JP5189130B2 - ホスホリパーゼおよびそれを製造する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、リン脂質を加水分解する方法、ホスホリパーゼを製造する方法、チーズを作る方法、およびホスホリパーゼに関する。
Soragni E. 他 (2001) ENBO J. 20: 5079-5090には、チューバー・ボルキイ (Tuber borchii) からのホスホリパーゼ (TbSP1) およびそれをコードする遺伝子のcDNAのヌクレオチド配列が開示されている。下記のペプチド配列は示された源において発表され、示された源生物に由来する:
・ COGENE植物病原性真菌および卵菌網 (Oomycete) ESTデータベース、ユニシークエンス (Unisequence) ID: VD0100C34、ベルチシリウム・ダヒリアエ (Verticillium dahliae) 。
・ NCBIタンパク質データベース、gl: 18307435、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 。
・ NCBIタンパク質データベース、gl: 16519372、ヘリコスポリウム (Helicosporium) 種HN1。
・ WO 0056762、配列番号5954、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 。
・ TREMBLタンパク質データベース、EAA28927、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 。
米国特許第6,399,121号には、チーズ製造におけるホスホリパーゼの使用が開示されている。
本発明者らは、真菌グループXIIIホスホリパーゼA2についての既知の配列データを解析し、発表された配列から、または天然源からの関係する配列についてスクリーニングすることによって、追加の配列を同定した。真菌グループXIIIホスホリパーゼA2を適当な宿主生物中で発現させることによって、発現された配列がN-またはC-末端側、または両方においてペプチド配列に結合したコアペプチドから成ること、そして適当な宿主生物中の遺伝子の発現が発現されたペプチドを切断して、N-またはC-末端にペプチドのエクステンションをもたないコアペプチドを生成できることを発見した。
a) 配列番号1のアミノ酸146-153、配列番号3のアミノ酸87-94、または配列番号12のアミノ酸79-86により与えられるアミノ酸配列、または単一アミノ酸の他のアミノ酸による置換を除外してこれらのアミノ酸配列のいずれかと同一である配列、および
b) 上記a) に記載の配列のN-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基、および
c) 上記a) に記載の配列のC-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基、
を含んでなる、ホスホリパーゼを製造する方法を提供する。
最後に、本発明は、ある種の特定した配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるホスホリパーゼを提供する。
本発明において、発現された真菌ペプチドを使用し、このペプチドは下記の文献に記載されているグループ 「真菌グループXIIIホスホリパーゼA2」 の定義において使用されている活性部位配列の類似性およびシステイン残基の保存により規定されるグループに属する: Soragni E. 他 (2001) ENBO J. 20: 5079-5090。このペプチドは真菌性であり、これは、例えば、セイヨウショウロ (Tuber) 、ベルチシリウム (Verticillium) 、ニューロスポラ (Neurospora) 、ヘリコスポルム (Helicosporum) 、またはアスペルギルス (Aspergillus) 、特にチューバー・ボルキイ (T. borchii) 、チューバー・アルビヅム (T. albidum) 、ベルチシリウム・ダヒリアエ (V. dahliae) 、ベルチシリウム・テネルム (V. tenerum) 、ニューロスポラ・クラッサ (N. crassa) 、ヘリコスポリウム (Helicosporium) 種HN1、またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) に由来する。
いくつかの特定の例は、次のような配列のリストに記載されているアミノ酸配列を有する既知のペプチドである。
・ 配列番号1、チューバー・ボルキイ (Tuber borchii) 、Soragni E. 他 (2001) ENBO J. 20: 5079-5090。
・ 配列番号3、ベルチシリウム・ダヒリアエ (Verticillium dahliae) 、COGENE植物病原性真菌および卵菌網 (Oomycete) ESTデータベース、ユニシークエンス (Unisequence) ID: VD0100C34。
・ 配列番号4、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 、NCBIタンパク質データベース、gl: 18307435。
・ 配列番号5、ヘリコスポリウム (Helicosporium) 種HN1、NCBIタンパク質データベース、gl: 16519372。
・ 配列番号7、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 、WO 0056762、配列番号5954。
・ 配列番号8、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 、TREMBLタンパク質データベース、EAA28927。
・ 配列番号10、チューバー・アルビヅム (Tuber albidum) 。購入先: Centraalbureau voor Schimmelcultures、オランダ国ウトレヒト、単離物CBS272.72。
・ 配列番号12、ベルチシリウム・テネルム (Verticillium tenerum) 、アイルランド、1996。
配列のリスト中のホスホリパーゼ配列を解析することによって、本発明者らは、各発現されたアミノ酸配列が単一ペプチド、コアペプチド、およびさらにコアペプチドのC-またはN-末端、または両方に結合した機能が未知のペプチド配列から成ることを発見した。
コアペプチドは、真菌/細菌グループXIIIホスホリパーゼA2についてSoragni E. 他 (2001) ENBO J. 20: 5079-5090が観測した同一の活性部位配列の類似性およびシステイン残基保存により特徴づけられる。
本発明の好ましい態様において、コアペプチドは下記を含んでなる: a) 配列番号1のアミノ酸146-153、配列番号3のアミノ酸87-94、または配列番号12のアミノ酸79-86により与えられる配列、または単一アミノ酸の他のアミノ酸による置換を除外してこれらのアミノ酸配列のいずれかと同一である配列、およびb) 上記a) に記載の配列のN-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基、およびc) 上記a) に記載の配列のC-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基。
切断点はFGである配列の11アミノ酸内で、またはKex2部位である配列の10アミノ酸内で見出すことができる。Kex2部位は、例えば、RR、KR、KKまたはRKである。1つの態様において、コアペプチドは100〜150アミノ酸、例えば、110〜140アミノ酸、115〜133アミノ酸、116〜129アミノ酸、または118〜126アミノ酸の長さを有する。
糸状真菌宿主細胞は、例えば、下記の細胞であることができる: アクレモニウム (Acremonium) 、アスペルギルス (Aspergillus) 、フザリウム (Fusarium) 、フミコラ (Humicola) 、ミセリオフトラ (Myceliopthora) 、ニューロスポラ (Neurospora) 、ペニシリウム (Penicillium) 、リゾムコル (Rhizomucor) 、テルモマイセス (Thermomyces) 、チエラビア (Thielavia) 、トリポクラジウム (Tolypocladium) 、またはトリコデルマ (Trichoderma) 、特にアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・フェチヅス (A. foetidus) 、アスペルギルス・ジャポニカス (A. japonicus) 、アスペルギルス・ニヅランス (A. nidulans) 、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、
形質転換、培養、発現、回収は慣用法により、例えば、下記の文献に記載されている一般的方法により実施することができる: EP 238023、EP 305216、WO 9600787、EP 244234またはT. Christensen 他、Bio Technology Vol. 6、Dec. 1988、1419-22。
1つの態様において、本発明は、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドに関し、ここでポリペプチドは少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、なおより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも97%、なお最も好ましくは少なくとも98%、例えば、少なくとも99%の配列番号16 (すなわち、成熟ポリペプチド) のアミノ酸29〜149に対する同一度を有するアミノ酸配列を含んでなり、好ましくはから成る。
ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼをコードするDNA配列で適当な宿主細胞を形質転換し、その酵素の産生を可能とする条件下に形質転換された生物を培養し、そして培養物から酵素を回収することによって製造することができる。
ヌクレオチド配列は、デフォルト設定を使用してベクターNTIプログラムスイート7.0のAlignX適用で整列させることができる。この設定は変更されたClustalWアルゴリズム (Thompson J. D.、Higgins D. G. およびGibson T. J. (1994) Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680) 、swgapdnarntスコアマトリックス、15のギャップオープニングペナルティーおよび6.66のギャップエクステンションペナルティーを使用する。
任意のリン脂質、例えば、レシチン、セファリンまたはイノシチドの加水分解において、本発明を使用することができる。
本発明は、先行技術のプロセスと同様に、例えば、焼いた製品(WO 0032758、WO 9953769) 、マヨネーズ (GB 1525929、米国特許第4,034,124号) の製造、または植物油の処理 (米国特許第5,264,367号) においてホスホリパーゼを置換することによって、使用することができる。
本発明のホスホリパーゼは、ホスホリパーゼの種々の工業的用途において、例えば、後述するように使用することができる。
本発明のホスホリパーゼは、練り粉、パンおよびケーキの製造において、例えば、パンまたはケーキの弾性を改良するために使用できる。こうして、ホスホリパーゼは、それを練り粉の成分に添加し、練り粉を練り、そして練り粉を焼いてパンを製造することを含んでなる、パンを製造する方法において使用することができる。これは米国特許第4,567,056号またはWO 99/53769におけるようにして実施することができる。
変異型は洗剤添加剤として、例えば、0.001〜10 (例えば、0.01〜1) mg/gの洗剤または0.001〜100 (例えば、0.01〜10) mg/リットルの洗浄液の濃度 (純粋な酵素タンパク質として表して) で使用できる。
本発明のホスホリパーゼは、炭水化物由来の水性溶液またはスラリーをホスホリパーゼで処理することによってその濾過性を改良するために使用できる。これは特に澱粉加水分解物、ことにコムギ澱粉加水分解物を含有する溶液またはスラリーに適用可能である。なぜなら、これは濾過し、曇った濾液を得ることが困難である傾向があるからである。この処理はEP 219,269 (CPC International) と同様にして実施することができる。
さらに、本発明のホスホリパーゼは、ホスホリパーゼを飼料物質および少なくとも1種のリン脂質と混合することを含んでなる、動物飼料を製造する方法において使用できる。これはEP 743 017と同様にして実施できる。
本発明のホスホリパーゼは、米国特許第6,399,121号に記載されている方法と同様にして、チーズの製造に使用することができる。
本発明の好ましい態様において、チーズ乳またはチーズ乳の画分を本発明のホスホリパーゼと接触させ、そしてチーズ乳からチーズを製造することによって、チーズを製造する。
a) 配列番号1のアミノ酸146-153、配列番号3のアミノ酸87-94、または配列番号12のアミノ酸79-86により与えられる配列、または単一アミノ酸の他のアミノ酸による置換を除外してこれらのアミノ酸配列のいずれかと同一である配列、および
b) 上記 a) に記載の配列のN-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基、および
c) 上記 a) に記載の配列のC-末端側に位置する少なくとも2つのシステイン残基、
を含んでなる。
1つの面において、本発明は、乳製品組成物を本発明のホスホリパーゼで処理し、そして前記乳製品組成物からチーズを製造することを含んでなる、チーズを製造する方法に関する。
この出願は配列表の形態で情報を含有し、これはこの出願に添付され、また、この出願に付随するデータキャリアで提出される。さらに、この出願において、寄託された微生物が言及されている。このデータキャリアおよび寄託された微生物の内容は、完全に引用することによって本明細書の一部とされる。
下記の生物学的材料はブタベスト条約の規定に従い下記に寄託された: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen、ドイツ国ブラウンシュウェイグD-38124、マシェロデル・ウエグ1B、そして下記の受託番号が与えられた:
寄託物 受け入れ番号 寄託日
大腸菌 (E. coli) DSM 15441 2003年2月12日
大腸菌 (E. coli) DSM 15442 2003年2月12日
培地および基質
培地YP+2%G
10 gの酵母エキス
20 gのペプトン
1リットルとする水
121℃において20分間オートクレーブ処理する。
100 mlの20%の無菌グルコース溶液を添加する。
50 gのコハク酸
12.1 gの硝酸ナトリウム
1 gのグルコース
20 mlの50×ボーゲル塩類 (Vogel’s salts) (Davis R. H. およびF. J. de Serres (1970) Meth. Enzymol. 17A: 79-143)
成分を1リットルの蒸留水中でブレンドし、滅菌濾過する。
0.023 Mのリン酸
0.023 Mの酢酸
0.023 Mのホウ酸
NaOHまたはHClで滴定して必要なpHにする。
ホスホリパーゼ活性 (LEU)
レシチンを一定pHおよび温度において加水分解し、そしてホスホリパーゼ活性を遊離した脂肪酸の中和間の滴定剤 (0.1 N NaOH) の割合として決定する。
基質が大豆レシチン (L-α-ホスファチジル-コリン) であり、そして条件はpH 8.0、40.0℃、反応時間2分である。
Soragni 他 (前掲) に開示されているDNA配列を使用して、ゲノムDNAからのTbSP1のPCR増幅のためのプライマーをデザインし、適当な制限部位をプライマー末端に付加してPCR生成物 (配列番号13および14) のクローニングを促進した。チューバー・アルビヅム (Tuber albidum) 株、CBS 272.72はCBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures、オランダ国ウトレヒト) から入手し、そして培養物のリスト (1996) においてCBSが推奨するように、X-寒天上で20℃において培養した。菌糸体をプレート表面から除去し、製造業者の使用説明書に従い、FastDNA Spin Kit (BIO 101, Inc.、カリフォルニア州ヴィスタ) を使用して全DNAを単離した。
SDS-PAGEにより、約25 kDaおよび約16 kDaの分子量の2つのバンドが明らかにされた。50 mMの酢酸塩緩衝液と平衡化したSP-セファローズカラム上のイオン交換クロマトグラフィーにより、上清を精製し、1 MのHCl pH 5.0で溶離した。2つのタンパク質は2つの別々の画分で溶出した。タンパク質濃度をタンパク質アッセイ(Protein Assay) ESL (Roche) で測定した。活性をLEUアッセイにより測定した。
チューバー・アルビヅム (T. albidum) PLA2を産生する実施例1に記載するアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 形質転換体のほとんどの発酵において、酵素の2つの形態が精製間に検出された。1つの形態はSDS-PAGEにおいて22〜23 kDaにおいて展開し、Soragni 他 (前掲) により報告されたペプチドに対応する。さらに、新しい形態が検出され、これはSDS-PAGEにおいて16〜17 kDaで展開し、そして高い比活性および高い等電点を有する。
アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 中で発現されたチューバー・アルビヅム (T. albidum) からのホスホリパーゼを含有する発酵上清 (実施例1において調製された) を、EKSフィルター (購入先: Seltz Schenk Bad Kreuznach、ドイツ国ワルドステッテンD-73550、ベットリンゲストラッセ42) で滅菌濾過した。
次いで、滅菌濾過した上清をpH 8に調節し、イオン強度を4 mSi以下に調節した。
50 mlのFast flow Q TMセファローズカラム (購入先: Amersham Pharmacia) を使用するアニオン交換カラムにより、精製の第1工程を実施した。このカラムを50 MのTris酢酸塩緩衝液pH 8と前もって平衡化した。次いで滅菌濾過した発酵ブロスをこのカラムに適用し、すべての非結合物質が洗浄除去されるまで、カラムを同一緩衝液で洗浄した。
次いで活性を含有する画分をプールし、Novex Pre注型ゲル4〜20% Tris-グリシンゲル (購入先: Invitrogen Life Technologies、米国カリフォルニア州92008、カリスバッド) を使用するSDS-PAGE電気泳動により、分子量について特性決定した。
22〜23 kDaのタンパク質が検出され、これらをブロットし、そして配列決定装置 (Applied Biosystems) によりN-末端を解析した。
N-末端からの最初の19アミノ酸残基が決定され、配列番号10のアミノ酸32-50の配列を有することが見出された。
アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 中で発現されたチューバー・アルビヅム (T. albidum) ホスホリパーゼの滅菌濾過した発酵上清をpH 4.7に調節し、そしてイオン強度を4 mSi以下に調節した。
SP-sepharose TM 高速流をAmersham Pharmaciaから購入した。50 mlのカラムを充填し、50 mlの酢酸塩緩衝液pH 4.7に対して平衡化し、次いで発酵上清をカラムに適用し、そして同一緩衝液を使用して非結合物質を洗浄した。
次いで1 Mの塩化ナトリウムを含有する50 mMの酢酸塩緩衝液pH 4.7を使用する線形塩勾配で、pIが高い結合タンパク質を溶離した。分画および流速は、低いpI形態のホスホリパーゼに使用したものに類似した。前述したようにNEFAキットを使用して、画分中のホスホリパーゼ活性を定量的にアッセイした。ホスホリパーゼ活性を含有する画分をプールし、前述したように、SDS-PAGEを実施した。
タンパク質をブロットした後、配列決定装置 (Applied Biosystems) によりN-末端を解析し、これによりSoragni 他 (前掲) により報告されたものと完全に異なるN-末端を示された。こうして、チューバー・アルビヅム (T. albidum) PLA2は異なるN-末端のプロセシングから誘導される2つの形態を有することが見出され、N-末端配列は配列番号10のそれぞれアミノ酸86-105および91-110に対応する。
低温殺菌した、非均質化クリーム (North Carolina State University Dairy Plant) を使用して、500 gの低温殺菌した、非均質化スキムミルク (North Carolina State University Dairy Plant) を3.5%の脂肪に標準化し、こうして完全な脂肪のモッザレラ (mozzarella) チーズを製造した。各実験のためのチーズ乳を、実施例2に従い製造した16〜17 kDaのチューバー・アルビヅム (T. albidum) ホスホリパーゼ、または商業的ホスホリパーゼLecitase(商標)10L (Novozymes A/S、デンマーク国バグスバード) で処理し、35℃の水浴中に配置してその温度に平衡化した。チーズ乳の初期pHを測定し、そして0.01% (w/w) のスターター培養物を添加した。
ホスホリパーゼを添加しない以外同一手順に従い、同一バッチの乳から、対照チーズを製造する実験を実施した。
湿分の標準的レベルに調節した実際の収率として、湿分調節したチーズの収率を表した。下記の式に従い、実際の収率および実際の湿分/標準的湿分の比を掛けることによって、湿分調節した収率を計算した:
Y調節 = Y実際 × (1 - M実際) / (1 - M標準的)
ここでY調節 = 湿分調節したチーズ収率、Y実際 = 実際のチーズ収率、M実際 = 実際の湿分分数およびM標準的 = 標準的湿分分数 (0.48) 。
フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) A3/5の細胞 (本来フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum) ATCC 20334として寄託され、そして最近下記によりフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) として再分類された: YoderおよびChristianson、1998、Fungal Genetics and Biology 23: 62-80; およびO’Donnell 他、1998、Fungal Genetics and Biology 23: 57-67) を、ボーゲル(Vogel) 最小培地 (Davis R. H. およびF. J. de Serres (1970) Meth. Enzymol. 17A: 79-143) 中で28℃において震蘯培養により2日間増殖させ、無菌のミラクロス (Miracloth) (Calbiochem、米国カリフォルニア州サンディエゴ) 上で濾過し、 「RA胞子形成培地」 に移し、ここでそれらを震蘯培養により28℃においてさらに24時間インキュベートした。
FvPLA1: CTGGGATCCTCAAGATGAAGTTCAGCG
FvPLA2.2: GACCTCGAGACCCGCCATTTAAGATT
製造業者の使用説明書に従いExtensor Hi-Fidelity PCR Master Mix (Abgene、英国サレイ) を使用し、そして20サイクルについて52℃のアニリーング温度および60℃のエクステンション温度を使用して、PCR増幅を実施した。
フザリウム・ベネナツム (F. venenatum) からのホスホリパーゼをコードする遺伝子を含有する大腸菌 (Escherichia coil) の株はブタベスト条約の規定に従い下記に寄託された: Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen、ドイツ国ブラウンシュウェイグD-38124、マシェロデル・ウエグ1b。寄託日は2003年2月12日であり、そして受託番号はDSM 15442であった。
50 mlの酢酸塩緩衝液pH 4.7と平衡化したSP-セファローズ細胞上のイオン交換クロマトグラフィーにより、実施例4の発酵からのFvPLA2を精製し、そして1 MのNaCl pH 4.7で溶離した。画分をSDS-PAGEで分析し、そして14 kDaのタンパク質を含有する画分をプールした。純粋なタンパク質の同一性をN-末端配列の決定により確認し、これは配列番号16のアミノ酸 (aa) 29-40からの配列と同一であった。さらに、ペプチドの質量を質量分析により決定した。なぜなら、SDS-PAGEから推定された見掛けの大きさ14 kDaは、配列番号16における理論的ペプチドのプロセシングにより予測されるそれよりも小さいからである。精製された活性なFvPLA2の質量は13336 Daであることが見出された。この分子量はC-末端における追加のプロセシングを示し、配列番号16におけるアミノ酸29-149が13335.66 Daの理論的質量を有するので、149と150との間の切断と一致する。
触媒活性
実施例4のホスホリパーゼA2についてのLEUアッセイにより、酵素濃度の関数としてのホスホリパーゼ活性を決定した。結果を表3に示す。
5.3 μg/mlの濃度の酵素溶液について、温度の関数として酵素活性を測定した。結果を表4に示す。
酵素をブリットン・ロビンソン (Britton Robinson) 緩衝液中に特定したpHにおいて30℃で30分間希釈した。水中にさらに希釈した後、触媒活性をLEUアッセイにおいて測定した。結果を表5に示す。
酵素をブリットン・ロビンソン (Britton Robinson) 緩衝液中で、それぞれ、pH 3およびpH 10において、そして30%のソルビトールとともにpH 7において希釈した。特定した温度において30分間インキュベートした後、溶液を反応温度に冷却し、LEUアッセイにおいてアッセイした。結果を表6に示す。最高の測定された活性に関して、活性を記載する。
低温殺菌した、非均質化クリーム (North Carolina State University Dairy Plant) を使用して、500 gの低温殺菌した、非均質化スキムミルク (North Carolina State University Dairy Plant) を3.5%の脂肪に標準化し、こうして完全な脂肪のモッザレラ (mozzarella) チーズを製造した。
pH 6.4に到達するまで、pHをモニターした。250 μlのレンネット (Novozym 89L) を脱イオン水で9 mlの全溶液に希釈し、そしてチーズ乳を激しく3分間攪拌した。攪拌棒を除去し、そしてレンネット化乳を35℃において放置した。
ホスホリパーゼを添加しない以外同一手順に従い、同一バッチの乳から、対照チーズを製造する実験を実施した。
チーズ乳の全重量に関してストレッチ後の重量として、実際のチーズ収率を計算した。
湿分の標準的レベルに調節した実際の収率として、湿分調節したチーズの収率を表した。
Y調節 = Y実際 × (1 - M実際) / (1 - M標準的)
ここでY調節 = 湿分調節したチーズ収率、Y実際 = 実際のチーズ収率、M実際 = 実際の湿分分数およびM標準的 = 標準的湿分分数 (0.48) 。
すべての実験および対照の湿分調節チーズ収率を表7に示す。
乳を72℃において15秒間低温殺菌し、次いで10℃以下に冷却した。乳をクリームで2.4%の脂肪に標準化した。標準化した後、乳を熱交換器中で34.5℃の前熟成温度に予熱した。150 kgの乳を各チーズ大桶に注入し、15 gの培養物 (F-DVS ST-M6) を添加した。実施例5からのホスホリパーゼを5 LEU/gの脂肪の投与量で添加し、そして乳を34.5℃において1時間インキュベートした。レンネット (Chy-Max Plus、200 IMCU) を添加し、攪拌を4分以下の時間続けた。
実際の収量 (AY) チーズ中の48%の湿分に調節した:
調節収量 = AY × (100 - 湿分%) / (100-48)
培地
DAP2C-1
11 gのMgSO4・7H2O
1 gのKH2PO4
2 gのクエン酸、一水和物
30 gのマルトデキストリン
6 gのK3PO4・3H2O
0.5 gの酵母エキス
0.5 mlの微量金属溶液
1 mlのPluronic PE 6100 (BASF、ドイツ国ルドウィグシャフェン)
この培地をオートクレーブ中で滅菌する。冷却した後、下記の成分を1リットルの培地に添加する:
23 mlの50% w/vの(NH4)2PO4、濾過滅菌した
33 mlの20% 乳酸、濾過滅菌した
6.8 gのZnCl2
2.5 gのCuSO4・5H2O
0.24 gのNiCl2・6H2O
13.9 gのFeSO4・7H2O
8.45 gのMnSO4・H2O
3 gのクエン酸、一水和物
成分を1 リットルの脱イオン水中で配合する。
この配列を使用してプライマーAoPLA1をデザインした。このプライマーは、AS3812からのPLA2エンコーディング遺伝子のPCR増幅においてベクタープライマーpYESrevとともに使用し、制限部位を付加してPCR生成物のサブクローニングを促進した:
AoPLA1: TGAGGATCCATCATGAAGAACATCTTCG
PYESrev: gggcgtgaatgtaagcgtgac
実施例9の発酵からのアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) ホスホリパーゼを0.22 μの滅菌フィルターSeltz-EKS (購入先: Pall Corporation、Pall SeitzSchenk Filter Systems GmbH、ドイツ国バッド・クレウズナーハD-55543、ピアニゲルストラッセ137) に通して濾過した。次いで滅菌濾過した溶液を希薄酢酸でpH 4.7に調節した。次いで発酵上清のイオン強度を調節して、塩濃度を低くし、そしてイオン強度を4 mSi以下にした。SPセファローズ高速流マトリックス (購入先: Amersham-Pharmacia、スウェーデン国) を使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより、必要なPLA2タンパク質を精製した。
N-およびC-末端の両方におけるアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) PLA2 (AoPLA2) およびフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) PLA (FvPLA2) のプロセシングは単一または複数の塩基性残基 (lysまたはarg) において起こり、Kexin様マツラーゼの切断部位に典型的であり、これらはしばしばプロペプチドのプロセシングを原因とする (Jalving R. 他 (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 363-368) 。AoPLA2およびFvPLA2の活性に対するプロセシングの効果を決定するために、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) のKexin欠失株において酵素を発現させた。次いでプロセシングをSDS-PAGEで評価し、そして野生型およびKexin欠失バックグラウンドの両方においてAoPLA2およびFvPLA2を発現する株の培養物について、ホスホリパーゼ活性を測定した。
Claims (13)
- 下記のいずれかのポリペプチド:
(a)大腸菌 (Escherichia coil) 受託番号DSM 15442中に存在するプラスミド中にクローニングされたDNA配列のホスホリパーゼコード部分によりコードされたポリペプチド;あるいは
(b)配列番号16のアミノ酸29-149のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または
(c)配列番号16のアミノ酸29-149のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入により修飾されているアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;あるいは
(d)下記を満足する上記(a)または(b)に規定されるポリペプチドのアナローグ:
(i)前記ポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するか、または
(ii)前記ペプチドのアレレ変異型である;
を含んで成るホスホリパーゼ。 - フザリウム (Fusarium) の株、特にフザリウム・ベネナツム (F. venenatum) に対して生来的である、請求項1に記載のホスホリパーゼ。
- 請求項1または2に記載のホスホリパーゼをコードする核酸配列を含んでなる核酸。
- 下記の配列:
(a)大腸菌 (Escherichia coil) 受託番号DSM 15442中に存在するプラスミド中にクローニングされた成熟ホスホリパーゼをコードする部分的DNA配列;あるいは
(b)配列番号15の核酸133-495の成熟ホスホリパーゼをコードする部分的DNA配列;
(c)ホスホリパーゼをコードする上記(a)または(b)において規定された配列のアナローグ、前記アナローグは下記を満足する:
(i)前記DNA配列と少なくとも90%の同一性を有する、または
(ii)請求項1または2に記載のホスホリパーゼをコードする、または
(iii)それらのアレレ変異型である;あるいは
(d)上記(a)、(b)または(c)の相補的鎖;
を含んで成る核酸。 - 適当な発現宿主におけるホスホリパーゼの発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された請求項3または4に記載の核酸を含んでなる核酸構築物。
- 請求項5に記載の核酸構築物、プロモーター、および転写および翻訳の停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクター。
- 請求項5に記載の核酸構築物または請求項6に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
- ホスホリパーゼの産生を促進する条件下に請求項7に記載の宿主細胞を培養し、そしてホスホリパーゼを回収することを含んでなる、ホスホリパーゼを製造する方法。
- 請求項1又は2に記載のホスホリパーゼを練り粉に添加することを含んでなる、練り粉または練り粉から作られた焼かれた製品を製造する方法。
- 請求項1又は2に記載のホスホリパーゼを含んでなる練り粉組成物。
- 界面活性剤と、請求項1又は2に記載のホスホリパーゼとを含んでなる洗剤組成物。
- 水の存在下に植物油を請求項1又は2に記載のホスホリパーゼと接触させ、次いで水性相を油から分離する工程を含んでなる、植物油中のリン含有率を減少させる方法。
- 乳製品組成物をホスホリパーゼで処理し、そして前記乳製品組成物からチーズを製造することを含んでなり、ここでホスホリパーゼは請求項1又は2に記載のホスホリパーゼである、チーズの製造方法。
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