JP5918141B2 - 酸性ホスホリパーゼのクローニング、発現および用途 - Google Patents
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Description
油を精製する方法の最初の工程は脱ガム質である。脱ゴム質工程中にゴム質物、初期ホスホリピッドが除去される。それらは油の味に悪い影響を与え且つ油精製方法のさらなる工程を妨げる。
リン含量は脱ガム質の程度の指標となるので、得られた脱ガム質油の品質は残存するリンの含量を求めることによって算定される。精製方法のさらなる工程のために、リンの残存量が10ppmより少ない脱ガム質油が求められる。
酸性脱ガム質方法において油は酸で処理される。酸は非水和性ホスホリピッドを水和性ホスホリピッドに変換する。水和性ホスホリピッドは油不溶性となる。油不溶性スラリーが遠心分離あるいは濾過により油から除去されて形成される。この方法の後、油中に残存するリンの含量は約25〜100ppmである。
酵素的脱ガム質は、食用油からホスホリピッドを穏やかに除去するために、効率的な、費用効果の高い且つ環境に優しい方法を提供する。
牛および豚膵臓からおよびミツバチの毒素や幾つかのヘビ種からホスホリパーゼA2の抽出は既に知られている。ホスホリパーゼは、バクテリアやカビの如き微生物からも抽出されるしまた組換え技術によって十分な収率で製造することもできる。
この脱ガム質方法で、油は規定量の水と混合される。次いで、酵素含有水相と油相は酵素が働くように混合される。水の量は、ここでは、できるだけ少なくすべきである。多量の水を用いるとエネルギー消費量が増加し且つ処分費用も増加する。それ故、少ない水含量(2%)を用いる酵素的脱ガム質方法は、既にこの点で有利である。
特許文献4は、分子量65kDaのホスホリパーゼが食用油の脱ガム質用に水含量5%で65℃までの温度でアスペルギルス フミガタス(Aspergillus fumigatus)中で用いられることが記載されている。
特許文献5は、油に関して15%の水含量で、60℃で6時間で油の脱ガム質のためにバチルス セレウス(Bacillus cereus)のホスホリパーゼCを使用することを記載している。この方法の後で、残存するリンの含量は5ppmより少なくなる。
特許文献6には、油の脱ガム質の方法の反応時間はホスホリパーゼA1またはA2とホスホリパーゼCとの反応で、それぞれ、30分間短くなることが記載されている。
生物工学において、ホスホリパーゼはホスホリピッドの抽出用生物触媒として用いられる。ホスホリパーゼは極性脂質であり、それらの親油的および親水的構造の特徴により乳化剤として作用する。実施例は、改質レシチンの製造に、ソース、マヨネーズおよびサラダドレッシングの製造における食品乳化剤として、ミルク、ココアおよびコーヒー粉末の如きインスタント粉末の製造に、チョコレートの製造における流動改良剤として、および食品補助剤としての、ホスホリパーゼの用途である。製薬および化粧品工業において、ホスホリピッドとリゾホスホリピッドは、クリーム、ローション、ゲルおよびリポゾーム調合品の製造に用いられている。
このように、技術分野において、応用可能性の大きな且つ最大限に利用された分野を持つ、ホスホリパーゼの変わらない需要がある。
さらに、ホスホリパーゼ活性を有する蛋白質の製造は、簡単な、費用効率がよく且つ商業的であるべきである。さらに、ホスホリパーゼ活性を持つ蛋白質の製造のために適切な、本発明による発現構造が提供されるべきである。
この点に関し耐熱性(以下において、耐高温性または耐温性とは耐熱性と同じ意味である)とは、2%の水含量の油脱ガム質法の条件下、60℃の温度で6時間後に、酵素がその活性を工業的に利用できる程度まで保持していることを意味する。酵素が残存するリンの含量がいわゆる技術的に重要でない油を生産する場合、酵素は、その活性を工業的に利用できる程度まで保持している。好ましくは、酵素的に脱ガム質された油の残存リンの含量が10ppm未満、より好ましくは5ppm未満である。
当該技術分野の水準で公知のホスホリパーゼは本発明の範囲から除外される。
それ故、本発明によるエイ.フミガタスに由来する(以下、「から誘導された」が「に由来する」と同じ意味で用いられる)ホスホリパーゼは3〜5の広いpH範囲で活性であり且つこの範囲で広い至適活性を示すことは特に有利である。それ故、本発明によるホスホリパーゼはそれらが本質的にリパーゼ活性を示さないという利点を持つだけではない。それらは、さらに、広いpH範囲に亘り酵素活性を発現ししかもそのため広いpH範囲に亘って用いられる。
さらに、633のアミノ酸を持つホスホリパーゼ(WO2008/040466)および611のアミノ酸を持つリゾホスホリパーゼ(WO2008/040465)はアスペルギルス フミガタスRH3949から単離された。
さらに、28〜30kDaの範囲の小さな分子量を持つ酸性ホスホリパーゼ(pl 4.1)は、アスペルギルス フミガタスRH3949のゲノム中に発見された。
それ故、本発明によるホスホリパーゼは、アスペルギルス フミガタスはもちろんのこと、Af293の如き密に関連したアスペルギルス フミガタス菌のリパーゼとして注釈された配列からの公知のホスホリパーゼとは異なっている。
驚いたことに、本発明によるDNA配列は、菌株Af293のゲノム配列から誘導されたプライマーによってアスペルギルス菌株RH3949から単離され得ることが発見された(実施例4参照)。このことは、増幅のために用いられた菌株RH3949(周囲単離体)がAf293(臨床単離体)と表現型的に異なっており、それ故殆ど間違いなく遺伝子的(配列)にも異なっているために予測されなかった。このように、菌株Af293のゲノムDNA上のN2−3948とApal−3949に隣接する結合部位を持つ他のプライマー対によってRH3949からのホスホリパーゼ遺伝子を増幅させることは可能ではなかった。
遺伝子の増幅はアスペルギルス フミガタスRH3949のゲノムDNAからポリメラーゼ鎖反応(PCR)の助力により実施された。
本発明によるSEQ ID NO:2によるホスホリパーゼ配列は当該技術分野の水準のホスホリパーゼ配列と比較された。アミノ酸配列の部分的類似性は他のアスペルギルス菌株からの公知のアミノ酸配列すなわちアスペルギルス ツビンゲンシス(Aspergillus tubingensis)のリパーゼ(WO98/45453)あるいはアスペルギルス フォティダス(Aspergillus foetidus)からのリゾホスホリパーゼ(EP0808903)と60%、アスペルギルスニガーのホスホリパーゼ(WO03/097825、WO98/31790)と59%の類似性を持つことが発見された。
驚いたことに、本発明によるアスペルギルス フミガタスRH3949から単離されたホスホリパーゼは、食用油の酵素的脱ガム質の条件下では、この方法と関連するリパーゼ活性を示さない。さらに、この酵素は、これまでに知られた他のアスペルギルス菌株からのホスホリパーゼに対し著しく広いpH至適範囲と耐高温性をもっている。すなわち、本発明による酵素は、油の中のトリグリセリド結合の如何なるあるいは単に重要でない部分をも加水分解しないので、食用油の酵素的脱ガム質の方法で有利に用いられる。
そのような異形の製造は、一般に、当該技術分野で公知である。例えばポリペプチドのアミノ酸配列異形はDNAによる突然変異によって製造される。核酸配列の突然変異誘発と変化のための方法は当該技術分野でよく知られている(例えばトミックら、NAR、18:1656(1990)、ギーベルとスプルティス NAR、18:4947(1990)参照)。
ホスホリパーゼBまたはリゾホスホリパーゼは標準酵素EC分類EC3.1.1.5によるポリペプチドである。
核酸に関して“作用結合”は、プロモーターの転写開始の適切な位置と方向において同じ核酸分子の部分としての化合物のことを言っている。プロモーターへの機能的結合におけるDNAはプロモーターの転写開始制御下に置かれている。コード化配列はセンス配向また非センス配向で調節配列と作用的に結合されている。ポリペプチドに関して、作用結合は同じポリペプチドの部分としての、すなわちペプチジル結合を介しての、結合のことを言っている。
そのようなDNAは、通常組換えDNAと呼ばれている。すなわち、適当なDNAは完全に合成されたDNA、半合成DNA、生物学的起源から単離されたDNAおよび導入されたRNAから誘導されたDNAからなる。一般に、導入されたDNAは受容体DNAの遺伝子型の本来の部分ではないが、本発明によれば遺伝子は特定の遺伝子型から単離されてもよく、そしてその遺伝子の場合により変性され且つ引き続く多重複写体が、例えば特定の遺伝子産品の生産を増加させるために、同じ遺伝子型中に導入されてもよい。
形質転換のために、本発明で用いられるDNAは、環状、線状、二本鎖または一本鎖であることができる。一般にこのDNAはプラスミドDNAの如きキメラ性DNAであり、調節配列が両側に配置されそして転質転換された細胞中に存在する組換えDNAの発現を裏付けるコード域も含有する。例えば、このDNAそれ自体は細胞中で活性であり、その細胞中とは異なる起源から誘導されるプロモーターを含有もしくは成ることができあるいは細胞すなわち形質転換対象細胞中に既に存在しているプロモーターを用いることもできる。
一般に、導入されるDNAは、DNAのサイズとともに増大する物理的、化学的または酵素的減成に対する感応性を最小とするために比較的小さく約30kb未満である。
適当な宿主細胞の例は、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾプス(Rhizopus)、トリコダーマ(Trichoderma)、ニューロスポラ(Neurospora)、ムコル(Mucor)、ペニシリウム(Penicillium)属等の菌類細胞例えばクルイベロマイセス(Kluyveromyces)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)、トリコスポロン(Trichosporon)、シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、ハンセニュラ(Hansenula)、ピキア(Pichia)属等のイーストである。適当な宿主システムは、例えばアスペルギリ(Aspergill:例えばアスペルギルス ニガー(ATCC 9142)、アスペルギルス フィカウム(ficuum)(NRLL 3135)、もしくはトリコダーマ(例えばトリコダーマ リーゼイ QM6a)の如き菌類およびサッカロマイセス例えばサッカロマイセス セルヴィジェ、またはピキア例えばピキア パストリス、またはハンセニュラ例えばH.ポリモルファ(DSMZ 70277)の如きイーストである。そのような微生物は、確立された寄託機関例えばアメリカン タイプ カルチャー コレクション(ATCC)、セントラルビューロー フォル シメルカルチャー(CBS)またはドイッチェ サムルング ヒュル マイクロオーガニズメン ウント ゼルクルトゥレン GmbH(DSMZ)あるいは他の寄託機関から得ることができる。
本発明により用いられるベクターは発現の増幅のための適当な配列を含有することもできる。
発現カセットは、さらなる成分例えば天然産亜鉛指蛋白質またはキメラ性亜鉛フィンガ蛋白質を包含する亜鉛フィンガ蛋白質の如き内因性もしくは外因性成分によって調節されうる成分を含有することができる。
本発明により用いられる発現カセットは、同様に、エンハンサー成分または上流プロモーター成分を含有することもできる。
形質転換体を同定する能力を改善するために、選択可能またはスクリーン可能なマーカー遺伝子は発現カセットに含まれていてもよい。そのようなマーカー遺伝子は当業者によく知られている。
乾燥組成物は、その利用におけるpH値の如きある種の条件を制御するために、塩、特にリン酸塩およびその脱水形態の如き他の添加剤ならびにポリ(ビニルピロリドン)の如き安定剤等を含有することもできる。
好ましい利用は植物油の脱ガム質のための方法に本発明のホスホリパーゼを持つポリペプチドを用いることである。脱ガム質されるため食用油は、例えば本発明のポリペプチドで処理されそれによってホスホリピッドの大部分が加水分解され、引き続き加水分解されたホスホリピッドを含む水相が油から分離される。そのような方法はホスホリピッドを含有する植物油例えば大豆油、菜種油およびひまわり油の如き植物油の精製に特に適している。
ホスホリパーゼ処理は、一般にホスホリパーゼが水溶液中に、好ましくは平均粒径<10μmの滴の形態で、分散されるようにして行われる。水の量は、好ましくは、油に対して0.5〜5重量%(w/w)である。乳化剤は場合により添加してもよい。エマルジョンを保つために機械的に撹拌してもよい。ホスホリパーゼによる処理は約3.5〜約5.0の範囲のpH値で実施される。この方法のpH値は約3.5〜約5、好ましくは3.8〜4.5、最も好ましくは4.0〜4.2の範囲にある。酵素の能力発揮を最大とするためである。pH値は、例えばクエン酸、クエン酸緩衝液、リン酸または塩酸の添加によって調節される。適切な温度は一般に30℃〜70℃であり、好ましくは45℃〜65℃であり、最も好ましくは55〜62℃である。反応時間は典型的には1〜12時間、好ましくは2〜6時間である。適切な酵素量は一般に、油1kg当たり、通常120〜3,000ユニット、好ましくは250〜2,000ユニット、最も好ましくは750〜1,500ユニットである。
ホスホリパーゼ処理は水相と油相の分離に引き続き行われる。分離は慣用手段例えば遠心分離によって行うことができる。水性溶液はホスホリパーゼを含有しそしてこの酵素はこの方法の経済性を改善するために再使用されることができる。
この処理はそれ自体知られた方法によって行うこともできる。
有利なことに、本発明のホスホリパーゼはドウ(パン生地)や焼パン製品を製造するのに用いることもでき、それによって本発明の有効量のポリペプチドがドウの中で作用する。本発明のホスホリパーゼ活性を有する、ポリペプチドを添加することによって、ドウやそのドウによって作られた焼きパン製品の1つまたは幾つかの性質は、本発明のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドが添加されないドウや焼きパン製品と比較して改善される。
ドウはここで十分に混練またはロールされた固体である小麦粉および他の成分の混合物として規定される。ドウは、生でも混練されても、予め調理されてもプレベークされていてもよい。
これらの焼きパン製品の製造において、本発明のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドおよび/または1種またはそれ以上のさらなる酵素がそれぞれの用途について好適な調合物中に、例えば乾燥品の形態で、液体としてあるいはプレミックスとして、添加されてもよい。さらに、1種またはそれ以上のさらなる酵素がドウに添加されてもよい。これらのさらなる酵素は如何なる起源のものでもよく、例えば哺乳類や植物から誘導されたものでもよい。好ましくは、それらは微生物起源のものであり、そして細菌や菌類に由来するものが特に好ましい。
このまたはこれらの場合によりさらに添加される酵素あるいは酵素類は、本発明のホスホリパーゼが活性を有するポリペプチドと別にあるいは一緒に、焼きパン用剤の成分あるいはドウ添加物として、場合により添加されてもよい。
本発明は、同様にドウおよび/またはドウから作られた焼きパン製品を調製するための、例えば粉体組成物の形態にある、プレミックスに関するものでもある。それにより、このプレミックスは本発明のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドを含有する。
本発明のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドは、錦糸のような布素材の加工の際の洗滌工程において、繊維のさらなる処理を容易にするために用いることもできる。洗滌により得られる改良は染色中の動きのみならず繊維やそれから作られた布地のさらなる機械的および酵素的加工に影響を与える。
本発明は添付の図面に基づいてさらに記載される。
ホスホリパーゼ活性の決定
1ホスホリパーゼ単位(PLU)はホスファチジル コリンから標準条件で1分間当たり1μmolの脂肪酸を放出する酵素の量に相当する。
基質エマルジョン:
1gのエピクロン(Epikuron)200(ルーカスメイヤー社の大豆から誘導された精製ホスファチジル コリン、現在カーギル社で入手可能)、100mlの脱イオン水および5mlの0.32M CaCl2溶液がウルトラ タラックス(Ultra Turrax)により24,000rpmで2分間ホモゲナイズされた。この基質エマルジョンは4℃から8℃で3〜4日間安定である。
他の溶液:
脱ミネラル水中の0.32MgCl2溶液、新鮮3.3mMクエン酸−1水和物溶液、10mM KOH溶液、1%トリトンX100(フルカ社)溶液、
酵素溶液:
酵素調合物が脱イオン水中に溶解される。そのバッチ中の酵素濃度は2.5Ug−1を超えない。
操作:
本試験値
10ml 基質エマルジョン
10ml 1%トリトンX100溶液
5ml 3.3mMクエン酸−1水和物溶液
が25mlの広口エルレンマイヤー フラスコ中にピペットされそして40℃で10分間加熱された。pH値は約3.3−3.5に調節される。
0.1mlの酵素溶液を添加した後、分析バッチが40℃で10分間インキュベートされた。インキュベーション時間が終了したとき、溶液は10ml KOHでpH10.0まで滴定された。その際、最初の5mlのKOHは急激に加えられた(その間:約1分)。KOHの消費量が記録される。
空試験値
酵素母液が95℃で15分間加熱されて不活性化される。室温まで冷却したのち、さらなる処理は本試験値に関するものと同じである。空試験値のインキュベーションは必要がない。
評価
CKOH(mol l−1) KOH溶液の濃度
Δt (min) インキュベーション時間
Cs (g ml−1) 試料の濃度
v (ml) 使用した容積
ホスホリパーゼの検出のための、pH3.5での高速試験
試薬:
基質エマルジョン
1gエピクロン−200が100mgのミリキュー(MilliQ)水および5mlの0.32M塩化カルシウム溶液と混合されそしてウルトラ−タラックスによってホモゲナイズされる(約24000rpmで約1−2分間)。
分析のための基質エマルジョン10mlが10mlの1%のトリトンX−100溶液と5mlの3.3mMクエン酸溶液−1水和物溶液と混合される。
遊離脂肪酸、セミマイクロ試験(ベーリンガー)
(セミマイクロ試験は反応混合物A、反応混合物BおよびN−エチルマレイミド用試薬を含有している)。
操作
最初に、5μlの稀釈された酵素溶液が微量滴定板上に準備されそして0.1mlの基質エマルジョンと混合される。
この基質/酵素バッチは40℃で10分間水浴中でインキュベートされる。次いで、5μlのバッチが100μlの反応混合物Aに対し第2の微量滴定板中へピペットされそして40℃で5分間インキュベートされる。
インキュベーション時間が終了したのち、反応混合物BとN−エチルマレイミド溶液の1:1比の混合物5μlが添加され、そして再度40℃で5分間インキュベートされる。
反応バッチが赤色となればホスホリパーゼ活性がある。
遊離脂肪酸の含量の決定
試薬
エタノール(96%溶液)、トルエン
エタノールとトルエンが1:1の比(v/v)で混合される。
0.1Nエタノール性KOH
エタノール中の1%フェノールフタレン溶液
操作
約3gの水無し油がエルレンマイヤーフラスコ中に正確に小数点以下4桁まで秤量され、20mlのエタノール−トンエン混合物に溶解され、2〜3滴のフェノールフタレンと混合されそして赤色が継続するまで0.1NKOH溶液で滴定する。
評価
酸価は遊離脂肪酸の含有量の指標である。酸価は1kgの油中に含有される遊離脂肪酸の中和に必要な水酸化セリウムの量のことである。酸価(AN)は次式により計算される。
N KOHの規定度
E 秤量された脂肪のg量
56.1 KOHのg/molのモル質量
酸価は遊離脂肪酸(FFA)の含有量をパーセントで計算するために用いられる。
リパーゼの検出
オリーブ油寒天上のリパーゼの定性的検出はクーカーとジェガー(KoukerとJaeger)の方法(Applied,Environ,Microbiol.,59:211−213(1987))により同様に実施される。
リパーゼ活性の検出のため、1%オリーブオイルを用いて製られたトリブチリン(tributyrin)寒天(Fluka 91015)製の寒天板が用いられる。pH値は5.5に調節される。
リパーゼ活性の検出は、ウィンクラーとスタックマン(Winkler and Stuckmann(1979)(J.Bac.,138:663−670(1979))による、0.5Mクエン酸塩/リン酸塩緩衝液中に基質として乳化されたp−ニトロフェニルパルミテート、pH5.1(シグマ N2752)を用いて光度測定により行われる。
アルペルギルス フミガタス株RH3949からのホスホリパーゼの抽出
アスペルギルス フミガタスを50mlの媒体が充填された200mlの振盪フラスコ中、28℃、200rpm、5日間生長させた。媒体は0.5%エピクロン(Epicuron)200(ルーカス メイヤー)、0.5%コーン浸漬粉、0.2% NH4NO3、100mM KH2PO4および0.1%トリトンX100からなる。pH値は殺菌前にpH6に調節された。媒体は胞子懸濁物と一緒にインキュベートされた。5日後、培養液上澄が濾過により菌糸体から分離されそしてその液体中のホスホリパーゼ活性が測定された。
アスペルギルス フミガタス株RH3949からのホスホリパーゼの精製
工程1:アニオン交換体、マクロ プレップQ
ホスホリパーゼを精製するために、まず蛋白質の分離がアニオン交換体マクロ プレップ(Macro Prep)Qで行われた。
この目的のために、実施例1による培養液からの濃縮培養液上澄が、その蛋白質溶液が緩衝液Aとして同じ導電性を持つまで完全な脱塩水で稀釈された。次いで、蛋白質試料が1M NaOHでpH7に調節されそして緩衝液Aによって平衡化されたカラムに掛けられた。緩衝液Aでカラムを洗滌後、ホスホリパーゼが線状に増加するNaCl勾配0〜1Mで溶離された。ホスホリパーゼ活性を有するフラクションが合せられ、さらに精製された。
緩衝液A:5mM CaCl2+20mM トリス−HCl、pH7.0
緩衝液B:5mM CaCl2+20mM トリス−HCl、pH7.0+1M NaCl
工程2:HIC フェニルセファローズ6高速流低置換
工程1によるホスホリパーゼ活性を有する蛋白質試料が3.4M硫酸アンモニウム溶液と1:1の比で混合されそして1M NaOH溶液でpH7.0に調節された。試料を、同様に緩衝液Aで平衡化された、フェニルセファローズカラムに掛けたのち、ホスホリパーゼが硫酸アンモニウム勾配を減らしながら溶離された。
緩衝液A:5mM CaCl2+20mM トリス−HCl、pH7.0+1.7M硫酸アンモニウム
緩衝液B:5mM CaCl2+20mM トリス−HCl、pH7.0
工程3 ゲル濾過、セファローズ 12HR10/30
最後の精製工程として、蛋白質がゲル濾過カラムで分離された。この目的のために、工程2によるホスホリパーゼ試料が透析管(ナチュリン蛋白質ファース(Naturin protein farce))中完全な脱塩水に対して1.5時間透析され、引き続いて凍結乾燥された。凍結乾燥品は500μlの完全な脱塩水中に吸収された。それぞれ250μlずつ2段階でカラムに掛けられそして緩衝液Aで溶離された。
緩衝液A:5mM CaCl2+20mM トリス−HCl、pH7.0
精製されたホスホリパーゼがIEFゲルに掛けられた。結果は図1に示されている。
バンドは同定のために切り出されそして記載された分析法によりホスホリパーゼ活性のために試験された。
N−末端蛋白質配列
スーペローズ(Superose)を経た最終精製工程の後、精製された蛋白質が元のゲル上に分離された。ホスホリパーゼ活性を有する蛋白質バンドが切り出されそして分子量を決定するためにSDSゲルに再び掛けられた。N−末端アミノ酸の決定のために、蛋白質バンドが元のゲルからPVDF膜(フルオトランス トランスファー メンブレン(Fluotrans Transfer Membrane))に移されそしてN−末端アミノ酸配列がクーマジー ステインニング法(Coomassie Staining Process)によりアミノ酸シークエンサー(アプライド バイオシステムズ モデル 470A(Applied Biosystems Model 470A))で決定された。
それらは、1DVSAS VLQKL SLFAQY16(SEQ ID NO:3)である。
ホスホリパーゼ遺伝子のN−末端アミノ酸配列はアスペルギルス フミガタス株 Af293(GenBank EAL86100)からの細胞外リパーゼの遺伝子と高い配列類似性を有することが配列の比較からわかる。
アスペルギルス フミガタス株 RH3949からの染色体ホスホリパーゼ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるクローニング
ホスホリパーゼDNAの増幅のための異なるオリゴプライマーがアスペルギルス フミガタス リパーゼの染色体DNA配列のデータから誘導された。染色体DNA調合がハイネス.エム.ジェイ(Hynes,M.J)ら、(1983)Mol.Cell.Biol.3、1430−1439の改良説明書に従って行われた。ホスホリパーゼ遺伝子の増幅はPCR法によって行われた。PCR生物はpCR2.1−TOPP プラスミド中にクローン化され且つ配列された。ここで、プラマー組 N2−3948と3949Apalは本発明のホスホリパーゼDNAを持つ遺伝子に結合することが示されている。
このホスホリパーゼをコードする開放読みとりフレームは299のアミノ酸を含む1052のヌクレオチドを含有する。このホスホリパーゼ遺伝子は3つのイントロンを含有する。
誘導されたN−末端アミノ酸配列は蛋白質配列によって決定されたペプチド配列に相当する(実施例3、SEQ ID NO:3)。
誘導された分子量約28.6kDaはSDS−PAGEによって決定された約29kDaに相当する(実施例8)。
発現ベクターpAB500−PL3949の構築
発現ベクターpAB500−PK3949中で、ホスホリパーゼ遺伝子はティー.リーゼイ(T.reesei)cbhlプロモーターとcbhlターミネーターの制限下にある。
プラスミドpAB500−PL3949の構築のために、ホスホリパーゼをコードする遺伝子はPCRによってプラスミドpPL3949.Topo2.5から増幅される。PCR生成物は、酵素Avrll/Paclで加水分解され、引き続きプラスミドpAB500のティー.リーゼイcbh1プロモーターの後のSpelとPacl開裂部位に挿入された。得られたプラスミドはpAB500−PL3949として言及される。
プラスミドpAB500の構築は次の工程により行われた。
さらなる開裂部位(cbhlプロモーターとcbhlターミネーター間のSacll部位中のSpelとPacl)を導入することによって、プラスミドpAB487がプラスミドpALK487から製造された(WO94/28117)。Spel−Pacl開裂部位はホスホリパーゼ遺伝子の直接クローニングのために用いられる。
そのプロモーターとそのターミネーターを包含するamdS遺伝子はPCRによってプラスミドp3SR2(GenBank 16371)から増幅された。PCR生成物はAsclとNrulで切断され、pAB487のAscl/Stul開裂部位に挿入され、それによってプラスミドpAB500が得られた。
ティー.リーゼイ(T.reesei)の形質転換
ティー.リーゼイの形質転換と処理のために用いられた技術はペンティレら(Penttila et al.)によるものである(1987.Gene61:155−164)。ティー.リーゼイRH32439はプラスミドpAB500−PL3949から単離された、線状発現カセットで形質転換された。
形質転換体は単一胞子単離法によって選択され且つ精製された。全ての形質転換体のうち、最も高い分泌能力を持つものが選ばれそしてさらに酵素物質の製造のために実施例7で用いられた。
振盪フラスコ中の培養による酵素溶液の製造
実施例6の発現カセットを持つ形質転換体が振盪フラスコ中でセルラーゼが誘発媒体上で培養された。6日間生育の後に得られた培養物濾液が酵素の特徴付け(実施例8)と油脱ガム質法の分析(実施例9)のために用いられた。
組換えホスホリパーゼの特徴付け
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分子量の決定は本発明のホスホリパーゼについて約29kDaの分子量をもたらした。
組換えホスホリパーゼのN−末端配列化はクロマテック社(Chromatec、ドイツ国)により行われた。配列化により得られたアミノ酸配列はホスホリパーゼのN−末端配列(実施例3)に相当する。
MALD1−MSによる組換え蛋白質の同定はプロタゲン社(Protagen、ドイツ国)により行われた。この結果は本発明のホスホリパーゼの蛋白配列が正しいことを確認した。
酵素活性の温度依存性は、上記した決定法により異なる温度で決定された。ホスホリパーゼの至適温度は50℃である(図2参照)。
酵素活性の至適pH値は上記した決定法により異なるpH値で決定された。この目的のために、反応バッチ中のpH値はクエン酸を用いて調節された。
酵素はpH3〜5の広いpH範囲で活性である(図3参照)。
リパーゼ活性は上記した決定法により決定された。本発明によるエイ.フミガタス(A.fumigatus)ホスホリパーゼは、非常に低いリパーゼ活性を有する。計算によれば、ホスホリパーゼ活性対リパーゼ活性の比は7480:1であった(実験変動限界±10%)。
エイ.フミガタスRH3949からの遺伝子を持つ組換えトリコダーマ リーゼイ株の培養液上澄からの酵素による油の脱ダム質
200gの食用油(リン含量163.6ppmの大豆油1:リン含量161.6ppmの菜種油:リン含量592.8ppmの大豆油2およびリン含量81.1ppmの大豆油3)が400mlのガラスビーカー中で0.42mlの46%クエン酸溶液および水と混合された。これにより、全水含量は2%を超えなかった。反応混合物のpH値は7%NaOH溶液(0.6ml)を添加することによってpH4.0に調節された。本発明による酵素溶液(50U)を添加した後、反応バッチはウルトラ タラックス(Ultra Turrax)により24,000rpmで2分間混合された。引き続き、混合物が3ツ口丸底フラスコに充填され、そしておだやかに撹拌しながら(200rpm)、55℃もしくは60℃でインキュベートされた。
酵素溶液が添加された後120分して、それぞれ試料20mlが採取された。試料は4,300×gで5分間遠心分離されそして酸化マグネシウムを添加することにより850℃で灰化した後、リンppmで示される、ホスホリピッド含量が、油中830nmでリンモリブデン酸錯体として光度計で求められた。
アスペルギルス フミガタスRH3949の組換え株に由来するホスホリパーゼによる、食用油の55℃もしくは60℃での脱ガム質法で得られた結果は表2に示されている。
この結果は、クエン酸を用いる水脱ガム質法と比較して本発明による酵素を用いる脱ガム質法での明瞭な脱ガム質効果を示している。僅か4時間後で残存リンの含量が10ppmよりも少なくなっている。
油脱ガム質法における遊離脂肪酸の含有量
油脱ガム質法における遊離脂肪酸の含有量の決定は参考例3に記載されたとおりに行われた。食用油は実施例9に記載されたとおりホスホリパーゼと混合されそして57℃で6時間培養された。ホスホリピッドの酵素的加水分解は脂肪酸を開裂させるホスホリパーゼによって引き起こされる。比較の理由のため、同じ分析が空値として純粋食用油を用いて行われた。
空値(BV)と比較して、試料中の遊離脂肪酸(FFA)の含有量は極く僅かに上昇しそして食用油をホスホリパーゼで57℃の温度で処理した後の差(ΔFFA)は0.18%である(第3表)。
Claims (16)
- リパーゼ活性を持たず、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであって、このDNAは、
a)配列番号1によるヌクレオチド配列を有するDNA、
b)配列番号1によるコード化配列を有するDNA、
c)配列番号2による蛋白質配列をコードするDNA、
d)図7による制限マップを持ち、受託番号DSM22741で寄託されている、プラスミドpPL3940−Topo2.5によってコードされるDNA、
e)a)、b)、c)またはd)によるDNAの1つと、ストリンジェント条件下で交雑するDNA、
f)a)、b)、c)、d)またはe)のDNAと遺伝子コードが縮重しているDNA、および
g)a)〜f)によるDNAに対する相補鎖
から選択され、ここでDNAはアスペルギルスに由来する、ことを特徴とする、上記DNA。 - 請求項1に記載のDNAの1つの類似体を含有する核酸であって、この核酸はリパーゼ活性を有さず、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして
該ポリペプチドは配列番号2と少なくとも90%の同一性を持つアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする、上記核酸。 - 適当な宿主細胞中でホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドの発現を指示するために用いられる1つまたはそれ以上の配列と作用可能に結合している、請求項1または2に記載のDNAまたは核酸の配列を含有する発現構造であって、ポリペプチドの発現を指示するために用いられる上記配列はアスペルギルス属のグルコアミラーゼプロモーターもしくはα−アミラーゼプロモーター、トリコダーマ属のセルラーゼ(セルビオヒドロラーゼ)プロモーター、ホスホグリセレート キナーゼもしくはグリセロールアルデヒド−3−ホスフェート ディヒドロゲナーゼであるグルコース代謝経過中の酵素のためのプロモーター、キシラナーゼ プロモーターもしくはエノラーゼプロモーター、およびさらに分泌リーダー配列を含有するこれらのプロモーターから選ばれるプロモーターである、上記発現構造。
- 請求項3に記載の発現構造によって形質転換されたことを特徴とする組換え宿主細胞。
- アスペルギルス属、リゾプス属、トリコダーマ属、ニューロスポラ属、ムコル属もしくはペニシリウム属の細菌細胞、またはクルイヴェロマイセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカトマイセス属、トリコスポロン属、シュワニオマイセス属、ハンセニュラ属もしくはピキア属のイースト細胞に由来することを特徴とする請求項4に記載の組換え宿主細胞。
- 図7による制限マップを有し、受託番号DSM22741で寄託されているpPL3949−Topo2.5プラスミド。
- a)請求項1または2に記載のDNAまたは核酸のコードする部分によってコードされるポリペプチド、
b)配列番号2による配列を有するポリペプチド、
c)配列番号2のアミノ酸1〜299と少なくとも90%同一性を有する配列を有するポリペプチド、
d)(i)配列番号1のヌクレオチド55〜1106、
(ii)配列番号1のヌクレオチド55〜1106に含有されるcDNA配列、または
(iii)(i)もしくは(ii)の相補鎖
と、ストリンジェント条件下で交雑する核酸配列によってコードされるポリペプチド、
から選ばれる、リパーゼ活性を有さず、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチド。 - 28〜30kDaの範囲にある分子量を有し、レシチンの2つの脂肪酸の少なくとも1つを加水分解することができ、リパーゼ活性を示さず、耐熱性を有しそしてアスペルギルス属の生物体から単離し得る、ことを特徴とする、請求項7に記載のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチド。
- アスペルギルス フミガタスから単離されうることを特徴とする請求項8に記載のポリペプチド。
- 配列番号2による配列を含有することを特徴とする、請求項8〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを添加剤とともに含有する、ことを特徴とする、ホスホリパーゼ組成物。
- 食品もしくは動物飼料用の1つもしくはそれ以上の酵素をさらに含有する請求項11に記載のホスホリパーゼ組成物。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項11または12に記載のホスホリパーゼ組成物の、植物油の脱ガム、ドウおよび/または焼きパン製品の製造または日用品の製造のため、動物飼料への添加物として、あるいは布地原材料の加工のため、の使用。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項4または5に記載の宿主細胞がポリペプチドの発現を支える条件下で生育され、引き続いてポリペプチドが抽出される、上記方法。
- a)処理されるべき植物油が準備され、
b)請求項7〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項11または12に記載のホスホリパーゼ組成物を含有する水溶液が上記油に添加され、
c)b)による反応バッチが30℃と70℃の間の温度で1〜12時間加熱され そして
d)水相と油相が分離される
ことを特徴とする、植物油の脱ガム方法。 - 処理されるべき植物油が予め前処理されている請求項15に記載の植物油の脱ガム方法。
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