MX2011012971A

MX2011012971A - Metodos para preparar panes usando fosfolipasas y composiciones de masa de pan y mezcla de pan que comprenden fosfolipasas.

Info

Publication number: MX2011012971A
Application number: MX2011012971A
Authority: MX
Inventors: Jesper Vind; Leonardo De Maria; Morten Tovborg Jensen; Ingrid Van Haesendonck; Goedele Van Der Biest
Original assignee: Puratos Nv
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-11-23
Also published as: CN102803480A; CA2764692A1; BRPI1010893A2; AU2010257550A1; WO2010142697A1; US20120156328A1; EP2440657A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para preparar un pan usando variantes de fosfolipasa y composiciones de pan y mezcla de pan que comprenden las mismas.

Description

METODOS PARA PREPARAR PANES USANDO FOSFOLIPASAS Y COMPOSICIONES DE MASA DE PAN Y MEZCLA DE PAN QUE COMPRENDEN FOSFOLIPASAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para preparar panes usando variantes de fosfolipasás .

Antecedentes de la Invención La WO 98/26057 describe una lipasa/fosfolipasa de Fusarium oxysporum y su uso en horneado o panificación.

Soragni et al., 2001, EMBO J. 20: 5079-5090 describen una fosfolipasa (TbSPl) de Tuber borchii y la secuencia de nucleótidos de un ADNc de un gen que la codifica. La WO 2004/097012 describe una fosfolipasa de Fusarium venentatum y secuencia de ácido nucleico de un gen que la codifica. La WO 00/32758 describe variantes de enzimas lipolíticas que tienen actividad de fosfolipasa y galactolipasa y su uso en horneado. La WO 2008/025674 describe el uso de fosfolipasas para reducir la cantidad de huevos usados en pasteles.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a métodos para preparar panes usando una fosfolipasa, en donde la fosfolipasa comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, REF. :225857 110, 116, 119 o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 y/o una extensión de aminoácidos en el N y/o C-terminal de la fosfolipasa. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar un pan, que comprende: a) preparar una masa de pan que comprende lecitina de yema de huevo y una fosfolipasa de la presente invención; b) hornear la masa de pan para producir un pan.

La fosfolipasa se puede aplicar en la preparación de un pan de cualquier manera adecuada, incluyendo, por ejemplo, por adición directa de la fosfolipasa a una masa de pan, por la adición de una fosfolipasa a ingredientes usados para preparar una masa de pan (antes de la formación de la masa de pan) , o por tratamiento de los ingredientes de pan, tal como, yema de huevo, lecitina de yema de huevo o una proteína no de huevo, separados de la masa de pan, seguidos por la inclusión de los ingredientes tratados en una masa de pan) . La fosfolipasa también se puede aplicar en la forma de una mezcla seca que comprende uno o más ingredientes de masa de pan.

La invención también proporciona un método para preparar un pan usando una cantidad reducida de huevo o proteína de huevo (por ejemplo, lecitina de yema de huevo) en comparación a la cantidad de huevo o proteína de huevo usada en recetas convencionales de pan. Por consiguiente, en otra modalidad, el método comprende poner en contacto una masa de pan con una fosfolipasa de la presente invención, en donde la masa de pan contiene 0.3-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 %, en peso de huevo entero.

En otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una combinación de una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo y una fosfolipasa de la presente invención.

En otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una combinación de una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo y una fosfolipasa de la presente invención, en donde también se usa una cantidad reducida de huevo o proteína de huevo en la receta de pan. En aún otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una combinación de una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo y una fosfolipasa de la presente invención, en donde la masa de pan contiene 0.3-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero.

La presente invención también se refiere a composiciones de masa de pan que comprenden una fosfolipasa de la presente invención y a una mezcla seca de composiciones que comprenden una fosfolipasa de la presente invención y uno o más ingredientes de masa de pan.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Actividad de fosfolipasa: El término "actividad de fosfolipasa" se define en la presente como actividad enzimática que cataliza la liberación de grupos acilo grasos de un fosfolípido. Una fosfolipasa puede catalizar también la liberación de grupos acilo grasos de otros lípidos . Para los propósitos de la presente invención, se puede determinar la actividad de fosfolipasa en el ensayo LEU al hidrolizar lecitina de soya (L-a-fosfatidil-colina de soya Sigma P5638) . La mezcla de reacción de 20 g/L de lecitina, desoxicolato de sodio 3.2 mM, cloruro de calcio 6.4 mM se mantiene a pH 8.0 durante la reacción (2 minutos) a 40°C. La actividad de fosfolipasa se expresa como la velocidad de consumo del valorante (NaOH 0.1 M) necesaria para mantener el pH constante, con relación a una norma, durante la neutralización del ácido graso liberado.

Variante: El término "variante" se define en la presente como un polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa que comprende una alteración (sustitución, inserción, y/o supresión o extensión N o C terminal) de uno o más (varios) residuos de aminoácido en una o más (varias) posiciones específicas. El polinucleótido alterado se obtiene a través de intervención humana por modificación de la secuencia de polinucleótido, por ejemplo, la secuencia de polinucleótido descrita en SEQ ID NO: 1; o una secuencia homologa de esta. La variante también se puede preparar por síntesis génica o cualquier otro método adecuado para obtener una secuencia de ácido nucleico de interés que codifica para la fosfolipasa variante.

Enzima Tipo Silvestre: El término "tipo silvestre" denota una fosfolipasa expresada por un organismo que se presenta de forma natural, tal como un hongo bacteriano, de levadura, o filamentoso encontrado en la naturaleza, secuencia de ácido nucleico que codifica para la enzima tipo silvestre que no se ha alterado por intervención humana.

Enzima Progenitora: El término "progenitor" como se usa en la presente significa una fosfolipasa a la cual se hace una modificación, por ejemplo, sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamientos para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. Este término también se refiere al polipéptido con el cual se compara y alinea una variante. El progenitor puede ser un polipéptido que se presenta de forma natural (tipo silvestre) o una variante. Por ejemplo, el polipéptido progenitor puede ser una variante de un polipéptido que se presenta de forma natural que se ha modificado o alterado en la secuencia de aminoácidos. Un progenitor también puede ser una variante alélica, que es un polipéptido codificado por cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico.

Aislado: El término "aislado", como en "polipéptido aislado" o "variante de fosfolipasa aislada" o "polinucleótido aislado", como se usa en la presente se refiere a una variante o a un polipéptido que se aisla de una fuente (microorganismo) . En un aspecto, la variante polipéptido es al menos 1 % pura, de manera preferente al menos 5 % pura, de manera más preferente al menos 10 % pura, de manera más preferente al menos 20 % pura, de manera más preferente al menos 40 % pura, de manera más preferente al menos 60 % pura, de manera aún más preferente al menos 80 % pura, y de manera más preferente al menos 90 % pura, como se determina por SDS-PAGE. En un aspecto, el polinucleótido aislado es al menos 1 % puro, de manera preferente al menos 5 % puro, de manera más preferente al menos 10 % puro, de manera más preferente al menos 20 % puro, de manera más preferente al menos 40 % puro, de manera más preferente al menos 60 % puro, de manera aún más preferente al menos 80 % puro, y de manera más preferente al menos 90 % puro, y de manera aún más preferente al menos 95 % puro, como se determina por electroforesis de agarosa.

Sustancialmente puro: El término "sustancialmente puro" denota en la presente una preparación de polipéptido que contiene a lo mucho 10 %, de manera preferente a lo mucho 8 %, de manera más preferente a lo mucho 6 %, de manera preferente a lo mucho 5 ¾, de manera preferente a lo mucho 4 %, de manera preferente a lo mucho 3 %, de manera aún preferente a lo mucho 2 %, de manera preferente a lo mucho 1 %, y de manera aún preferente a lo mucho 0.5 % de otro material de polipéptido con el cual está asociado de forma nativa o recombinante . Por lo tanto, se prefiere que la variante o polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92 % puro, de manera preferente al menos 94 % puro, de manera aún más preferente al menos 95 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 97 % puro, de manera más preferente al menos 98 % puro, de manera aún más preferente al menos 99 %, de manera más preferente al menos 99.5 % puro, y de manera aún más preferente al menos 100 % puro en peso del material de polipéptido total presente en la preparación. Las fosfolipasas variantes de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede lograr, por ejemplo, al preparar la fosfolipasa variante por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos clásicos de purificación.

El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se usa en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de polipéptidos genéticamente manejados. De esta manera, un polinucleótido sustancialmente puro contiene a lo mucho 10 %, de manera preferente a lo mucho 8 %, de manera más preferente a lo mucho 6 , de manera más preferente a lo mucho 5 %, de manera más preferente a lo mucho 4 %, de manera más preferente a lo mucho 3 %, de manera aún más preferente a lo mucho 2 %, de manera más preferente a lo mucho 1 %, y de manera aún más preferente a lo mucho 0.5 % en peso de otro material de polinucleótido con el cual está asociado de forma nativa o recombinante. Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3 que se presentan de manera natural, tal como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos 90 % puro, de manera más preferente al menos 92 % puro, de manera más preferente al menos 94 % puro, de manera más preferente al menos 95 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 97 % puro, de manera aún más preferente al menos 98 % puro, de manera mucho más preferente al menos 99 % puro, y de manera aún mucho más preferente al menos 99.5 % puro, en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación de polinucleótido esté esencialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual está asociado de forma nativa o recombinante. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semi-sintético, sintético o cualquier combinación de éstos.

Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se define en la presente como un polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa que está en su forma final después de la traducción y cualquier modificación post-transduccional , tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. Para un gen específico, el polipéptido maduro puede variar dependiendo de qué hospedador se use para producir el polipéptido .

Secuencia codificadora de polipéptido maduro: El término "secuencia codificadora de polipéptido maduro" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido maduro que tiene actividad de fosfolipasa .

Identidad: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad" . Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y unsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalidad de abertura de separación de 10, penalidad de extensión de separación de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . La salida de Needle marcada "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porciento de identidad y se calcula como sigue: (Residuos Idénticos x 100 )/ (Longitud de Alineación - Número Total de Separaciones en Alineación) Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias desoxirribonucleótido se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete en EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, supra; http://emboss.org), preferentemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalidad de abertura de separación de 10, penalidad de extensión de separación de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4 ) . La salida de Needle marcada "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porciento de identidad y se calcula como sigue: (Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100) / (Longitud de Alineación - Número Total de Separaciones en Alineación) Secuencia homologa: el término "secuencia homologa" se define en la presente como un polipéptido previsto que da un valor E (o puntuación de expectación) de menos de 0.001 en una búsqueda tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener y S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) con la fosfolipasa A2 (SEQ ID NO: 2) de Tuber borchii. De manera alternativa, el término "secuencia homologa" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos/secuencia de polipéptido que tiene identidad al polipéptido maduro que codifica para parte de SEQ ID NO: l o al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO : 3, de al menos 75 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, más preferentemente al menos 90 , más preferentemente al menos 91 %, más preferentemente al menos 92 %, de manera aún más preferentemente al menos 93 %, de manera más preferentemente al menos 94 %, de manera aún más preferentemente al menos 95 %, tal como al menos 96 %, al menos 97 , al menos 98 %, o aún al menos 99 %.

Fragmento de polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" se define en la presente como un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos del amino-terminal y/o carboxilo del polipéptido maduro; o una secuencia homologa de este; en donde el fragmento tiene actividad de fosfolipasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 90 residuos de aminoácido, más preferentemente al menos 100 residuos de aminoácido, y de manera más preferentemente al menos 110 residuos de aminoácido del polipéptido maduro o una secuencia homologa de éste.

Subsecuencia : El término "subsecuencia" se define en la presente como una secuencia de polinucleótido que tiene uno o más (varios) nucleótidos suprimidos del extremo 5' y/o 3' de la secuencia codificadora de polipéptido maduro o una secuencia homologa de esta; en donde la subsecuencia codifica para un fragmento de polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa .

Variante alélica: El término "variante alélica" denota en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico, la variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden estas imperceptibles (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden producir polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido que codifica para una variante alélica de un gen.

Secuencia codificadora: cuando se usa en la presente el término "secuencia codificadora" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de polipéptido. Los límites de la secuencia codificadora se determinan en general por un cuadro de lectura abierto, que empieza usualmente con el codón de inicio ATG o los codones de inicio alternativos tal como GTG y TTG y termina con un codón finalizador tal como TAA, TAG, y TGA. La secuencia codificadora puede ser un ADN, un ADNc , sintética, o polipéptido recombinante .

ADNc: El término "ADNc" se define en la presente como una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula de ARNm, madura, empalmada, obtenida de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias de intrón que usualmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. El trascripto de ARN, primario, inicial es un precursor a ARNm que se procesa a través de una serie de pasos antes de aparecer como un ARNm empalmado, maduro. Estos pasos incluyen la remoción de secuencias de intrón por un proceso llamado empalme. Por lo tanto, el ADNc derivado de un ARNm, carece de cualquier secuencia de intrón.

Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" como se usa en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra individual o de doble hebra, que se aisla de un gen que se presenta de forma natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintética. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificadora de la expresión.

Secuencias de control: El término "secuencias de control" se define en la presente como que incluye todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña al polipéptido que codifica para el polipéptido o nativa o extraña entre sí. Estas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia guía, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia promotora, una secuencia de péptido de señal, y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención trascripcional y transduccional . Las secuencias de control se pueden proporcionar con ligadores para el propósito de introducir sitios específicos de restricción que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificadora del polinucleótido que codifica para un polipéptido.

Operablemente enlazado: El término "operablemente enlazado" denota en la presente una configuración en la cual se coloca una secuencia de control en una posición apropiada con relación a la secuencia codificadora de la secuencia de polinucleótido tal que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificadora de un polipéptido.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso comprendido en la producción del polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional , traducción, modificación post-transduccional, y secreción.

Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención y está operablemente enlazado a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.

Célula hospedadora: El término "célula hospedadora" , como se usa en la presente, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible a transformación, transíección, traducción, y similares, con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprenda un polinucleótido de la presente invención.

Propiedad mejorada: El término "propiedad mejorada" se define en la presente como una característica asociada con una fosfolipasa variante que se mejora en comparación a al fosfolipasa progenitora. Estas propiedades mejoradas incluyen, pero no se limitan a," perfil de actividad alterada dependiente de temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto, y estabilidad química. En la técnica son bien conocidos los métodos para medir estas propiedades. Se puede medir la termoestabilidad, por ejemplo, por Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) .

Especificidad mejorada de producto: El término "especificidad mejorada de producto" se define en la presente como una fosfolipasa variante que presenta un perfil alterado de producto con relación al progenitor en el cual el perfil alterado del producto mejora el desempeño de la variante en una aplicación determinada con relación al progenitor. El término "perfil de producto" se define en la presente como la composición química de los productos de reacción producidos por hidrólisis enzimática . En una modalidad, la especificidad mejorada de producto es una relación incrementada de actividad contra fosf tidil-etanolamina (PE) de huevo a fosfatidil-colina (PC) de huevo (es decir, relación PE/PC) en comparación al progenitor.

Pan: El término "pan" se define en la presente como cualquier producto horneado basado en harina y una levadura química. El término "masa de pan" se define en la presente como la suma de ingredientes de pan antes del mezclado y/u horneado. En una masa de pan, los ingredientes convencionales y sus cantidades típicas (en % en peso de la masa) son: - proteína, por ejemplo lecitina de yema de huevo, por ejemplo, en la forma de huevos enteros, yemas de huevo, o polvo de huevo: 0.6-3 % de lecitina de huevo o 10-50 % de huevos enteros .

- Harina (no tratada, térmicamente tratada, clorada) : 15-30 % - Almidón (modificado, nativo) : 0-10 % - Azúcar: 15-25 % - Emulsionador (mono- y di-glicéridos de ácidos grasos, ásteres de propilenglicol de ácidos grasos, esteres de ácido láctico de mono- y di-glicéridos de ácidos grasos, estearoil-2-lactilato de sodio): 0.1-1 % Polvo de hornear (que contiene bicarbonato y ácido o sales ácidas) : 0.5-1 % - Hidrocoloides (goma de acacia, goma de guar, goma de tara, goma de xantano, carragenina, goma de acacia, celulosa, celulosa modificada, peptina) : 0-1 % - Grasa vegetal (por ejemplo, aceite, margarina, manteca, pasta grasa, grasa en polvo) : 5-30 % - Agua: hasta 100 % Propiedades mejoradas de pan: Las propiedades mejoradas de pan incluyen propiedades mejoradas de volumen, y textura, por ejemplo, cohesión, elasticidad, y resiliencia del producto horneado.

Se puede medir el volumen mejorado del pan como el volumen del pan sin el bote o molde dividido por la masa del mismo pan medida por el método de desplazamiento de semilla de colza, que es bien conocido en la técnica. La unidad para el volumen específico es milímetro por gramo.

La textura mejorada de un pan se puede medir como se describe en Bourne M.C. (2002), 2 ed., Food Texture and Viscosity: Concept and Measurement, Academic Press.

La cohesión y elasticidad mejoradas de un pan se pueden medir como sigue: se realizan dos deformaciones consecutivas de una muestra cilindrica de migaja de pan (45 mm) realizadas con una sonda cilindrica (100 mm) con una deformación máxima de 50 % de la altura inicial del producto a una velocidad de deformación de 2 mm/segundo y un tiempo de espera entre las deformaciones consecutivas de 3 segundos. La fuerza se registra como una función del tiempo. La cohesión se calcula como la relación entre el área bajo la segunda curva de deformación (hacia abajo + hacia arriba) y el área bajo la primera curva de deformación (hacia abajo + hacia arriba) . La elasticidad se calcula como la relación de la altura de la descompresión de la segunda deformación a la altura de la descompresión de la primera deformación con 3 segundos de tiempo de espera entre las deformaciones. La resiliencia se calcula como la relación entre el área bajo la primera curva hacia arriba y la primera curva hacia abajo después de la deformación.

La elasticidad mejorada de un pan se puede medir como sigue: Penetración de migaja de pan con una sonda cilindrica (25 mm) hasta una deformación total de 25 % de la altura inicial de la muestra, a una velocidad de deformación de 2 mm/segundo y manteniendo la deformación objetivo constante durante 20 segundos. Se registra la fuerza como una función del tiempo. La elasticidad se calcula como la relación (expresada en porciento) entre la fuerza medida después de 20 segundos a deformación constante a la fuerza aplicada para obtener la deformación objetivo.

Se pueden determinar las propiedades mejoradas de pan al comparar un pan preparado usando la fosfolipasa de la presente invención con un pan de control preparado bajo las mismas condiciones (por ejemplo, misma receta), pero sin el tratamiento de fosfolipasa.

En otra modalidad, las variantes de fosfolipasa se usan para obtener pan comercialmente adecuado, tal como, panes que tienen un volumen, textura, cohesión, elasticidad y resiliencia, adecuadas, cuando se usa una cantidad reducida de huevo en la receta de pan. Las propiedades del pan (por ejemplo, volumen y textura, incluyendo cohesión, resiliencia y elasticidad) tienden a deteriorarse cuando se reduce la cantidad de huevo en la receta de pan. Las fosfolipasas variantes de la presente invención se pueden usar para contrarrestar el deterioro al adicionar las fosfolipasas variantes a la masa de pan, preferentemente, en combinación con una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo. Por consiguiente, las fosfolipasas variantes pueden producir propiedades de pan comercialmente aceptables cuando se reduce la cantidad de huevos en la receta de pan, tal como, una reducción de la cantidad de huevo (medida por ya sea la lecitina de huevo o como huevos enteros) usada en la receta de pan por al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % en comparación a una receta convencional de pan. Las recetas convencionales de pan usan en general de 0.3-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevos enteros.

Convenciones para Designación de Variantes Para propósitos de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa descrita en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 se usa para determinar el correspondiente residuo de aminoácido en otra fosfolipasa (variante o progenitora) . Para propósitos de numeración, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 son los aminoácidos 91 a 210 del polipéptido de SEQ ID NO: 2. El programa SIGNALIP3.0 que predice los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2 es un péptido de señal. Para propósitos de numeración, el primer aminoácido del polipéptido maduro se designa por el número o posición 1, y por consiguiente, de acuerdo con las variantes de fosfolipasa de la presente invención, el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 (y la numeración de aminoácidos) es: SPASDTDRLL YSTSMPAFLT AKRNKNPGNL DWSDDGCSNS PDRPAGFNFL DSCKRHDFGY RNYKKORRFT EPNRKRIDDN FKKDLYNECA KYSGLOSWKG VACRKIANTY YDAVRSFGWL La secuencia de aminoácidos de otra fosfolipasa se alinea con la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa descrita en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, y en base a la alineación, se puede determinar el número de posición de aminoácido que corresponde a cualquier residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa descrita en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2. Se puede hacer una alineación de secuencias de polipéptido, usando por ejemplo "ClustalW" (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). Una alineación de secuencias de ADN se puede hacer usando la alineación de polipéptido como una plantilla, reemplazando los aminoácidos con el correspondiente codón de la secuencia de ADN.

Los algoritmos de comparación de secuencias en pares en uso común son adecuados para detectar similitudes entre secuencias de polipéptido que no se han desviado más allá del punto de aproximadamente 20-30 % de identidad de secuencia (Doolittle, 1992, Protein Sci. 1: 191-200; Brenner efc al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 6073-6078). Sin embargo, los polipéptidos verdaderamente homólogos con el mismo pliegue y una similar función biológica frecuentemente se han desviado al punto donde la comparación tradicional basada en secuencias falla en detectar su relación (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Bíol. 295: 613-615). Se puede lograr mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para buscar bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso iterativo de búsqueda en base de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr aún mayor sensibilidad si la familia o superfamilia para el polipéptido de interés tiene uno o más (varios) representantes en las bases de datos de estructuras de proteína. Los programas tal como GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol. Bíol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural, y potenciales de solvatación) como entrada a una red neural que predice el pliegue estructural de una secuencia de consulta. De manera similar, se puede usar el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Bíol. 313: 903-919, para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden usar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido de interés, y estos modelos se pueden valorar para exactitud usando una variedad de herramientas desarrolladas para ese propósito.

Para proteínas de estructura conocida, están disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de SCOP de proteína se han alineado estructuralmente, y estas alineaciones están accesibles y descargables . Se pueden alinear dos o más estructuras de proteína usando una variedad de algoritmos tal como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33:88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés a fin de descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567). Estas alineaciones estructurales se pueden usar para predecir los residuos de aminoácido estructuralmente y funcionalmente correspondientes en proteínas dentro de la misma superfamilia estructural. Esta información, junto con la información derivada del modelado por homología y búsquedas de perfiles, se puede usar para predecir qué residuos mutar cuando se mueven mutaciones de interés de una proteína a un homólogo cercano o remoto.

Al describir las varias variantes de fosfolipasa de la presente invención, la nomenclatura descrita más adelante se adapta para facilidad de referencia. En todos los casos, se emplea la abreviación aceptada de aminoácido de una sola letra o de tres letras de IUPAC.

Sustituciones . - Para una sustitución de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido o posición, y aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de serina con cisteína en la posición 52 se designa como "Ser52Cys" o "S52C", de manera alternativa, "52Cys" o "52C" . Se separan múltiples mutaciones por marcas de adición ("+")/ por ejemplo, "S52C + D84C" o "52C + 84C" , que representan mutaciones en las posiciones 52 y 84 que sustituyen serina (s) con cisteína (C) , y ácido aspártico (D) con cisteína (C) , respectivamente. La sustitución alternativa en una posición se identifica por una coma, por ejemplo, Ser33Glu, Asp o S33E, D representa una sustitución de serina (S) con ya sea ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) , alternativamente 33 E, D.

Supresiones . - Para una supresión de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición* o simplemente posición*. Por consiguiente, la supresión de serina en la posición 52 se designa como "Ser52*" o "S52*", alternativamente, "52*". Múltiples supresiones se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Ser52* + Asp84*" o "S52* + 084*" .

Inserciones . Para una inserción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, nuevo aminoácido insertado o posición y nuevo aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de serina en la posición 52 se desgina "Ser52SerLys" o "S52SK" , alternativamente, "52SerLys" o "52SK" . Múltiples inserciones de aminoácidos se designan [Aminoácido original, posición, aminoácido original, nuevo aminoácido insertado. #1, nuevo aminoácido insertado #2; etc., o posición y nuevo aminoácido insertado #1, nuevo aminoácido insertado #2; etc.] . Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de serina en la posición 52 se indica como "Ser52SerLysAla" o "S52SKA" o "52SLK" .

En estos casos, los residuos de aminoácido insertados se numeran por la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido que precede los residuos de aminoácido insertados. En el ejemplo anterior, las secuencias de esta manera seria: Extensiones N- y/o C-Terminales . Para una inserción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido N y/o C-terminal original, posición, más extensiones de aminoácido o posición N- y/o C-terminal original más extensiones de aminoácido. Por ejemplo, la extensión C-terminal de la fosfolipasa se puede designar por lo siguiente L12OLDATPG que indica una adición de aminoácidos DATPG a C-terminal . De manera alternativa, se puede indicar una extensión al adicionar numeración adicional de posición de aminoácido. Por ejemplo, la mínima extensión del C-terminal de la fosfolipasa se puede designar por lo siguiente L120+121D+122A+123T+124P+125G, y cuando se combina con una alteración en el aminoácido terminal se puede designar por lo siguiente L120D+121D+122A+123T+124P+125G.

Fosfolipasa Progenitora: La fosfolipasa progenitora incluye un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o una polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2; tal como, al menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 65 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 70 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 75 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 85 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 90 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 91 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 92 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 93 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 94 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 96 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 97 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2, al menos 98 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, o al menos 99 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 .

La fosfolipasa progenitora incluye un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3; tal como, al menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 65 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 70 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 75 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 3 , al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 85 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 90 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 91 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 92 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 93 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 94 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 3 , al menos 96 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 97 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 98 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o al menos 99 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.

En un aspecto, la fosfolipasa progenitora es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 por treinta aminoácidos, veintinueve aminoácidos, veintiocho aminoácidos, veintisiete aminoácidos, veintiséis aminoácidos, veinticinco aminoácidos, veinticuatro aminoácidos, veintitrés aminoácidos, veintidós aminoácidos, veintiuno aminoácidos, veinte aminoácidos, diecinueve aminoácidos, dieciocho aminoácidos, diecisiete aminoácidos, dieciséis aminoácidos, quince aminoácidos, catorce aminoácidos, trece aminoácidos, doce aminoácidos, once aminoácidos, y diez aminoácidos, nueve aminoácidos, ocho aminoácidos, siete aminoácidos, seis aminoácidos, cinco aminoácidos, cuatro aminoácidos, tres aminoácidos, dos aminoácidos, o un aminoácido. Los ejemplos de diferencias de aminoácido incluyen cambios que son de naturaleza menor, tal como sustituciones conservadoras de aminoácido y otras sustituciones que no afectan de forma significativa el plegado tridimensional o la actividad de la proteína o polipéptido ; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino-o carboxil-terminales, tal como un residuo de metionina amino-terminal , un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una marca de afinidad) , tal como un tracto de poli-histidina, o proteína A (Nilsson et al., 1985, E BO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol . 198: 3. Ver también, en general, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Aunque los cambios descritos anteriormente son preferentemente de una naturaleza menor, estos cambios también pueden ser de una naturaleza sustantiva tal como fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más tanto como extensiones amino- o carboxil-terminales .

La fosfolipasa progenitora comprende o consiste preferentemente del polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o una variante alélica de estos; o un fragmento de los mismos que tiene actividad de fosfolipasa. Un fragmento contiene al menos 90 residuos de aminoácido, más preferentemente al menos 100 residuos de aminoácido, y de manera más preferente al menos 110 residuos de aminoácido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 o secuencias homologas del mismo.

La fosfolipasa progenitora se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para propósitos de la presente invención, el término "obtener de" como se usa en la presente en unión con una fuente determinada debe significar que la fosfolipasa progenitora codificada por un polinucleótido se produce por la fuente o por una célula en la cual se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, la fosfolipasa progenitora se segrega de manera extracelula .

La fosfolipasa progenitora puede ser una fosfolipasa fungoidea. En otro aspecto, la fosfolipasa progenitora se obtiene del género Tuber, tal como las especies Tuber borchii o Tuber albidum. Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, tal como the American Type Culture Collection (ATCC, por sus siglas en inglés) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, por sus siglas en inglés) , Centraalbureau Voor Schiramelcultures (CBS, por sus siglas en inglés) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL, por sus siglas en inglés) . En otra modalidad, la fosfolipasa progenitora es la fosfolipasa A2 Tuber borchii o fosfolipasa A2 de Tuber albidum, tal como se describe en Soragni et al., 2001, EMBO J. 20: 5079-5090 y Publicación de Patente de los Estados Unidos 20070092945, que se incorporan de este modo como referencia. Se tenderá que para las especies mencionadas en lo anteriormente la invención abarca tanto estados perfectos como imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos por ejemplo, anamorfos, con respecto al nombre de especie por el cual se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

En otra modalidad, la fosfolipasa progenitora es la fosfolipasa A2 de Tuber borchii que comprende una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 o la fosfolipasa A2 de Tuber albidum que comprende una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

La fosfolipasa progenitora también se puede identificar y obtener , de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, composta, agua, 'etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, composta, agua, etc.), usando las sondas mencionadas anteriormente. Son bien conocidas las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de habitad naturales . El polinucleótido que codifica para una fosfolipasa entonces se puede derivara al examinar similarmente una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo o una muestra mezclada de ADN. Una vez que se ha detectado un polinucleótido que codifica para una fosfolipasa con las sondas adecuadas como se describe en la presente, la secuencia se puede aislar o clonar al utilizar técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, Nueva York) .

La fosfolipasa progenitora también puede incluir polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindibles en los cuales se fusiona otro polipéptido en el N-terminal o en el C- terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Se produce un polipéptido fusionado al fusionar un polinucleótido (o una porción del mismo) que codifica para otro polipéptido a un polinucleótido (o una porción del mismo) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son bien conocidas e incluyen en ligar las secuencias codificadoras que codifican para los polipéptidos de modo que estén en cuadro y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control de los mismos promotores y terminadores . También se pueden construir proteínas de fusión usando tecnología intein en la cual se crean fusiones de forma post-transduccional (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266 : 776-779) .

Fosfolipasas Variantes: En la presente invención, las variantes aisladas de una fosfolipasa progenitora comprenden o consisten de una alteración de una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119, o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde las variantes tiene actividad de fosfolipasa. En una modalidad, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que- tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2; tal como, al menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 65 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 70 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 75 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 85 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 90 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 91 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 92 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 93 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 94 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 96 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 97 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, al menos 98 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, o al menos 99 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante consiste de una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119, O 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, tiene actividad de fosfolipasa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3; tal como, al menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 3 , al menos 65 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 70 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 75 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 85 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 90 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 91 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 92 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 93 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 94 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 96 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 97 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 98 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o al menos 99 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.

La presente invención también se refiere al uso de variantes de fosfolipasa que comprenden o consisten de una alteración de una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119, o 120 de SEQ ID NO: 2, en donde las variantes tienen actividad de fosfolipasa, y comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o fosfolipasa A2 de Tuber albidum; tal como, al menos 60 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 65 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 70 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 75 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 80 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 85 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 90 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 91 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 92 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 93 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 94 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 95 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 96 ' % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 97 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, al menos 98 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum, o al menos 99 % de identidad con la fosfolipasa A2 de Tuber borchii o Fosfolipasa A2 de Tuber albidum.

En un aspecto, la variante de fosfolipasa es un polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 por treinta aminoácidos, veintinueve aminoácidos, veintiocho aminoácidos, veintisiete aminoácidos, veintiséis aminoácidos, veinticinco aminoácidos, veinticuatro aminoácidos, veintitrés aminoácidos, veintidós aminoácidos, veintiuno aminoácidos, veinte aminoácidos, diecinueve aminoácidos, dieciocho aminoácidos, diecisiete aminoácidos, dieciséis aminoácidos, quince aminoácidos, catorce aminoácidos, trece aminoácidos, doce aminoácidos, once aminoácidos, y diez aminoácidos, nueve aminoácidos, ocho aminoácidos, siete aminoácidos, seis aminoácidos, cinco aminoácidos, cuatro aminoácidos, tres aminoácidos, dos aminoácidos, o un aminoácido.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión, o inserción) en una posición que corresponde a la posición 1 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en una posición que corresponde a la posición 1 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 6 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 6 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 30 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 30 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 31 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 31 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 33 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 33 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 38 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 38 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 39 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 39 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 42 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 42 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 43 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 43 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 44 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 44 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 45 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 45 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) with Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 47 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 47 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 52 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 52 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 59 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 59 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 61 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 61 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 64 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 64 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 65 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 65 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 77 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 77 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 84 ' (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 84 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 102 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 102 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) con Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 106 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 106 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 110 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 110 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 116 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 116 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 119 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración). En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 119 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, o Val.

En un aspecto, la fosfolipasa variante comprende una alteración (sustitución, supresión o inserción) en una posición que corresponde a la posición 120 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 para numeración) . En una modalidad, la fosfolipasa variante comprende una sustitución de un aminoácido en la posición que corresponde a la posición 120 (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.

En otro aspecto, la fosfolipasa variante comprende una extensión peptídica de uno o más aminoácidos en el N y/o C-terminal de la fosfolipasa. En una modalidad, la variante comprende o consiste de una inserción en el N- y/o C-terminal de la fosfolipasa de 1 a 10 aminoácidos, o de 1 a 9 aminoácidos, o de 1 a 8 aminoácidos, o de 1 a 7 aminoácidos, o de 1 a 6 aminoácidos, de 1 a 5 aminoácidos, o de 1 a 4 aminoácidos, o de 1 a 3 aminoácidos o de 2 aminoácidos o de 1 aminoácido. En una modalidad, la variante consiste de una inserción en el N- y/o C-terminal de la fosfolipasa de menos de 20 aminoácidos, menos de 19 aminoácidos, menos de 18 aminoácidos , menos de 17 aminoácidos , menos de 16 aminoácidos , menos de 15 aminoácidos , menos de 14 aminoácidos , menos de 13 aminoácidos , menos de 12 aminoácidos , menos de 11 aminoácidos , menos de 10 aminoácidos , menos de 9 aminoácidos, menos de 8 aminoácidos, menos de 7 aminoácidos , menos de 6 aminoácidos, menos de 5 aminoácidos , menos de 4 aminoácidos, menos de 3 aminoácidos, menos de 2 aminoácidos, o 1 aminoácido.

La fosfolipasa variante también puede comprender un truncamiento de uno o más residuos de aminoácido en el N- y/o C-terminal, tal como una supresión de 1 a 30 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 20 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 10 aminoácidos, supresión de 1 a 9 residuos de aminoácido supresión de 1 a 8 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 7 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 6 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 5 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 4 residuos de aminoácido, supresión de 1 a 3 residuos de aminoácido, supresión de 2 residuos de aminoácido o supresión de 1 residuo de aminoácido. Las alteraciones descritas en la presente se pueden usar en combinación, por ejemplo, una sustitución en el aminoácido N- y/o C-terminal combinada con una extensión de péptido N- y/o C-terminal.

En modalidades de ejemplo de las variantes de fosfolipasa de la invención, la variante comprende (usando el polipéptxdo maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) y una o más (varias) alteraciones seleccionadas del grupo que consiste de - sustitución de E o D en la posición 33 (tal como, S33E, D) ; - sustitución de E en la posición 31 (tal como, D31E) ; - sustitución de E en la posición 65 (tal como, K65E) ; - sustitución de T o D en la posición 38 (tal como S38T, D) ; - sustitución de K en la posición 39 (tal como, N39K) ; - sustitución de Y en la posición 110 (tal como, Y110F) ; - sustitución de L, V o A en la posición 106 (tal como, I106L, V, A) ; - sustitución de D, F o C en la posición 45 (tal como, A45D, F, C) ; - sustitución de Y en la posición 47 (tal como, F47F) ; - sustitución de E en la posición 102 (tal como, A102E) . - sustitución de R en la posición 64 (tal como, K64R) ; - sustitución de T en la posición 116 (tal como, S116T) - sustitución de G en la posición 119 (tal como W119G) ; y - sustitución de D en la posición 120 (tal como L120D) ; - inserción en el C-terminal (tal como, inserción de D-A-T-P-G en el C-terminal) .

En modalidades de ejemplo de combinaciones de alteraciones, la variante comprende (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) uno de los siguientes: - una sustitución de Y en la posición 47 más una sustitución de E en la posición 102 (tal como F47Y+A102E) ; o - una sustitución de R en la posición 64 más una sustitución de G en la posición 119 más una sustitución de D en la posición 120 más unan extensión C-terminal de DATPG (tal como K64R+ 119G+L120D+121D+122A+123T+124P+125G) .

En otra modalidad de ejemplo, la variante comprende la creación de un puente extra de disulfuro (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) al hacer las siguientes alteraciones: sustituciones de residuos de cisteína en las posiciones 52 y 84 (tal como, S52C+D84C) sustituciones de residuos de cisteína en las posiciones 59 y 77 (tal como, G59C+I77C) sustituciones de residuos de cisteína en las posiciones 1 y 30 (tal como, S1C+L30C) sustitución de residuos de cisteína en la posición 6 y 30 (tal como, T6C+L30C) .

En modalidades adicionales de ejemplo de la invención, la variante comprende (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) una o más (varias) alteraciones seleccionadas del grupo que consiste de: 31E (tal como D31 E) ; 33C, W, D, M, E, G, A, Y, R, L, Q (tal como, S33C,W,D,M,E,G,A,Y,R,L,Q) ; 38D,A,T (tal COmo S38D,A,T); 39K,C,I,F,L,M,S,P,T,W,R,Q (tal como N39K,C,I,F,L,M,S,P,T,W,R,Q) ; 42V (tal como, D42V) 43W (tal como, R43 ) 44L (tal como, P44L) 45D, F, V, L, K, T, G, R, E, C (tal como, A45D, F,V,L,K,T,G,R,E,C) ; 47Y,L,W,R,V,G,C (tal como, F47Y, L, W, R, V, G, C) ; 61C,F,Y,A,V,K,L,N,E,I,S (tal como R61C, F, Y, A, V, K,L,N, E, I, S) 64R (tal como K65R)¦ 65E (tal como, K65E) ; 77C (tal como, I77C) ; 84C (tal como, D84C) ; 102E,G,H,S (tal como, Al02E, G, H, S) ; 106A,V,P,L (tal como, I106A, V, P, L) ; 110F (tal como, Y110F) 116Q,H,R,T,A,L,I,Y,P,F (tal como, S116Q,H,R,T,A,L, I, Y,P,F) 119V, H, A, R, T, K,L, I,N, G, E,Q, P, C, S, F (tal como, W119V,H,A,R,T,K, L, I, N, G, E, Q, P, C, S ; F) ; 120E,S,A, ,H,Y,P,T,V,Q,R,I (tal como L120E,S,A,K,H,Y,P,T,V,Q,R,I) En modalidades adicionales de ejemplo de la invención, la variante comprende (usando el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 para numeración) una de las siguientes alteraciones : 47Y+102E (tal como, F47Y+A102E) ; 64R+116C (tal como, K64R+S116C) ; 119G+120DDATPG (tal como, W119G+L120DDATPG) ; 119H+120IATRA (tal como, W119H+L120IATRA) ; 119F+120ICNSSL (tal como, W119F+L120ICNSSL) ; 119H+120CNSSLR (tal como, W119H+L120CNSSLR) ; 119H+120IVTRA (tal como, W119H+L120IVTRA) ; 119P+120LCNSSL (tal como, 119P+L120LCNSSL) ; 64R+119G+120DDATPG (tal como, K64R+W119G+L120DDATPG) ; 42V+43W (tal como, D42V+R43W) ; 44L+47L (tal como P44L, F47L) ; 33D+1 19G (tal como, S33D+W119G) ; 33D+39K+119G (tal como, S33D+N39K+W119G) ; 33D+39K+119N (tal como, S33D+N39K+W119N) ; 31Y+33D+39K+119N (tal como, D31Y+S33D+, N39K+W119N) 39K+119G (tal como, N39K+ 119G) Preparación de Variantes Las variantes de una fosfolipasa progenitora se pueden preparar de acuerdo a cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semi-sintéticos , mutagénesis aleatoria, transposición, etc. Los ácidos nucleicos que codifican para fosfolipasas progenitoras que se pueden usar para preparar las variantes de la presente invención incluyen, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico mostrada como SEQ ID NO:l.

Otros ácidos nucleicos que codifican para fosfolipasas progenitoras incluyen secuencias de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones de muy baja severidad, condiciones de baja severidad, condiciones de severidad media, condiciones de severidad media-alta, condiciones de severidad alta, y condiciones de muy alta severidad con la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, una subsecuencia de la misma o una hebra complementaria de la misma (J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, N. Y.). Una subsecuencia contiene al menos 100 nucleótidos contiguos de manera preferente al menos 200 nucleótidos contiguos. Las condiciones de severidad se defienden como pre-hibridación e hibridación a 42°C en 5 x SSPE, 0.3 % SDS, 200 ug/ml de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y ya sea 25 % de formamida para severidades muy bajas y bajas, 35 % de formamida para severidades media y media-alta, o 50 % de formamida para severidades alta y muy alta, siguiente los procedimientos normales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas opcionalmente . Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos usando 2 x SSC, 0.2 % SOS preferentemente a al menos 45 °C (severidad muy baja) , de manera más preferente a al menos 50°C (baja severidad) , de manera más preferente a al menos 55°C (severidad media) , de manera más preferente a al menos 60°C (severidad media-alta) , de manera aún más preferente a al menos 65 °C (alta severidad) , y de manera más preferente a al menos 70°C (severidad muy alta) .

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la cual se crean una o varias mutaciones en un sitio definido en una molécula de polinucleótido que codifica para la fosfolipasa progenitora. La técnica se puede realizar in vitro o in vivo.

La construcción de genes 1 sintéticos conlleva la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido designada para codificar para una molécula de polinucleótido de interés. La síntesis de genes se puede regresar usando varias técnicas, tal como la tecnología basada en microchip multiplex descrita por Tian, et al., (Tian, et . al., Nature 432:1050-1054) y tecnologías similares en donde se sintetizan y ensamblan oligonucleótidos en chips microfluídicos foto-programables .

Se puede lograr in vitro la mutagénesis dirigida al sitio por PCR que comprende el uso de cebadores de oligonucleótido que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede realizar in vitro por mutagénesis de cásete que comprende la escisión por una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica para la fosfolipasa progenitora y la ligación subsiguiente de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Usualmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo extremos adhesivos del plásmido e inserciones para ligarse entre sí. Ver, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 7349-4966.

Se puede lograr in vivo la mutagénesis dirigida al sitio por métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, publicación y solicitud de patente de los Estaos Unidos 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat . Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

La presente invención se puede usar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Hay muchos equipos comerciales disponibles que se pueden usar para preparar variantes de una fosfolipasa progenitora.

Se pueden hacer sustituciones, supresiones y/o inserciones individuales o múltiples de aminoácidos y se pueden probar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o transposición, seguido por un procedimiento pertinente de examen, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o O 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a error, visualización en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Los métodos de mutagénesis/transposición se pueden combinar con métodos de examen automatizado de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutageneizados , clonados, expresados por células hospedadoras . Las moléculas de ADN mutageneizado que codifican para polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente usando métodos normales en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos individuales de aminoácido en un polipéptido de interés.

La construcción génica semi-sintética se logra al combinar aspectos de construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida al sitio, y/o mutagénesis aleatoria, y/o transposición. La construcción semisintética se tipifica por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Las regiones definidas de genes de esta manera se pueden sintetizar de novo, en tanto que se pueden amplificar otras regiones usando cebadores mutagénicos específicos del sitio, en tanto que aún otras regiones se pueden someter a PCR propensa a error o amplificación por PCR no propensa a error. Entonces se pueden transponer los fragmentos de polinucleótido .

Construcción de Ácido Nucleico Un polinucleótido aislado que codifica para una variante de fosfolipasa de la presente invención se puede manipular de varias maneras para proporcionar la expresión de la variante. La manipulación de polinucleótido antes de su inserción en un vector puede se deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Son bien conocidas las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante .

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, que se reconoce por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la fosfolipasa variante . El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección incluyendo promotores imitantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifiquen para polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del operon lac de E. colí, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) , gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y gen de beta-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 80: 21-25) . Los promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en "Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra .

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora fungoidea filamentosa son promotores obtenidos de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proteinasa de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable a ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa-fosf to-isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Daría de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787) , beta-glucosidasa de Trichoderma reesei , celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endogluconasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endogluconasa III de Trichoderma reesei, endogluconasa IV de Trichoderma reesei, endogluconasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutrales Aspergillus niger y triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y promotores imitantes, truncados e híbridos de éstos.

En un hospedador de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa-fosfato-isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) , y 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que se reconoce por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se enlaza de manera operable al terminal 3' del polinucleótido que codifica para la fosfolipasa variante. En la presente invención se puede usar cualquier terminador que es funcional en la célula hospedadora de elección.

Los terminadores preferidos para células hospedadoras fungoideas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) , y gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un AR m que es importante para la traducción por la célula hospedadora. La secuencia guía se enlaza de forma operable al 5' -terminal del polinucleótido que codifica para la fosfolipasa variante. Cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula hospedadora de lección se puede usar en la presente invención.

Las guías preferidas para células hospedadoras fungoideas filamentosas se obtienen de los gentes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y triosa- fosfato- isomerasa de Aspergillus nidulans.

Las guías adecuadas para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharo yces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3 -fofato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente en lazada al 3' -terminal de la. secuencia que codifica para el polipéptido y cuando se transcribe, se reconoce por la célula hospedadora como una señal para adicionar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. En la presente invención se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora de elección.

Las secuencias preferidas de poliadenilación para células hospedadoras fungoideas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusariu oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Las secuencias útiles de poliadenilación para células hospedadoras de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificadora de péptido de señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al amino- terminal de una fosfolipasa variante y dirige el polipéptido codificado en la ruta secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificadora del polinucleótido puede contener una región codificadora de péptido de señal naturalmente enlazada en el cuadro de lectura de traducción con el segmento de la región codificadora que codifica para la fosfolipasa variante segregada. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificadora puede contener una región codificadora de péptido de señal que es extraña a la secuencia codificadora. La región codificadora, extraña, de péptido de señal se puede requerir donde la secuencia codificadora no contenga de forma natural una región codificadora de péptido de señal. De manera alternativa, la región codificadora, extraña de péptido de señal puede reemplazar simplemente la región codificadora, natural de péptido de señal a fin de mejorar la secreción de la fosfolipasa variante. Sin embargo, en la presente invención se puede usar cualquier región codificadora de péptido de señal que dirija el polipéptido expresado en la ruta secretoria de una célula hospedadora de elección .

Las secuencias codificadoras, efectivas de péptido de señal para células hospedadoras , fungoideas, filamentosas son las secuencias codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa. TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutral de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.

Los péptidos de señal útiles, para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para el alfa- factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias codificadoras, útiles de péptidos de señal se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región codificadora de propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos colocada en el amino-terminal de una fosfolipasa variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un cimógeno en algunos casos) . En general un propolipéptido es inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificadora de prolipép ido se puede obtener de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila ( O 95/33836) .

Donde están presentes regiones tanto de péptido de señal como de propéptido en el amino- erminal de un polipéptido, la región de propéptidos está colocada cerca del amino-terminal de un polipéptido y la región de péptido de señal está colocada cerca del amino-terminal de la región de propéptido .

También puede ser deseable adicionar secuencias reguladoras para permitir la regulación de la expresión de la fosfolipasa variante con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que se active o desactive la expresión de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac, y trp. En levadura, se puede usar el sistema de ADH2 o el sistema GAL1 en hongos filamentosos, el promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden usar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos , estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofoliato-reductasa que se amplifica en la presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica para la fosfolipasa variante se enlazará de forma operable con la secuencia reguladora.

Vectores de Expresión Las varias secuencias de nucleótidos y de control, descritas anteriormente, se pueden unir conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica para la variante en estos sitios. De manera alternativa, el polinucleótido se puede expresar al insertar el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificadora está localizada en el vector de modo que la secuencia codificadora se enlaza de forma operable con las secuencias apropiadas de control para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede dar lugar a la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares, cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un microcromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación . De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica conjuntamente con los cromosomas en los cuales se ha integrado. Adicionalmente, se puede usar un vector o plásmido individual o dos o más vectores o plásmidos que contienen conjuntamente el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposon.

Los vectores de la presente invención contienen de manera preferente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, transíectadas , transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia a biocidas o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos, y similares .

Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos que permite que se replique in vivo un plásmido o vector.

Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060, y ???ß? que permiten la replicación en Bacillus .

Los ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedadora de levadura son los orígenes de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fungoidea filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo a los métodos descritos en WO 00/24883.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para incrementar la producción de una variante de fosfolipasa. Un incremento en el número de copia del polinucleótido se puede obtener al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y de este modo copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar para cultivar las células en la presencia del agente seleccionable, apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión, recombinantes , de la presente invención son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obtener variantes de fosfolipasa, sustancialmente puras.

Células Hospedadoras Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedadora de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autoreplicante como se describe anteriormente. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran parte del gen que codifica para el polipéptido y su fuente.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una fosfolipasa variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

La célula hospedadora procariótica puede ser cualquier bacteria Grampositiva o una bacteria Gramnegativa . Las bacterias Grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridiu , Geobacillus, y Oceanobacillus . Las bacterias Gramnegativas incluyen, pero no se limitan a E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria, y Ureaplasma.

Las células hospedadoras bacterianas pueden ser cualquier célula de Bacillus . Las células de Bacillus útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Bacillus alkalophilus, Bacillus, amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis .

En un aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis . En otro aspecto, la célula hospedadora bacterianas es una célula de Bacillus amyloliquefaciens . En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus clausii. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus licheniformis. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus subtilis .

La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula Streptococcus. Las células de Streptococcus útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equí subespecie. Las células Zooepidemicus.

En un aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptococcus equisimilis. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptococcus pyogenes. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptococcus uberis. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptococcus egui subespecie., Zooepidemicus.

La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces . Las células de Streptomyces útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans .

En un aspecto, las células hospedadoras bacterianas es una célula de Streptomyces achromogenes. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de ¦Streptomyces avermitilis. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptomyces coelicolor. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptomyces griseus. En otro aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Streptomyces lividans .

La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar, por ejemplo, por formación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), al usar células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff -Abelson, 1971 , Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o por conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278) . La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar, por ejemplo por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol . 166: 557-580) o electroporación (ver, por ejemplo, Dower et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145) . La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar, por ejemplo por transformación de protoplastos y electroporación (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), por conjugación (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transcucción (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudo onas, se puede efectuar, por ejemplo por electroporación (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57) . La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar, por ejemplo, por competencia natural (ver, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect . Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991), Microbios. 68: 189-2070, por electroporación (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugación (ver, por ejemplo, Cle ell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436) . Sin embargo, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.

La célula hospedadora también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, planta o fungoidea.

En un aspecto, la célula hospedadora es una célula fungoidea. "Hondo" como se usa en la presente incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygo ycota (como se define por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ava edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU) asi como el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra) .

En otro aspecto, la célula hospedadora fungoidea es una célula de levadura. "Levadura" como se usa en la presente incluye la levadura ascosporogenous (Endomycetales) , levadura basidiosporogenous , y levadura que corresponde a los hongos imperfectos (Blastomycetes ) . Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, la levadura se debe definir como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc . App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces ovifor is . En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de Kluyveromyces lcictis. En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica .

En otro aspecto, la célula hospedadora fungoidea es una célula fungoidea filamentosa. "Hongos filamentoso" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eu ycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento y es obligatoriamente aeróbico el catabolismo de carbono. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por brote de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

En otro aspecto, la célula hospedadora, fungoidea, filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporiu , Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma .

En otro aspecto, la célula hospedadora, fungoidea, filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto, la célula hospedadora fungoidea, filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusariu crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochrou , Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecoides , o Fusarium venenatu . En otro aspecto, la célula hospedadora fungoidea, filamentosa es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fungoideas se pueden trasformar por un proceso que comprende la formación de protoplastos , la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. Se puede transformar la levadura usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simón, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; lto et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75: 1920.

Métodos de Producción En los métodos de producción de las variantes de fosfolipasa, las células hospedadoras se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de la variante de la fosfolipasa usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz agitado, o por fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en lotes, en lotes alimentados o en estado sólido) en termentadores industriales o de laboratorio realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que se exprese y/o aisle el polipéptido. El cultivo puede tomar lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuente de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo a composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo) . Si el polipéptido se segrega en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, se puede recuperar de los lisados celulares.

En un aspecto alternativo, la variante de fosfolipasa no se recupera, sino más bien como una fuente de la variante si usa una célula hospedadora de la expresión que expresa una variante.

La variante de fosfolipasa se puede detectar usando métodos conocidos en la técnica que son especificos para los polipéptidos . Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un substrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente en los ejemplos.

La variante de fosfolipasa resultante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación .

Una variante de fosfolipasa de la presente invención se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía, (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófobo, cromatoenfoque , y exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes de fosfolipasa sustancialmente puras .

Métodos para Preparar Panes Se puede preparar un pan de cualquier manera adecuada, incluyendo, por ejemplo como se . describe en la WO 2008/025674, que se incorpora de este modo como referencia.

La fosfolipasa se puede aplicar a la masa de pan o a los ingredientes de masa de pan de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la fosfolipasa se puede aplicar por la adición directa de la fosfolipasa a una masa de pan por la adición de una fosfolipasa a los ingredientes usados para preparar una masa de pan (antes de la formación de una masa de pan) , o por tratamiento de una fuente de fosfollpido, tal como por ejemplo, lecitina de yema de huevo, una fuente de proteína no de huevo, o de fosfolípido no de huevo separada de la masa de pan, seguido por la inclusión de la proteína tratada en una masa de pan. En una modalidad, la fosfolipasa se adiciona directamente a una masa de pan. En otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un pan, que comprende: a) preparar una masa de pan que comprende la lecitina de yema de huevo; b) adicionar una variante de fosfolipasa de la presente invención a la masa de pan; c) hornear la masa de pan para producir un pan.

La fosfolipasa también se puede adicionar de forma separada a ingredientes usados para preparar una masa de pan y luego los ingredientes y la fosfolipasa se pueden incluir en una masa de pan. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar un pan, que comprende: a) proporcionar uno o más ingredientes de masa de pan y una fosfolipasa de la presente invención; b) preparar una masa de pan usando la composición de a) ; c) hornear la masa de pan para producir un pan.

La fosfolipasa también se puede usar para preparar una mezcla seca adecuada para preparar una masa de pan. En una modalidad, la masa seca incluye uno o más de los siguientes ingredientes: harina, gluten, almidón, edulcorantes (dextrosa, maltosa, fructosa, lactosa, azúcar café e invertida, solos o en combinación) , saborizantes , colorantes, componentes que contienen grasa, agentes de volumen, fuentes de proteína, agentes de levadura, emulsionadores , y/o una o más enzimas adicionales. La mezcla seca que comprende la fosfolipasa de la presente invención se puede adicionar a una masa de pan u otros ingredientes de masa de pan, u otros ingredientes de masa de pan, como se describe anteriormente..

La presente invención también se refiere a una composición de mezcla seca para producir un pan, que comprende una variante de fosfolipasa de la presente invención y uno o más ingredientes de masa de pan, tal como por ejemplo, uno o más de los siguientes ingredientes, harina, gluten, almidón, edulcorantes (dextrosa, maltosa, fructosa, lactosa, azúcares café e invertido, solos o en combinación), saborizantes, colorantes, componentes que contiene grasa, agentes de volumen, fuentes de proteína, agentes de levadura, emulsionadores y/o una o más enzimas adicionales .

El método para preparar un pan puede comprender además opcionalmente adicionar un fosfolípido no de huevo o una fuente de proteína a la masa de pan en combinación con una fosfolipasa de la presente invención. Como se usa en la presente, "fuente de proteína o fosfolípido no de huevo" significa una fuente de proteína o fosfolípido que no se deriva de un huevo, tal como, lecitina de yema de huevo. Los ejemplos de las fuentes de proteína o fosfolípido no de huevo incluyen, por ejemplo, proteínas de trigo, caseína, proteína de suero, gluten de trigo, proteína de legumbres (por ejemplo, soya, chícharo o lupino) . La fuente de proteína o fosfolípido no de huevo se adiciona preferentemente en cantidades que no están presentes normalmente en una receta de pan. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar un pan, que comprende: a) preparar una masa de pan que comprende lecitina de yema de huevo, b) adicionar una variante de fosfolipasa de la presente invención a la masa de pan en combinación con una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo, c) hornear la masa de pan para producir el pan.

En una modalidad, una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo se puede tratar con una fosfolipasa de la presente invención antes de la inclusión con una masa de pan. Por consiguiente, una modalidad comprende un método para preparar un pan, que comprende: a) tratar una fuente de proteína o fosfolípido no de huevo con una variante de fosfolipasa de la presente invención; b) incluir la fuente de fosfolípido no de huevo, tratada en una masa de pan; y c) hornear la masa de pan para producir el pan.

En una modalidad, la masa usada para preparar el pan puede contener 0.5-6.0 % en peso de proteína no de huevo, tal como, 0.1-6 % en peso, tal como 0.5-3.0 % en peso de proteína no de huevo, tal como, 0.5-2 % en peso de proteína no de huevo .

En una modalidad, la masa puede contener 0.1-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero (tal como, 7-20 % o 8-15 % en peso de huevo entero) . La masa puede contener 0.1-1.5 %, tal como, 0.1-1.2 %, 0.1-0.9 %, 0.2-1.5 %, 0.2-0.9 %, 0.3-1.5 %, 0.3-1.2 %, 0.3-0.9 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de nuevos enteros.

En otra modalidad, la cantidad de proteína de huevo se puede reducir en la receta. Por ejemplo, la cantidad de proteína de huevo presente en una receta de pan puede ser de 0.6 % a 3 % en peso de la masa de pan. En otra modalidad, la cantidad de proteína de huevo se puede reducir por al menos 1-5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 %. En una modalidad, la invención también proporcionar un método para preparar un pan usando una cantidad reducida de huevo o proteína de huevo o leeitina de yema de huevo en comparación a la cantidad de huevo o proteína de huevo usada en recetas convencionales de pan. En una modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una fosfolipasa de la presente invención, en donde la masa de pan contiene 0.1-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero.

En aún otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una combinación de una proteína o fosfolípido no de huevo y una fosfolipasa de la presente invención, en tanto que también se usa una cantidad reducida de huevo o proteína de huevo en la receta de pan. En otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la masa de pan con una combinación de una proteína o fosfolípido no de huevo y una fosfolipasa de la presente invención, en donde la masa de pan contiene 0.1-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero.

Las variantes de fosfolipasa se adicionan a la masa en una cantidad efectiva para obtener un impacto benéfico en la masa o pan preparado de la masa, tal como, propiedades mejoradas de volumen, textura, tal como cohesión, elasticidad y resilencia del pan, o para compensar el uso reducido de huevo. Los ejemplos no limitantes de cantidades de fosfolipasa para el uso en la presente invención incluyen 750 a 2500 LU/kg de harina.

El tratamiento de la fosfolipasa puede presentarse bajo condiciones normales de preparación de pan (temperaturas y tiempo de retención de horneado y retención) , como se conoce en la técnica.

Se pueden usar enzimas adicionales en combinación con la fosfolipasa al preparar el pan incluyen, por ejemplo, amilasa anti-envejecimiento, tal como, alfa-amilasa maltogénica (por ejemplo, NOVAMYL de Novozymes A/S) , una alfa-amilasa fungoidea o bacteriana (por ejemplo, de Aspergillus o Bacillus) , amiloglucosidasa, una beta-amilasa, una xilanasa, una proteasa, una ciclodextrina-glucanotransferasa o una enzima ramificadora, una peptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una fosfolipasa, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una proteína de disulfuro-isomerasa, una oxidoreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una laccasa, una glucosa-oxidasa, una piranosa-oxidasa, una lipoxigenasa o una carbohidrato-oxidasa .

La presente invención también proporciona una composición de masa de pan que comprende al menos un ingrediente de masa de pan y una fosfolipasa variante, en donde la fosfolipasa comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119 o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 y/o una extensión de aminoácidos en el N y/o C-terminal de la fosfolipasa.

La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos que no se deben considerar como que limitan el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1: Se prepararon variantes de fosfolipasa al alterar la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:l) que codifica para la fosfolipasa A2 de Tuber borchii (SEQ ID NO:2). Las variantes se prepararon por mutagénesis de saturación. Se hicieron las siguientes variantes de fosfolipasa: 1. W119* 2. W119G, L120DDATPG 3. L120Q 4. L120R 5. L120I 6. R61C 7. R61F 8. R61Y 9. R61A 10 R61V 11. R61K 12. R61L 13. R61N 14. R61E 15. R61I 16. R61S 17. S116A 18. S116L 19. S116T 20. S116R 21. S116I 22. S116Y 23. S116Q 24. S116P 25. S116H 26. S116F 27. W119T 28. W119* 29. W119P 30. W119G 31. W119A 32. W119K 33. W119N 34. W119V 35. W119H 36. L120E 37. L120S 38. L120A 39. W119H, L120IATRA 40. W119F, L120ICNSSL 41. W119R 42. W119H, L120CNSSLR 43. W119H, L120IVTRA 44. W119L 45. W119P, L120LCNSSL 46. L120K 47. L120H 48. L120Y 49. L120P 50. L120T 51. L120V 52. S33D 53. S33E 54. D31E 55. K65E 56. S38D 57. S38A 58. N39K 59. Y110F 60. I106V 61. I106P 62. A45F 63. A45V 64. A45D 65. F47Y, A102E 66. A102E 67. F47Y 68. K64R, S116C 69. K64R, W119G, L12ODDATPG 70. I106A 71. D84C 72. S52C, D84C 73. S52C 74. G59C 75. G59C, 177C 76. L30C 77. S1C, L30C 78. L6C, L30C 79. L30C 80. S38T 81. I106L 82. D42V, R43W 83. W1191 84. W119E 85. W119Q 86. N39C 87. N39I 88. N39F 89. A45L 90. P44L, F47L 91. F47W 92. 119C 93. W119S 94. W119F 95. S33M 96. S33C 97. S33G 98. S33 99. S33A 100. S33Y 101. S33R 102. S33L 103. S33Q 104. N39L 105. N39M 106. N39S 107. N39I 108. N39P 109. N39T 110. N39W 111. N39R 112. N39Q 113. A45K 114. A45T 115. A45G 116. A45R 117. A45E 118. A45C 119. F47R 120. F47V 121. F47G 122. F47L 123. F47C 124. A102G 125. A102H 126. A102S 127. S33D, W119G 128. S33D, N39K, 119G 129. S33D, N39K, W119N 130. D31Y, S33D, N39K, W119N 131. N39K, W119G 132. N39K, S116T 133. S1C, L30C, S116T 134. S33D, S116T 135. S33D, N39K 136. S33L, S116T 137. A45C, S116T 138. S1C, L30C, S33Q 139. S1C, L30C, S33L 140. S1C, L30C, S33D 141. S330, A45C, S116T 142. S330, A45C 143. S1C, L30C, A45C, S116T 144. S1C, L30C, N39K Ejemplo 2: Aunque se pueden producir masas de pan de acuerdo a cualquier receta de preferencia, este experimento abordó el efecto de las variantes de fosfolipasa en pan con poco huevo. La receta para los panes usó una masa de pan de alta relación basada en azúcar, harina de trigo, aceite vegetal refinado, almidón modificado, polvo de suero, polvo de hornear: bicarbonato de sodio (E500Ü) - pirofosfato ácido de sodio (E450i) , gluten de trigo sal, emulsionador : estearoil-2-lactilato de sodio (E481) - mono- y di-glicéridos de ácidos grasos (E471) - esteres de ácido graso de mono- y di-glicéridos de ácidos grasos (E472b) , estabilizador: carboximetilcelulosa (E466) - goma de guar (E412) . La azúcar se adicionó a 90 % cuando el 100 % se define como la suma de harina y almidón. La receta usó la mezcla comercial de pan Tegral Satín Créme Cake de Puratos NV/SA, Groot-Bij gaarden, Bélgica. La receta base para un pan de control fue la siguiente : Todos los ingredientes se pesaron en un tazón de mezclado y se mezclaron usando un mezclador industrial (por ejemplo Bjorn/Bear AR 5 A VarimixerMR) con una paleta K durante 2 minutos lento y dos minutos rápido. Se vació por raspado la masa de los lados del tazón. Se pesan 300 gramos en moldes de aluminio (7 x 19 cm) . Los panes se hornean en un horno adecuado (por ejemplo horno Sveba Dahlin deck) durante 45 minutos a 180°C. A fin de afrontar la efectividad de las fosfolipasas en panes con poco huevo, entonces se reemplazó 50 % (cincuenta por ciento) de huevo (175g) con: A. Mezcla de 42 g de gluten de trigo, 133 g de agua y una fosfolipasa en una cantidad de 2 kLEU/kg; ?· Mezcla de 42 g de gluten de trigo, 133 g de agua y una fosfolipasa en una cantidad de 5 kLEU/kg; C. Mezcla de 42 g de gluten de trigo, 133 g de agua y una fosfolipasa en una cantidad de 6 kLEU/kg; Después del enfriamiento, los panes se almacenan en bolsas plásticas selladas con atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente.

Medición de Volumen Se calculó el volumen específico a partir de volumen de los dos panes sin moldes dividido por la masa de los mismos panes medida por desplazamiento de semilla de colza. La unidad para el volumen específico es mililitro por gramo .

Medición de Textura Se evaluó la textura de los panes en el día 1, 7 y 14 después del horneado, se usaron dos panes en cada ocasión, y para cada pan se analizaron tres cortes de pan. La cohesión, elasticidad y resiliencia de los panes se evalúo usando el análisis de perfil de textura (TPA, por sus siglas en inglés) con el analizador de textura TA-XTplus . El análisis de perfil de textura (TPA) se realizó como se describe en Bourne M. C. (2002) 2. ed. , Food Texture and Viscosity: Concept and Measurement . Academic Press. Con una sonda circular con una área de 491 mm2.

Variantes con Volumen Mejorado de Pan Se hicieron varias mutaciones para mejorar el volumen de un pan con poco contenido de huevo.

Tabla 1. Volumen específico (ml/g) de panes con 50 % de reducción de huevo con relación a un pan de control con contenido normal de huevo (es decir, sin reducción de contenido de huevo) y sin adición de fosfolipasa, y control que se valoró como 1000 Wt (fosfolipasa de Tuber albidum) sólo se incluyó en mezcla de 5 kLEU/kg.

Variantes con Diferentes Mejoras a Cohesión de Pan Se pueden hacer varias mutaciones para mejorar la cohesión de un pan con poco contenido de huevo.

Tabla 2. Cohesión de panes con 50 % de reducción de huevo con relación a un pan de control con contenido normal de huevo medido 1, 7 y 14 días después del horneado. Los panes se compararon a controles almacenados igual número de días . La dosis de enzima es mezcla de 5 kLEU/kg.

Variantes con Diferentes Mejoras a Elasticidad de Pan Se pueden hacer varias mutaciones para mejorar la elasticidad de un pan con contenido reducido de huevo.

Tabla 3. Elasticidad de panes con 50 % de reducción de huevo con relación a un pan de control con contenido normal de huevo medido 1, 7 y 14 días después del horneado. Los panes se compararon a controles almacenados igual número de días . La dosis de la enzima es mezcla de 5 kLEU/kg.

Variantes con Diferentes Mejoras a Resiliencia de Pan Se pueden hacer varias mutaciones para mejorar la resiliencia de un pan con contenido reducido de huevo.

Tabla 34 Resiliencia de panes con 50 % de reducción de huevo con relación a un pan de control con contenido normal de huevo medido 1, 7 y 14 días después del horneado. Los panes se compararon a controles almacenados igual número de días . La dosis de la enzima es mezcla de 5 kLEU/kg.

La invención descrita y reclamada en la presente no se limita en el alcance por los aspectos específicos descritos en la presente, puesto que estos aspectos se proponen como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se proponen cualquier aspecto equivalente que esté dentro del alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente llegarán a ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Estas ttiodificaciones también se propone que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción que incluye las definiciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para preparar un pan, caracterizado porque comprende : a) preparar una masa de pan que comprende lecitina de yema de huevo y una variante de una fosfolipasa progenitora, en donde la fosfolipasa variante comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119 o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 en donde la fosfolipasa variante tiene actividad de fosfolipasa y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 3 y b) hornear la masa de pan para producir un pan.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al .menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 65 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 70 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 75 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 85 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 90 de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 91 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 92 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 93 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 94 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 96 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 97 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, al menos 98 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o al menos 99 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa progenitora se obtiene de un hongo .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa progenitora se obtiene del género Tuber borchii .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa progenitora es una fosfolipasa obtenida de Tuber borchii .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa progenitora es una fosfolipasa obtenida de Tuber albidum.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa progenitora comprende una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la masa comprende 0.1-1.5 % en peso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero.

9. El método de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque la masa comprende una proteína no de huevo .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la masa comprende al menos 0.5 % en peso de una proteína no de huevo.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la masa comprende al menos 0.5-6.0 % en peso de proteína no de huevo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína no de huevo se selecciona del grupo que consiste de proteínas de trigo, caseína, proteína de suero, gluten de trigo, y proteína de legumbres.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la masa comprende un fosfolípido no de huevo .

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la masa comprende 0.3-1.5 % en poso de lecitina de huevo o 5-25 % en peso de huevo entero.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa se adiciona a la masa de pan en la forma de una mezcla seca.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipasa se adiciona a los ingredientes de una masa de pan antes de la adición a la masa de pan.

17. Una masa de pan que comprende una variante de una fosfolipasa progenitora, caracterizada porque la fosfolipasa variante comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119 o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde la fosfolipasa variante tiene actividad de fosfolipasa y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO : 3.

18. Una mezcla seca de masa de pan, caracterizada porque comprende un ingrediente de masa de pan y una variante de una fosfolipasa progenitora, en donde la fosfolipasa variante comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1, 6, 30, 31, 33, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 52, 59, 61, 64, 65, 77, 84, 102, 106, 110, 116, 119 o 120 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde la fosfolipasa variante tiene actividad de fosfolipasa y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.