JPH09220092A - １本鎖Ｆｖ抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】１本鎖Ｆｖ抗体の発現は種々報告されている
が、いずれも生産性が低いという問題がある。 【解決手段】大腸菌によってインクル−ジョンボディと
して発現させた抗Ｔ３−１本鎖Ｆｖ抗体を、塩酸グアニ
ジンにより変性させ、さらにフォ−ルディングさせて、
１本鎖Ｆｖ抗体を得る。また大腸菌によってシャペロニ
ンと抗ｇｐ１３０−１本鎖Ｆｖ抗体とを共発現させ、１
本鎖Ｆｖ抗体を可溶性画分として発現させて、１本鎖Ｆ
ｖ抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１本鎖抗体の製造
法に関するものである。さらに詳しくは、大腸菌により
１本鎖Ｆｖ抗体をインクル−ジョンボディとしてまたは
可溶性画分として発現させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】抗体は分子量が１０万を越える巨大分子
であるが、このうち抗原との結合に寄与している部分は
Ｖ領域（可変領域）と呼ばれ、Ｈ鎖（長鎖）のＶ領域
（分子量約１万）とＬ鎖のＶ領域（分子量約１万）とか
ら構成されている。本発明の１本鎖Ｆｖ抗体とは、図１
に示すようにＨ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域とを適当なリ
ンカ−でつないだものであり、もとの抗体分子全体のう
ち、主に抗原との結合性に必須の部分から構成された分
子量約２万の蛋白質である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】近年、１本鎖Ｆｖ抗体
の発現が種々報告されているが（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，５４５，１９９１年
参照）、いずれも大腸菌のペリプラズムに発現させる方
法をとっており、生産性が低いという問題がある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、１本鎖Ｆ
ｖ抗体の発現について鋭意研究した結果、本発明に到達
した。

【０００５】即ち本発明は、大腸菌によってインクル−
ジョンボディとして発現させた１本鎖Ｆｖ抗体を、変性
により可溶化させ、さらにフォ−ルディングさせること
を特徴とする、１本鎖Ｆｖ抗体の製造法である。また本
発明は、大腸菌によってシャペロニンと１本鎖Ｆｖ抗体
とを共発現させることにより、１本鎖Ｆｖ抗体を、可溶
性画分として発現させることを特徴とする、１本鎖Ｆｖ
抗体の製造法である。

【０００６】以下に本発明を更に詳しく説明する。

【０００７】本発明で提供される１本鎖Ｆｖ抗体は、図
１のような構造をもつ。すなわち、Ｈ鎖のＶ領域とＬ鎖
のＶ領域がリンカーで結合されたものである。このリン
カーは、好ましくは１０から３０、さらに好ましくは１
５から２５のアミノ酸から構成されるものである。Ｈ鎖
のＶ領域とＬ鎖のＶ領域は、どちらがＮ末端側に位置し
ていてもよい。また、リンカ−の配列としては、特に限
定はなく、配列番号３に記載の配列が例示されるが、そ
の他の配列でもよい。

【０００８】本発明の１本鎖Ｆｖ抗体を大腸菌によって
発現させるために必要なベクタ−系は、１本鎖Ｆｖ抗体
の遺伝子以外に、遺伝子を発現（転写）させるためのプ
ロモ−タ−／オペレ−タ−、遺伝子の発現（転写）を終
了させるためのタ−ミネ−タ−、宿主細胞中での複製の
ための遺伝子等、他の遺伝子配列を含んでいても良い。

【０００９】本発明では、大腸菌によってインクルージ
ョンボディとして発現させた１本鎖Ｆｖ抗体を変性によ
り可溶化させ、更にフォールディングさせる。変性の方
法に特に限定はなく、加熱、超音波、変性剤などがあげ
られる。以下に変性剤を用いた変性−可溶化−フォール
ディングの方法を例示する。

【００１０】大腸菌によってインクルージョンボディと
して発現した１本鎖Ｆｖ抗体を、例えば６Ｍ塩酸グアニ
ジンを用いて変性させ、それから徐々に塩酸グアニジン
の濃度を下げてフォ−ルディングさせる。変性剤として
は、塩酸グアニジンのほかに、尿素やイソチオシアネ−
ト、界面活性剤等が例示できる。また、変性剤の濃度を
徐々に下げる方法としては、サンプルを透析し外液を変
えていく方法や、サンプルに直接溶液を加え、変性剤の
濃度を下げていく方法が例示できる。

【００１１】このようにして、１本鎖Ｆｖ抗体はフォー
ルディングさせることができる。

【００１２】一方、本発明において大腸菌によってシャ
ペロニンと１本鎖Ｆｖ抗体とを共発現させる方法は、１
本鎖Ｆｖ抗体を発現させるプラスミドとシャペロニンを
発現させるプラスミドとを両方保持する大腸菌を樹立
し、これを培養して共発現させる方法があげられる。ま
た、１本鎖Ｆｖ抗体とシャペロニンの両方を発現できる
ようなプラスミドを作製し、これを導入した大腸菌を培
養し共発現させる方法でもよい。即ち、大腸菌レベルで
シャペロニンと１本鎖Ｆｖ抗体とが同時に発現するもの
であれば、由来するプラスミドは同じであっても異なっ
ていてもよい。また、使用するシャペロニンは、大腸菌
由来のシャペロニンＧｒｏＥＳＬの他に、真核生物由来
のシャペロニン、例えばＨＳＰ４７などを使用すること
ができる。

【００１３】上述の２つの１本鎖Ｆｖ抗体の製造法は、
どのような抗原を認識する抗体であっても適用できるも
のである。例えば蛋白、糖、脂質、核酸、有機化合物な
どを認識する抗体の製造に利用することができる。

【００１４】一例をあげると、Ｔ３はトリヨ−ドサイロ
ニンの略称で、それ自体甲状腺ホルモンとして構造や機
能がよく知られているものである。本発明の製造法によ
って提供される抗Ｔ３抗体として、１本鎖Ｆｖ型抗Ｔ３
抗体ＴＴ１が例示される。このＴＴ１の配列は、配列番
号１で表されるものであるが、これらのうち数個から数
十個のアミノ酸配列が付加、欠失、または置換した配列
であってもよい。なお、ＴＴ１については、特願７−２
７４０１２に詳しく記載されている。

【００１５】一方ｇｐ１３０は、インタ−ロイキン−６
等のサイトカインのシグナルを伝達する膜蛋白質とし
て、それ自体構造や機能がすでに報告されている（Hibi
ら、Cell, 63, p1149, 1990 年参照）。本発明の製造法
によって提供される抗ｇｐ１３０抗体として、１本鎖Ｆ
ｖ型抗ｇｐ１３０抗体ＧＰＸ７が例示される。このＧＰ
Ｘ７の配列は、配列番号２で表されるものであるが、こ
れらのうち数個から数十個のアミノ酸配列が付加、欠
失、または置換した配列であってもよい。なお、ＧＰＸ
７については、特開５−３０４９８６号公報に詳しく記
載されている。

【００１６】

【発明の効果】本発明で提供される大腸菌１本鎖Ｆｖ抗
体の製造法により、大腸菌１本鎖Ｆｖ抗体を大量に生産
することができる。このことは、大腸菌１本鎖Ｆｖ抗体
を免疫診断や分離精製手段として用いることにより、従
来、抗体の一定領域に由来する副反応を抑えることがで
き、基礎研究や診断薬治療薬開発に大きな意義をもつも
のである。

【００１７】

【実施例】以下本発明をさらに詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００１８】実施例１ 抗Ｔ３抗体ＴＴ１の遺伝子単離
と一本鎖Ｆｖ発現プラスミドの作製。

【００１９】ＴＴ１は、特願７−２７４０１２に記載さ
れている方法に従って製造した。すなわち、Ｔ３をＢＳ
Ａに結合させたものをＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、ひ
臓細胞とミエロ−マとをポリエチレングリコ−ルを用い
る通常の方法で細胞融合させ、ＨＡＴ培地選択及び抗原
への反応性を確認した後に限界希釈法によりクロ−ニン
グを行い、抗Ｔ３モノクロ−ナル抗体ＴＴ１（ＩｇＧク
ラス）産生ハイブリド−マを作製した。

【００２０】次に、ＲＰＭＩ１６４０で培養した１×１
０⁶個のＴＴ１ハイブリド−マから、ｍＲＮＡ抽出キッ
ト（ファルマシア製）により、ＴＴ１ハイブリド−マの
ｍＲＮＡを調製し，常法に従ってｃＤＮＡを調製した。

【００２１】次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌ
クレオチドプライマ−ＶＨＢＴ３ＳＣ（配列番号４）及
びＶＨＦＴ３ＳＣ（配列番号５）を用いてＰＣＲ（条
件：９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分、２５サイク
ル）を行って、抗体のＨ鎖Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡ断
片を増幅した。一方、同ｃＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌ
クレオチドプライマ−ＶＬＢＴ３ＳＣ（配列番号６）及
びＶＬＦＴ３ＳＣ（配列番号７）を用いてＰＣＲ（条
件：９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分、２５サイク
ル）を行って、抗体のＬ鎖Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡ断
片を増幅した。

【００２２】次に、上記２種類の増幅ＤＮＡを混合し、
アニ−リングと伸長反応（条件：９４℃１分、６４℃４
分、７サイクル）を行い、生成物（Ｌ鎖Ｖ領域−Ｈ鎖Ｖ
領域）を鋳型として上記オリゴヌクレオチドプライマ−
（ＶＬＢＴ３ＳＣ，ＶＨＦＴ３ＳＣ）を用いてＰＣＲ
（９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分、２５サイク
ル）を行った増幅物は直ちにＰＣＲ産物挿入用ベクタ−
ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン）に挿入し、スクリ−ニ
ングを経て目的ＤＮＡ断片の挿入されたベクタ−を得
た。

【００２３】次に、このベクタ−ＤＮＡをＦｓｐＩとＢ
ｇｌＩＩで消化し、これをｐＥＴ８ｃ（ノバジェン社）
（ＮｃｏＩ消化、Ｂｌｕｎｔ処理、ＢａｍＨＩ消化を順
に行ったもの）に挿入した。

【００２４】このようにして作製されたプラスミドにリ
ンカ−部位を以下の手順で挿入した。すなわち、リンカ
−部ＤＮＡとしてＳＣＬＢ１（配列番号８）とＳＣＬＦ
１（配列番号９）をアニ−ルし、上記プラスミド（Ｂａ
ｍＨＩ消化とＸｈｏＩ消化を行ったもの）に挿入し、最
終的に大腸菌でのＴＴ１（１本鎖Ｆｖ）抗体発現プラス
ミドｐＥＴ８ｃ−ＴＴ１ｓｃＦｖを作製した。また、ｐ
ＥＴ８ｃ−ＴＴ１ｓｃＦｖがコ−ドするＴＴ１の一本鎖
Ｆｖの１次構造及びそれをコードする核酸を配列番号１
に示す。

【００２５】実施例２ 抗Ｔ３抗体ＴＴ１の発現とフォ
−ルディング。

【００２６】ｐＥＴ８ｃ−ＴＴ１ｓｃＦｖを大腸菌ＢＬ
２１（ノバジェン社）に導入し、プレ−トにまいた。翌
日、１クロ−ンを１０ｍｌのＮＺ培地に接種し、３７℃
で一晩種培養した。翌日、上記培養液１０ｍｌを１リッ
トルのＮＺ培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６６
０が０．３に達した段階（培養開始後約２時間）でＩＰ
ＴＧを１ｍＭになるように添加し、さらに２時間培養し
た。

【００２７】次に、遠心で菌体を集め、３０ｍＭ Ｔｉ
ｒｓ−ＨＣｌ，３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８で２回洗っ
た後、２０ｍｌの同溶液に懸濁した。超音波で菌体を破
砕後、遠心を行いインクル−ジョンボディ及び可溶性画
分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図２に示
す。図中、レーン１は菌体の可溶性画分、レーン２はイ
ンクルージョンボティである。矢印は１本鎖Ｆｖ型抗体
ＴＴ１のバンドを示す。図２から明らかなように、ＴＴ
１の一本鎖抗体はインクルージョンボディに発現してい
ることが確認された。

【００２８】インクル−ジョンボディを１０ｍｌの２％
ＴｒｉｔｏｎＸ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８に懸濁
し、再度超音波処理をした後、４℃で一晩放置した。

【００２９】翌日、不溶性画分を遠心で集め、３０ｍＭ
Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ，３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８で２
回洗った後、１０ｍｌの同溶液に懸濁した。次に、蛋白
質濃度が１０μｇ／ｍｌになるように４５０ｍｌの３０
ｍＭ Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ，３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８
に希釈し、これを６Ｍ塩酸グアニジン、４０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１ｍＭＤＴＴに透析した。４時
間後、外液の半分を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８，１ｍＭ ＤＴＴに交換した。同様に４時間以上経過
後に外液の半分を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８，１ｍＭ ＤＴＴに交換する操作を４回繰り返した
後、最終的に外液を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８，１００ｍＭ ＮａＣｌに置き換えた。４時間後サン
プルを回収し、抗Ｔ３抗体ＴＴ１の一本鎖Ｆｖ標品とし
た。

【００３０】抗Ｔ３抗体ＴＴ１の一本鎖Ｆｖ標品の、Ｔ
３との結合性は以下の方法で確認した。即ちＴＴ１の一
本鎖Ｆｖ標品（１０μｇ／ｍｌ、リン酸バッファに溶
解）をマイクロタイタ−プレ−トに固相化し、ＢＳＡで
ブロッキングした。次に、アルカリフォスファタ−ゼで
標識したＴ３（特願７−２７４０１２参照）を加え、最
後にアルカリフォスファタ−ゼの基質を加え４０５ｎｍ
の吸光度をイムノリ−ダ−で測定した。結果を図３に示
す。図中、プレート１は本試験を行ったもの、プレート
２は対象として１本鎖Ｆｖ抗体標品を固相化しなかった
プレートを用いたものである。

【００３１】図３から明らかなように、ＴＴ１をコ−ト
したウエルはＴＴ１をコ−トしていないウエルと比較し
て、有意な差が認められた。これは、ＴＴ１の一本鎖Ｆ
ｖ標品がＴ３と結合することを示すものである。

【００３２】実施例３ 抗ｇｐ１３０抗体ＧＰＸ７の遺
伝子単離と１本鎖Ｆｖ発現プラスミドの作製。

【００３３】ＲＰＭＩ１６４０で培養した１×１０⁶個
のＧＰＸ７ハイブリド−マ（斎藤ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６３巻、ｐ２１７，１９９３年
参照）から、ｍＲＮＡ抽出キットにより、ＧＰＸ７ハイ
ブリド−マのｍＲＮＡを調製し，常法に従ってｃＤＮＡ
を調製した。

【００３４】次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌ
クレオチドプライマ−ＶＨＢＧＰＸ７ＳＣ（配列番号１
０）及びＶＨＦＧＰＸ７ＳＣ（配列番号１１）を用いて
ＰＣＲ（条件：９４℃１．５分、５４℃２．５分、７２
℃３分、３０サイクル）を行い、抗体のＨ鎖Ｖ領域をコ
−ドするＤＮＡ断片を増幅した。一方、同ｃＤＮＡを鋳
型とし、別のオリゴヌクレオチドプライマ−ＶＬＢＧＰ
Ｘ７ＳＣ（配列番号１２）及びＶＬＦＧＰＸ７ＳＣ（配
列番号１３）を用いてＰＣＲ（条件：９４℃１．５、５
４℃２．５分、７２℃３分、３０サイクル）を行って、
抗体のＬ鎖Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅した。
増幅したＤＮＡはそれぞれｐＵＣプラスミドにクロ−ニ
ングし、塩基配列を決定した。

【００３５】次に、上記ｃＤＮＡを鋳型として、オリゴ
ヌクレオチドプライマ−ＶＨＢＧＰＸ７ＳＣ（配列番号
１０）及びＶＨＦＧＰＸ７ＳＣ（配列番号１１）を用い
てＰＣＲ（条件：９４℃２分、５６℃２分、７２℃２
分、３０サイクル）を行って、抗体のＨ鎖Ｖ領域をコ−
ドするＤＮＡ断片を増幅した。一方、同ｃＤＮＡを鋳型
とし、オリゴヌクレオチドプライマ−ＶＬＢＧＰＸ７Ｓ
Ｃ（配列番号１２）及びＶＬＦＧＰＸ７ＳＣ（配列番号
１３）を用いてＰＣＲ（条件：９４℃２分、５６℃２
分、７２℃２分、３０サイクル）を行って、抗体のＬ鎖
Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅した。

【００３６】次に、上記２種類の増幅ＤＮＡを混合し、
アニ−リングのためのＰＣＲ（条件：９４℃２分、５６
℃２分、７２℃２分、３０サイクル）を行った。

【００３７】次に、アニ−ルされたＤＮＡをＦｓｐＩと
ＢｇｌＩＩで消化し、これをｐＥＴ８ｃ（ノバジェン
社）（ＮｃｏＩ消化、Ｂｌｕｎｔ処理、ＢａｍＨＩ消化
を順に行ったもの）に挿入した。

【００３８】このようにして作製されたプラスミドにリ
ンカ−部位を以下の手順で挿入した。すなわち、リンカ
−部ＤＮＡのＳＣＬＢ２（配列番号１４）とＳＣＬＦ２
（配列番号１５）をアニ−ルし、上記プラスミド（Ｘｈ
ｏＩ消化とＭｕｎＩ消化を行ったもの）に挿入し、最終
的に大腸菌でのＧＰＸ７（１本鎖Ｆｖ）抗体発現プラス
ミドｐＥＴ８ｃ−ＧＰＸ７ｓｃＦｖを作製した。また、
ｐＥＴ８ｃ−ＧＰＸ７ｓｃＦｖがコ−ドするＧＰＸ７の
一本鎖Ｆｖの１次構造及びそれをコードする核酸を配列
番号２に示す。

【００３９】実施例４ 抗ｇｐ１３０抗体ＧＰＸ７の１
本鎖ＦｖとシャペロニンＧｒｏＥＳＬとの共発現。

【００４０】図６に示す方法により、抗ｇｐ１３０抗体
ＧＰＸ７の１本鎖ＦｖとシャペロニンＧｒｏＥＳＬとの
共発現ベクタ−ｐＥＴ−ｓＦｖ−ＥＳＬを作製した。

【００４１】次いで、ｐＥＴ−ｓＦｖ−ＥＳＬを大腸菌
ＢＬ２１（ノバジェン社）に導入し、プレ−トにまい
た。

【００４２】翌日、１クロ−ンを１０ｍｌのＮＺ培地に
接種し、３７℃で一晩種培養した。翌日、上記培養液１
０ｍｌを１リットルのＮＺ培地に接種し、３７℃で培養
した。ＯＤ６６０が０．３に達した段階（培養開始後約
２時間）でＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、さら
に２時間培養した。

【００４３】次に、遠心で菌体を集め、３０ｍＭ Ｔｉ
ｒｓ−ＨＣｌ，３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８で２回洗っ
た後、２０ｍｌの同溶液に懸濁した。超音波で菌体を破
砕後、遠心で不溶性画分及び可溶性画分を集めた。菌体
の不溶性画分（レーン１）と可溶性画分（レーン２）と
を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図５に示す。
図中、矢印Ａは発現したシャペロニンＧｒｏＥＳＬ、矢
印Ｂは発現した１本差Ｆｖ型ＧＰＸ７のバンドを示す。
図５から明らかなように、シャペロニンＧｒｏＥＳＬと
共発現させることにより、可溶性画分にＧＰＸ７の１本
鎖Ｆｖ抗体が検出された。このＧＰＸ７の１本鎖Ｆｖ抗
体をマイクロタイタープレートに固相化し、アルカリホ
スファターゼで標識したｇｐ１３０と反応させたとこ
ろ、ＧＰＸ７の１本鎖Ｆｖ抗体はｇｐ１３０と結合する
ことが示された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の１本鎖Ｆｖ抗体の構造を示す模式図で
ある。

【図２】実施例２で行った、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのパタ−
ンを示す図である。

【図３】実施例２で行った、マイクロタイタープレート
１，２の吸光度を示す図である。

【図４】実施例４で行った、ｐＥＴ−ｓＦｖ−ＥＳＬの
作製手順を示す図である。

【図５】実施例４で行った、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのパタ−
ンを示す図である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７３５塩基 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 単離クローン名：ハイブリド−マＴＴ１ 配列 ATG GCA GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA ACC ACC ATG GTT GCA TCT 48 Met Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Val Ala Ser 1 5 10 15 CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT ATA AGT 96 Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser 20 25 30 TCC AAT TAC TTG CAT TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGA TTC TCC CCT AAA 144 Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys 35 40 45 CTC TTG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGT GTC CCA ACT CGC 192 Leu Leu Ile Tyr Arg Tyr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg 50 55 60 TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC 240 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr 65 70 75 80 ATG GAG GCT GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG GGT AGT AGT 288 Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser 85 90 95 ATA CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTC GAG ATC GGT GGC GGT 336 Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Gly Gly 100 105 110 GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCC GAG GTC AAG CTG 384 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu 115 120 125 CAG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG AAG CTT GGC GGG TCC CTG AAA CTC 432 Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140 TCC TGT GAA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGT TAT TAC ATG TCT TGG 480 Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 145 150 155 160 GTT CGC CAG ACT CCA GAG AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA GCC ATT AAT 528 Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Ala Ile Asn 165 170 175 AGT AAT GGT GGT ACC ACC TAC TAT TCA GAC ACT GTG AAG GGC CGA TTC 576 Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC 624 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser 195 200 205 AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC TTG TAT TAC TGT GCA AGC CCG GTC 672 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser Pro Val 210 215 220 TCC TAT TAT TAC CTC TAT GTC ATG TAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG 720 Ser Tyr Tyr Tyr Leu Tyr Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 225 230 235 240 GTC ACC GTC TCC TCA 735 Val Thr Val Ser Ser 245 配列番号：２ 配列の長さ：７２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 単離クローン名：ハイブリド−マＧＰＸ７ 配列 GAG CTC GTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA TTG ATA TCT GCA TCT CCA GGG 48 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ile Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AAT GTC AGC TCA AGT GTT ACT TCC ATG 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Val Ser Ser Ser Val Thr Ser Met 20 25 30 TAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT CCT CGC TCC AGT GGC AGT 192 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Ser Ser Gly Ser 50 55 60 GGG TCT GGG ACC ACT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC TTG GAG GCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ACT AAC CCG CTC ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTC GAG CTG GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 336 Phr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCG GAC GTC CAA TTG CAG CAG TCT GGA 384 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 115 120 125 CCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATA CCC TGC AAG GCT 432 Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala 130 135 140 TCA GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AAG CAG AGC 480 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser 145 150 155 160 CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT AAT TCT CAT AGT GGT 528 His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Ser His Ser Gly 165 170 175 GGT ATT ATC TAC AAC CAA AAG TTC AAG GAC AAG GCC ATA TTG ACT GTA 576 Gly Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val 180 185 190 GAT AAG TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT 624 Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser 195 200 205 GAG GAC ACT GCA GTC TAT TAT TGT GCA AGA ACC TAC TAT GTG TAC GGC 672 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Val Tyr Gly 210 215 220 CAC TTC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA 720 His Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu The Val Ser Ser 225 230 235 240 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGGCCGCGG ATCCGAGGTC AAGCTGCAG 29 配列番号：５ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CAGTGGCAGA GGAGTACTAT TTCTAGAATG CA 32 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACGTATGCGC AGACATTCAG CTGACC 26 配列番号：７ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCTGGTTCG AGCTCTAGCG CCGGCGCCTA GG 32 配列番号：８ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCGAGATCGG TGGCGGTGGC TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCG 48 配列番号：９ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCCGCCGC CACCCGACCC ACCACCGCCC GAGCCACCGC CACCGATC 48 配列番号：１０ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA 32 配列番号：１１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCCTCTGCAG TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34 配列番号：１２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CACGTGAATT CGACGTCCAG CTGCAGCAGT CTGG 34 配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGGCTTGTCG ACACAATCCC TGGGCACAAT 30 配列番号：１４ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCGAGCTGGG TGGCGGTGGC TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCGGACGTCC 60 配列番号：１５ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AATTGGACGT CCGATCCGCC GCCACCCGAC CCACCACCGC CCGAGCCACC GCCACCCAGC 60

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大腸菌によってインクル−ジョンボディと
   して発現させた１本鎖Ｆｖ抗体を、変性により可溶化さ
   せ、さらにフォ−ルディングさせることを特徴とする、
   １本鎖Ｆｖ抗体の製造法。
2. 【請求項２】大腸菌によってシャペロニンと１本鎖Ｆｖ
   抗体とを共発現させることにより、１本鎖Ｆｖ抗体を、
   可溶性画分として発現させることを特徴とする、１本鎖
   Ｆｖ抗体の製造法。
3. 【請求項３】１本鎖Ｆｖ抗体が、配列番号１で表される
   抗Ｔ３抗体である請求項１または請求項２に記載の製造
   法。
4. 【請求項４】１本鎖Ｆｖ抗体が、配列番号２で表される
   抗ｇｐ１３０抗体である請求項１または請求項２に記載
   の製造法。