JP3258630B2 - 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ - Google Patents

生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ

Info

Publication number
JP3258630B2
JP3258630B2 JP32218498A JP32218498A JP3258630B2 JP 3258630 B2 JP3258630 B2 JP 3258630B2 JP 32218498 A JP32218498 A JP 32218498A JP 32218498 A JP32218498 A JP 32218498A JP 3258630 B2 JP3258630 B2 JP 3258630B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
ser
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP32218498A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11218532A (ja
Inventor
トーマス ダウンズ ジェームズ
スー ジョンソン キンバリー
スティーブン メゼス ピーター
ジョージ オッターネス イバン
Original Assignee
ファイザー・プロダクツ・インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ファイザー・プロダクツ・インク filed Critical ファイザー・プロダクツ・インク
Publication of JPH11218532A publication Critical patent/JPH11218532A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3258630B2 publication Critical patent/JP3258630B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的媒体中の
タンパク質フラグメントを検出するための方法に関す
る。より詳しくは、それは、タイプIIコラーゲンのコラ
ゲナーゼ切断に起因するコラーゲンフラグメントを定量
するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】関節軟骨の生理学的ターンオーバーは、
合成と分解との間の精巧な平衡状態を表わす。それは、
成人における軟骨の正常な成長及び増殖、並びに維持の
特徴である。正味の軟骨損失は、リウマチ様関節炎及び
変形性関節症の特徴である。それは、生活の不能性及び
低特性に強く関係している。リウマチ様関節炎及び変形
性関節症における軟骨破壊は、現在、臨床的徴候及び放
射線的発見の組合せに基づいて診断される。関節軟骨に
対する損傷は、放射線的に検出され得るずっと前に、疾
病において初期に発生し；損傷は、広範且つたぶん可逆
的な軟骨損失が存在した後でのみ、放射線的に検出され
る。従って、臨床医は軟骨損傷の初期診断のための生化
学的マーカーを有することが決定的に重要なことであ
り、その結果、治療は、広範な損傷が生じる前、初期に
開始され得る。
【０００３】タイプＩコラーゲンがほとんど他の組織、
たとえば皮膚、骨、靱帯及び腱の細胞外マトリックスの
原線維構成を形成するように、タイプIIコラーゲンは、
軟骨マトリックスのフィブリルの大部分を構成する。そ
れらのコラーゲンは、きつく巻かれたトリプルヘリック
スから構成されており、これはメタロプロテイナーゼコ
ラゲナーゼにより単に切断されてポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により同定できる３／４及び１／４長のα−
鎖フラグメントを生成することができる。
【０００４】関節疾患の間の関節軟骨の破壊は、一部、
フィブリルタイプIIコラーゲン及び集合プロテオグリカ
ンから主に構成される細胞外マトリックスの分解によ
る。関節軟骨において、タイプIIコラーゲンフィブリル
は引張り強さを担当し、そしてプロテオグリカンは正常
な連結及び機能のために必要な圧縮剛性を提供する。そ
れらの結合組織成分が劣化される正確な機構は、まだ十
分には理解されていない。哺乳類においては、重要な機
構は、ヘリカル（生来的）コラーゲンを部位−特異的に
切断できる酵素群であるコラゲナーゼを包含する。
【０００５】発明の要約 本発明は、タンパク質フラグメント、好ましくはタイプ
IIコラーゲンのコラゲナーゼ切断に起因するコラーゲン
フラグメントについて生物学的媒体をモニターするため
の方法を含んで成り、ここでこの方法は、前記生物学的
媒体と捕捉抗体とを接触せしめ、ここで該捕捉抗体は配
列番号１及び２として配列表に示される配列に対して活
性であり；前記生物学的媒体と検出抗体とを接触せし
め、ここで該検出抗体は配列番号３及び４として配列表
に示される配列に対して活性であり；そして最後に、当
業者によく知られている標準の技法を用いて、前記捕捉
抗体及び検出抗体に対して結合したコラーゲンフラグメ
ントの量を検出することを含んで成る。
【０００６】当業者は、前記抗体と前記生物学的媒体と
を接触する順序は逆にされ得ることを認識するであろ
う。従って、もう１つの観点においては、本発明は、タ
ンパク質フラグメントについて生物学的媒体をモニター
するための方法を含んで成り、ここで前記方法は、前記
生物学的媒体と捕捉抗体とを接触せしめ、ここで該捕捉
抗体は配列番号３及び４として配列表に示される配列に
対して活性であり；前記生物学的媒体と検出抗体とを接
触せしめ、ここで該検出抗体は配列番号１及び２として
配列表に示される配列に対して活性であり；そして前記
捕捉抗体及び検出抗体に対して結合したコラーゲンフラ
グメントの量を検出する；ことを含んで成る。
【０００７】好ましい観点において、本発明は、関節軟
骨のコラゲナーゼ切断により生成されるコラーゲンフラ
グメントであるタンパク質フラグメントの検出のための
方法、及びより具体的には、前記タンパク質フラグメン
トがタイプIIコラーゲンのコラゲナーゼ切断から生成さ
れるような方法を提供する。さらにもう１つの観点にお
いては、本発明は、関節軟骨から生成されるコラーゲン
フラグメントについて生物学的媒体をモニターするため
の第３方法を提供し、ここでこの方法は、前記生物学的
媒体と配列番号３及び４として配列表に示される配列に
対して活性である抗体とを接触せしめ；そして前記抗体
に対して結合したコラーゲンフラグメントの量を検出す
ることを含んで成る。
【０００８】広い観点においては、本発明は、生物学的
媒体と、配列番号３及び４として配列表に示される配列
を含むタンパク質フラグメントを認識し、そしてそれに
結合できる抗体とを接触せしめ；そして前記抗体に対し
て結合したタンパク質フラグメントの量を検出すること
を含んで成る、タンパク質フラグメントについて生物学
的媒体をモニターするための方法を提供する。
【０００９】本発明は、モノクローナル抗体である捕捉
抗体を提供する。本発明はまた、モノクローナル抗体で
ある検出抗体も提供する。本発明は、配列番号５として
配列表に示されるＶH 配列、及び配列番号６として配列
表に示されるＶL 配列を有する、９Ａ４と称するモノク
ローナル抗体を提供する。本発明は、それぞれ、配列表
に示される配列番号７及び８に対応する、ｐ９Ａ４ＩＣ
ＡＴ７−１（ＡＴＣＣ９８５９３）（ATCC ; American
Type Culture Collection, 10801 University Blvd., M
anassas, Virginia 20110-2209 USA）のｓｃＦｖ９Ａ４
及びｐ９Ａ４ＩＦ−５（ＡＴＣＣ９８５９２）に関連す
るが、しかし配列において必ずしも同一ではない遺伝子
操作された抗体である抗体を提供する。
【００１０】本発明は、配列番号９として配列表に示さ
れるようなｐ５１０９ＣｓｃＦｖ７（ＡＴＣＣ９８５９
４）のｓｃＦｖ５１０９に関連するが、しかし配列にお
いて必ずしも同一ではない遺伝子操作された抗体である
抗体を提供する。本発明は、配列番号１０として配列表
に示されるＶH 配列、及び配列番号１１として配列表に
示されるＶL 配列を有する、５１０９と称するモノクロ
ーナル抗体を提供する。
【００１１】本発明は、配列番号１０として配列表に示
されるＶH 配列、及び配列番号１１として配列表に示さ
れるＶL 配列を有する、５１０９と称する抗体を用いて
タンパク質フラグメントを検出するための方法を提供す
る。もう１つの観点において、本発明は、配列番号１又
は２として配列表に示される構造から実質的に成るペプ
チドに対して結合するモノクローナル抗体を生成する、
ＡＴＣＣ ＨＢ−１２４３６の識別特徴を有するハイブ
リドーマ細胞系を提供する。
【００１２】もう１つの観点において、本発明は、配列
番号３又は４として配列表に示される構造から実質的に
成るペプチドに対して結合するモノクローナル抗体を生
成する、ＡＴＣＣ ＨＢ−１２４３５の識別特徴を有す
るハイブリドーマ細胞系を提供する。さらにもう１つの
観点においては、本発明は、配列番号１又は２として配
列表に示される構造から実質的に成るペプチドに対して
結合する９Ａ４に関連する遺伝子操作された抗体を生成
するＥ．コリ培養物を提供する。もう１つの観点におい
ては、本発明は、配列番号３又は４として配列表に示さ
れる構造から実質的に成るペプチドに対して結合する５
１０９に関連する遺伝子操作された抗体を生成するＥ．
コリ培養物を提供する。
【００１３】さらにもう１つの観点においては、本発明
は、個々の半分の抗体がそのそれぞれの結合パートナー
を認識する、抗体９Ａ４及び５１０９のハイブリダイゼ
ーションにより生成される二元特異的抗体を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、ＶL （５１０
９）−リンカー−ＶH （５１０９）−リンカー−Ｖ
L （９Ａ４）−リンカー−ＶH （９Ａ４）形で抗体９Ａ
４及び５１０９のＶL 及びＶH ドメイン及びそれらの同
等物を組合することによって生成される前記抗体の遺伝
子操作された組合せである二元特異的抗体を供給する。
【００１４】本発明はさらに、生物学的媒体を上記二元
特異的抗体９Ａ４／５１０９とを接触せしめ；そして前
記抗体に対して結合したコラーゲンフラグメントの量を
検出することを含んで成る、生物学的媒体におけるコラ
ーゲンフラグメントをモニターするための方法を提供す
る。本発明はまた、抗体５１０９及び９Ａ４の遺伝子的
に修飾された変異体から生成される二元特異的抗体も供
給する。
【００１５】本発明の特定の記載 タイプIIコラーゲンは、関節軟骨にその引張り強さ及び
剪断耐性を与える構造タンパク質である。それはまた、
圧縮耐性を付与し、そしてそのようにすることで、浸透
的に加圧された軟骨の形を直接的に決定するプロテオグ
リカンの包含のための構造的基礎を提供する。従って、
タイプIIコラーゲンの構造的完全性は、関節軟骨の物性
及び耐久性の主要決定因子である。
【００１６】関節軟骨の進行性不全は、関節疾患の顕著
な特徴の１つである。その不全がタイプIIコラーゲン構
造の変化に基づいている場合、タイプIIコラーゲンの分
解を特異的に測定する方法を有することが好都合であ
る。関節軟骨からのタイプIIコラーゲンのフラグメント
が、そのタイプIIコラーゲンが分解するにつれて、滑
液、リンパ、血液及び尿中に開放される。生き残ったフ
ラグメントの測定は、関節疾患の開始を検出し、そして
疾患の進行を測定するためにタイプIIコラーゲン分解を
モニターするための方法を提供する。さらに、疾病の
間、タイプIIコラーゲン分解に対する治療の効果を測定
することもまた有用である。
【００１７】種々の方法が、コラーゲン分解をモニター
するために使用されて来た。哺乳類組織においては、コ
ラゲナーゼは、タイプIIコラーゲンの分解に関与する律
速的細胞外酵素であると思われる（１）。３／４及び１
／４断片へのコラーゲンのコラゲナーゼ断片化は早く１
９６７年に同定されており（２，３）、そしてタイプII
コラーゲンの分解に関与する現在同定された３種の哺乳
類コラゲナーゼが存在する（４，５）。１つの酵素は、
タイプIIコラーゲンのさらなる断片化に関与する。フィ
ブリルコラーゲンのリソソーム分解は、骨及び肝臓にお
いて知られている（６，７）。コラーゲンは高いヒドロ
キシプロリン含有率により特徴づけられる数種のタンパ
ク質の１つであるので、尿ヒドロキシプロリンの測定が
コラーゲンターンオーバーの測定として試験されて来た
（８）。
【００１８】しかしながら、タイプＩ及びタイプIII コ
ラーゲンは一般的に皮膚、骨及び結合組織において多量
に見出されるので、前記方法は特定の身体成分、たとえ
ば骨から特定タイプのコラーゲン又はコラーゲンのいづ
れかの分解を測定するために有用でないことが見出され
ており、そしてそれはヒドロキシプロリンの毎日の尿分
泌中の非常に小さな部分のみを提供するのでタイプIIコ
ラーゲンをモニターするためには価値がない（８）。従
って、コラーゲンの分解又はコラーゲンそれ自体をモニ
ターするための努力が、免疫学的方法に向けられて来
た。
【００１９】抗体は、コラーゲンタイプ及び切断部位に
対して特異的なコラーゲンフラグメントを識別すること
ができ、そしてコラーゲン分解の特定の態様をモニター
することができる可能性がある（９）。ポリクローナル
及びモノクローナル抗体は、タイプＩ及びIII コラーゲ
ン又はそれらのフラグメントに対して調製され；そして
タイプＩ及びIII コラーゲンのコラーゲン分解生成物の
ためのアッセイ法が用意されて来た；たとえばＥｙｒｅ
（１０）を参照のこと。タイプIIコラーゲンの分解生成
物に対する抗体を生成する比較的少数の方法が報告され
ている。
【００２０】ポリクローナル及びモノクローナル抗体
が、タイプIIコラーゲンに対して調製されて来た（９，
１１−１３）。それらの抗体は、コラーゲンフラグメン
トの定量測定よりもむしろ無傷の（intact）タイプIIコ
ラーゲンの検出のために利用されて来た。しかしなが
ら、Eyre（１４）は、架橋残基を含むタイプIIコラーゲ
ンフラグメントに対するモノクローナル抗体を調製し、
そして彼の発行された特許に類似するタイプIIコラーゲ
ン特異的類似配列を含む架橋フラグメントに基づいてタ
イプIIコラーゲンの分解についてのアッセイを開発した
（１０）。Dodge 及びPoole は、他のコラーゲンと反応
しない変性されたタイプIIコラーゲンに対するポリクロ
ーナル抗体を調製した（１５，１６）。
【００２１】エピトープが配列決定され、そして後に、
Hollander 及びPoole （１７，１８，１９）は、モノク
ローナル抗体を用いて、配列番号１２及び１３として配
列表に示される配列を有するタイプIIコラーゲンフラグ
メントに対する競争抗体アッセイ法を用意した。Billin
ghurstなど（２０）は、タイプIIコラーゲン（配列番号
２として配列表に示される配列を有する）のコラーゲン
切断部位ネオエピトープに対するポリクローナル抗体を
調製し、そして競争タイプIIコラーゲンアッセイを開発
した。Srinivas，Barrach 及びChichester（２１−２
３）は、抗原としてタイプIIコラーゲンの臭化シアンフ
ラグメントを用いてタイプIIコラーゲンアッセイのため
の複数のモノクローナル抗体を調製した。
【００２２】抗体と反応性のエピトープは同定されなか
ったが（２４）、それらはタイプIIコラーゲンをアッセ
イすることができる。本発明は、タイプIIコラーゲン代
謝の２種のタイプのアッセイを提供する。両アッセイ
は、タイプIIコラーゲンの特定の配列に対する、まだ調
製されたことがない抗体（ポリクローナル、モノクロー
ナル又は遺伝子操作された抗体）に基づいている。前記
配列、すなわちＣ−末端で１つの残基が欠失している、
配列番号３として配列表に示される配列は、酸性残基に
富んでいる。
【００２３】哺乳類細胞外アスパルチルエンドペプチダ
ーゼ又はグルタミルエンドペプチダーゼは記載されたこ
とがないので、酸性残基に富んでいるコラーゲンフラグ
メントは、さらなる代謝に対して生き残り、そして体液
中での測定のために利用できるはずである。それらの残
基又はそれらの残基を含むコラーゲンフラグメントに対
する抗体が、コラーゲン代謝物の生成方法に関係なく、
体液中のタイプIIフラグメントの一般的検出方法を提供
するであろう。この発明は、モノクローナル抗体５１０
９、及びタイプIIコラーゲン配列に対して特異的であ
り、そして前記配列を含むコラーゲンフラグメントに対
して結合する遺伝子操作された５１０９の変異体を提供
する。
【００２４】第１アッセイは、タイプIIコラーゲンの分
解を評価するための一般的な方法である。このアッセイ
は、Ｃ−末端で１つの残基が欠失している、配列番号３
として配列表に示される配列、及びその密接に関係する
類似物の量を定量化するための一般的な競争方法を提供
する。第２のアッセイに関しては、配列番号１４として
配列表に示される配列に対して向けられる追加の抗体が
調製された。グリシン（配列番号１４の残基９）上に遊
離Ｃ−末端カルボキシル基が存在する。この配列は、コ
ラゲナーゼがタイプIIコラーゲンを分解する場合に得ら
れ、そして従って、それはネオエピトープとして分類さ
れ、すなわちそれは生来の配列（配列番号１５として配
列表に示される配列は−ＧＰＯＧＰＱＧ／ＬＡＧ−（こ
こで、コラゲナーゼが垂直バーで分解する）と続く）に
おいて存在しないが、しかしコラーゲンがコラゲナーゼ
により分解される場合に生じる。
【００２５】その配列に対するポリクローナル抗体はこ
れまで報告されている（２１）。モノクローナル抗体９
Ａ４及びそれからの遺伝子操作された誘導体は、配列番
号２として配列表に示されるネオエピトープ配列と反応
するが、しかし切断されていないタイプIIコラーゲン又
はタイプＩコラーゲンとは反応しない。そのネオエピト
ープ配列は、コラゲナーゼにより切断される場合、タイ
プIIコラーゲンに対してユニークであるが、相同及び弱
い交差反応性の配列（配列表に示されるような配列番号
１６）は、コラゲナーゼにより切断される場合、タイプ
Ｉコラーゲンにおいて生成される。
【００２６】これはまた、タイプIII コラーゲンのため
にも真実であり；それは、コラゲナーゼにより切断され
る場合、配列番号２として配列表に示される弱い交差反
応性の配列を生成する。従って、ネオエピトープ抗体は
タイプIIコラーゲンに対する十分な特異性を欠いてお
り、そして単独で使用される場合、コラゲナーゼによる
タイプIIコラーゲンの切断を選択的に検出できない。し
かしながら、抗体５１０９及び抗体９Ａ４がサンドイッ
チアッセイにおいて組合される場合、それらの２種の抗
体は、コラゲナーゼにより生成されるタイプIIコラーゲ
ン代謝物を選択的に検出することができる。
【００２７】さらに、このサンドイッチタイプのアッセ
イがこの発明において提供する利点は、９Ａ４のみに基
づく単純な競争アッセイよりも１００〜１０００倍の感
度の増強が現在、達成され得ることである。従って、本
発明に記載される抗体を有するサンドイッチアッセイ型
式は、これまで記載されたことがない、正常状態及び病
的状態でのコラゲナーゼによるタイプIIコラーゲン代謝
をモニターするためのユニークな方法を提供する。コラ
ーゲンタイプを区別する必要がない限り、抗体９Ａ４
は、単独で、タイプＩ又はタイプIIもしくはタイプIII
コラーゲンのコラゲナーゼ切断されたフラグメントの検
出のために使用される新規モノクローナル抗体である。
【００２８】定義 免疫グロブリン （Ｉｇ）：アミノ酸配列及びグルコシル
化の程度に依存して、約２３KDの２つのＬ鎖及び約５３
〜７０KDの２つのＨ鎖から構成される天然の四量体タン
パク質。その四量体タンパク質の多量体もまた形成され
る（ＩｇＭ及びＩｇＡ）。２種類のＬ鎖、すなわちカッ
パ（κ）及びラムダ（λ）鎖、並びにいくつかの種類の
Ｈ鎖、すなわちガンマ（γ）、ミュ（μ）、アルファ
（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）鎖が存在す
る。
【００２９】またそれらのサブクラスも存在する。個々
の鎖は、Ｌ鎖又はＨ鎖のいづれであろうと、２つの部分
から構成されている。いづれかの鎖のＮ−末端から開始
する第１の部分は、可変ドメインと呼ばれる。Ｌ鎖のＣ
−末端半分はＬ鎖の不変領域と呼ばれ、そしてそれはＬ
鎖がκ又はλ型のいづれかである主要決定因子である。
Ｈ鎖の不変領域は、Ｃ−末端のＨ鎖のほぼ３／４を含ん
で成り、そして免疫グロブリン分子（ＩｇＧ1 ，Ｉｇ
Ｍ、等）の種類を決定し、すなわちχＨ鎖はＩｇＧに対
応し、そしてμＨ鎖はＩｇＭに対応する。
【００３０】ＶL 及びＶH ：Ｌ鎖の可変ドメイン
（ＶL ）及びＨ鎖の可変ドメイン（ＶH ）のアミノ酸配
列は一緒になって、免疫グロブリン分子の結合特異性及
び結合（KD）定数を決定する。その可変ドメインは、Ｌ
鎖の長さのほぼ半分及びＨ鎖の長さのほぼ１／４を含ん
で成り、そして両鎖に関しては、鎖のＮ−末端で開始す
る。可変領域は、相補的決定領域又はＣＤＲとして知ら
れている３種の超可変セグメントをそれぞれ含む。
【００３１】ＣＤＲ及びＦＲ：個々の可変ドメイン、Ｖ
L 又はＶH は次の３種のＣＤＲから構成される：ＣＤＲ
１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３。ＣＤＲの前、それらの間、
又はそれらの後の介在配列セグメントは、フレームワー
クセグメント（ＦＲ）として知られている。個々のＶL
及びＶH は、次の４種のＦＲセグメントから構成され
る：ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４。
【００３２】Ｖκ及びＶλ：ＶL ドメインは、その不変
領域（Ｃκ又はＣλ）がＬ鎖の生産性転位（productive
rearrangement）の間に使用されることに依存して、κ
又はλのいづれかである（ＶＪＣκ又はＶＪＣλ）。抗体 ：抗体は、タンパク質、糖タンパク質、ウィルス細
胞、キャリヤーに結合される化学物質及び他の物質によ
るチャレンジに応答して免疫系のＢ−細胞により生産さ
れる特定の免疫グロブリン分子である。抗体は、単純に
は、その結合パートナーが知られている免疫グロブリン
分子である。抗体が結合する物質は抗原と呼ばれる。そ
のような抗体のその抗原への結合は高度区別され、そし
てＨ及びＬ鎖の可変ドメインにおけるアミノ酸配列の変
化により生成され得る多数の特異性に注目すべきであ
る。
【００３３】ポリクローナル抗体：通常の免疫化は、同
じ抗原に対する広範囲の種類の抗体を導く。個々のＢリ
ンパ球は通常、一定のアミノ酸配列の１つの免疫グロブ
リン分子を生成するが、免疫応答において、多くのＢリ
ンパ球は、抗原と反応する免疫グロブリン分子、すなわ
ち抗体を生産するよう刺激される。それらの異なった抗
体は、結合の精巧な特異性及び親和性において差異をも
たらす、免疫グロブリンの可変領域における異なったア
ミノ酸配列により特徴づけられる。そのような抗体は、
免疫応答に利用される異なった免疫グロブリン分子に見
出される種々のアミノ酸配列から生じる種々の結合特異
性及び結合定数を強調するためにポリクローナル抗体と
呼ばれる。
【００３４】モノクローナル抗体（ＭＡｂ）：単一の抗
体分子を生成するＢリンパ球は、抗体産生不滅細胞系、
すなわちハイブリドーマを誘導するために、不滅Ｂリン
パ球細胞系、すなわち骨髄腫とハイブリダイズされ得
る。そのような形成されたハイブリッドは、選択、希
釈、サブクローニング及び再増殖により単一の遺伝子株
に分離され、そして従って、個々の株は単一の遺伝子系
を表わす。それは、特異な配列の単一の抗体を生成す
る。そのような細胞系により生成される抗体は、その純
粋な遺伝子血統を表わし、そして混合された遺伝子バッ
クグラウド、すなわち複数のＢ細胞から生成されるポリ
クローナル抗体からそれを区別する“モノクローナル抗
体”又はＭＡｂと呼ばれる。ＭＡｂは純粋な化学試薬で
あるので、それは免疫試験において一定の均等な結果を
提供する。さらに、ＭＡｂは不滅細胞系により生成され
るので、試薬供給は制限的でない。それらの理由のため
に、ＭＡｂは、診断目的のためにポリクローナル抗体よ
りも、より好ましい。
【００３５】遺伝子操作された抗体：抗体の結合特異性
はＬ及びＨ鎖の可変領域がもたらすので、抗体は不変領
域を変更し、又は除去するために遺伝子操作され得、そ
して正しく行なわれる場合、それは異なった性質及び分
子量を有するが、しかし同じか又は非常に類似する抗原
結合特性も有する抗体分子をもたらすことができる。た
とえば、ＶL 及びＶH 遺伝子は、クローン化され得、そ
してそれらの間の適切なリンカーを用いてアセンブルさ
れ得る（又はＶH 及びＶL ）。そのような新しい遺伝子
操作された分子は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖとして略され
る）と呼ばれ、そして典型的には、精製、安定性、トラ
フィキング、検出、等において助けるためのリンカーの
設計及び他の配列の付加に依存して、２５〜２８KDの分
子量を有する。
【００３６】一本鎖抗体の多量体はまた、リンカーの適
切な使用により製造することができ、この場合には個々
のＶH ，ＶL 対の順序が変更できる。さらに、所望の抗
原結合特性を保持する、ＶL 及びＶH 領域のアミノ酸配
列のいくらかの変更が行なわれ得る。抗原に対する結合
特異性を保持し、且つ特定の必要要件を満たすよう調整
された無限の種類の遺伝子操作された抗体が元の抗体配
列から誘導され得る。遺伝子操作された抗体の他の例
は、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 、キメラ抗体、ヒト化抗
体、等を包含するが、但しそれらだけには限定されな
い。総説として、Winter G and Milstein C,“Man-made
Antibodies ”, Nature 1991 ; 349, 243-299を参照の
こと。
【００３７】二元特異的抗体：通常、ＩｇＧ抗体は、２
種の同一のＬ鎖及びＨ鎖を有する。従って、免疫グロブ
リン分子に２つの同一の抗体結合部位が存在する。これ
に対して、二元特異的抗体は、２つの特異性を有する単
一の免疫グロブリン分子である。それは、個々のハイブ
リドーマは異なった抗原特異性を有する２種のモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系の融合、及びその
組成が個々の融合パートナーからの１つのＬ鎖及び１つ
のＨ鎖から構成される四量体である抗体を生成する細胞
系（クアドローマ（quadroma））についての選択により
製造することができる。
【００３８】クアドローマにより生産される抗体は、個
々の親特異的な１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖のみを有し、
そして個々のＨ／Ｌ鎖対のための１つの結合部位を有
し、そして二元特異性であり、すなわちそれは異なった
特異性の２種の結合部位を有する。二元特異的抗体はま
た、遺伝子構築によっても製造され得る。それは１つの
抗体分子のＶL −リンカー−ＶH に追加のリンカーを通
して連結されるもう１つの抗体のＶL −リンカー−ＶH
を含むことができる。ＶL 及びＶH の順序は変更され得
るが、しかし最終結果は二元特異的抗体である。
【００３９】エピトープ：抗原の大きさ、構造及びコン
ホメーションに依存して、抗体は完全な構造体の小さな
部分にのみ結合することができる。抗体が結合する抗原
分子の部分がそのエピトープと呼ばれる。異なる抗体
は、同じ抗原上の異なるエピトープに位置づけられ得
る。
【００４０】ネオエピトープ：抗原は、特定の抗体に結
合できないよう隠されているエピトープを有することが
ある。しかしながら、抗原におけるコンホメーション変
化は、その分子の表面の部分の折たたみをほぐすか又は
被覆を除去することによりエピトープの出現を引き起こ
すことができる。これは今や、エピトープへの抗体の結
合を可能にする。もう１つの観点においては、抗原に対
する酵素の作用は、抗体が結合できる新しいエピトープ
の出現を引き起こすことができる。たとえば、タンパク
質分解酵素による切断の後、新しいＮ−末端及び新しい
Ｃ−末端配列が生成される。そのエピトープは親分子に
は観察されないので、そして親分子におけるいくつかの
変化の後、エピトープが現わされ、そして今や、抗体を
結合できるので、それはネオエピトープと呼ばれる。
【００４１】生物学的媒体：これは、抗原を含み、そし
てこの方法によりアッセイするために注目されるいづれ
かの生物学的流体として定義され得る。これは、血液、
滑液、尿、脊髄液、細気管支洗浄液、リンパ、膿の硝子
体液、組織の抽出物、組織培養上清液、軟骨の抽出物、
等を包含する。生物学的媒体はヒトサンプルに限定され
る必要はなく、また、上記例に類似する態様で類似する
種類の動物媒体（マウス、ラット、ハムスター、テンジ
クネズミ、イヌ及びウシが試験されて来た）から得られ
る。
【００４２】イムノアッセイ：特定の分子又は１組の相
同分子であり得る物質を認識するために抗体の結合特性
の使用に基づく物質（複雑な生物学的物質、たとえばタ
ンパク質、又は単純な化学物質）についてのアッセイ。
このアッセイは、１又は複数の抗体を包含できる。直接的なアッセイ ：抗体が、生物学的検体（細胞、組
織、組織断片、等）中の抗原に対して、あるいは固体表
面に吸着されているか又は化学的に結合されている抗原
に対して直接的に結合する。抗体自体は通常、抗原に対
して結合される抗体の量の決定を可能にするためにラベ
ルされる。あるいは、抗体（ここで、一次抗体と称す
る）は、その一次抗体の結合が生じたことを示すであろ
うラベルされた二次抗体により検出される。
【００４３】競争アッセイ：単一の抗体分子の結合特性
に基づくアッセイ。典型的には、ラベルされた抗原が、
未知の抗原と競争するために使用され、そして未知の抗
原の量が、ラベルされた抗原のいかに多くが未知の抗原
により置換されるかにより決定される。ラベルは、放射
性、光学的、酵素、螢光偏光、螢光消光性ラベル、又は
他のラベルであり得る。抗体は一元特異的又は二元特異
的であり得る。
【００４４】サンドイッチアッセイ：これは、両抗体が
抗原と結合する２種の抗体及びそれらの間の抗原を含む
三量体免疫複合体又はサンドイッチを形成する二重抗体
アッセイである。１つの抗体は、検出表面又はチャンバ
ーに免疫複合体を局在化するために使用される。この抗
体は捕捉抗体と称する。他の抗体は、免疫複合体の検出
を可能にするであろうラベルを担持する。それは検出抗
体と呼ばれる。免疫複合体が形成されない（抗原が存在
しない）場合、捕捉抗体は、検出抗体を検出器に運ぶこ
とができない。抗原が存在する場合、免疫複合体が形成
され、そして捕獲細胞が検出抗体と連結され、その結
果、免疫複合体における検出抗体の量が存在する抗原の
量に定量的に関連する。
【００４５】アッセイは、多くの手段により形式に従っ
て配列され得る。たとえば、捕捉抗体は、測定装置に免
疫複合体を局在化する手段として、固体表面に化学的に
結合され、又はビオチニル化を通してアビジン様分子、
たとえばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートロア
ビジン、磁気粒子又はビーズに結合されたストレプタビ
ジン又はアビジン−被覆の表面に、非特異的に吸着され
得る。検出抗体は放射性ラベルされ得、又はそれは、Ｅ
ＬＩＳＡ（酵素−結合免疫アッセイ）として配列される
場合、種々の可能な酵素的増幅系、たとえばホースラデ
ィシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＰ）、ウレアーゼ、等を有することができ
る。それは、免疫複合体における検出抗体の量を決定す
るために、電気化学、光学、螢光又は他の検出方法を有
することができる。
【００４６】検出装置における免疫複合体を捕獲するた
めの種々の方法、及び免疫複合体の量を測定するための
種々の検出システムを用いてのサンドイッチアッセイに
おいて、２種の抗体が一対にされる多くの例が誘導され
得ることが見出され得る。分子生物学的技法 ：ＶH 及びＶL −コード領域のヌクレ
オチド配列が今や、本発明の抗体のために提供されてい
るので、当業者は、ＶH 及びＶL 領域をコードする完全
な遺伝子及び完全に機能的な抗体をインビトロで生成す
ることができる。
【００４７】それは、付加されるＨ鎖及びＬ鎖の不変領
域を有するいづれか一定の種類の免疫グロブリン分子と
して生成され得、又はそれは、適切に付加された標識と
共にリンカーにより連結されたＶH 及びＶL を有するｓ
ｃＦｖとして生成され得る。構成された遺伝子は、発現
プラスミドに遺伝子挿入体を供給するために、従来の組
換え技法により構築され得る。その後、プラスミドが宿
主細胞中で発現され得、ここで宿主細胞は細菌、たとえ
ばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス（Bacillus）
種、酵母細胞、たとえばピチア パストリス（Pichia p
astoris)であり得、又は哺乳類細胞系、たとえばＳｐ２
／０，Ａｇ８又はＣＨＯ細胞において発現され得る。
【００４８】略語 核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基及び類似す
る成分は、短縮される場合、IUPACIUB（Commission on
Biological Nomenclature)又は関係する分野での実務に
従って短縮される。
【００４９】標準の略語 ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動 ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応 Ｏｌｉｇｏ：オリゴヌクレオチド ＲＴ：室温、約２２℃。
【００５０】試薬： ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム ＴＷ−２０：Ｔｗｅｅｎ−２０ ＮＦＤＭ：脱脂ドライミルク ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝溶液 Ｂｔ：ビオチニル化された ＨＡＴ：ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含
有培地 ＨＴ：ヒポキサンチン、チミジン含有培地 ＨＲＰ：ホースラディシュペルオキシダーゼ
【００５１】免疫グロブリン様分子又は鎖 ＶH ：Ｈ鎖の可変領域 ＶL ：Ｌ鎖の可変領域 ｓｃＦｖ：ＶL 及びＶH を含む一本鎖抗体 核酸 ＲＮＡ：リボ核酸 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ 核酸塩基
【００５２】
【表１】 アミノ酸−一文字コード：三文字コード：完全な名称
【００５３】
【表２】
【００５４】参考文献 1. Harris ED. Jr. Krane S. Collagenases, N Engl J
Med 1974; 291: 557-563, 606-609, 652-661. 2. Nagai Y, Lapiere CM, Gross J. Tadpole collagen
ase. Preparation andpurification. Biochemistry 196
6; 5: 3123-3130. 3. Sakai T, Gross J. Some properties of the produ
cts of reaction of tadpole collagenase with collag
en. Biochemistry 1987; 6: 518-528. 4. Pendas AM, Matilla T, Estivill X, Lopez-Otin
C. The human collagenase-3 (CLG3) gene is located
on chromosome 11q22.3 clustered to other members o
f the matrix metalloproteinase gene family. Genomi
cs 1995; 26: 615-8. 5. Mitchell PG, Magna HA, Reeves LM, Lopresti-Mor
row LL, Yocum SA, Rosner PJ, Geoghegan KF, Hambor
JE. Cloning. expression, and type II collagenolyti
c activlty of matrix metalloproteinase-13 from hum
an osteoarthritic cartilage. J Clin Invest 1996; 9
7: 761-8.
【００５５】6. Maciewicz RA, Wotton SF, Etheringt
on DJ, Duance VC. Susceptibilityof the cartilage c
ollagens type II, IX and XI to degradation by the
cysteine proteinases, cathepsins B and L. FEBS Let
t 1990; 269: 189-193. 7. van Noorden CJF, Everts V. Selective Inhibitio
n of cysteine proteinases by z-phe-alaCH2F suppres
ses digestion of collagen by fibrobiasts and osteo
clasts. Biochem Biophys Res Comm 1991; 178: 178-18
4. 8. Kivirikko, K. I. Urinary secretion of hydroxy-
Proline in health and disease. Int. Rev. Connect T
issue Res. 1970; 5, 93-163. 9. Timpl R. Antibodies to collagens and procollag
en. Methods Enzymol1982; 82: 472-498. 10. Eyre D. アメリカ特許第5,320,970 号。
【００５６】11. Holmdahl R. Andersson M, Tarkowsk
i A. Origin of the autoreactive anti-type II colla
gen response, I. Frequency of specific and multisp
ecific B-cells in primed murine lymph nodes. Immun
ology 1987; 61: 369-374. 12. Punjabi CJ. Wood DD. Wooley PH. A monoclonal
anti-type II collagenantibody with cross reactive
antl-lg activity specific for the F(ab')2fragment.
J Immunol 1988; 141: 3819-3822. 13. Jasin HE, Taurog JD. Mechanisms of disruption
of the articular cartilage surface in inflammatio
n. Neutrophil elastase increases avallability of c
ollagen II epitopes for binding with antibodies on
the surface ofarticular cartilage. J Clin Invest
1991; 87: 1531-1536. 14. Norlund LL. Shao P. Yoshihara P, Eyre DR. Mar
kers of bone type I and cartilage type II collagen
degradation in the Hartley guinea pig model of os
teoarthritis. Trans Orthoped Res Assoo 1987; 22: 3
13.
【００５７】15. Dodge GR, Poole AR. Immunohistoch
emical detection and immunochemical analysis of ty
pe II collagen degredation in human normal, rheuma
toidand osteoarthritic articular cartilages and in
explants of bovine articular cartilage cultured w
ith interleukin-1, J Clin Invest 1989; 83: 647-66
1. 16. Dodge GR, Pidoux I, Poole AR. The degradation
of type II collagenin rheumatoid arthritis: an im
munoelectron microscopic study. Matrix 1991; 11: 3
30-338. 17. Poole AR. WO94/14070.
【００５８】18. Hollander AP, Heathfield TF, Webb
er C, Iwata Y, Bourne R, RorabeckC, Poole AR. Incr
eased damage to type II collagen in osteoarthritic
articular cartilage detected by a new immunoassa
y. J Clin invest 1994; 93:1722-32. 19. Hollander AP, Pldoux I, Reiner A, Rorabeck C,
Bourne R, Poole AR.Damage to type II collagen in
aging and osteoarthritis starts at the articular s
urface, originates around chondrocytes, and extend
s into the cartilage with progressive degeneratio
n. J Clin Invest 1995; 96: 2859-69. 20. Billinghurst RC, Dahlberg L, lonescu M, Reine
r A, Bourne R, Rorabeck C, Mitchell P. Hambor J, D
iekmann O, Tsechesche H, Chen J, van Wart H. Poole
AR, Enhanced cleavage of type II collagen by coll
agenases in osteoarthritic articular cartilage. J
Clin Invest 1997; 99: 1534-1545.
【００５９】21. Srinivas GR, Barrach HJ, Chichest
er CO. Quantitative immunoassaysfor type II collag
en and its cyanogen bromide peptides. J Immunol Me
th 1993; 159: 53-62. 22. Srinivas GR, Chichester CO, Barrach HJ, Maton
ey AL. Effects of certain antiarthritic agents on
the synthesis of type II collagen and glycosaminog
lycans in rat chondrosarcoma cultures. Agents Acti
ons 1994; 41: 193-199.
【００６０】23. Srinivas GR, Chichester CO, Barra
ch HJ, Pillai V, Metoney AL. Production of type II
collagen specific monoclonal antibodies. Immunol
Invest 1994; 23: 85-98. 24. Chichester CO, Barrach HJ, Srinivas GR, Mitch
ell P. Immunologicaldetection of type II collagen
degradation: use in the evaluation of anti-arthrit
ic therapies. Pharm Pharmaool 1996; 48: 694-698.
【００６１】
【実施例】例１．モノクローナル抗体９Ａ４の製造及び
特性決定 Balb/cマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, M
E）を、まず、ＫＬＨマレイミド（Pierce Chemical, Ro
ckford, IL)に共有結合され、そして、配列番号１７と
して配列表に示される配列を有するペプチド（Anaspec,
San Jose, CA)により完全フロイトアジュバント（DIFC
O Detroit, MI)と共に免疫化した。力価が１：１００，
０００になるまで、マウスを、不完全フロイトアジュバ
ント（DIFCO, Detroit, MI）を用いて約５カ月間、毎月
追加免疫した。
【００６２】マウスを、融合の１０日前、ｉ．ｖ．追加
免疫した。脾臓細胞を集め、そして５０％のＰＥＧ−１
４５０（ＡＴＣＣ）を用いて、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションＡ
ＴＣＣ，Bethesda, ＭＤ）に由来する非−Ｉｇ分泌細胞
系により融合した。それらを、１５％ウシ胎児血清（Hy
clone, Provo, Utah）を有するＨＡＴ培地（Sigma, St.
Louis, MO）を含む９６ウェルマイクロタイタープレー
トに１０6 個の細胞／ウェルでプレートした。１０日
後、ウェルをＥＬＩＳＡによりスクリーンした。
【００６３】陽性の抗体産生ウェルの同定のために、１
０ng／mlのビオチニル化されたペプチド（Ｂｔ−ＡＥＧ
ＰＰＧＰＱＧ）を、ストレプトアビジン（１０μｇ／m
l）被覆されたプレート（Pierce Chemical)に添加し、
そして個々のハイブリドーマ上清液２μｌを、０．０５
％のＴＷ−２０（Sigma)を含むＤＰＢＳ（Gibco, Grand
Island, NY)１００μｌに添加した。Ｅｌｉｓａ陽性ウ
ェルを、ウサギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson Im
muno Research, West Grone, PA)により検出した。
【００６４】ＥＬＩＳＡにおける陽性ウェルを、BIAcor
e 上での２回目の選択にゆだねた。BIAevaluation バー
ジョン２．１ソフトウェア（Pharmacia Biosensor, Pis
cataway, NJ)を用いて決定されるようなBIAcore 上での
遅いオフ−速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する抗体を生
成するウェルを捜した。１００μｇ／mlでのストレプト
アビジン（Pierce Chemical)を、Pharmacia Amine Coup
ling Kit（PharmaciaBiosenson)を用いて、カルボキシ
ル化されたデキストラン−被覆されたバイオセンサーチ
ップ（Pharmacia Biosensor)に、pH４．０で、５μｌ／
分の流速で３５分間、接合した。典型的には、２０００
ＲＵを添加した。
【００６５】配列表に示されるような配列番号１４の１
の残基上でビオチニル化されたペプチド（１００ng／m
l）を、１００μｌ／分の流速で１０秒間、ストレプト
アビジンチップ上に通した。抗体を含む候補体上清液
を、前記チップ上に通し（２μｌ／分で３０秒間）、そ
して添加された抗体の量に注目した。緩衝液をＨＢＳ
（Pharmacia Biosensor)に代え、そして解離速度を次の
８０秒間、注目した。
【００６６】チップを０．１ＮのＨＣｌにより、個々の
実験の間、３０秒間、清浄し、残留抗体を除去し、そし
ていづれかの非特異的結合を清浄した。そのオフ−速度
を、BIAevaluation 動力学分析ソフトウェアバージョン
２．１を用いて決定した。最も遅いオフ−速度を有する
クローンを、さらなる分析のために選択した。それらの
クローンは、９Ａ４，１１Ｆ２及び３Ｈ１０を含んでい
た。
【００６７】それらのクローンのさらなる特性決定を次
の通りに実施した：タイプＩコラーゲン、コラゲナーゼ
により切断されたタイプＩコラーゲン、タイプIIコラー
ゲン、及びコラゲナーゼにより切断されたタイプIIコラ
ーゲンから成る４種の調製物を、ＢＩＡ２０００装置上
で別々の流動細胞にそれぞれカップリングした。それら
を、Pharmacia Amine Coupling Kit (Pharmacia Biosen
sor)を用いて、カルボキシル化されたデキストラン被覆
されたバイオセンサーチップ（Pharmacia Biosensor)
に、pH４．０で、５μｌ／分の流速で３５分間、接合し
た。前記４種の流動細胞を、それぞれ８０００，７００
０，４０００及び４０００ＲＵに添加した。
【００６８】細胞を０．１ＮのＨＣｌにより洗浄し、実
験の間、いづれかのカップリングされなかった材料を清
浄し、そしていづれかの残留抗体を清浄した。すべての
抗体調製物を、Protein Ｇクロマトグラフィー（Pharma
cia Biotechnology, Piscataway, NJ)により精製し、そ
して１０μｇ／mlで実施した。４種の表面の個々に対す
る合計の結合を記録した。コラゲナーゼ切断されたタイ
プIIコラーゲンに対する選択的結合を示し（タイプＩ＝
１１ＲＵ；タイプII＝２８０ＲＵ）、そして切断されて
いないコラーゲンに対する有意な結合を欠いている（タ
イプＩ＝３ＲＵ；タイプII＝６ＲＵ）ので、抗体９Ａ４
を選択した。
【００６９】５％ウシ胎児血清（Hyclone)を有するＨＴ
培地（Sigma)においての制限希釈による３回のサブクロ
ーニングの後、安定した９Ａ４モノクローナルハイブリ
ドーマを得た。それを、ＡＴＣＣ−ＨＢ−１２４３６と
してアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに
寄託した。
【００７０】例２．モノクローナル抗体５１０９の製造
及び特性決定 Balb/cマウスを、まず、ＫＬＨマレイミド（Pierce Che
mical, Rockford, IL)に共有結合され、そして配列番号
１８として配列表に示される配列を有するペプチド（An
aspec, San Jose, CA)により、完全フロイトアジュバン
ト（DIFCO Detroit, MI)と共に免疫化した。力価が１：
１００，０００になるまで、マウスを、不完全フロイト
アジュバント（DIFCO, Detroit, MI）を用いて約５カ月
間、毎月追加免疫した。マウスを、融合の１０日前、
ｉ．ｖ．追加免疫した。
【００７１】脾臓細胞を集め、そして５０％のＰＥＧ−
１４５０（ＡＴＣＣ）を用いて、P3X63Ag8.653細胞に由
来する非−Ｉｇ分泌細胞系により融合した。それらを、
１５％ウシ胎児血清（Hycione, Provo, Utah）を有する
ＨＡＴ培地（Sigma, St. Louis, MO）を含む９６ウェル
マイクロタイタープレートに１０6 個の細胞／ウェルで
プレートした。１０日後、ウェルをＥｌｉｓａによりス
クリーンした。
【００７２】陽性の抗体産生ウェルの同定のために、１
０ng／mlのビオチニル化されたペプチド（配列表に示さ
れるような配列番号１９の残基１上でビオチニル化され
ている）を、ストレプトアビジン（１０μｇ／ml）被覆
されたプレート（Pierce Chemical)に添加し、そして個
々のハイブリドーマ上清液２μｌを、０．０５％のＴＷ
−２０（Sigma)を含むＤＰＢＳ（Gibco, Grand Island,
NY)１００μｌに添加した。ＥＬＩＳＡ陽性ウェルを、
ウサギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson Immuno Res
earch, West Grone, PA)により検出した。
【００７３】陽性ウェルを、BIAcore 上で最も遅いオフ
−速度を付与する抗体を有したウェルについて、BIAcor
e 上での２回目の選択にゆだねた。１００μｇ／mlでの
ストレプトアビジン（Pierce Chemical)を、Pharmacia
Amine Coupling Kit（Pharmacia Biosensor)を用いて、
カルボキシル化されたデキストラン−被覆されたバイオ
センサーチップ（Pharmacia Biosensor)に、pH４．０
で、５μｌ／分の流速で３５分間、接合した。典型的に
は、２０００ＲＵを添加した。配列表に示されるような
配列番号１９の残基１上でビオチニル化されたペプチド
（１００ng／ml）を、１００μｌ／分の流速で１０秒
間、ストレプトアビジンチップ上に通した。
【００７４】抗体を含む上清液を、前記チップ上に通し
（２μｌ／分で３０秒間）、そして添加された抗体の量
に注目した。緩衝液をＨＢＳ（Pharmacia Biosensor)に
変え、そして解離速度を次の８０秒間、注目した。チッ
プを０．１ＮのＨＣｌにより、個々の実験の間、３０秒
間、洗浄して残留抗体を除去し、そしていづれかの非特
異的結合を洗浄除去した。そのオフ−レートを、BIAeva
luation ソフトウェアバージョン２．１を用いて決定し
た。遅いオフ−レートを有するクローンを捜した。ＭＡ
ｂ５１０９をさらなる分析のために選択した。
【００７５】タイプＩコラーゲン、コラゲナーゼにより
切断されたタイプＩコラーゲン、タイプIIコラーゲン、
及びコラゲナーゼにより切断されたタイプIIコラーゲン
から成る４種の調製物を、４つのチャネルのBIAcore の
単一のチャネルにそれぞれカップリングした。それら
を、Pharmacia Amine Coupling Kit（Pharmacia Biosen
sor)を用いて、カルボキシル化デキストランで被覆され
たバイオセンサーチップ（Pharmacia Biosensor)に、pH
４．０で、５μｌ／分の流速で３５分間、接合した。前
記４種のフローセルに、それぞれ８０００，７０００，
４０００及び４０００ＲＵを添加した。セルを０．１Ｎ
のＨＣｌにより洗浄して、すべてのカップリングされな
かった材料を除去し、そして実験の間のすべての特異的
材料を除去した。
【００７６】すべての抗体調製物を、Protein G クロマ
トグラフィー（Pharmacia Biotechnology, Piscataway,
NJ)により精製し、そして１０μｇ／mlで実施した。４
種の表面の個々に対する合計の結合を記録した。コラゲ
ナーゼ切断されたコラーゲンに対する選択的結合を示す
が（切断されたタイプＩ＝２３ＲＵ；切断されたタイプ
II＝１７３ＲＵ）、しかし切断されていないコラーゲン
に対する有意な結合を欠いている（タイプＩ＝２３Ｒ
Ｕ；タイプII＝１５ＲＵ）ので、抗体５１０９を選択し
た。５％ウシ胎児血清（Hyclone)を有するＨＴ培地（Ｓ
ｉｇｍａ）での制限希釈による９回のサブクローニング
の後、安定した５１０９モノクローナルハイブリドーマ
を得た。それを、ＡＴＣＣ−ＨＢ−１２４３５としてア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに寄託し
た。
【００７７】例３．捕捉抗体として９Ａ４及び検出抗体
としてモノクローナル５１０９を用いてのサンドイッチ
アッセイの説明 モノクローナル抗体９Ａ４（捕捉抗体）を、０．０５Ｍ
の硼酸ナトリウム緩衝液（pH８．５）中１０μｇ／mlの
９Ａ４を有するNunc Maxisorp (VWR, Boston MA)９６−
ウェルプレートに、１００μｌ／ウェルで添加し（但
し、対照ウェル４．５及び６については、表１を参照の
こと）、そして４℃で１８〜４８時間インキュベートし
た。
【００７８】プレートを、０．０５％のＴＷ−２０（Si
gma)を含むＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ／ＴＷ−２０）により３
度洗浄し；２００μｌ／ウェルを用いた。プレート中の
ウェルを、新しく調製された１００μｌ／ウェルの、Ｄ
ＰＢＳ（ＮＦＤＭ ＤＰＢＳ）に溶解された１％脱脂ド
ライミルク（ＮＦＤＭ）により、ＲＴで１時間インキュ
ベートしてブロックした。使用の日の間、氷上に維持し
た。そのブロック溶液を捨て、ウェルを２００μｌのＤ
ＰＢＳ／ＴＷ−２０により１度すすいだ。
【００７９】ペプチド１３０を、表３に示される濃度に
０．１％のＮＦＤＭ ＤＰＢＳにより希釈した。ペプチ
ド１３０は、配列番号２０として配列表に示される配列
を有し、そしてAnaspec Inc.（San Jose, CA）により合
成され、そして精製された。ペプチド１３０（配列番号
２０）の希釈溶液、適切な希釈度での検体、及び対照
を、表３に示されるようにマイクロタイタープレートの
特定のウェル中に配置した。
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】ウェルを２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ
ＴＷ−２０により３度洗浄した。ビオチン−接合されＭ
Ａｂ５１０９（Ｂｔ−５１０９）を、すべてのペプチド
１３０（配列番号２０）含有ウェル、すべてのサンプル
ウェル、及びすべての対照ウェル（１，２及び５を除
く）に添加した。０．１％ＮＦＤＭ ＤＰＢＳ中、１μ
ｇ／mlでの５１０９−Ｂｔ（１００μｌ／ウェル）を個
々のウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で４０分
間インキュベートした。
【００８３】注：ＭＡｂ５１０９を、１mgのＭＡｂ５１
０９当たり３７μｇのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンアミド（Pierce Chemical)を用いて２時間ビオチニル
化し、そして次に、１０KDのカット−オフ透析用カセッ
ト（Pierce Chemical)を用いて一晩、透析した。ウェル
を２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ ＴＷ−２０により３
度洗浄した。ＨＲＰ（Jackson Immuno Research)接合マ
ウスモノクローナル抗−ビオチン抗体を、０．１％のＮ
ＦＤＭ ＤＰＢＳ中に１／５０００に希釈し、そして１
００μｌ／ウェルをすべてのウェルに添加し、そしてＲ
Ｔで３０分間インキュベートした。
【００８４】ウェルを、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ
ＴＷ−２０により３度洗浄した。１００μｌ／ウェル
の１段階Turbo （３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジンを使用できる；Pierce Chemical)を個々のウェ
ルに添加し、そしてＲＴで約１０分間インキュベートし
た。色の進行を２ＮのＨ2 ＳＯ4 により停止した。結果
を、４５０nmで分光光度計上で読み取った。
【００８５】
【表５】
【００８６】ペプチド１３０の濃度及び４５０nmでの得
られる光学密度読み取り（表５）から、標準曲線を構成
した（図１）。他の適切なペプチド又はコラーゲンフラ
グメントを置換し、図１に類似する標準曲線を調製する
ことができる。単位は、標準のモル等量により表わされ
た。この場合、単位は、ペプチド１３０（配列番号２
０）のnM当量であった。
【００８７】曲線の直線部分にわたって、回帰線を用い
て、データを適合せしめた。この場合、標準曲線は、濃
度が対数尺度（例におけるように、図１）で与えられる
場合、０．７３５nMと０．４６nMとの間で直線的であ
り、そして回帰曲線を、その曲線の直線部分を用いて得
た。その直線部分の外側に存在するサンプルに関して、
濃度をグラフから読み取り、又はサンプルを曲線の標準
部分内に入るよう希釈することができ、又はそれらは検
出の限界以下に存在する。
【００８８】対数（nM）とＯＤ４５０との間の回帰線
は、０．０２９ＯＤ４５０／対数（nM）の傾斜及び０．
０２４ＯＤ４５０の切片を与える。未知のサンプルを実
験する場合、検量線が、サンプルの光学密度からコラゲ
ナーゼ−生成されたタイプIIフラグメントの濃度を決定
するために使用され得る。次の等式が使用され得る： 対数（濃度）＝（サンプルＯＤ４５０−切片）／傾斜
【００８９】サンプル：この場合、滑液の未知サンプル
が、０．２２９のＯＤ４５０を有した。従って、 対数（濃度）＝（サンプルＯＤ４５０−０．０２４）／
０．０２９＝−０．９４９である。真数を取る場合、滑
液におけるフラグメントの濃度は、０．１１２nMであ
る。
【００９０】例４．捕捉抗体としてモノクローナル抗体
５１０９及び検出抗体として９Ａ４を用いてのサンドイ
ッチアッセイの説明 モノクローナル抗体５１０９（捕捉抗体）を、０．０５
Ｍの硼酸ナトリウム緩衝液（pH８．５）中１０μｇ／ml
の５１０９を有するNunc Maxisorp (VWR, Boston, MA）
９６−ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加し
（但し、対照ウェル４，５及び６については、表６を参
照のこと）、そして４℃で１８〜４８時間インキュベー
トした。
【００９１】プレートを、２００μｌ／ウェルのＤＰＢ
Ｓ ＴＷ−２０により３度洗浄した。プレート中のウェ
ルを、１００μｌ／ウェルの新しく調製されたＤＰＢＳ
に溶解された１％（ＮＦＤＭ）により、ＲＴで１時間イ
ンキュベートしてブロックした。そのブロック溶液を捨
て、そしてウェルを２００μｌのＤＰＢＳ／ＴＷ−２０
により１度すすいだ。
【００９２】ペプチド１３０（配列番号２０）を、０．
１％のＮＦＤＭ ＤＰＢＳにより表６に示される濃度に
希釈した。ペプチド１３０は、配列番号２０として配列
表に示される配列を有し、そしてAnaspec Inc.（Sun Jo
se, CA）により合成され、そして精製されたものであ
る。ペプチド１３０（配列番号２０）の希釈溶液、適切
な希釈度での未知の検体、及び対照を、表６に示される
ようにマイクロタイタープレートの特定のウェル中に配
置した。
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】ウェルを２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ
ＴＷ−２０により３度洗浄した。ビオチン−接合された
ＭＡｂ９Ａ４（Ｂｔ−９Ａ４）を、すべてのペプチド１
３０（配列番号２０）含有ウェル、すべてのサンプルウ
ェル、及びすべての対照ウェル（１，２及び５を除く）
に添加した。０．１％ＮＦＤＭ ＤＰＢＳ中、１μｇ／
mlの９Ａ４−Ｂｔ（１００μｌ／ウェル）を個々のウェ
ルに添加し、そしてプレートを３７℃で４０分間インキ
ュベートした。
【００９６】注：９Ａ４を、１mgのＭＡｂ９Ａ４当たり
３７μｇのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド
（Pierce Chemical)を用いて２時間ビオチニル化し、そ
して次に、１０KDのカット−オフ透析用カセット（Pier
ce Chemical)を用いて一晩、透析した。ウェルを２００
μｌ／ウェルのＤＰＢＳ ＴＷ−２０により３度洗浄し
た。ＨＲＰ（Jackson Immuno Research)接合マウスモノ
クローナル抗−ビオチン抗体を、０．１％のＮＦＤＭ
ＤＰＢＳにより１／５０００に希釈し、そしてその１０
０μｌ／ウェルをすべてのウェルに添加し、そしてＲＴ
で３０分間インキュベートした。
【００９７】ウェルを、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ
ＴＷ−２０により３度洗浄した。１００μｌ／ウェル
の１段階Turbo （３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジンを使用できる；Pierce Chemical)を個々のウェ
ルに添加し、そしてＲＴで約１０分間インキュベートし
た。発色を２ＮのＨ2 ＳＯ4 により停止した。結果を、
４５０nmで分光光度計上で読み取った。
【００９８】
【表８】
【００９９】ペプチド１３０（配列番号２０）の濃度及
び４５０nmでの得られる光学密度読み取りから、標準曲
線を構成した。再び、他の適切なペプチド又はコラーゲ
ンフラグメントを用いて、標準曲線を調製することがで
きる。必要とされる単位は、標準のモル等量により表わ
された。この場合、単位は、ペプチド１３０（配列番号
２０）のnM当量であった。
【０１００】曲線の直線部分にわたって、回帰線を用い
て、データを適合せしめた。この場合、標準曲線は、濃
度が対数尺度（図におけるように）で与えられる場合、
０．３１２５nMと０．０１９５nMとの間で直線であり、
そして回帰曲線を、その曲線の直線部分を用いて得た。
その直線部分の外側に存在するサンプルについては、濃
度をグラフから読み取り、又はサンプルを曲線の標準部
分内に入るよう希釈することができ、又はサンプルにお
けるコラーゲンフラグメントの濃度は検出限界以下であ
り得る。対数（nM）とＯＤ４５０nmとの間の回帰線は、
０．４２ＯＤ４５０／対数（nM）の傾斜及び０．７０Ｏ
Ｄ４５０nmの切片を与える。サンプルを実験する場合、
検量線が、サンプルの光学密度からコラーゲンフラグメ
ントの濃度を決定するために使用され得る。
【０１０１】サンプル：この場合、関節炎患者からのヒ
ト尿の未知サンプルが、０．１２４のＯＤ４５０を有し
た。従って、 対数（濃度）＝（サンプルＯＤ４５０−０．７０）／
０．４２＝−１．３６である。真数を取る場合、尿中の
フラグメントの濃度は、０．４４nMである。もう１つの
場合、標準曲線は０．２４９の傾斜及び０．６３８の切
片を与えた。ヒト変形性関節症血漿の未知のサンプル
は、０．１７２のＯＤ４５０nMを有した。変形性関節症
血漿のサンプルは、６８ｐＭの濃度を有した。
【０１０２】例５．抗体５１０９は、競争アッセイにお
いてタイプIIコラーゲンフラグメントの量を測定するた
めに直接的に使用され得る 濃度分析の適応において（BIAapplications Handbook,
Pharmacia Biosensor,June, 1994 Edition, p.6-2〜6-
9), 100 μｇ／mlでのストレプトアビジン（Pierce Che
mical, Rockford, IL)を、カルボキシル化されたデキス
トラン被覆されたバイオセンサーチップ（Pharmacia Bi
osensor)に、pH４．０で、５μｌ／分の流速で３５分
間、Pharmacia Amine Coupling Kit（Pharmacia Biosen
sor)を用いて接合した。
【０１０３】典型的には、２０００ＲＵを添加した。配
列番号１９として配列表に示される配列を有するビオチ
ニル化されたペプチド（１００ng／ml）を、ストレプト
アビジンチップ上に、５μｌ／分の流速で２分間通し；
１４４ＲＵのペプチドをそのストレプトアビジン表面に
添加した。６．３μｇ／mlの濃度でのＭＡｂ５１０９
を、単独で、又は標準濃度のペプチド０５４（配列番号
１９）と組合せて、又は５１０９及び未知の量のコラー
ゲンフラグメントを有するサンプルの希釈溶液の混合物
を、１０μｌ／分の流速で１分間、ペプチド表面上に通
した。
【０１０４】個々の曲線についての会合相の直線部分の
傾斜を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン２．１
ソフトウェアにより分析した。傾斜に対する競争ペプチ
ド０５４（配列番号１９）の標準曲線を構成した。サン
プルにおけるコラーゲンエピトープの量を、エピトープ
の量を計算するために標準曲線の傾斜に対するサンプル
の傾斜の比較により決定した。個々の注入間で、チップ
は、０．１ＮのＨＣｌにより３０秒間、洗浄され、抗体
が除去された。
【０１０５】
【表９】 回帰線の傾斜＝−２６．３６ ｙ−切片＝−１７６
【０１０６】サンプル：ウシ鼻軟骨のコラゲナーゼ−３
ＭＭＰ１３消化物の上清液。２倍、４倍及び８倍希釈さ
れたサンプルを、BIAcore チップ上に通した。０５４
（配列番号１９）ペプチドに関するコラーゲンの計算さ
れた量を決定した。その結果は、表１０の第４列に与え
られる。力価により掛け算した後、コラーゲンのモル濃
度（Ｍ）を、ペプチド０５４（配列番号１９）標準によ
り決定することができる。
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】希釈度についての訂正の後、結果（最後の
列）の一致が、未知のサンプルの３種の別々の希釈度か
ら計算された値（最後の列のすぐ前）の一致により示さ
れる。７５nMのタイプ４コラーゲンフラグメントの平均
値が、ウシ鼻軟骨上清液に関して得られる。
【０１０９】例６．９Ａ４に関連する遺伝子操作された
抗体の調製 遺伝子操作された抗体及び生物学的活性又は有意義な分
子としてのそれらの続く評価についての基礎は、親抗体
のＶL 及びＶH ドメインのクローニング、アセンブリー
コンフィグレーション、及び特性決定である。本発明者
は、対象抗体のＶL 及びＶH 構造配列、及び本発明に記
載される抗原に対する活性結合部位を形成する特定のＶ
L −ＶH 組合せの独自性を決定した。
【０１１０】９Ａ４可変領域遺伝子をクローニングする
前、親９Ａ４ ＩｇＧ１抗体の可変ドメインの部分のタ
ンパク質配列を決定する必要があり、その結果、その可
変ドメインがクローン化される場合、正しい可変ドメイ
ンが実際的に得られ、そして骨髄腫融合パートナーに由
来する他のドメイン又はハイブリドーマの生成に使用さ
れるＢ−細胞からの不活性偽遺伝子ではないことが確か
められ得る。ローラーボトルにおいて９Ａ４ハイブリド
ーマを増殖することによって、９Ａ４ ＩｇＧ１を含む
培養上清液を生成した。上清液を二塩基性リン酸ナトリ
ウムによりpH７．５に調節し、そして塩濃度を３Ｍの塩
化ナトリウムにより１５０mMの最終濃度に調節した。
【０１１１】濾過された（０．２μ）上清液を、１５ml
の層体積のプロテインＧカラム（Pharmacia)に、２０ml
／分の流速で通した。１５０mMのＮａＣｌ溶液によりカ
ラムをさらに洗浄した後、抗体を１００mMのグリシン
（pH３．１）により溶出した。抗体が、マウス免疫グロ
ブリンイソタイプ分類キット（Boehringer Mannheim, I
ndianapolis, IN)から抗−血清を用いてイソタイプ分類
され、そしてカッパＬ鎖を有するＩｇＧ１種類のネズミ
抗体であることが見出された。
【０１１２】いくつかの単離されたタンパク質がそれら
のアミノ末端で“ブロックされている”ことが観察され
た。“ブロックされた”とは、ポリペプチド鎖のアミノ
末端でのアミノ酸残基の構造が、細胞の作用又はなんら
かの自発的な化学変化により、そのポリペプチド鎖がエ
ドマン分解に対して耐性であるように、翻訳後に化学的
に修飾されていることを意味する。エドマン分解法は、
タンパク質のアミノ酸配列を決定するために過去４０年
間にわたって日常使用されて来た化学的方法である。配
列決定機又はタンパク質配列決定機として知られる実験
用器具により通常、自動化されたエドマン分解技法の使
用は、タンパク質生化学の当業者によく知られた標準の
方法である。
【０１１３】ブロッキングの通常の態様は、アミノ−末
端グルタミニル残基のピログルタミル残基への転換であ
る。これは、α−アミノ基とδ−カルボキシル基との間
に新しいアミド連鎖が形成されてグルタミニル残基の環
化が生じるので、エドマン反応に近づきにくい構造が形
成されるためである。そのような環境下で、タンパク質
のアミノ末端からの配列情報を得る可能性は、化学的又
は酵素的方法によるピログルタミル残基の除去に依存す
る。重要な方法は、ピログルタミル残基を除去するため
に、ピログルタメートアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．
４．１９．３）と呼ばれる酵素を使用することである。
【０１１４】溶液で存在するか、又は膜材料、たとえば
ＰＶＤＦ（ポリビニリデン ジフルオリド）に電気ブロ
ットされ得る前記ブロックされたタンパク質を、自動化
されたエドマン法によりアミノ酸配列の好都合な決定を
可能にするために十分な量のタンパク質が脱ブロックさ
れるまで、ピログルタメート アミノペプチダーゼの溶
液により処理する。このための典型的な例は、次のもの
に記載されている：Fowler EF, Moyer M, Krishna RG,
Chin CCQ and Wold F. (1995) “Removal of N-Termina
l Blocking Groups from Proteins ”, Current Protoc
ols in ProteinScience., pp.11.7.1-11.7.17 (eds. Co
ligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW., & Wing
field PT.), John Wiley, New York 。
【０１１５】本発明においては、ＭＡｂ９Ａ４のＨ及び
Ｌ鎖を、サンプル緩衝液中の還元剤（β−メルカプトエ
タノール）の使用により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した。電気泳動に続いて、ゲル
中のポリペプチドをＰＶＤＦ膜に電気ブロットし、そし
てクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０による染色
により検出した。次に、９Ａ４のＨ及びＬ鎖を含むバン
ドをブロットから切り出し、そしてピログルタメートア
ミノペプチダーゼにより別々に処理した。個々の場合、
この処理に続いて、エドマン分解によりアミノ末端配列
情報を得ることが可能であることがわかった。配列決定
を、Perkin-Elmer Applied BiosystemsModel 494 Proci
se タンパク質配列決定機上で実施した。
【０１１６】タンパク質からの内部（すなわち、Ｎ−末
端ではない）アミノ酸配列情報を得ることが所望される
場合、タンパク質のブロットされたサンプルをトリプシ
ンにより消化し、そしてその得られる消化物を、続いて
配列決定され得る個々のペプチドを供給するために、Ｈ
ＰＬＣにより分別した。前記研究の特徴は次の通りであ
った：
【０１１７】ピログルタメートアミノペプチダーゼ（Ｐ
ＧＡＰ）によるＮ−末端脱ブロック 抗体（９Ａ４）を、トリス−Ｇｌｙ４−２０％ポリアク
リルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上
でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその構成成分のＨ及びＬ鎖に
分離した。次に、それをProBlott（Perkin-Elmer Appli
ed Biosystems,Foster City, CA）上に電気ブロット
し、そしてバンドをPonceau S (Sigma）染色により可視
化した。
【０１１８】９Ａ４のＬ鎖を含む膜を切り出し、そして
次の成分を含む緩衝液において３０分間インキュベート
した：０．１Ｍのリン酸ナトリウム、１０mMのＮａ2 Ｅ
ＤＴＡ，５mMのジチオエリトリトール、５％のグリセロ
ール、及び０．１％の還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００。ピログルタメートアミノペプチダーゼ（２０mg）
（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)をバイアル
に添加し、その内容物を軽く混合し、そして反応物を３
７℃で一晩インキュベートした。膜を取り出し、そして
水により十分に洗浄し、すべての塩、界面活性剤及び酵
素を除去した。次に、膜を、製造業者により提供される
説明に従って、Ｎ−末端配列分析のためにApplied Bios
ystems Model ４９４タンパク質配列決定機（Perkin-E
lmer）に配置した。Ｈ鎖を、Ｌ鎖についてと同じ態様で
処理した。次のＮ−末端配列結果が得られた：
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】上記で得られたＮ−末端配列データの他
に、９Ａ４抗体Ｌ鎖の内部配列決定も、Fernandez J, A
ndrews L, Mische SM, Anal Biochem 1994;218:112-117
により開発された方法に従って実施した。９Ａ４Ｌ鎖に
対応する４種のバンドを、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ
（pH８．８）中、ProBlottから切り出し、そして１０％
アセトニトリル、及び還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００を含む緩衝液において３０分間インキュベートし
た。
【０１２１】Sequencing Grade Modified Trypsin
（０．２mg）（Promega, Madison, WI）を添加し、そし
てバンドを３７℃で一晩インキュベートした。得られる
ペプチドを、６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ，
Ｈ2 Ｏにより洗浄し、そして音波処理することによって
膜から抽出した。ペプチドを、Vydac Ｃ１８２１８ＴＰ
カラム（１．０×２５０cm）（Vydac, Hesperia, CA)上
でＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。ピークを眼で見て、
手で集め、そして選択されたピークを、上記のようなMo
del 494 タンパク質配列決定機上で自動化されたエドマ
ン配列決定により分析した。
【０１２２】ペプチドフラグメントについての次のＮ−
末端配列が得られた：
【表１２】
【０１２３】９Ａ４Ｌ鎖（ＶL −Ｃカッパ）アミノ酸配
列（クローン化されたＶL （下記を参照のこと）及びネ
ズミＣカッパ（Kabat EA, Wutt, Perry HM, Botlesman
KS及びFoeller C,“Sequences of Proteins of Immunol
ogical Interest, U.S. Department of Health and Hum
an Services, NIH, 5th Edition,出版#91-3242, 1991か
ら得られた）のＤＮＡ配列決定に起因する配列と、エド
マン分解により得られた配列との比較）。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】下線のアミノ酸は、自動化されたエドマン
配列決定により配列決定されている。クローン化された
ＤＮＡから得られる配列は、上記に示される元の抗体タ
ンパク質のフラグメントからのアミノ酸配列と比較され
る場合、クローン化された遺伝子が９Ａ４ ＶL に関し
て正しい遺伝子であることを示す。上記アミノ酸１０６
★は、Ｊ１ジャームラインセグメントにおいて、通常Ｌ
ｙｓ残基であるが、しかし９Ａ４ ＶL について上記に
示されるＩｌｅ残基に突然変異されている。アミノ酸１
０６はＶL ドメインの末端を示し、そしてアミノ酸１０
７（Ａｒｇ）は、Ｃカッパドメインの開始を示す。
【０１２６】ＭＡｂ９Ａ４のＶL 及びＶH 配列のクロー
ニング及び決定 ９Ａ４ハイブリドーマ細胞系を、５％ウシ胎児血清（Ｈ
ｙｃｌｏｎｅ）を含むＨＴ培地（Sigma)中で増殖せしめ
た。ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、Ph
armacia Quick Prep mRNA Extraction Kit（Pharmacia)
を用いて、１×１０7 個の細胞を含む細胞ペレットから
抽出した。次に、ｃＤＮＡを、製造業者により提供され
るプロトコールに従って、Boehminger Mannheim's cDNA
Kit（Indianapolis, IN）を用いて、両ＶL 及びＶH 遺
伝子セグメントについて合成した。
【０１２７】ＶL ｃＤＮＡ反応（ＭＬＫと称す）に使用
され、そして配列番号２１として配列表に示されるオリ
ゴヌクレオチドは、ネズミＬ鎖カッパ領域に対して特異
的であり、そしてＶH ｃＤＮＡ反応に使用されるオリゴ
ヌクレオチドは、ＭＨＧと称するネズミＨ鎖γ領域のＣ
H ２ドメインにおけるセグメントに対して特異的であっ
た。ＭＨＧの配列は、配列番号２２として配列表に示さ
れる。
【０１２８】このオリゴヌクレオチドを、すべての４種
のネズミＩｇＧイソタイプ、たとえばＩｇＧ１，ＩｇＧ
２ａ，ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３に対してアニーリングす
るよう設計した。配列番号２２のヌクレオチド５でＩｇ
Ｇ１についての１つの塩基のミスマッチが存在するが、
しかしこれはｃＤＮＡのアニーリング及び続くその生成
を妨げないことが当業者に明らかであろう。 注：オリゴヌクレオチドは、Oligos Etc (Wilsonville,
OR), Genosys (The Woodlands, TX) 又はPerkin-Elmer
Applied Biosystems (Foster City, CA) により合成さ
れた。
【０１２９】アミノ末端のアミノ酸配列データを用い
て、次の通りに、ＰＣＲにより正しい９Ａ４ ＶH 遺伝
子を単離するために可能なオリゴヌクレオチドを生成し
た。配列番号５の残基１〜２０に対応するＶH について
上記に示される２０個のアミノ酸配列に基づいて、及び
分泌された抗体Ｈ鎖の成熟形のアミノ末端アミノ酸が実
際、Ｇｌｎ残基であることを仮定して、既知の抗体の配
列と、９Ａ４ ＶH の配列とを、Ｋａｂａｔ データベ
ース、Sequences of Proteins of ImmunologicalIntere
st, Volume II, １９９１を用いて、比較した。
【０１３０】９Ａ４の最初の２０個のアミノ酸と適合す
る抗体ＶH ドメインは、次のものを包含する：MAb264
(Nottenburg C, St. John T. and Weissman IL, J Immu
nol.1987; 139, 1718-1726); MAbRFT2 (Heinrich G, Gr
am H, Hocher HP, SchreierMH, Ryffel B, Akbar A, Am
lot PL, and Janossy G, J Immunol 1989; 143: 3589-3
597).及びMAb2H1 (Li Y-W, Lawrie DK, Thammana D, Mo
ore GP and ShearmanCW, Mol Immunol 1990; 27: 303-3
11) 。
【０１３１】成熟抗体のアミノ末端に対応する元のＤＮ
Ａ配列を得ることが重要であるので、５′ＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドは、シグナルペプチドセグメントにおい
て、アミノ末端から５′側（上流）をアニールするよう
企画されるべきである。９Ａ４ＶH の最初の２０個のア
ミノ酸が同一である、上記３種のすべての抗体のＤＮＡ
配列は、既知のシグナルペプチドのＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を有した。それらのＤＮＡ配列は下記に示され
る（下線のヌクレオチドは、配列間での差異を示す）：
【０１３２】
【表１４】
【０１３３】それらの配列は、その対応する抗体のＶHS
のためのシグナルペプチド中のアミノ酸−１１〜−１７
をコードする。従って、５′オリゴヌクレオチド、すな
わちＭＨＭＩＳＣは、純粋な９Ａ４ ＶH を単離するよ
う企画された。ＭＨＭＩＳＣの配列は、配列番号２６と
して配列表に示される。９Ａ４ ＶL を単離するため
に、一連の５種の縮重オリゴヌクレオチドの組を、既知
のネズミカッパＬ鎖のリーダーペプチドセグメントにア
ニーンルにするよう企画した。それらのオリゴヌクレオ
チドは、５種の別々のＰＣＲ増幅に使用された（下記を
参照のこと）。５種の縮重オリゴヌクレオチドの組の配
列は、DOWChemical Company（Midland, MI)により供給
され、そしてそれにより認識される。真実の９Ａ４ Ｖ
L を付与する５′オリゴヌクレオチド組はＭＫ３であ
り、この配列は、配列番号２７として配列表に示され
る。それらのオリゴヌクレオチドは、シグナルペプチド
中の残基−８〜−１４をコードする。
【０１３４】ＶL 及びＶH ＰＣＲのための逆方向プライ
マーを、配列番号２８として配列表に示される、ＭＩＧ
Ｇ１ＣＨ１と呼ばれるネズミＩｇＧ１Ｈ鎖不変領域（Ｃ
H １ドメインからの）、及び配列番号２９として配列表
に示される、ＭＬＫＮと呼ばれるカッパＬ鎖の不変領域
の既知配列から設計した。それらのオリゴヌクレオチド
は、ｃＤＮＡ合成に使用される３′プライマーに対して
増幅された（上流）。アニーリングセグメントは、配列
番号２９のヌクレオチド１０で始まる。
【０１３５】９Ａ４のＶH 及びＶL 遺伝子を、上記に記
載されるその対応するオリゴヌクレオチド及び０．４１
μｇの９Ａ４ハイブリドーマｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ
により増幅した。ＰＣＲを、生来のＴａｑポリメラーゼ
を含むGene Amp(R) Kit (Perkin Elmer)を用いて設定
し、そして製造業者の規定に従って使用した。変性、ア
ニーリング及び重合の温度は、ＶH ＰＣＲに関して、そ
れぞれ４５秒、４５秒、及び６０秒間で９４℃、５５℃
及び７２℃であり、そしてＶL ＰＣＲに関しては、アニ
ーリング温度は６０℃に変えられた。
【０１３６】ＰＣＲは３６サイクル実施され、そして７
分間７２℃の最終重合、続いて４℃で維持された。ＰＣ
Ｒ生成物を、配列決定ベクターｐＣＲ２．１（Invitrog
en,Carisbad, CA）にクローン化し、そしてＶL 及びＶ
H のＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を決定し、そして
確かめるために配列決定した。配列決定のために使用さ
れるオリゴヌクレオチドは、ＵＮＩＶＬＳＥＱ−５′及
びＴＥＲＭＳＥＱ（−）であり、そしてそれぞれ配列番
号３０及び３１として配列表に示されている。
【０１３７】９Ａ４のＶH 及びＶL に対応するＤＮＡ配
列及びアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５及び６と
して配列表に示される。９Ａ４のＶH 及びＶL の推定ア
ミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３２及び３３として
配列表に別々に示されている。驚くべきことには、オリ
ゴヌクレオチドＭＨＭＩＳＣ（配列番号２６）が、９Ａ
４のＩｇＧ１のタンパク質配列決定により決定された成
熟タンパク質ＶH の最初の２０個のアミノ酸に正確に対
応するＶH 配列を都合良く供給した。５′ＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドＭＨＭＩＳＣ（配列番号２６）のすぐ近く
の３′側での９Ａ４のＶH のリーダーペプチドセグメン
トにおけるＤＮＡ配列は、ＭＡｂ２Ｈ１のその対応する
セグメントに対してほとんど同一であり、そして従っ
て、２Ｈ１と同じジャームラインＶH 遺伝子にたぶん由
来している。
【０１３８】ＶH 領域における２種の抗体間のアミノ酸
配列にわずか３種差異が存在し；ＣＤＲ１において１つ
の、ＣＤＲ２において１つの及びＦＲ３において１つの
差異が存在する。それらは、たぶん、それらの２種の抗
体のための親和性成熟工程の間に生じた体細胞突然変異
であり、そしてそれらのそれぞれの標的物のための個々
の抗体の特異性及び親和性を定義することに役割を演じ
ることができる。９Ａ４のＶH は、ネズミＪH ２連結セ
グメントを利用し、そして配列番号３２の残基１０３
（ＣＤＲ３内の）〜１１５をコードする。
【０１３９】９Ａ４可変Ｈ鎖は、ＫａｂａｔのマウスＩ
ｇＨ鎖ファミリーIIに属する。（ここで同定されたＶH
遺伝子は、http://immuno. bme. nwu. edu/famgroup. h
tmlでのKabat Databaseから入手された）。９Ａ４のＶ
H Ｈ鎖（配列番号５）は、Ｄａｔａｂａｓｅ ＩＤ番号
００１２４６に最も密接に類似する。それらの２種のＶ
H 遺伝子にわずか２つの差異が存在し、１つはＦＲ１に
おいて存在し（サイレント突然変異）、そして他の１つ
はＣＤＲ１において存在し、ここでアミノ酸位置３４で
（配列番号３２）、９Ａ４はＩｌｅを有し、そして００
１２４６はＭｅｔを有する。それらの遺伝子の両者はま
た、同じ生殖系ＶH にたぶん由来する。
【０１４０】本発明者は、９Ａ４のＶH ジャームライン
遺伝子に関連する他の抗体におけるＶH 遺伝子を請求
し、ここで前記ＶH 遺伝子生成物がこの他の抗体のＶL
と生産性ＶL −ＶH 対を形成する場合、それは９Ａ４に
類似する態様（特異性及び親和性）で結合する。９Ａ４
ＶL 遺伝子及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番
号６及び３３として配列表に示される。９Ａ４のＶL 遺
伝子の推定アミノ酸配列は、上記に示されるような純粋
な９Ａ４ Ｌ鎖のタンパク質配列決定からのすべてのペ
プチドフラグメントと適合する。
【０１４１】９Ａ４可変Ｌ鎖は、Kabat's Mouse Kappa
Family XI に属し、そしてDatabaseID Number 006306
に最も類似する。７種のアミノ酸差異をもたらす１０の
ヌクレオチドミスマッチが存在する。それらの差異のう
ち２つは、ＦＲ１において、他の２つはＣＤＲ２におい
て、他の１つはＦＲ３において、そして他の２つはＣＤ
Ｒ３において生じる。それらの変化の大部分はＣＤＲに
おいて生じるので、それらの２つの遺伝子は、同じか又
は少なくとも非常に類似する生殖系ＶL に由来すること
によって、たぶん関連している。
【０１４２】本発明者は、９Ａ４のＶL ジャームライン
遺伝子に由来するか又はそれに関連する他の抗体におけ
るＶL 遺伝子を請求し、ここで前記ＶL 遺伝子生成物が
この他の抗体のＶH と生産性抗体ＶL −ＶH 対を形成す
る場合、それは９Ａ４に類似する態様（特異性及び親和
性）で結合する。本発明者はまた、ＶL 及びＶH の両者
が、本明細書に開示される９Ａ４ ＶL及びＶH ジャー
ムライン遺伝子に由来する抗体を請求し、ここで前記Ｖ
L 及びＶ H 遺伝子生成物が生産性ＶL −ＶH 対を形成す
る場合、９Ａ４からのこの他の又は異なった抗体は９Ａ
４に類似する態様（特異性及び親和性）で実質的に結合
する。
【０１４３】本発明者は、現在、本発明の９Ａ４抗体の
遺伝子操作されたバージョンを企画し、そして構成する
基礎を有する。２つの例（両一本鎖抗体（ｓｃＦｖ））
が下記に示される。１つの場合、その企画は、ベクター
ｐＣＡＮＴＡＢ６におけるＶ H −リンカー−ＶL −ＨＩ
Ｓ−ＭＹＣ標識であり、そして他の場合、ｓｃＦｖが異
なったリンカーにより反対の方向に構成され、すなわち
ベクターｐＡＴＤＦＬＡＧにおけるＶL −リンカー−Ｖ
H −ＦＬＡＧ標識が構成される。それらの例は、制限を
意味するものではないが、しかし当業者にとって、９Ａ
４の新しく特徴づけられたＶL 及びＶH ドメイン（配列
番号５及び６）が、前に記載された抗体型、たとえばＦ
ａｂ′、又はＶドメインのいくらかの決定的部分を用い
る新規の形状を得るために一部又は全体で使用され得る
ことが明らかであろう。
【０１４４】ｐＣＡＮＴＡＢ６中の９Ａ４ ｓｃＦｖ
（ＶH −リンカー−ＶL ）の構成 ＳＯＥｉｎｇ（オーバーラップ延長によるスプライシン
グ）ＰＣＲプライマーを用いて、ｓｃＦｖ抗体中へのＶ
H 及びＶL フラグメントのアセンブリーを調製した。２
つのプライマーを、ＶH 領域のために企画し、そしてPe
rkin Elmerから入手し：その５′末端で、ＳｆｉＩ部位
を付加し、そして３′末端で、（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3 リ
ンカーを有するオーバーラップ配列を付加した。５′Ｖ
H プライマーは、９Ａ４ＶＨ５ＣＡＮと呼ばれ、そして
３′ＶH プライマーは９Ａ４Ｈ３ＣＡＮと呼ばれ、それ
らは配列表における配列番号３４及び３５に対応する。
【０１４５】ＶL のために、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカー領
域中にオーバーラップする５′末端プライマー、及びＮ
ｏｔＩ制限部位を組込む３′プライマーを企画し、そし
てまた、Perkin Elmerから入手した。５′プライマーは
９Ａ４ＶＬ５ＣＡＮと呼ばれ、そして３′ＶL プライマ
ーは９Ａ４ＶＬ３ＣＡＮＩＬＥと呼ばれ、それらは配列
表における配列番号３６及び３７に対応する。
【０１４６】ＶH 及びＶL ＤＮＡ成分をＰＣＲにより増
幅し、そして続いて、アセンブリー、すなわちＳＯＥ−
ＰＣＲ段階により連結した。ＳＯＥ−ＰＣＲ反応に続い
て、−７００bpであることが同定された、アガロースゲ
ルにおけるバンドを切り出し、そしてQIAquick Gel Pur
ification Kit (QIAgen)を用いて、製造業者の説明書に
従ってゲル精製した。得られるＤＮＡをＳｆｉＩ及びＮ
ｏｔＩにより消化し、そして同じ制限酵素によりまた消
化されたｐＣＡＮＴＡＢ６ベクターＤＮＡ（Cambridge
Antibody Technology, Melbourne, Cambridgeshire, UK
から得られた）と共に連結に使用した。次に、連結され
たＤＮＡを用いて、成分Ｅ．コリＴＧ１細胞をエレクト
ロポレーションにより形質転換した。成分Ｅ．コリＴＧ
１細胞を生成するための基本的なプロトコールは、次の
通りであった：
【０１４７】２Ｌの円錐形フラスコにおける３７℃に前
もって暖められた５００mlの２ＹＴ培地（Bio101, LaJo
lla, CA)を、ＴＧ１細胞の新鮮な一晩の培養物２．５ml
により接種した。それらを、６００nmでのＯＤが通常、
１〜１．５時間後、０．２〜０．２５になるまで、３７
℃で激しいエアレーション（３００rpm)を伴って増殖し
た。フラスコを氷上で３０分間急冷し次に２５０mlの遠
心分離管中に注ぎ、そして前もって急冷（４℃）された
Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機において４，０００rpm で１
５分間、回転せしめ、細胞をペレット化した。細胞を元
の体積の予備急冷された水に再懸濁し、そして上記のよ
うにして再び回転せしめ、細胞をペレット化した。
【０１４８】前記細胞を、元の半分の体積、すなわち２
５０mlの予備急冷された水に再懸濁し、そして氷上に３
分間放置し、上記のように再懸濁し、そして再び回転せ
しめた。次に、細胞を２０mlの予備急冷された１０％グ
リセロールに再懸濁し、予備急冷された５０mlのＦａｌ
ｃｏｎ管に移し、氷上に１５分間放置し、そして遠心分
離機において、３，５００rpm で４℃で１０分間遠心分
離した。最終的に、細胞を、１．０〜２．５mlの予備急
冷された１０％グリセロールに再懸濁し、そしてエレク
トロポレーション段階に直接的に使用した。
【０１４９】連結されたＤＮＡ（９Ａ４ ＶH −Ｌ−Ｖ
L −ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩを含む２５〜２５０ngのｐＣＡ
ＮＴＡＢ６−ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩベクター）を、次の通
りに、成分Ｅ．コリＴＧ１細胞中にエレクトロポレート
した：連結されたＤＮＡを、標準のプロトコールに従っ
て、エタノール沈殿せしめた。ＤＮＡペレットを、１０
μｌの脱イオン化された無菌蒸留水に溶解した。ＤＮＡ
（合計細胞体積の１０％までの）を、１００μｌの細胞
に添加し、そして予備急冷されたエレクトロポレーショ
ンキャベット（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、そして氷上に放
置した。
【０１５０】エレクトロポレーションGene Pulser 装置
（Ｂｉｏｒａｄ）パラメーターを、２５μFD，２．５kV
に設定し、そしてパルスコントローラーを２００ｏｈｍ
ｓに設定した。組織を含むキュベットを乾燥せしめ、エ
レクトロポレーションチャンバーに配置し、そして１回
パルスした。３．５〜４．８ｍ秒の範囲での時定数を、
典型的には得た。エレクトロポレートされた細胞をすぐ
に、２％グルコースにより補充された２ＹＴ培地１mlに
より希釈した。細胞を１５mlのＦａｌｃｏｎ管に移し、
そして３７℃で１時間、振盪した。
【０１５１】形質転換された細胞混合物（２０〜１００
０μｌ）を、２ＹＴ，２％グルコース及び１００μｇ／
mlのアンピシリンを含む適切なサイズの培地プレート
（２ＹＴＡＧ）上にプレートした。最初に、読取り外に
下流配列を配置する、ＮｏｔＩ部位で５個の塩基の挿入
を有するクローンを得た（ｐ９Ａ４ＩＣＡＴ３−２）。
これを補正するために、９Ａ４ＮＯＴＦＩＸ３（この配
列は、配列番号３８として配列表に示されている）と呼
ばれる新規のオリゴヌクレオチドを製造した。
【０１５２】アニーリングオリゴヌクレオチドのための
標的物としてｐ９Ａ４ＩＣＡＴ３−２を含むＥ．コリ細
胞を用いてのＰＣＲ増幅を、Advantage Klen Taq Polym
erase Mix (Clontech, Palo Alto, CA）を用いて、製造
業者のプロトコールに従って実施した。アニーリングオ
リゴヌクレオチド（それぞれ３５ｐモル）は、９Ａ４Ｎ
ＯＴＦＩＸ３及びｐＵＣ１９Ｒであった。ｐＵＣ１９Ｒ
の配列は配列番号３９として配列表に示され；それはＳ
ｆｉＩ部位から上流をアニールする。
【０１５３】ＰＣＲサイクル（Perkin Elmer Cetus Mod
el 9600 熱サイクラーを用いて）を次の通りに設定し
た：最初のサイクルに関しては、９４℃で１分間のＤＮ
Ａの変性、６０℃で４５秒間のアニーリング、及び６８
℃で１．５分間の重合であった。サイクル２〜３１に関
しては、同じ温度及び時間が使用されたが、但し変性時
間は３０秒に減じられた。最終サイクル（３２）に関し
ては、重合を５分間、設定し、この後、サイクラーがサ
ンプルを４℃に冷却した。
【０１５４】ＴＡ クローニングシステム（Invitroge
n）を用いて、製造業者により提案されるプロトコール
に従って、プラスミドｐＣＲ２．１において得られるＰ
ＣＲ生成物をクローン化した。１２の白色のコロニー
を、上記のようなKlen Taqポリメラーゼを用いてのＰＣ
Ｒにより、オリゴヌクレオチド M13 Forward 及びM13
Reverse (Invitrogen)を用いて挿入体についてスクリー
ンした。３つのコロニーが、アガロースゲル電気泳動上
で正しいサイズの挿入体を生成した。
【０１５５】９Ａ４ ＶH −リンカー−ＶL 構造体につ
いての正しいＤＮＡ配列を有するそれらのコロニーの１
つを、さらなる研究のために選択した。ｓｃＦｖ遺伝子
を含むＤＮＡ挿入体を、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩによるｐ
ＣＲ２．１誘導体の液化により得、QIAquick Gel Extra
ction キットを用いて精製し、そして同じ制限酵素によ
り消化されたｐＣＡＮＴＡＢ６ベクターにより連結し
た。ＤＮＡを上記のようにして成分Ｅ．コリＴＧ１細胞
中にエレクトロポレートし、そして活性ｓｃＦｖを含む
ｐ９Ａ４ＩＣＡＴ７−１（ＡＴＣＣ ９８５９３）と称
するクローンをもたらした。
【０１５６】この９Ａ４ ｓｃＦｖのＤＮＡ配列は配列
番号７として配列表に示され、そしてそのアミノ酸配列
は配列番号４０として別々に示されている。配列番号７
の位置２９で始まるＧＴＧコドンは、開始コドン（Ｍｅ
ｔ）であることを注目すること。使用される配列決定オ
リゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号３９及び４１と
して配列表に示されるｐＵＣ１９Ｒ及びＦＤＴＥＴＳＥ
Ｑであった。
【０１５７】ｓｃＦｖ抗体についてのＤＮＡ及びアミノ
酸配列の特定の特徴については、配列表における配列番
号７及び４０についての情報を参照のこと。遺伝子操作
された９Ａ４ ＶH −リンカー−ＶL 型ｓｃＦｖ抗体を
Ｅ．コリＴＧ１細胞において発現し、そして前記抗体を
ＮＴＡ−Ｎｉアガロース（ＱＩＡｇｅｎ）アフィニティ
ークロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲ
ル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、モノマーｓ
ｃＦｖ種を単離した。ｓｃＦｖの親抗原への結合性を、
ＢＩＡｃｏｒｅ上で評価した（下記を参照のこと）。プ
ラスミドｐＡ４ＩＣＡＴ７−１を含むＥ．コリを、ＡＴ
ＣＣ ９８５９３としてアメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクションに寄託した。
【０１５８】ｐＡＴＤＦＬＡＧ中の９Ａ４ ｓｃＦｖ
（ＶL −リンカー−ＶH ）の構成 ＳＯＥｉｎｇ オリゴヌクレオチドをまた、ｐ９Ａ４Ｉ
ＣＡＴ７−１において上記に示される例に対して反対の
形状、すなわちＶL −リンカー−ＶH の形状で、ＶH 及
びＶL フラグメントのＰＣＲ−ＳＯＥアセンブリーを調
製した。２種のプライマーをＶL −リンカー領域のため
に企画し；その５′末端で、ＮｃｏＩ部位が付加され、
そして３′末端で、配列番号４２として配列表に示され
る２５個のアミノ酸のリンカー配列を有するオーバーラ
ップする配列（Pantoliano MW, Bird RE, Johnson S, A
sel ED, Dodd SW, Wood JF, and Hardman KD, Biochemi
stry 1991; 30: 10117-10125）が付加された。５′ＶL
プライマーは、９Ａ４ＶＬ５ＡＴＤと命名され、そして
３′ＶL プライマーは９Ａ４ＶＬ３ＡＴＤＩＬＥと命名
された。それらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞ
れ配列番号４３及び４４として配列表に示される。
【０１５９】ＶH'に関しては、リンカー領域中へのオー
バーラップを有する５′末端プライマー及び付加された
ＮｈｅＩ部位を有する３′末端ＰＣＲプライマーを企画
した。５′ＶH プライマーは９Ａ４ＶＨ５ＡＴＤと命名
され、そして３′ＶH プライマーは９Ａ４ＶＨ３ＡＴＤ
と命名された。それらのオリゴヌクレオチドの配列は、
それぞれ配列番号４５及び４６として配列表に示され
る。
【０１６０】ＶL 及びＶH 成分をＰＣＲにより増幅し
た。次に、ＶL 及びＶH を、オリゴヌクレオチド９Ａ４
ＶＬ５ＡＴＤ（配列番号４４）及び９Ａ４ＶＬＨ３ＡＴ
Ｄ（配列番号４６）を用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲによりリ
ンカー領域に連結した。約７００bpの正しいサイズでの
ＤＮＡを、１％アガロースゲルから切り出し、そしてＱ
ＩＡｑｕｉｃｋゲル溶出キットを用いて溶出した。
【０１６１】得られるＤＮＡを、５′末端で制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及び３′末端でＮｈｅＩによりそれらの末端で修
正した。これを、同じ制限酵素により処理された発現ベ
クターｐＡＴＤＦＬＡＧ（ＰＣＴ ＷＯ９３／１２２３
１）により連結した。コンピテントＥ．コリＤＨ５α細
胞を製造業者のプロトコールに従って前記連結により形
質転換し、そして選択剤として２０μｇ／mlのクロラム
フェニコールを含む寒天プレート上にプレートした。ク
ローンのうち２種を配列決定した。ｐ９Ａ４ＩＦ−３及
びｐ９Ａ４ＩＦ−６９は、ＰＣＲ又は構成誤差を有さな
かった。配列決定オリゴヌクレオチドは、ＵＮＩＶＬＳ
ＥＱ−５′（配列番号３０）及びＴＥＲＭＳＥＱ（−）
（配列番号３１）であった。
【０１６２】ｐ９Ａ４ＩＦ−５を含むＥ．コリを、構築
された９Ａ４ ｓｃＦｖ抗体のさらなる研究及び発現の
ために選択した。このｓｃＦｖのＤＮＡ配列は配列番号
８として配列表と示されており、そして誘導されたアミ
ノ酸配列は配列番号４７として別に示されている。ＶL
−Ｌ−ＶH −ＦＬＡＧ９Ａ４ ｓｃＦｖ、たとえばシグ
ナルペプチド、リンカー及び標識の位置の特定の特徴
は、配列番号８及び４７についての情報として配列表に
与えられている。記載される構築された抗体は、Ｅ．コ
リからだけでなく、他の生物、たとえばＰ．パストリス
（P. pastoris)、バキュロウィルス（Baculovirus)、バ
チルス（Bacillus）種、哺乳類細胞、等（但し、これら
だけには限定されない）からも発現され得ることは、当
業者に明らかであろう。
【０１６３】Ｅ．コリからのこのｓｃＦｖ生成物の発現
及び精製のために、２０μｇ／mlのクロラムフェニコー
ルを含むＬＢブイヨンの１〜２Ｌの培養物を、３７℃で
一晩増殖せしめた。細胞を、ＧＳ−３ローターを用いて
Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機によりペレット化した。Ｍ２
アフィニティーカラム（Kodak, New Haven, CT）（上記
配列に示されるＦＬＡＧエピトープに対して特異的であ
る）を用いてのアフィニティークロマトグラフィーのた
めの調製においては、ペレット化されたＥ．コリ細胞
を、トリス／ＥＤＴＡ／スクロース培地において処理
し、細胞周辺画分を単離し、又は最少量のＤＰＢＳ緩衝
液において直接的に音波処理した（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ音
波処理機）。
【０１６４】アフィニティーカラムを、粗ｓｃＦｖサン
プルの負荷の後、ＤＰＢＳにより広範に洗浄し、いづれ
かの結合されなかった材料を除去した。ｓｃＦｖ抗体を
０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（pH３．１）を用いて溶出
した。モノマーを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲル濾過ク
ロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により単離し
た。抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質であると判断
され、そしてクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０
により染色した。抗体をＯＤ２８０nmで分光光度計によ
り定量化し、ここで１．４の吸光度が、１．０cmの通過
の長さの石英キュベットを用いて、１．０mg／mlのｓｃ
Ｆｖに等しいものとして定義された。プラスミドｐ９Ａ
４ＩＦ−５を含むＥ．コリを、ＡＴＣＣ−９８５９２と
してアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに
寄託した。
【０１６５】抗原に対する結合性を、ｐ９Ａ４ＩＣＡＴ
７−１及びｐ９Ａ４ＩＦ−５ ｓｃＦｖ精製された両遺
伝子生成物についてBIAcore 上で次の通りに評価した。
ストレプトアビジンチップを、上記例１におけるよう
に、配列番号１４のビオチニル化されたペプチドにより
負荷した。両ｓｃＦｖ構成物が抗原を結合することが示
され、すなわち１．２×１０-7ＭのＫを伴って結合する
親９Ａ４ ＩｇＧに比較して、９Ａ４ ＩＦ−５ ｓｃ
Ｆｖは１．１×１０-7ＭのＫを有する。９Ａ４ＩＣＡＴ
７−１ ｓｃＦｖに関しては、オフ−レートは１．２×
１０-3／秒であり、比較して９Ａ４ ＩｇＧ（親抗体）
のその速度は１．７６×１０-2／秒であった。それらの
データは、構築された抗体の親和性が親抗体よりも少な
くとも良好であることを示す。
【０１６６】ＢＩＡｃｏｒｅにより決定される特異性及
び動力学的データにより明示されるように、上記９Ａ４
ＶL 及びＶH ドメインを含む２種の構築された抗体は
上記例３及び４に記載される定量測定アッセイにおいて
それらを用いるための所望する特徴を有する。親９Ａ４
抗体の親和性及び特異性を有する、本明細書に開示され
る９Ａ４ ＶL 及びＶH のいくらか又はすべてを含んで
成る他の構築された抗体は、従って、本発明の範囲内に
あると見なされる。
【０１６７】例７．５１０９に関連する遺伝子操作され
た抗体の調製 ５１０９可変領域遺伝子をクローニングする前、親５１
０９抗体の可変ドメインの一部のタンパク質配列を決定
することが必要であり、その結果、可変ドメインがクロ
ーン化される場合、正しい可変ドメインが実際に得ら
れ、そして骨髄腫融合パートナーに由来するか又はハイ
ブリドーマの生成に使用されるＢ細胞からの不活性偽遺
伝子に由来する他のドメインが得られないことが確証さ
れ得る。５１０９を含む培養上清液を、ローラーボトル
において５１０９ハイブリドーマを増殖することによっ
て生成した。
【０１６８】上清液を二塩基性リン酸ナトリウムにより
pH７．５に調節し、そして塩濃度を、１５０mMの最終濃
度になるよう、３Ｍの塩化ナトリウムにより調節した。
濾過された（０．２μ）上清液を、１５mlの層体積のPr
otein G (Pharmacia）に、２０ml／分の流速で通した。
１５０mMのＮａＣｌ溶液によりカラムをさらに洗浄した
後、抗体を１００mMのグリシン（pH３．１）により溶出
した。抗体を、マウス免疫グロブリンイソタイプ分類キ
ット（Boehringer Mannheim)から抗−血清を用いてイソ
タイプ分類し、そしてカッパＬ鎖不変ドメインを有する
ＩｇＧ１種類のネズミ抗体であることが見出された。
【０１６９】本発明においては、ＭＡｂ５１０９のＨ及
びＬ鎖は、サンプル緩衝液への還元剤（β−メルカプト
エタノール）の使用によりＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
された。電気泳動に続いて、ゲル中のポリペプチドをＰ
ＶＤＦ膜に電気ブロットし、そしてクーマシーブリリア
ントブルーＲ−２５０による染色により検出した。次
に、５１０９のＨ及びＬ鎖を含むバンドを切り出し、そ
してエドマン分解にゆだねた。配列決定を、Perkin-Elm
er Applied Biosystems Model 494 Procise タンパク質
配列決定機上で、製造業者のプロトコールに従って実施
した。得られたＨ及びＬ鎖の配列決定は表１５に示され
ており、そしてＶH に関しては、配列番号４８の残基１
〜４０、及びＶL に関しては、配列番号４９の残基１〜
３９に対応する。
【０１７０】
【表１５】
【０１７１】推定上のアミノ酸が（ ）により示され
る。注：ＶL における位置２２及びＶ H における位置２
３は通常Ｃｙｓであり、そしてエドマン分解により決定
され得ない。
【０１７２】ＭＡｂ５１０９のＶL 及びＶH 配列のクロ
ーニング及び決定 ５１０９ハイブリドーマ細胞系を、５％ウシ胎児血清
（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有するＨＴ培地（Ｓｉｇｍａ）に
おいて増殖せしめた。細胞をペレット化し（２．５×１
０7 個の細胞／ペレット）、そして使用まで−８０℃で
凍結した。ｍＲＮＡの抽出（OligotexTM Direct mRNA K
it;QIAGEN)を、製造業者の説明書に従って実施した。次
に、ｃＤＮＡを、Boehringer Mannheim's First-strand
cDNA Synthesis Kit を用いて、ＶL 及びＶH 領域のた
めに合成した。ＶL ｃＤＮＡ反応に使用されるオリゴヌ
クレオチドはネズミＬ鎖カッパ領域（ＭＬＫ）に対して
特異的であり、そしてＶH ｃＤＮＡ反応に使用されるオ
リゴヌクレオチド、すなわちＭＨＧはネズミＨ鎖ＣH ２
γ領域におけるセグメントに対して特異的である。オリ
ゴヌクレオチドＭＬＫ及びＭＨＧの配列は、それぞれ配
列番号２１及び２２として配列表に示される。
【０１７３】ＰＣＲプライマーを、エドマン分解により
ＶL 及びＶH のために得られたアミノ酸配列に基づい
て、Ｈ及びＬ鎖の分泌された成熟形のＮ−末端配列のた
めに企画した。５′ＶH プライマー及び５′ＶL プライ
マーの配列が、それぞれ、５１−０９ＶH ５′ＮＤｅ及
び５１−０９ＶL ５′ＮＤｅと命名され、そして配列番
号５０及び５１として配列表に示される。
【０１７４】逆方向プライマーを、ＩｇＧ１ Ｈ鎖不変
領域（ＣH １ドメインにおけるセグメントに対して）、
及びカッパＬ鎖の不変領域の既知の配列から企画した。
それらの３′オリゴヌクレオチドの両者は、ｃＤＮＡを
生成するために使用される元のオリゴヌクレオチドの
５′（上流）である。ＭＩＧＧ１ＣＨ１と称する３′Ｖ
H プライマー、及びＭＵＬＫ２と称する３′ＶL プライ
マーは、それぞれ配列番号２８及び５２として配列表に
示される。
【０１７５】ＶL 及びＶH のためのそれらの得られるＰ
ＣＲ生成物をｐＣＲ２．１中に連結し、そして代表的な
クローンを、続くＤＮＡ配列決定のために選択した。Ｄ
ＮＡ配列決定を、製造業者により提供されるプロトコー
ルに従って設定され、そして操作されるApplied Biosys
tems Model 373 Stretch Sequencerに基づいて実施し
た。ＤＮＡ配列決定のために、Invitrogenから市販され
ている配列決定オリゴヌクレオチドＭ１３Ｆ及びＭ１３
Ｒを用い、それらの配列は配列番号５３及び５４として
配列表に示される。
【０１７６】５１０９ＶL 及びＶH 成熟アミノ末端につ
いてエドマン分解により決定された最初の２１個のアミ
ノ酸は、ＰＣＲによりここでクローン化されたそれらの
対応する遺伝子のＤＮＡ配列に由来するそれらの対応す
るアミノ酸配列に対して同一であることが見出された。
５１０９ＶH 及びＶL ドメインのＤＮＡ及び誘導された
アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０及び１１として
配列表に示される。５１０９ＶH 及びＶL のアミノ酸配
列は、それぞれ配列番号４８及び４９として配列表に示
される。前記ＤＮＡは、示されるように、ＰＣＲアニー
リングオリゴヌクレオチドに対応するＶ L 及びＶH セグ
メントの個々のアミノ末端セグメントにおいて正しいア
ミノ酸をコードするが、元のハイブリドーマＤＮＡにお
いて存在したような、それらのオリゴヌクレオチドに対
応する抗体アミノ酸セグメントのための正確なコドンは
凝う余地のないことが注目されるべきである。
【０１７７】５１０９可変Ｈ鎖は、Kabat's Mouse Ig
Ｈ鎖Family XIVに最も関連し、そしてＤａｔａｂａｓｅ
ＩＤ番号００２７５４に最も密接に類似する。１４種
のアミノ酸差異をもたらす、それらの２つのＶH 遺伝子
間に２４のヌクレオチド差異が存在する。それらの２つ
の遺伝子が同じジャームライン遺伝子に由来しないこと
は、この高い数の差異にたぶん基づかれている。しかし
ながら、前記２つの遺伝子は同じ生殖系に由来し、そし
て両者はインビボ親和性成熟工程において重度に突然変
異誘発され、そしてその得られる分岐が増幅された可能
性がある。その５１０９は、どちらかといえば、Ｔｈｒ
残基（配列番号１０の位置３２８及び３３０）をコード
するが、しかし５１０９においては、ａｌａ残基（配列
番号４８の位置１１０）であるコーダーにおける突然変
異誘発を有するＪH ３連結セグメント遺伝子を利用し
た。
【０１７８】本発明者は、５１０９ＶH ジャームライン
遺伝子に関連する他の抗体におけるＶH 遺伝子を請求
し、ここでそのＶH 遺伝子生成物がこの他の抗体のＶL
と生産性抗体ＶL −ＶH 対を形成する場合、それは５１
０９に類似する態様（特異性及び親和性）で結合する。
前記５１０９は、配列番号１１として配列表に示される
ようなアミノ酸１０２〜１１２をコードするＪ５連結セ
グメントを利用した。この抗体のためのＣＤＲ３は、そ
こに含まれるＣｙｓ−９４残基のために、比較的まれで
ある。ＣＤＲ３は、配列番号１１又は４９の残基９４か
ら１０２まで延びる。
【０１７９】配列番号４９のＣｙｓ−９４は、別の遺伝
子構造体においてＳｅｒ残基により置換された。このｓ
ｃＦｖバージョンは、親Ｃｙｓ−９４残基を有するｓｃ
Ｆｖに匹敵する活性を有することが見出された。配列番
号１１及び４９のＡｌａ−８３は、ＰＣＲ誤差のため
に、親配列のＦＲ３におけるＶａｌ−８３と置換され
た。保存性差異として、それは、遺伝子操作された生成
物の活性に影響を及ぼすことに関して重要でないように
思われ、そして従って、下記ｓｃＦｖ構造体のＶLにお
いて前方への担持を可能にされた。突然変異は、配列番
号９のヌクレオチド７３８で生じ、そして配列番号６３
の位置２１５でのＡｌａをもたらし、もちろん、当業者
によれば、このＰＣＲ誤差がまた、相互関連しており、
そして元のＶａｌ残基がこの位置で得られたことは明ら
かであろう。
【０１８０】５１０９ＶL は、Kabat's Mouse Kappa Fa
mily VI に属し、そしてDatabase ID Number ００５８
４１，００５８４２，００５８４３及び００５８４４に
最も類似する。それらのデータベースにおける４種の抗
体は、それらのヌクレオチド配列において同一であり、
その結果、５１０９ＶL との比較が同時にそれらの４種
のすべてに対して行なわれ得る。８種のアミノ酸差異を
もたらす、１２のヌクレオチド不適性が存在する。これ
らの差異の１つは、ＦＲ１で、他の３つはＣＤＲ１で、
他の１つはＦＲ２で、他の１つはＣＤＲ２で、他の１つ
はＦＲ３で、他の１つはＣＤＲ３で生じる。それらの変
更はＶL じゅうに存在するが、しかしＣＤＲに対して集
中され、そして８種の差異のうち５がそれらの超可変セ
グメントに存在する。従って、たぶん、それらの遺伝子
は同じか又は少なくともひじょうに類似する生殖系ＶL
に由来することによって関連していると思われる。
【０１８１】本発明者は、５１０９ＶL ジャームライン
遺伝子に関連する他の抗体におけるＶL 遺伝子を請求
し、ここで前記ＶL 遺伝子生成物がこの他の抗体のＶH
と生産性抗体ＶL −ＶH 対を形成する場合、それは５１
０９に類似する態様（特異性及び親和性）で結合する。
本発明者は、ＶL 及びＶH の両者が、この特許に開示さ
れる、５１０９ＶL 及びＶH ジャームライン遺伝子に由
来する抗体をまた請求し、ここで前記ＶL 及びＶH 遺伝
子生成物が生産性ＶL −ＶH 対を形成する場合、５１０
９からのこの他の又は異なった抗体は、５１０９に類似
する態様（特異性及び親和性）で実質的に結合する。
【０１８２】ｐＵＣ１１９中の５１０９ ｓｃＦｖ構築
された抗体（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）の構成 ＳＯＥｉｎｇ（オーバーラップ延長によるスプライシン
グ）ＰＣＲプライマーを用いて、ＶH 及びＶL 成分のア
センブリーを調製した。５１０９ｓｃＦｖ構成に使用さ
れるオリゴヌクレオチドのすべては、Beckman Oligo 10
00M DNA 合成機（Fullerton, CA)を用いて内部で合成さ
れた。５１０９ＶＨ５′，５１０９ＶＨ３′，５１０９
ＶＬ５′，５１０９ＶＬ３′ＳＥＲ及び５１０９ＶＬ
３′ＣＹＳと呼ばれるそれらの５種のＰＣＲプライマー
は、それぞれ配列番号５５，５６，５７，５８及び５９
として配列表に示される。
【０１８３】オリゴヌクレオチド５１０９ＶＬ３′Ｓｅ
ｒ（配列番号５８）を用いて、配列番号４９のＣｙｓ−
９４をＳｅｒ−９４（配列番号６３の位置２２５でのＣ
ｙｓ残基に対応する）に変更し、その得られるｓｃＦｖ
の安定性を実質的に改良した。他のプライマー、すなわ
ち５１０９ＶＬ３′Ｃｙｓ（配列番号５９）を、元のＣ
ｙｓ配列を保持するために、また製造した。ＳＯＥｉｎ
ｇ反応に続いて、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、そして
その生成物を配列の確認のために直接的に配列決定し
た。
【０１８４】ＤＮＡ配列を、Applied Biosystems Model
373 Stretch Sequencing Unitを用いて、製造業者の説
明書に従って確かめた。次のオリゴヌクレオチドを、ｐ
ＵＣ１１９中に直接的に連結される可能性ある５１０９
ｓｃＦｖ構築された抗体の配列決定のために使用した：
／ｐＵＣ１９Ｒ，ＭｙｃＳｅｑ１０，Ｇｌｙ４Ｓｅｒ
５′，Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３′；それらの配列はそれぞれ配
列番号３９，６０，６１及び６２として配列表に示され
る。ｐＣＲ２．１ベクター中に連結されるそれらの５１
０９ＤＮＡカセットに関しては、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ
から購入されたＭ１３Ｆ及びＭ１３Ｒオリゴヌクレオチ
ド（配列番号５２及び５３）を、２つの内部オリゴヌク
レオチドとして、配列番号６１及び６２と共に、配列プ
ライミング反応のために使用した。
【０１８５】ｐＵＣ１９中に直接的に連結されたクロー
ンは、多数のＰＣＲ誤差を含んだ。しかしながら、許容
できるクローン（Ｈ５５）を、ｐＣＲ２．１ベクターに
おいて同定した。次に、この構造体を、ＳｆｉＩ及びＮ
ｏｔＩによりｓｃＦｖを消化することによってサブクロ
ーン化し、そして同様にして消化されたｐＵＣ１９に連
結した。クローンを、ｐＵＣ１９Ｒ及びＭｙｃＳｅｑ１
０オリゴヌクレオチド（配列番号３９及び６０）を用い
てＰＣＲ増幅により挿入体についてスクリーンした。３
つのクローンを、配列決定のために提出した。所望する
配列を有する１つのクローンを同定し、そしてｐ５１０
９ＣｓｃＦｖ７（ＡＴＣＣ９８５９４）と命名し；その
ＤＮＡ及び誘導されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番
号９及び６３として配列表に示される。この構築された
抗体の配列特徴は、配列番号６３についての情報セクシ
ョンに与えられる。
【０１８６】新規の一本鎖構造体が親分子の結合性質を
保持することを確かめるために、５１０９ｓｃＦｖを、
Ｅ．コリにおいて発現し、そして精製した。１００μｇ
／mlのアンピシリン及び２％グルコースを含む２ＹＴ開
始培地（５０ml）を、−８０℃のグリセロールストック
５０μｌにより接種した。培養物を３０℃で、３００rp
m で、振盪しながらインキュベートした。１００μｇ／
mlのアンピシリン及び０．１％グルコースにより補充さ
れた２ＹＴ培地を含む６個の２ｌフラスコの個々を、前
記一晩の開始培養物５mlにより接種した。培養物を、濁
るまで３０℃でインキュベートし、そして続いて、１mM
の最終濃度までＩＰＴＧイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（Boehringer Maunheim)を添加すること
によって誘発した。培養物を、ｓｃＦｖの生成のために
さらに４時間、増殖せしめた。細胞を５０００xgで１０
分間、遠心分離した。細胞ペレットを、処理するまで、
−２０℃で貯蔵した。
【０１８７】ｓｃＦｖ精製のために、細胞ペレットを、
ＴＥＳ（０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ，０．５mMのＥＤＴ
Ａ，０．５Ｍのスクロース）に再懸濁した。再懸濁に続
いて、プロテアーゼインヒビター（Complete Protease
Inhibitor Cocktail, Boehringer Mannheim)を含む上記
ＴＥＳ緩衝液の１：５希釈溶液を添加した。この調製物
を４℃で３０分間、インキュベートせしめた。インキュ
ベーションに続いて、細胞を１２，０００xgで１５分
間、ペレット化した。ＭｇＣｌ2 をその上清液に添加
し、５mMの最終濃度にした。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース
（ＱＩＡｇｅｎ）を、３００mMのＮａＣｌ，１５mMのイ
ミダゾール、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，pH７．４を含
むＰＢＳにより１度洗浄した。
【０１８８】次に、洗浄されたアガロースを添加し、そ
してそのスラリーを４℃で３０分間インキュベートし
た。次に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ及びｓｃＦｖ
を、前記のようにして４度洗浄した。次に、ｓｃＦｖ
を、２５０mMのイミダゾールを含む洗浄緩衝液により溶
出した。その溶出物をＮＡＰ−２５カラム（Pharmacia-
Biotech, Uppsala, Sweden）上で脱塩し、そしてCentri
prep濃縮装置（Amicon, Beverly, MA)を用いて濃縮し
た。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動にかけ、そ
して銀染色により可視化した。ｐ５１０９ＣｓｃＦｖ７
（Ｃｙｓ）及びｐ５１０９ＳｓｃＦｖＡ９（Ｓｅｒ）に
ついてのその得られたｓｃＦｖ生成物は、それぞれ、約
１５％及び７５％の純度であった。
【０１８９】Origenの方法論（Technical manual, Orig
en Instrument, Igen Corporation,Gaithersburg, MD)
を用いて、５１０９ｓｃＦｖ種によるビオチニル化され
たペプチド２２５（配列番号６４として配列表に示され
る配列を有する）への結合性を測定した。ペプチド２２
５は、Ａｎａｓｐｅｃにより調製された。ペプチド２２
５を、８００μｇ／mlのストレプトアビジン被覆された
磁気ビーズ（Dynabeads, Igen, Gathersburg, MD）に添
加し、その最終濃度を１０nMにし、そして１５分間イン
キュベートした。新規の遺伝子操作されたｓｃＦｖ抗体
を、ペプチド／ビース溶液に３０分間、振盪しながら添
加した。
【０１９０】９Ｅ１０抗−ｍｙｃ標識ルテニル化ＭＡｂ
を、２００μｌのＩｇｅｎアッセイ緩衝液（Igen, Gait
hersburg, MD）に添加し、そしてＥＣＬシグナルをOrig
en Instrument (Igen)上で読み取った。ＭＡｂ ９Ｅ１
０を生成し、そしてＡＴＣＣから得られた９Ｅ１０細胞
系から精製した。ＭＡｂを、Ｎ−ヒドロキシスクシンア
ミド誘導体Origen TAG-NHS Ester（Igen）を用いて、製
造業者の説明書に従ってルテニル化した。５１０９ｓｃ
Ｆｖの不存下で、２９９５ＥＣＬ単位のバックグラウン
ドシグナルを得た。
【０１９１】５１０９ｓｃＦｖ Ｃｙｓ構造体（ｐ５１
０９ＣｓｃＦｖ７）の添加は、５３６，９９７ＥＣＬ単
位をもたらした。Ｓｅｒ構造体（ｐ５１０９ＳｓｃＦｖ
Ａ９）の添加は、６９４，２５３ＥＣＬ単位をもたらし
た。それらの結果は、両５１０９ｓｃＦｖが生物学的に
活性であり、そしてＭＡｂ５１０９と同じコラーゲン関
連ペプチドフラグメントに結合されることを示す。ｐ５
１０９ＣｓｃＦｖＡ９を含むＥ．コリの培養物を、ＡＴ
ＣＣ−９８５９４としてアメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクションに寄託した。
【０１９２】Ｏｒｉｇｅｎ技法により決定された特異性
データは、上記５１０９ＶL 及びＶ H ドメインを含む構
築された抗体が、上記例３及び４に記載される定量測定
アッセイにそれを用いるための所望する特徴を有するこ
とを示す。従って、親５１０９抗体の親和性及び特異性
を有する、本明細書に開示される５１０９ＶL 及びＶ H
のいくらか又はすべてを含んで成る他の構築された抗体
は、本発明の請求の範囲にあると思われる。
【０１９３】９Ａ４及び５１０９ＶL 及びＶH ドメイン
の組合せを含んで成る構築された抗体、たとえば５１０
９ＶL −リンカー−５１０９ＶH −リンカー−９Ａ４Ｖ
L −リンカー−９Ａ４ＶH −Ｔａｇの二元特異的ｓｃＦ
ｖダイマーはまた、上記例３及び４における唯一の抗体
試薬として有用であることがまた注目されるべきであ
る。その差異は、単一の二元特異的試薬が、９Ａ４及び
５１０９を別々に用いることによりもむしろ一段階ＥＬ
ＩＳＡに使用され得ることであろう。当業者にとって、
本発明の抗体の可変ドメインを含んで成る多くの遺伝的
組成物が、種々の二元特異的分子を製造するために連結
して使用され、そして従って、例３及び４に示されるア
ッセイを単純にすることは明らかである。そのような分
子の結合活性により、アッセイの全体の感度がまた、有
意に改良され得る。
【０１９４】例８．本発明の抗体に関連する抗体のアミ
ノ酸配列における突然変異又は差異は、親抗体の結合性
質（親和性及び特異性）及び従って有用性を保持するこ
とができる。これは、９Ａ４ ＶH のＣＤＲ３における
一連の変異体の生成により下記に示される。当業者にと
って、９Ａ４及び５１０９の両者の同じ生殖系ＶL 及び
ＶH遺伝子の他の領域における他の突然変異が、本発明
に開示される元の抗体に対して同じか又は良好な結合性
質の抗体を付与することができることは明らかである。
【０１９５】９Ａ４ ＶＨ ＣＤＲ３領域変異体の生成 上記例６に示されるｐ９Ａ４ＩＣＡＴ７−１と称する、
９Ａ４ ｓｃＦｖのｐＣＡＮＴＡＢ６誘導体を、ＣＤＲ
３セグメント及びそのＣＤＲ３に密接に隣接するVernie
r 残基における変異体を生成するために、開始材料とし
て使用した。突然変異のために標的化されるＣＤＲ３
ＶH 領域の親ＤＮＡ配列は、配列番号７のヌクレオチド
３８３〜４０９を含んで成る。それらのヌクレオチドに
対応する誘導されたアミノ酸は、配列番号４０の残基９
７〜１０５である。ＣＤＲ３は残基９９で始まり、そし
て１０４で終結する。
【０１９６】この領域においてランダム突然変異を導入
するために、ＶH 及びＶL 領域を、２回のＰＣＲにより
別々に増幅した。最初のＰＣＲにおいては、オリゴヌク
レオチド（Oligos Etc. から得られた）ｐＵＣ１９Ｒ
（配列番号３９）、及び９Ａ４ＭＵＴ（配列番号６５と
して配列表に示される）を用いて、ＶH 部分を増幅し、
ここで９Ａ４ＭＵＴは突然変異を導入したオリゴヌクレ
オチドであった。
【０１９７】９Ａ４ＭＵＴ（配列番号６５）におけるヌ
クレオチド２５〜５１は、１０％スパイクされた。換言
すれば、書かれたような配列は、個々の位置２５〜５１
で付加されたヌクレオチドの９０％を占め、そして個々
の位置２５〜５１における他の３種のヌクレオチドは、
それぞれ３．３％で、成長するオリゴヌクレオチド鎖に
導入された。これは、オリゴヌクレオチド合成の分野に
おいて良く知られている方法により達成された。
【０１９８】ランダムヌクレオチドは実際、定義された
領域に導入された事実が下記に論ぜられるであろう。第
２ＰＣＲは、２種のオリゴヌクレオチド（Oligos Etc.
からまた得られた）９Ａ４Ｌ５（配列番号６６）及びＦ
ＤＴＥＴＳＥＱ（配列番号４１）を用いた。これは、
３′末端でｐ９Ａ４ＩＣＡＴ７−１におけるＮｏｔＩ部
位までのリンカーＶL 部分、及び最初のＰＣＲからの突
然変異誘発されたＶH ＰＣＲ生成物との続くアニーリン
グ及びアセンブリーを可能にする、５′末端でＶ H 中に
オーバーラップする部分を生成した。
【０１９９】ＰＣＲは次の通りに設定された。変異体Ｖ
H のためには、それぞれ５０ｐモルのオリゴヌクレオチ
ドｐＵＣ１９Ｒ（配列番号３９）及び９Ａ４ＭＵＴ（配
列番号６５）を、１００μｌの反応に使用した。鋳型Ｄ
ＮＡ標的物は、ＳＮＡＰ（Invitrogen）精製されたプラ
スミドＤＮＡ−ｐ９Ａ４ＩＣＡＴ７−１のアリコートで
あった。Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）が、３０
サイクルのＰＣＲに使用された。変性、アニーリング及
びポリメラーゼ反応時間及び温度は、それぞれ、９４℃
で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間であっ
た。
【０２００】３０回目のサイクルに関しては、重合反応
が、反応を４℃に冷却する前、合計１０分間、延長され
た。ＶH 種とオーバーラップするＶL に関しては、ＰＣ
Ｒは、Klen Taqポリメラーゼ（Clontech）及びＴａｑポ
リメラーゼ（Perkin Elmer）の両者を用いて設定され
た。ＤＮＡ生成物を、ＱＩＡｇｅｎゲル抽出キットによ
り精製した。突然変異誘発されたＶH 及びＶL のための
ＰＣＲアセンブリー反応は、それぞれ精製されたＰＣＲ
生成物のアリコート（１〜２μｌ）を用いて、合計２５
サイクル行なわれ、ここで２回の温度サイクル、すなわ
ち９４℃で１分間、６５℃で４分間、及び最後に４℃で
の維持が存在した。オリゴヌクレオチドはこの段階のた
めには使用されなかった。
【０２０１】突然変異誘発された９Ａ４アセンブリーの
ＰＣＲ通過のためには、５μｌの精製されていないアセ
ンブリー反応を、鋳型として、及びオリゴヌクレオチド
ｐＵＣ１９Ｒ（配列番号３９）及びＦＤＴＥＴＳＥＱ
（配列番号４１）をアニーリングプライマーとして使用
した。正しいサイズの生成物が約９００bpで観察され、
そしてＱＩＡｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製され
た。突然変異誘発された９Ａ４ ｓｃＦｖ挿入体をＳｆ
ｉＩ及びＮｏｔＩにより処理し、同じ制限酵素により切
断されたｐＣＡＮＴＡＢ６ベクターＤＮＡとの連結のた
めに調製した。連結の後、ＤＮＡ混合物をエタノール沈
殿せしめ、そして２４μｌの脱イオン化された滅菌蒸留
水に溶解した。コンピテントＥ．コリＴＧ１細胞の調製
及びエレクトロポレーションを、例６に記載されるよう
にして行なった。
【０２０２】１２回の別々のエレクトロポレーションを
実施し、そして最後にプールし、そしてプレートした。
合計１．５×１０6 個のクローンを得、そしてグリセロ
ールストックとして−８０℃で貯蔵した。１２のクロー
ンのランダムサンプリングは、それらのクローン（１つ
のクローンは配列データを付与しなかった）のうち９つ
のクローンが、オリゴヌクレオチドＦＤＴＥＴＳＥＱ
（配列番号４１）及びｐＵＣ１９Ｒ（配列番号３９）を
用いてＰＣＲによりスクリーンされる場合、挿入体を有
することを示した。それらの挿入体をＱＩＡｇｅｎキッ
トを用いて精製し、そしてＣＤＲ３ＶH における配列を
決定した。その配列決定データの結果は下記に示され
る。“親配列”のＤＮＡ配列は、配列番号７のヌクレオ
チド３８３〜４０９として配列表に示される。
【０２０３】
【表１６】
【０２０４】上記コホートにおける突然変異は、個々の
クローンに関して１〜６の数で変化し、そしてそれらは
種々の位置で生じる。突然変異は、Ｎ（＝ヌクレオチド
は割り当てられ得なかった）以上の種々のクローンにお
いて太字の下線で示されている。このランダム態様で調
べられた８個のクローンのうちわずか１つのクローン
（９Ａ４ＭＵＴ−１２）が、親アミノ酸配列を付与し
た。上記に示される結果のランダム性に基づいて、良好
な突然変異誘発されたライブラリーを生成した。従っ
て、ビオチン選択が、９Ａ４のためのエピトープである
ペプチド０４０（配列番号１４）に対する結合体を見出
すために実施された。
【０２０５】下記で得られる抗体についてのビオチン選
択の説明 約１００μｌの突然変異誘発されたライブラリーストッ
クのアリコートを、１００μｇ／mlのアンピシリン及び
２％グルコースを含む２ＹＴ培地２５mlに添加した。そ
の培養物を、３７℃で約６０分間、又は細胞が中間対数
値（ＯＤ600nm＝０．５〜１．０）に達するまでインキ
ュベートした。次に、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ
（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を前記培養物に添加
し、５×１０ 8pfu／mlの濃度にした。次に、ヘルパーフ
ァージを用いて、３７℃で２０分間、振盪しないで、及
び次に、３７℃でさらに２５分間、２００rpm で振盪し
て培養物を感染せしめた。
【０２０６】感染された細胞を、５０mlの円錐形遠心分
離管に移し、そして３０００rpm で１０分間、ペレット
化した。細胞を、１００μｇ／mlのアンピシリン及び５
０μｇ／mlのカナマイシンを含む２ＹＴ培地に再懸濁し
た。この培養物を新しい２５０mlのフラスコに移し、そ
して３０℃で２時間インキュベートし、この間、ファー
ジ粒子が生成された。細胞を、１４，０００rpm で２分
間の遠心分離により除去した。次に、ファージのアリコ
ート（１ml）を、ＰＢＳ及びＮＦＤＭを、１×ＰＢＳ及
び３％ＮＦＤＭの最終濃度まで添加することによって、
室温で３０分ブロックした。これは、１mlのファージ
に、６×ＰＢＳ，１８％ＮＦＤＭの溶液２００μｌを添
加することによって達成された。ビオチニル化されたペ
プチド０４０（配列番号１４）を、１０ｐＭ〜１μＭの
濃度範囲でファージ溶液に添加した。
【０２０７】その溶液をＲＴで６０分間インキュベート
した。ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ（Dyna
l, Oslo, Norway)を、ＰＢＳ中、３％ＮＦＤＭにおい
て、ずっと振盪しながら、ＲＴでブロックした。インキ
ュベーションに続いて、ストレプトアビジンビーズを磁
石により管の側面で捕獲し、そしてブロック溶液を注意
して吸い出した。次に、結合したペプチドを有するブロ
ックされたファージを、ストレプトアビジンビーズに添
加し、そして１５分間、ずっと振盪しながら、ＲＴでイ
ンキュベートした。ビーズ複合体を磁気的に捕獲し、そ
して結合されなかったファージを注意して吸い出した。
【０２０８】磁結合されたビーズ複合体を、０．１％Ｔ
Ｗ−２０を含むＰＢＳにより４度及びＰＢＳのみで４
度、洗浄した。最終捕獲に続いて、ビーズ複合体を、Ｐ
ＢＳ中、１００mMのトリエチルアミン溶液１００μｌに
再懸濁し、そして等体積の１Ｍのトリス（pH７．４）に
より中和した。次に、中間一対数相のＥ．コリＴＧ１細
胞（１０ml）を、１００μｌのビーズ複合体により感染
せしめた。感染を、３７℃で２０分間、振盪しないで、
及び次に、３７℃でさらに２５分間、２００rpmで振盪
しながら進行せしめた。
【０２０９】次に、感染された細胞をペレット化し、新
しい２ＹＴ培地５００μｌに再懸濁し、そして１００μ
ｇ／mlのアンピシリン及び２％グルコースを含む２４３
×２４３mmの２ＹＴ寒天プレート上にプレートした。プ
レートを３０℃で一晩インキュベートした。約１６時間
の増殖に続いて、コロニーを剥ぎ取ることにより回収
し、そして液体培養物を接種するために使用した。前記
工程を最少２回及び最大５回の選択のためにくり返し
た。ビオチン選択から回収されたクローンを増殖せし
め、ｓｃＦｖの生成のために誘発され、前記ｓｃＦｖを
下記に概略されているプロトコールに従って精製した。
【０２１０】低張ショック法を用いてのｓｃＦｖ変異体
クローンの調製 培養物をペレット化し、そして０．８mlの氷冷却された
ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ，０．５nMの
ＥＤＴＡ，０．５Ｍのスクロース）に再懸濁した。ＴＥ
Ｓ（１．２mlの氷冷却された１：５の希釈溶液）を添加
し、そして培養物を氷上で３０分間インキュベートし
た。細胞を４℃で１４，０００rpm （３０分間）でペレ
ット化した。ｓｃＦｖ上清液を、１０μｌの１．０Ｍの
ＭｇＣｌ2を含む新しい管に添加した。２００μｌのＮ
ＴＡ−アガロース（ＱＩＡｇｅｎ）を、５０mMのリン酸
ナトリウム、pH＝８．０，５００mMのＮａＣｌ，２０mM
のイミダゾール及び０．１％ＴＷ−２０を含むリン酸イ
ミダゾール洗浄緩衝液中で洗浄することによって調製し
た。
【０２１１】ｓｃＦｖ上清液を、ＮＴＡ−アガロースに
添加し、そして４℃で約３０分間インキュベートした。
ｓｃＦｖを含むＮＴＡ−アガロースを回転せしめ、そし
て溶出緩衝液５００体積を添加した。前記溶出緩衝液
は、５０mMのリン酸ナトリウム、pH８．０，５００mMの
ＮａＣｌ及び２５０mMのイミダゾールから成った。溶出
物を回転せしめ、そして遠心分離し、ＮＴＡ−アガロー
スを除去した。ｓｃＦｖ上清液を、それをＮＡＰ−５カ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、製造業者の説明書に
従って通すことによって緩衝液交換した。ｓｃＦｖ構造
体に関してのオフ−レートの測定。
【０２１２】ｓｃＦｖ構造体についてのオフ−レート
を、BIAeraluation バージョン２．１ソフトウェアによ
る、BIAcore (Pharmacia Biosensor）上で得られた解離
データの分析により測定した。ＢＩＡｃｏｒｅに基づく
データを得るために、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上のストレ
プトアビジン表面を、例１に記載のようにして調製し
た。ビオチニル化されたペプチド（配列番号１４）を、
約２〜１１ＲＵ／表面の範囲のＲＵ密度にするよう、調
製されたストレプトアビジン表面に結合せしめた。より
低いレベルの誘導体化は、多量の輸送物が流出物である
場合に得られる誤ったオフ−レートを得ることの回避を
助けるであろう。精製されたｓｃＦｖを、６０秒間、構
造体の結合を可能にするためにそれらの表面上に注入し
た。次に、ＰＢＳ緩衝液のみを交換し、そしてｓｃＦｖ
の解離を、さらに２８０秒間、進行せしめた。オフ−レ
ートを、それらの解離データから計算した。
【０２１３】
【表１７】 注：クローンＩＣＡＴ７−１及びＩＦ−５は、親配列を
有するＣＤＲ３領域を示す。変更が、標的物の結合を保
持しながら、親抗体のアミノ酸配列において行なわれ得
ることは、上記データから明らかである。上記抗体のオ
フ−レーンの差異は大きさの程度内であるが、突然変異
のための抗体ＶH 又はＶL の異なった領域を標的化し、
又は９Ａ４又は５１０９と同じ生殖系ＶL 及びＶH 遺伝
子に由来するＶL 及び／又はＶH ドメインを有する、免
疫化により得られた異なった抗体を見出すことによっ
て、上記例６及び７に開示される親抗体に関して種々の
又は増強された結合性質を有する抗体を発見することが
できる。
【０２１４】
【配列表】
（１）一般情報： （iii)配列の数：６６ （２）配列１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２１５】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：３ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである
【０２１６】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２１７】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：３ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである
【０２１８】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４０８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物名：Ｍｕｓ ｍｕｓｃａｒｉｓ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：シグナルペプチド （Ｂ）位置：−１１〜−１ （Ｃ）同定法：他の免疫グロブリンシグナル配列に類似
する、疎水性 （Ｄ）他の情報：免疫グロブリン９Ａ４ ＶH 領域 （xi）配列：配列番号５： TTC CTG ATG GCA GCT GCC CAA AGT ATC CAA GCA CAG ATC CAG TTG GTG 48 Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG TCT GGT CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC 96 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser 10 15 20 TGC AAG GCT TCT GGT TAT ACC TTC ACA GAC TAT TCA ATA CAC TGG GTG 144 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val 25 30 35 AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACT 192 Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 40 45 50 GAG ACT GGT GAG CCA ACA TAT GCA GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC 240 Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala 55 60 65 TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC 288 Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn 70 75 80 85 CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCT AGG GGC GGT AGC 336 Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser 90 95 100 CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC AAA 384 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys 105 110 115 ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA 408 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 120 125
【０２１９】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物名：Ｍｕｓ ｍｕｓｃａｒｉｓ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：シグナル配列 （Ｂ）位置：−７〜−１ （Ｃ）同定法：他の免疫グロブリンシグナル配列に類似
する、疎水性 （Ｄ）他の情報：免疫グロブリン９Ａ４ ＶL 領域 （xi）配列：配列番号６： CC TCA GTC ATA CTG TCC AGA GGA 23 Ser Val Ile Leu Ser Arg Gly -5 CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GTA TTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG 71 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG 119 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT CAT 167 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile His 35 40 45 GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC GGT 215 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Gly 50 55 60 GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA 263 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGA AGT TAT ACA CGG ACG 311 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Tyr Thr Arg Thr 85 90 95 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC ATA CGG GCT GAT GCT GCA CCA 359 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110
【０２２０】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８８３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：シグナル配列 （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：他のシグナル配列に類似する、疎水性 （xi）配列：配列番号７： AAGCTTTGGA 10 GCCTTGGAGA TTTTCAAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT 61 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val -20 -15 GTT CCT TTT TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG ATC CAG TTG GTG 109 Val Pro Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ile Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG TCT GGT CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC 157 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser 10 15 20 TGC AAG GCT TCT GGT TAT ACC TTC ACA GAC TAT TCA ATA CAC TGG GTG 205 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val 25 30 35 AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACT 253 Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 40 45 50 GAG ACT GGT GAG CCA ACA TAT GCA GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC 301 Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala 55 60 65 TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC 349 Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn 70 75 80 85 CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCT AGG GGC GGT AGC 397 Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser 90 95 100 CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GGT GGA 445 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly 105 110 115 GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGA TCG CAA ATT GTT 493 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val 120 125 130 CTC ACC CAG TCT CCA GTA TTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC 541 Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val 135 140 145 ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC 589 Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr 150 155 160 165 CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT CAT GCC ACA TCC 637 Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile His Ala Thr Ser 170 175 180 AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC GGT GGG TCT GGG 685 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly 185 190 195 ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC 733 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala 100 205 210 ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGA AGT TAT ACA CGG ACG TTC GGT GGA 781 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Tyr Thr Arg Thr Phe Gly Gly 215 220 225 GGC ACC AAG CTG GAA ATC ATA GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC 829 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile Ala Ala Ala His His His His His His 230 235 240 245 GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC 877 Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 250 255 260 GCA TAG 883 Ala
【０２２１】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３４０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：シグナル配列 （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：他のシグナル配列に類似する、疎水性 （xi）配列：配列番号８： CTCATGTTTG ACAGCTTATC ATCGATGAAT TCCATCACTT CCCTCCGTTC ATTTGTCCCC 60 GGTGGAAACG AGGTCATCAT TTCCTTCCGA AAAAACGGTT GCATTTAAAT CTTACATATA 120 TAATACTTTC AAAGACTACA TTTGTAAGAT TTGATGTTTG AGTCGGCTGA AAGATCGTAC 180 GTACCAATTA TTGTTTCGTG ATTGTTCAAG CCATAACACT GTAGGGATAG TGGAAAGAGT 240 GCTTCATCTG GTTACGATCA ATCAAATATT CAAACGGAGG GAGACGATTT TG ATG AAA 298 Met Lys TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA 346 Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln -20 -15 -10 -5 CCA GCC ATG GCC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GTA TTC ATG TCT 394 Pro Ala Met Ala Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Met Ser 1 5 10 GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT 442 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser 15 20 25 GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA 490 Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg 30 35 40 CTC CTG ATT CAT GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC 538 Leu Leu Ile His Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 45 50 55 60 TTC AGT GGC GGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA 586 Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 65 70 75 ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGA AGT 634 Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser 80 85 90 TAT ACA CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC ATA CTT AGT 682 Tyr Thr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile Leu Ser 95 100 105 GCG GAC GAT GCG AAA AAG GAT GCT GCG AAG AAG GAT GAC GCT AAG AAA 730 Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys 110 115 120 GAC GAT GCT AAA AAG GAC CTC GAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGT CCT 778 Asp Asp Ala Lys Lys Asp Leu Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 125 130 135 140 GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT 826 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 145 150 155 GGT TAT ACC TTC ACA GAC TAT TCA ATA CAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA 874 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro 160 165 170 GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACT GAG ACT GGT GAG 922 Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu 175 180 185 CCA ACA TAT GCA GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA 970 Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu 190 195 200 ACC TCT GCC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG 1018 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu 205 210 215 220 GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCT AGG GGC GGT AGC CTT GAC TAC TGG 1066 Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser Leu Asp Tyr Trp 225 230 235 GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCT AGC GAC TAC AAG GAC 1114 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Lys Asp 240 245 250 GAT GAT GAC AAA TAAAAACCTA GCGATGAATC CGTCAAAACA TCATCTTACA 1166 Asp Asp Asp Lys 255 TAAAGTCACT TGGTGATCAA GCTCATATCA TTGTCCGGCA ATGGTGTGGG CTTTTTTTGT 1226 TTTCTATCTT TAAAGATCAT GTGAAGAAAA ACGGGAAAAT CGGTCTGCGG GAAAGGACCG 1286 GGTTTTTGTC GAAATCATAG GCGAATGGGT TGGATTGTGA CAAAATTCGG ATCC 1340
【０２２２】（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９０７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：シグナル配列 （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：他のシグナル配列に類似する、疎水性 （xi）配列：配列番号９： AAGCTTTGGA 10 GCCTTGGAGA TTTTCAAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT 61 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val -20 -15 GTT CCT TTT TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAA GTG CAG CTG GTG 109 Val Pro Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val -10 -5 1 5 GAG TCT GGG GGA GGC TCA GTG CAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC 157 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 10 15 20 TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AAT ACC TAC GGC ATG TCT TGG GTT 205 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val 25 30 35 CGC CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AAT AGT 253 Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser 40 45 50 AAT GGT GGT CTC ACC TTT TAT GCA GAC AGT GTG AAG GGC CGA TTC ACC 301 Asn Gly Gly Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 55 60 65 ATT TCC AGA GAC AAT GCC AAA AAC ACC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGG 349 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg 70 75 80 85 CTG AAG TCT GGG GAC TCA GGC ATG TAT TAC TGT GTA AGA GGA TAT AGT 397 Leu Lys Ser Gly Asp Ser Gly Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Tyr Ser 90 95 100 AAT TAC GCT CGC TGG GGC CAA GGG GCG CTG GTC ACT GTC TCG AGT GGT 445 Asn Tyr Ala Arg Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 105 110 115 GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAT 493 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp 120 125 130 GTT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC ACT TTG TCG GTT ACC ATT GGA CAA 541 Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln 135 140 145 TCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC TTA GGT AGT GAT 589 Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gly Ser Asp 150 155 160 165 GGA TTG ACA TAT TTG ATT TGG TTG TTG CAG AGG CCA GGC CAG TCT CCA 637 Gly Leu Thr Tyr Leu Ile Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro 170 175 180 AAG CGC CTA ATC TTT CTG GTG TCT GAA TTG GAC TCT GGA GTC CCT GAC 685 Lys Arg Leu Ile Phe Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp 185 190 195 AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC 733 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 200 205 210 AGA GCG GAG GCT GAA GAT TTG GGA GTT TAT TAT TGC TGC CAA GGT ACA 781 Arg Ala Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly Thr 215 220 225 CAT TTT CCT CAC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA GCG 829 His Phe Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala 230 235 240 245 GCC GCA GAA CTA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA 877 Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Ala Ala 250 255 260 CAT CAC CAC CAT CAC CAT TAATAAGAAT TC 907 His His His His His His 265
【０２２３】（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３４８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：モノクローナル抗体５１０９ＶH （Ｂ）位置：１〜１１６ （xi）配列：配列番号１０： GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TCA GTG CAG CCT GGA GGG 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AAT ACC TAC 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 GGC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC 114 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCA ACC ATT AAT AGT AAT GGT GGT CTC ACC TTT TAT GCA GAC AGT GTG 192 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATT TCC AGA GAC AAT GCC AAA AAC ACC CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC AGG CTG AAG TCT GGG GAC TCA GGC ATG TAT TAC TGT 288 Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Ser Gly Asp Ser Gly Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 GTA AGA GGA TAT AGT AAT TAC GCT CGC TGG GGC CAA GGG GCG CTG GTC 336 Val Arg Gly Tyr Ser Asn Tyr Ala Arg Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val 100 105 110 ACT GTC TCT GCA 348 Thr Val Ser Ala 115
【０２２４】（２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iv）特徴： （Ａ）名称／キー：モノクローナル抗体５１０９ＶL （Ｂ）位置：１〜１１２ （xi）配列：配列番号１１： GAT GTT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC ACT TTG TCG GTT ACC ATT GGA 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 CAA TCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC TTA GGT AGT 96 Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gly Ser 20 25 30 GAT GGA TTG ACA TAT TTG ATT TGG TTG TTG CAG AGG CCA GGC CAG TCT 144 Asp Gly Leu Thr Tyr Leu Ile Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 CCA AAG CGC CTA ATC TTT CTG GTG TCT GAA TTG GAC TCT GGA GTC CCT 192 Pro Lys Arg Leu Ile Phe Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 AGC AGA GTG GAG GCT GAA GAT TTG GGA GTT TAT TAT TGC TGC CAA GGT 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly 85 90 95 ACA CAT TTT CCT CAC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA 336 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110
【０２２５】（２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：２ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：８ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：１１ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （xi）配列：配列番号１２： Ala Xaa Gly Glu Asp Gly Arg Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro 1 5 10
【０２２６】（２）配列番号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：９ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：１５ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：１８ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （xi）配列：配列番号１３： Gly Lys Val Gly Pro Ser Gly Ala Xaa Gly Glu Asp Gly Arg Xaa Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro 20
【０２２７】（２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２２８】（２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：３ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：切断部位 （Ｂ）位置：７ （Ｄ）他の情報：コラゲナーゼは残基７のＣＯＯＨ側上
で切断する
【０２２９】（２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２３０】（２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２３１】（２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２３２】（２）配列番号１９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０２３３】（２）配列番号２０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号２０： Gly Glu Pro Gly Asp Asp Gly Pro Ser Gly Ala Glu Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gln Gly
【０２３４】（２）配列番号２１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２１： GGTGAAGTTG ATGTCTTGTG 20
【０２３５】（２）配列番号２２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２２： GACCTTGCAT TTGAACTCCT TGC 23
【０２３６】（２）配列番号２３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２３： GGCTGTGGAA CTTGCTATTC 20
【０２３７】（２）配列番号２４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２４： GGGTGTGGAC CTTGCCATTC 20
【０２３８】（２）配列番号２５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２５： GGGTGTGGAC CTTGCTATTC 20
【０２３９】（２）配列番号２６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２６： GGSTGTGGAM CTTGCYATTC 20
【０２４０】（２）配列番号２７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２７： GCTTCCTGCT AATCAKTG 18
【０２４１】（２）配列番号２８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２８： GGCAGCAGAT CCAGGGGCCA G 21
【０２４２】（２）配列番号２９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２９： GGGAAAGCTT GTTAACTGCT CACTGGATGG TGG 33
【０２４３】（２）配列番号３０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３０： CTATTGCCTA CGGCAGCCGC TG 22
【０２４４】（２）配列番号３１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３１： CACATGATCT TTAAAGATAG 20
【０２４５】（２）配列番号３２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３６個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶH シグナルペプチドの部
分 （Ｂ）位置：−１１〜−１ （Ｃ）同定法：他のネズミ免疫グロブリンとの比較 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質９Ａ４ ＶH （Ｂ）位置：１〜１１５ （Ｃ）同定法：アミノ末端配列決定、他のネズミ免疫グ
ロブリンとの比較 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ネズミＩｇＧ１ ＣH １ドメインの
開始 （Ｂ）位置：１１６〜１２５ （Ｃ）同定法：他のネズミＩｇＧ１免疫グロブリンとの
比較 （xi）配列：配列番号３２： Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val -10 -5 1 5 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser 10 15 20 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val 25 30 35 Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 40 45 50 Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala 55 60 65 Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn 70 75 80 85 Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser 90 95 100 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys 105 110 115 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 120 125
【０２４６】（２）配列番号３３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶL シグナルペプチドの部
分 （Ｂ）位置：−７〜−１ （Ｃ）同定法：他のネズミ免疫グロブリンとの比較 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質９Ａ４ ＶL （Ｂ）位置：１〜１０６ （Ｃ）同定法：アミノ末端配列決定、他のネズミ免疫グ
ロブリンとの比較 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ネズミＬ鎖不変カッパドメインの開
始 （Ｂ）位置：１０７〜１１２ （Ｃ）同定法：他のネズミカッパＬ鎖免疫グロブリンと
の比較 （xi）配列：配列番号３３： Ser Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val -5 1 5 Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 10 15 20 25 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser 30 35 40 Ser Pro Arg Leu Leu Ile His Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 45 50 55 Pro Val Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 60 65 70 Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 80 85 Trp Arg Ser Tyr Thr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 90 95 100 105 Ile Arg Ala Asp Ala Ala Pro 110
【０２４７】（２）配列番号３４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３４： GAGGAGGCCC AGCCGGCCAT GGCCCAGATC CAGTTGGTGC AGTCTGG 47
【０２４８】（２）配列番号３５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３５： GCCGCTGCCA CCTCCGCCTG AACCGCCTCC ACCACTCGAG ACTGTGAGAG TGGTGCCTTG 60 G 61
【０２４９】（２）配列番号３６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３６： GGTTCAGGCG GAGGTGGCAG CGGCGGTGGC GGATCGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTC 56
【０２５０】（２）配列番号３７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３７： GAAGGACGCC GGCGTATGAT TTCCAGCTTG GTGCCTCC 38
【０２５１】（２）配列番号３８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３８： AAGAAGCGGC CGCTATGATT TCCAGCTTGG TGCCTC 36
【０２５２】（２）配列番号３９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３９： AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 23
【０２５３】（２）配列番号４０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８４個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ｐＣＡＮＴＡＢ６シグナルペプチド （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：疎水性 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質９Ａ４ ｓｃＦｖ，
ＶH −リンカー−Ｖ L −標識 （Ｂ）位置：１〜２６２ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶH （Ｂ）位置：１〜１１５ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：（Ｇｌｙ4 ，Ｓｅｒ）3 リンカー （Ｂ）位置：１１６〜１３０ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶL （Ｂ）位置：１３１〜２３６ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：Ｈｉｓ ｔａｇ （Ｂ）位置：２４０〜２４５ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ｍｙｃ ｔａｇ （Ｂ）位置：２４９〜２５８ （xi）配列：配列番号４０： Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala -20 -15 -10 Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu -5 1 5 10 Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly 30 35 40 Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 45 50 55 Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr 60 65 70 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp 75 80 85 90 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 110 115 120 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 125 130 135 Val Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser 140 145 150 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 155 160 165 170 Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile His Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 175 180 185 Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 190 195 200 Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 205 210 215 Gln Trp Arg Ser Tyr Thr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 220 225 230 Ile Ile Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln 235 240 245 250 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 255 260
【０２５４】（２）配列番号４１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４１： GTCGTCTTTC CAGACGTTAG T 21
【０２５５】（２）配列番号４２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号４２： Leu Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 5 10 15 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Leu 20 25
【０２５６】（２）配列番号４３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４３： GAGGAGCCAT GGCCCAAATT GTTCTCACCC AGTC 34
【０２５７】（２）配列番号４４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４４： CTTTCTTAGC GTCATCCTTC TTCGCAGCAT CCTTTTTCGC ATCGTCCGCA CTAAGCTTGA 60 TTTCCAGCTT GGTGCCTCC 79
【０２５８】（２）配列番号４５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４５： CTGCGAAGAA GGATGACGCT AAGAAAGACG ATGCTAAAAA GGACCTCGAG ATCCAGTTGG 60 TGCAGTCTGG 70
【０２５９】（２）配列番号４６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４６： GAGGAAGCTA GCTGAGGAGA CTGTGAGAGT GGTGCC 36
【０２６０】（２）配列番号４７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７８個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ｐＡＴＤＦＬＡＧシグナルペプチド
（ｐｅｌ Ｂ） （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：疎水性 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質９Ａ４ ｓｃＦｖ，
ＶL −リンカー−Ｖ H −ＦＬＡＧ標識 （Ｂ）位置：１〜２５６ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶL （Ｂ）位置：１〜１０６ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：２０５Ｃリンカー （Ｂ）位置：１０７〜１３１ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：９Ａ４ ＶH （Ｂ）位置：１３２〜２４６ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ＦＬＡＧ標識 （Ｂ）位置：２４９〜２５６ （xi）配列：配列番号４７： Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala -20 -15 -10 Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe -5 1 5 10 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 15 20 25 Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 30 35 40 Pro Arg Leu Leu Ile His Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 45 50 55 Val Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 60 65 70 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 75 80 85 90 Arg Ser Tyr Thr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile 95 100 105 Leu Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 110 115 120 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Leu Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser 125 130 135 Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 140 145 150 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln 155 160 165 170 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr 175 180 185 Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser 190 195 200 Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys 205 210 215 Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser Leu Asp 220 225 230 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr 235 240 245 250 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 255
【０２６１】（２）配列番号４８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１６個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質５１０９ ＶH （Ｂ）位置：１〜１１６ （xi）配列：配列番号４８： Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Ser Gly Asp Ser Gly Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Tyr Ser Asn Tyr Ala Arg Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115
【０２６２】（２）配列番号４９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質５１０９ ＶL （Ｂ）位置：１〜１１２ （xi）配列：配列番号４９： Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Leu Thr Tyr Leu Ile Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Phe Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110
【０２６３】（２）配列番号５０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５０： GAAGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGG 24
【０２６４】（２）配列番号５１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５１： GATGTTGTGA TGACCCAAAC 20
【０２６５】（２）配列番号５２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５２： CTGATCAGTC CAACTGTTCA GGAC 24
【０２６６】（２）配列番号５３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５３： GTAAAACGAC GGCCAG 16
【０２６７】（２）配列番号５４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５４： CAGGAAACAG CTATGAC 17
【０２６８】（２）配列番号５５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５５： GAAGAGCGGC CCAGCCGGCC ATGGCCGAAG TGCAGCTGGT GGAGTCTGG 49
【０２６９】（２）配列番号５６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５６： CGATCCGCCA CCGCCGCTGC CACCTCCGCC TGAACCGCCT CCACCACTCG AGACAGTGAC 60 CAGCGCCCCT TGGC 74
【０２７０】（２）配列番号５７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５７： GGTTCAGGCG GAGGTGGCAG CGGCGGTGGC GGATCGTCTG ATGTTGTGAT GACCCAAACT 60 CCACTC 66
【０２７１】（２）配列番号５８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５８： GGAAGGAGCG GCCGCTTTCA GCTCCAGCTT GGTCCCAGCA CCGAACGTGT GAGGAAAATG 60 TGTACCTTGG GAGCAATAAT AAACTCC 87
【０２７２】（２）配列番号５９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５９： GGAAGGAGCG GCCGCTTTCA GCTCCAGCTT GGTAGC 36
【０２７３】（２）配列番号６０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号６０： CTCTTCTGAG ATGAGTTTTT G 21
【０２７４】（２）配列番号６１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号６１： GAGGCGGTTC AGGCGGAG 18
【０２７５】（２）配列番号６２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号６２： GATCCGCCAC CGCCGCTG 18
【０２７６】（２）配列番号６３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ｐＣＡＮＴＡＢ６シグナルペプチド （Ｂ）位置：−２２〜−１ （Ｃ）同定法：疎水性 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：成熟タンパク質５１０９ｓｃＦｖ，
ＶH −リンカー−Ｖ L −標識 （Ｂ）位置：１〜２６７ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：５１０９ＶH （Ｂ）位置：１〜１１６ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：リンカー （Ｂ）位置：１１７〜１３２ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：５１０９ＶL （Ｂ）位置：１３３〜２４４ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ｍｙｃ標識 （Ｂ）位置：２４８〜２５７ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：Ｈｉｓ標識 （Ｂ）位置：２６２〜２６７ （xi）配列：配列番号６３： Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala -20 -15 -10 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly -5 1 5 10 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp 30 35 40 Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Leu Thr 45 50 55 Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 60 65 70 Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Ser Gly Asp 75 80 85 90 Ser Gly Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Tyr Ser Asn Tyr Ala Arg Trp 95 100 105 Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 110 115 120 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln 125 130 135 Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Ser Ala Ser Ile Ser 140 145 150 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gly Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Leu 155 160 165 170 Ile Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Phe 175 180 185 Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 190 195 200 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Ala Glu Ala Glu 205 210 215 Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr 220 225 230 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ala Ala Glu Gln Lys 235 240 245 250 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Ala Ala His His His His His 255 260 265 His
【０２７７】（２）配列番号６４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：修飾され、且つ通常でないアミノ酸 （Ｂ）位置：１７ （Ｄ）他の情報：“Ｘａａ”は４Ｈｙｐである （xi）配列：配列番号６４： Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Asp Ala Pro Ser Gly Ala Glu Gly Pro 5 10 15 Xaa Gly Pro Gln Gly 20
【０２７８】（２）配列番号６５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：スパイクされたヌクレオチド （Ｂ）位置：２５〜５１ （Ｃ）他の情報：スパイキングのレベル＝１０％ （xi）配列：配列番号６５： GACTGTGAGA GTGGTGCCTT GGCCCCAGTA GTCAAGGCTA CCGCCCCTAG CACAGAAATA 60 TG 62
【０２７９】（２）配列番号６６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号６６： GCCAAGGCAC CACTCTCACA GTCTCC 26
【図面の簡単な説明】
【図１】９Ａ４捕獲／Ｂｔ−５１０９サンドイッチＥｌ
ｉｓａについての標準曲線を示す。
【図２】５１０９捕獲／Ｂｔ−９Ａ４検出サンドイッチ
アッセイについての標準曲線を示す。
【図３】ペプチド０５４（配列番号１８）による５１０
９結合の阻害についての標準曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ピーター スティーブン メゼス アメリカ合衆国，コネチカット 06371, オールド ライム，クラークス レーン ７ (72)発明者 イバン ジョージ オッターネス アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロートン，モニュメント ストリート 241 ナンバー ５ (56)参考文献 Ｒ．Ｃｌａｒｋ Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕ ｒｓｔ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ．，99（７），ｐ．1534− (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C07K 16/18 C07K 16/42 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 15/02 C12N 15/09 G01N 33/577 C12N 15/09

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質フラグメントについて生物学
    的媒体をモニターするための方法であって； 前記生物学的媒体と捕捉抗体とを接触せしめ、ここで該
    捕捉抗体は配列番号１及び２として配列表に示される配
    列に対して活性であり； 前記生物学的媒体と検出抗体とを接触せしめ、ここで該
    検出抗体は配列番号３及び４として配列表に示される配
    列に対して活性であり；そして前記捕獲及び検出抗体に
    対して結合したコラーゲンフラグメントの量を検出し；
    あるいは、 前記生物学的媒体と捕捉抗体とを接触せしめ、ここで該
    捕捉抗体は配列番号３及び４として配列表に示される配
    列に対して活性であり； 前記生物学的媒体と検出抗体とを接触せしめ、ここで該
    検出抗体は配列番号１及び２として配列表に示される配
    列に対して活性であり；そして前記捕獲及び検出抗体に
    対して結合したコラーゲンフラグメントの量を検出す
    る； ことを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】 前記タンパク質フラグメントが、関節軟
    骨のコラゲナーゼ切断により生成されるコラーゲンフラ
    グメントである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記タンパク質フラグメントが、タイプ
    IIコラーゲンのコラゲナーゼ切断から生成される請求項
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 タンパク質フラグメントについて生物学
    的媒体をモニターするための方法であって； 前記生物学的媒体と、配列番号３及び４として配列表に
    示される配列に対して活性である５１０９と称する抗体
    とを接触せしめ；そして前記抗体に対して結合したタン
    パク質の量を検出する； ことを含んで成る方法であって、前記５１０９と称する
    抗体が、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ−１２４３５に
    より生産されるモノクローナル抗体、あるいは配列番号
    １０及び４８として配列表に示されるＶ H 配列並びに配
    列番号１１及び４９として配列表に示されるＶ L 配列を
    有する遺伝子操作された抗体であること を特徴とする方
    法。
  5. 【請求項５】 前記タンパク質フラグメントがコラーゲ
    ンフラグメントである請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記捕捉抗体及び検出抗体がモノクロー
    ナル抗体である請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記捕捉抗体及び検出抗体がモノクロー
    ナル抗体である請求項２記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記捕捉抗体が遺伝子操作された抗体で
    ある請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記検出抗体が遺伝子操作された抗体で
    ある請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ９Ａ４と称する前記捕捉抗体が、配列
    番号５及び３２として配列表に示されるＶH 配列、並び
    に配列番号６及び３３として配列表に示されるＶL 配列
    を有する請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ５１０９と称する前記検出抗体が、配
    列番号１０及び４８として配列表に示されるＶH 配列、
    並びに配列番号１１及び４９として配列表に示されるＶ
    L 配列を有する請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 配列番号５及び３２として配列表に示
    されるＶH 配列、並びに配列番号６及び３３として配列
    表に示されるＶL 配列を有する、９Ａ４と称する抗体。
  13. 【請求項１３】 配列番号１０及び４８として配列表に
    示されるＶH 配列、並びに配列番号１１及び４９として
    配列表に示されるＶL 配列を有する、５１０９と称する
    抗体。
  14. 【請求項１４】 配列番号１又は２として配列表に示さ
    れる構造から実質的に成るペプチドに対して結合する特
    異的結合パートナーを生成する、ＡＴＣＣＨＢ−１２４
    ３６の識別特徴を有する細胞系。
  15. 【請求項１５】 配列番号３又は４として配列表に示さ
    れる構造から実質的に成るペプチドに対して結合する特
    異的結合パートナーを生成する、ＡＴＣＣＨＢ１２４３
    ５の識別特徴を有する細胞系。
  16. 【請求項１６】 それぞれＡＴＣＣ−９８５９３及びＡ
    ＴＣＣ−９８５９２の特徴を有するＥ．コリｐ９Ａ４Ｉ
    ＣＡＴ７−１又はｐ９Ａ４ＩＦ−５により発現される遺
    伝子操作された抗体９Ａ４形。
  17. 【請求項１７】 抗体５１０９の代わりに置換され得、
    そしてＡＴＣＣ−９８５９４の特徴を有するＥ．コリｐ
    ５１０９ＣｓｃＦｖに由来するような遺伝子操作された
    抗体５１０９形。
  18. 【請求項１８】 個々の半分の抗体がそのそれぞれの結
    合パートナーを認識する、抗体９Ａ４及び５１０９のハ
    イブリダイゼーションにより生成される二元特異的抗
    体。
  19. 【請求項１９】 ＶL （５１０９）−リンカー−ＶH
    （５１０９）−リンカー−ＶL （９Ａ４）−リンカー−
    ＶH （９Ａ４）形で抗体９Ａ４及び５１０９のＶL 及び
    ＶH ドメイン又はそれらの同等物を組合すことによって
    生成される前記抗体の遺伝子操作された組合せである二
    元特異的抗体。
  20. 【請求項２０】 生物学的媒体におけるコラーゲンフラ
    グメントをモニターするための方法であって、前記生物
    学的媒体と、請求項２２記載の二元特異的抗体９Ａ４／
    ５１０９とを接触せしめ；そして前記抗体に対して結合
    されるコラーゲンフラグメントの量を検出する； ことを含んで成る方法。
  21. 【請求項２１】 抗体５１０９及び９Ａ４の遺伝子操作
    された変異体から生成される請求項１９に記載の二元特
    異的抗体。
  22. 【請求項２２】 抗体９Ａ４及び５１０９の対応するＶ
    L 及びＶH と同じジャームライン遺伝子に由来するＶL
    及びＶH 遺伝子により抗体９Ａ４又は５１０９に関連し
    ており、そしてその変更は配列中に存在するが、しかし
    ＶL −ＶH 変異体の組合せが抗体９Ａ４又は５１０９の
    結合特性を維持している抗体。
  23. 【請求項２３】 配列番号１もしくは２に示される配列
    に対して活性な抗体、又は配列番号３もしくは４に示さ
    れる配列に対して活性な抗体であって、検出を促進する
    ためにラベルされる抗体。
  24. 【請求項２４】 前記ラベルが、放射性、光学的、酵
    素、螢光偏光又は螢光消光ラベルである請求項２３記載
    の抗体。
  25. 【請求項２５】 配列番号１もしくは２に示される配列
    に対して活性な抗体、又は配列番号３もしくは４に示さ
    れる配列に対して活性な抗体であって、抗体の捕獲を促
    進するためにラベルされる抗体。
  26. 【請求項２６】 前記ラベルが、ビオチン又は磁気粒子
    である請求項２５記載の抗体。
JP32218498A 1997-11-13 1998-11-12 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ Expired - Fee Related JP3258630B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6542397P 1997-11-13 1997-11-13
US60/065423 1997-11-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11218532A JPH11218532A (ja) 1999-08-10
JP3258630B2 true JP3258630B2 (ja) 2002-02-18

Family

ID=22062616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP32218498A Expired - Fee Related JP3258630B2 (ja) 1997-11-13 1998-11-12 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6030792A (ja)
EP (1) EP0921395B1 (ja)
JP (1) JP3258630B2 (ja)
AT (1) ATE237133T1 (ja)
BR (1) BR9804988A (ja)
CA (1) CA2254010A1 (ja)
DE (1) DE69813158T2 (ja)
DK (1) DK0921395T3 (ja)
ES (1) ES2194277T3 (ja)
PT (1) PT921395E (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034128A1 (ja) 2009-09-16 2011-03-24 塩野義製薬株式会社 コラーゲンネオエピトープ抗体

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6642007B1 (en) * 1998-11-02 2003-11-04 Pfizer Inc. Assays for measurement of type II collagen fragments in urine
US20050281821A1 (en) * 1999-01-06 2005-12-22 Flavia Pernasetti Method and composition for angiogenesis inhibition
US7122635B2 (en) * 1999-01-06 2006-10-17 University Of Southern California Method and composition for angiogenesis inhibition
CN1379685A (zh) * 1999-07-13 2002-11-13 南加利福尼亚大学 用基于MMP－9和β1整联蛋白的拮抗剂抑制血管发生的新方法和组合物
AU2001288342A1 (en) * 2000-08-21 2002-03-04 Smith Kline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
EP1329719A4 (en) * 2000-09-29 2004-07-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR ANALYZING THE MOLECULAR STRUCTURE OF AN ANTIBODY
WO2002098917A2 (en) * 2001-02-12 2002-12-12 Curagen Corporation Human proteins and nucleic acids encoding same
US20030040027A1 (en) * 2001-08-16 2003-02-27 Gerd Ritter Method for determining protein component in a biological sample
US20030054426A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-20 Welsch Dean J. Peptide biomarker and method of identification
US20040067882A1 (en) * 2001-10-22 2004-04-08 Alsobrook John P. Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US7390885B2 (en) * 2001-11-26 2008-06-24 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
US7365167B2 (en) * 2001-11-26 2008-04-29 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
US20030219843A1 (en) * 2001-12-20 2003-11-27 Welsch Dean J. Methods of diagnosing and treating abnormal growth
US20030119203A1 (en) * 2001-12-24 2003-06-26 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Lateral flow assay devices and methods for conducting assays
US8367013B2 (en) * 2001-12-24 2013-02-05 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Reading device, method, and system for conducting lateral flow assays
EP1504033A2 (en) 2002-05-03 2005-02-09 Millenium Biologix Inc. Connective tissue stimulating peptides
US7432061B2 (en) * 2002-05-31 2008-10-07 Biozyme, Inc. Assays for measuring matrix metalloproteinase activities
US7285424B2 (en) 2002-08-27 2007-10-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Membrane-based assay devices
US7432105B2 (en) * 2002-08-27 2008-10-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Self-calibration system for a magnetic binding assay
US7488792B2 (en) * 2002-08-28 2009-02-10 Burnham Institute For Medical Research Collagen-binding molecules that selectively home to tumor vasculature and methods of using same
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US20040101920A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
US7781172B2 (en) * 2003-11-21 2010-08-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for extending the dynamic detection range of assay devices
US20040106190A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-03 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow-through assay devices
US7247500B2 (en) * 2002-12-19 2007-07-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Reduction of the hook effect in membrane-based assay devices
US20040197819A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Assay devices that utilize hollow particles
US7851209B2 (en) 2003-04-03 2010-12-14 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Reduction of the hook effect in assay devices
US20050112703A1 (en) 2003-11-21 2005-05-26 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Membrane-based lateral flow assay devices that utilize phosphorescent detection
US7713748B2 (en) * 2003-11-21 2010-05-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method of reducing the sensitivity of assay devices
US7943395B2 (en) * 2003-11-21 2011-05-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Extension of the dynamic detection range of assay devices
US20050136550A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow control of electrochemical-based assay devices
US7943089B2 (en) * 2003-12-19 2011-05-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Laminated assay devices
US7521226B2 (en) * 2004-06-30 2009-04-21 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. One-step enzymatic and amine detection technique
JP4683572B2 (ja) * 2005-01-28 2011-05-18 塩野義製薬株式会社 組換え蛋白質の定量法
CA2619654A1 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Cell Matrix Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions
CA2646329C (en) * 2006-03-20 2018-07-03 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
US7858752B2 (en) 2006-12-05 2010-12-28 Abbott Laboratories Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same
US8940298B2 (en) * 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
EP2209498A2 (en) * 2007-10-03 2010-07-28 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to psma
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
ES2712732T3 (es) * 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
CA2782333C (en) 2009-12-02 2019-06-04 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
DE102012107651A1 (de) * 2012-08-21 2014-02-27 Astrium Gmbh Verfahren zur Durchführung einer biochemischen Analyse, insbesondere im Weltraum
AU2016304764C1 (en) 2015-08-07 2023-06-01 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EP3773714A1 (en) * 2018-04-12 2021-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Anticancer combination therapy with cd73 antagonist antibody and pd-1/pd-l1 axis antagonist antibody

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5320970A (en) * 1987-11-06 1994-06-14 Washington Research Foundation Detection of collagen degradation in vivo
US5300434A (en) * 1987-11-06 1994-04-05 Washington Research Foundation Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide
WO1994014070A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 Shriners Hospitals For Crippled Children Immunoassay for the measurement of collagen cleavage in cartilage
US5541295A (en) * 1993-02-12 1996-07-30 The Board Of Governors For Higher Education State Of Rhode Island And Providence Plantations Detection of type II collagen and its peptides
GB9702252D0 (en) * 1997-02-06 1997-03-26 Univ Sheffield Medical The Sch Collagen assay

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｒ．Ｃｌａｒｋ Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕｒｓｔ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９（７），ｐ．１５３４−

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034128A1 (ja) 2009-09-16 2011-03-24 塩野義製薬株式会社 コラーゲンネオエピトープ抗体

Also Published As

Publication number Publication date
ES2194277T3 (es) 2003-11-16
PT921395E (pt) 2003-06-30
US6030792A (en) 2000-02-29
EP0921395B1 (en) 2003-04-09
EP0921395A3 (en) 1999-09-01
BR9804988A (pt) 2000-03-28
DE69813158T2 (de) 2003-11-27
EP0921395A2 (en) 1999-06-09
JPH11218532A (ja) 1999-08-10
DK0921395T3 (da) 2003-07-07
ATE237133T1 (de) 2003-04-15
DE69813158D1 (de) 2003-05-15
CA2254010A1 (en) 1999-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3258630B2 (ja) 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ
CN110234349B (zh) 特异性地结合人il-15的抗体及其用途
Wels et al. Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single–chain antibody–phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB–2 receptor
ES2551682T3 (es) Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
CN109937212B (zh) B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN102282174B (zh) 抗人epo受体的抗体
US6342587B1 (en) A33 antigen specific immunoglobulin products and uses thereof
US20030100023A1 (en) Immunoassay and antibody selection methods using cell surface expressed libraries
EP1978034B1 (en) Anti-periostin antibody and pharmaceutical composition containing the same for preventing or treating periostin-related disease
JP2000515002A (ja) 標的分子の活性部位またはクレフトと特異的に相互作用する認識分子
US6642007B1 (en) Assays for measurement of type II collagen fragments in urine
JPH08504080A (ja) 変性された抗体、それに関連する生成物及び方法
MX2007000104A (es) Anticuerpos anti-tnf-? de gran afinidad y metodo.
CN102421795A (zh) 针对肌钙蛋白i的抗体及其使用方法
US20080003617A1 (en) Methods for the identification and the isolation of epitope specific antibodies
JPH06502526A (ja) 結合ドメイン
CN109336973B (zh) 抗转铁蛋白抗体及其用途
CN102232087A (zh) 修饰的人igf-1/e肽的抗体
Kim et al. Expression and characterization of recombinant single-chain Fv and Fv fragments derived from a set of catalytic antibodies
KR102029394B1 (ko) 치쿤구니아 바이러스 감염 진단용 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이를 이용한 치쿤구니아 바이러스 감염 진단 방법
JPH07506727A (ja) 凝集アッセイ用試薬
Hawlisch et al. Guinea pig C3 specific rabbit single chain Fv antibodies from bone marrow, spleen and blood derived phage libraries
CN116162158A (zh) 结合bp特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
CA2340865A1 (en) High-affinity antibodies
CN113603786A (zh) 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees