JPH0568599A - 遺伝子工学的に作られた抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定の部分への親和性によりイムノグロブリ
ンＦａｂ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を選択する方法
を提供する。 【構成】 イムノグロブリンの軽鎖の可変領域からなる
ＤＮＡライブラリー及びイムノグロブリンの重鎖の可変
領域からなるＤＮＡライブラリーが得られる。上記ＤＮ
Ａライブラリーのうちの一つを含むプラスミド発現ベク
ターを用いて原核生物を形質転換し、そして形質転換さ
れた細胞に他方の上記ＤＮＡライブラリーを含むバクテ
リオファージ発現ベクターを感染させる。感染及び形質
転換された細胞は蛋白質を生産する。特定の部分（モイ
エティ）に結合する新規な蛋白質を含む複数の蛋白質
は、感染及び形質転換された細胞により発現されたＦａ
ｂ蛋白質をスクリーニングすることにより選択されう
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は２つの違ったイムノグロ
ブリン サブユニットを構成する組換え体高親和性結合
蛋白質の発現及び検出に関する。特に、本発明は特定の
部分への親和性による、イムノグロブリンＦａｂ蛋白質
をコードするＤＮＡ配列の選択法に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換え体ベクター内の適切な翻訳及び輸
送のシグナルを使用して大腸菌のような原核細胞生物
を、正確にフォールドされたイムノグロブリン（Ｉｇ）
断片を翻訳及び分泌するために制御できることが、最近
報告された。スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４０：１０３８−１０４１，（１９８８）におい
て、ｏｍｐＡ及びｏｍｐＢのような遺伝子からリーダー
あるいはシグナル ペプチドをコードするＤＮＡ配列
を、特定の抗原を認識する特定のＦ_V断片を構成する重
鎖（Ｖ_H）および軽鎖（Ｖ_L）をコードする別々の配列そ
れぞれの最初に挿入した。これらの結合された配列を、
引き続き大腸菌を形質転換するために使用された発現ベ
クターに挿入した。形質転換された大腸菌の生育培地か
ら回収された培地の濾過液は、同じ抗原に特異的なＦ_V
断片を含んでいた。ＦｄおよびｐｅｌＢリーダーを持っ
たｋ配列を使用した同様の実験において、ベター（Ｂｅ
ｔｔｅｒ）ら、Ｉｂｉｄ．，１０４１−１０４３，は、
大腸菌が既にフォールドされたＦａｂ蛋白質を分泌でき
ることを証明した。このことは、大腸菌がイムノグロブ
リン鎖をコードする配列に対応するアミノ酸配列を翻訳
できるばかりでなく、既にフォールドされたＦ_V及びＦ
ａｂ断片を最後に培地中に分泌する前に、シグナル配列
がペプチドから切り離され、ジスルフィド結合が正確に
形成される場所であるペリプラズム領域に個々のペプチ
ド配列を輸送できることも示している。その多様性がｉ
ｎ ｖｉｖｏの抗体の濃度に固有の多様性に合っている
か又はそれを越えている結合蛋白質の母集団をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで生産する問題点は、組み合わせを変えること
において、ヒトのリンパ球において表された重鎖および
軽鎖を発現する問題に変わる。

【０００３】造血茎の細胞がＢ細胞の系列に分化すると
き、最初に検出される遺伝的なできごとは、二つの連続
する体細胞組み換え、Ｄ_H−Ｊ_H及びＶ_H−Ｄ_H−Ｊ_Hから
なる重鎖（それぞれＶ_H，Ｄ_H，及びＬ_H）の可変性で、
多様性のある、結合領域を含むイムノグロブリンの重鎖
（ＩｇＨ）遺伝子の再構成である（ウオルドマン（Ｗａ
ｌｄｍａｎ）（１９８７）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４
０：２４７−３２１）。多様性のある唯一のＶ_H領域は
いつも完全なＶ_H遺伝子の形成の間に作られる。多数の
Ｖ_H，Ｄ_H，及びＪ_H部分はランダムに結合でき、組み換
え部位において生じた柔軟性は、不均質な、鋳型に由来
しないヌクレオチドの挿入及び欠失を含みうる。さら
に、体細胞の変異は再構成された遺伝子部分をさらに多
様化しうる。従って、集合したＶ_H領域は相補性決定領
域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの可変性の高い領域により
分断された、比較的保存されたアミノ酸配列のフレーム
枠を含む。同様の再構成は軽鎖の可変領域を生じる。

【０００４】１９７０年代の中頃から多くの実験室が、
ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ源からさまざまなイムノグロブ
リン ドメインに対応する核酸の配列をクローニングし
ようと試みて来た。天然のイムノグロブリン配列は大変
に多様化しているので、クローニングはめんどうであ
る。この問題を解消するために、ポリメラーゼ チェイ
ン リアクション（ＰＣＲ）のような核酸の増幅法が使
用されてきた。ポリメラーゼ チェイン リアクション
のためのオリゴヌクレオチド プライマーを作るため
に、イムノグロブリン遺伝子の大変に多様化している可
変領域の周囲の、短くて、高度に保存された配列が使用
されて来た。これらのプライマーを使用して、イムノグ
ロブリンをコードする遺伝子の体細胞の再構成の不均一
性を低下させる事なく、イムノグロブリンの断片に対応
する核酸の配列を増幅できた（オーランディ（Ｏｒｌａ
ｎｄｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，３６：３８３３−３８３７（１９８９）；ヤマ
ダ（Ｙａｍａｄａ）ら、Ｉｂｉｄ．，ｐｐ．５１２３−
５１２７；サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）ら、Ｉｂｉ
ｄ．，ｐｐ．５７２８−５７３２）。

【０００５】ワード（Ｗａｒｄ）ら（１９８９）、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６は、適切な分泌のシ
グナル配列を含む大腸菌のプラスミド発現ベクターに、
ＰＣＲで増幅された大量の別々のＶ_H遺伝子を挿入し
た。これらの発現ベクターで形質転換された細胞は、既
にフォールドされた重鎖を培地中に分泌し、広範囲の違
ったＶ_H蛋白質を生産した。単一のプラスミド ライブ
ラリーからワード（Ｗａｒｄ）らは、２つの違った抗体
それぞれに結合する多くの別々のクローンを選択でき
た。このことは、このライブラリーが広範囲な特異的結
合性を持つＶ_H蛋白質をコードする、実質的に多様性の
ある配列を含むことを示している。軽鎖及び重鎖のイム
ノグロブリン ドメインを発現する形質転換細胞の大腸
菌クローンが、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら及びベター
（Ｂｅｔｔｅｒ）らにより記述された様式でジスルフィ
ド架橋により共に連結された軽鎖及び重鎖から形成され
たＦａｂ断片を分泌するという、同様の手引きを使用す
ることによりおそらく高親和性の結合蛋白質が生産でき
るであろうということが、ワード（Ｗａｒｄ）ら（及び
ワード（Ｗａｒｄ）らの結果を批評したオースチン（Ａ
ｕｓｔｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ，３４１：４８４−４８５
（１９８９）によっても）により示唆された。

【０００６】以下の配列の別々の遺伝子ライブラリーか
らの軽鎖及び重鎖の配列をランダムにｉｎ ｖｉｔｒｏ
で結合し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏの構築技術によりバ
クテリオファージに挿入することからなる、一つの軽鎖
をコードするＤＮＡ配列を一つの重鎖をコードするＤＮ
Ａ配列に結合させてバクテリオファージＤＮＡライブラ
リーを構築することにより重鎖及び軽鎖のＶ領域及び不
変の領域の一部を含むイムノグロブリンＦａｂ断片を生
産する方法をヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９），Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５が教示した。引き続
き、受容宿主細胞に構築されたファージを感染させ、多
様化に特異的なＦａｂ断片が完全に生産された。ヒュー
ズ（Ｈｕｓｅ）らは、ｍＲＮＡのＰＣＲによる増幅によ
り最初に得られた重鎖及び軽鎖の断片をコードするＤＮ
Ａ配列のライブラリーを使用した。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】広範囲な特異性を持っ
た新規な結合蛋白質を創造するために、さまざまな重鎖
及び軽鎖をランダムな集団内において結合させることに
おいて、Ｆａｂ分子の母集団を発現する多様化した母集
団を生産する（あるいはスクリーニングする）ための改
良された方法を提供することが本発明の目的である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の方法において、
軽鎖あるいは重鎖のイムノグロブリン鎖のいずれかの可
変領域を少なくともコードする配列のライブラリーから
なるプラスミド発現ベクターの母集団を用いて適切な宿
主細胞を形質転換する。プラスミド ライブラリーを含
む宿主細胞の母集団に、軽鎖あるいは重鎖のイムノグロ
ブリン鎖のいずれかの他の可変領域を少なくともコード
する配列のライブラリーからなるバクテリオファージ発
現ベクターを感染させた。２つのライブラリーにおいて
軽鎖及び重鎖をランダムな結合を表すＦａｂ分子は、プ
ラークから回収されうる。文献に記述された、どのよう
な有用な方法も使用して、特定の部分に所望の特異的親
和性を持つＦａｂ分子をプラークからスクリーニングし
た。

【０００９】好ましい様式において、軽鎖をコードする
配列のライブラリーをプラスミドベクターに挿入し、そ
して重鎖をコードする配列のライブラリーをファージ
ベクターに挿入した。両方のベクターに適切な宿主であ
る細胞を、最初にプラスミド ベクターで形質転換し
た。２番目の段階において、プラスミド ベクターを含
む細胞に続いてファージを感染させた。上述のような特
定の部分で結合する、特定のＦａｂ分子を探すために、
感染細胞が生育したプレートをスクリーニングした。

【００１０】本発明の方法は、ＤＮＡ配列を割り込ま
せ、そして所望の結合活性を持ったＦａｂ分子をコード
するＤＮＡ配列を選択するための迅速な方法を提供す
る。ライブラリーはヒューズ（Ｈｕｓｅ）らのようにｍ
ＲＮＡよりむしろゲノミックＤＮＡから構築できる。ｍ
ＲＮＡの母集団は、先の個々の免疫的な暴露に依存し
た、特定の限定された集団を用いてイムノグロブリンを
コードする配列を優先するように偏るので、ゲノミック
ＤＮＡを使用した方が有利である。しかし、再構成され
たゲノミックＤＮＡは、選択されず、増幅されないリン
パ球の母集団を反映して広い多様性を含みやすい。

【００１１】重鎖及び軽鎖に別々のベクターを使用する
ことにより、及び連続して上記ベクターを宿主細胞に導
入することにより、この方法はそれぞれの段階において
容易に監視されうる。さらに、本発明の方法は重鎖及び
軽鎖をコードするＤＮＡを一つのベクターに挿入する方
法よりもはるかに容易にに実行される。別々のベクター
を使用した方法は類似の発現を達成するために細胞の機
能に依存できるが、一つのベクターの構築はｉｎ ｖｉ
ｔｒｏにおける厄介で冗長で難しい遺伝学的な操作を必
要とする。

【００１２】図面の簡単な説明 第１図 ＰｅｌＢリーダー配列を発現ベクターに導入す
るために使用された二本鎖ＤＮＡ配列。ＰｅｌＢ、シャ
イン−ダルガノ結合部位及び５’と３’のクローニング
部位（ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩ）を合成するために、
ポリメラーゼチェイン リアクションにおいて２つのプ
ライマーが使用された。

【００１３】第２図 ベクターｍｐ１９−Ｐｅｌ−Ｃ_γ
１あるいはＣ_γ２の地図。

【００１４】第３図 ベクターｐＵＣ−Ｐｅｌ−Ｃ_kあ
るいはＣ_λの地図。

【００１５】詳細な説明 本発明は、それぞれの鎖をコードするＤＮＡの２つの不
均質な母集団をランダムに結合させることにより、Ｆａ
ｂを構成する重鎖及び軽鎖のＩｇポリペプチドを生産す
ることからなる、Ｆａｂ分子の不均質な母集団をスクリ
ーニングすることにより新規な結合蛋白質を同定するた
めの迅速な方法を意図する。本発明配列を、好ましくは
ゲノミックＤＮＡからの増幅により、個々のイムノグロ
ブリン重鎖及び軽鎖のポリペプチドの可変領域をコード
する配列からなる、ＤＮＡの高度に不均質なライブラリ
ーの構築を意図する。そして軽鎖及び重鎖の配列を別々
の原核生物のベクターに挿入する。これらの特定のベク
ターは、発現されたポリペプチドの分泌を制御するため
に、挿入部位の５’末端にプロモーター配列並びに開
始、翻訳及び輸送のシグナル配列を含む。それらは、好
ましくは挿入部位の３’側の翻訳解読枠内の軽鎖の不変
の領域あるいは重鎖の不変の領域も含む。

【００１６】本発明は、一方のベクターがプラスミドで
あり、他方のベクターがファージであり、そしてＩｇの
軽鎖に対応するライブラリーを一つのベクターに導入
し、そしてＩｇの重鎖に対応するライブラリーを他方の
ベクターに導入することからなる、２つの別々のベクタ
ーの使用を意図する。本発明は、微少な不均質性がイム
ノグロブリンの可変領域のＤＮＡライブラリーの不均質
性の結果である、２つの別々の微少な不均質性ベクター
の母集団を創造する。適切な宿主株の細胞を、一つのラ
イブラリーを含むプラスミド ベクターで最初に形質転
換し、そして続いて他方のライブラリーを含むファージ
ベクターを感染させる。ベクターのＩｇ配列の発現が
誘導され、そしてライブラリーによりコードされる軽鎖
及び重鎖のポリペプチドが、化学的な部分の多様性のあ
る母集団にそれぞれ結合できるＦａｂ断片の母集団とし
て分泌される。

【００１７】感染され、形質転換された細胞の発酵作用
をこれらの結合性蛋白質の源として使用できるが、本発
明の本来の使用はスクリーニング系である。所望の結合
特異性及び親和性を持ったＦａｂ蛋白質を分泌する形質
転換細胞が同定されれば、これらの細胞に含まれる所望
のＤＮＡ配列を、よく知られた組み換え技術を使用して
より効率的な生産系に導入できる（例えば、ウインター
（Ｗｉｎｔｅｒ）欧州特許出願第０２３９４００号、１
９８７年９月３０日公開；キャビリー（Ｃａｂｉｌｌ
ｙ）ら、欧州特許出願第０１２５０２３号、１９８４年
１１月１４日公開）。

【００１８】Ａ．Ｉｇ遺伝子ライブラリーの生産 Ｉｇの重鎖及びＩｇの軽鎖の遺伝子の再構成された可変
領域に対応した、それぞれ２つの別々の遺伝子ライブラ
リーを調製する。再構成されたゲノム内のすべての可変
領域をコードする配列を含む可変領域のカセットを生産
するために、ゲノミックＤＮＡの再構成されたイムノグ
ロブリンＤＮＡの可変領域をＰＣＲにより増幅する。イ
ムノグロブリンの可変領域に対応するＤＮＡを増幅する
他の方法も使用される（例えば、ファン ブラント（Ｖ
ａｎ Ｂｒｕｎｔ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８：
２９１−２９４；グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：
１８７４−１８７８，１９９０を参照せよ）。あまり好
ましくない別の方法において、どのような適切な核酸の
増幅方法によっても、リンパ球のｍＲＮＡからの対応す
る可変領域を増幅できる。

【００１９】ＰＣＲにより増幅するとき、イムノグロブ
リン重鎖（Ｖ_H）及び軽鎖（Ｖ_L）の可変領域（Ｖ）をコ
ードする核酸配列のそれぞれの末端における、保存され
た領域が最初に同定される。２番目に、クローニングを
強制させる制限酵素部位を持つ、増幅のためのプライマ
ーを設計する。３番目に、Ｖドメインのアミノ酸配列の
特徴を残しているが、増幅されたＤＮＡが複製され、そ
して発現されるように、これらの同じ制限酵素部位を含
むベクターを構築する。

【００２０】約１００−２００のメンバーからなるヒト
Ｖ_H領域内のＶ_H部分をさらに６のファミリー（Ｖ_H１−
６）に分類した。それぞれのファミリーのメンバーは２
つの近隣のＶＨ部分が少なくとも３．５−１１キロベー
ス離れて広く散在している（ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）
ら、（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．，７：７２７−７３
８）。Ｖ_H領域は２５００ｋｂの大きさ（ベルマン（Ｂ
ｅｒｍａｎ）ら、１９８８）であり、Ｊ_H領域から１０
０ｋｂ以内に離れている。３ｋｂの大きさのＪ_H領域は
６つの部分のクラスターからなり、μ−鎖遺伝子の不変
領域の６ｋｂ上流にある（ラベット（Ｒａｂｅｔｅｃ
ｈ）ら、（１９８１）Ｃｅｌｌ，２７：５８３−５９
１）。Ｄ_H領域は別々のファミリー メンバーの間で大
きく多様化したヌクレオチド配列を持っているので、６
つの別々のＤ_Hファミリーに分類できる。６つのＤ_H遺伝
子は少なくとも５倍に像増加しており、Ｖ_Hクラスター
の間で分散している（イチハラ（Ｉｃｈｉｈａｒａ）
ら、（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．，７：４１４１−４１
５０）。分化可能な造血茎の細胞がＢ−細胞の系列に分
化するとき、最初に検出される遺伝的なできごとは、二
つの連続する体細胞組み換え、Ｄ_H−Ｊ_H及びＶ_H−Ｄ_H−
Ｊ_Hからなる重鎖（それぞれＶ_H，Ｄ_H，及びＬ_H）の可変
性で、多様性のある、結合領域を含むイムノグロブリン
の重鎖（ＩｇＨ）遺伝子の再構成である（ウオルドマン
（Ｗａｌｄｍａｎ）（１９８７）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．４０：２４７−３２１）。これらの変化により１０
００ベース以内に離れたＪ_H部分の隣にＶ_H部分が運ばれ
る。茎の細胞の分化の間、同様の再構成はＶ_L領域を生
じる。

【００２１】ポリメラーゼ チェイン リアクション
（ＰＣＲ）（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、（１９８５）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４）が最近ゲ
ノミック（シャルフ（Ｓｃｈａｒｆ）ら、（１９８６）
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：１０７６−１０７８）及びｃ
ＤＮＡ（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、（１９８８）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１）のクローニングに
使用された。それは、遺伝子のそれぞれの末端の領域に
特異的な２つのプライマーからの伸長合成反応の繰り返
しの連続を含む。プライマーは遺伝子の配列と正確に適
合している必要はなく（リー（Ｌｅｅ）ら、（１９８
８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１２８８−１２９１）、
増幅されたＤＮＡを強制的にクローニングさせるように
プライマー内に制限酵素部位が挿入されうる（シャルフ
（Ｓｃｈａｒｆ）ら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３３：１０７６−１０７８）。

【００２２】本発明の好ましい手続きは、イントロンを
持たない可変性のイムノグロブリン遺伝子の再構成され
た領域を増幅するためにＰＣＲ技術を使用し、そしてそ
れぞれの重鎖及び軽鎖の可変領域の完全なコード領域に
対応するＶ領域のカセットを生産するために、あつらえ
のオリゴヌクレオチド プライマーを使用する。ゲノミ
ック レベルで再構成された可変領域の増幅は、Ｖ_H遺
伝子部分のＦＲ１領域及びＪ_H部分の３’領域内の保存
された配列と相同性を持つオリゴヌクレオチドを使用し
て実行できる。従って、ＰＣＲは３−６ｋｂ以上の範囲
を制御することはできない（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、
（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３
５４；サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、（１９８８）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２３９：４８７−４９１）ので、結果として再
構成された領域の増幅のみを制御するこれらのオリゴヌ
クレオチドになる。なぜならば、これらの配列は茎の細
胞のゲノミックＤＮＡにおいて大変に離れており、Ｖ_H
−Ｄ_H−Ｊ_Hの再構成後のみに近接した所にくるからであ
る。陽性の組換え体クローンの定量は与えられたＣＤＲ
−ＩＩＩのＤＮＡ配列及び、したがってすべての母集団
内の特定のＢ細胞クローンの数を正確に反映しているこ
とが示された（ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ら、１９８
９）。

【００２３】Ｖ遺伝子のオリゴヌクレオチド プライマ
ーは、このようにさらに同定されたＶ_H及びＶ_Lファミリ
ーのメンバーと相同な配列を表すフレーム枠領域１（Ｆ
Ｒ１）の配列に基づいて設計される。Ｊ_H及びＪ_Lのアン
チセンス プライマーはＪ_H及びＪ_Lの部分の３’末端と
適合するように設計される。プライマーの配列は例えば
サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）らにより記述された、カバ
ット（Ｋａｂａｔ）ら（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｓ，Ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉ
ｃｅにおいて与えられた可変領域の配列の保存された部
分から選択されうる。

【００２４】５’オリゴヌクレオチド プライマー配列
はそれぞれの公表された配列の最初のアミノ酸をコード
する配列とのハイブリダイゼーションを確実にするため
に、５’配列を十分に含んでいるべきである。同様に、
３’オリゴヌクレオチド プライマーの配列は興味のあ
る種における、すべてよく知られたＪ配列の３’末端と
ハイブリダイズするように設計される。これらの５’及
び３’領域は高度に保存されているが、比較的わずかに
明らかな配列の違いがこれらの領域において生じてお
り、全てかあるいは異なるＶ及びＪ部分の可変部位にさ
えもハイブリダイズする配列を提供するために、特に
５’末端において多様性のプライマーが必要となる。Ｐ
ＣＲの試薬の混合物は、Ｖ領域の莢膜内部の、再構成さ
れたリンパ球のゲノム内の多様性の獲得を保持するため
に、多様性プライマーを最大限に含むべきである。一
方、分離反応は別々のプライマーの組み合わせにより実
行されうる。

【００２５】制限酵素部位を作るために好ましくは５’
末端付近に（シャルフ（Ｓｃｈａｒｆ）ら、１９８６）
点突然変異の導入によりプライマーは修飾される。プラ
イマー内の人工的な制限酵素部位の存在は、プラスミド
あるいはファージベクター内へのＶ莢膜のクローニング
を許容する。プラスミド内に挿入された制限酵素部位
は、クローン化に使用され、そしてそれぞれのＶ莢膜の
ライブラリーを発現するベクター内の制限酵素部位に対
応する。それぞれのライブラリーの独立した操作を許容
するためにそれぞれ重鎖及び軽鎖のベクター内にただ一
つの制限酵素部位が存在する。

【００２６】可変領域のカセットをリーダー配列及び不
変領域の配列に連結すれば、フレームの合った翻訳産物
を生産するために制限酵素部位の３’側に０，１あるい
は２個のヌクレオチドを付加する事を含むことにより、
唯一の５’及び３’プライマー配列がさらに好ましく多
様化（３タイプ）されるはずである。そのようなプライ
マーの使用により、再構成部位の下流の配列における解
読枠のズレを生じる茎の細胞分化の間、幾つかの再構成
の結果として、別の方法で失われたと思われるゲノムの
Ｖ領域内の付加的な多様性が救済される。同様に多様性
の救済を達成するための、あまり好ましくない別の方法
は、不変領域の隣の制限酵素部位の３’側に、ベクター
に０，１あるいは２個のヌクレオチドを付加的に挿入す
ることであろう。この別の方法は、ライブラリーが挿入
されるはずのところに３つの別々のベクターを構築する
ことを必要とする。

【００２７】Ｂ．ベクターの構築 ２つのライブラリーからのイントロンのないＤＮＡを所
望の宿主細胞に導入するために、２つの別々の発現ベク
ター、即ちプラスミド ベクター及びバクテリオファー
ジ ベクターが使用される。増幅された軽鎖の可変領域
を含む配列のライブラリーは一方の発現ベクターに挿入
し、増幅された重鎖の可変領域を含む配列のライブラリ
ーは他方の発現ベクターに挿入する。形質転換され、そ
してイムノグロブリンの可変領域のライブラリーを含む
発現ベクターを感染させられた宿主細胞の母集団は、高
度に多様性を持ったＦａｂ分子の母集団を生産する。好
ましい生産において、軽鎖の可変領域はプラスミド ベ
クターに挿入し、重鎖の可変領域はファージ ベクター
に挿入する。

【００２８】本発明に使用されたベクターは、以下に記
述されるように選択される宿主細胞を形質転換しあるい
は感染することが知られており、よく特徴づけられたポ
リクローニング部位を持つ原核生物の発現ベクターから
構築される。プラスミド及びファージ ベクターは遺伝
物質の交換を避けるために限られた相同性を持つことが
望ましい。ベクターは、分離及び同様の選択を許容する
ために違ったマーカーを含むことが望ましいはずであ
る。

【００２９】ベクターはそれぞれ発現の制御に使用され
るプロモーターの３’にリボソーム結合部位を持ち、発
現のために選択された宿主株において効果的な、分泌シ
グナル配列をその下流に持つように構築される。好まし
い作成において、ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）らにより使用
されたＰｅｌ Ｂリーダー配列を、大腸菌宿主細胞に使
用できる。Ｖ_L及びＶ_Hライブラリーを作成するために使
用されたＰＣＲのプライマー中に存在する部位に対応し
た制限酵素部位を、Ｖ領域の莢膜を翻訳枠に挿入するよ
うなシグナル配列の後につなげる。これらの制限酵素部
位の直後に、適切な重鎖及び軽鎖の不変領域をコード
し、終止コドンで終わる配列を挿入することが好まし
い。適切な不変領域の配列は当業者によって公表された
配列により容易に選択され得る。この配列に対応するヌ
クレオチド配列は、例えばオリゴヌクレオチドの合成あ
るいは公表されたイムノグロブリンの配列から設計され
たプライマーを使用したＰＣＲにより調製され得る。任
意に付加的な配列を不変領域と終止コドンの間に加え得
る。この配列は、同定及びスクリーニングのために使用
される、発現されたイムノグロブリン ペプチドに付着
した付加的なペプチドの標識の発現をもたらす。

【００３０】ところどころに一定の領域を持つベクター
を調製することにより、可変領域のカセットがリンパ球
から調製でき、上記ベクターに挿入後、Ｆａｂ断片の軽
鎖及び重鎖のための完全な配列が転写され、そしてイン
トロン配列を除去することなく原核生物において翻訳で
きる。あまり好ましくない他方の方法において、ヒュー
ズ（Ｈｕｓｅ）らにより報告されたようにリンパ球のｍ
ＲＮＡから可変領域あるいは完全な鎖の配列が得られ得
る。しかし、この母集団は器官が感差されるような抗原
に対して特異的な抗体に有利に歪められやすく、従って
Ｆａｂの母集団を引き起こす最終の多様性が好ましい手
続きに似て、減じられる。

【００３１】目的がＤＮＡ源をスクリーニングすること
であり、蛋白質の大量生産ではないから、使用されるプ
ロモーターの活性が大変に強い必要はない。所望のＤＮ
Ａ配列が選択されれば、後でより効果的な生産系が構築
され得る。２つのベクターにおいて使用されたプロモー
ターは同じでも（一つの薬剤により誘導を釣り合わせる
ため）、違っていても（個々に発現を制御させるため）
よい。

【００３２】広範囲なさまざまのプラスミド及びファー
ジが当業者に知られている（例えば、ポウエルズ（Ｐｏ
ｕｗｅｌｓ）ら、「クローニング ベクターズ」、エル
セビア、１９８５）。与えられたどのような宿主とも共
に使用される特定のプラスミド及びファージの選択は、
その分野においては容易である。同様に、プロモーター
の選択、分泌シグナル配列、制限酵素部位の位置及び種
類、及び終止コドンは当業者に知られている範囲内のも
のである。

【００３３】大腸菌宿主のための好ましいプラスミド
ベクターはｐＵＣ１９である。好ましいファージ ベク
ターはＭ１３に基づいている。ｐＵＣ１９プラスミド
ベクターはアンピシリン耐性マーカーを持ち、Ｍ１３の
ようにｌａｃオペロン中に挿入された多様性部位を持
ち、両者はアメリカン タイプ セル カルチャー
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ））あるいはベセスダ
リサーチ ラボラトリーズ （ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販され
ている。

【００３４】Ｃ．プラスミド ベクターを用いた宿主細
胞の形質転換 それぞれのベクターに両用できる宿主細胞が形質転換に
使用されるべきである。好ましい系は、大腸菌及び大腸
菌のクローニング仲介物に基づいている。宿主細胞の遺
伝的な組み立てはクローニングの間の選択方法を単純化
するために好ましく選択される。選択方法は、例えば抗
生物質の耐性、あるいは他の知られている方法を含む。
所望の特性を備えたベクター及び宿主細胞系はポウエル
（Ｐｏｕｗｅｌ）ら、（１９８５）において記述され、
例えばＡＴＣＣなどの多くの場所から容易に入手でき、
そして選択方法は例えば、引用により本明細書の一部を
なすサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｎｕａｌ，２版、コールド スプリングハーバ
ー ラボラトリー出版、１９８９において記述されてい
る。

【００３５】鎖の一方をコードするイムノグロブリン配
列のライブラリーを持つ組み換えプラスミドを用いて宿
主細胞を形質転換する。一般的な技術、好ましくは抗生
物質の耐性を使用してうまくいった形質転換体を選択す
る。形質転換及び形質転換された細胞の選択は当業者の
知る範囲であり、公表された刊行物例えばサンブルック
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにおいて記述されている。

【００３６】Ｄ．形質転換された宿主細胞の感染 対応するイムノグロブリン ポリペプチドの発現ライブ
ラリーを含むバクテリオファージ ベクターにより一方
のイムノグロブリン ポリペプチドのための発現ライブ
ラリーを運ぶ、形質転換された宿主細胞の母集団の感染
は、バクテリオファージ内の組換え体ヌクレオチド配列
の発現のためにその分野において使用されている、よく
知られた多くのどの方法によっても達成される。１つの
方法において、他方のイムノグロブリン鎖のライブラリ
ーを含むバクテリオファージ ベクターのウイルスのス
トックを調製し、宿主細胞の懸濁液をそのウイルスのス
トックと混合する。ウイルス粒子が細胞に吸着させるた
め、細胞とバクテリオファージの混合物をインキュベー
トし、そして細胞をプレートに撒く。プレートのための
培地は選択される２つのベクターの発現系の誘導体を含
む。一方、２つの発現ベクター上に存在するプロモータ
ーの誘導体中に前もって浸したフィルターをプレートに
重層する。

【００３７】一方の手続きにおいて、一方のイムノグロ
ブリン ポリペプチドの発現ライブラリーを運ぶ、形質
転換された宿主細胞をプレート上にまき、そして他方の
イムノグロブリン鎖に対応するイムノグロブリン ポリ
ペプチドの発現ライブラリーを含むバクテリオファージ
を感染させる。２つの発現ベクターの上に存在するプロ
モーターの誘導体に前もって浸したニトロセルロース
フィルターを、感染させた層に重層する。どちらの方法
においても、使用されたバクテリオファージの濃度を、
プレート上に適当な数のプラークを生じるように、好ま
しくは１５ｃｍのプレートあたり約２０，０００に調整
する。

【００３８】さらにインキュベートした後、通常の方法
を使用して特定の所望の部分に特異的に結合する蛋白質
を見つけるために、プラークをスクリーニングする。ス
クリーニングの段階の間に生じたＦａｂ分子に結合する
ものに対する特定の部分は、抗原、ハプタン、エピトー
プ及び分子を認識できる類似の科学的な構造を含むがこ
れらに限定されない。ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、（１９
８９）により記述された方法は、ニトロセルロース フ
ィルター上に結合蛋白質を移すこと及びＦａｂが結合す
る部分としてヨウ素化された抗原蛋白質を使用したフィ
ルター上への結合アッセイを実行することを含む。例え
ば、誘導体に浸したフィルターをコロニーから取り出
し、無関係な蛋白質をブロックし、そして標識された
（放射標識あるいは酵素的な標識）抗原を用いて拾いあ
げる。そして元のプレートから興味あるＤＮＡコロニー
を捜し出すために、特定の検出法が使用される。そして
適切なプラークを拾いあげ、プレートし直して、適切
な、Ｆａｂを生産するコロニーを豊富にするために再び
スクリーニングできる。

【００３９】一方、フィルター ペーパーは適切な部分
を含む分子でコートし、感染させたバクテリア細胞の層
の上でインキュベートする前にブロックできる。組換え
体Ｆａｂ断片は、基のコロニーと関連性を示すフィルタ
ー ペーパーの特定の領域と結合し、そして抗−ＦＡＢ
抗体あるいは構成物に含まれる、コードされた余分な領
域と反応する抗血清により検出される。

【００４０】両方のイムノグロブリンの可変領域のライ
ブラリーを含む、プラスミドを含む宿主細胞及びバクテ
リオファージを利用できれば、細胞を感染させ、そして
発現されたＦａｂ断片をスクリーニングする方法は単純
であり、当業者は新しいバクテリオファージの感染実験
を実行することを単純に好み、その後に新しい部分に特
異的な蛋白質をその時々にスクリーニングすることを必
要とする。一方、最初の結合蛋白質の最初のスクリーニ
ングの後、引き続く段階においてこれらの他の部分に結
合する可能性をもつプラークで試験することにより、付
加された部分に結合するＦａｂ断片、あるいは分子が、
同定される。また一方において、興味ある結合蛋白質が
意図されたようになるために、他の部分を含む別の分子
が、別の部分に結合する別の複数のＦａｂを、別のプラ
ーク内で同様にして検出するために使用され得る、別の
唯一の検出可能な余分な領域を用いて標識される。

【００４１】Ｅ．トランスフェクトされたセル ライン
からのＤＮＡの回収 興味ある結合蛋白質を用いて同定されたプラークのバク
テリオファージ及びプラスミドは通常の方法により回収
される。同定されたバクテリオファージは、バクテリオ
ファージの単離及びプラークの精製のための通常の方法
によりプラークから回収されうる。プラスミドは、例え
ばスーパーコイルされたＤＮＡの精製、そして新しい宿
主バクテリアへの形質転換、そして引き続いて独立のコ
ロニーの増殖及び成長によりプラークから回収されう
る。それぞれのプラークは、別々のプラスミドを持つ、
別々のバクテリア細胞を含み得るので、独立のコロニー
により幾つかの別々の種類のプラスミドを独立に単離す
る。それぞれの種類のプラスミドを含むコロニーを増殖
させ、再び同じプラークに由来するバクテリオファージ
で感染させることができる。最も望まれたプラスミド／
バクテリオファージの組み合わせを同定することができ
るようにするために、それぞれのバクテリオファージ／
プラスミドの組み合わせを、抗原に対する結合性により
試験できる。

【００４２】結合の特異性を持つ場所として最初に決定
されたのがＶ_H領域内で、Ｖ_H領域内の分配によりＦａｂ
断片の結合親和性が高められた場合において、本発明の
方法はバクテリオファージ内にＶ_Hライブラリーを挿入
し、形質転換されたバクテリアに感染させることにより
最大限に実行される。そしてプラークは単一のの重鎖及
びさまざまな軽鎖からなるさまざまなＦａｂ断片を含
み、このことにより所望の標的物に特異的な重鎖は親和
性が最も高められた軽鎖と組合わされる機会が増加す
る。さらに、高められた親和性を持つＦａｂを生産する
ためにプラークの領域の中の軽鎖の一つ以上が組合わさ
れているので、重鎖を検出できる能力が増加するので、
より容易に検出された、所望の特異性をもつＦａｂの母
集団がもたらされる。

【００４３】バクテリオファージが好ましいＭ−１３を
基にしたベクターからなり、形質転換及び感染された細
胞が溶解しないので、最高の親和性を持つＦａｂ分子を
生産する細胞を、最初の結合の研究において同定された
プラークの細胞をプレートすることによりコロニー化で
きる。そして最高の結合親和性を示す単一の細胞のコロ
ニーに存在するプラスミド及びバクテリオファージから
所望のＤＮＡ配列を回収できる。

【００４４】適切なバクテリオファージとプラスミドの
組合わせは同定され、大量に生育させることができる。
ＤＮＡが単離されそして重鎖及び軽鎖の可変領域をコー
ドする配列は、それらを最初にスクリーニング ベクタ
ーに導入するときに使用したのと同じ制限部位を使用し
て切り出され得る。そしてこれらの配列はどのような発
現ベクターにも挿入され得る；即ち制限部位及び／また
はどのような特定の系においても発現を最高にするのに
効果的であると証明されている他の配列を挿入及び／ま
たは除去するために、他の発現ベクター系に導入する前
に、通常の変異導入法により必要な所で、それらをさら
に修飾できる。

【００４５】

【実施例】

実施例１ 特別発現ベクターの調製 １）ｐＵＣ１９およびＭ１３ｍｐ１９のＨｉｎｄIII −
ＳａｌI クローニングサイト中へのＰｅｌ Ｂの挿入 ５' 末端に、バクテリアのリボゾームの効果的結合およ
び効率的翻訳のためのコンセンサスなシャインダルガノ
配列を有する合成ＰｅｌＢ ＤＮＡは、図１に示すよう
にして二つの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのＰＣ
Ｒ増幅により調製した。この合成ＰｅｌＢを、ｐＵＣ１
９およびＭ１３ ｍｐ１９ベクター内に存在するポリリ
ンカーのＨｉｎｄIII −ＳａｌI クローニングサイトに
強制的に連結し、そして確立されている方法によって
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ α Ｆ' ＩＰ細胞にトランスフ
ェクトした。

【００４６】得られた二つのベクターは、ｐＵＣ−Ｐｅ
ｌＢおよびｍｐ１９−ＰｅｌＢと呼ばれる。

【００４７】２）κおよびλのためのコンスタント領域
の合成およびＫｐｎI ／ＥｃｏＲI サイトへのサブクロ
ーニング 第３表に示すプライマーを用いて、κおよびλコンスタ
ント領域をヒト末梢血リンパ球ＤＮＡから、ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクションを用いて増幅した。増幅し
た材料を、ＫｐｎI およびＥｃｏＲI サイトへの強制的
クローニングにより、ｐＵＣ−ＰｅｌＢベクター内へ連
結した。得られたベクターをｐＵＣ−ＰｅｌＢ−Ｃκお
よびｐＵＣ−ＰｅｌＢ−Ｃλと呼ぶ。

【００４８】３）ＣＨ１−γおよびＣＨ１−γ２鎖の合
成およびｍｐ１９−ＰｅｌＢベクターのＫｐｎI および
ＥｃｏＲI クローニングサイトへのクローニング Ｆａｂフラグメント内に存在するコンスタント領域の配
列をコードするイムノグロブリン重鎖のコンスタント領
域セグメントは、コンスタント領域遺伝子の第一エクソ
ン内に存在する。このセグメント（ＣＨ１）を、適当な
修飾クローニングサイトと共に、表４に示すプライマー
を用いそしてテンプレートとして末梢血ヒトリンパ球の
ＤＮＡを用いて、増幅した。増幅した材料をｍｐ１９−
ＰｅｌＢベクターのＫｐｎI およびＥｃｏＲI サイトへ
強制的にクローニングした。

【００４９】Ｅ．ｃｏｌｉ内への形質転換の後、組換え
コロニーをＣＨ１−γ１およびＣＨ１−γ２配列に特異
的な診断オリゴヌクレオチドプローブ（表４）を用いて
スクリーニングした。

【００５０】突き止められた陽性クローンを配列決定し
て、ＣＨ１−γ１およびＣＨ１−γ２配列が正しくベク
ター内に挿入されたことを確認した。

【００５１】このベクターをｍｐ１９−ＰｅｌＣ−γ２
とよぶ。

【００５２】ここに記載した四つの特別ベクターのマッ
プを図２に示す。

【００５３】実施例２ イムノグロブリン遺伝子ライブ
ラリーの調製およびスクリーニング Ａ）イムノグロブリン配列のライブラリーの調製 １）ＶＨ−Ｄ−ＪＨジョイニングのプール−ＤＮＡの調
製 確立された方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）によ
り、脾臓細胞または末梢血リンパ球から、高分子量ゲノ
ムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡ配列は、ヤマダら，
１９８９のポリメラーゼ・チェイン・リアクションによ
り増幅する。

【００５４】ＰＣＲはサイキら（１９８５，１９８６）
に記載された方法で行う。ＤＮＡを最初に沸騰水中で５
分間変性させ、さらに５単位のＴｈｅｒｍｕｓ ａｐｕ
ａｔｉｃｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−
エルマー／シータス）を添加する。各サイクルは、５５
℃１分間のアニーリング工程、７０℃２分間のエロンゲ
ーション工程、および９５℃２分間の変性工程を含んで
いる。合計で３０−４０サイクルを行った。Ｖ_H−Ｄ−
Ｊ_Hカセットの増幅に用いたプライマーは、表１に示
す。

【００５５】増幅したＤＮＡを２倍量の１００％エタノ
ール中で沈澱させ、そして１０mMトリスと１mM ＥＤＴ
Ａを含むバッファー（pH７．５）に再懸濁し、この反応
生成物の１／５を、４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖ
ｅ，ＦＭＣ）および０．０８９Ｍトリスホウ酸／０．０
０２Ｍ ＥＤＴＡを用いてゲル電気泳動により分析す
る。電気泳動したＤＮＡをサザンブロッティングのため
に１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（pH８．０）を用い
てナイロン膜（Ｚｅｔａｂｉｎｄ，Ｃｕｎｏ）へ転写
し、そしてＪ領域の５' 末端とホモロガスな³²Ｐ−標識
した診断用オリゴヌクレオチドプローブと５０℃てハイ
ブリダイズする。フィルターを６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム，pH７．０）中、オリゴヌクレオチドプローブの計
算された融点である２℃以下（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，
（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８０：５３８７−５３９１）で洗浄した
後、フィルターを−７０℃でＸ−線フィルムに一夜露出
する。

【００５６】増幅材料中の不純物をジェネクリーン（Ｇ
ｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ １０１， ＬＡ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）による処理で除去する。ＤＮＡをＳａｌI
およびＫｐｎI で消化し、そして下記の特別ファージベ
クターｍｐ１９−ＰｅｌＣγ−１またはｍｐ１９−Ｐｅ
ｌＣγ−２にライゲートして、Ｖ_H鎖バクテリオファー
ジライブラリーを得る。

【００５７】２）ＶＬ−ＪＬプールＤＮＡの調製 ポリメラーゼ・チェイン・リアクションで異なるプライ
マーのセットを用いる以外は、同様にして軽鎖配列のラ
イブラリーを調製する。Ｖ_L−Ｊ_L領域の増幅に用いたプ
ライマーは表２に示されている。

【００５８】増幅された材料を特別プラスミドベクター
ｐＵＣ−ＰｅｌＢＣκまたはｐＵＣ−ＰｅｌＢ−Ｃλに
クローニングして、Ｖ_Lプラスミドライブラリーを得
る。

【００５９】Ｂ）ｐＵＣ ＰｅｌＢ−Ｃκ（λ）による
宿主細胞の形質転換 この実施例に用いた宿主細胞は、ベセスダリサーチラボ
ラトリーから得られ、ＤＨ５αＦ¹ ＩＱと呼ばれる。こ
の細胞は雄のＥ．ｃｏｌｉストレインで、安定なＦ₁ エ
ピゾームを含みそしてｌａｃＩプロモーターからの転写
を制御するｌａｃリプレッサー蛋白質を生産する。これ
らの細胞を、軽鎖ライブラリーを含む特別プラスミドベ
クターｐＵＣ−ＰｅｌＢ−ＣκまたはｐＵＣ−ＰｅｌＢ
−Ｃλで形質転換する。形質転換細胞をアンピシリン含
有培地中での増殖により選択する。

【００６０】Ｃ）重鎖ライブラリーを含むバクテリオフ
ァージによる形質転換宿主細胞のインフェクション 上記Ｂに記載した選択形質転換細胞の懸濁液を、上記で
調製したイムノグロブリン可変重鎖ライブラリーを含む
特別バクテリオファージｍｐ１９ ＰｅｌＣ−γベクタ
ーの懸濁液と混合し、ザムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ）ら，（１９８０）の記載にしたがってプレーティン
グする。インキュベートののち、プラークをニトロセル
ロースフィルターに釣り上げ、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）
ら，（１９８８）に記載された様にしてオートラジオグ
ラフィーにより、 ¹²⁵Ｉ標識された所望蛋白質抗原との
結合に関してスクリーニングする。

【００６１】Ｄ）選択されたＦａｂのＤＮＡのスクリー
ニングおよび回収 プレートの寒天からニトロセルロースフィルター上の陽
性結合位置に対応する部分を取って、その中からＤＮＡ
を抽出し、得られたＤＮＡ抽出物を上記のようにしてＰ
ＣＲにより増幅する。

【００６２】実施例３ 別のスクリーニング方法 形質転換細胞および重鎖ライブラリーを含むバクテリオ
ファージを、実施例２Ａに記載したようにして調製す
る。

【００６３】ｐＵＣ−ＰｅｌＢ−Ｃλ特別ベクターでト
ランスフェクトした組換えＥ．ｃｏｌｉを、プレートし
て菌叢を形成せ、次いで組換え可変重鎖を含むｍｐ１９
−ＰｅｌＣ−γでインフェクトする。感染菌叢をインキ
ュベートして、プレート当たりの平均プラーク濃度が２
０，０００シングルプラークとする。この菌叢の上に
（後のオリエンテーションのために）マークを付したニ
トロセルロース性フィルターを重層する；このフィルタ
ーはβ−ｇａｌプロモーターによる構築した挿入物の誘
導のために予めＩＰＴＧに浸漬して用いる。これによ
り、感染した菌叢内に、分泌型組換えＦａｂ' ｓの生産
が開始される。コロニーからＩＰＴＧに浸漬したフィル
ターを取り上げ、不活性蛋白質でブロックし、そして標
識（放射性標識または酵素標識）抗原でプローブ処理す
る。次に特異的検出現象を用いて、マスタープレートか
ら興味あるＤＮＡクローンの位置を求める。次にそのク
ローンをひろいあげ、再度プレーティングしてそして、
目的のＦａｂ生産性コロニーを正しく増加させるために
再度スクリーニングすることができる。その方法には何
通りもの変法があることは明らかであり、例えば、目的
クローンを拾って、挿入された可変領域カセットを直接
ＰＣＲに用いることも十分に可能である。次にそれらの
可変領域を、さらなる研究および挿入の確認のために、
容易に他の発現システムに移し変えることもできる。

【００６４】実施例４ 別のスクリーニング方法 この方法は、ニトロセルロース性の誘導紙を関連抗原で
被覆し、そして感染バクテリア細胞の菌叢上でインキュ
ベートする前にブロックする以外は、実施例２と同じで
ある。組換えＦａｂフラグメントは、その起源のコロニ
ーに相当するフィルター紙の特異領域に結合し、これを
次に構築物のコードされたタグ領域と反応するするかま
たは抗−Ｆａｂ抗体と反応する抗血清で検出する。突き
止められたコロニーを次にひろいあげ、目的の関連コロ
ニーを単離するために再スクリーニングする。

【００６５】本発明の修飾は当業者に明らかであるか
ら、本発明の範囲は請求の範囲の記載のみに限定され
る。

【００６６】 表１ Ｖ_H −Ｄ−Ｊ_H ジョイントのＰＣＲ増幅のためのプライマー Ｖ_H 1-5 センス T GTC GAC CAG GTG CAG CTG GTG C Ｖ_H 3 センス T GTC GAC CAG TGT GAG CTG GTG GAG Ｖ_H 4-6 センス T GTC GAC CAG GTG CAG CTG CAG GAG Ｖ_H アンチセンス T GGT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C ------- 表中、------の上部のGTC GAC はＳａｌI クローニング
サイトであり、GGT ACCはＫｐｎI クローニングサイト
である。

【００６７】 表 2 Ｖ_L −Ｊ_L ジョイントのＰＣＲ増幅のためのプライマー Ｊ_K アンチセンス T GGT ACC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC Ｊλアンチセンス T GGT ACC ACT TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC Ｖ_K −１ センス T GTC GAC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT Ｖ_K −２センス T GTC GAC GCT CAA GTG CTG ACC CAG ACT Ｖ_K −３センス T GTC GAC GAT GTT GTG ATG ACC CAA ACT Ｖ_L −１センス T GTC GAC CAG TCT GTG TTG ACG CAG CCG CCC Ｖ_L −２センス T GTC GAC CAG ACT GTG GTG ACT CAG GAG CCC ------- 表中、------の上部のGTC GAC はＳａｌI クローニング
サイトであり、GGT ACCはＫｐｎI クローニングサイト
である。

【００６８】 表 3 Ｃ_K およびＣλセグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマー Ｃ_K センス T GGT ACC GTG GCT GCA CCA TCT GTC Ｃ_K アンチセンス T GAA TTC TTA TTA ACA CTC TCC GTT GAA Ｃλセンス T GGT ACC CAG CCC AAG GCT GCC Ｃλアンチセンス T GAA TTC TTA TTA TGA ACA TTC TGC AGG ------- 表中、TTA はバクテリアの終止コドン配列であり、そし
て------の上部のGGT ACC はＫｐｎI クローニングサイ
トであり、GAA TTC はＥｃｏＲI クローニングサイトで
ある。

【００６９】 表 4 Ｃ_H １−γ１およびＣ_H １−γ２鎖の合成のプライマー Ｃ_H 1-γセンス T GGT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C Ｃ_H 1-γアンチセンス T GAA TTC TTA TTA TTT CTT GTC CAC CTT GGT ------- Ｃ１ ＤＰ ACC TCT GGG GGC ACA GCG GC Ｃ２ ＤＰ ACC TCC GAG AGC ACA GCC GC 表中、TTA は原核動物の終止コドン配列であり、そして
GAA TTC はＥｃｏＲIクローニングサイトであり、GGT A
CC はＫｐｎI クローニングサイトである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰｅｌＢリーダー配列を発現ベクターに導入す
るために使用された二本鎖ＤＮＡ配列を示す図である。

【図２】ベクターｍｐ１９−Ｐｅｌ−Ｃγ１またはＣγ
２の地図である。

【図３】ベクターｐＵＣ−ｐｅｌ−ＣκまたはＣλの地
図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アンドリユー・ジエイ・カートン アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104， フイラデルフイア，スプリング・ガーデ ン・ストリート 3706 (72)発明者 ピーター・ジエイ・カーテイス アメリカ合衆国ペンシルバニア州19130， フイラデルフイア，ペンシルバニア・アベ ニユー 2401，アパートメント ９シー49 (72)発明者 デービツド・ビー・ウエイナー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19151， ペンウイン，ヘンリー・ロード 23

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）第一のＤＮＡライブラリーを含むプ
   ラスミド発現ベクター集団で原核細胞を形質転換し； ｂ）上記形質転換細胞を、第二のＤＮＡライブラリーを
   含むバクテリオファージ発現ベクター集団で感染させ
   （ここで上記ＤＮＡライブラリーの一方はイムノグロブ
   リン軽鎖の可変領域を含み、他方はイムノグロブリン重
   鎖の可変領域を含む）；そして ｃ）下記部分（モイエティー）と結合する蛋白質を発現
   する感染した形質転換細胞を同定する； ことよりなる、少なくとも二つの異なるサブユニットを
   含む蛋白質をコードし、且つ特定の部分（モイエティ
   ー）に結合することが可能なＤＮＡ配列を選択する方
   法。
2. 【請求項２】 感染した形質転換細胞が、上記二つのＤ
   ＮＡライブラリーの一方に含まれるＤＮＡにコードされ
   る少なくとも一つのサブユニットおよび該二つのＤＮＡ
   ライブラリーの他方に含まれるＤＮＡにコードされる少
   なくとも一つのサブユニットからなる蛋白質を発現する
   ためにインキュベートされる、ここで上記複数のサブユ
   ニットは無作為的なとりあわせで組み合わされたもので
   ある、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 プラスミドがイムノグロブリン軽鎖のＤ
   ＮＡライブラリーを含み、そしてバクテリオファージが
   イムノグロブリン重鎖のＤＮＡライブラリーを含む、請
   求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 イムノグロブリン軽鎖の可変領域を含む
   ＤＮＡライブラリーが、リンパ球から単離されたＤＮＡ
   内の再配列された可変領域を増幅して得られるものであ
   る、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 イムノグロブリン重鎖の可変領域を含む
   ＤＮＡライブラリーが、リンパ球から単離したＤＮＡ内
   の再度配列された可変領域を増幅して得られるものであ
   る、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 発現ベクターの両者がイムノグロブリン
   のコンスタント領域も含んでおり、その軽鎖ライブラリ
   ーは軽鎖コンスタント配列と解読枠内に存在し、その重
   鎖ライブラリーは重鎖コンスタント配列と解読枠内に存
   在する、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 工程(c) がさらに下記の工程： ａ）感染した形質転換細胞を、上記発現ベクターにより
   コードされる蛋白質の発現を誘発する条件下で増殖さ
   せ； ｂ）前記部分に結合する蛋白質をどの細胞が発現してい
   るか決定し；そして ｃ）工程ｂ）で決定された細胞からＤＮＡを回収する； からなる、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の方法で同定された細胞。