RU2005136868A

RU2005136868A - Фосфолипаза и способ ее получения

Info

Publication number: RU2005136868A
Application number: RU2005136868/13A
Authority: RU
Inventors: Мэри Энн СТРИНГЕР (DK); Мэри Энн СТРИНГЕР; Тине Муксолль ФАТУМ (DK); Тине Муксолль ФАТУМ; Шамкант Анант ПАТКАР (DK); Шамкант Анант ПАТКАР
Original assignee: Новозимс А/С (Dk); Новозимс А/С; Кр.Хансен А/С (Dk); Кр.Хансен А/С
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2006-05-27
Also published as: EP1620551B1; CA2522954C; AU2004234472B2; JP5189130B2; NZ542924A; NZ553115A; MXPA05011421A; CA2522954A1; JP2010172343A; EP1620551A2; AU2009200207A1; AU2004234472A1; DK1620551T3; AR044117A1; AU2009200207B2; WO2004097012A2; BRPI0409599A; JP2006524495A; RU2363731C2; PL1620551T3

Claims

1. Способ получения фосфолипазы, который включает процессинг экспрессированного грибного пептида, так что достигается отщепление пептида от С-терминального конца и/или пептида от N-терминального конца с образованием корового пептида, обладающего фосфолипазной активностью, где указанный коровый пептид включает

а) аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 146-153 в SEQ ID NO: 1, аминокислотами 87-94 в SEQ ID NO: 3, или аминокислотами 79-86 в SEQ ID NO: 12; или последовательность, идентичную любой из указанных аминокислотных последовательностей, за исключением замещения одной аминокислоты другой аминокислотой; и

b) по меньшей мере два цистеиновых остатка, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а); и

с) по меньшей мере два цистеиновых остатка, расположенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессированный пептид экспрессируется в клетке-хозяине нитевидного гриба, трансформированной ДНК, кодирующей экспрессированный пептид.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой Aspergillus, Fusarium или Trichoderma, предпочтиетльно A. oryzae, A. niger, F. venenatum или T. reesei.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что экспрессированный пептид подвергается процессированию in vivo в клетке-хозяине.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что коровый пептид имеет длину из 100-150 аминокислот.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная фосфолипаза обладает удельной фосфолипазной активностью, которая по меньшей мере в два раза превышает активность экспрессированного пептида до процессинга.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессированный пептид получают из Tuber, Verticillium, Neurospora, Aspergillus или Helicosporum, в частности T. borchii, T. albidum, V. dahliae, V. tenerum, N. crassa, A. oryzae или Helicosporum sp. HN1.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессируемый пептид расщепляют в пределах участка 0-18 аминокислоты на N-концевом участке последовательности, сравнимом с участком 97-101 аминокислот в SEQ ID NO: 1, когда полную последовательность экспрессированного пептида сравнивают одновременно с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессированный пептид расщепляют в пределах участка 0-11 аминокислоты на С-концевом участке последовательности, выровненном по аминокислотам 204-209 в SEQ ID NO: 1, когда полную последовательность экспрессированного пептида сравнивают одновременно с последовательностями, приведенными SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспресированный пептид расщепляют в пределах участка из 10 аминокислот, входящего в сайт процессинга Kex2, или внутри участка из 11 аминокислот в последовательности FG или на обоих указанных участках.

11. Способ гидролиза фосфолипида, включающий взаимодействие фосфолипида с фосфолипазой, получаемой согласно способу по любому из пп.1-10.

12. Способ изготовления сыра, включающий взаимодействие молока для сыроделия или фракции молока для сыроделия с фосфолипазой, где указанная фосфолипаза включает:

а) последовательность, представленную аминокислотами 146-153 аминокислоты в SEQ ID NO: 1, аминокислотами 87-94 в SEQ ID NO: 3, или аминокислотами 79-86 в SEQ ID NO: 12; или последовательность, идентичную любой из указанных аминокислотных последовательностей, за исключением замещения одной аминокислоты другой аминокислотой; и

b) два цистеиновых остатка, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а); и

с) два цистеиновых остатка, расположенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а).

13. Способ изготовления сыра, включающий взаимодействие молока для сыроделия или фракции молока для сыроделия с фосфолипазой, получаемой согласно способу по любому из пп.1-10.

14. Фосфолипаза, которая представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотам 91-210 в SEQ ID NO: 10 (T.albidum), аминокислотам 92-211 в SEQ ID NO: 1 (T. borchii), аминокислотам 30-137 в SEQ ID NO: 12 (V. tenerum), аминокислотам 38-145 в SEQ ID NO: 3 (V.dahliae), аминокислотам 44-151 в SEQ ID NO: 4 (N. crassa), аминокислотам 37-157 в SEQ ID NO: 7 (A oryza.), или аминокислотам 58-168 в SEQ ID NO: 8 (N. crassa).

15. Фосфолипаза, которая включает

а) полипептид, кодируемый частью последовательности ДНК, кодирующей фосфолипазу, клонированной в плазмиде, которая присутствует в Escherichia coli, депонированной под номером DSM 15442; или

b) полипептид, включающий аминокислотную последовательность из аминокислот 29-149 в SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая может быть получена из нее путем замещения, делеции и/или вставки одной или нескольких аминокислот, или

с) аналог полипептида, определенного в пунктах a) или b), который

i) обладает по меньшей мере 80% гомологией с данным полипептидом или

ii) иммунологически реактивен с антителом, образуемым против данного полипептида в очищенной форме, или

iii) является аллельным вариантом указанного полипептида;

или

d) полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях низкой строгости с комплементарной цепью последовательности нуклеиновой кислоты на участке нуклеотидов 133-495 в SEQ ID NO: 15, кодирующей зрелый полипептид, или ее подпоследовательностью, включающей по меньшей мере 100 нуклеотидов.

16. Фосфолипаза по п.15, которая является нативной для штамма Fusarium, в особенности F. venenatum.

17. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фосфолипазу по п.15.

18. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая включает

а) частичную последовательность ДНК, кодирующую зрелый полипептид, клонированную в плазмиде, присутствующей в Escherichia coli DSM 15442;

b) частичную последовательность ДНК, кодирующую зрелую фосфолипазу, на участке нуклеотидов 133-495 в SEQ ID NO: 15,

с) аналог последовательности, определенной в а) или b), которая кодирует фосфолипазу, и

i) обладает по меньшей мере 80% гомологией с указанной последовательностью ДНК или

ii) гибридизируется в условиях высокой строгости с комплементарной цепью данной последовательности ДНК или ее подпоследовательностью, включающей по меньшей мере 100 нуклеотидов,

iii) является ее аллельным вариантом или

d) цепь, комплементарную a), b) или с).

19. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты по п.17 или 18, оперативно связанную с одной или несколькими управляющими последовательностями, способными управлять экспрессией фосфолипазы в соответствующем организме-хозяине, где происходит экспрессия.

20. Рекомбинантный вектор экспрессии, включающий конструкцию нуклеиновой кислоты по п.19, промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции.

21. Рекомбинантная клетка-хозяин, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты по п.20.

22. Способ получения фосфолипазы, включающий культивирование клетки-хозяина по п.21 в условиях, подходящих для продукции фосфолипазы и выделения фосфолипазы.

23. Способ изготовления теста и хлебобулочных продуктов, получаемых из теста, включающий добавление фосфолипазы по п.15 к тесту.

24. Композиция теста, включающая фосфолипазу по п.15.

25. Детергентная композиция, включающая поверхностно-активное вещество и фосфолипазу по п.15.

26. Способ снижения содержания фосфора в растительном масле, включающий взаимодействие масла с фосфолипазой по п.15 в присутствии воды с последующим отделением водной фазы от масла.

27. Способ изготовления сыра, включающий обработку молочной композиции фосфолипазой и получение сыра из молочной композиции, где указанная фосфолипаза представляет собой фосфолипазу по п.15.

28. Способ изготовления сыра, включающий обработку молочной композиции фосфолипазой и получение сыра из молочной композиции, где указанную фосфолипазу выбирают из группы XIII грибных/бактериальных фосфолипаз PLA2.