KR101696974B1 - 열 안정성이 우수한 저온성 단백질 분해효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저온성 단백질 분해효소, 상기 효소를 코딩하는 Q1M2 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 저온성 단백질 분해효소의 제조 방법, 및 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 세제 조성물, 식품 처리용 조성물에 관한 것으로, 상기 저온성 단백질 분해효소는 저온에서 높은 활성을 나타내는 동시에 장기간 및 고온 보관 시에도 효소의 활성을 유지하여 열안정성이 우수하며, 용이하게 생산할 수 있다.

Description

열 안정성이 우수한 저온성 단백질 분해효소 {Thermo-stabilized psychrophilic protease}

본 발명은 저온성 단백질 분해효소, 상기 효소를 코딩하는 Q1M2 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 저온성 단백질 분해효소의 제조 방법, 및 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 직물 세탁 또는 식기 세정용 세제 조성물, 식품 처리용 조성물에 관한 것이다.

단백질 분해효소(protease)는 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소군의 총칭이다. 단백질 분해효소는 총 산업 효소 시장의 약 60%를 차지하고 있으며, 세제 산업, 식품 산업, 정육 및 가죽 산업, 콘택트 렌즈 세정제, 목욕용제, 인체용 세정제, 각질 제거용 화장료, 사진필름의 젤라틴 제거제, 양조 시 첨가제 그리고 인간과 동물의 소화 보조제 등의 다양한 영역에 사용된다(Rao, M.B. 외, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, 62, 597-635).

일반적으로 효소는 상온, 중성 pH, 상압 등의 반응조건에서 높은 촉매활성을 발휘하나, 한편, 극지, 해양 등 저온에서 생존할 수 있는 생물에서 유래된 저온성 단백질 분해효소는 상온 25℃ 이하, 심지어 0℃ 저온에서도 높은 단백질 분해 활성을 나타내므로(Dockyu Kim 외, The Korean Journal of Microbiology, 2010, 46(1), 73-79), 저온 환경에서 단백질분해가 필요한 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 한국공개특허 제2010-0086303호는 퓨조박테리아(Fusobacteria sp.)에 속하는 저온성 박테리아 균주에서 유래한 저온성 단백질 분해효소를 기재하고 있다.

최근 강조되는 에너지 절약 트랜드로 인해 점차 저온성 효소의 필요성이 커지고 있으나, 50℃ 이상 온도에서 최적활성을 나타내는 고온성 효소와는 달리, 대부분의 저온성 효소는 효소 자체의 열역학적 안정성이 낮다. 따라서, 대량생산이 어려우며, 보관온도, 유통환경, 사용기간 등에 따라 쉽게 불활성화되어 실제 사용 시점에서 효소 활성이 감소하는 문제가 있다. 따라서 이러한 문제점을 개선한 저온 활성의 효소가 여전히 요구되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존의 저온 활성은 유지하면서 열안정성이 우수한 단백질 분해 효소를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 야생형 단백질 분해 효소 Q1wt를 변이시킨 단백질 분해 효소 Q1M2가 우수한 저온 활성을 나타내고, 야생형에 비해 장기간 및 고온 보관 시에도 활성이 유지되며, 재조합 미생물을 이용하여 이를 용이하게 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 효소를 코딩하는 Q1M2 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 저온성 단백질 분해효소의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 직물 세탁 또는 식기 세정용 세제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 식품 처리용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2를 제공한다.

이하, 본 발명에서의 저온성 단백질 분해효소를 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 해양박테리아인 슈도알테로모나스 Q-1 (Pseudoalteromonas Q-1)유래의 단백질 분해효소(단백질 ID: D7RAE7)의 아미노산 서열 중 프로펩티드 서열 및 촉매 도메인으로 예상되는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 위치 393 내지 395의 아미노산인 티로신(Y)-세린(S)-글루타민(Q)을 알라닌(A)-라이신(K)-세린(S)으로 치환하여 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분해효소를 제작하여 그 활성을 확인한 결과, 상기 단백질 분해효소는 저온에서 우수한 단백질 분해 활성을 나타냄과 동시에, 장기간 또는 높은 온도에서 보관하더라도 효소의 안정성이 유지됨을 확인하였다.

본 발명의 저온성 단백질 분해효소 Q1M2는 저온에서 우수한 단백질 분해 활성을 나타내는 단백질 분해효소를 의미한다. 상기 저온은 상온 이하의 온도를 의미할 수 있으며, 일 예로 25℃ 이하의 온도를 의미할 수 있다.

본 발명의 저온성 단백질 분해효소 Q1M2는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열에서 위치 393 내지 395의 아미노산인 티로신(Y)-세린(S)-글루타민(Q)이 알라닌(A)-라이신(K)-세린(S)으로 치환된 단백질인 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 저온성 단백질 분해효소 Q1M2는 서열번호 5의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 일 예로 90% 이상, 다른 일 예로 95% 이상, 또 다른 일 예로 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 저온 활성을 나타내며 장기간 또는 높은 온도에서 보관하더라도 효소의 안정성이 유지되는 단백질이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 5의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(Sambrook et al., 1989, Infra), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

상기 저온성 단백질 분해효소는 5 ℃ 내지 25 ℃에서 가장 높은 활성을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명자들은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 저온성 단백질 분해효소가 저온에서 우수한 효소 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 2, 도 1). 일 예로, 상기 저온성 단백질 분해효소는 10℃ 내지 25 ℃에서 가장 높은 활성을 나타내는 것일 수 있다.

또한, 상기 저온성 단백질 분해효소는 0 ℃ 내지 40℃에서 효소의 활성을 유지하는 것일 수 있다. 본 발명자들은, 야생형의 저온성 단백질 분해효소가 20 ℃ 이상의 온도에서 급격하게 효소 안정성이 낮아지는 것과 달리, 본 발명의 저온성 단백질 분해효소는 40 ℃까지 효소의 안정성이 70% 이상으로 유지되어, 우수한 열 안정성을 가짐을 확인하였다(실험예 3, 도 3).

또한, 상기 저온성 단백질 분해효소는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 분해효소에 비하여 저장 안정성이 개선된 것일 수 있다. 일 예로 0℃ 내지 30℃의 온도에서 5시간 이상의 보관시간 동안 효소활성을 유지하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 야생형의 저온성 단백질 분해효소가 1시간 이후부터 급격하게 효소 안정성이 낮아지는 것과 달리, 본 발명의 저온성 단백질 분해효소는 0℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 5시간까지 효소의 안정성을 100% 유지하여, 장기 보관성이 우수함을 확인하였다(실험예 3, 도 2).

본 발명은 다른 양태로서, 상기 효소를 코딩하는 Q1M2 유전자를 제공한다. 상기 Q1M2 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 의미한다.

상기 유전자는 일 예로 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 다른 일 예로 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 유전자는 형질전환체에 코돈 최적화된 것일 수 있다. 상기 코돈 최적화는, 숙주에서의 상기 유전자의 발현을 보다 효율적으로 하기 위하여 유전자의 코돈을 상기 숙주 유전자에서 높은 빈도로 사용되는 코돈으로 치환하는 것을 의미한다. 최적화를 위한 방법은 당업계에서 형질전환체에서의 단백질 발현을 증가시키기 위하여 사용되는 방법이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다.

상기 유전자는 일 예로 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열과 70% 이상의 상동성을 가지며, 본 발명의 저온성 단백질 분해 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 다른 일 예로 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열과 80% 또는 85% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 유전자는 서열번호 8 또는 10의 염기서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 일 예로 상기 발현벡터는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 다른 일 예로 상기 발현벡터는 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될수 있다.

본 발명에서 사용되는 발현 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pET계, pMAL계 또는 pHT계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pMAL-p2x 또는 pHT43 벡터 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

상기 형질전환체는 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터가 도입되어 본 발명의 저온성 단백질 분해효소를 발현할 수 있는 한 제한되지 않는다. 예를 들어 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속(Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다.

일 예로 대장균 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바실러스 균주 기반의 단백질 분비 발현 시스템은 생산균주의 안정성, 재조합 단백질의 안정적 발현, 단백질 생산량, 재조합 단백질의 세포 외 분비로 인한 정제 효율성 등 기술적, 경제적 장점이 많아, 상업용 효소 생산 시에 자주 이용되는 발현 시스템이다. 본 발명의 구체적인 일 실시양태에서는, 바실러스 서브틸리스에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환한 결과, 본 발명의 저온성 단백질 분해효소의 발현량을 향상시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 4, 도 4).

상기 형질전환체는 일 예로 발현한 저온성 단백질 분해효소를 분비할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 저온성 단백질 분해효소를 대장균과 바실러스 균주 기반의 분비 및 발현 시스템에서 발현시켜 별도의 분리과정 없이 생산할 수 있음을 확인하였으며(실험예 1, 실험예 4), 생산된 저온성 단백질 분해효소가 저온 활성 및 장기간, 고온 보관성이 높으면서도 생산 및 회수가 용이함을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 형질전환된 대장균을 KCTC 한국미생물자원센터에 2014년 8월 14일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12652BP 를 부여받았다.

또한, 본 발명자들은 형질전환된 바실러스 서브틸리스를 KCTC 한국미생물자원센터에 2014년 8월 14일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12653BP 를 부여받았다.

따라서, 상기 형질전환체는 수탁번호 KCTC 12652BP의 대장균, 또는 수탁번호 KCTC 12653BP 의 바실러스 서브틸리스일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 저온성 단백질 분해효소의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 배양된 형질전환체에서 저온성 단백질 분해효소를 분리하여 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 및 정제하는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 직물 세탁 또는 식기 세정용 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 저온성 단백질 분해효소는 상기한 것과 같다.

본 발명의 저온성 단백질 분해효소는 저온에서 활성이 높게 나타남을 확인하였는바, 저온의 물을 사용하는 세탁기, 식기세척기 등에서 의류 또는 피혁을 포함한 직물, 도자기류를 포함한 식기를 세척하는 세제의 일 성분으로 유용하게 사용할 수 있다. 이 경우 세척온도를 낮춤으로써 에너지 소비를 감소시킬 수 있다.

상기 저온성 단백질 분해효소는 전체 조성물 총 중량의 0.001 중량% 내지 10중량%으로 포함되는 것일 수 있으며, 일 예로 0.001 중량% 내지 5중량%, 다른 일 예로 0.001 중량% 내지 3중량%, 또는 0.001 중량% 내지 1중량%로 포함될 수 있다. 0.001 중량% 미만으로 포함할 경우 원하는 세척 또는 세탁 효과를 얻기 어려울 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 식품 처리용 조성물을 제공한다.

상기 식품은 저온 또는 0 ℃이하의 온도에서 보관되는 것일 수 있다.

상기 식품 처리용 조성물은 빵, 육류, 생선을 포함한 수산물을 개질하거나 연화시켜 맛을 개선시키는 것일 수 있다. 또한 치즈의 숙성, 유제품 생산에 사용하는 것일 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 저온성 단백질 분해효소를 포함하는 화학공정상의 저온반응 촉매용 조성물, 또는 의약품 저온 처리용 조성물을 제공한다. 특히 상기 효소는 상온에서 휘발성인 유기용매의 화학반응을 저온에서 일으키는데 사용되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 저온성 단백질 분해효소는 저온에서 우수한 활성을 나타냄과 동시에, 야생형 분해효소에 비하여 열 안정성이 우수하여 고온에서 장기간 보관하더라도 효소 활성이 유지될 수 있으며, 그 생산 및 회수가 용이한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 단백질 분해효소 Q1M2, 야생형 단백질 분해효소 Q1wt, 대조군인 사비나제의 온도별 효소 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 단백질 분해효소 Q1M2, 야생형 단백질 분해효소 Q1wt, 대조군인 사비나제의 보관시간 경과에 따른 효소 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 단백질 분해효소 Q1M2, 야생형 단백질 분해효소 Q1wt, 대조군인 사비나제의 보관온도 상승에 따른 효소 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 균주 시스템에서 발현된 본 발명의 단백질 분해효소 Q1M2, 야생형 단백질 분해효소 Q1wt, 음성 대조군인 효소가 없는 벡터를 도입한 효소 미발현 균주 배양물의 효소 활성을 배양 시간 경과에 따라 나타낸 것으로, y축은 효소에 의해 AAPF분해 후 증가한 p-nitroanilide의 흡광도(410nm) 값을 의미한다.
도 5는 SDS-PAGE를 통해 본 발명의 단백질 분해효소 Q1M2의 단백질 크기를 확인하여 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 슈도알테로모나스 Q-1 유래 단백질 분해효소 유전자의 확보

저온성 단백질 분해효소의 서열을 확보하기 위하여, 기존에 보고된 슈도알테로모나스 Q-1 유래의 효소 아미노산 서열(단백질 ID: D7RAE7) 에서, N말단 27개 아미노산으로 된 시그널 펩티드(signal peptide) 서열과, 기능이 밝혀지지 않은 C말단 185개 아미노산 서열을 제외하고 단백질 분해효소의 프로펩티드(propeptide) 서열 및 촉매(catalytic) 도메인으로 예상되는 미성숙 (premature) 496개 아미노산 서열 (이하 'Q1wt'이라 함, 서열번호 1)을 선택하였다.

상기 Q1wt의 효소를 대장균에서 발현하기 위하여, 미국 진스크립트(GenScript)의 유전자합성 서비스를 활용하여 상기 Q1wt 서열을 대장균 전사 코돈에 최적화된 유전자 서열(서열번호 2)로 신규 합성하여 효소 유전자를 확보하였다.

그 후, NEB사의 중합효소(Phusion High-Fidelity polymerase) 2 유닛(unit), 반응 버퍼와 디뉴클레오타이드 (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 각 0.2mM, 합성 유전자 Q1wt 단편 100pg, 하기 서열번호 3과 서열번호 4의 PCR 프라이머 각 0.5μM로 총 50㎕ 부피 조성을 맞춘 뒤, '95℃ 4분' 1회, '95℃ 30초, 55℃ 15초, 72℃ 2분'으로 25회, '72℃ 5분' 1회를 조건으로 PCR 반응을 진행하여 상기 합성된 유전자를 증폭하였다.

효소 유전자 대장균 벡터 클로닝용 전방향 프라이머

AATAGGATCCCAAAGCGTTAGTAGCAGCATGGCA - 서열번호 3

효소 유전자 대장균 벡터 클로닝용 역방향 프라이머

AATAGTCGACTTATGCACCGCTTGGAACTGTCATTG - 서열번호 4

상기 증폭된 유전자를 NEB에서 구입한 제한효소 BamHI과 SalI을 이용하여 대장균 발현벡터 pMAL-p2x에 도입시켰고, 대장균 XL1-blue에 형질전환하여 저온성 단백질 분해효소의 대장균 발현시스템 (Q1wt/pMAL-p2x/E. coli XL1-blue)을 구축하였다.

실시예 2: 재조합 변이 효소 제작

상기 Q1wt (서열번호 1)의 아미노산 서열에서, 393~395 위치의 YSQ 서열을 AKS 서열로 대체한 변이 효소 Q1M2 (서열번호 5)를 설계하였다. 변이 효소 Q1M2의 유전자 제조를 위한 PCR 반응 조건은, 프라이머 서열을 제외하고는 실시예 1와 동일하게 하였다. 구체적으로, 서열번호 3과 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 변이위치를 포함한 N말단 단편(1~401)을 PCR 증폭하고, 서열번호 4와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 변이위치를 포함한 C말단 단편(387~496) 을 PCR 증폭하였다. 그 후, 각각 증폭된 양 단편 유전자를 PCR 주형으로 하여 전체 길이로 연결하는 어셈플리 PCR(Assembly PCR)법을 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 수행하여 변이 효소 Q1M2 전체를 코딩하는 유전자 서열 (서열번호 8)을 제작하였다.

돌연변이 도입용 전방향 프라이머

CTTCATCGGATAGCTACGGTGCAAAGAGCGGTACGAGCATGGCCGCACC - 서열번호 6

돌연변이 도입용 역방향 프라이머

GGTGCGGCCATGCTCGTACCGCTCTTTGCACCGTAGCTATCCGATGAAG - 서열번호 7

이 후, 실시예 1과 동일하게 상기 증폭된 유전자에 제한효소 BamHI과 SalI을 처리한 후, pMAL-p2x 발현벡터 및 대장균 XL1-blue 균주에 순차적으로 도입하여 변이 효소 발현 재조합 대장균 균주(Q1M2/pMAL-p2x/E. coli XL1-blue)를 제작하였다.

실험예 1: 대장균 발현 시스템에서의 변이효소의 발현 및 분비

①실시예 1의 Q1wt이 도입된 재조합 대장균 (Q1wt/pMAL-p2x/E. coli XL1-blue), ②실시예 2의 변이 효소 Q1M2이 도입된 재조합 대장균 (Q1M2/pMAL-p2x/E. coli XL1-blue), 그리고 ③음성 대조군으로서 효소가 삽입되지 않은 공벡터 pMAL-p2x만 가진 재조합 대장균 (pMAL-p2x/E. coli XL1-blue)에 대하여 하기의 실험을 진행하였다.

먼저 각 대장균을 100㎍/㎖의 카르베니실린(Carbenicillin)이 포함된 멸균된 LB 액체배지 100㎖가 들어있는 500㎖ 삼각플라스크에서, 온도 37℃, 교반속도 190rpm으로 각각 배양하였다. 그 후, 600nm 파장에서의 흡광도 값이 0.4가 될 때 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 0.5mM을 배지에 추가한 뒤, 18℃ 저온에서, 교반속도 190rpm으로 24시간 더 배양하여 효소를 발현하였다. 배양이 완료된 재조합 대장균은 원심분리를 통해 배양액과 분리시켰다. 분리된 대장균을 100mM Tris-HCl pH 8.0 버퍼에 적정 농도로 희석한 뒤, 초음파분쇄기를 이용하여 대장균 균주를 파쇄 후 원심분리하여, 발현된 효소가 포함된 상등액(cytosolic soluble fraction)을 분리, 제조하였다.

효소의 발현 여부는, 100mM 포타슘 포스페이트(potassium phosphate) pH 8.0 버퍼 945㎕, 100mM AAPF (N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide) 용액 5㎕, 효소용액 50㎕를 섞어 1㎖의 반응액을 제조하고, 상기 반응액을 20℃에서 각 30분간 반응시켜, 분해기질인 AAPF가 분해되어 생산되는 p-나이트로아닐라이드(p-nitroanilide)의 흡광도를 410nm 파장에서 측정하여 정량하였다.

그 결과, 야생형 단백질 분해효소인 Q1wt가 도입된 대장균과, 변이 효소 Q1M2를 도입한 대장균으로부터 얻은 반응액에서는 단백질 분해활성을 확인하였고, 효소가 포함되지 않은 공벡터를 도입한 대장균으로부터 얻은 반응액에서는 단백질 분해활성이 나타나지 않았다.

한편, 상기 상등액을 이용하여 단백질 전기영동(PAGE)을 수행한 결과, 야생형 단백질 분해효소인 Q1wt, 또는 변이 효소 Q1M2를 도입한 대장균의 경우, 대조군인 공벡터를 도입한 대장균과 비교할 때, 효소로서 추정되는 밴드를 확인할 수 없었다. 이를 통해, 대장균 발현 시스템을 활용하여 재조합 변이 효소 Q1M2를 발현 시킬 경우, 발현량이 매우 약하며 효소 활성 정도의 측정만이 가능함을 확인하였다.

실험예 2: 변이 효소 Q1M2 의 저온활성 검증

상기 실험예 1에서 발현된 효소의 활성을 동일한 방법으로 0℃ 내지 60℃의 여러 온도에서, 30분 간 반응시켜 측정하였다. 이 때, 고온성 세탁효소인 노보자임스(Novozymes)사의 사비나제(Savinase® 12T Green)를 100mM Tris-HCl pH8.0 버퍼에 0.001%(w/v) 농도로 녹인 사비나제 용액을 대조군으로 사용하였다. 측정된 흡광도 값은 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

온도 ℃	0 ℃	10 ℃	20 ℃	30 ℃	40 ℃	50 ℃	60 ℃
Q1wt	0.2756	0.4334	0.2916	0.1695	0.0899	0.0874	0.0808
	(64%)	(100%)	(67%)	(39%)	(21%)	(20%)	(19%)
Q1M2	0.9747	1.7147	2.2654	0.7699	0.3886	0.3508	0.3071
	(43%)	(76%)	(100%)	(34%)	(17%)	(15%)	(14%)
Savinase	0.0334	0.0939	0.2602	0.6558	1.3051	1.7004	1.1464
	(2%)	(6%)	(15%)	(39%)	(77%)	(100%)	(67%)

(주) 괄호: 각 효소의 온도 별 최고활성을 100%로 한 상대 활성비율 %

상기와 같이, 통상적인 저온 영역인 상온 25℃이하의 온도 영역에서, 야생형 단백질 분해효소인 Q1wt와 재조합 변이 효소 Q1M2는 가장 높은 활성을 나타낸 반면, 고온성 세탁효소인 사비나제는 약 50℃의 고온 영역에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 Q1wt와 Q1M2는 저온영역에서 최적활성을 유지하는 저온성 효소임을 확인하였다.

한편, 공벡터를 도입한 대장균으로부터 얻은 용액에서는 모든 온도범위에서 효소 활성이 나타나지 않았다.

실험예 3: 변이 효소 Q1M2 의 열역학적 안정성 검증

변이 효소 Q1M2가 높은 온도에서도 열역학적 안정성을 갖는지 확인하기 위하여, ①일정 온도에서 시간 변화에 따른 효소 활성, ②동일 시간 동안 온도 변화에 따른 효소 활성을 측정하였다.

먼저, 실험예 1에서 발현시킨 효소 Q1wt, Q1M2와 실험예 2에서 사용한 것과 동일한 사비나제 용액을 30℃에서 보관하며 1시간 간격으로 50㎕씩 샘플링하여 효소 활성을 측정하였다. 이 때 효소활성은, 100mM Tris-HCl pH8.0 버퍼 945㎕, 100mM AAPF 용액 5㎕, 효소용액 50㎕를 섞어 1㎖ 반응액을 제조하고, 상기 반응액을 20℃에서 30분간 반응시켜 AAPF의 분해에 따라 p-나이트로아닐라이드의 생성 정도를 410nm 파장의 흡광도 측정을 통해 정량하였다. 그 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2에 도시된 것과 같이, 변이 효소 Q1M2는 30℃에서 적어도 5시간까지 효소활성을 100% 유지하는 것을 확인하였다. 이에 반해, 야생형 단백질 분해효소인 Q1wt의 경우 보관 1시간 이후 효소 활성이 60% 이하로 급격히 저하되었으며, 시간이 지남에 따라 효소 활성이 점점 낮아지는 것으로 나타났다. 한편, 열역학적 안정성이 높은 것으로 알려진 고온성 사비나제의 경우 변이 효소인 Q1M2와 유사하게 보관시간의 경과에도 불구하고 효소 활성이 유지되었다.

다음으로, 0℃~60℃ 온도 별로 상기 3종류의 효소를 30분씩 보관한 후, 상기와 같은 방법으로 효소활성을 측정하여, 그 결과를 도 3에 도시하였다.

그 결과, 야생형 Q1wt의 경우 40℃에서 효소 활성이 약 10%로 측정된 반면, 변이 효소 Q1M2의 경우 약 70%의 효소 활성을 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, 변이 효소 Q1M2는 30℃내지 50℃ 온도 영역에서 야생형 Q1wt에 비해 확연히 효소 안정성이 개선되었음을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 본 발명의 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 나타내는 변이 효소 Q1M2는 기존 야생형 단백질 분해효소에 비해 높은 온도까지 열역학적 안정성이 크게 개선되었음을 확인하였다.

실험예 4: 바실러스 발현 시스템에서의 변이효소의 발현 및 분비

바실러스 균주 기반의 분비 및 발현 시스템을 이용하여 변이 효소 Q1M2를 생산할 수 있는지 확인하기 위하여, 하기의 실험을 진행하였다. 바실러스 벡터/균주 시스템은 독일 모비텍(Mobitec) 사의 pHT43 바실러스 벡터와 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) WB800N 균주를 사용하였다.

먼저, 야생형 효소 Q1wt의 유전자 서열(서열번호 1)을 미국 진스크립트(GenScript)의 유전자합성 서비스를 활용하여, 바실러스 발현 코돈에 최적화된 서열(서열번호 9)로 신규 합성하였다. 상기 신규 합성된 Q1wt 유전자 서열로부터 서열번호 10의 바실러스 발현용 Q1M2 변이효소 유전자를 만들기 위하여, 하기의 서열번호 11과 서열번호 12의 변이서열 도입용 PCR프라이머를 설계하였다. 벡터 도입을 위한 유전자 증폭용 N말단, C말단 PCR 프라이머는 하기의 서열변호 13과 서열번호 14와 같이 설계하였다.

돌연변이 도입용 전방향 프라이머

CAGATAGTTATGGTGCAAAATCAGGAACGTCTATGGCAGCACC - 서열번호 11

돌연변이 도입용 역방향 프라이머

TGATTTTGCACCATAACTATCTGAACTCGGTGTGC - 서열번호 12

효소 유전자 바실러스 벡터 클로닝용 전방향 프라이머

AATAGGATCCCAGAGCGTATCATCTAGCATGG - 서열번호 13

효소 유전자 바실러스 벡터 클로닝용 역방향 프라이머

AATTAGACGTCTTACGCTCCAGATGGCACCGTCA - 서열번호 14

유전자 클로닝 방법은 실시예 1 및 실시예 2와 프라이머를 제외하고는 유사하게 진행하였다. 구체적으로, Q1wt는 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 실시예 1과 같이 PCR 증폭하였고, Q1M2는 서열번호 11, 12, 13, 14의 프라이머를 사용하여 실시예 2와 유사한 Assembly PCR법을 활용하여 유전자 증폭 하였다.

각 유전자를 제한효소 BamHI과 AatII를 사용하여 pHT43 벡터에 도입시켰고, 이를 대장균 XL1-blue에 도입하여 유전자서열을 재확인한 후에 바실러스 서브틸리스 WB800N 균주에 최종 도입시켜 재조합 효소 분비 발현 바실러스 균주로, Q1wt/pHT43/B. subtilis WB800N 와 Q1M2/pHT43/B. subtilis WB800N 을 제조하였다.

상기 2종류의 균주를 5㎍/㎖의 클로람페니콜(Chloramphenicol)이 포함된 멸균된 LB 액체배지 100㎖가 들어있는 500㎖ 삼각플라스크에서 온도 37℃, 교반속도 190rpm으로 각각 배양하였다. 그 후, 600nm 파장에서의 흡광도 값이 0.8이 될 때 IPTG 1mM을 추가한 뒤, 온도 30℃, 교반속도 190rpm으로 배양하였다. 3시간마다 실시간으로 배양액을 샘플링한 후 원심분리하여 바실러스균을 제거하고 배양액 50㎕ 내 포함된 효소 활성을 측정하였다. 활성 측정은 실험예 3과 동일하게, 100mM Tris-HCl pH8.0 버퍼 945㎕, 100mM AAPF 용액 5㎕, 바실러스 배양액 50㎕를 섞어 1㎖ 반응액을 제조하고, 상기 반응액을 20℃에서 30분간 반응시켜 AAPF 기질의 분해로 생성된 p-나이트로아닐라이드의 410nm 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 효소가 없는 벡터를 도입한 재조합 바실러스 균주 (pHT43/B. subtilis WB800N)를 사용하였다.

상기와 같은 바실러스 균주를 이용하여 발현된 효소의 활성을 측정한 결과, 도 4에 도시된 것과 같이, 야생형 효소 Q1wt의 활성은 매우 미미하게 나타난 반면, 변이 효소 Q1M2는 시간에 따라 점차 배양액 내 효소 활성이 증가하였으며, 특히 24~30시간 전후로 최대 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

이는 야생형 효소 Q1wt의 열역학적 안정성이 낮아, 발현된 효소가 배지로 분비된 후 짧은 시간 내에 활성을 잃기 때문으로 추정되며, 이와 달리 변이 효소 Q1M2는 열역학적 안정성이 높은 것을 확인할 수 있다.

한편, 발현 후 프로펩티드 서열이 제거되고 촉매 도메인만 남은 성숙형태 (mature form)의 Q1M2의 단백질 크기는 아미노산 서열의 조성에 따르면 38kD 내외로 계산된다. SDS-PAGE로 확인한 결과, 상기 Q1M2 단백질은 도 5와 같이 계산된 크기 부분(화살표 위치)에 나타남을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC12652BP 20140814 한국생명공학연구원 KCTC12653BP 20140814

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Thermo-stabilized psychrophilic protease <130> KPA140856-KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Pseudoalteromonas Q-1 <400> 1 Gln Ser Val Ser Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser Ala Lys Leu Gln Ser 1 5 10 15 Gln Gly Ser Phe Glu Thr Gln Phe Ile Ile Lys Tyr Lys Asn Asn Asn 20 25 30 Glu Met Ala Ser Phe Ser Thr Ala Asp Ala Ser Pro Ser Ser Met Lys 35 40 45 Lys Arg Ala Gln Ser Phe Val Lys Asn Phe Ala Ser Lys Lys Gly Lys 50 55 60 Val Lys Ala Lys Tyr Ile Arg Ala Met Ala Leu Asn Asn His His Val 65 70 75 80 Met Arg Ala Asp Lys Lys Leu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Phe Met 85 90 95 Gln Glu Met Val Asp Ser Gly Asn Val Glu Tyr Ile Glu Val Asp Gln 100 105 110 Met Leu Lys Pro Phe Ser Thr Pro Asn Asp Pro Arg Phe Asp Asp Gln 115 120 125 Trp His Tyr Tyr Glu Gln Ala Gly Gly Leu Asn Leu Pro Thr Ala Trp 130 135 140 Asp Thr Ala Thr Gly Ser Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Pro His Ala Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu Pro Gly Tyr Asp 165 170 175 Met Ile Ser Asn Leu Ser Val Ala Asn Asp Gly Gly Gly Arg Asp Ser 180 185 190 Asp Ala Arg Asp Pro Gly Asp Ala Val Ala Ala Asn Glu Cys Gly Thr 195 200 205 Asn Gly Ala Gln Asn Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr 210 215 220 Val Ala Ala Val Thr Asn Asn Gly Glu Gly Val Ala Gly Val Ala Tyr 225 230 235 240 Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Leu 245 250 255 Thr Ser Asp Ile Ala Asp Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Gly Ser Val 260 265 270 Ser Gly Ile Pro Ala Asn Ser Asn Pro Ala Asp Val Ile Asn Met Ser 275 280 285 Leu Gly Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ser Thr Thr Gln Asn Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ala Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Val Ile Ala Ala Gly Asn Asp 305 310 315 320 Asn Asp Asn Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Gly Asn Cys Asn Gly Val Val 325 330 335 Asn Val Ala Ser Val Gly Arg Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn 340 345 350 Tyr Gly Ser Asn Ile Asp Val Ala Ala Pro Gly Gly Ala Gln Ser Phe 355 360 365 Ala Asn Asp Ser Glu Gly Val Leu Ser Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Ser 370 375 380 Thr Pro Ser Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Ser Gln Gly Thr Ser Met Ala 385 390 395 400 Ala Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Ile Lys Gln Ala Lys Pro 405 410 415 Asp Ala Thr Pro Asp Glu Ile Glu Ser Ile Leu Lys Ser Thr Thr Arg 420 425 430 Ser Phe Pro Ala Thr Cys Thr Ser Cys Gly Thr Gly Ile Val Asp Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ser Gly Gly Thr Thr Pro Pro Thr Gly 450 455 460 Gly Asp Ser Glu Leu Ile Asn Gly Glu Ala Lys Thr Gly Leu Ser Gly 465 470 475 480 Ala Ala Asn Ala Gln Ala Phe Tyr Thr Met Thr Val Pro Ser Gly Ala 485 490 495 <210> 2 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence of Q1wt <400> 2 caaagcgtta gtagcagcat ggcagaaacc agcgcaaaac ttcagagcca gggtagcttt 60 gaaactcaat tcattattaa gtataaaaac aataatgaaa tggcaagctt ttctactgct 120 gatgcatcac cgagtagcat gaaaaaacgt gcacaaagct ttgtaaaaaa ttttgcatcc 180 aaaaaaggta aggttaaagc aaaatacatt cgcgcaatgg ctttgaataa tcatcatgtt 240 atgcgcgcgg ataaaaagct gagcgcagca gaagcacaag aatttatgca ggaaatggtt 300 gatagtggta atgtagagta tattgaagtt gatcagatgc taaagccttt tagcacgccg 360 aatgaccccc gtttcgatga tcaatggcac tattatgagc aggcaggagg tcttaactta 420 cctactgcat gggacaccgc aaccggtagc ggtgttgttg ttgcagtatt agatactgga 480 taccgaccac acgcagatct gaatgcaaac attctgccag gttatgacat gatctcaaat 540 ttgagcgttg caaatgatgg tggtggtcgt gatagcgacg cgcgtgatcc tggtgatgca 600 gtcgctgcaa atgaatgtgg caccaatggt gctcagaata gttcatggca tggtactcat 660 gttgcaggta cggttgcagc agttacgaat aatggtgagg gtgttgcagg tgtggcatac 720 aatgcaaagg ttgtacctgt aagagttctg ggtaaatgtg ggggtctgac aagcgatatt 780 gcagacggta tcatctgggc ctccggtggt tccgtctccg gtataccggc aaattcaaat 840 ccggcagatg tcataaatat gtccttaggt ggaagcggta gctgcagctc gaccacgcaa 900 aatgcaatta acacagcacg ctccaatggc accgtggtag tgatagcggc gggtaatgac 960 aatgataata gcgcaaacta taatccaggt aattgtaatg gtgtggttaa cgttgccagc 1020 gttggtcgta atggtggacg ggcatattat agcaattacg gaagtaatat cgatgttgca 1080 gcacccggcg gagcccagag ttttgcaaat gacagcgaag gtgtactctc 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Lys Arg Ala Gln Ser Phe Val Lys Asn Phe Ala Ser Lys Lys Gly Lys 50 55 60 Val Lys Ala Lys Tyr Ile Arg Ala Met Ala Leu Asn Asn His His Val 65 70 75 80 Met Arg Ala Asp Lys Lys Leu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Phe Met 85 90 95 Gln Glu Met Val Asp Ser Gly Asn Val Glu Tyr Ile Glu Val Asp Gln 100 105 110 Met Leu Lys Pro Phe Ser Thr Pro Asn Asp Pro Arg Phe Asp Asp Gln 115 120 125 Trp His Tyr Tyr Glu Gln Ala Gly Gly Leu Asn Leu Pro Thr Ala Trp 130 135 140 Asp Thr Ala Thr Gly Ser Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Pro His Ala Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu Pro Gly Tyr Asp 165 170 175 Met Ile Ser Asn Leu Ser Val Ala Asn Asp Gly Gly Gly Arg Asp Ser 180 185 190 Asp Ala Arg Asp Pro Gly Asp Ala Val Ala Ala Asn Glu Cys Gly Thr 195 200 205 Asn Gly Ala Gln Asn Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr 210 215 220 Val Ala Ala Val Thr Asn Asn Gly Glu Gly Val Ala Gly Val Ala Tyr 225 230 235 240 Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Leu 245 250 255 Thr Ser Asp Ile Ala Asp Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Gly Ser Val 260 265 270 Ser Gly Ile Pro Ala Asn Ser Asn Pro Ala Asp Val Ile Asn Met Ser 275 280 285 Leu Gly Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ser Thr Thr Gln Asn Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ala Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Val Ile Ala Ala Gly Asn Asp 305 310 315 320 Asn Asp Asn Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Gly Asn Cys Asn Gly Val Val 325 330 335 Asn Val Ala Ser Val Gly Arg Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn 340 345 350 Tyr Gly Ser Asn Ile Asp Val Ala Ala Pro Gly Gly Ala Gln Ser Phe 355 360 365 Ala Asn Asp Ser Glu Gly Val Leu Ser Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Ser 370 375 380 Thr Pro Ser Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Lys Ser Gly Thr Ser Met Ala 385 390 395 400 Ala Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Ile Lys Gln Ala Lys Pro 405 410 415 Asp Ala Thr Pro Asp Glu Ile Glu Ser Ile Leu Lys Ser Thr Thr Arg 420 425 430 Ser Phe Pro Ala Thr Cys Thr Ser Cys Gly Thr Gly Ile Val Asp Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ser Gly Gly Thr Thr Pro Pro Thr Gly 450 455 460 Gly Asp Ser Glu Leu Ile Asn Gly Glu Ala Lys Thr Gly Leu Ser Gly 465 470 475 480 Ala Ala Asn Ala Gln Ala Phe Tyr Thr Met Thr Val Pro Ser Gly Ala 485 490 495 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 cttcatcgga tagctacggt gcaaagagcg gtacgagcat ggccgcacc 49 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 7 ggtgcggcca tgctcgtacc gctctttgca ccgtagctat ccgatgaag 49 <210> 8 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q1M2 <400> 8 caaagcgtta gtagcagcat ggcagaaacc agcgcaaaac ttcagagcca gggtagcttt 60 gaaactcaat tcattattaa gtataaaaac aataatgaaa tggcaagctt ttctactgct 120 gatgcatcac cgagtagcat gaaaaaacgt gcacaaagct ttgtaaaaaa ttttgcatcc 180 aaaaaaggta aggttaaagc aaaatacatt cgcgcaatgg ctttgaataa tcatcatgtt 240 atgcgcgcgg ataaaaagct gagcgcagca gaagcacaag aatttatgca ggaaatggtt 300 gatagtggta atgtagagta tattgaagtt gatcagatgc taaagccttt tagcacgccg 360 aatgaccccc gtttcgatga tcaatggcac tattatgagc aggcaggagg tcttaactta 420 cctactgcat gggacaccgc aaccggtagc ggtgttgttg ttgcagtatt agatactgga 480 taccgaccac acgcagatct gaatgcaaac attctgccag gttatgacat gatctcaaat 540 ttgagcgttg caaatgatgg tggtggtcgt gatagcgacg cgcgtgatcc tggtgatgca 600 gtcgctgcaa atgaatgtgg caccaatggt gctcagaata gttcatggca tggtactcat 660 gttgcaggta cggttgcagc agttacgaat aatggtgagg gtgttgcagg tgtggcatac 720 aatgcaaagg ttgtacctgt aagagttctg ggtaaatgtg ggggtctgac aagcgatatt 780 gcagacggta tcatctgggc ctccggtggt tccgtctccg gtataccggc aaattcaaat 840 ccggcagatg tcataaatat gtccttaggt ggaagcggta gctgcagctc gaccacgcaa 900 aatgcaatta acacagcacg ctccaatggc accgtggtag tgatagcggc gggtaatgac 960 aatgataata gcgcaaacta taatccaggt aattgtaatg gtgtggttaa cgttgccagc 1020 gttggtcgta atggtggacg ggcatattat agcaattacg gaagtaatat cgatgttgca 1080 gcacccggcg gagcccagag ttttgcaaat gacagcgaag gtgtactctc tacctataat 1140 agcggtagct caaccccttc atcggatagc tacggtgcaa agagcggtac gagcatggcc 1200 gcaccgcatg tagcaggagt tgctgcactg attaaacagg caaaacccga cgcaaccccg 1260 gatgaaattg agagcatcct caagagcacc actcggagct tcccggctac gtgcacaagc 1320 tgcggtactg gcatagttga cgcagcagca gcagttgcag ctgcaagcgg tggtacaacc 1380 ccgccaacgg gtggggatag cgaactgatt aatggtgaag caaaaacagg tcttagcggt 1440 gcagcaaatg cccaggcatt ctatacaatg acagttccaa gcggtgca 1488 <210> 9 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence of Q1wt <400> 9 cagagcgtat catctagcat ggcagaaacg tcagctaaac tgcaaagtca gggatcattt 60 gaaacacaat ttatcatcaa atataaaaac aacaatgaaa tggcttcttt tagcacagct 120 gatgcgtctc ctagttcaat gaaaaaacgc gctcagagtt ttgtaaaaaa ctttgcgtct 180 aaaaaaggca aagtgaaagc aaaatatatt cgtgccatgg cattaaacaa ccatcatgtt 240 atgagagctg ataaaaaact ttctgcagct gaagcgcaag aatttatgca ggaaatggtt 300 gatagcggaa acgtagaata tatcgaagtg gatcaaatgc ttaaaccttt tagcacacca 360 aacgatcctc gctttgatga tcaatggcat tattatgaac aggctggagg cttaaatctt 420 ccgacggcgt gggatacagc cacgggctct ggtgttgtag tggcagtact tgatacaggt 480 tatcgacctc atgcagattt aaacgctaac atcctgcctg gatatgatat gatctctaat 540 ctgagcgtag ctaacgatgg tggaggccgc gattcagatg cacgagatcc gggagatgca 600 gtggcagcaa atgaatgtgg cacaaatggt gctcaaaact ctagctggca tggcacacat 660 gttgctggta cggttgcagc tgtaacaaac aatggagaag gcgtggctgg cgtcgcgtat 720 aatgccaaag tcgttccagt gcgtgtcctt ggtaaatgcg gtggactgac aagtgatatt 780 gcggatggca ttatctgggc atctggcggt agtgtctcag gtattcctgc aaactctaat 840 ccggctgatg taatcaatat gagcttagga ggctctggaa gctgtagttc aacaacgcaa 900 aatgcgatta acacggccag atcaaatgga acagtagtgg tcatcgcggc cggcaacgat 960 aacgataact ctgcaaacta taacccagga aattgcaacg gcgttgtaaa tgttgctagc 1020 gtaggacgta acggtggaag agcatattat agtaactatg gctcaaacat cgatgtggca 1080 gctcctggcg gtgcacagtc ttttgctaat gatagcgaag gtgttctttc tacgtataac 1140 agcggatcta gcacaccgag ttcagatagt tatggttatt cacaaggaac gtctatggca 1200 gcaccacatg tggctggtgt cgcagctctg attaaacagg cgaaaccgga tgccacacca 1260 gatgaaatcg aaagcatcct gaaaagtaca acgcgttcat ttccggcaac atgtacgtct 1320 tgcggtacag gaattgtcga tgcagcagca gctgttgcag cagcaagcgg aggtacaacg 1380 cctccaacgg gtggagattc agaactgatc aacggagaag caaaaacagg tctttctgga 1440 gcggcgaatg cccaagcctt ttatacaatg acggtgccat ctggagcg 1488 <210> 10 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q1M2 <400> 10 cagagcgtat catctagcat ggcagaaacg tcagctaaac tgcaaagtca gggatcattt 60 gaaacacaat ttatcatcaa atataaaaac aacaatgaaa tggcttcttt tagcacagct 120 gatgcgtctc ctagttcaat gaaaaaacgc gctcagagtt ttgtaaaaaa ctttgcgtct 180 aaaaaaggca aagtgaaagc aaaatatatt cgtgccatgg cattaaacaa ccatcatgtt 240 atgagagctg ataaaaaact ttctgcagct gaagcgcaag aatttatgca ggaaatggtt 300 gatagcggaa acgtagaata tatcgaagtg gatcaaatgc ttaaaccttt tagcacacca 360 aacgatcctc gctttgatga tcaatggcat tattatgaac aggctggagg cttaaatctt 420 ccgacggcgt gggatacagc cacgggctct ggtgttgtag tggcagtact tgatacaggt 480 tatcgacctc atgcagattt aaacgctaac atcctgcctg gatatgatat gatctctaat 540 ctgagcgtag ctaacgatgg tggaggccgc gattcagatg cacgagatcc gggagatgca 600 gtggcagcaa atgaatgtgg cacaaatggt gctcaaaact ctagctggca tggcacacat 660 gttgctggta cggttgcagc tgtaacaaac aatggagaag gcgtggctgg cgtcgcgtat 720 aatgccaaag tcgttccagt gcgtgtcctt ggtaaatgcg gtggactgac aagtgatatt 780 gcggatggca ttatctgggc atctggcggt agtgtctcag gtattcctgc aaactctaat 840 ccggctgatg taatcaatat gagcttagga ggctctggaa gctgtagttc aacaacgcaa 900 aatgcgatta acacggccag atcaaatgga acagtagtgg tcatcgcggc cggcaacgat 960 aacgataact ctgcaaacta taacccagga aattgcaacg gcgttgtaaa tgttgctagc 1020 gtaggacgta acggtggaag agcatattat agtaactatg gctcaaacat cgatgtggca 1080 gctcctggcg gtgcacagtc ttttgctaat gatagcgaag gtgttctttc tacgtataac 1140 agcggatcta gcacaccgag ttcagatagt tatggtgcaa aatcaggaac gtctatggca 1200 gcaccacatg tggctggtgt cgcagctctg attaaacagg cgaaaccgga tgccacacca 1260 gatgaaatcg aaagcatcct gaaaagtaca acgcgttcat ttccggcaac atgtacgtct 1320 tgcggtacag gaattgtcga tgcagcagca gctgttgcag cagcaagcgg aggtacaacg 1380 cctccaacgg gtggagattc agaactgatc aacggagaag caaaaacagg tctttctgga 1440 gcggcgaatg cccaagcctt ttatacaatg acggtgccat ctggagcg 1488 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 cagatagtta tggtgcaaaa tcaggaacgt ctatggcagc acc 43 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 12 tgattttgca ccataactat ctgaactcgg tgtgc 35 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 aataggatcc cagagcgtat catctagcat gg 32 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 14 aattagacgt cttacgctcc agatggcacc gtca 34

Claims (17)

1. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 저온성 단백질 분해효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 위치 393 내지 395의 아미노산인 티로신(Y)-세린(S)-글루타민(Q)이 알라닌(A)-라이신(K)-세린(S)으로 치환된 단백질인 것인, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 5 ℃ 내지 25 ℃에서 가장 높은 활성을 나타내는 것인, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 0 ℃ 내지 40℃에서 효소의 활성을 유지하는 것인, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분해효소에 비하여 저장 안정성이 개선된 것인, 저온성 단백질 분해효소 Q1M2.
   
6. 제1항의 효소를 코딩하는, Q1M2 유전자.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, Q1M2 유전자.
   
8. 제6항의 Q1M2 유전자를 포함하는 발현벡터.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 발현벡터는 pMAL-p2x 또는 pHT43인 것인, 발현벡터.
   
10. 제8항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균 또는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주인 것인, 형질전환체.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)인 것인, 형질전환체.
    
13. 제10항에 있어서,
    상기 형질전환체는 수탁번호 KCTC 12652BP의 대장균, 또는 수탁번호 KCTC 12653BP 의 바실러스 서브틸리스인, 형질전환체.
    
14. 제10항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항의 저온성 단백질 분해효소 Q1M2의 제조 방법.
    
15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 저온성 단백질 분해효소 Q1M2를 포함하는 직물 세탁 또는 식기 세정용 세제 조성물.
    
16. 제15항에 있어서,
    상기 저온성 단백질 분해효소 Q1M2는 전체 조성물 총 중량의 0.001 중량% 내지 10 중량%으로 포함되는 것인, 세제 조성물.
    
17. 삭제

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