JPH06327468A - ホスフォリパーゼａ２を生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ストレプトマイセス・ビオラセオルバーＡ−
２６８８株由来のホスフォリパーゼＡ２をコードするＤ
ＮＡを保持し、該ホスフォリパーゼＡ２を生産する実質
上純粋な微生物およびそれを用いたホスフォリパーゼＡ
２の製造法。 【効果】 本発明によれば、高濃度領域のカルシウムイ
オンの測定が行え、合成レシチンから新規な食品添加リ
ン脂質の製造にも有用であるホスフォリパーゼＡ２が提
供できる。また本発明によれば、ホスフォリパーゼＡ２
を安定的に大量に供給し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はホスフォリパーゼＡ２を
生産する実質上純粋な微生物、ホスフォリパーゼＡ２を
発現する実質上純粋なＤＮＡ及びホスフォリパーゼＡ２
の製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、ホスフォリパーゼＡ２は、水の存
在下、反応式

【０００３】

【化１】

【０００４】（式中のＲ１、Ｒ２はアルキル基を意味す
る。）で示されるように、リン脂質（たとえばレシチ
ン）をリゾリン脂質（たとえばリゾレシチン）と脂肪酸
に加水分解する触媒作用を有し、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．
１．１．４として知られている（酵素ハンドブック、第
４１７〜４１８頁、１９８２年、朝倉書店発行）。卵黄
レシチンや大豆レシチンなどに代表される天然レシチン
から、ホスフォリパーゼを用いて新規な食品添加リン脂
質製造の研究が行われている（食品産業のためのプロテ
インエンジニアリング、１６０〜１８１頁、食品化学新
聞社）。その他、ホスフォリパーゼＡ２はカルシウム要
求性を有するためこれを利用しカルシウムイオンの測定
にも利用できる。特に体液中のカルシウムの測定は、神
経、筋肉の興奮性、血液凝固反応、細胞膜の透過性等の
種々の生理機能や副甲状腺機能などの有用な情報を与
え、臨床的意義が高い。従来、体液中のカルシウムイオ
ンの測定には、イオン選択電極を用いた電極法などの方
法が実用化され一般に用いられていた。ところが本方法
は専用の装置が必要であり機器の保守・管理に注意が必
要であり、試料の分析処理効率が悪いなどの問題点があ
った。

【０００５】我々は、鋭意努力し、高濃度領域のカルシ
ウムイオンの測定が行えるホスフォリパーゼＡ２を検索
した。ホスフォリパーゼＡ２は、ヒト膵由来や動物、特
に蛇毒、蜂毒から多くの種類が単離されアミノ酸配列、
遺伝子クローニングが行われている（食品産業のための
プロテインエンジニアリング、２９２〜２９９頁、食品
化学新聞社）。しかしこれら動物起源のホスフォリパー
ゼＡ２は低濃度領域のカルシウムイオンで最大の活性化
が起きてしまうなどの反応性の他、Ｍｎイオン要求性、
耐熱性などで必ずしも満足の行くものではなかった。

【０００６】さらにホスフォリパーゼを種々鋭意検索し
たところ、ストレプトマイセス・ビオラセオルバーＡ−
２６８８株の生産するホスフォリパーゼＡ２が、上記の
問題点のない好ましい酵素であることを見いだした。さ
らに驚くべきことにこのホスフォリパーゼＡ２は、卵黄
レシチンや大豆レシチンなどに代表される天然レシチン
からの新規な食品添加リン脂質製造に適しているだけで
はなく、ジオレイルレシチン、ジリノレイルレシチン、
ジリノレオイルレシチン、１−パルミトイル−２−オレ
イルレシチン、１−パルミトイル−２−リノレイルレシ
チン、１−ステアロイル−２−オレイルレシチン、１−
ステアロイル−２−リノレイルレシチンなどの合成レシ
チンからの新規な食品添加リン脂質製造にも有用である
ことがわかった。

【０００７】しかし、ストレプトマイセス・ビオラセオ
ルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒ
ｕｂｅｒ）Ａ−２６８８株は、極めて低い生産量のホス
フォリパーゼＡ２しか生産せず、とくに食品分野への応
用に関しては製造コスト、生産量の面から実質的に使用
が困難である状況にあった。従来、ヒト膵由来のホスフ
ォリパーゼＡ２については遺伝子が既に単離され、遺伝
子の塩基配列が決定され、アミノ酸配列が推定されてい
る［ＤＮＡ，５，５１９〜５２７（１９８６）］。我々
はこの塩基配列及びアミノ酸配列を参考に種々のプロー
ブを作製し、ストレプトマイセス・ビオラセオルバーＡ
−２６８８株のホスフォリパーゼＡ２遺伝子を取得しよ
うと試みたが、意外にもその遺伝子を取得することがで
きなかった。即ち、後記するように本発明のホスフォリ
パーゼＡ２のアミノ酸配列及び該酵素のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの塩基配列は、ストレプトマイセス・
ビオラセオルバー由来のものとは、アミノ酸配列および
塩基配列として、相同性が１０％以下と極めて低く、各
生産種によってホスフォリパーゼＡ２がどのようなアミ
ノ酸配列であるか全く推定できないものであった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の状況
下、カルシウムの測定や、レシチンからの新規な食品添
加リン脂質の製造に広く用いることのできる有用なホス
フォリパーゼＡ２を効率よく生産する微生物を開発し、
この微生物を用いて該酵素を量産する方法を確立するこ
とを目的としてなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、本件ホスフォリ
パーゼＡ２を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブ
ラリーの中から、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスク
リーニングし、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクター
を構築したのち、例えばストレプトマイセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）に
属する微生物に導入して形質転換微生物を作出し、これ
を培地中で培養することによって、該ホスフォリパーゼ
Ａ２を効率よく量産することを見い出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、ホスフォリパーゼＡ
２を発現するＤＮＡを有する組換えプラスミドによって
形質転換されたストレプトマイセスに属する微生物であ
ることを特徴とするホスフォリパーゼＡ２を生産する実
質上純粋な微生物、図１で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有することを特徴とするホスフォリパ
ーゼＡ２を発現する実質上純粋なＤＮＡ、及び前記の形
質転換された微生物であるホスフォリパーゼＡ２を生産
する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培
養物からホスフォリパーゼＡ２を採取することを特徴と
するホスフォリパーゼＡ２の製造法を提供するものであ
る。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、ホスフォリパーゼＡ２を生産する形質転換され
た微生物を作出するのに用いられるホスフォリパーゼＡ
２を発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば該酵素を生産する
微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、スク
リーニングすることによって得ることができる。

【００１２】本発明においては、前記のホスフォリパー
ゼＡ２を生産する微生物として、ストレプトマイセス・
ビオラセオルバーＡ−２６８８株が好ましく用いられ
る。このストレプトマイセス・ビオラセオルバーの染色
体ＤＮＡライブラリーから該酵素を発現する遺伝子ＤＮ
Ａをスクリーニングする方法の具体例について説明する
と、まず、該微生物の染色体ＤＮＡ１００〜２０００μ
ｇ程度を通常用いられている方法によって抽出したの
ち、その１〜１０μｇ程度を制限酵素ＫｐｎＩで切断し
て、例えばクローニングベクターの一種、ｐＵＣ１１８
プラスミドのＫｐｎＩ部位に連結し、次いでこの組換え
ＤＮＡを、約１０⁴クローンからなる染色体ＤＮＡライ
ブラリーを作製する。この際用いられる宿主微生物とし
ては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；以
下Ｅ．ｃｏｌｉと略称することがある）がよく使用され
る。

【００１３】ｐＵＣ１１８プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに
属する微生物に導入する方法としては、コンピテントセ
ル法を用いてもよく、あるいはカルシウムイオンの存在
下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよい。また宿主微生
物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択については、
組換えＤＮＡを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに
基づく選択培地で、該宿主微生物を培養し、生育する宿
主微生物を選択すればよい。

【００１４】一方、後述の方法により精製されたホスフ
ォリパーゼＡ２精製標品、およびそのリシルエンドペプ
チダーゼまたはアスパラギニルエンドペプチダーゼ等の
切断酵素による処理断片を用い、そのアミノ酸配列を決
め、これに基づいて種々のオリゴヌクレオチドを合成
し、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、例えばア
イソトープで標識して放射性オリゴヌクレオチドプロー
ブを作製する。

【００１５】次いで、これらの放射性オリゴヌクレオチ
ドプローブを用い、従来慣用されている方法に従って、
前記の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ホスフォリ
パーゼＡ２を発現する遺伝子を持つ組換え体ファージを
スクリーニングするわけであるが、この段階が本発明に
おいて非常に困難な部分であり、ホスフォリパーゼＡ２
の部分的なアミノ酸配列から種々のプローブを作製した
が、ホスフォリパーゼＡ２遺伝子を保持するクローンを
なかなか見い出せなかった。具体的に述べるとプローブ
を設計する場合、一般に推定されるＤＮＡ配列の組合せ
がなるべく少ない配列を選択してプローブを合成する
が、本発明のホスフォリパーゼＡ２の場合、組合せの少
ない配列が余り存在せず、ストレプトマイセスの遺伝子
のコドン使用頻度を参考にして数多い組合せの中から組
合せを絞ったプローブを作製したり、複数に推定される
部分の塩基をイノシンにしたプローブを作製したり、ま
たプローブの長さについても種々検討し、さらにハイブ
リダイゼーション、及びその後の洗浄の条件（溶液の組
成、温度、時間）を種々検討した結果、後の実施例で述
べるが、本発明においてはリジルエンドペプチダーゼ処
理断片アミノ酸配列に基づく放射性オリゴヌクレオチド
プローブを用い、特定の条件でハイブリダイゼーショ
ン、洗浄を行って釣り上げられた組換え体が、目的の遺
伝子ＤＮＡを持つものであることが判明した。

【００１６】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む組換
え体から、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
の方法［「モレキュラル・クローニング：コールドスプ
リングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）」（１９８
２年）］などに従って、ホスフォリパーゼＡ２をコード
するＤＮＡを含む組換えプラスミド、例えばｐＰＬＡ５
１を調製することができる。このプラスミドの構成を示
す模式図を図４に示す。また、該プラスミド中のストレ
プトマイセス・ビオラセオルバー染色体ＤＮＡ由来の部
位の制限酵素地図は図３に示すとおりである。

【００１７】このようにして構築されたプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉに属する微生物に導入する方法としては、
コンピテントセル法を用いてもよく、あるいはカルシウ
ムイオンの存在下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよ
い。またバチルス属を宿主微生物とする場合は、例えば
ｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いればよく、サッカロミセ
ス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＹＣ５などを
用いればよい。そして宿主微生物への所望組換えＤＮＡ
導入の有無の選択については、組換えＤＮＡを構成する
ベクターの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、該宿
主微生物を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよ
い。

【００１８】次に、ホスフォリパーゼＡ２をコードする
遺伝子ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築する。こ
の発現用ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖
し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用と
して構築されたものが適している。前者のファージとし
ては、例えばストレプトマイセスを宿主微生物とする場
合には、φＣ３１などが用いられる。また、プラスミド
としては、ストレプトマイセスを宿主微生物とするに、
例えばｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ６１、ｐＩ
Ｊ１０１、ｐＩＪ９２２などが用いられる。

【００１９】これらのベクターに、該ホスフォリパーゼ
Ａ２遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については特に制限は
なく、従来慣用されている方法を用いることができる。
例えば適当な制限酵素を用いて、前記のホスフォリパー
ゼＡ２遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドＤＮＡ及び
該発現用ベクターを処理し、それぞれホスフォリパーゼ
Ａ２遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベクター断片を得たの
ち、それぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させることによって、発現ベク
ターが得られる。

【００２０】後述の実施例における発現ベクターは、前
記の組換えプラスミドｐＰＬＡ５１とベクタープラスミ
ドｐＩＪ６８０から得られ、ｐＰＬＡ１０１と命名され
たものであり、その構成の模式図は図５に示すとおりで
ある。このようにして、構築されたプラスミドのストレ
プトマイセスへの導入および宿主微生物への所望組換え
ＤＮＡ導入の有無の選択については、例えばホップウッ
ド（Ｈｏｏｐｗｏｏｄ）らの方法［「ジェネティック・
マニピュレーション・オブ・ストレプトマイセス・ア・
ラボラトリーマニアル：ザ・ジョン・イネス・ファンデ
ーション（ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ：Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅ
ｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」（１９８２年）］などに
従えばよい。

【００２１】本発明においては、前記組換えプラスミド
ｐＰＬＡ１０１によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに
属する微生物は、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ
２４−ｐＰＬＡ１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５４６）と
命名される。このようにして得られた形質転換微生物の
培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの
栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことが
できる。

【００２２】該炭素源としては、例えばグルコース、デ
ンプン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒
素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加
水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、
マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸など
の陰イオンを含む塩が挙げられる。

【００２３】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気攪拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって、通常２０〜５０℃、好ましく
は２０〜３５℃、より好ましくは２８℃近辺で、１２〜
４８時間程度培養する方法が用いられる。このようにし
て培養を行ったのち、遠心分離処理などの手段によって
培養液を集め粗酵素液とするか、または菌体を集め、次
いで酵素処理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理
などによって細胞を破壊して目的とする素酵素抽出液を
得る。この粗酵素液から、該酵素を分離、精製するに
は、例えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着
処理などを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、電気泳動法などによって精製すればよ
い。

【００２４】この精製標品について、ホスフォリパーゼ
Ａ２の酵素活性及び物理化学的性質を調べることによっ
て、該形質転換微生物がホスフォリパーゼＡ２の産生能
を有することが確認された。したがって、本発明におい
て用いたホスフォリパーゼＡ２を発現する遺伝子ＤＮＡ
は、図１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有し、かつその塩基配列が図２に示す配列であること
が明らかである。

【００２５】さらに、配列表に記載されたシグナルペプ
チド部分に相当する配列を有することにより菌体外に発
現され好ましい。このようにして得られたホスフォリパ
ーゼＡ２は、リン脂質（たとえばレシチン）をリゾリン
脂質（たとえばリゾレシチン）と脂肪酸に加水分解する
触媒作用を有することから、カルシウムの酵素法による
測定や、レシチンからの新規な食品添加リン脂質製造に
も有用有効である。

【００２６】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｈ：アデニン、チミンまたはシトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｙ：チミンまたはシトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン

【００２７】

【実施例】次に、参考例及び実施例によって本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってな
んら限定されるものではない。

【００２８】

【実施例１】 染色体ＤＮＡの分離 ストレプトマイセス・ビオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）Ａ−２６
８８株［微工研条寄第１３５４５号（ＦＥＲＭＰ−１３
５４５）］を培地〔トリプチックソイ培地 ３０ｇ／リ
ットル（ディフコ社製）、０．１％グリシン〕４５０ｍ
ｌにて２８℃で一昼夜振盪培養した後、この培養液を高
速冷却遠心機（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５０
０ｒｐｍで１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌し
た。

【００２９】次いで、この菌体を０．３Ｍシュークロー
ス４５０ｍｌで洗浄後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０％
シュークロースからなる溶液５０ｍｌ中に懸濁し、最終
濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチーム（生化学工
業社製）を加え、３７℃で１時間処理して菌株の細胞壁
を破壊した。

【００３０】次に、これに１０％ラウリル硫酸ナトリウ
ム（ナカライ社製）水溶液５００μｌを加えて、６５℃
で１０分間処理した後、これに等量のフェノール／クロ
ロホルム（１／１）混合液を加え、攪拌後遠心分離処理
して水相を分取した。この水相に倍量のエチルアルコー
ルを静かに混合し、ＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分
離した後、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１
ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２０ｍｌで溶解した。これ
にＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）を終濃度１００μｇ／ｍ
ｌになるように加え、４℃で一昼夜放置した。これに１
０ｍｌのフェノール／クロロホルム（１／１）混合液を
前記と同様に処理してそれぞれ水相を分取した。この１
０ｍｌのフェノール／クロロホルム（１／１）混合液を
前記と同様にさらに２回処理してそれぞれ水相を分取し
た。

【００３１】次に、この水相に等量のジエチルエーテル
を加え攪拌後遠心分離処理して水相を分取した。この水
相に２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度
ＤＮＡを分離し、約１０ｍｇのＤＮＡを得てそれを１０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ
からなる溶液５ｍｌに溶解した。

【００３２】

【実施例２】ストレプトマイセス・ビオラセオルバー遺
伝子ライブラリーの作製 実施例１で得られたストレプトマイセス・ビオラセオル
バー染色体５μｇを、制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）
１０単位を用い、５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び
１ｍＭ ＤＴＴからなる溶液中、３７℃で２時間切断処
理した後、ＤＮＡを回収した。

【００３３】また、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）１μｇ
を別の容器中で、制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）１０
単位を用い、５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び１ｍＭ
ＤＴＴからなる溶液中で、３７℃で２時間切断処理した
後、５’末端を脱リン酸化するために、反応液にアルカ
リ性ホスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加えて３７
℃で１時間処理した。この反応液に等量のフェノールを
加えて処理した後、遠心分離処理によって水相を分取し
た。次いで、この水相に等量のフェノール／クロロホル
ム（１／１）混合液を加えて処理した後、遠心分離処理
によって水相を分取した。さらに、この水相に１／１０
量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２倍量のエタノール
を加えて遠心分離処理することによってＤＮＡを回収
し、減圧乾燥後、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）
及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶解した。

【００３４】ストレプトマイセス・ビオラセオルバー染
色体ＤＮＡのＫｐｎＩ切断産物と制限酵素ＫｐｎＩによ
って切断したベクターＤＮＡを混合後、１／１０量の３
Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２倍量のエタノールを加え
て遠心分離処理することによってＤＮＡを回収し、減圧
乾燥した。そのＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶
解した後、６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び６６０μＭ
ＡＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ
４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）１００単位を用い、
４℃で１６時間ライゲーションを行ない、ストレプトマ
イセス・ビオラセオルバー遺伝子ＤＮＡライブラリーと
した。

【００３５】

【実施例３】 放射性オリゴヌクレオチドプローブの作
製 ホスフォリパーゼＡ２精製標品のＮ末端側アミノ酸配列
及びアスパラギニルエンドペプチダーゼ処理断片（Ｄ−
１１断片およびＤ−１４断片）のアミノ酸配列を調べた
ところ、図６に示す配列が決定された。この情報をもと
に遺伝子の５’末端側から塩基配列を予想した。この予
想された塩基配列には種々の組合せが考えられるので、
組合せの数が少ない部分のオリゴヌクレオチドを設計し
て実験を行なう必要がある。このオリゴヌクレオチドは
アール・エル・レッシンジャーらの方法［「ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」第９８巻、３６５５ペー
ジ］に基づき、ＤＮＡシンセサイザー［サイクロン（バ
イオサーチ社製）］を用いて作製した。

【００３６】我々は、図６のＮ末端断片の下線Ｉの部分
のアミノ酸配列、および図６のＤ−１４断片のIIとIII
の２カ所の下線部分のアミノ酸配列に対応するオリゴヌ
クレオチドを作製した。すなわちＩには図７のが、II
には図７のが、III には図７のがそれぞれ対応する
訳であるが、これらのオリゴヌクレオチドでは、本ホス
フォリパーゼＡ２遺伝子はクローニングができなかっ
た。そこでさらに多くのオリゴヌクレオチドを作製し、
種々の条件にて検討をした結果、以下のオリゴヌクレオ
チドが好適なものであることを見いだした。

【００３７】すなわち、図６のＤ−１１断片の下線IVの
部分のアミノ酸配列ＡｓｐからＴｈｒに対応するＤＮＡ
の組合せは２９マーのものを考えた場合４０９６通りも
存在する。したがって、アミノ酸配列から推定されるｍ
ＲＮＡに相補的でかつ効率の良い図７のに示す２９マ
ーのオリゴヌクレオチドを作製した。このようにして得
られたオリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼバッファー［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＤＴＴ、
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ スペルミジン］及
び７４０キロベクレルの［γ-32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャ
ム社製）の存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東
洋紡績社製）８．５単位を用い、３７℃で６０分間反応
させて、アイソトープ32Ｐを取り込ませ、放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。

【００３８】

【実施例４】 ホスフォリパーゼＡ２遺伝子含有ＤＮＡ
のスクリーニング 実施例２で得たストレプトマイセス・ビオラセオルバー
遺伝子ＤＮＡライブラリーを、ケー・シゲサダ（Ｋ．Ｓ
ｈｉｇｅｓａｄａ）の方法［「細胞工学」第２巻、６１
６〜６２６ページ（１９８３年）］によってコンピテン
ト細胞としたＥ．ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４
９）［Ｆ−、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、
ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒk-、ｍk+）、ＳｕｐＥ４
４、ｒｅｌＡ１、λ−］［「モレキュラル・クローニン
グ：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ）」５０４〜５０６ページ（１９８２年）］に形質
転換させた。平板寒天培地上に約１０⁴個の形質転換体
コロニーを形成させ、その上に、ニトロセルロースメン
ブレンフィルター（Ｓ＆Ｓ社製）を重ね、フィルター上
にコロニーの一部を移行させた後、このフィルターをア
ルカリ変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｎ−Ｎ
ａＯＨ溶液）中に５分間浸し、さらに中和溶液［０．５
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．０）及び３Ｍ ＮａＣｌ混合
液］に５分間浸漬後、乾燥させた。

【００３９】次に、このフィルターを８０℃で２時間加
熱し、組換え体ＤＮＡをフィルターに固定した。さら
に、このフィルターを、１．８Ｍ ＮａＣｌ、０．１８
Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５％二リン酸ナトリウ
ム、２０％ホルムアミド、０．１％ラウリル硫酸ナトリ
ウム、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリ
ドン、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％サケ精子ＤＮＡを
含有するプレハイブリダイゼション溶液に浸し、３７℃
で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。その
後、フィルターを、１．８Ｍ ＮａＣｌ、０．１８Ｍク
エン酸ナトリウム、０．０５％二リン酸ナトリウム、２
０％ホルムアミド、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、
０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％ＢＳＡ及び０．００２％大腸菌由来のトランス
ファーＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション溶液に
浸した後、実施例３で得られた放射性オリゴヌクレオチ
ドプローブを加え、３７℃で１６時間ハイブリダイゼー
ションを行った。

【００４０】ハイブリダイゼーション後、１．８Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１８Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５％二
リン酸ナトリウムを含む洗浄液でフィルターを３回洗浄
した後、４２℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプロー
ブを洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、Ｘ線
フィルム（富士写真フィルム社製、ＲＸＯ−Ｈ）に重
ね、遮光下−８０℃で２４時間オートラジオグラフィー
を行った。

【００４１】その後、フィルムを現像したところ、ポジ
ティブシグナルを示すコロニーを確認した。該コロニー
を形成する組換え体プラスミドＤＮＡの制限酵素切断地
図を図３に示した。該コロニーを形成する組換え体プラ
スミドＤＮＡをｐＰＬＡ５１と命名した。

【００４２】

【実施例５】 組換え体プラスミドＤＮＡの抽出と構造
解析 上記実施例４で取得した組換え体プラスミドｐＰＬＡ５
１ＤＮＡを抽出した。プラスミドｐＰＬＡ５１を有する
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１から、ティー・マニアティスらの方
法［「モレキュラル・クローニング：コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）」第８６
〜９４ページ（１９８２年）］によって、ｐＰＬＡ５１
ＤＮＡを抽出した。このプラスミドの構成を示す模式図
を図４に示す。該プラスミド中のストレプトマイセス・
ビオラセオルバー染色体由来の部位をジデオキシ法
［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」第２１４巻、第１
２０５〜１２１０ページ（１９８１年）］により、塩基
配列を決定し、ホスフォリパーゼＡ２をコードする全Ｄ
ＮＡが含まれていることを確認すると共に、その全塩基
配列を決定し、少なくとも図２にて示される配列を含む
ものであることを確認した。

【００４３】今回解析したホスフォリパーゼＡ２のＮ末
端側アミノ酸配列及びアスパラギニルエンドペプチダー
ゼ処理断片アミノ酸配列とも同一フレームにおいて完全
に一致した。

【００４４】

【実施例６】 放線菌でのホスフォリパーゼＡ２の活性
発現 実施例５で得られたプラスミドｐＰＬＡ５１を有する
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１を通常の方法で培養し、ホスフォリ
パーゼＡ２活性測定を行った。しかし菌体内及び培養ろ
液どちらにも有為なホスフォリパーゼＡ２酵素活性は認
められなかった。ホスフォリパーゼＡ２酵素活性の測定
方法を以下に示す。 反応試薬１ ０．２Ｍ トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０ ０．２ｍｌ ２％トリトンＸ−１００含有２０ｍＭ卵黄レシチン ０．０５ｍｌ １Ｍ ＣａＣｌ₂ ０．０２５ｍｌ ０．２Ｍ ＡＴＰ ｐＨ７．０ ０．０１ｍｌ ０．１Ｍ ＣｏＡ ｐＨ６．０ ０．０２ｍｌ １０ユニット／ｍｌ アシルＣｏ−Ａシンセタ−ゼ ０．０５ｍｌ Ｈ₂Ｏ ０．１４５ｍｌ 反応試薬２ ０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５ ０．０４ｍｌ ０．３％ ４−アミノアンチピリン ０．１ｍｌ ０．２％ フェノール ０．１ｍｌ ４５ユニット／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．０５ｍｌ ３００ユニット／ｍｌ アシルＣｏ−Ａオキシダーゼ ０．０５ｍｌ １０％トリトンＸ−１００ ０．０１ｍｌ ０．２Ｍ ＡＴＰ ｐＨ７．０ ０．０５ｍｌ １０ｍＭ ＦＡＤ ０．００５ｍｌ Ｈ₂Ｏ ０．０９５ｍｌ 反応試薬３ ２０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド ０．５ｍｌ 反応停止液 ５％ ソディウムドデシルサルフェイト １．５ｍｌ 反応試薬１にホスフォリパーゼＡ２酵素液を０．０５ｍ
ｌ加え、３７℃で１０分間反応させる。次に反応試薬２
及び反応試薬３を加えて３７℃で５分間反応させる。次
に反応停止液を加えて５００ｎｍの吸光度を測定するこ
とによりホスフォリパーゼＡ２酵素活性を求めることが
できる。

【００４５】数々の研究を繰り返したところ、本遺伝子
を放線菌で発現することも可能なことを見いだした。す
なわち、プラスミドｐＰＬＡ５１ ０．５μｇを 制限
酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したＤＮＡを調製
した。一方、放線菌由来ベクタープラスミドｐＩＪ６８
０（ＫＩｅｓｅｒ，Ｔ． ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰ
ＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ：Ｔｈｅ Ｊｏ
ｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ２９８−２
９９、１９８２）０．５μｇを 制限酵素ＢａｍＨＩで
切断した後、先に示した方法でアルカリ性ホスファター
ゼ処理を行った。以上の２種類のＤＮＡ溶液を混合し、
先に示した方法でライゲーションを行った。これをホッ
プウッド（Ｈｏｏｐｗｏｏｄ）らの方法［「ジェネティ
ック・マニピュレーション・オブ・ストレプトマイセス
・ア・ラボラトリーマニアル：ザ・ジョン・イネス・フ
ァンデーション（ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴ
ＩＯＮ ＯＦ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ Ａ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ：Ｔｈｅ ＪｏｈｎＩｎ
ｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」１０３−１２２（１
９８２年）］によってコンピテント化したストレプトマ
イセス・リビダンスに形質転換し、チオストレプトン耐
性コロニーを選択した。このようにしてホスフォリパー
ゼＡ２遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプ
ラスミドを保持する形質転換微生物を取得し、それより
得られた組換えプラスミドｐＰＬＡ１０１と命名した。
この制限酵素切断地図は図５に示す通りであった。

【００４６】プラスミドｐＰＬＡ１０１を保持する形質
転換微生物をチオストレプトン１０μｇ／ｍｌ含有トリ
プチックソイ培地にて２８℃一昼夜培養した後、培養液
を１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離処理して沈澱とろ
液を回収した。この沈澱に、該培養液と同量の１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕を行っ
た。

【００４７】この破砕液とろ液を適宜希釈した後、これ
をホスフォリパーゼＡ２酵素液として、先に示したホス
フォリパーゼＡ２酵素活性測定を行った。なお比較のた
めにｐＩＪ６８０をトランスフォーメーションしたスト
レプトマイセスの破砕液とろ液についても前記と同様の
処理を行い、ホスフォリパーゼＡ２活性を測定した。そ
の結果、プラスミドｐＰＬＡ１０１を保持した形質転換
微生物でのろ液の活性は１．０４ユニット／ｍｌ、菌体
破砕液での活性は０．０７ユニット／ｍｌであったが、
ｐＩＪ６８０を持つもののろ液の活性は０．０２ユニッ
ト／ｍｌ、菌体破砕液での活性は０であった。なお、ス
トレプトマイセス・ビオラセオルバーＡ−２６８８株の
培養ろ液の活性は０．０５ユニット／ｍｌ、菌体破砕液
での活性は０であった。これより、ホスフォリパーゼＡ
２活性をもつ形質転換体が得られていることが確認され
た。この形質転換体をストレプトマイセス・リビダンス
ＴＫ２４−ｐＰＬＡ１０１（Ｓｔｒｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４−ｐＰＬＡ１０１）（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３５４６）と命名した。さらに得られたホ
スフォリパーゼＡ２を含むろ液をアセトン抽出、ＣＭセ
ファロース、ＤＥＡＥセファロース等により精製し、分
子量が１５，０００±１，０００（セファデックスゲル
Ｇ１００によるゲル濾過法）であること、等電点がｐＩ
７．５±０．５であること、カルシウムイオン存在下、
ｐＨ８．０、１０分間処理において、５０℃まで安定、
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジン酸に基質特異性を示す等の物理化学
的性質を確認した。また本ホスフォリパーゼＡ２は、目
的どおりカルシウムの酵素法による測定や、レシチンか
らの新規な食品添加リン脂質製造にも有用有効である発
現蛋白であることを確認した。即ち、本ホスフォリパー
ゼＡ２においては、カルシウムイオンの濃度に依存して
直線的に活性の増強が認められたのに対し、対照とした
蜂毒起源のホスフォリパーゼＡ２は極めて低濃度領域の
カルシウムイオンで最大の活性化が起きてしまうことが
認められた。

【００４８】

【発明の効果】本発明によると、カルシウムの測定や、
レシチンからの新規な食品添加リン脂質の製造に広く用
いることのできる有用なホスフォリパーゼＡ２を効率よ
く生産する微生物が提供でき、この微生物を用いて該酵
素を量産する方法が確立される。

【００４９】また、本発明によって、ホスフォリパーゼ
Ａ２の全アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする遺
伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたので、該酵素の基質
及び補酵素特異性の変換や耐熱性の向上などのプロテイ
ンエンジニアリングが可能となった。

【００５０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５６７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ストレプトマイセス・ビオラセオルバー 株名：Ａ−２６８８ 配列の特徴： ２１−１０７ Ｅ シグナルペプチド １０８−４７３ Ｅ ホスフォリパーゼＡ２遺伝子 配列 CCCCACCTTG GAGGCCGCCC GTG CGC ACC ACC ACC AGG ACC CGG ACC ACG CTC 53 Val Arg Thr Thr Thr Arg Thr Arg Thr Thr Leu -25 -20 GCC GCC GTC GGT GCG GCG CTC GCC CTC GGC GTC GCC GCC GCG CCC GCC 101 Ala Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Pro Ala -15 -10 -5 CAG GCG GCC CCC GCG GAC AAG CCC CAG GTA CTC GCC TCC TTC ACG CAG 149 Gln Ala Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln 1 5 10 ACC AGC GCG TCC AGC CAG AAC GCC TGG CTC GCG GCC AAC CGG AAC CAG 197 Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln 15 20 25 30 TCC GCC TGG GCC GCC TAC GAG TTC GAC TGG TCC ACG GAC CTG TGC ACC 245 Ser Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr 35 40 45 CAG GCG CCC GAC AAC CCC TTC GGC TTC CCG TTC AAC ACG GCC TGC GCG 293 Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala 50 55 60 CGC CAC GAC TTC GGT TAC CGC AAC TAC AAG GCG GCG GGC AGC TTC GAC 341 Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Ser Phe Asp 65 70 75 GCC AAC AAG AGC CGT ATC GAC AGC GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGC 389 Ala Asn Lys Ser Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg 80 85 90 GTC TGC ACC GGC TAC ACC GGC GAG AAG AAC ACG GCC TGC AAC AGC ACC 437 Val Cys Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr 95 100 105 110 GCC TGG ACC TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGC TGAGCCGAGC 483 Ala Trp Thr Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly 115 120 CGAGCCGAGC CGAACGAGCC TGCCGAGCCG AGCAGGGCGG AGCAGGCAGC GCGGGCCCCG 543 GGCCGAGGAG GGGAAGACGC ATGC 567

【００５１】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２６塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ホスフォリパーゼＡ２遺伝子プローブ Ｐ
ＬＡ１ 配列 GCSCCSGCSG ACAAGCCSCA GGTSCT 26

【００５２】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：２６塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ホスフォリパーゼＡ２遺伝子プローブ Ｐ
ＬＡ２ 配列 GACTTCGGST ACCGSAACTA CAAGGC 26

【００５３】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：２６塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ホスフォリパーゼＡ２遺伝子プローブ Ｐ
ＬＡ３ 配列 GCSTTCTACG AGGACATGAA GCGSGT 26

【００５４】

【配列表】

配列番号：５ 配列の長さ：２９塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ホスフォリパーゼＡ２遺伝子プローブ Ｐ
ＬＡ４ 配列 GACAACCCCT TCGGSTTCCC STTCAACAC 29

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本願ホスフォリパーゼＡ２のアミノ酸配
列を示す図である。

【図２】図２は図１のアミノ酸をコードするホスフォリ
パーゼＡ２遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図３】図３はプラスミドｐＰＬＤ５１におけるストレ
プトマイセス・ビオラセオルバー由来の染色体ＤＮＡの
制限酵素地図である。

【図４】図４はプラスミドｐＰＬＤ５１の構造を示す模
式図である。

【図５】図５はプラスミドｐＰＬＡ１０１の構造を示す
模式図である。

【図６】図６はホスフォリパーゼＡ２精製標品のＮ末端
側アミノ酸配列、及びアスパラギニルエンドペプチダー
ゼ処理断片のアミノ酸配列を示す図である。なお、Ｘは
不明アミノ酸を示す。

【図７】図７はオリゴヌクレオチドプローブの作製に用
いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。

【図８】図８は本発明で用いたホスフォリパーゼＡ２遺
伝子発現ベクターの構築の流れを示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:04） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１で表されるアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を有する組換えプラスミドによって形質転換
   されたストレプトマイセスに属する微生物であることを
   特徴とするホスフォリパーゼＡ２を生産する実質上純粋
   な微生物。
2. 【請求項２】 形質転換されたストレプトマイセスに属
   する微生物が、プラスミドｐＰＬＡ１０１によって形質
   転換されたものである請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 プラスミドｐＰＬＡ１０１によって形質
   転換されたストレプトマイセスに属する微生物がストレ
   プトマイセス・リビダンスＴＫ２４−ｐＰＬＡ１０１
   （ＦＥＲＭ Ｐ−１３５４６）である請求項２記載の微
   生物。
4. 【請求項４】 図１で表されるアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を有することを特徴とするホスフォリパーゼ
   Ａ２を発現する実質上純粋なＤＮＡ。
5. 【請求項５】 塩基配列が図２で表される塩基配列であ
   る請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 図１で表されるアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を有する組換えプラスミドによって形質転換
   された微生物であるホスフォリパーゼＡ２を生産する実
   質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物か
   らホスフォリパーゼＡ２を採取することを特徴とするホ
   スフォリパーゼＡ２の製造方法。
7. 【請求項７】 形質転換された微生物が、プラスミドｐ
   ＰＬＡ１０１によって形質転換された微生物である請求
   項６記載の製造方法。
8. 【請求項８】 プラスミドｐＰＬＡ１０１によって形質
   転換された微生物が、ストレプトマイセス・リビダンス
   ＴＫ２４−ｐＰＬＡ１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５４
   ６）である請求項７記載の製造方法。