vogel (Davis, R. H. and F. J. de Serres (1970), Meth. Enzymol. 17A: 79-143) a 28°C en cultivo sacudido, filtrado en tela Miracloth estéril (Calbiochem, San Diego, California, USA) , y se transfirieron a "medio de esporulación RA" , en el cual fueron incubadas en cultivo sacudido por unas 24 horas adicionales a 28 °C. Las células y esporas fueron colectadas por centrifugación y lisado, se extrajo ARN y se transcribió en ADNc que fue clonado en pZErO-2 por los métodos descritos en el documento WO 00/56762. El número de clones independientes en esta biblioteca antes de la amplificación fue 2.5x105, del cual, 92% contiene insertos que varían en tamaño desde 550-2500 pb. Se determinaron las secuencias de ADN parciales por aproximadamente 1000 clones elegidos aleatoriamente y las secuencias fueron almacenadas en una base de datos por ordenador, por métodos descritos en el documento WO 00/56762. La secuencia de nucleótido de un ADNc que codifica TbSPl, una fosforilasa A2 de Tuber borchii, y la traducción del péptido correspondiente, fueron reportador por E. Soragni et al., 2001. Esta secuencia peptídica traducida se comparó con las traducciones de las secuencias de ADNc parciales de Fusarium venenatum, usando el programa TFASTXY, versión 3.3t08 (Pearson et al., 1997). Una secuencia traducida de F. venenatum se identificó por tener 42% de identidad a TbSPl a través de un traspale de 125 aminoácidos . La secuencia completa del inserto de ADNc del clon correspondiente, FM0700 se determinó y está presente como la SEC ID NO: 15, y el péptido traducido de esta secuencia, FvPLA2, se presenta como SEC ID NO: 16. Esta secuencia se usó para diseñar los cebadores FvPLAl, y FvPLA2.2 por amplificación de RCP del gen que codifica a FvPLA2 a partir de FM0700, con sitios de restricción apropiados agregados a los extremos cebadores para facilitar la sub-clonación del producto de RCP. FvPLAl : CTGGGATCCTCAAGATGAAGTTCAGCG FvPLA2.2 :GACCTCGAGACCCGCCATTTAAGATT Se realizó amplificación de RCP usando Extensor de Mezcla Principal de RCP de Alta Fidelidad (ABgene, Surrey, U.K), siguiendo las instrucciones del fabricante y usando una temperatura de templado de 52°C y una temperatura de extensión de 60°C por 20 ciclos. El fragmento de PCR fue restringido con BamHI y Xhol y clonado en el vector de expresión de Rspergillus pMStr57, usando técnicas estándares. El vector de expresión pMStr57 contiene los mismos elementos como pCaHj483 (documento WO 98/00529), con modificaciones menores hechas al promotor NA2 de Aspergillus, como se describe para el vector pMT2188 en el documento WO 01/12794, y tiene secuencias para selección y propagación en E. coli, y la selección y expresión en Aspergillus. Específicamente, la selección en Aspergillus es facilitada por el gen amdS de Aspergillus nidulans, el cual permite el uso de acetamida como una fuente de nitrógeno sola. La expresión en Aspergillus es mediada por un promotor de amilasa II neutral modificada (NA2) a partir de Aspergillus niger, el cual es fusionado a la secuencia líder al 5' del gen que codifica a fosfato isomerasa (tpi) a partir de Aspergillus nidulais, y el terminador a partir del gen que codifica a amiloglucosidasa a partir de Aspergillus niger. El gen que codifica a fosfolipasa del constructo de expresión de Aspergillus resultante, pMStr77, fue secuenciado y la secuencia agregada completamente con aquella determinada previamente por el inserto de FM0700. Se transformó la cepa Aspergillus oryzae BECh2 (documento WO 00/39322) con pMStr77 usando técnicas estándares (Christensen, T. et al., 1988) . Los transformantes fueron cultivados en medio YP+2 G sacudido a 275 RPM a 30°C y la expresión de FvPLA2, fue monitoreada por SDS-PAGE. Una cepa de Escherichia coli que contiene un gen que codifica la fosfolipasa a partir de F. venenatum, fue depositada por los inventores bajo los términos del Tratado de Budapest con Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder eg Ib, D- 38124 Braunschweig, Alemania. La fecha del depósito fue 12 de febrero de 2003, y el número de acceso fue DSM 15442. Ejemplo 5: Purificación y comparación de secuencia de FvPLA2 FvPLA2 a partir de la fermentación del ejemplo 4, se purificó por cromatografía de intercambio iónico en una columna SP-sepharose equilibrada con 50 mM de amortiguador de acetato a pH 4.7 y eluida con 1M de NaCl a pH 4.7. Las fracciones fueron analizadas en SDS-PAGE, y las fracciones que contienen una proteína de 14 kDa fueron combinadas. La identidad de la proteína pura se confirmó determinando la secuencia N-terminal, la cual fue idéntica a la secuencia del aminoácido (aa) 29-40 de la SEC ID NO: 16. Adicionalmente, la masa del péptido se determinó por análisis de espectro de masas, debido a que el tamaño aparente estimado de SDS-PAGE, 14 kDa, es más pequeño que aquél del péptido predicho por el procesamiento del péptido teórico en la SEC ID NO: 16. La masa de la FvPLA2 activa, purificada, se encontró por ser de 13336 Da. Esta masa molecular indica procesamiento terminal en el C-término y es consistente con un desdoblamiento entre los aminoácidos 149 y 150 en la SEC ID NO: 16, como el péptido de la secuencia de un aminoácido 29 a 149 tiene una masa teórica de 13335,66 Da.

Una comparación del péptido procesado maduro (aminoácidos 29-149 de la SEC ID N0:16), con las secuencias conocidas, muestra que la secuencia de la técnica anterior más cercana, fue una fosfolipasa a partir de Verticillium dahliae, traducida de la Unisecuencia ID.-VD0100C34 de la COGEME Base de datos EST Hongo Fitopatogénico y Oomiceto, Versión 1.2 (http://cogeme.ex.ac.uk/) (Soanes et al. (2002) Genomics of phytopathogenic fungi and the development of bioinformatic resources. Mol Plant Microbe Interact. 15 (5): 421-7). El procesamiento del péptido parcial predicho de la secuencia de V. dahliae fue estimado por comparación al procesamiento encontrado para FvPLA2. La identidad entre los aminoácidos 29 a 149 de la SEC ID NO: 16 y la secuencia estimada del péptido maduro de la fosfolipasa V. dahliae, se calculó por ser 77%. Ejemplo 6: Propiedades físicas de FvPLA2 Actividad catalítica La actividad de fosfolipasa como una función de la concentración enzimática, se determinó en el ensayo LEU para FvPLA2 del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la tabla 1. Tabla 1 Concentración enzimática foglml) LEU (µß? de NaOH/min) 71.1 14.0 53.3 12.7 21.3 10.6 10.7 7.4 5.3 5.6 2.7 4.1 Perfil de Temperatura La actividad enzimática como una función de la temperatura, se determinó por una solución enzimática con una concentración de 5.3 µ9 p?1. Otras condiciones como en el ensayo LEU. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Estabilidad de pH La enzima se diluyó en amortiguador Britton Robinson a el pH especificado por 30 minutos a 30 °C. Después de la dilución en agua, se midió la actividad catalítica en el ensayo LEU. Los resultados se muestran en la tabla 3.-Tabla 3.

Termoestabilidad La enzima se diluyó en amortiguador Britton Robinson a pH 3 y 10 respectivamente, y a pH 7 con sorbitol al 30%. Después de la incubación a la temperatura especificada por 30 minutos, la solución se enfrió a la temperatura de reacción y se analizó en el ensayo LEU. Los resultados se muestran en la tabla 4 ; las actividades se dan relativas a la actividad de medición más alta. Tabla 4 . Actividad relativa (%) como una función de pH y temperatura Ejemplo 7: Elaboración de queso con FvPLA2 Se usó crema no homogenizada, pasteurizada (Planta de Lácteos de la Universidad Estatal de Carolina del Norte) para estandarizar quinientos gramos de leche desnatada no homogenizada, pasteurizada (Planta Láctea de la Universidad Estatal de Carolina del Norte) con 3.5% de grasa, asi para producir queso mozzarella de pura crema. La leche de quesería para cada experimento se trató con ya sea con la fosfolipasa (FvPLA2) de F. venenatum preparada de conformidad con el ejemplo 5, o de la fosfolipasa comercial Lecitase® 10L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), y se colocó en un baño maría a 35 °C hasta que la temperatura se equilibró. El pH inicial de la leche de quesería se tomó y se agregó 0.01% (p/p) del cultivo de partida. El pH se monitoreo hasta que se alcanzó un pH de 6.4. Se diluyó 250 µ? de cuajo (Novozym 89L) en 9 mi de solución total con agua desionizada; se agregó un mi de esta solución a la leche de quesería y la leche de quesería se agitó vigorosamente por 3 minutos. La barra de agitación se movió y la leche recuajada se dejó asentarse a 35°C. Después de los tratamientos anteriores, el requesón se cortó fácilmente cuando se insertó una espátula y se observaron los bordes agudos. El queso se cortó empujando el cortador de forma descendente mientras se sostiene rápidamente el vaso volteando el cortador y finalmente sacando el cortador. El requesón se dejó reposar 5 minutos después se agitó suavemente con una cuchara. La temperatura se elevó a 41°C con agitación suave intermitente por -45 minutos o hasta que el pH bajo a 6.0-5.9. El requesón se filtró usando una gasa después se reemplazó en el vaso y se mantuvo a 41°C en agua mientras se vertió fuera del suero como se necesite. Cuando el requesón alcanzó pH 5.3, el tazón de acero inoxidable con el requesón se sumergió en un baño de agua a 69°C por 5 minutos, después se estiró con la mano. El requesón se templó en agua helada por 30 minutos. El requesón del queso se secó con papel absorbente, se pesó y refrigeró durante la noche . Se hicieron experimentos control de elaboración de queso a partir del mismo lote de leche siguiendo los mismos procedimientos excepto que no se agregó fosfolipasa. Se calculó el rendimiento de queso actual como el peso de queso después del estiramiento relativo al peso total de la leche de quesería. Se expresó el rendimiento de queso de humedad ajustada como el rendimiento actual ajustado al nivel constante estándar de humedad. Se calculó el rendimiento de humedad ajustada multiplicando el rendimiento actual y la relación de contenido de humedad actual para la humedad estándar, de conformidad con la siguiente fórmula: Yadj = Yact x (1-Mact) / (1-Mstd) en donde Yadj = rendimiento de queso de humedad ajustada, Yact = rendimiento de queso actual, Mact = fracción de humedad actual y std = fracción de humedad estándar (0.48) . El rendimiento de queso de humedad ajustada de todos los experimentos y controles se muestra en la tabla 5.

Tabla 5 Ejemplo 8: Elaboración de queso con FvPLA2 La leche se pasteurizó a 72 °C por 15 segundos y después se enfrió por debajo de 10°C. La leche se estandarizó a 2.4% de grasa con crema. Después de la estandarización la leche se precalentó en un intercambió de calor a una temperatura de pre-maduración de 34.5°C. Se vertieron 150 mg de leche en cada tanque de queso y se agregaron 15 g del cultivo (F-DVS ST-M6) . La fosfolipasa del ejemplo 5 se agregó en una dosificación de 5 LEU/g de grasa y la leche se incubó por 1 hora a 34.5°C. Se agregó el cuajo (Chy-Max Plus, 200 IMCU) y la agitación se continúo por no más de 4 minutos. Después de aproximadamente 60 minutos cuando el coágulo se juzgó preparado, se cortó usando un cuchillo de 10 mm. El agitador se regresó al vaso y después de 10 minutos, se hierve incrementando la temperatura a 41 °C dentro de 30 minutos. Después de alcanzar 41 °C, tomó lugar una agitación adicional por aproximadamente 20 minutos, hasta que una acidez valorable de 0.15-0.16% se alcanzó. El requesón se dejó asentar en el vaso, y el suero se drenó. El requesón se cortó en bloques uniformes y los bloques se voltearon y apilaron en dos. Subsecuentemente, en intervalos de 10 minutos, los bloques se voltearon y mantuvieron en pilas de dos . A un pH de aproximadamente 5.15-5.20, el requesón se molió en una máquina de molienda. Se agregaron dos por ciento de sal a las piezas de requesón (peso/peso) . Después de la molienda, todo el requesón, se agregó en el estirador, el cual contiene 70 1 de agua precalentada a 74 °C. Alrededor de 20 1 de agua caliente se transfirieron a la cámara superior y se agregó el queso. Cuando el requesón alcanzó una temperatura de 62 °C, el estiramiento se detuvo y el requesón se movió al extrusor. Los quesos se sometieron a extrusión en barras de 8-9 quesos, cada uno de 2.3 kg, y se enfriaron en agua a 5-7°C. Después de 20 minutos de enfriamiento, los quesos se movieron a la salmuera saturada y se agregó salmuera por 1.5 horas, a 5-6 °C. L salmuera se realizó mezclando 120 kg de agua, agregando sal a 22Be, 750 g de CaCl2 (solución al 34%) y ajustando a pH 5.1. Después de curar en- salmuera cada queso se secó por alrededor de 30 minutos- y se pesó antes del envasado a vacío. Las muestras se tomaron por pH y análisis composicional (humedad, sal, grasa y proteína) después de aproximadamente almacenaje por 1 semana a temperatura fría. Rendimiento actual (RA) se ajustó a humedad al 48% en el queso: Rendimiento Adj = RA, x (100 - % de humedad) 100 - 48 Tabla 6 Ejemplo 9: Sobre-expresión de PLA2 de Aspergillus oryzae (AoPLA2) en Aspergillus oryzae Medio DAP2C-1 11 g de MgS04»7H20 1 g de KH2P04 2 g de Monohidrato de ácido cítrico 30 g de maltodextrina 6 g de ?3?04·3?20 0.5 g de extracto de levadura 0.5 mi de rastros de solución de metales 1 mi de Pluronic PE 6100 (BASF, Ludwigshafen, Alemania) Los componentes se mezclaron en un litro de agua destilada y se dividieron en matraces, se agregó 250 mg de CaC03 a cada uno en 150 mi por porción. El medio se esterilizó en una autoclave. Después del enfriamiento, lo siguiente se agregó a 1 litro del medio: 23 mi (NH4)2HP04 al 50% p/v, filtro esterilizado 33 mi de ácido láctico al 20%, filtro esterilizado Restos de solución de metales 6.8 g de ZnCl2 2.5 g de CuS04»5H20 0.24 g de NiCl2»6H20 13.9 g de FeS04#7H20 8.45 g de nS04»H20 3 g de Monohidrato de ácido clorhídrico Los componentes se mezclaron en un litro de agua destilada. La clonación y se secuenciación parcial de ADNc que codifica una fosfolipasa A2 de Aspergillus oryzae se describe en el documento WO 00/56762. La secuencia completa del clon AS3812, se da en la SEC ID NO: 6. Esta secuencia se usó para designar el cebador AoPLAl para uso con el cebador vector pYESrev en amplificación de RCP del gen que codifica PLA2 de AS3812 con la adición de un sitio de restricción para sub-clonar el producto RCP: AoPLAl : TGAGGATCCATCATGAAGAACATCTTCG pYESre : gggcgtgaatgtaagcgtgac La amplificación de RCP se acompañó usando Extensor de Mezcla Principal de RCP de Alta Fidelidad (ABgene, Surrey, U.K.) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando una temperatura de recocido de 52 °C para los primeros 5 ciclos y 62 °C para los últimos 25 ciclos, y un tiempo de extensión de 1.5 minutos . El fragmento RCP se restringió con BamHI y Xhol y se clonó en el vector de expresión pMStr57 de Aspergillus (descrito en el Ejemplo 1) usando técnicas estándares. El gen que codifica la fosfolipasa del constructo de expresión de Aspergillus resultante pMStr71, se secuenció y la secuencia fue completamente contradictoria con aquella determinada previamente para el inserto de AS3812. La cepa BECh2 de Aspergillus oryzae (documento WÓ 00/39322) se transformó con pMStr71 usando técnicas estándares (T. Christensen et al., 1988). Se cultivaron los transformantes en medio DAP2C-1 agitado a 270 RPM a 37 °C por 4 días y la expresión de fosfolipasa se monitoreó por SDS-PAGE. Ejemplo 10: Purificación y determinación del procesamiento del péptido La fosfolipasa de Aspergillus oryzae de la fermentación del ejemplo 9 se filtró a través de filtro estéril Seitz-EKS de 20 µ obtenido de Pall Corporation (Pall SeitzSchenk Filter Systems GmbH Pianiger Str. 137 D-55543 Bad Kreuznach, Alemania) . La solución filtrada estéril después se ajustó a pH 4.7 usando ácido acético diluido. La fuerza iónica del sobrenadante de la fermentación después se ajustó de manera que la concentración de sal fue baja y la fuerza iónica está bajo 4 mSi. La purificación de la proteina PLA2 deseada se obtuvo por cromatografía de intercambio catiónico usando matriz de Flujo rápido de sefarosa SP obtenida de Amersham-Pharmacia (Suecia) . La matriz de intercambio catiónico fue pre-equilibrada y lavada envasada con 50 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 4.7 (Amortiguador A) en columna XK26 obtenida de Amersham Pharmacia. La fermentación del sobrenadante que contiene el PLA2 deseado se ajustó a pH y después se aplicó fuerza iónica en la columna. El material no unido después se lavó con el amortiguador A hasta que todo el material absorbente de UV se lavó, lo cual se monitoreó por detector UV unido al equipo colector de fracción. Las proteínas enlazadas después se eluyeron con un gradiente de sal lineal usando el Amortiguador B, el cual contiene 1M de cloruro de sodio como sal en 50 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 4.7. El volumen total del gradiente lineal que alcanzó una concentración de sal de 1M es de aproximadamente 500 mi (10 volúmenes en columna) . Las fracciones de 10 mi cada una se colectaron durante la elución. Todas las fracciones se sometieron a ensayo para determinar la actividad de fosfolipasa usando Lecitina como sustrato obtenido de Sigma chemicals . Los ácidos grasos liberados de Lecitina en incubación con la fosfolipasa se detectaron usando el kit NEFA C obtenido de Waco chemicals . Las f acciones que contienen actividad de fosfolipasa fueron entonces verificadas por pureza de la protelna usando la técnica SDS-PAGE estándar. Las fracciones se combinadas conteniendo una banda sencilla del PLA2 deseada que muestra el peso molecular de aproximadamente 16 kDa, como se determinó por comparación a estándares de peso molecular de Amersham-Pharmacia. La identidad de la proteína pura se confirmó determinando la secuencia N-terminal, la cual fue idéntica a la secuencia del aminoácido (aa) 37-47 de la SEC ID NO: 7. De manera adicional, la masa del péptido se determinó .por análisis espectral de masa. La PLA2 de Aspergillus activo, purificada, dio dos masas, 14114 y 14242 Da. Estas masas moleculares indican procesamiento adicional en el C-término, consistente con el desdoblamiento entre los aminoácidos 121 y 122 en la SEC ID NO: 7, como la secuencia peptídica del aminoácido 37 a 121 tiene una masa teórica de 14114.11 Da y un desdoblamiento entre los aminoácidos 122 y 123 , que predicen la secuencia peptídica a partir de un aminoácido 37 a 123 con una masa teórica de 14242.29 Da.

Ejemplo 11: Expresión de fosfolipasa incompletamente procesada a partir de Aspergillus oryzae y Fusarium venenatum El procesamiento de PLA2 de Aspergillus oryzae (AoPLA.2) y el PLA de Fusarium venenatum (FvPLA2) , ambas en el N- y C-término, ocurren en residuos básicos únicos o múltiples (lys o arg) , típicos de los sitios de desdoblamiento de maturasas como Kexina, las cuales a menudo son responsables de los procesamientos peptídicos (Jalving, R. , et al. (2000) Appl. Environ. icrobiol . 66:363-368) . Para determinar el efecto de procesamiento en la actividad de AoPLA2 y FvPLA2, las enzimas fueron expresadas en una cepa deficiente en Kexina de Aspergillus oryzae. El procesamiento entonces fue procesado por SDS-PAGE, y la actividad de fosforilasa se midió por los cultivos de cepas que expresan AoPLA2 y FvPLA2 en tanto antecedentes deficientes de Kexina como de tipo nativo. Una cepa deficiente de Kexina de Aspergillus oryzae (TexEf) se construyó por una interrupción del gen kexB de A. oryzae (EMBL :AB056727) por métodos establecidos en la técnica, tales como aquellos descritos en los documentos WO 98/12300 y US6013452. El rompimiento de JexB se confirmó por el análisis de manchado Southern y monitoreando la expresión de péptidos en donde iexB se conoce por ser el responsable de la maduración. La cepa ícexB" se transformó con el constructo de expresión AoPLA2 descrito en el Ejemplo 9, y con el constructo de expresión FvPLA2 descrito en el Ejemplo 4. Estas cepas fueron fermentadas en YP+2 G a 30°C, junto con las cepas de expresión kexB para tanto AoPAL2 como FvPLA2 descritos en los Ejemplos 9 y 4, y cepas no transformadas como controles. Las cepas que expresan AoPLA2 fueron sacudidas a 200RPM por 4 días, mientras las cepas que expresan FvPLA2 fueron sacudidas a 275RPM por 3 dias . La expresión de fosfolipasa y procesamientos fueron ensayados por SDS-PAGE. En análisis SDS-PAGE, se resolvió ApPLA2 como una banda distinta única en tanto cepas JexB+ como kexB~ . Cuando se expresa en la cepa kexB*, AoPLA2 corre a aproximadamente 16 kDA, consistente con la migración observada primeramente por la AoPLA2 completamente procesada (Ejemplo 10) , mientras en la cepa kex ', AoPLA2 corre a aproximadamente 27-28 kDa, consistente con una carencia de procesamiento o procesamiento incompleto. Cuando se expresa en la cepa kexB+, FvPLA2 se resuelve como dos bandas con pesos moleculares aparentes de 17 kDa y 14 kDa. La banda de 14kDa corresponde al péptido completamente procesado (Ejemplo 5) , mientras el péptido de 17kDa es una forma parcialmente procesada. Cuando se expresa en la cepa JcexB", FvPLA2 corre como una banda única a aproximadamente 18-19 kDA, un tamaño consistente con el procesamiento incompleto. No se observaron bandas similares en cualquiera de las muestras de control a partir de las cepas no transformadas. Las intensidades de bandas relativas sugieren que la expresión de AoPLA2 en la cepa kexB' fue 1/5 a 1/10 el nivel de aquel en la cepa kexB+, mientras la expresión de FvPLA2 en la cepa kexB' fue la misma a 1/2 el nivel de aquella en la cepa kexB* . La actividad de las fosfolxpasas producidas por cada cepa se determinó en el ensayo LEU y se muestra en la tabla 7. Tabla 7 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para producir una fosfolipasa el cual comprende procesar un péptido fúngico expresado, para desdoblar un péptido a partir del extremo C-terminal y/o un péptido a partir del extremo N-terminal para obtener un péptido nuclear con la actividad fosfolipasa, caracterizado porgue el péptido nuclear comprende a) la secuencia de aminoácido dada por los aminoácidos 146-153 de la SEC ID NO:l, aminoácidos 87-94 de la SEC ID NO: 3, o aminoácidos 79-86 de la SEC ID NO-.12, o una secuencia idéntica a cualquiera de estas secuencias de aminoácido, excepto para la sustitución de un aminoácido único con otro aminoácido; y d) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) ; y e) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) . 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido expresado es expresado en una célula hospedera fúngica filamentosa transformada con el ADN que codifica el péptido expresado.
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula hospedera es una de Aspergillus, Fusarium o Trichoderma, particularmente A. oryzae, A. niger, F. venenatum o T. reesei.
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el péptido expresado es procesado in vivo por la célula hospedera.
5. 5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el péptido nuclear tiene una longitud de 100-150 aminoácidos.
6. 6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la fosfolipasa tiene una actividad de fosfolipasa específica, la cual es al menos 2 veces la actividad del polipéptido expresado antes del procesamiento.
7. 7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el péptido expresado se deriva de Tuber, Verticillium, Neurospora, Aspergillus, o Helicosporum, particularmente T. borchii, T. albidum, V. dahliae, V. tenerum, N. crassa, A. oryzae, o Helicosporium sp. HN1.
8. 8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el péptido expresado es desdoblado dentro de 0-18 aminoácidos en el extremo N-terminal del alineamiento de secuencia con los aminoácidos 97-101 de la SEC ID NO:l, cuando la secuencia peptídica expresada completa es alineada simultáneamente con las secuencias dadas en las SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 5 , SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 12.
9. 9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el péptido expresado es desdoblado dentro de los aminoácidos 0-11 en el extremo C-terminal del alineamiento de secuencia con los aminoácidos 204-209 de la SEC ID NO:l, cuando la secuencia peptídica expresada completa es alineada simultáneamente con las secuencias dadas en las SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO:10 y SEC ID NO: 12.
10. 10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el péptido expresado es desdoblado dentro de los 10 aminoácidos de un sitio de procesamiento ex2 o dentro de 11 aminoácidos de una secuencia FG o ambas.
11. 11. Método para idrolizar un fosfolípido, caracterizado porque comprende poner en contacto el fosfolípido con una fosfolipasa producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. 12. Método para producir queso, que comprende poner en contacto leche de quesería o una fracción de leche de quesería con una fosfolipasa, caracterizado porque la fosfolipasaJ comprende : a) la secuencia de aminoácido dada por los aminoácidos 146-153 de la SEC ID N0:1, aminoácidos 87-94 de la SEC ID N0:3, o aminoácidos 79-86 de la SEC ID NO: 12, o una secuencia idéntica a cualquiera de estas secuencias de aminoácido, excepto por la sustitución de un aminoácido único con otro aminoácido; y b) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo N-terminal de la secuencia dada en a) ; y c) al menos dos residuos de cisteína ubicados en el extremo C-terminal de la secuencia dada en a) .
13. 13. Método para producir queso, caracterizado porque comprende poner en contacto leche de quesería o una fracción de leche de quesería con una fosfolipasa producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
14. 14. Fosfolipasa, caracterizada porque es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido la cual es al menos 80% idéntica con los aminoácidos 91-210 en la SEC ID NO:10 (G. alJidum) , aminoácidos 92-211 en la SEC ID N0:1 (G. borchii) , aminoácidos 30-137 en la SEC ID N0:12 (V. terzeruni) , aminoácidos 38-145 en la SEC ID NO: 3 (V. dahliae) , aminoácidos 44-151 en la SEC ID ?0:4' [N. crassa), amino ácidos 37-157 en la SEC ID NO: 7 [A: oryzae) , o aminoácidos 58-168 en la SEC ID NO: 8 (iV. crassa) .
15. 15. Fosfolipasa, caracterizada porque comprende: a) un polipéptido codificado por una fosfolipasa que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en el depósito número DSM 15442 de Escherichia col!; o b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 29 a 149 de la SEC ID NO: 19, o una secuencia de aminoácido la cual se puede obtener a partir de esta por sustitución, supresión y/o inserción de uno o más aminoácidos; o c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) el cual: i) tiene al menos 80% de homología con dicho polipéptido, o ii) es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo originado contra dicho polipéptido en la forma purificada, o iii) es una variante alélica de dicho polipéptido; o d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad con una hebra complementaria de la secuencia de ácido nucleico de los ácidos nucleicos 133 a 495 de la SEC ID NO: 15 que codifica el polipéptido maduro o una secuencia del mismo que tiene al menos, 100 nucleótidos .
16. 16. Fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque es nativa a una cepa de Fusarivm, particularmente F. venenatum.
17. 17. Secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica la fosfolipasa de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16.
18. 18. Secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende : a) la secuencia de ADN parcial que codifica una fosfolipasa madura clonada en un plásmido presente en DS 15442 de Escheric ia coli. b) la secuencia de ADN parcial que codifica una fosfolipasa madura de ácidos nucleicos 133 a 495 de la SEC ID NO: 15, c) un análogo de la secuencia definida en a) o b) , el cual codifica una fosfolipasa y i) tiene al menos 80% de homología con dicha secuencia de ADN, o ii) hibridiza a alta rigurosidad con una hebra complementaria de dicha secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma que tiene al menos, 100 nucleótidos, iii) es una variante alélica del mismo, o e) una hebra complementaria de a) , b) o c) .
19. 19. Constructo de ácido nucleico caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 17 o 18, operablemente ligadas a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la fosfolipasa en un hospedero de expresión adecuado.
20. 20. Vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, un promotor, y señales de detención transcripcionales y traduccionales .
21. 21. Célula hospedera recombinante, caracterizada porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20.
22. 22. Método para producir una fosfolipasa, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21, bajo condiciones que conducen a la producción de fosfolipasa y la recuperación de la fosfolipasa.
23. 23. Método para preparar una pasta o un producto horneado elaborado a partir de la pasta, caracterizado porque comprende agregar la fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15 a la pasta.
24. 24. Composición de pasta, caracterizada porque comprende la fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15.
25. 25. Composición detergente, caracterizada porque comprende un tensioactivo y la fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15.
26. 26. Proceso para reducir el contenido de fósforo en un aceite vegetal, caracterizado porque comprende poner en contacto el aceite con la fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15 en la presencia de agua, y después separar una fase acuosa del aceite .
27. 27. Proceso para producir queso, caracterizado porque comprende tratar una composición láctea con una fosfolipasa y producir queso a partir de la composición láctea, en donde la fosfolipasa es la fosfolipasa de conformidad con la reivindicación 15.
28. 28. Proceso para producir queso, caracterizado porque comprende tratar una composición láctea con una fosfolipasa y producir queso a partir de la composición láctea, en donde la fosfolipasa se selecciona del grupo que consiste de fosfolipasas PLA2 del' grupo XIII fúngico/bacteriano .