CN1957256B - 用于子宫颈疾病检测的方法和组合物 - Google Patents
用于子宫颈疾病检测的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1957256B CN1957256B CN2005800163173A CN200580016317A CN1957256B CN 1957256 B CN1957256 B CN 1957256B CN 2005800163173 A CN2005800163173 A CN 2005800163173A CN 200580016317 A CN200580016317 A CN 200580016317A CN 1957256 B CN1957256 B CN 1957256B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- sample
- biomarker
- purposes
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
提供了用于在患者样品中鉴定高度子宫颈疾病的方法和组合物。本发明的方法包括在机体样品中检测至少一种生物标志物的过表达,其中所述生物标志物选择性地在高度子宫颈疾病中过表达。在特定的权利要求中,所述机体样品是Pap抹片或单层宫颈细胞。本发明的生物标志物包括参与细胞周期调控、信号转导和DNA复制及转录的基因和蛋白。在特定的权利要求中,所述生物标志物是S期基因。在本发明的一些方面,使用生物标志物的特异性抗体在蛋白水平上或使用核酸杂交技术在核酸水平上检测目的生物标志物的过表达。还提供了实施本发明方法的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及用于检测高度子宫颈疾病的方法和组合物.
发明背景
宫颈癌是妇女中的第二大常见肿瘤,大约占所有女性癌症的12%,每年导致大约250,000人死亡。Baldwin等人(2003)Nat ureReviewsCancer3:1-10。在许多不能进行大规模筛查程序的发展中国家,临床问题更加严重。在这些国家,宫颈癌是妇女中癌症死亡的头号病因。
大部分宫颈癌的病例表现为鳞状细胞癌,尽管也观察到腺癌。可通过人群筛查来预防宫颈癌,因为其通过已完全明确的非浸润上皮内阶段演化而来,所述阶段可通过形态学方法进行辨别。Williams等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14932-14937。尽管不知道正常细胞是如何开始转化的,但从正常的复层上皮通过子宫颈上皮内赘瘤(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)至浸润性癌的组织病理学变化的连续谱的概念多年来已被广泛接受。宫颈癌的前身是发育异常,在本领域也称为CIN或鳞状上皮内病变(squamousintraepithelial lesions,SIL)。可使用三级(three-tiered)(CIN)或二级(two-tiered)(Bethesda)系统将鳞状上皮内异常分类。在Bethesda系统下,低度鳞状上皮内病变(LSIL),对应于CINI和HPV感染,通常代表了有效果的HPV感染,其发展成浸润性疾病的风险相对较低。尽管LSIL和HSIL都被视为恶性肿瘤的潜在前身,但在三级系统中对应于CINII和CINIII的高度鳞状上皮内病变(HSIL),和LSIL相比显示更高的发展成宫颈癌的风险。在该系统下,也可将患者的样品分类为ASCUS(意义不明的非典型性鳞状细胞,atypical squamouscells of unknown significance)或AGUS(意义不明的非典型性腺细胞,atypical glandular cells of unknown significance)。
已证实宫颈癌和通过高危型的人乳头瘤病毒(HPV)例如16、18和31型的感染之间的强关联性。事实上,大量流行病学和分子生物学证据已将HPV感染确定为宫颈癌的病因因素。此外,在85%或更多的高度子宫颈疾病的病例中发现了HPV。然而,HPV感染非常普遍,可能在5-15%超过30岁的妇女中发生,但很少有HPV阳性的妇女会发展成高度子宫颈疾病或癌症。单独的HPV存在只是感染的指标,而不是高度子宫颈疾病的指标,因此,只对HPV感染进行检测导致许多假阳性。参见,例如,Wright等人(2004)Obstet.Gyhecol.103:304-309。
目前的文献表明HPV感染宫颈的深部组织内的基底干细胞。干细胞向成熟角质形成细胞的分化(结果导致所述细胞迁移至复层子宫颈上皮)和HPV病毒复制以及细胞的再传染有关联。在该病毒复制过程中,发生许多细胞变化,包括细胞周期失控(de-regulation)、活跃的增殖、DNA复制、转录激活和基因组的不稳定性(Crum(2000)ModeriiPatliology13:243-251;Middleton等人(2003)J.Virol.77:10186-10201;Pett等人(2004)CaracerRes.64:1359-1368)。
大多数HPV感染实际上是短暂的,因为病毒感染会在12个月内将其自身消解。对于那些因为一种或多种HPV的致癌亚型而发生持久性感染的个体,和无HPV感染的患者相比,存在发展瘤形成的风险。已知HPV在子宫颈瘤形成(cervical neop lasia)的发展上的重要性,在鉴定可能发生子宫颈瘤形成的患者上,HPV的临床检测已逐渐成为重要的诊断工具。基于HPV的子宫颈疾病的筛查的临床功效在于其阴性预测价值。HPV阴性结果和正常的Pap抹片检查史一起是无疾病状况和在以后的1-3年期间较少可能发生子宫颈瘤形成的优良指标。然而,阳性HPV结果不是子宫颈疾病的诊断,而只是感染的指征。尽管大多数HPV感染是短暂的并且会在12个月的时期内自发清除,但具有高危HPV病毒亚型的持续性感染预示着发生子宫颈瘤形成的更大可能性。为补充HPV检测,预期和子宫颈瘤形成关联的分子标志物的鉴定可提高针对子宫颈疾病诊断的临床特异性。
对经帕帕尼古拉乌染色的子宫颈抹片(Pap抹片)进行细胞学检查目前是检测子宫颈癌所选用的方法。Pap抹片检查是种主观的方法,60多年来其基本上保持未变。然而,关于其性能存在几个顾虑。报道的单一Pap检查的灵敏度(检查呈阳性的疾病阳性的比例)较低,并且显示较宽的变化范围(30-87%)。对于潜在的高度疾病的确定,单一Pap抹片检查的特异性(经检验呈阴性的疾病阴性的比例)在筛查人群中低达86%,在ASCUS PLUS人群中更要低得多。参见,Baldwin等人,同上。相当比例的鉴定为LSIL或CINI的Pap抹片检查实际上是高度病变阳性。此外,高达10%的Pap抹片检查被分类为ASCUS(意义不明的非典型性鳞状细胞),即不太可能明确归类为正常、中度或严重病变、或肿瘤。然而,经验显示高达10%的该ASCUS群体具有高度病变,所述病变因此而被忽略掉。参见,例如,Manos等人(1999)JAMA281:1605-1610。
因此,需要这样的用于诊断高度子宫颈疾病的方法,该方法不依赖于常规的Pap抹片检查和针对高危HPV感染的分子检测或者与其一起使用。该方法应当能够特异性地鉴定存在于所有患者群体中的高度子宫颈疾病,包括通过Pap染色被分类为LSIL或CINI、而实际上是高度病变阳性(即,“假阴性”)的病例。因此,本领域需要这样的特异的、可靠的诊断方法,该方法能够检测高度子宫颈疾病以及能够区别高度疾病和不被当作临床疾病的病症例如早期HPV感染和轻度发育异常。
发明概述
提供了用于诊断高度子宫颈疾病的组合物和方法。本发明的方法包括检测至少一种生物标志物、特别是核生物标记物在机体样品中的过表达,其中所述所述生物标志物的过表达的检测特异性地鉴定显示高度子宫颈疾病的样品。本方法可将显示高度子宫颈疾病的样品和显示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品区分开。因此,该方法依赖于这样的生物标志物的检测,该生物标志物选择性地在高度子宫颈疾病状态中过表达,而不在正常细胞或不指示临床疾病的细胞中过表达。
本发明的生物标志物是选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的蛋白和/或基因,包括由于HPV诱导的细胞周期功能失调和负责S期诱导的某些基因的激活造成的蛋白和/或基因的过表达。特别吸引人的生物标志物包括S期基因,其过表达是由于HPV诱导的细胞周期功能失调和随后的转录因子SP-1和E2F的激活造成的。本发明的生物标志物基因或蛋白的过表达的检测可区分显示高度疾病的样品(例如中度至严重的发育异常和宫颈癌)和正常细胞或不指示临床疾病(例如,无发育异常的早期HPV感染和轻度发育异常)的细胞。
可在蛋白或核酸水平上估计生物标志物的过表达。在一些实施方案中,提供了利用抗体在子宫颈细胞学样品中检测生物标志物的过表达的免疫细胞化学技术。在本发明的该方面,使用至少一种针对感兴趣的特定生物标志物的抗体。也可通过基于核酸的技术(包括,例如,杂交和RT-PCR)检测过表达。此外还提供了包含用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。
也可将本发明的方法和用于分析形态学特征或HPV感染状况的常规妇科诊断技术结合使用。因此,例如,此处提供的免疫细胞化学方法可和Pap抹片检查一起使用,这样就保存了来自常规方法的所有形态学信息。通过这种方式,对在高度子宫颈疾病中选择性地过表达的生物标记物的检测可减少Pap抹片检查的高假阳性率,从而有助于大规模自动化筛查。
附图概述
图1提供了子宫颈结构异常中的增殖和细胞周期失控的图解概述。子宫颈瘤形成中的细胞周期变化和增殖控制缺陷。HPV感染和E6与E7癌蛋白(oncoproteins)的过表达引起了细胞周期和增殖控制中的一系列变化。HPVE6癌蛋白消除了G1/S和G2/M界线上的细胞周期关卡,结果DNA进行复制,产生体细胞突变。E7促进了加速进入S期,结果DNA复制所需的S期基因长时间表达(异常的S期诱导)。同样,E6提高了端粒酶的表达,在增殖和细胞永生化期间确保了连续的染色体端粒完整性。最后,E7消除了TGF-β信号转导途径,从而消除了G1期阻滞的该控制机制和增殖的控制。
图2提供了子宫颈瘤形成中的异常S期诱导的示意性图解说明。HPV蛋白对细胞周期控制和增殖的作用包括p53和Rb肿瘤抑制途径的失活、E2F-1转录的激活、S期基因MCM-2、MCM-6、MCM-7、TOP2A和细胞周期蛋白E1等的诱导。此外,E2和Sp-1转录因子相互作用,从而激活p21-waf-1的基因表达。
图3提供了细胞周期的异常S期中关于细胞增殖的反馈回路的示意图。S期中细胞周期蛋白E和CDK2的过表达导致允许诱导S期基因的独立机制。
图4提供了c-myc在异常S期诱导中的作用的示意图。C-myc是细胞增殖中重要的转录激活物。编码c-myc的基因位于染色体上。该位置与已证实了HPV18的整合以及该基因区域的相应扩增属同一位置。c-myc基因的扩增将导致被编码的蛋白的过表达,c-myc的增加的水平将独立地促进S期基因转录,从而进一步加速细胞增殖。
图6举例说明了具有轻度发育异常的患者和患有鳞状细胞癌的患者在IHC测定法中针对Claudin1的抗体的差异染色模式。
图7举例说明IHC和ICC形式中针对Claudin1的抗体的差异染色模式。显示了正常细胞和指示CINIII和HSIL的细胞。
图8举例说明了用核生物标志物(即,MCM2)获得的细胞核染色模式和用细胞质生物标志物(p16)获得的细胞质染色模式。结果来自高度子宫颈疾病患者样品的免疫细胞化学(ICC)测定。
图9举例说明在使用两种不同的针对MCM6的抗体对来自患有高度子宫颈疾病的患者的宫颈组织进行的免疫组织化学(IHC)测定中期望的和不期望的抗体染色。
发明详述
本发明提供了用于鉴定或诊断高度子宫颈疾病的组合物和方法。该方法包括检测选择性地在高度子宫颈疾病(例如中度至严重的发育异常和宫颈癌)中过表达的特定生物标志物的过表达。即,本发明的生物标志物能够区别HPV感染的细胞和癌变前、恶性的、或显露癌性的HPV感染的细胞。用于诊断高度子宫颈疾病的方法包括来自患者的组织或体液样品中检测至少一种指示高度子宫颈疾病的生物标志物的过表达。在特定的实施方案中,使用抗体和免疫细胞化学技术检测目的生物标志物的表达。此外还提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。
“诊断高度子宫颈疾病”包括,例如,诊断或检测子宫颈疾病的存在、监控疾病的进程,和鉴定或检测指示高度子宫颈疾病的细胞或样品。术语诊断、检测和鉴定高度子宫颈疾病在此处可交换使用。“高度子宫颈疾病”是指通过阴道镜被分类为癌前病理、恶性病理、中度至严重发育异常,和宫颈癌的病症。潜在的高度子宫颈疾病包括CINII、CINIII、HSIL、原位癌、腺癌,和癌(FIGOI-IV期)的组织学鉴定。
如上所述,相当比例的表现Pap抹片检查分类为正常、CINI或ASCUS的患者实际上具有高度子宫颈疾病特征性的病变。因此,本发明的方法允许在所有患者(包括这些“假阴性”患者)群体中鉴定高度子宫颈疾病,并且便于检查患者样品中的稀有异常细胞。尽管本发明的方法也可和常规诊断技术例如Pap抹片检查、针对高危型HPV的分子检测等一起使用,但其可不依赖于细胞形态学和HPV感染状态进行诊断。
基于HPV型和宫颈癌以及癌前病变的相关性已将其分为高危型和低危型类别。低危HPV型包括6、11、42、43、44型,并且和增加的宫颈癌风险无关。相反地,高危HPV型,包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型,和宫颈癌以及鳞状上皮内病变强烈相关。参见,例如,Wright等人(2004)Obstet.Gynecol.103:304-309。事实上,超过99%的宫颈癌和高危HPV感染相关。持久的高危HPV感染通过HPV基因E2、E6和E7的作用导致子宫颈细胞中细胞周期和有丝分裂关卡的破坏。具体地说,HPV E7导致细胞周期蛋白E的增加和随后转录因子E2f从视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白(Rb)的释放。然后释放的E2f转录因子触发各种S期基因的转录,导致细胞周期控制的丧失,所述S期基因包括拓扑异构酶IIα(Topo2A)、MCM蛋白、细胞周期蛋白E1和E2以及p14α。HPV E2通过激活Sp-1转录因子进一步刺激S期基因例如p21Waf-1的过表达。由持久HPV感染引起的细胞周期的破坏可导致轻度宫颈结构异常,然后该疾病可发展为中度或严重发育异常,最终在一些情况下导致宫颈癌。“宫颈癌”指和宫颈组织或子宫颈细胞相关的任何癌症或癌症病变。
宫颈角质形成细胞内的HPV感染导致破坏细胞周期内的活动的多种变化。高危HPV亚型的E6和E7癌蛋白参与许多这样的细胞过程,所述细胞过程和被感染的角质形成细胞的增加的增殖和致瘤性转化相关。E6蛋白参与两个至关重要的过程。第一个过程是通过遍在蛋白介导的蛋白水解进行的P53肿瘤抑制蛋白的降解。功能性p53的除去消除了在进入DNA修复和有丝分裂前负责DNA修复的主要细胞周期关卡(Duensing和Munger(2003)Prog CellCycle Res.5:383-391)。此外,已显示E6和c-myc蛋白相互作用,负责hTERT基因的直接转录激活,随后表达端粒酶(McMurray和McCance(2003)J Virol.77:9852-9861;Veldman等人(2003)Proc Natl Acad SciU.S.A.100:8211-8216)。端粒酶的活化是癌症生物学中负责在复制染色体时保持端粒长度的关键步骤,该酶在细胞永生化期间可确保功能完整的染色体。
已知HPV癌蛋白E7通过两个独立的机制促进细胞增殖。第一机制是通过E7和Smad蛋白(Smad2、3和4)的直接相互作用,从而抑制其结合DNA的能力(Lee等人(2002)J Biol Chem.277:38557-38564),由此使负责将细胞周期阻滞在G1期的TGF-β肿瘤抑制途径失活。同样,已知E7特异性地和Rb肿瘤抑制蛋白相互作用。在细胞周期的G1期内,Rb和E2F转录因子复合,从而防止E2F激活基因转录。在G1/S边界上,Rb蛋白被磷酸化,释放出E2F转录因子,从而启动E2F基因转录和进入细胞周期的S期。HPV E7癌蛋白通过直接结合Rb并从复合物中置换出E2F来消除该控制机制。这导致受E2F基因驱动的基因转录不依赖于正常的细胞周期控制(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5:383-391;Duensing和Munger(2004)Int J Cancer109:157-162;Clarke和Chetty(2001)GynecolOncol.82:238-246)。该E2F的释放使基因转录和细胞周期控制解偶联,从而导致负责DNA合成和细胞增殖的S期基因的长时间和异常转录。此外,已显示E6和E7两者的组合作用导致子宫颈瘤形成中的中心体异常和后来的基因组不稳定性(Duensing和Munger(2004)Int JCancer109:157-162)。
尽管不想限制于特定的机制,但在一些实施方案中,作为HPV的致癌株系感染的结果,可将高度子宫颈疾病的分子行为表征为通常只在细胞周期的S期期间表达的离散基因的过表达。随后不受控制的基因转录的激活和异常的S期诱导通过E2F-1转录因子途径来介导。该行为似乎标示了高度子宫颈疾病并提供了致癌HPV感染和子宫颈瘤形成的分子行为之间的联系。在分子诊断测定形式中使用这些子宫颈瘤形成的分子标志物可改进子宫颈疾病的检测,使之具有比现有方法更高的灵敏度和特异性。一般参见图1-4和Malinowski(2005)BioTechniques38:1-8(即将出版),在此以其全文引用作为参考。因此,在特定的实施方案中,用于诊断高度子宫颈疾病的方法包括检测生物标志物的过表达,其中如此处描述的,该生物标志物的过表达标示了异常的S期诱导。在其他实施方案中,所述方法包括检测生物标志物的过表达,其中该生物标志物的过表达标示了HPV E6和HPV E7基因的活跃转录或过表达。
以形态学术语常规地定义发育异常,表现在上皮细胞的正常定位的丧失、伴随细胞和细胞核大小、形状和染色特征上的改变。如通过癌前发育异常病症例如CIN的鉴定所显示的,根据细胞异常的程度对发育异常分级(即,轻度、中度、严重),发育异常被广泛视作从正常组织到子宫颈瘤形成的进程中的中间阶段。基于对于高度子宫颈疾病特异的生物标志物的过表达,本发明的方法允许鉴定高度子宫颈疾病,包括中度至严重发育异常以及宫颈癌(即,CINII病症和以上病症)。
和Pap抹片检查和/或HPV感染检测法相比,此处公开的方法提供了更优越的高度子宫颈疾病检测法。在本发明的特定方面,本方法的灵敏度和特异性等于或高于常规的Pap抹片检查法。如此处所用的“特异性”是指本发明的方法可准确鉴定已通过阴道镜被确定为NIL(即真阴性)的样品的水平。即,特异性是试验呈阴性的疾病阴性的比例。在临床研究中,通过将真阴性的数目除以真阴性和假阳性之和来计算特异性。“灵敏度”是指本发明的方法可精确地鉴定已通过阴道镜确定为高度子宫颈疾病阳性(即真阳性)的样品的水平。因此,灵敏度是试验呈阳性的疾病阳性的比例。在临床研究中,通过将真实阳性的数目除以真阳性和假阴性之和来计算灵敏度。参见下面的实施例1-3。在一些实施方案中,用于高度子宫颈疾病检测的所公开方法的灵敏度优选地是至少大约70%,更优选地至少大约80%,最优选地至少大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或更多。此外,本方法的特异性优选地为至少大约70%,更优选地至少大约80%、最优选地至少大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或更多。
术语“阳性预测值”或“PPV”是指当患者限定于通过使用本发明方法分类为阳性的患者时,该患者患有高度子宫颈疾病的概率。在临床研究中,通过将真阳性的数目除以真阳性和假阳性之和来计算PPV。在一些实施方案中,用于诊断高度子宫颈疾病的本发明方法的PPV至少为约40%,同时保持至少大约90%,更优选地至少大约95%的灵敏度。试验的“阴性预测值”或“NPV”是当患者限定于所有试验呈阴性的患者时,该患者不患有该疾病的概率。在临床研究中通过将真阴性的数目除以真阴性和假阴性之和来计算NPV。
本发明的生物标志物包括基因和蛋白,以及其变体和片段。这些生物标志物包括这样的DNA,该DNA包含编码该生物标志物的核酸序列的完整或部分序列、或该序列的互补序列。生物标志物核酸也包括这样的RNA,该RNA包含任何目的核酸序列的完整或部分序列。生物标志物蛋白是由本发明DNA标志物编码的蛋白或对应于本发明DNA标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标记蛋白或多肽的完整的或部分氨基酸序列。
“生物标志物”是任何这样的基因或蛋白,所述基因或蛋白在组织或细胞中的表达水平与正常的或健康的细胞或组织中的表达水平相比发生了改变。本发明的生物标志物是针对潜在的高度子宫颈疾病而言具有选择性的。“在高度子宫颈疾病中选择性过表达”是指目的生物标记物在高度子宫颈疾病中过表达,但不在被分类为LSIL、CINI的病症、无任何发育异常存在的HPV-感染样品、不成熟的完全发育细胞和不被当作临床疾病的其他病症中过表达。因此,本发明的生物标志物的检测能够区别指示潜在的高度子宫颈疾病的样品和指示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品。“早期HPV感染”是指未发展成宫颈结构异常的HPV感染。如此处所用的,“轻度发育异常”是指其中无高度病变存在的LSIL和CINI。本发明的方法也可将指示高度疾病的细胞与正常细胞、不成熟的完全发育细胞和不指示临床疾病的其他细胞区分开。这样,本发明的方法允许准确地鉴定高度子宫颈疾病,即使在被常规的Pap抹片检查错误地分类为正常、CINI、LSIL或ASCUS情况(即,“假阴性”)下亦如此。在一些实施方案中,作为对异常的或非典型的Pap抹片检查的反映,进行诊断高度子宫颈疾病的方法。即,可进行本发明的方法以响应具有异常或非典型性Pap抹片检查结果的患者。在本发明的其他方面,将所述方法作为在一般的妇女人群中进行的高度子宫颈疾病的初步筛查来进行,就如同目前进行常规的Pap抹片检查一样。
本发明的生物标志物包括选择性在上面定义的高度子宫颈疾病中过表达的任何基因或蛋白。这些生物标记物能够在细胞学细胞悬浮物中鉴定癌前、恶性或显现癌性的细胞。本发明的生物标志物检测CINII病症和以上病症中的细胞,但不检测CINI和其中不存在潜在的高度疾病的HPV感染细胞。特别感兴趣的生物标志物包括参与细胞周期调控、细胞周期的HPV干扰、DNA复制和转录以及信号转导的基因和蛋白。在一些实施方案中,生物标志物是S期基因,包括其表达受E2f转录因子或Sp-1转录因子刺激的基因。细胞核生物标志物可用于实施本发明的某些方面。“细胞核生物标志物”是指主要在细胞的细胞核中表达的生物标志物。细胞核生物标志物可在细胞的其他部分以较低的程度表达。尽管标示高度子宫颈疾病的任何生物标志物可用于本发明,但在某些实施方案中,生物标志物,特别是细胞核生物标志物,选自MCM2、MCM6、MCM7、p21Wafl、拓扑异构酶IIα(Topo2A)、p14arf和细胞周期蛋白E。更具体地,生物标志物可以包含MCM蛋白。
微小染色体维持(MCM)蛋白在真核细胞DNA复制中起着非常重要的作用。微小染色体维持(MCM)蛋白通过在双DNA链的从头合成期间将复制前复合物(prereplication complex)加载至DNA上和充当解旋酶以帮助双链DNA解链而在DNA复制的早期阶段发挥作用。MCM蛋白中的每一个蛋白在其高度保守的中心结构域具有DNA依赖性ATP酶基元。当正常细胞从细胞周期的G0期进行至G1/S期时,MCM蛋白的水平通常以可变的方式增加。在G0期,MCM2和MCM5蛋白远不如MCM7和MCM3蛋白丰富。MCM6和MCM2、MCM4以及MCM7形成结合组蛋白H3的复合物。此外,MCM4、MCM6和MCM7的亚复合物具有解旋酶活性,该活性是通过MCM6的ATP结合活性和MCM4的DNA结合活性介导的。参见,例如,Freeman等人(1999)Clin.Cancer Res.5:2121-2132;Lei等人(2001)JCellSci.114:1447-1454;Ishimi等人(2003)Eur.J.Biochem.270:1089-1101,所有文献在此以其全文引用作为参考。
早期的出版物已显示MCM蛋白,特别是MCM-5,可用于检测子宫颈疾病(Williams等人(1998)Proc Natl Acad SciU.S.A.95:14932-14937)以及其他癌症(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.5:2121-2132)。已出版的文献表明针对MCM-5的抗体能够检测子宫颈瘤形成细胞。MCM-5用于检测高度子宫颈疾病的特异性未得到证实(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.95:14932-14937)。MCM-5表达的检测不限于高度子宫颈疾病,其还在经鉴定的低度发育异常和在用高危HPV感染后已进入细胞周期的细胞中被检测到。使用针对MCM-5的抗体对子宫颈瘤形成的检测显示于图4。除了MCM-5外,已显示来自MCM家族的其他成员,包括MCM-2和MCM-7,是用于在组织样品中检测子宫颈瘤形成的可能有用的生物标志物(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.5:2121-2132;Brake等人(2003)Cancer Res.63:8173-8180)。近年来的结果已显示MCM-7似乎是用于使用免疫化学形式检测高度子宫颈疾病的特异性标志物(Br ake等人(2003)Cancer Res.63:8173-8180;Malinowski等人(2004)ActaCytol.43:696)。
拓扑异构酶IIα(Topo2a)是参与DNA复制的基本的细胞核酶,其是许多用于癌症治疗的抗癌药物的靶。Topo2a的减少的表达是对几种化疗剂的耐受性的最主要机制。在许多不同的肿瘤中已注意到该蛋白的表达范围的重大变化。Topo2a主要存在于正在增殖的细胞中,其在M期在特定的位点被磷酸化修饰,这对有丝分裂染色体凝集和分离至关重要。
p21是由染色体6p上的WAF1/Cip1编码的蛋白。经显示该基因抑制几种细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性,从而阻止细胞周期的进程。p21Wafl的表达介导p53的细胞周期阻滞功能。因为p21似乎介导p53的几种生长调节功能,其表达可能比p53的积累更准确地反映p53的功能状态。此外,p21Watl可通过阻断增殖细胞中的细胞核抗原(PCNA)的作用来抑制DNA复制。
细胞周期蛋白E是cdk-2的调控亚基,其在哺乳动物细胞周期中控制G1/S的转变。细胞周期蛋白E的多种同种型只在肿瘤中表达而不在正常的组织中表达,这暗示着细胞周期蛋白E的转录后调控。体外分析表明,细胞周期蛋白E的这些截短的变体同种型能够磷酸化组蛋白H1。细胞周期蛋白E上的变化已被认为是各种癌症中预后差的指标。
尽管已详细地讨论了上述生物标志物,但可将在高度子宫颈疾病状态(例如,CINII、CINIII和宫颈癌)中过表达的任何生物标志物用于实施本发明。其它感兴趣的生物标志物包括对于G1/S期边界点或S期特异的受细胞周期调控的基因。这些基因包括但不限于解旋酶(DDX11)、尿嘧啶DNA乙二醇酯酶(uracil DNA glycolase,UNG)、E2F5、细胞周期蛋白E1(CCNE1)、细胞周期蛋白E2(CCNE2)、CDC25A、CDC45L、CDC6、p21WAF-l(CDKN1A)、CDKN3、E2F1、MCM2、MCM6、NPAT、PCNA、茎环BP(SLBP)、BRCA1、BRCA2、CCNG2、CDKN2C、二氢叶酸还原酶(DHFR)、组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、MSH2、NASP、核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)、核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)、胸苷合成酶(TYMS)、复制因子C4(RFC4)、RAD51、染色质因子1A(CHAF1A)、染色质因子1B(CHAF1B)、拓扑异构酶III(TOP3A)、ORC1、引发酶2A(PRIM2A)、CDC27、引发酶1(PRIM1)、瓣结构内切核酸酶(flap structure endonuclease,FEN1)、fanconi anemia comp.grp A(FNACA)、PKMYT1和复制蛋白A2(RPA2)。参见,例如,Whitfield等人(2002)Mol.Biol.Cell13:1977-2000,以其全文在此引用作为参考。其他感兴趣的S期基因包括细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、MCM3、MCM4、MCM5、DNA聚合酶Iα(DNA POL1)、DNA连接酶1、B-Myb、DNA甲基转移酶(DNA MET)、中心粒周围蛋白(pericentrin,PER)、KIF4、DP-1、ID-3、RAN结合蛋白(RANBP1)、间隙连接α6(GJA6)、氨基乙酰丙酸脱水酶(amino levulinatedehydratase,ALDH)、组蛋白2A Z(H2A.Z)、精胺合酶(SpmS)、增殖蛋白2、T淋巴细胞激活蛋白、磷脂酶A2(PLA2)和L6抗原(L6)。参见,例如,Nevins等人(2001)Mol.Cell.Biol.21:4689-4699,此处引用作为参考。
在本发明的一些方面,生物标志物包含由E2f转录因子诱导的基因。这些基因包括但不限于胸苷酸合酶(thymidylate synthase)、胸苷激酶1、核糖核苷酸还原酶M1、核糖核苷酸还原酶M2、CDK2、细胞周期蛋白E、MCM3、MCM7、PCNA、DNA引发酶小亚基、拓扑异构酶IIA(Topo2A)、DNA连接酶1、flap endonuclease1、RAD51、CDC2、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白B2、KI-67、KIFC1、FIN16、BUB1、输入蛋白α-2、HMG2、zeste增强子、STK-1、组蛋白茎环BP、Rb、P18-INK4C、膜联蛋白VIII、c-Myb、CDC25A、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E1、脱氧胞嘧啶激酶、DP-1、内皮素转化酶(endothelin converting enzyme)、烯醇化酶2、P18I NK4C、核糖核苷酸还原酶和尿嘧啶DAN乙二醇酯酶2。参见,例如Nevins等人,同上;Muller等人(2000)Genes and Dev.15:267-285。在特定的实施方案中,感兴趣的生物标志物是由参与细胞周期调控和DNA复制的E2f转录因子诱导的基因,例如,细胞周期蛋白E2、Ki-67、p57KIP2、RANBPM和复制蛋白A1。一些E2f诱导的感兴趣基因参与凋亡,其包括APAF1、Bc1-2、caspase3、MAP3激酶5和TNF受体相关因子。其他E2f诱导的基因参与转录的调控,其包括例如ash2样、polyhomeotic2、embryonic ectoderm protein、Zeste基因增强子、hairy/enhancerof split、同源异形盒A10、同源异形盒A7、同源异形盒A9、同源结构域TF1、早期前B细胞白血病FT3、YY1TF、POU结构域TF、TAFII130、TBP因子172、碱性TF3、溴区结构(bromodomain)/锌指、SWI/SNF、ID4、TEA-4、NFATC1、NFATC3、BT、CNC-1、MAF、MAFF、MAFG、核心结合蛋白、E74样因子4、c-FOS、JUNB、锌指DNA BP和Cbp/p300转录激活物。参与信号转导的E2f诱导的基因也是潜在的目的生物标志物,其包括TGFβ、卵泡抑素(follistatin)、骨形态发生蛋白2(bonemorphogenetic protein2)、BMP受体类型1A、曲蛋白同源物1(frizzled homologl)、WNT10B、鞘氨醇激酶1、双特异性磷酸酶7、双特异性(Y)磷酸酶、FGF受体3、蛋白酪氨酸磷酸酶、双特异性(Y)磷酸酶D6655、胰岛素受体、成熟T细胞增殖蛋白1、FGF受体2、TGFα、CDC42效应蛋白3、Met、CD58、CD83、TACC1和TEAD4。
尽管本发明的方法要求在患者样品中检测至少一个生物标志物以检测高度子宫颈疾病,但可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个生物标志物来实施本发明。已认识到对机体样品中的超过一个生物标志物的检测可用于鉴定高度子宫颈疾病的事件。因此,在一些实施方案中,使用两种或更多种生物标志物,更优选地,使用两种或更多种互补生物标志物。“互补”是指机体样品中生物标志物的组合的检测导致比只使用其中一个生物标志物时以更大比例成功鉴定高度子宫颈疾病。因此,在一些情况下,可通过使用至少两种生物标志物进行高度子宫颈疾病的更准确的确定。因此,当使用至少两种生物标志物时,使用至少两种针对不同生物标志物蛋白的抗体来实施此处公开的免疫细胞化学方法。可同时或共同地将抗体和机体样品接触。在本发明的某些方面,使用3种抗体检测MCM2和Topo2A的过表达,其中抗体中的两种抗体对于MCM2是特异性的,第三种抗体对于Topo2A是特异性的。
在特定的实施方案中,本发明的诊断方法包括从患者收集子宫颈样品,将样品和至少一种对于目的生物标志物特异的抗体接触,检测抗体结合。表现本发明生物标志物的过表达的样品,如通过抗体结合的检测所确定的,被认为是高度子宫颈疾病阳性的。在特定的实施方案中,机体样品是单层子宫颈细胞。在本发明的一些方面,在玻璃载片上提供单层子宫颈细胞。
“机体样品”是指可检测到生物标志物表达的细胞、组织或体液的任何取样。这些机体样品的示例包括但不限于血液、淋巴、尿、妇科流体(gynecological fluids)、活组织检查和涂片。可通过各种技术,包括例如,通过刮取或擦拭表面或通过使用针头抽取体液来从患者获得机体样品。用于收集各种机体样品的方法在本领域是众所周知的。在特定的实施方案中,机体样品包括子宫颈细胞,作为宫颈组织样品或如悬浮物中的子宫颈细胞,特别是基于液体的制备物。在一个实施方案中,按照基于液体的细胞学样品制备指南,例如SurePath(TriPath Imaging,Inc.)或ThinPreppreparation(CYTYC,Inc.)所述收集宫颈样品。可将机体样品转移至玻璃载片上以进行放大观察。可对载片上的细胞使用固定液和染色液以保存样品和帮助检查。在一个实施方案中,收集宫颈样品,对其进行处理以提供单层样品,如美国专利号5,346,831(此处引用作为参考)中所示。
单层方法涉及在带阳离子电荷的基底上制备单层细胞学材料的方法。该方法包括这样的步骤,即在密度梯度上通过离心分离细胞学材料,产生该细胞学材料的紧密聚集的沉淀,混合该细胞学材料的沉淀,从混合的沉淀中取出预先确定体积的等分,将该等分和预先确定体积的水沉积在沉降容器中,该容器可移动地装在带阳离子电荷的基底上,从而可使细胞学材料在重力作用下沉淀在该基底上,在细胞学材料沉淀后,从沉降容器中除去水分。为了进行自动化分析,可将沉淀容器和基底分开。可通过本领域已知的任何方法,例如吹吸法(syringing)、胰蛋白酶法(trypsinizing)、超声处理、震荡、涡旋或通过使用美国专利5,316,814(其内容在此引用作为参考)中描述的装置进行分离。在一些实施方案中,使用PrepStainTM载片处理器(TriPath Imaging,Inc.)从SurePathTM(TriPath Imaging,Inc.)制备包含单层子宫颈细胞的载片。
此处包括本领域可获得的用于鉴定或检测生物标志物的任何方法。可在核酸水平或蛋白水平上检测本发明的生物标志物的过表达。为了确定过表达,可将要检查的机体样品和来源于健康人的对应的机体样品进行比较。即,表达的“正常”水平是未遭受高度子宫颈疾病的人受试者或患者的子宫颈细胞中该生物标志物的表达水平。在一些实施方案中,特别是当机体样品包含单层子宫颈细胞时,生物标志物过表达的确定不需要机体样品和来源于健康人的对应机体样品之间的比较。在该情况下,来自单一患者的单层子宫颈细胞可以每50,000个正常细胞包含少至1-2个异常细胞。这些异常细胞(通过本发明标志物的过表达鉴定的)的检测,排除了和来源于健康人的对应机体样品相比较的需要。
用于检测本发明标志物的方法包括在核酸或蛋白水平上确定生物标志物的量或存在的任何方法。这些方法在本领域是熟知,包括但不限于western印迹法、Northern印迹法、southern印迹法、ELISA、免疫沉淀法、免疫荧光法、流式细胞术、免疫细胞化学法、核酸杂交技术、核酸逆转录法以及核酸扩增法。在特定的实施方案中,使用例如针对特定生物标志物蛋白的抗体在蛋白水平上检测生物标志物的过表达。这些抗体可用于各种方法,例如western印迹法、ELISA、免疫沉淀法或免疫细胞化学技术。同样,可将Pap抹片检查的免疫染色和常规Pap染色结合,这样可获得形态学信息和免疫细胞化学信息。这样,生物标志物的检测可减少Pap抹片检查的高假阴性率,从而可促进大规模自动化筛查。
在一个实施方案中,使用对于生物标志物蛋白特异的抗体检测机体样品中生物标志物蛋白的过表达。该方法包括从患者获得机体样品,将该机体样品和至少一种针对于选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物的抗体相接触,和检测抗体结合以确定该生物标志物在患者样品中是否过表达。本发明的优选的方面提供了用于诊断高度子宫颈疾病的免疫细胞化学技术。具体地,该方法包括患者样品中的生物标志物的抗体染色,该生物标志物对于高度子宫颈疾病是特异性的。本领域技术人员认识到,可人工地或以自动化的方式(使用例如Autostainer Universal Staining System(Dako)或Biocare NemesisAutostainer(Biocare))进行本文下面描述的免疫细胞化学法。实施例1中提供了一个用于宫颈样品的抗体染色(即免疫细胞化学)的方案。
在优选的免疫细胞化学法中,将患者的宫颈样品收集入液体培养基中,例如,在SurePathTM收集小瓶(TriPath Imaging,Inc.)中。使用自动化处理器,例如.PrepStainTM系统(TriPath Imaging,Inc.),从液体培养基中收集细胞和将其沉淀在载玻片上的薄层内以待进一步分析。可固定或不固定载片样品,并可在制备后立即对其进行分析或可将其保存以待以后分析。在一些实施方案中,将制备的玻片贮存在95%的乙醇中最少24小时。可选择地,在其他实施方案中,如下所述将载片贮存在预处理缓冲液中。
为制备易于抗体结合的生物标志物抗原,可能需要对样品进行修饰。在免疫细胞化学法的特定方面,将载片转移至预处理缓冲液例如制备缓冲液(TriPath Imaging,Inc.)和任选地将其加热以增加抗原的易接近性。样品在预处理缓冲液中的加热快速地破坏了细胞的脂双层,使得抗原(即,生物标志物蛋白)更容易进行抗体结合。预处理缓冲液可包含聚合物、去垢剂、或者非离子或阴离子表面活性剂例如乙氧基化的阴离子或非离子表面活性剂、链烷酸酯或烷氧基化物或甚至这些表面活性剂的混合物,或甚至使用胆盐。在特定的实施方案中,预处理缓冲液包含非离子或阴离子去垢剂,例如和具有大约370kD分子量的烷氧基化物混合的具有大约183kD分子量的链烷酸钠(在下文中称作RAM)。在特定的实施方案中,预处理缓冲液包含1%RAM。在一些实施方案中,预处理缓冲液也可用作上面指出的载片贮存缓冲液。在另一个实施方案中,将0.1%至1%的脱氧胆酸、钠盐、一水合物的溶液用作贮存缓冲液和预处理缓冲液。在本发明的另一个实施方案中,可将月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(例如,Sandopan LS)或/和乙氧基化的阴离子复合物或甚至烷基芳基乙氧化羧酸的溶液用于贮存和预处理缓冲液。在本发明的特定方面,载片预处理缓冲液包含0.05%至5%月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠,优选地0.1%至1%月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠、更优选地0.5%月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。在一个实施方案中,载玻片可在预处理和染色处理前在缓冲液中贮存长达72小时。可将本发明的预处理缓冲液用于制备在免疫测定法(例如,免疫细胞化学法和免疫组织化学法)中更容易进行抗体结合的抗原的方法。参见实施例14。术语“预处理缓冲液”和“制备缓冲液”在此处可交换使用,其是指这样的缓冲液,该缓冲液用于制备,特别是通过增加抗原的对抗体结合的易接近性来制备用于免疫染色的细胞学或组织学样品。
可将制备更容易进行抗体结合的抗原的任何方法用于本发明的实施,所述方法包括本领域已知的抗原修复法(antigen retrievalmethods)。参见,例如,Bibbo等人(2002)Acta.Cytol.46:25-29;Saqi等人(2003)Diagn.CytopatlioL27:365-370;Bibbo等人(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.25:8-11,此处以其全文引用作为参考。在一些实施方案中,抗原修复包括将载片贮在95%的乙醇中至少24小时,将载玻片浸没在预热至95℃的1X Target RetrievalSolution pH6.0(DAKOS1699)/dH2O浴中,将载玻片置于蒸器中25分钟。参见下面的实施例2。
在进行增加抗原的易接近性的预处理或抗原修复后,使用合适的封闭试剂(例如,过氧化物酶封闭试剂例如过氧化氢)封闭样品。在一些实施方案中,使用蛋白封闭剂封闭样品以防止抗体的非特异性结合。所述蛋白封闭剂可包含,例如,纯化的酪蛋白。然后将针对目的生物标志物的抗体,特别是单克隆抗体,和样品一起温育。如上面所指出的,本领域技术人员认识到,在一些情况下,通过在患者样品中检测超过一种生物标志物可获得高度子宫颈疾病的更准确的诊断。因此,在特定的实施方案中,使用至少两种针对两种不同生物标志物的抗体检测高度子宫颈疾病。当使用超过一种抗体时,可将这些抗体作为单个抗体试剂顺次加入至单一样品中或作为抗体混合物同时加入。参见下面实施例3。可选择地,可将各单一抗体加入至来自相同患者的分开的样品,再将所得的数据合并。在特定的实施方案中,抗体混合物包含至少3种抗体,其中两种抗体特异性地结合MCM2,第三种抗体特异性地结合Topo2A。
检测抗体结合的技术在本领域是熟知的。可使用产生对应于抗体结合水平、因此对应于生物标志物蛋白表达水平的可检测信号的化学试剂来检测针对目的生物标志物的抗体结合。在本发明的其中一个免疫细胞化学法中,通过使用缀合了被标记的聚合物的第二抗体来检测抗体结合。经标记的聚合物的示例包括但不限于聚合物-酶缀合物。一般将这些复合物中的酶用于催化色原在抗原-抗体结合位点的沉积,从而引起对应于目的生物标志物的表达水平的细胞染色。特别有吸引力的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。可使用商购获得的抗体检测系统,例如,Dako Envision+系统和Biocare Medical′sMach3系统实施本发明。
在本发明的一个具体的免疫细胞化学法中,通过使用HRP标记的缀合了二抗的聚合物来检测针对生物标志物的抗体结合。也可使用结合小鼠单克隆抗体的小鼠探针试剂和结合小鼠探针试剂的缀合HRP的聚合物来检测抗体结合。使用色原3,3-二氨基联苯胺(DAB)就抗体结合对载玻片进行染色,然后用苏木精和任选地着色剂例如氢氧化铵或TBS/Tween-20进行复染。在本发明的一些方面,由细胞检验技术员和/或病理学家在显微镜下检查载片以评估细胞染色(即,生物标志物的过表达)和确定是否存在高度子宫颈疾病。可选择地,可通过自动化的显微镜方法或通过人工借助有助于鉴定阳性染色细胞的计算机软件检查样品。
术语“抗体”广义上包括天然发生的抗体形式和重组抗体例如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体和多特异性抗体以及所有前述抗体的片段和衍生物,所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可包含缀合至所述抗体的蛋白或化学部分。
“抗体”和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现对抗原的结合特异性,但免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一种的多肽通过例如淋巴系统以较低的水平产生,在骨髓瘤中以增加的水平产生。
术语“抗体”以最广的意义使用,其包括完全地组装的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如,Fab′、F′(ab)2、Fv、单链抗体、二价抗体(diabodies))和包含前述抗体的重组肽。
此处使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体的群体中获得的抗体,即,构成该群体的各抗体是完全相同的,除了可能天然发生的可以少量存在的突变。“抗体片段”包含完整抗体的部分,优选地完整抗体的抗原结合或可变区部分。抗体片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;二价抗体;线性抗体(Zapata等人(1995)Protein Eng8(10):1057-1062);单链抗体分子;和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶降解产生两个完全相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,各片段具有单个抗原结合位点,剩余的“Fc”片段,其名称反应其容易地结晶35的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并能够交联抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中,该区域由一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域通过紧密的、非共价缔合形成的二聚体构成。在单链Fv种类中,可通过柔性肽连接体将一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域共价连接,从而可使轻链和重链以类似于双链Fv种类中的形式以“二聚”结构结合。正是处于该构型,各可变区的3个CDRs相互作用,从而在VH-VL二聚体的表面上确定了抗原结合位点。总之,6个CDRs为抗体提供了抗原结合特异性。然而,即使是单个可变区(或只包含3个特异于抗原的CDRs的Fv一半)也具有识别和结合抗原的能力,但以比完整结合位点更低的亲合力结合。
Fab片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段和Fab′片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基端加入了少数残基,包括一个或多个来源于抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH在此处是Fab′的名称,在所述Fab’中,恒定区的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab′)2抗体片段最初作为成对的Fab′片段(在其之间具有铰链半胱氨酸)产生。
可通过用生物标志物蛋白免疫原免疫合适的受试者(例如,兔子、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备多克隆抗体。可通过标准技术,例如采用使用固定的生物标志物蛋白的酶联免疫吸附测定法(ELISA)在一段时间内监控被免疫的受试者中的抗体滴度。在免疫后的合适时间点,例如当抗体滴度最高时,可从受试者获得抗体生产细胞,并通过标准技术将其用于制备单克隆抗体,所述标准技术是例如最先由Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today4:72)、EBV杂交瘤技术(Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,ed.Reisfeld和Sell(AlanR.Liss,Inc.,New York,NY),pp.77-96)或trioma技术。用于生产杂交瘤的技术是熟知的(一般参见Coligan等人,编著(1994)Current Protocols in Immunology(JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY);Galfre等人(1977)Nature266:550-52;Kenneth(1980)in Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.,NY);和Lerner(1981)YaleJ.Biol.Med.,54:387-402)。
作为制备单克降抗体分泌性杂交瘤的另一选择,可通过用生物标志物蛋白筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如,抗体噬菌体展示文库)从而分离结合该生物标志物蛋白的免疫球蛋白文库成员来鉴定和分离单克隆抗体。可商购(例如,the Pharmacia Recombinant PhageAntibody System,Catalog No.27-9400-01;和the StratageneSurfZAP9Phage Display Kit,Catalog No.240612)获得产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒。此外,特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的示例可见于例如美国专利号5,223,409;PCT公开号WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;93/01288;WO92/01047;92/09690;90/02809;Fuchs等人(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85;Huse等人(1989)Science246:1275-1281;Griffiths等人(1993)EMBOJ12:725-734中。
可通过将抗体偶联可检测物质来帮助抗体结合的检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;合适的辅基的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素;合适的荧光物质的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(phycoerythrin);发光物质的示例包括鲁米诺(lumino);生物发光物质的示例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白;合适的放射性物质的示例包括125I、131I、35S或3H。
关于本发明免疫细胞化学法中的抗体染色的检测,本领域内也存在用于在生物学样品中定量确定多分子种类(例如生物标志物蛋白)的量的视频显微术(video-microscopy)和软件方法,其中通过具有特定颜色的代表性染料标志物来指示存在的各分子种类。这些方法作为比色分析法在本领域也是已知的。在这些方法中,在将生物学样品染色以可视地显现特定目的生物标志物的存在后,使用视频显微术提供所述生物样品的图象。这些方法中的一些方法,例如在属于Marcelpoil等人的美国专利申请.09/957,446和属于Marcelpoil等人的美国专利申请10/057,729(此处引用作为参考)中公开的方法,公开了成象系统和相关软件基于代表性颜色染料标志物的存在确定存在的各分子种类的相对量的用途,所述分子种类的相对量分别由成象系统和相关软件确定的所述颜色染料标志物的光密度或透射值(transmittance value)表示。通过使用被“解构”成其组分颜色部分的单一视频图象,这些技术可定量确定各分子种类在经染色的生物样品中的相对量。
选择用于实施本发明的抗体,使其对目的生物标志物蛋白具有高特异性。制备抗体和选择合适抗体的方法在本领域是已知的。参见,例如,Celis,编著(即将出版)Cell Biology&Laboratory Handbook,第3版(Academic Press,New York),在此以其全文引用作为参考。在一些实施方案中,可使用商购获得的针对特定生物标志物蛋白的抗体来实施本发明。也可基于想要的细胞学而不是组织学样品的染色来选择本发明的抗体。即,在特定的实施方案中,根据最终的样品形式(即,细胞学制备物)和就结合特异性来选择抗体。
在本发明的一些方面,通过多步筛选法选择和纯化针对特定目的生物标志物的抗体。在特定的实施方案中,筛选多元瘤(polydomas)以鉴定具有想要的特异性和灵敏度性状的生物标志物的特异性抗体。如此处所用的,“多元瘤”是指多个杂交瘤。一般地在多孔组织培养板上提供本发明的多元瘤。在最初的抗体筛选步骤中,产生包含多个正常(即,无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的肿瘤组织微阵列。用于在单张载片上产生多个组织的阵列的方法和设备,例如Advanced Tissue Arrayer在本领域是已知的。参见,例如,美国专利号4,820,504。使用标准的免疫组织化学技术就阳性染色对来自各孔的包含多元瘤的未稀释上清液进行分析。在该起始筛选步骤中,基本上忽略背景,即非特异性结合。选择产生阳性结果的多元瘤并将其用于抗体筛选的第二阶段。
在第二筛选步骤中,将阳性多元瘤接受有限稀释法。使用标准的免疫组织化学技术就CINIII或宫颈癌样品的阳性染色对所得的未经筛查的抗体进行分析。在该阶段,背景染色是相关的,只选择只对异常细胞(即,CINIII和癌细胞)阳性染色的候选多元瘤作进一步分析。
为鉴定可将正常样品和CINI样品与来自标示高度子宫颈疾病(即,CINII和其以上病症)的样品区分开的抗体,产生疾病组组织微阵列。该组织微阵列一般包含多个无CIN的样品、CINI样品、CINII样品、CINIII样品、鳞状细胞癌样品和腺癌样品。使用标准的免疫组织化学技术就只对标示高度子宫颈疾病的样品(即,CINII样品和其以上病症的样品)特异性阳性染色来对候选多元瘤进行测定。选择产生阳性结果和最小背景染色的多元瘤以进行进一步分析。
为了选择单个候选单克隆抗体,将阳性染色的培养物制备为单一克隆。用于分离单个克隆的方法在本领域是熟知的。使用上述的肿瘤和疾病组组织微阵列,就CINII、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的特异性染色来测定来自各克隆的包含未纯化抗体的上清液。选择显示高度子宫颈疾病样品(即,CINII和其以上病症)的阳性染色、其他细胞类型(即,正常样品和CINI样品)的最小染色以及极少背景的候选抗体以进行纯化和进一步分析。通过亲和吸附层析纯化抗体的方法在本领域是熟知的。
为了鉴定高度子宫颈疾病样品中展示最大特异性染色而在子宫颈细胞学样品中展示最小背景(非特异性染色)的抗体,使用本发明的免疫细胞化学技术测定在上述基于免疫组织化学的筛选方法中分离和纯化的候选抗体。在实施例1和2中提供了进行免疫细胞化学法的示例性方案。
具体地,使用纯化的目的抗体测定统计学上显著数目的NIL(即,非浸润性病变)、ASCUS、LSIL、HSIL或癌性子宫颈细胞学患者样品。通过此处描述的免疫细胞化学法分析所述样品,并基于对特定生物标志物的阳性抗体染色将其分类为高度子宫颈疾病阳性、阴性或不确定的类型。计算各抗体的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。为本发明选择在子宫颈细胞学样品中展现最大的高度子宫颈疾病特异性染色和最低背景(即,最大信噪比)的抗体。
合适的抗体的鉴定导致测定的信噪比增加和临床功效上的增加。使用的测定形式和样品类型在合适的抗体的选择中是至关重要的因素。许多针对生物标志物的抗体在使用细胞学制备物的免疫细胞化学形式中或在使用福尔马林固定的石蜡包埋样品的免疫组织化学形式中不产生理想的信噪比。此外,在免疫组织化学形式中产生最大信噪比的生物标志物抗体可能在免疫细胞化学测定法中表现不好。例如,在免疫细胞化学形式中产生理想的染色水平的抗体可能在免疫组织化学测定中不产生合适的染色水平(数据未显示)。同样,当用于免疫组织化学测定时产生可接受的信噪比的抗体可能导致免疫细胞化学样品的过度染色(数据未显示)。因此,抗体的选择需要及早考虑所用的测定形式和最终样品类型。
在不能获得支持免疫细胞化学形式中的染色解释的组织结构的情况下,基于细胞学的测定法(即,免疫细胞化学法)和基于组织的测定法(即,免疫组织化学法)不同。例如,在用针对Claudin1的抗体对来自患有轻度发育异常或鳞状细胞癌的患者的样品进行免疫组织化学测定时,结果显示Claudin1在轻度发育异常样品的病灶中表达(即,淡棕色染色),但在癌症病灶(图12)中明显地过表达(即,暗棕色染色)。在免疫细胞化学测定法中用相同的Claudin1抗体获得的结果是不确定的(图13)。尽管在免疫组织化学测定法中使用Claudin1抗体可容易地检测异常细胞,但在本发明的免疫细胞化学测定法中通过Claudin1染色获得的结果更难以解释。因此,适合于免疫组织化学形式的生物标志物可能不适合于免疫细胞化学测定法,从而不包含在本发明的优选实施方案中。
此外,生物标志物在细胞内的定位也是免疫细胞化学测定法中要考虑的重要问题。展示细胞核、细胞质或膜染色模式的生物标志物可通过形态学的方法进行确定并且适合用于免疫组织化学法。然而,细胞质和膜染色使得在免疫组织化学测定法中鉴定子宫颈疾病的至关重要的形态学特征(例如,核质比)非常困难。参见图15。相反地,在细胞核中表达和显示细胞核染色模式的生物标志物有助于抗体染色的检查,也允许形态学分析。参见图15。因此,在一些优选的实施方案中,只有选择性地在细胞核中表达的生物标志物用于本发明的免疫细胞化学测定法。
本领域技术人员认识到,需要对抗体滴度和检测化学条件进行优化,以使特定抗体的信噪比达到最大。要确定使抗体和本发明的生物标志物的特异性结合最大化并使非特异性结合(或“背景”)最小化的抗体浓度。在特定的实施方案中,通过开始时在福尔马林固定、石蜡包埋的正常组织样品和高度子宫颈疾病组织样品上检测各种抗体稀释度来确定用于子宫颈细胞学制备物的合适的抗体滴度。最先确定针对福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈组织样品的最适宜抗体浓度和检测化学条件。优化抗体滴度和检测条件的设计是常规的,并且在本领域技术员的常规能力范围之内。在确定了针对固定的组织样品的最优条件之后,在相同的条件下将各抗体用于子宫颈细胞学制备物。一些抗体需要额外的最优化以减少背景染色和/或增加细胞学样品中的染色的特异性和灵敏度。
此外,本领域技术人员认识到用于实施本发明方法的特定抗体的浓度视如下因素(如结合时间、抗体对生物标志物蛋白的特异性水平和机体样品制备的方法)的变化而变化。此外,当使用多个抗体时,所需的浓度可能受到向样品中加入所述抗体的顺序(即,作为混合物同时加入或作为单种抗体试剂顺次加入)影响。此外,也必须优化用于显示针对目的生物标志物的抗体结合的检测化学条件,以产生想要的信噪比。
在另一个实施方案中,在核酸水平上检测目的生物标志物的表达。用于评估表达的基于核酸的技术在本领域是熟知的,其包括,例如,确定机体样品中生物标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。可使用不对mRNA的分离进行选择的任何RNA分离技术来从子宫颈细胞纯化RNA(参见,例如,Ausubel等人,编著,(1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,NewYork)。此外,可使用本领域技术人员熟知的技术,例如Chomczynski的单步RNA分离法(1989,美国专利号4,843,155),容易地处理大量组织样品。
术语“探针”是指可选择性地结合明确想要的靶生物分子(例如,核苷酸转录物或由生物标志物编码的蛋白或对应于生物标志物的蛋白)的任何分子。探针可由本领域技术人员合成,或其可来源于合适的生物学制剂。可特别地设计探针以使其被标记。可用作探针的分子的示例包括但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定法,其包括,但不限于,Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于mRNA水平检测的一个方法包括将分离的mRNA和能够与由被检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是,例如,全长cDNA或其部分,例如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下特异性地和编码本发明生物标志物的mRNA或基因组DNA杂交的寡核苷酸。mRNA和探针的杂交表明所述生物标志物正在表达。
在一个实施方案中,将mRNA固定在固体表面上并使其和探针接触,例如通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑胶和将所述mRNA从凝胶转移至膜例如硝酸纤维素上来进行。在可选择的实施方案中,将探针固定在固体表面并将mRNA和探针例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。本领域技术人员可容易地改造已知的mRNA检测方法,使之适合用于检测由本发明的生物标志物编码的mRNA的水平。
用于确定样品中生物标志物mRNA的水平的可选择方法包括核酸扩增的方法,例如,通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利号4,683,202中所示的实验实施方案)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193)、自主序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法,然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果分子以极低的数量存在,则这些检测方案特别适合用于检测这样的核酸分子。在本发明的特定方面,通过荧光定量RT-PCR(即,TaqManSystem)评估生物标志物的表达。这些方法一般使用成对的特异于目的生物标志物的寡核苷酸引物。用于设计特异于已知序列的寡核苷酸引物的方法在本领域是熟知的。
使用膜印迹(例如用于杂交分析的印迹例如Northern、Southern、斑点印迹等)、或微孔、样品管、凝胶、小珠或纤维(或任何包含结合的核酸的固体支持物)监控RNA的生物标志物表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934,其在此引用作为参考。生物标志物表达的检测也可包括使用溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方案中,使用微阵列检测生物标志物的表达。因为不同实验之间的重复性的原因,微阵列特别适合用于该目的。DAN微阵列提供了用于同时测量大量基因的表达水平的一个方法。各阵列由附着至固体支持物上的捕获探针的可重复模式构成。将标记的RNA或DNA和阵列上的互补探针杂交,然后通过激光扫描进行检测。确定阵列上各探针的杂交强度,将其转化为表示相对基因表达水平的数量值。参见,美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316,其在此引用作为参考。高密度的寡核苷酸阵列特别适合用于确定样品中大量RNA的基因表达谱。
使用机械合成法合成这些阵列的技术描述于例如美国专利5,384,261中,在所有情况下以其全文在此引用作为参考。尽管平面阵列表面是优选的,但可将阵列制作在实际上是任何形状的表面或甚至多层表面上。阵列可以是小珠、凝胶、聚合物表面、纤维例如光纤、玻璃或任何其他合适的基底上的肽或核酸,参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992,在所有情况下,各以其全文在此引用作为参考。可以这样的方式包装阵列以使其能够用于诊断学或内含设备的其他操作。参见,例如,美国专利号5,856,174和5,922,591,此处引用作为参考。
在一个方法中,把从样品中分离的总mRNA转变成标记的cRNA,然后将其和寡核苷酸阵列杂交。将各样品和分开的阵列杂交。可通过参考存在于阵列上和样品中的合适对照来计算相对转录水平。
此外还提供了实施本发明方法的试剂盒。“试剂盒”是指包含至少一种用于特异性地检测本发明生物标志物表达的试剂,例如抗体、核酸探针等的任何产品(例如,包装盒或容器)。试剂盒可以作为进行本发明方法的单位形式推销、分发或销售。此外,试剂盒可包含描述试剂盒和其使用方法的说明书。
在特定的实施方案中,提供了用于实施本发明的免疫细胞化学方法的试剂盒。该试剂盒可与下面实施例1中描述的人工和自动化免疫细胞化学技术(例如,细胞染色)相容。这些试剂盒包含至少一种针对目的生物标志物的抗体、用于检测针对生物标志物的抗体结合的化学物质、复染剂和可选地帮助鉴定阳性染色细胞的着色剂。可使用检测抗原-抗体结合的任何化学物质实施本发明。在一些实施方案中,检测化学物质包含缀合至第二抗体的经标记的聚合物。例如,可提供这样的第二抗体,该第二抗体缀合了催化色原在抗原-抗体结合位置沉积的酶。这些酶和使用其检测抗体结合的技术在本领域是熟知的。在一个实施方案中,试剂盒包含缀合至经HRP标记的聚合物的第二抗体。此外还可提供可和缀合的酶相容的色原(例如,在经HRP标记的第二抗体的情况下是DAB)和溶液,例如用于阻止非特异性染色的过氧化氢。在其他实施方案中,通过使用结合小鼠单克隆抗体的小鼠探针试剂,然后加入用结合小鼠探针试剂的HRP缀合的葡聚糖聚合物来检测针对生物标志物蛋白的抗体结合。这些检测试剂可从例如BiocareMedical商购获得。
本发明的试剂盒可进一步包含过氧化物酶封闭试剂(例如,过氧化氢)、蛋白封闭试剂(例如,纯化的酪蛋白)以及复染剂(例如,苏木精)。在试剂盒中还可提供着色剂(bluing agent)(例如,含有Tween-20和叠氮化钠的氢氧化铵或TBS、pH7.4)以帮助检测阳性染色的细胞。
在另一个实施方案中,本发明的免疫细胞化学试剂盒额外地包含至少两种用于特异性地检测至少两种不同生物标志物表达的试剂,例如,抗体。在试剂盒中可以单一试剂或可选择地以包含针对不同目的生物标志物的所有抗体的抗体混合物形式提供各抗体。此外,可在这样的容器(例如密封的容器)中提供任何或所有试剂盒试剂,该容器保护它们免受外部环境的影响。在下面的实施例8中描述了用于实施本发明方法的示例性试剂盒。
可在试剂盒中包含阳性和/或阴性对照以证明根据本发明使用的试剂的活性和正确用法。对照可包含已知对于目的生物标志物的存在是阳性的或阴性的样品,例如组织切片、固定在载片上的细胞等。在特定的实施方案中,阳性对照包含SiHa细胞。该细胞是超三倍体(hypertriploid)并且HPV-16感染阳性的人宫颈鳞状癌细胞系,因此其可用作高度子宫颈疾病状态中的生物标志物过表达的正对照。可在本发明的试剂盒中以制备的载片或与载片制备物相容的细胞悬浮物的形式提供SiHa对照细胞。对照的设计和使用是标准的并且在本领域技术人员的常规能力范围之内。
在其他实施方案中,还提供了用于鉴定(包括在核酸水平上检测生物标志物过表达)高度宫颈的试剂盒。这些试剂盒包含,例如,至少一种特异性地结合生物标志物核酸或其片段的核酸探针。在特定的实施方案中,试剂盒包含至少两种与不同的生物标志物核酸杂交的核酸探针。
在一些实施方案中,本发明的方法可和分析形态学特征的常规细胞学技术一起使用。例如,本发明的免疫细胞化学技术可和常规的Pap染色一起使用,这样保存了来自常规方法的所有形态学信息。这样,生物标志物的检测可减少Pap抹片检查的高假阴性率,并且可有助于大规模的自动化筛查。在特定的实施方案中,如下面实施例6-7中所描述的,在单一方法中将上面公开的免疫细胞化学法和常规的Pap染色组合使用。组合的免疫细胞化学法和Pap染色法允许显现选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物和单一样品(例如,包含单层子宫颈细胞的显微镜载片)中的细胞形态学。组合的免疫细胞化学和Pap染色法可允许更准确的鉴定和诊断高度子宫颈疾病,特别是在被常规的Pap抹片检查检测错误地分类为正常的、LSIL或ASCUS的情况下。在单一方法中对生物标志物的过表达和细胞形态学进行分析可取代Pap抹片检查作为宫颈癌的主要筛选方法。
本领域技术人员认识到需要对该组合方法学的染色参数(例如,温育时间、洗涤时间、色原/染色浓度等)进行优化,以使能够获得免疫细胞化学结果(例如,色原染色)和Pap染色之间的足够反差。使染色参数最优化的测定法的设计是标准的,并且在本领域技术人员的常规能力之内。本发明也包含用于进行组合的免疫细胞化学和Pap染色的方法的试剂盒。如上所述,这些试剂盒包含进行免疫细胞化学法所需的试剂和进行常规的Pap染色所需的试剂,特别是EA50和OrangeG。
本领域技术人员还认识到本发明的方法中的任一步骤或所有步骤可由人执行,或可选择地以自动化的方式进行。因此,可将机体样品制备、样品染色和生物标志物表达的检测的步骤自动化。
通过举例说明的方式但不以限定的方式提供下列实施例:
实施例
实施例1:使用免疫细胞化学法进行的生物标志物过表达的检测
载片的制备和预处理
收集患者宫颈样品并将其放入SurePathTM收集瓶(TriPathImaging,Inc.)。使用PrepStainTM载片处理系统(TriPathImaging,Inc.)从液体培养基中收集子宫颈细胞并将其沉积在载玻片上的薄层中。将制备的载片立即转移至预处理缓冲液(1%RAM)中并在95℃下加热45分钟。将载片冷却至室温,在TBS(tris缓冲盐溶液)中漂洗3次(每次漂洗2分钟)。
人工免疫细胞化学法
为防止非特异性背景染色,不允许在染色过程中使载片变干。此外,为了阻止非特异性染色,对载片施加过氧化氢5分钟,然后用TBS漂洗。在室温下给载片施用将针对MCM6的抗体,进行1小时。在用MCM6抗体温育后,用TBS洗涤载片3次,每次洗涤2分钟。在室温下给载片施用Dako Envision+HRP标记的聚合物第二抗体,进行30分钟,然后用TBS漂洗。施加HRP底物色原DAB10分钟,然后用水漂洗载片5分钟。用苏木精复染各载片,然后用水漂洗直至干净。复染后,将载片浸入氢氧化铵10秒,然后用水漂洗1分钟。
通过将载片浸入95%乙醇1分钟,然后浸入无水乙醇再进行1分钟来对样品进行脱水。通过在二甲苯中漂洗3次,每次漂洗1分钟,来透化载片。然后用永久性封片剂封片,在35℃下烘干。使用明视野显微镜显现阳性染色细胞。
自动化的免疫细胞化学法
按照厂商说明书为Dako Autostainer Universal Staining系统编程,将上述人工免疫细胞化学法中所必需的染色和复染试剂装载入机器。将制备的和预处理的载片装入自动染色仪中,运行程序。在运行结束时,取出载片并在水中漂洗5分钟。如上所述将载片脱水、透化、封片和分析。
实施例2:临床样品中生物标志物的检测
收集大约180个代表各种诊断的子宫颈细胞学患者样品。之前通过阴道镜确定了这些患者中存在或不存在指示高度疾病的癌细胞或者病变。下表显示在该研究中分析的各诊断组内的样品数目和阴道镜判定的描述(例如,高度病变的存在或不存在)。
表1:被分析的样品
诊断 | 计数 | 描述 |
NIL | 72 | HPV阴性 |
ASC-US | 26 | 26个无病变0个具有病变或高危HPV |
LSIL | 48 | 42个高度病变阴性6个高度病变阳性 |
HSIL | 25 | |
癌症 | 10 | 鳞状细胞癌和腺癌 |
通过免疫细胞化学法分析样品以鉴定高度子宫颈疾病。使用抗体检测6个目的生物标志物的过表达:MCM2、MCM6、MCM7、p21Wafl、细胞周期蛋白E和Topo2A。测定对照包括在SiHa细胞系上进行的MCM2、MCM6、MCM7、p21Wafl、细胞周期蛋白E、Topo2A和小鼠IgG阴性。也通过常规的Pap染色技术分析样品。
载片的制备
从贮存室中取出各样品并让其恢复至室温。向各瓶中加入6mlTriPath CytoRich防腐剂并振荡混匀。在TriPathPrepMate自动处理器上处理样品,将小瓶中所有剩余的液体转移至离心管中。在200xg下离心样品2分钟,吸取上清液。然后在800xg下离心样品10分钟,轻轻倒出上清液。将样品管装载至TriPath PrepStain系统上,运行系统软件(版本1.1;Transfer Only)。每个患者样品制备8张载片,在使用Pap染色和免疫细胞化学法之前将其贮存在95%乙醇中至少24小时,但不要超过2周。
Pap染色法
将制备的载片在95%乙醇中温育30秒,然后用水再漂洗30秒。对载片使用苏木精6分钟。在水中漂洗载片1分钟,在酸性水中漂洗2秒和在水中漂洗30秒。使用着色剂(氢氧化铵)30秒,首先在水中漂洗、然后在95%乙醇中漂洗各30秒。使用EA50和OrangeG分钟。在95%乙醇中漂洗载片2分钟,在100%乙醇中漂洗3次,在二甲苯中漂洗3次,每次漂洗30秒。
然后使用Acrytol封片剂封片并在35℃下烘干。由病理学家使用明视野显微镜检查样品。
免疫细胞化学法
从95%的乙醇中取出制备的载片,用去离子水漂洗大约1分钟。将载片置于1X靶修复溶液(Target Retrieval Solution)pH6.0(DAKO S1699)/预热至95℃的dH2O水浴中并置于蒸器中进行25分钟。让样品在室温下冷却20分钟,在去离子水中充分漂洗,将其置于TBS中。基本上按照上述实施例1中,“自动化的免疫细胞化学法”部分所述,就生物标志物表达对预处理的载片染色。按照说明稀释商购获得的针对MCM2(1:200)、MCM7(1:25)、p21wafl(1:100)和细胞周期蛋白E(1:100)的抗体,使用其检测生物标志物的表达。以1:6000的稀释度使用通过实施例4中描述的多元瘤筛选法鉴定的纯化MCM6抗体。
载片的解释
由细胞检验技术员和病理学家筛选和检查各载片。按照下列参数将样品分类为高度子宫颈疾病阳性、阴性或不确定性:
●排除非细胞人工假象和染成棕色(DAB)的炎性细胞。
●当用DAB染色时,成熟的、正常表现的鳞状细胞和正常表现的腺细胞不计为阳性。
●鳞状完全发育细胞和不正常细胞一起被认为是阳性的。
●低于1.5的染色强度被认为是阴性的。
●通过结合载片的检查解决不一致的结果。
将免疫细胞化学法的结果和前面通过阴道镜获得的结果进行比较。然后给予每张载片最终的结果:真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)或不确定性。计算各生物标志物的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。
结果
下面概述了各生物标志物的结果。
表2:MCM2
灵敏度0.8718
特异性0.9478
PPV 0.8293
NPV 0.9621
表3:MCM6
灵敏度0.9459
特异性0.8702
PPV 0.6731
NPV 0.9828
表4:MCM7
灵敏度0.9250
特异性0.8923
PPV 0.7255
NPV 0.9748
表5:细胞周期蛋白E
灵敏度0.7059
特异性0.9779
PPV 0.8889
NPV 0.9301
表6:p21
wafl
灵敏度0.8378
特异性0.8760
PPV 0.6739
NPV 0.9464
表7:TOPO2A
灵敏度0.8919
特异性0.9597
PPV 0.8684
NPV 0.9675
使用本发明的免疫细胞化学法就高度子宫颈疾病的存在分析大约180个病例。在该数目中,MCM生物标志物产生在4%至7%范围内变化的不确定性比率。此外,MCM显示95%的特异性和87%的灵敏度。MCM6和MCM7生物标志物分别产生95%和93%的相当的灵敏度结果。这两个生物标志物的特异性在87%至89%之间。
细胞周期蛋白E产生98%的最高特异性值。尽管不确定性率为6%,但灵敏度只有71%。P21wafl的不确定性率是所有受测试标志物中最高的,为13%。P21wafl产生84%的灵敏度和88%的特异性。对于生物标志物Topo2A,观察到96%的特异性。Topo2A的不确定性率为11%,具有89%的灵敏度。
实施例3:使用抗体混合物进行的临床样品中生物标志物的检测
通过免疫细胞化学法分析大约180个通过阴道镜确定的子宫颈细胞学样品以鉴定高度子宫颈疾病。就多个目的生物标志物的表达分析各样品。具体地,就其检测高度子宫颈疾病的能力对针对MCM2、MCM6、MCM7、p21wafl、细胞周期蛋白E和Topo2A的抗体的各种组合进行分析。使用免疫细胞化学法和实施例2中所述的载片解释指南就多个目的生物标志物的表达对这些样品进行评估。
将免疫细胞化学结果和前面通过阴道镜获得的结果进行比较。然后给各载片以真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)或不确定性的最终结果。计算各生物标志物的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。
结果
下面概述各生物标志物的结果。
表8:MCM2和MCM7
灵敏度0.9268
特异性0.8810
PPV 0.7170
NPV 0.9737
表9:MCM6和MCM7
灵敏度0.9500
特异性0.8516
PPV 0.6667
NPV 0.9820
表10:MCM7和TOP02A
灵敏度0.8889
特异性0.8906
PPV 0.6957
NPV 0.9661
表11:MCM7和细胞周期因子E
灵敏度0.9268
特异性0.8923
PPV 0.7308
NPV 0.9748
表12:MCM7和p21waf1
灵敏度0.9250
特异性0.8376
PPV 0.6607
NPV 0.9703
表13:MCM2和MCM6
灵敏度0.9487
特异性0.8450
PPV 0.6491
NPV 0.9820
表14:MCM2和TOPOIIA
灵敏度0.8409
特异性0.9231
PPV 0.8043
NPV 0.9391
表15:MCM2和细胞周期蛋白E
灵敏度0.8537
特异性0.9318
PPV 0.7955
NPV 0.9535
表16:MCM2和p21wafl
灵敏度0.8780
特异性0.8644
PPV 0.6923
NPV 0.9533
表17:TOP02A和细胞周期蛋白E
灵敏度0.8947
特异性0.9520
PPV 0.8500
NPV 0.9675
表18:TOP02A和D21waf1
灵敏度0.9268
特异性0.8522
PPV 0.6909
NPV 0.9703
表19:p21waf1和周期蛋白E
灵敏度0.8684
特异性0.8760
PPV 0.6875
NPV 0.9550
表20:MCM2、MCM6和MCM7
灵敏度0.9500
特异性0.8400
PPV 0.6552
NPV 0.9813
表21:MCM2、MCM7和TOPO2A
灵敏度0.9512
特异性0.8739
PPV 0.7222
NPV 0.9811
表22:MCM6、MCM7和TOPO2A
灵敏度0.9512
特异性0.8455
PPV 0.6724
NPV 0.9811
表23:MCM6、MCM7和细胞周期蛋白E
灵敏度0.9500
特异性0.8516
PPV 0.6667
NPV 0.9820
表24:MCM2、MCM7和细胞周期蛋白E
灵敏度0.9268
特异性0.8810
PPV 0.7170
NPV 0.9737
表25:MCM2、MCM7和p21waf1
灵敏度0.9268
特异性0.8319
PPV 0.6667
NPV 0.9691
表26:MCM2、TOPOIIA和细胞周期蛋白E
灵敏度 | 0.9250 |
特异性 | 0.9180 |
PPV | 0.7872 |
NPV | 0.9739 |
表27:MCM2、细胞周期蛋白E和p21wafl
灵敏度 | 0.8780 |
特异性 | 0.8644 |
PPV | 0.6923 |
NPV | 0.9533 |
表28:MCM2、TOPOIIA和p21waf1
灵敏度 | 0.9268 |
特异性 | 0.8482 |
PPV | 0.6909 |
NPV | 0.9694 |
表29:MCM7、TOPO2A和细胞周期蛋白E
灵敏度0.9512
特异性0.8852
PPV 0.7358
NPV 0.9818
表30:MCM7、p21waf1和细胞周期蛋白E
灵敏度0.9268
特异性0.8362
PPV 0.6667
NPV 0.9700
表31:MCM7、p21waf1和TOPO2A
灵敏度0.9512
特异性0.8273
PPV 0.6724
NPV 0.9785
表32:MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E和p21wafl
灵敏度0.9268
特异性0.8319
PPV 0.6667
NPV 0.9691
表33:MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E和TOPOIIA
灵敏度0.9512
特异性0.8739
PPV 0.7222
NPV 0.9811
表34:MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E、p21waf1和TOPO2A
灵敏度0.9512
特异性0.8241
PPV 0.6724
NPV 0.9780
表35:MCM2、MCM6、MCM7、TOPO2A、细胞周期蛋白E和p21waf1
灵敏度0.9512
特异性0.7818
PPV 0.6190
NPV 0.9773
汇集上述关于28个抗体混合物的数据。使用包含针对2、3、4、5或甚至所有6个目的生物标志物的抗体的混合物对生物标志物的表达进行分析。28个抗体混合物中的21个显示大于92%的灵敏度。28个混合物的4个产生高于90%的特异性,最低值为78%。MCM2、TOPOIIA和细胞周期蛋白E的组合获得最高值。该混合物产生93%的灵敏度和92%的特异性。可以看出至少3个生物标志物的组合应当产生大于90%的灵敏度。要认识到,对测定法的调整可进一步增加该测定法的灵敏度和特异性。
实施例4:使用抗体混合物对生物标志物表达的检测
使用各种针对细胞周期蛋白E、MCM2、MCM6、MCM7、p21wafl和TOPO2a的抗体的组合制备抗体混合物。各混合物的组成列于下表。
表36:抗体混合物的组合
混合物编号 | 生物标志物 |
混合物1 | Cyclin E,MCM2,MCM7 |
混合物2 | Cyclin E,MCM6,MCM7 |
混合物3 | Cyclin E,MCM7,p21wafl |
混合物4 | Cyclin E,MCM7,topO2a |
混合物5 | MCM2,MCM7,p21wafl |
混合物6 | MCM6,MCM7,p21wafl |
混合物7 | MCM7,p21wafl,topO2a |
混合物8 | MCM2,MCM7,topO2a |
混合物9 | MCM6,MCM7,topO2a |
混合物10 | MCM2,MCM6,MCM7 |
混合物11 | Cyclin E,MCM2,MCM6,MCM7,p21waf1,topO2a |
混合物12 | Cyclin E,MCM2,MCM7,p21wafl |
混合物13 | MCM2和MCM7 |
混合物14 | MCM7和p21wafl |
混合物15 | MCM7和CyclinE |
混合物16 | MCM2和p21wafl |
混合物17 | Cyclin E和p21wafl |
混合物18 | MCM2和CyclinE |
混合物19 | MCM7和topO2a |
混合物20 | MCM2和topO2a |
混合物21 | CyclinE和topO2a |
混合物22 | p21wafl和topO2a |
通过合并HSIL事例(HSIL库)和NIL事例(NIL库)来制备两组子宫颈细胞学样品。然后在HSIL库和NIL库上检验各抗体混合物。也将生物标志物抗体单个地作为对照进行检验。如实施例2中所述,进行载片制备和自动化的免疫细胞化学法。
由细胞检验技术员和病理学家筛查和检查载片。在筛选过程中记录的标示高度子宫颈疾病的细胞的特异性染色、腺细胞的染色、细菌交叉反应性和细胞染色的位置都是可变的。
当和使用单一生物标志物的检测获得的结果相比时,使用生物标志物抗体混合物的免疫细胞化学法的结果显示在HSIL库中标示高度子宫颈疾病的细胞的染色增加。此外,当混合物中抗体的数目从2增加至3、4或6时背景没有明显的增加。另外,当在NIL库上进行检验时,各种抗体的混合物没有显示背景染色上的增加。
实施例5:使用免疫细胞化学法对宫颈样品中生物标志物的过表
达进行检测
载片制备和预处理
如上面实施例1中所述收集患者宫颈样品。通过System使用“prep only”模式制备包含单层子宫颈细胞的载片。立即将制备的载片置于预处理缓冲液(去离子水中的0.5%月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(Sandopan LS))中进行最少1小时、最多72小时。将预处理的载片放入95℃下的蒸器中进行45分钟而无需预热。从蒸器中取出载片,让其在室温下冷却20分钟,然后在去离子水中充分漂洗。在TBST(TBS/Tween-20)中漂洗载片2次,每次漂洗2分钟。轻拍载片以除去多余的缓冲液并将其放入湿盒。如下所述,将载片接受人工或自动化的免疫细胞化学法。
人工免疫细胞化学法
给各载片施用200μl过氧化物酶封闭剂(0.03%过氧化氢)以覆盖细胞沉积区域,进行5分钟的时间。然后用TBST漂洗载片3次,每次漂洗2分钟。除去过量的缓冲液,然后将载片放入湿盒。给各载片施用200μl蛋白封闭剂(纯化的酪蛋白和表面活性剂)并将其温育5分钟。在除去过量蛋白封闭剂后,将载片放入湿盒中。
给各载片施用200μl包含2种针对MCM2的小鼠抗人抗体(0.39mg/ml的克隆27C5.6,1:800的稀释度;0.918mg/m l的克隆26H6.19,1:10,000的稀释度)的第一单克隆抗体混合物和特异于Topo2A(100μg/ml的克隆SWT3D1,1:10,000稀释度)的第三种鼠抗人抗体,以完全覆盖细胞沉积区域。将载片温育30分钟,然后用TBST漂洗3次,每次漂洗2分钟。除去多余的缓冲液,再将载片放回湿盒中。如上施用200μl结合小鼠单克隆抗体的探针试剂,进行20分钟。用TBST漂洗载片3次,每次漂洗2分钟。除去多余的缓冲液,再将载片放入湿盒。
如上施用200μl这样的结合小鼠探针试剂的聚合物试剂进行20分钟,该聚合物试剂包含缀合有HRP和第二山羊抗小鼠抗体的葡聚糖聚合物,然后用TBST漂洗载片3次,每次漂洗2分钟。在除去多余的缓冲液后,将载片放回湿盒。如上施用200μl DAB底物色原溶液,进行5分钟。用去离子水漂洗载片5分钟,然后用TBST漂洗2分钟,其间更换一次缓冲液。如前所述,除去多余的缓冲液,将载片放入温盒。加入200μl苏木精,进行1分钟,然后用去离子水漂洗3次,每次漂洗2分钟。除去多余的去离子水,将载片放入湿盒。给各载片施用200μl着色剂(即,含有tween-20和叠氮化钠的TBS,pH7.4),进行1分钟。然后在TBST中漂洗(其间更换一次TBST)载片和在去离子水中漂洗(其间更换一次水)载片,各进行2分钟。然后如实施例1和2中所述对载片进行脱水、透化、封片和分析。
自动化的免疫细胞化学法
按照厂商说明书为自动化染色仪编程,包括下列顺序步骤:
a.2次缓冲液漂洗(TBST)
b.5分钟过氧化物酶封闭
c.2次缓冲液漂洗(TBST)
d.5分钟蛋白封闭,吹风(blow)
e.30分钟一抗混合物温育
f.3次缓冲液漂洗(TBST)
g.20分钟小鼠探针试剂温育
h.3次缓冲液漂洗(TBST)
i.20分钟聚合物-HRP温育
j.3次缓冲液漂洗(TBST)
k.5分钟DAB(加1滴色原至1ml缓冲液中)
1.3次水漂洗
m.2次缓冲液漂洗(TBST)
n.1分钟Mayer′s苏木精染色
o.3次水漂洗
p.1分钟着色剂
q.1次缓冲液漂洗(TBST)
r.1次水漂洗
将必需的染色剂和复染试剂装入机器。将制备的和经预处理的载片加载到自动化染色仪上,运行上述程序。在运行结束时,取出载片用自来水短暂漂洗。如实施例1和2中所述对载片进行脱水、透化、封片和分析。
结果
表37:NIL事件(n=45)
表38:HSIL事件(n=45)
在45个测试的NIL事件中,经Pap染色的载片的检查显示一个ASC-US事件。NIL样品的免疫细胞化学(ICC)结果呈阴性,一个事件被认为不满足评估的要求。对于HSIL事件,基于经Pap染色的载片的检查,45个事件中的每一个都被确定为高度子宫颈疾病。此外,在ICC测定中45个HSIL事件中的每一个也呈阳性。阴性对照,即施用于SiHa细胞系对照的通用小鼠IgG对照,在ICC测定中产生阴性结果。阳性对照,即用于SiHa细胞系对照的一抗混合物在ICC测定中产生阳性结果。
实施例6:组合的免疫细胞化学和Pap染色法
如上面实施例子1中所述收集患者子宫颈样品。如实施例5中所述制备和预处理包含单层子宫颈细胞的载片。将经预处理的各载片接受自动化的免疫细胞化学和Pap染色法,从而允许在单张载片上显现生物标志物的过表达和细胞形态学。
自动化免疫细胞化学法
如上面实施例5中所述在各载片上进行自动化免疫细胞化学法。在染色程序结束时,从自动化染色仪中取出载片,用自来水漂洗3-5分钟。然后如下所述,按照常规Pap染色法对各载片进行染色。
Pap染色法
在进行自动化免疫细胞化学法之后,进一步用Pap染色法对各载片进行染色。首先在95%乙醇中漂洗载片30秒。给一半载片施用EA50和Orange G3分钟,给剩下的载片施用EA50和Orange G6分钟。然后在95%乙醇中漂洗所有载片2次,在100%乙醇中漂洗3次,在二甲苯中漂洗3次,每次漂洗30秒。然后如上面实施例1和2中所述用永久性封片剂对载片进行封片并对其进行分析。
结果
在Pap染色法中,使5个NIL和5个HSIL事件的组各自接受3分钟或6分钟的使用EA50和Orange G的染色。结果显示3分钟和6分钟染色方案之间的差异很小。接受3分钟Pap染色的载片表现稍微较弱的染色。此外,用Pap复染容易地观察ICC阳性染色的HSIL细胞。
实施例7:组合的免疫细胞化学和Pap染色法(Pap染色的最优
化)
为使免疫细胞化学法的色原(即,DAB)染色和Pap染色的水平之间的反差最大,修改实施例6中概述的组合免疫细胞化学和Pap染色法以优化Pap染色参数。
如上面实施例6中所述制备、预处理载片,并使其接受自动免疫细胞化学法。然后基本上按照实施例6中所描述的,并作下述改动,用常规Pap染色对载片进行染色。使用Harris制剂和Myers制剂检测苏木精。施用EA/Orange G3分钟或6分钟。此外,在加入EA/OrangeG后更换95%的乙醇3次。
基于免疫细胞化学染色将载片确定为阳性、阴性或不确定性。此外,从形态学上对载片进行评估以便与即将进行的Pap诊断进行比较。
结果
表39:组合免疫细胞化学和PaD染色法的结果
进行的Pap诊断 | ICC结果 | 备注 |
NILN=7 | 阴性 | 所有事件被确定为NIL |
LSILN=6 | 阴性 | 6个LSIL中的5个在载片上没有LSIL细胞。这些事件是NIL或ASC-US。 |
HSILN=6 | 阳性 | 所有事件被确定为HSIL |
癌症n=4 | 阳性 | 所有事件是鳞状细胞癌 |
组合的ICC和Pap染色法允许进行形态学分析和生物标志物过表达的估量。需要其他的实验来进一步最优化所述方法。
实施例8:用于检测子宫颈样品中生物标志物过表达的免疫细胞
化学法试剂盒
I.方法的原理
免疫细胞技术检测试剂盒包含完成常规制备的单层宫颈样品的三步骤免疫细胞化学染色法所需要的试剂。在用单克隆抗体混合物温育后,该试剂盒使用基于葡聚糖技术的立即可使用的显色剂。该试剂由第二山羊抗小鼠抗体分子和连接至葡聚糖聚合物主链的辣根过氧化物酶分子组成。随后加入的色原的酶促转化导致在抗原位置上形成可见的反应产物。然后用苏木精复染样品,使用着色剂,对载片进行封片。使用光学显微镜解释结果。当目的细胞被染成棕色时,获得指示宫颈高度疾病的阳性结果。
可使用自动成象设备建立潜在阳性细胞的图库。然后检查图库以确定阳性结果或阴性结果。
所述免疫细胞化学检测试剂盒可用于人工和自动染色。
II.提供的试剂
免疫细胞化学检测试剂盒包含下列材料,其足以满足75个单层制备物,每个制备物使用200μl立即可使用的小鼠单克隆抗体混合物:
表40:免疫细胞化学法试剂盒组分
瓶号 | 量 | 描述 |
1a | 1x15mL | 过氧化物酶-封闭剂:缓冲的过氧化氢和稳定剂和合适的组分 |
1b | 1x15mL | 蛋白封闭剂:纯化的酪蛋白和含有防腐剂与表面活性剂的经修饰PBS中的蛋白的合适组合 |
2 | 1x15mL | 小鼠抗人抗体的混合物:在含有Tween20、pH7.4的TRIS缓冲溶液中提供的立即可使用的单克隆抗体混合物。包含0.39mg/mL MCM2mAb克隆27C5.6(1:800的稀释度)、0.918mg/mL MCM2mAb克隆26H6.19(1:10000的稀释度)、稳定蛋白和抗微生物剂 |
3a | 1x15mL | 小鼠探针试剂:结合小鼠单克隆抗体 |
3b | 1x15mL | 聚合物试剂:缀合有结合小鼠探针试剂的辣根过氧化物酶的聚合物 |
4a | 1x18mL | DAB底物缓冲液:用于制备DAB色原的底物缓冲液 |
4b | 1x1mL | DAB色原:3,3’-二氨基联苯胺色原溶液 |
5 | 1x18mL | 苏木精复染液:水性的Mayers苏木精 |
6 | 1x18mL | 着色剂:含有Tween20和0.09%NaN3的Tris缓冲盐溶液,pH7.4 |
下列材料和试剂是进行免疫细胞化学法所需但试剂盒中未提供的:
●吸收剂Wipes
●SiHa细胞系(TriPath Imagi ng,Inc.)
●去离子或蒸馏水
●乙醇(95%和100%)
●玻璃盖片
●Gloves
●湿盒
●光学显微镜(10x、20x、40x物镜)
●封片剂
●移液器和移液器吸头(能够递送20μl、200μl和1000μl体积)
●SureSlide制备缓冲液(TriPath Imaging,Inc.)-预处理缓冲液(去离子水中的0.5%月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(SandopanLS))
●染色缸或或水浴
●定时器(能够1-60分钟的时间间隔)
●Tris缓冲盐溶液(TBS)
●Tween20
●通用小鼠IgG阴性对照
●涡旋器
●二甲苯或二甲苯替代物
●蒸器(Steamer)/水浴锅
III.使用说明书
样品制备
进行下列制备宫颈样品的步骤:
●参考用于从残留样品制备载片的SurePath PrepStainSystemTM的操作员手册。
●向SurePathTM瓶(大约2mL)中的残留样品加8mLSurePathTM防腐液。使用标准技术在PrepMateTM上和使用GYN版本1.1,Slide Preparation在PrepStainTM上处理经稀释的样品。
●在免疫染色之前,将制备的载片立即放入预处理缓冲液中最短1小时,最长72小时。
●为了获得最优化的试剂盒性能,必须使用抗原表位修复法。该方法包括在室温下将制备的载片浸于预处理缓冲液中最短1小时,然后在预处理缓冲液中加热载片至95℃。将载片在95℃下保持15分钟,让其在室温下冷却20分钟。推荐使用经校准的水浴锅或能够保持所需温度的蔬菜蒸器(vegetable steamer)。位于更高海拔的实验室应当确定保持所需温度的最好方法。在抗原表位修复和冷却后立即开始染色过程。偏离所述方法可影响结果。
试剂制备
在染色前制备下列试剂:
含有0.05%Tween20的Tris缓冲盐溶液(TBST)
●按照厂商说明书制备TBS。
●以0.05%的终浓度加入Tween20。
●如果在一周内使用,在室温下贮存。
●未使用的溶液可在2-8℃下贮存3个月。
●溶液是清亮和无色的。如果出现混浊弃去稀释的溶液。
底物色原溶液(DAB)(足够5张载片的体积)
●将1mL DAB缓冲的底物移入试管。
●加入一滴(20-30μL)DAB+色原。充分混合并用移液器加至载片上。
●每天重新配制底物-色原溶液。
●溶液中产生的任何沉淀不影响染色质量。
IV.染色方案(在室温下进行,20-25℃)
进行下列步骤以便对子宫颈细胞学样品进行免疫染色:
染色方法注意事项:
●用户应当在使用前仔细阅读这些说明书并且熟悉所有成分。
●在免疫染色前将所有试剂平衡至室温(20-25℃)。在室温下进行所有温育。
●在染色过程中不要让载片变干。变干的细胞制品可表现增加的非特异性染色。将盖片暴露于通风处(drafts)。应当将载片置于温盒中以进行长时间温育。
抗原表位修复
●将制备的载片置于预处理缓冲液,最短1小时至最长72小时。
●在95℃下温育15分钟。
●将整个科普林缸和载片从水浴锅或蒸器中取出,让载片在缓冲液中冷却20分钟。
●用双蒸水漂洗载片并转移至TBST水浴中。
过氧化物酶封闭
●使多余的缓冲液流出。
●将载片放入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●施加200μL过氧化物酶封闭剂覆盖细胞沉积区域。
●温育5分钟(±1分钟)。
●在TBST中漂洗,更换3次,每次2分钟。
蛋白封闭
●使多余的缓冲液流出。
●将载片放入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL蛋白封闭剂完全覆盖细胞沉积区域。
●温育5分钟(±1分钟)。
●不漂洗载片。
一抗混合物
●使多余的蛋白封闭液流出。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL一抗混合物(以完全覆盖细胞沉积区域)。
●在室温下温育30分钟。
●使用洗瓶(不要将液流直接对着细胞沉积区域)用TBST单个地漂洗每张载片。将载片装入载片架中。
●在TBST中漂洗载片,更换3次,每次2分钟。
检测化学法
●使多余的缓冲液流出。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL小鼠探针以完全覆盖细胞沉积区域。
●温育20分钟(±1分钟)。
●在TBST中漂洗载片,更换3次,每次2分钟。
●使多余的缓冲液流出。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL聚合物以完全覆盖细胞沉积区域。
●温育20分钟(±1分钟)。
●在TBST中漂洗载片,更换3次,每次2分钟。
●流出多余的缓冲液。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL DAB工作溶液以完全覆盖细胞沉积区域。
●温育5分钟(±1分钟)。
●在diH2O中漂洗载片5分钟。
复染
●在TBST中漂洗载片,更换1次,进行2分钟。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL苏木精以完全覆盖细胞沉积区域。
●温育1分钟(±10秒)。
●在流动的H2O中漂洗载片3分钟。
●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。
●使用200μL着色剂使载片着色,进行1分钟(±10秒)。
●重复流水漂洗1分钟。
封片
●将载片浸入95%乙醇中,1分钟或25次浸入。
●将载片浸入无水乙醇,更换4次,每次1分钟或25次浸入。
●用二甲苯透化,更换3次,每次1分钟或25次浸入。
●使用玻璃盖玻片用非水性、永久性封片剂遮盖载片。
V.质量控制
当使用本实施例中描述的免疫细胞化学法试剂盒时考虑下列质量控制问题:
结果的可变性通常来源于样品操作中的差异和检测方法中的变化。参考免疫细胞化学法的NCCLS质量保证的提议的质量控制指南以获得额外的信息。
可从TriPath Imaging,Inc.商购获得对照细胞系。各瓶装有被作为临床样品以相似的方式进行处理的宫颈癌细胞系。在各染色方法中应当染两张载片。对照载片细胞系的评估显示染色进行的有效性。
VI.染色的解释
对照载片:
首先检查用免疫细胞化学检测试剂盒染色的对照载片以确定所有试剂功能正常。细胞的细胞核中棕色(3,3′-二氨基联苯胺四盐酸,DAB)反应产物的存在表示阳性反应性。
患者的样品:
由细胞检验技术员或病理学家使用光学显微镜进行载片评估。人工地检查细胞或通过电子技术将其贮存在来源于光学显微镜的图象库中。
收集大约1610个代表各种诊断的宫颈样品。下表显示在各诊断组(通过常规Pap染色法或活组织检查确定的)中使用免疫细胞化学试剂盒分析的样品的数目。
表41:各诊断组(PaD染色)中的患者样品
细胞学结果 | 数目 | % |
NIL | 671 | 41.7% |
LSIL | 395 | 24.53% |
ASCUS | 349 | 21.68% |
HSIL | 150 | 9.32% |
ASCH | 38 | 2.36% |
AGUS | 6 | 0.37% |
SCC | 1 | 0.06% |
总计 | 1610 |
表42:各诊断组(活组织检查)内的患者样品
活组织检查结果 | 数目 | % |
NIL | 968 | 60.20% |
CIN1 | 369 | 22.95% |
CIN2 | 140 | 8.71% |
CIN3 | 131 | 8.15% |
遗失 | 2 | |
总计 | 1610 |
载片打分指导
进行下列步骤以给通过本实施例中描述的免疫细胞化学法分析的所有载片打分:
步骤1:其是恰当的样品吗?
The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology(第2版)指出,“恰当的基于液体的制品应当具有至少5000个良好显现的/良好保存的鳞状细胞的估量最低值。”当评估所有载片时使用这些相同的标准。然而,正如常规的Pap制备一样,按照定义,具有表现阳性分子反应的异常细胞的任何样品是符合评估要求的。如果对该步骤的回答是“是”,那么细胞检验技术员进行下一步骤;如果回答是“否”,那么该结果不符合评估要求。
步骤2:在上皮细胞中存在中度至强烈的棕色细胞核染色吗?
用于本实施例的免疫细胞化学法试剂盒(例如,SureDetectDetection Chemistry试剂盒)的检测化学药品将和≥CIN2相关的发育异常细胞核染上棕色色源DAB。对该步骤回答“是”,就容易显现的棕色染色对样品进行分析。如果只看到微弱的棕色或呈现“红色”的棕色,那么不足以确保其是阳性。如果没有看到棕色的细胞核染色,则认为其是阴性检测结果。如果具有足够的棕色染色,分析进入下一步骤。
步骤3:这是具有棕色细胞核染色的鳞状细胞(或腺)细胞吗?
该细胞≥ASC(AGC)吗?
使用The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology(第2版)(“TBS”)中概述的相同形态学标准,确定含有棕色细胞核的鳞状细胞是否≥ASC(非典型性鳞状细胞)。这包括ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL和癌细胞。如果细胞在外表上是腺细胞,那么使用确定细胞是否≥AGC(非典型性腺细胞)的TBS标准。其包括子宫颈内AGC、子宫内膜AGC、AIS和腺癌。如果细胞被认为≥ASC(或≥AGC),那么这将导致阳性结果。如果所述细胞和NILM(上皮内病变或恶性肿瘤呈阴性)一致,那么这应该是阴性检测结果。
VII.结果
最初通过常规Pap染色法分类为NIL的27个事件在免疫细胞化学检测中被染成阳性。根据通过行业认证的病理学家(aboardcertified pathologist)的检查,在这27个事件中,7件被分类为HSIL,10件为ASC-H,3件为ASC-US,3件为不确定事件。7个HSIL事件被认为是高度子宫颈疾病。在免疫细胞化学测定中通过阳性免疫染色鉴定了这27个事件,从而显示此处公开的用于鉴定通过Pap染色被错误分类为NIL的患者的方法的价值。
没有获得所有NIL样品的活组织检查结果。基于和“黄金标准”活组织检查结果的比较计算本实施例中描述的免疫细胞化学法的灵敏度和阳性预测值(PPV)的估计值。单一的活组织检查作为黄金标准具有局限性。通过对患者的系列监控或使用积极手术终点例如电圈切除术(loop electrosurgical excision procedure)或锥形活组织检查将提高ICC测定法的PPV。已知单一的活组织检查具有至少31%的疾病的假阴性结果。参见Elit等人(2004)J.LowerGenitalTractDisease8(3):181-187。
表43:基于活组织检查结果的I CC检测法的估量的灵敏度和阳性
预测值
ASC-H | ASCUS | LSIL | HSIL | >ASCUS | |
灵敏度 | 76.5%(52.7%,90.4%)* | 92.6%(76.6%,97.9%) | 97.7%(92.1%,99.4%) | 98.5%(94.6%,99.6%) | 96.2%(93.1%,97.9%) |
PPV | 59.1%(38.7%,76.7%) | 26.0%(18.3%,35.6%) | 31.0%(25.9%,36.7%) | 90.1%(84.1%,94.0%) | 46.9%(42.8%,51.2%) |
*(95%的置信区间)
也将免疫细胞化学法的灵敏度和PPV与用常规Pap染色获得的灵敏度和PPV进行比较。使用Pap染色的两个临床终点(即,≥LSIL和≥HSIL)。同样,所有计算的标准是活组织检查的结果。
表44:Pap检测法和免疫细胞化学法的比较
>LSIL(采用Pap检验法) | >HSIL(采用Pap检验法 | >ASCUS(采用ICC) | |
灵敏度 | 76.5%(52.7%,90.4%)* | 92.6%(76.6%,97.9%) | 97.7%(92.1%,99.4%) |
PPV | 59.1%(38.7%,76.7%) | 26.0%(18.3%,35.6%) | 31.0%(25.9%,36.7%) |
*(95%的置信区间)
表42中提供的结果表明免疫细胞化学法检测出更多的高度子宫颈疾病样品,同时保持高PPV。
在使用免疫细胞化学试剂盒的本研究中有14个假阴性。对该14个患者样品中的13个进行HPV检测。没有获得其中一个假阴性患者的多余样品。
使用Tissue DNA试剂盒(BD Clontech,Cat#635967)从宫预细胞学样品分离基因组DAN。为了进行质量控制,进行β珠蛋白(一种管家基因)的PCR分析。
如本领域中所述通过常规的L1PCR用MY09/11引物组和通过嵌套式PCR用MY09/11和GP5+/6+引物组进行HPV L1基因的扩增以提高检测灵敏度。进一步对L1扩增子进行DNA测序以鉴定存在的HPV的类型。
从13个临床细胞学样品中的10个样品中分离出质量好的基因组DNA。如通过β珠蛋白PCR分析所显示的,3个样品具有质量差的基因组DNA。在13个样品中的10个样品中,使用常规的L1PCR(用MY09/11引物)和嵌套式L1PCR(用MY09/11和GP5+/6+引物)不能检测到HPVDNA或HPV DNA经检测呈阴性。该数据表明,假定HPV对于高度子宫颈疾病呈阳性(>92%的灵敏度),那么对于大部分假阴性样品发生了取样错误。
实施例8:MCM6抗体的抗择
多元瘤筛选
筛选多孔组织培养板中提供的多元瘤以鉴定具有想要的灵敏度和特异性性质的MCM6生物标志物特异性抗体。产生在单张载片上包含多个正常(即无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的组织微阵列。就组织微阵列的阳性染色对来自各孔的包含多元瘤的未稀释上清液进行分析。在该阶段基本上忽略背景,即非特异性结合。35个受试多元瘤中的11个产生阳性染色结果,选择其以作进一步分析。
为了确定选择的多元瘤的特异性,将用所述多元瘤上清液获得的染色模式和用商购获得的MCM6抗体(BD Transduction Laboratories)的染色模式进行比较。用所述多元瘤上清液获得的染色模式似乎比用商购获得的MCM6抗体(图17)观察到的染色模式更具特异性。
然后将11个选择的多元瘤接受有限稀释法。就包含多个正常(即,无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的组织微阵列的阳性染色对30个由选择的多元瘤的上清液产生的有限稀释度进行测定。基于异常和癌性宫颈组织样品的阳性染色选择两个作为最好的上清液的有限稀释度克隆9D4.3和9D4.4。然后就其和NIL、LSIL、HSIL组织的反应性检测这些克隆的不同稀释度并合并基于液体的细胞学样品。1:100稀释度的克隆9D4.3产生最大的信噪比,选择其以作进一步的表征。
MCM6,克隆9D4.3的表征
为了进一步表征克隆9D4.3,就40个基于液体的细胞学样品的阳性染色对该克隆进行测定,所述细胞学样品选自下列诊断类别:NIL(7)、LSIL(10)、HSIL(18)和宫颈癌(5)。使用PrepStainTM载片处理器(TriPath Imaging,Inc.)制备40个样品中每一个样品的载片。每个样品的两张载片各用MCM2抗体(Dako)和克隆9D4.3进行染色。剩下的载片用于PAP染色或作为阴性对照。
为制备载片,将各样品在200xg下离心2分钟以形成沉淀,轻轻倒出上清液。向各样品中加入2mL去离子水,涡旋样品,然后在600xg下离心5分钟。在轻轻倒出上清液后,加入另外的700μL tris缓冲的水。最后将样品装在PrepStainTM载片处理器(Tripath Imaging,Inc.),版本1.1上,运行Transfer Only程序。
制备后,将所有载片保持在95%的ETOH中至少24小时并且不超过3天。通过将载片置于1x靶修复溶液(Target Retrieval Solution)pH6.0(DAKO S1699)/dH2O浴(预热至95℃)中,在蒸器中进行25分钟来实现MCM2的抗原修复。对于MCM6,通过将载片放入1x Tris pH9.5缓冲液(Biocare)/dH2O水浴(预热至95℃)中,在蒸器中进行25分钟来实现抗原的可接近性。在蒸后,让所有载片在室温下冷却20分钟。
通过使用实施例1(“自动化免疫组织化学法”)中所述的DAKO通用自动化染色仪的免疫组织化学法,来对载片进行染色。由经验丰富的细胞检验技术员就通过形态学确定的诊断分类来对载片进行筛选和评估。就标志物染色强度(0-3)、阳性染色细胞的百分比和标志物染色的定位(细胞核、细胞质、膜或其组合)来评估样品。细胞染色强度按0-3评分。对细胞评分≥1.5的进行计数。当表现成熟正常的鳞状细胞和表现正常的腺细胞染色呈棕色时,不将其当作阳性计数。然而,将鳞状成熟细胞和异常细胞作为阳性计数。然后将免疫细胞化学载片命名为TN(真阴性)、FN(假阴性)、TP(真阳性)或FP(假阳性)。
表45:克隆9D4.3(MCM6)
表46:MCM
使用的计算
灵敏度=TP/(TP+FN)
特异性=TN/(FP+TN)
阳性预测指数(Positive Predictive Power,PPP)=TP/(TP+FP)
阴性预测指数(Negative Predictive Power,NPP)=TN/(FN+TN)
将克隆9D4.3的灵敏度和特异性与用商购获得的MCM2抗体获得的相当。一个NIL事件对于两个抗体都呈阴性。在使用克隆9D4.3和商购获得的MCM2抗体的情况下,10个LSIL事件中的9个为阴性。在使用9D4.3和商购获得的MCM2抗体的情况下,24个HSIL事件中的23个为阳性。对于宫颈癌样品,在使用克隆9D4.3的情况下,所有5个样品都为阳性,在使用MCM2抗体的情况下,5个样品中的4个为阳性。
MM6、克隆9D4.3的纯化
由于其灵敏度、特异性和显示细胞核染色模式的原因,纯化克隆9D4.3以作进一步分析。按照标准方法,使用StreamlinerProteinA(Amersham Biosciences)亲和吸附层析获得纯化的抗体。然后在1:500和1:6000之间的各种稀释度下就对HSIL的基于液体的子宫颈细胞学集库(pool)的反应性对所得的抗体溶液进行检测。在达到1:6000的滴度时,信号仍然明显。
实施例10:临床组织样品中生物标志物的实时PCR检测
使用ABI Prism7700序列检测系统(Applied Biosystems)进行实时PCR。在本研究中,在Primer ExpressTM程序,版本1.5(Applied Biosystems)的帮助下,设计用于靶宫颈生物标志物(即,MCM7、p21waf、p14ARF/p16、细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白E2)的特异性扩增的引物和探针。下面显示了引物和探针的序列信息:
MCM7:
引物名称:MCM7_T1T3-F
序列:CTCTGAGCCCGCCAAGC(SEQ ID NO:25)
引物名称:MCM7_T1T3-R
序列:TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA(SEQ IDNO:26)
探针名称:MCM7_T1T3-探针
序列:CCCTCGGCAGCGATGGCACT(SEQ ID NO:27)
引物名称:MCM7_T2T4-F
序列:GAGGAATCCCGAGCTGTGAA(SEQ ID NO:28)
引物名称:MCM7_T2T4-R
序列:CCCGCTCCCGCCAT(SEQ ID NO:29)
探针名称:MCM7_T2T4-探针
序列:CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA(SEQ IDNO:30)
引物名称:MCM7_T2-F
序列:GTCCGAAGCCCCCAGAA(SEQ ID NO:31)
引物名称:MCM7_T2-R
序列:CCCGACAGAGACCACTCACA(SEQ ID NO:32)
探针名称:MCM7_T2-探针
序列:CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA(SEQ ID NO:33)
引物名称:MCM7_T3T4-F
序列:CGCTACGCGAAGCTCTTTG(SEQ ID NO:34)
引物名称:MCM7_T3T4-R
序列:CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA(SEQ ID NO:35)
探针名称:MCM7_T3T4-探针
序列:TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA(SEQ ID NO:36)
引物名称:p21T1T2-F
序列:CAAACGCCGGCTGATCTT(SEQ ID NO:37)
引物名称:p21T1T2-R
序列:CCAGGACTGCAGGCTTCCT(SEQ ID NO:38)
探针名称:p21T1T2-探针
序列:CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA(SEQ ID NO:39)
引物名称:p21T2-F
序列:GAGCGGCGGCAGACAA(SEQ ID NO:40)
引物名称:p21T2-R
序列:CCGCGAACACGCATCCT(SEQ ID NO:41)
探针名称:p21T2-探针
序列:CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG(SEQ ID NO:42)
引物名称:p21T3-F
序列:TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA(SEQ ID NO:43)
引物名称:p21T3-R
序列:TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT(SEQ ID NO:44)
探针名称:p21T3-探针
序列:CGGCGGCAGACCAGCATGAC(SEQ ID NO:45)
引物名称:p16T4-F
序列:GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT(SEQ ID NO:46)
引物名称:p16T4-R
序列:TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA(SEQ ID NO:47)
探针名称:p16T4-探针
序列:AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC(SEQ ID NO:48)
引物名称:p16T1-F
序列:TGCCCAACGCACCGA(SEQ ID NO:49)
引物名称:p16T1-R
序列:GGGCGCTGCCCATCA(SEQ ID NO:50)
探针名称:p16T1-探针
序列:TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG(SEQ ID NO:51)
引物名称:p16T2-F
序列:AAGCTTCCTTTCCGTCATGC(SEQ ID NO:52)
引物名称:p16T2-R
序列:CATGACCTGCCAGAGAGAACAG(SEQ ID NO:53)
探针名称:p16T2-探针
序列:CCCCCACCCTGGCTCTGACCA(SEQ ID NO:54)
引物名称:p16T3-F
序列:GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG(SEQ ID NO:55)
引物名称:p16T3-R
序列:TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT(SEQ ID NO:56)
探针名称:p16T3-探针
序列:ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT(SEQ ID NO:57)
引物名称:p16通用-F
序列:CACGCCCTAAGCGCACAT(SEQ ID NO:58)
引物名称:p16通用-R
序列:CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG(SEQ ID NO:59)
探针名称:p16通用-探针
序列:TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC(SEQ ID NO:60)
细胞周期蛋白E1:
引物名称:CCNE1T1T2-F
序列:AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC(SEQ ID NO:61)
引物名称:CCNE1T1T2-R
序列:GAGCCTCTGGATGGTGCAA(SEQ ID NO:62)
探针名称:CCNE1T1T2-P
序列:CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA(SEQ ID NO:63)
引物名称:CCNE1T1-F
序列:TCCGCCGCGGACAA(SEQ ID NO:64)
引物名称:CCNE1T1-R
序列:CATGGTGTCCCGCTCCTT(SEQ ID NO:65)
探针名称:CCNE1T1-探针
序列:ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG(SEQ ID NO:66)
细胞周期蛋白E2:
引物名称:CCNE2T1T2-F
序列:GGAATTGTTGGCCACCTGTATT(SEQ ID NO:67)
引物名称:CCNE2T1T2-R
序列:CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT(SEQ ID NO:68)
TaqMan探针名称:CCNE2T1T2-P
序列:CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA(SEQ IDNO:69)
引物名称:CCNE2T1T3-F
序列:TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC(SEQ ID NO:70)
引物名称:CCNE2T1T3-R
序列:ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC(SEQ ID NO:71)
TaqMan探针名称:CCNE2T1T3-P
序列:CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA(SEQ IDNO:72)
引物名称:CCNE2T2-F
序列:TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG(SEQ ID NO:73)
引物名称:CCNE2T2-R
序列:ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA(SEQ ID NO:74)
TaqMan探针名称:CCNE2T2-P
序列:AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT(SEQ IDNO:75)
在5’碱基上用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)标记探针,并在3’碱基上用淬灭染料TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)标记探针。扩增子的大小大约为100bp。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VICTM标记18SrRNA探针。从Applied Biosystems购买已配好的18S rRNA引物/探针混合物。通过使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)用随机六碱基聚合物将从正常(N)或癌(T)宫颈组织中提取的5μg总RNA定量地转化成单链cDNA形式。
制备下列反应试剂:
20X引物/探针的主混合物(MasterMix)(200μl中)
180μM正向引物 20μl
180μM反向引物 20μl
100μM TaqMan探针 10μl
H2O 150μl
最终的反应混合物(25μl/小孔)
20X引物/探针的主混合物 1.25μl
2X TaqMan通用PCR主混合物(P/N:4304437) 12.5μl
cDNA模板 5.0μl
H2O 6.25
从Applied Bios ystems购买20X TaqMan通用PCR主混合物。在25μl总体积中,最终的引物和探针浓度分别为0.9μM和0.25μM。每个小孔使用10ng总RNA。扩增条件是:50℃下进行2分钟,95℃下进行10分钟,和2步骤循环:95℃下进行15秒和60℃下进行60秒,总共40个循环。各轮中包含至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式三份进行。
在各反应结束时,将记录的荧光强度用于下面的计算:Rn+是包含所有组分的反应的Rn值。Rn-是未反应样品的Rn值(基线值或在NTC中检测到的值)。ΔRn是Rn+和Rn-之间的差,其是通过PCR产生的信号大小的指标。在本研究中使用比较CT法,该方法不使用已知量的标准,但将靶序列的相对量和选择的任何参照值(例如18S rRNA)进行比较。使用Human Endogenous Control Plate方案转换原始数据以进行实时PCR数据分析。
结果
以列表的形式在下面列出用各生物标志物和用特异性引物获得的结果。用正常宫颈组织样品(即,NIL)获得的结果称为N;用宫颈癌组织获得的结果标记为T。
表47:MCM7的结果
样品 | T2 | T5 | T1T3 | T2T4 | T3T4 |
CV01-T | 4 | 0.04 | 29.9 | 4.5 | 1.4 |
CV03-T | 5.7 | 0.02 | 36.8 | 6.1 | 2.6 |
CV05-T | 4.13 | 0.08 | 17.3 | 1.35 | 3.68 |
CV07-T | 2.6 | 0.06 | 18.77 | 0.88 | 3.27 |
CV09-T | 4.96 | 0.08 | 15.01 | 3.69 | 3.22 |
CV11-T | 5.9 | 0.01 | 7.37 | 3.08 | 1.75 |
CV13-T | 6.74 | 0.04 | 19.74 | 4.55 | 4.11 |
CV15-T | 3.04 | 0.05 | 3.65 | 3.43 | 1.25 |
CV17-T | 5.21 | 0.02 | 20.07 | 2.74 | 1.56 |
CV19-T | 3.34 | 0.09 | 21.17 | 2.88 | 6 |
CV21-T | 6.7 | 0.08 | 10.64 | 4.75 | 4.59 |
CV23-T | 7.08 | 0.33 | 32.17 | 5.6 | 4.25 |
CV25-T | 4.87 | 0.03 | 18.11 | 4.58 | 4.51 |
CV27-T | 4.24 | 0.03 | 36.25 | 4.6 | 2.82 |
平均值 | 4.89 | 0.07 | 20.50 | 3.77 | 3.22 |
中值 | 4.89 | 0.05 | 19.74 | 3.77 | 3.22 |
STD | 1.32 | 0.07 | 9.46 | 1.39 | 1.32 |
CV02-N | 2.5 | 0.02 | 10.6 | 2.6 | 1.1 |
CV04-N | 4.6 | 0.02 | 7.1 | 4.8 | 2.4 |
CV06-N | 1.75 | 0.01 | 2.14 | 1.36 | 2.63 |
CV08-N | 1.35 | 0.01 | 4.8 | 1.71 | 1.54 |
CV10-N | 5.6 | 0.03 | 5.07 | 5.12 | 1.85 |
CV12-N | 5.68 | 0.02 | 7.34 | 3.19 | 2.29 |
CV16-N | 4.35 | 0.08 | 3.72 | 2.75 | 1.78 |
CV18-N | 3.98 | 0.01 | 4.74 | 3.63 | 1.7 |
CV20-N | 2.03 | 0.03 | 5.42 | 1.4 | 2.78 |
CV22-N | 2.66 | 0.02 | 4.33 | 2.26 | 2.42 |
CV24-N | 4.88 | 0.09 | 9.03 | 1.53 | 2.77 |
CV28-N | 2.71 | 0.01 | 10.38 | 1.36 | 1.7 |
平均值 | 3.51 | 0.03 | 6.22 | 2.64 | 2.08 |
中值 | 3.51 | 0.02 | 5.42 | 2.60 | 2.08 |
STD | 1.40 | 0.03 | 2.48 | 1.21 | 0.50 |
患者 | T1T2 | T2 | T3 |
Pt01-T | 23.33 | 0.06 | 0.00 |
Pt02-T | 14.66 | 0.01 | 0.00 |
pt03-T | 11.86 | 0.00 | 0.00 |
Pt04-T | 27.04 | 0.01 | 0.00 |
Pt05-T | 14.72 | 0.00 | 0.00 |
Pt06-T | 22.84 | 0.01 | 0.00 |
Pt07-T | 14.04 | 0.00 | 0.00 |
Pt08-T | 31.93 | 0.01 | 0.01 |
Pt09-T | 35.02 | 0.00 | 0.00 |
Pt10-T | 13.2 | 0.00 | 0.00 |
Pt11-T | 24.87 | 0.01 | 0.00 |
Pt12-T | 10.85 | 0.00 | 0.00 |
Pt13-T | 36.51 | 0.02 | 0.01 |
Pt14-T | 12.72 | 0.00 | 0.00 |
Pt15-T | 10.64 | 0.00 | 0.00 |
Pt16-T | 22.58 | 0.04 | 0.00 |
Pt17-T | 39.64 | 0.14 | 0.04 |
Pt01-N | 4.57 | 0.03 | 0.00 |
Pt02-N | 5.57 | 0.00 | 0.00 |
Pt03-N | 3.54 | 0.00 | 0.00 |
Pt04-N | 8.18 | 0.00 | 0.00 |
Pt05-N | 5.4 | 0.10 | 0.00 |
Pt06-N | 11.01 | 0.00 | 0.00 |
Pt08-N | 10.39 | 0.00 | 0.00 |
Pt09-N | 9.11 | 0.00 | 0.00 |
Pt10-N | 4.41 | 0.00 | 0.00 |
Pt11-N | 8.64 | 0.00 | 0.00 |
Pt12-N | 3.03 | 0.00 | 0.00 |
Pt14-N | 3.55 | 0.00 | 0.00 |
Pt15-N | 2.42 | 0.01 | 0.00 |
Pt17-N | 11.46 | 0.05 | 0.01 |
T-平均值 | 21.5559 | ||
N-平均值 | 6.52 | ||
St.T-检验= | 7.3E-06 |
患者 | T1 | T2 | T3 | T4 | 通用 |
Pt01-T | 0.2 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
Pt02-T | 16.3 | 11.2 | 5.1 | 21.7 | 36.5 |
Pt03-T | 16.5 | 6.2 | 3.1 | 15.1 | 29.6 |
Pt04-T | 10.1 | 2.8 | 2.6 | 13.2 | 27.7 |
Pt05-T | 12.7 | 3.6 | 2.1 | 11.3 | 23.1 |
Pt01-N | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
Pt02-N | 2.5 | 2.6 | 1.6 | 2.7 | 6.8 |
Pt04-N | 2.6 | 0.6 | 0.8 | 2.4 | 5.8 |
Pt05-N | 2.1 | 0.8 | 0.7 | 4.1 | 4.6 |
T-平均值 | 11.2 | 4.8 | 2.6 | 12.3 | 23.4 |
N-平均值 | 1.8 | 1.0 | 0.8 | 2.3 | 4.3 |
表50:细胞周期蛋白E1的结果
患者 | T1T2癌M. | 癌SD | T1T2正常M. | 正常SD | T1癌M. | 癌SD | T1正常M. | 正常SD |
Pt01 | 12.19 | 0.12 | 4.11 | 0.13 | 1.34 | 0.04 | 0.5 | 0.03 |
Pt02 | 16.72 | 0.21 | 4.44 | 0.34 | 1.35 | 0.02 | 0.47 | 0.05 |
Pt03 | 11.45 | 0.41 | 2.81 | 0.13 | 1.17 | 0.01 | 0.06 | 0.02 |
Pt04 | 21.33 | 0.45 | 5.33 | 0.09 | 0.76 | 0.1 | 0.23 | 0.01 |
Pt05 | 11.17 | 0.25 | 3.68 | 0.15 | 0.95 | 0.05 | 0.15 | 0.03 |
Pt06 | 21.65 | 024 | 3.11 | 0.22 | 0.89 | 0.03 | 0.13 | 0.02 |
Pt07 | 23.26 | 0.54 | 0 | 0 | 0.75 | 0.06 | 0 | 0.01 |
Pt08 | 8.37 | 0.24 | 3.1 | 0.01 | 0.12 | 0.01 | 0.13 | 0.02 |
Pt09 | 17.74 | 0.43 | 2.17 | 0.08 | 0.73 | 0.02 | 0.09 | 0.01 |
Pt10 | 18.51 | 0.29 | 4.56 | 0.17 | 1.37 | 0.03 | 0.41 | 0.04 |
Pt11 | 10.58 | 0.52 | 3.92 | 0.12 | 0.57 | 0.01 | 0.23 | 0.03 |
Pt12 | 33.67 | 0.58 | 7.87 | 0.1 | 0.78 | 0.01 | 0.28 | 0.05 |
Pt13 | 36.9 | 0.41 | 0 | 0 | 1.05 | 0.04 | 0 | 0 |
Pt14 | 31.01 | 0.29 | 6.01 | 0.26 | 1.68 | 0.05 | 0.24 | 0.03 |
Pt15 | 7.35 | 0.23 | 1.24 | 0.09 | 0.34 | 0.08 | 0.08 | 0.02 |
Pt16 | 12.71 | 0.61 | 3.72 | 0 | 1.1 | 0.06 | 0.07 | 0.01 |
Pt17 | 12.13 | 0.21 | 11.46 | 0.15 | 0.34 | 0.07 | 0.05 | 0.01 |
Pt18 | 14.22 | 0.14 | 5.94 | 0.06 | 0.73 | 0.08 | 0.26 | 0.04 |
Pt19 | 12.69 | 0.81 | 3.52 | 0.02 | 0.41 | 0.04 | 0.24 | 0.02 |
Pt20 | 16.56 | 0.16 | 6.1 | 0.12 | 0.17 | 0.02 | 0.06 | 0 |
Pt21 | 11.63 | 0.23 | 3.01 | 0.06 | 0.54 | 0.04 | 0.23 | 0.01 |
Pt22 | 17.39 | 0.34 | 2.36 | 0.02 | 0.47 | 0.02 | 0.24 | 0.05 |
Pt23 | 16.56 | 0.16 | 2.1 | 0.02 | 0.18 | 0.03 | 0.09 | 0.01 |
Pt24 | 22.23 | 0.33 | 4.06 | 0.28 | 1.9 | 0.17 | 0.52 | 0.01 |
Pt25 | 13.98 | 0.48 | 3.72 | 0.05 | 0.54 | 0.04 | 0.23 | 0.01 |
Pt26 | 22.71 | 0.76 | 4.48 | 0.07 | 0.47 | 0.02 | 0.24 | 0.05 |
Pt27 | 16.17 | 0.4 | 5.64 | 0.3 | 0.18 | 0 | 0.12 | 0.01 |
Pt28 | 12.6 | 0.56 | 3.8 | 0.06 | 0.29 | 0.03 | 0.05 | 0 |
Pt29 | 13.69 | 0.34 | 3.1 | 0.18 | 0.29 | 0.03 | 0.11 | 0 |
Pt30 | 17.69 | 0.61 | 4.3 | 0.11 | 0.36 | 0.01 | 0.03 | 0 |
Pt31 | 20.46 | 0.3 | 3.91 | 0.21 | 0.47 | 0.03 | 0.08 | 0 |
Pt32 | 18.38 | 0.18 | 3.16 | 0.06 | 0.42 | 0.02 | 0.17 | 0.01 |
Pt33 | 21.1 | 0.62 | 4.52 | 0.33 | 1.07 | 0.05 | 0.24 | 0.01 |
Pt34 | 21.5 | 1.37 | 4.56 | 0.13 | 0.24 | 0.01 | 0.11 | 0.01 |
平均 | 17.54 | 4.26 | 0.68 | 0.20 | ||||
T/N | 4.1 | |||||||
t-检验P= | 7.80E-14 |
表51:细胞周期蛋白E2的结果
患者 | T1T2 | T1T2Std.Dev. | T1T3 | T1T3Std.Dev. | T2 | T2Std.Dev. |
Pt01-T | 13.17 | 1.02 | 16.11 | 0.39 | 0.01 | 0.00 |
Pt02-T | 13.42 | 0.3 | 18.12 | 2.21 | 0.15 | 0.02 |
Pt03-T | 13.64 | 0.50 | 17.40 | 2.16 | 0.05 | 0.01 |
Pt04-T | 19.37 | 1.41 | 24.26 | 1.01 | 0.01 | 0.00 |
Pt05-T | 10.59 | 1.1 | 14.71 | 1.58 | 0.17 | 0.02 |
Pt06-T | 7.96 | 0.91 | 9.32 | 0.51 | 0.06 | 0.01 |
Pt07-T | 14.1 | 1.73 | 16.92 | 0.84 | 0.54 | 0.06 |
Pt08-T | 8.11 | 0.67 | 9.50 | 0.66 | 0.34 | 0.07 |
Pt09-T | 13.04 | 0.72 | 18.27 | 0.99 | 0.02 | 0.00 |
Pt10-T | 19.56 | 2.29 | 23.42 | 0.00 | 0.02 | 0.01 |
Pt11-T | 16.8 | 1.57 | 18.71 | 2.15 | 0.08 | 0.01 |
Pt12-T | 16.05 | 0.85 | 18.81 | 0.74 | 0.91 | 0.01 |
Pt13-T | 14.91 | 0.87 | 18.51 | 1.59 | 0.61 | 0.16 |
Pt14-T | 14.89 | 0.32 | 20.49 | 0.86 | 0.42 | 0.03 |
Pt15-T | 12.44 | 0.47 | 15.26 | 1.00 | 0.68 | 0.18 |
Pt16-T | 11.54 | 1.58 | 13.13 | 0.75 | 1.02 | 0.14 |
Pt17-T | 6.78 | 0.47 | 7.91 | 0.45 | 0.85 | 0.10 |
Pt01-N | 4.89 | 0.21 | 5.94 | 0.53 | 0.00 | 0.00 |
Pt02-N | 6.32 | 0.47 | 8.91 | 0.61 | 0.13 | 0.00 |
Pt03-N | 4.8 | 0.31 | 5.89 | 0.30 | 0.04 | 0.00 |
Pt04-N | 13.28 | 0.74 | 15.28 | 1.37 | 0.01 | 0.00 |
Pt05-N | 6.51 | 1.2 | 9.04 | 0.82 | 0.16 | 0.02 |
Pt06-N | 4.96 | 0.83 | 6.41 | 0.84 | 0.05 | 0.01 |
Pt08-N | 6.48 | 0.73 | 6.82 | 0.60 | 0.07 | 0.02 |
Pt09-N | 3.74 | 0.48 | 4.63 | 0.66 | 0.03 | 0.01 |
Pt10-N | 10.32 | 0.93 | 11.31 | 0.89 | 0.02 | 0.00 |
Pt11-N | 10.34 | 0.26 | 13.90 | 0.53 | 0.04 | 0.04 |
Pt12-N | 13.81 | 1.69 | 16.60 | 1.45 | 0.24 | 0.07 |
Pt14-N | 6.92 | 0.63 | 9.07 | 0.95 | 0.14 | 0.03 |
Pt15-N | 4.8 | 0.73 | 8.55 | 1.40 | 0.10 | 0.03 |
Pt17-N | 5.33 | 0.2 | 5.78 | 0.27 | 0.23 | 0.07 |
T-平均值 | 13.32 | 16.52 | 0.35 | |||
N-平均值 | 7.32 | 9.15 | 0.09 | |||
St.T-检验 | 4.16E-05 | 3.31742E-05 | 0.008813 |
实施例11:临床组织样品中生物标志物的实时PCR检测
如实施例9中所述,使用宫颈癌组织样品(例如,腺癌、鳞状细胞癌)和正常宫颈组织样品进行实时PCR。在本研究中,在Primer ExpressTM程序,版本1.5(Applied Biosystems)的帮助下,设计用于靶宫颈生物标志物(即,MCM2、MCM6、MCM7和Topo2A)的特异性扩增的引物和探针。下面显示引物和探针的序列信息:
TaqMan引物
MCM2:
引物名称:MCM2-F
序列:5’-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-3’(SEQ ID NO:80)
引物名称:MCM2-R
序列:5’-GGGAGATGCGGACATGGAT-3’(SEQ ID NO:81)
TaqMan’探针名称:MCM2-P
序列:5’-CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA-3’(SEQ ID NO:82)
MCM6:
引物名称:MCM6-F
序列:5’-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-3’(SEQ ID NO:83)
引物名称:MCM6-R
序列:5’-ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-3’(SEQ ID NO:84)
TaqMan探针名称:MCM6-P
序列:5’-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-3’(SEQ IDNO:85)
MCM7:
引物名称:MCM7_T1T3-F
序列:CTCTGAGCCCGCCAAGC(SEQ ID NO:25)
引物名称:MCM7_T1T3-R
序列:TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA(SEQ IDNO:26)
探针名称:MCM7_T1T3-探针
序列:CCCTCGGCAGCGATGGCACT(SEQ ID NO:27)
引物名称:MCM7_T2T4-F
序列:GAGGAATCCCGAGCTGTGAA(SEQ ID NO:28)
引物名称:MCM7_T2T4-R
序列:CCCGCTCCCGCCAT(SEQ ID NO:29)
探针名称:MCM7_T2T4-探针
序列:CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA(SEQ IDNO:30)
引物名称:MCM7_T2-F
序列:GTCCGAAGCCCCCAGAA(SEQ ID NO:31)
引物名称:MCM7_T2-R
序列:CCCGACAGAGACCACTCACA(SEQ ID NO:32)
探针名称:MCM7_T2-探针
序列:CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA(SEQ ID NO:33)
引物名称:MCM7_T3T4-F
序列:CGCTACGCGAAGCTCTTTG(SEQ ID NO:34)
引物名称:MCM7_T3T4-R
序列:CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA(SEQ ID NO:35)
探针名称:MCM7_T3T4-探针
序列:TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA(SEQ ID NO:36)
TOPO2A:
引物名称:TOP2A_F
序列:5’-GGCTACATGGTGGCAAGGA-3’(SEQ ID NO:86)
引物名称:TOP2A_R
序列:5’-TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG-3’(SEQ ID NO:87)
TaqMan探针名称:TOP2A_P
序列:5’-TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC-3’(SEQ ID NO:88)
结果
以列表的形式在下面列出获得的各标志物的结果。也在下面对数据进行概述。
表52:速冻的宫颈癌组织样品
患者 | TPOID | 诊断的病程 | HPV类型 | MCM2TaqM | MCM6TaqMan | MCM7TaqM | top2ATaqM |
Pt01 | CV-001 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 8.93 | 11.31 | 29.9 | 23.76 |
Pt02 | CV-003 | 腺癌 | HPV18 | 10.94 | 14.29 | 36.8 | 25.28 |
Pt03 | CV-005 | 腺癌 | HPV18 | 17.67 | 13.84 | 17.3 | 23.18 |
Pt04 | CV-007 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 23.61 | 13.3 | 18.77 | 23.26 |
Pt05 | CV-009 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 9.3 | 11.26 | 15.01 | 20.33 |
Pt06 | CV-011 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 13.86 | 11.58 | 7.37 | 8.37 |
Pt07 | CV-013 | 腺癌 | HPV18 | 27.03 | 16.32 | 19.74 | 34.29 |
Pt08 | CV-015 | 鳞状细胞癌 | HPV16,HPV18,+ | 8.28 | 8.16 | 3.65 | 8.57 |
Pt09 | CV-017 | 鳞状细胞癌 | HPV18 | 12.61 | 13.56 | 20.07 | 11.31 |
Pt10 | CV-019 | 鳞状细胞癌 | HPV18 | 31.88 | 23.38 | 21.17 | 27.48 |
Pt11 | CV-021 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 11.27 | 14.76 | 10.64 | 12.73 |
Pt12 | CV-023 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 11.39 | 11.29 | 32.17 | 21.11 |
Pt13 | CV-025 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 23.88 | 18.98 | 18.11 | 27.96 |
Pt14 | CV-027 | 鳞状细胞癌 | HPV18,HPV16,+ | 12.26 | 15.53 | 36.25 | 26.63 |
Pt15 | CV-029 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 6.56 | 7.92 | 9.64 | 7.81 |
Pt16 | CV-031 | 鳞状细胞癌 | HPV73 | 28.12 | 12.21 | 27.3 | 21.4 |
Pt17 | CV-033 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 8.76 | 7.59 | 14.37 | 12.42 |
Pt18 | CV-035 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 21.4 | 12.65 | 23.63 | 27.57 |
Pt19 | CV-037 | 鳞状细胞癌 | HPV18 | 12.59 | 13.06 | 14.37 | 9.24 |
患者 | TPOID | 诊断的病程 | HPV类型 | MCM2TaqM | MCM6TaqMan | MCM7TaqM | top2ATaqM |
Pt20 | CV-039 | 腺、鳞细胞癌 | HPV16,HPV18,+ | 7.24 | 8.17 | 16.97 | 15.13 |
Pt21 | CV-041 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 9.61 | 11.84 | 13.88 | 11.92 |
Pt22 | CV-043 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 21.57 | 13.21 | 18.31 | 24.19 |
Pt23 | CV-045 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 21.19 | 13.18 | 18.76 | 19.97 |
Pt24 | CV-047 | 鳞状细胞癌 | HPV18 | 24.61 | 19.09 | 20.19 | 28.14 |
Pt25 | CV-049 | 鳞状细胞癌 | HPV18 | 11.43 | 10.2 | 13.70 | 10.55 |
Pt26 | CV-051 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 24.25 | 20.54 | 23.26 | 33.26 |
Pt27 | CV-053 | 鳞状细胞癌 | HPV45 | 26.74 | 21.34 | 20.96 | 20.34 |
Pt28 | CV-055 | 鳞状细胞癌 | HPV16,HPV18,+ | 12.65 | 12 | 14.42 | 12.17 |
Pt29 | CV-057 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 16 | 14.72 | 25.46 | 22.16 |
Pt30 | CV-059 | 鳞状细胞癌 | HPV16,HPV18,+ | 22.55 | 17.87 | 15.30 | 25.54 |
Pt31 | CV-061 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 24.08 | 21.88 | 23.11 | 25.28 |
Pt32 | CV-063 | 鳞状细胞癌 | HPV18,HPV16,+ | 24.16 | 12.55 | 21.63 | 22.39 |
Pt33 | CV-065 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 26.63 | 16.05 | 27.56 | 28.84 |
Pt34 | CV-067 | 鳞状细胞癌 | HPV16 | 19.61 | 23.28 | 19.03 | 25.57 |
表53:相邻的正常组织样品
患者 | TPOID | HPV类型 | MCM2TaqM | MCM6TaqMan | MCM7TaqM | top2ATaqM |
Pt01 | CV-002 | 阴性 | 3.04 | 4.4 | 10.6 | 10.52 |
Pt02 | CV.004 | 阴性 | 6.26 | 6.28 | 7.1 | 9.06 |
Pt03 | CV-006 | HPV18 | 2.06 | 2.53 | 2.14 | 3.86 |
Pt04 | CV-008 | 阴性 | 3.14 | 4.15 | 4.8 | 8.03 |
Pt05 | CV-010 | 阴性 | 2.2 | 3.45 | 5.07 | 6.91 |
Pt06 | CV-012 | 阴性 | 2.06 | 2.29 | 7.34 | 6.82 |
Pt07 | CV-014 | 阴性 | N/A | N/A | N/A | N/A |
Pt08 | CV-016 | 阴性 | 2.55 | 3.13 | 3.72 | 2.02 |
Pt09 | CV-018 | 阴性 | 2.09 | 3.09 | 4.74 | 1.24 |
Pt10 | CV-020 | 阴性 | 8.15 | 6.76 | 5.42 | 10.41 |
Pt11 | CV-022 | 阴性 | 4.53 | 5.34 | 4.33 | 6.64 |
Pt12 | CV-024 | 阴性 | 1.94 | 2.45 | 9.03 | 6.13 |
Pt13 | CV-026 | 阴性 | N/A | N/A | N/A | N/A |
Pt14 | CV-028 | 阴性 | 2.62 | 2.95 | 10.38 | 5.3 |
Pt15 | CV-030 | 阴性 | 1.14 | 1.28 | 2.06 | 1.54 |
Pt16 | CV-032 | 阴性 | N/A | N/A | N/A | N/A |
Pt17 | CV-034 | 阴性 | 1.24 | 1.91 | 1.32 | 0.42 |
Pt18 | CV-036 | 阴性 | 3.4 | 1.89 | 4.01 | 4.32 |
Pt19 | CV-038 | 阴性 | 3.48 | 4.98 | 5.60 | 7.92 |
Pt20 | CV-040 | 阴性 | 1.84 | 3.28 | 3.73 | 1.38 |
患者 | TPOID | HPV类型 | MCM2TaqM | MCM6TaqMan | MCM7TaqM | top2ATaqM |
Pt21 | CV-042 | 阴性 | 1.53 | 3.3 | 4.77 | 1.01 |
Pt22 | CV-044 | 阴性 | 2.65 | 4.03 | 2.74 | 2.59 |
Pt23 | CV-046 | 阴性 | 3.09 | 3.53 | 5.90 | 3.42 |
Pt24 | CV-048 | HPV18 | 2.57 | 5.19 | 3.82 | 5.32 |
Pt25 | CV-050 | 阴性 | 5.84 | 4.64 | 7.78 | 9.14 |
Pt26 | CV-052 | 阴性 | 5.11 | 5.22 | 5.37 | 5.13 |
Pt27 | CV-054 | 阴性 | 2.91 | 3.29 | 5.10 | 0.76 |
Pt28 | CV-056 | 阴性 | 4.14 | 3.74 | 5.54 | 4.15 |
Pt29 | CV-058 | HPV16 | 2.83 | 4.98 | 10.13 | 7.57 |
Pt30 | CV-060 | 阴性 | 6.41 | 5 | 5.39 | 10.05 |
Pt31 | CV-062 | 阴性 | 5.72 | 4.93 | 9.29 | 9.95 |
Pt32 | CV-064 | 阴性 | 8.06 | 5.41 | 7.64 | 9 |
Pt33 | CV-066 | 阴性 | 9.93 | 7.94 | 10.78 | 9.95 |
Pt34 | CV-068 | 阴性 | 2.36 | 6.39 | 5.73 | 1.81 |
结果概述
表54:肿瘤对相邻正常组织
M:平均值:SD:标准误:R:肿瘤平均值对正常平均值的比例;P:t-test的P值。
表55:HPV-16对HPV-18
表56:鳞状细胞癌与腺癌
SCC:鳞状细胞癌;AC:腺癌
实施例12:宫颈癌和乳腺癌细胞系中生物标志物的实时PCR检测
进行实时PCR以检测MCM2、MCM6和MCM7在宫颈癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达水平。
实验设计和方案
从ATCC购买三种人宫颈癌细胞系SiHa、Caski和HeLa以及三种人乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR3和CAMA,并将其用于本实验。通过Protect Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从新培养的细胞提取总细胞RNA,并使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems,P/N:4322171)用随机六聚物将其转变成单链cDNA形式。在ABI7700Sequence Detection System上使用通用PCR主混合物(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)进行实时PCR。
用ABI Primer ExpressTM程序(版本1.5)设计用于MCM2、MCM6和MCM7的特异性扩增的引物和探针。MCM7包含4种转录变体:在NCBIEntrez核苷酸数据库中鉴定了转录变体1(T1,refseqNM_005916)和转录变体2(T2,refseq NM_182776)。如通过由NCBI的Model Maker汇集的EST所分析的,变体T3和T4在5′末端附近具有可变的外显子。特别地设计了引物和探针T1T3、T2T4、T2和T3T4用于检测变体T1和T3、T2和T4、T2,以及T3和T4。引物和探针的序列显示于上面的实施例10和11中。
用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)在5′碱基上和用淬灭染色TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)在3′碱基上标记探针。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VIC标记18SrRNA探针。从AppliedBiosystems购买已配好的18S rRNA引物/探针混和物。在总体积为25μl、分别包含0.9μM和0.25μM的引物和探针的反应混合物中使用10ng cDNA,扩增条件是:50℃下进行2分钟,95℃下进行10分钟,和2步骤循环:95℃下进行15秒和60℃下进行60秒,总共40个循环。各轮反应中包含至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式两次进行。按照ABI的用户指南(P/N4303859)使用相对定量方法,基于其CT值计算靶基因相对于18S内源对照的表达水平。
结果
以列表的形式在下面列出获得的各生物标志物的结果。
表57:宫颈癌细胞系和乳腺癌细胞系的生物标志物的表达
结论
结果显示宫颈HeLa细胞具有低表达水平的MCM2、MCM6和MCM7生物标志物。宫颈SiHa、乳腺MCM7和CAMA细胞系都显示MCM2、MCM6和MCM7生物标志物的过表达。宫颈Caski和乳腺SK-BR3细胞系显示MCM7的过表达,但显示MCM2和MCM6的低表达。
实施例.13:通过瞬时HPV16E6/E7基因转染进行的293细胞中宫
颈生物标志物表达的诱导
实验设计和方案
在本实验中采用受四环素调控的表达系统(T-Rex系统,Invitrogen,Inc)。构建表达HPV16E2、E6或E7蛋白的T-Rex载体。将包含突变体E2、E6或E7基因的载体用作负对照。然后用HPV质粒转染T-Rex293细胞,用四环素激活HPV基因的表达,进行4小时、24小时和72小时。通过Protect Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从经转染的细胞提取总细胞RNA,并使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems,P/N:4322171)用随机六核苷酸聚体将其转变为单链cDNA形式。在ABI7700Sequence Detection System上使用UniversalPCR Master Mix(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)进行实时PCR。
用ABI Primer ExpressTM程序(版本1.5)设计用于MCM2、MCM6、MCM7、T0P2A、细胞周期蛋白E1、p21、p14、HPV16E2、E6和E7的特异性扩增的引物和探针。MCM7包含4种转录变体:在NCBI Entrez核苷酸数据库中鉴定了转录变体1(T1,refseqNM_005916)和转录变体2(T2,refseq NM_182776)。如通过由NCBI的Model Maker汇集的EST装配所分析的,变体T3和T4在5′末端附近具有可变的外显子。用于特异性地检测变体T1和T3、T2和T4、T2以及T3和T4的引物和探针分别称为T1T3、T2T4、T2和T3T4。引物和探针的序列和上面实施例10和11中显示的一样。
用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)在5′碱基上和用淬灭染色TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)在3′碱基上标记探针。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VIC标记18SrRNA探针。从AppliedBiosystems购买已配好的18SrRNA引物/探针混和物。在总体积为25μl、包含浓度分别为0.9μM和0.25μM的引物和探针的反应混合物中使用10ng cDNA。扩增条件是:50℃下进行2分钟,95℃下进行10分钟,和2步骤循环:95℃下进行15秒和60℃下进行60秒,总共40个循环。每轮包括至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式两份进行。按照ABI的用户指南(P/N4303859)使用相对定量方法,基于其CT值计算靶基因相对于18S内源对照的表达水平。
结果
通过转染的时间进程曲线观察到T-Rex293细胞中HPV16E2、E6和E7基因的表达增加。转染后从4小时直到72小时,T-Rex293细胞中Topo2A、MCM2、MCM6、MCM7和细胞周期蛋白E的mRNA表达显著地由HPV16E6或E7基因诱导。然而,在HPV基因感染后对p21和p14并未检测到表达水平升高。E6或E7的表达似乎不被E2基因的共转染抑制。这是因为E6或E7的表达完全由外源CMV启动子驱动而不是由天然的HPV启动子驱动。后者在本模型系统中不存在。
表58:Topo2A
表59:MCM2
表60:MCM6
表61:MCM7
表62:Cyclin E1
表63:p21
表64:p14
表65:HPV16 E2
表66:HPV16 E6
表67:HPV16 E7
实施例14:使用载片预处理缓冲液增加免疫细胞化学和免疫组织
化学法中的抗原可接近性
样品选择和试剂描述
将成对的来自相同患者的细胞学和组织学样品接受免疫测定以检测生物标志物的过表达。分析来自分类为ASCUS(3)、LSIL(6)和HSIL(5)的患者的石蜡块组织样品和细胞学样品。所用的试剂是抗体混合物(用于细胞学)、经修饰的抗体混合物(用于组织学)、检测试剂、复染剂和制备缓冲液10X(预处理溶液)。
细胞学载片制备和自动免疫细胞化学法
为了进行免疫细胞化学法,如实施例5中所示进行载片制备和预处理。然后如实施例5中所述的一样(除了一点不同外)对各细胞学样品进行自动化免疫细胞化学法。对于本实验,将一抗混合物(MCM2克隆26H6.19 1:10,000、MCM2克隆27C5.6 1:800、TOPOIIA克隆SWT3D1 1:1000)的温育减少至30分钟。
组织学载片制备和自动化免疫细胞化学法
对于各事件,切取4微米的切片并将其干燥过夜或在70℃的鼓风干燥箱中干燥20分钟。将切片在二甲苯中脱蜡,更换3次二甲苯,每次5分钟。然后在无水乙醇中清洗载片,每次5分钟。将载片放入水下并充分漂洗。将载片转移至1XSureSlide制备缓冲液的预热溶液并置于蒸器中温育25分钟。从蒸器中聚出载片并让其在室温下冷却20分钟。慢慢地在水中漂洗载片直至缓冲液被完全替换掉。进行TBST漂洗,更换2次缓冲液,每次2分钟。
如实施例5中针对免疫细胞化学法的描述一样(除了两点不同外)进行自动化免疫组织化学法。在本实验中,一抗混合物的温育减少至30分钟。此外,用下列稀释度(MCM2克隆26H6.19 1:4,000、MCM2克隆27C5.6 1:200、TOPOIIA克隆SWT3D1 1:400)修饰一抗混合物。
结果
表68:生物标志物核苷酸和氨基酸序列的信息
根据上面的描述和实施例,本领域技术人员认识到,和常规方法相比,本发明的方法允许对高度子宫颈疾病进行更优越的不依赖于年龄的检测。本发明的方法可特别地适合下面所述的用途:
●用于年龄超过30岁的妇女,所述检测可以是HPV阳性结果的反映或作为ASCUS+细胞学结果的反映。
●用于年龄小于30岁的妇女,所述检测可和用于检测高度子宫颈疾病的细胞学检测法一起使用。
●用于年龄超过30岁的妇女,所述检测可和用于检测高度子宫颈疾病的细胞学检测法一起使用。
●用于年龄小于30岁的妇女,将所述检测作为检测高度子宫颈疾病的初步筛查来进行使用。
●用于年龄超过30岁的妇女,将所述检测作为检测高度子宫颈疾病的初步筛查来进行使用。
●在年龄小于30岁的妇女中,所述检测可替代Pap抹片检查。
●最后,不依赖于年龄,所述检测可替代Pap抹片检查。
来源于本发明的实践的其他潜在有利方面包括:
●30岁和30岁以上具有NIL/HPV阳性结果的妇女中的组织学高度异常性的检测。
●年龄超过30岁、对DNA+Pap抹片检查呈阳性的妇女中高度子宫颈疾病的检测有更好的特异性。
●对ASC-US、ASC-H和LSIL分类范围内的妇女中高度子宫颈疾病可更好的检测,不依赖于年龄。
●对HSIL分类范围内的高度子宫颈疾病的检测有更好的特异性。
●和基于细胞学的诊断结合在年龄小于30岁的妇女中用于检测高度子宫颈疾病。
●和基于细胞学的诊断结合用于高度子宫颈疾病的检测,不依赖于年龄。
●作为年龄小于30岁的妇女中的初步筛查用于高度子宫颈疾病的检测有提高的特异性。
●作为初步筛选用于高度子宫颈疾病的检测有提高的特异性,不依赖于年龄。
●鉴定子宫颈疾病和区别HPV感染与高度子宫颈疾病。
●可使用人工解释或通过自动化显微镜技术辅助解释建立可接受的测定表现。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请代表了和本发明所属技术领域内的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在此处引用作为参考,就如同每一篇出版物或专利申请被明确和单独地指示被引用作为参考一样。
尽管已通过图表和示例对前述发明作了较为详细的描述以便理解清楚,但很显然,可进行某些改变和修饰而不背离所附实施方案的范围。
Claims (32)
1.至少三种抗体在制备用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的试剂中的用途,其中第一种和第二种抗体特异性结合于生物标志物蛋白MCM2,且第三种抗体特异性结合于生物标志物蛋白Topo2A,其中所述三种抗体特异性地检测来自患者的机体样品中的所述生物标志物蛋白的过表达,其中所述生物标志物蛋白的过表达的检出特异性地鉴定指示高度子宫颈疾病的样品。
2.权利要求1的用途,其中所述生物标志物蛋白的过表达将指示高度子宫颈疾病的样品和指示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品区分开。
3.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病不依赖于形态学分析或不依赖于HPV感染状况的确定。
4.权利要求1的用途,其中通过进行免疫细胞化学法检测所述生物标志物蛋白的表达。
5.权利要求4的用途,其中人工地进行所述免疫细胞化学法。
6.权利要求4的用途,其中以自动化的方式进行所述免疫细胞化学法。
7.权利要求1的用途,其中所述样品包含子宫颈细胞。
8.权利要求1的用途,其中所述样品包含单层子宫颈细胞。
9.权利要求1的用途,其中所述样品包括基于液体的制备物中处于悬浮状态的子宫颈细胞。
10.权利要求1的用途,其中所述样品包括子宫颈组织样品。
11.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病的灵敏度至少为90%。
12.权利要求11的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病的阳性预测值至少为40%。
13.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病的特异性至少为85%。
14.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病针对具有异常帕帕尼克拉乌Pap抹片检查结果的患者进行。
15.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病作为一般患者群体中高度子宫颈疾病的初步筛查进行。
16.权利要求1的用途,其中所述诊断高度子宫颈疾病与形态学分析结合进行。
17.权利要求1的用途,其中所述诊断还包括样品的帕帕尼古拉乌(Pap)染色。
18.权利要求1的用途,其中将所述抗体作为单独的抗体试剂按顺序和所述样品接触。
19.权利要求1的用途,其中将所述抗体作为抗体混和物同时和所述样品接触。
20.权利要求1的用途,其中将所述抗体中的各抗体和分开的包含部分样品的显微镜载片接触。
21.包含至少三种抗体的试剂盒,其中第一种和第二种抗体特异性结合于生物标记蛋白MCM2,且第三种抗体特异性结合于生物标记蛋白Topo2A。
22.权利要求21的试剂盒,其中所述试剂盒还包含过氧化物酶封闭剂、蛋白封闭剂、用于检测抗体与所述生物标志物蛋白的结合的化学试剂、复染剂、着色剂和使用说明书。
23.权利要求22的试剂盒,其中所述用于检测抗体结合的化学试剂包括色原和缀合至被标记的聚合物上的二抗,其中所述色原包含3′,3′-二氨基联苯胺,其中所述被标记的聚合物包含缀合至葡聚糖聚合物的辣根过氧化物酶。
24.权利要求22的试剂盒,其中所述复染剂包含苏木精。
25.权利要求22的试剂盒,其中所述着色剂包含含有pH 7.4的Tris缓冲盐水、Tween-20和叠氮化钠的溶液。
26.权利要求22的试剂盒,还包含阳性对照样品。
27.权利要求26的试剂盒,其中所述阳性对照样品包含SiHa细胞。
28.权利要求21的试剂盒,还包含用于Pap染色的试剂。
29.权利要求28的试剂盒,其中用于Pap染色的试剂包含EA50和Orange G。
30.权利要求21的试剂盒,其中将所述至少三种抗体作为分开的试剂提供。
31.权利要求21的试剂盒,其中将所述至少三种抗体作为混合物来提供。
32.权利要求21的试剂盒在制备用于诊断高度子宫颈疾病的试剂中的用途。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55649504P | 2004-03-24 | 2004-03-24 | |
US60/556,495 | 2004-03-24 | ||
PCT/US2005/009740 WO2005095964A2 (en) | 2004-03-24 | 2005-03-23 | Methods and compositions for the detection of cervical disease |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1957256A CN1957256A (zh) | 2007-05-02 |
CN1957256B true CN1957256B (zh) | 2013-01-02 |
Family
ID=34964649
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2005800163173A Active CN1957256B (zh) | 2004-03-24 | 2005-03-23 | 用于子宫颈疾病检测的方法和组合物 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US7157233B2 (zh) |
EP (2) | EP2293069A3 (zh) |
JP (2) | JP4545189B2 (zh) |
KR (3) | KR20080075045A (zh) |
CN (1) | CN1957256B (zh) |
AT (1) | ATE549625T1 (zh) |
AU (1) | AU2005228026B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0509193B8 (zh) |
CA (1) | CA2560782C (zh) |
ES (1) | ES2381644T3 (zh) |
MX (1) | MXPA06011020A (zh) |
WO (1) | WO2005095964A2 (zh) |
Families Citing this family (89)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7125663B2 (en) * | 2001-06-13 | 2006-10-24 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
KR20050058407A (ko) * | 2002-08-20 | 2005-06-16 | 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 | 자궁경부암의 확인, 평가, 예방 및 요법을 위한 조성물, 키트 및 방법 |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
WO2006036788A2 (en) * | 2004-09-22 | 2006-04-06 | Tripath Imaging, Inc. | Methods and compositions for evaluating breast cancer prognosis |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
US7595380B2 (en) | 2005-04-27 | 2009-09-29 | Tripath Imaging, Inc. | Monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
US7732166B2 (en) * | 2005-11-15 | 2010-06-08 | Oncohealth Corporation | Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer |
US7972776B2 (en) * | 2005-11-15 | 2011-07-05 | Oncohealth Corporation | Protein chips for HPV detection |
US20070140915A1 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Cytyc Corporation | Method and Apparatus for Obtaining Aliquot from Liquid-Based Cytological Sample |
US7686771B2 (en) * | 2005-12-12 | 2010-03-30 | Cytyc Corporation | Method and apparatus for obtaining aliquot from liquid-based cytological sample |
US7632498B2 (en) | 2005-12-19 | 2009-12-15 | Tripath Imaging, Inc. | MCM6 and MCM7 monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
CA2634896C (en) * | 2005-12-30 | 2018-08-07 | Ventana Medical Systems, Inc. | Na+, k+-atpase expression in cervical dysplasia and cancer |
EP2363205A3 (en) | 2006-01-11 | 2014-06-04 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices And Methods Of Use In The Formation And Control Of Nanoreactors |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
EP2530167A1 (en) | 2006-05-11 | 2012-12-05 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices |
JP5406019B2 (ja) | 2006-05-17 | 2014-02-05 | セルーメン、インコーポレイテッド | 自動化組織分析のための方法 |
EP3536396B1 (en) | 2006-08-07 | 2022-03-30 | The President and Fellows of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US8968995B2 (en) * | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
US8859218B2 (en) * | 2008-06-13 | 2014-10-14 | Oncohealth Corp. | In situ detection of early stages and late stages HPV infection |
US20080133267A1 (en) * | 2006-11-30 | 2008-06-05 | George Maltezos | System and method for individualized patient care |
WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
US8795197B2 (en) | 2007-07-17 | 2014-08-05 | Histologics, LLC | Frictional trans-epithelial tissue disruption collection apparatus and method of inducing an immune response |
AU2008275983B2 (en) * | 2007-07-17 | 2014-07-31 | Histologics Llc | Frictional trans-epithelial tissue disruption and collection apparatus and method of inducing and/or augmenting an immune response |
US7838215B2 (en) * | 2007-09-25 | 2010-11-23 | Canvir, Inc. | Advanced cervical cell screening methods |
US20090132443A1 (en) * | 2007-11-16 | 2009-05-21 | Odilo Mueller | Methods and Devices for Analyzing Lipoproteins |
EP4047367A1 (en) | 2008-07-18 | 2022-08-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting target analytes with droplet libraries |
US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
EP2403880A1 (en) | 2009-03-05 | 2012-01-11 | Tripath Imaging, Inc. | Matrix metalloproteinase-7 (mmp-7) monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer |
JP2012524521A (ja) | 2009-03-06 | 2012-10-18 | トライパス イメージング インコーポレイテッド | グリコデリンモノクローナル抗体および卵巣癌の検出におけるその使用のための方法 |
EP3415235A1 (en) | 2009-03-23 | 2018-12-19 | Raindance Technologies Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
EP2425227B1 (en) | 2009-04-27 | 2020-10-14 | Becton Dickinson and Company | Sample preparation device and associated method |
EP2427763A4 (en) | 2009-05-07 | 2013-08-21 | Oncohealth Corp | IDENTIFICATION OF HIGH GRADE OR CIN2 FOR DETECTION, MONITORING AND DIAGNOSIS, AT EARLY STAGES AND ADVANCED STAGES, OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) AND HPV ASSOCIATED CANCERS |
DE102009021734B4 (de) * | 2009-05-12 | 2012-02-02 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Diagnostische Marker für die Bestimmung der Prädisposition der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und für die Bestimmung eingesetzte Oligonukleotide |
US8207651B2 (en) | 2009-09-16 | 2012-06-26 | Tyco Healthcare Group Lp | Low energy or minimum disturbance method for measuring frequency response functions of ultrasonic surgical devices in determining optimum operating point |
EP2486409A1 (en) | 2009-10-09 | 2012-08-15 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
EP2517025B1 (en) | 2009-12-23 | 2019-11-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
US9128094B2 (en) | 2010-01-08 | 2015-09-08 | Oncohealth Corp. | High throughput cell-based HPV immunoassays for diagnosis and screening of HPV-associated cancers |
WO2011086172A1 (en) * | 2010-01-14 | 2011-07-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Recombinant probiotic bacteria for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease (ibd) and irritable bowel syndrome (ibs) |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US8535889B2 (en) | 2010-02-12 | 2013-09-17 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9044213B1 (en) | 2010-03-26 | 2015-06-02 | Histologics, LLC | Frictional tissue sampling and collection method and device |
US8900813B2 (en) * | 2010-08-17 | 2014-12-02 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | CIP2A as a biomarker in detection of cervical cancer |
WO2012045012A2 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
CN107699618B (zh) | 2010-11-12 | 2021-08-20 | 茵赛德斯有限公司 | 非疾病诊断的确定宫颈上皮内瘤样(cin)细胞是否存在于来自受试者的标记液体宫颈细胞样本的方法和系统 |
WO2012090479A1 (en) * | 2010-12-28 | 2012-07-05 | Oncotherapy Science, Inc. | Mcm7 as a target gene for cancer therapy and diagnosis |
WO2012109600A2 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
EP2675819B1 (en) | 2011-02-18 | 2020-04-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
AU2012229102B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-02-04 | Cernostics, Inc. | Systems and compositions for diagnosing Barrett's esophagus and methods of using the same |
US10445846B2 (en) | 2011-04-14 | 2019-10-15 | Elwha Llc | Cost-effective resource apportionment technologies suitable for facilitating therapies |
US9626650B2 (en) | 2011-04-14 | 2017-04-18 | Elwha Llc | Cost-effective resource apportionment technologies suitable for facilitating therapies |
EP3216872B1 (en) | 2011-06-02 | 2020-04-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
US8816814B2 (en) | 2011-08-16 | 2014-08-26 | Elwha Llc | Systematic distillation of status data responsive to whether or not a wireless signal has been received and relating to regimen compliance |
US10527526B2 (en) * | 2011-11-03 | 2020-01-07 | Tripath Imaging, Inc. | Methods and compositions for preparing samples for immunostaining |
GB201200178D0 (en) * | 2012-01-06 | 2012-02-22 | Cytosystems Ltd | Diagnostic method and system |
CN104471405B (zh) * | 2012-01-26 | 2017-03-29 | 莱卡生物系统里士满股份有限公司 | 用于苏木精‑伊红染色的方法和成分 |
WO2013120089A1 (en) | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Raindance Technologies, Inc. | Molecular diagnostic screening assay |
EP2844768B1 (en) | 2012-04-30 | 2019-03-13 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10201332B1 (en) | 2012-12-03 | 2019-02-12 | Healoe Llc | Device and method of orienting a biopsy device on epithelial tissue |
KR101432174B1 (ko) * | 2013-01-22 | 2014-08-22 | 한국원자력의학원 | Cdc27을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도 |
EP2984487B1 (en) | 2013-04-11 | 2019-03-27 | Cytocore, Inc. | Method for estimating the risk of dysplasia progressing to cancer in a subject |
EP2986762B1 (en) | 2013-04-19 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
CN103262838B (zh) * | 2013-06-05 | 2014-04-30 | 合肥安旸生物医药有限公司 | 一种宫颈异常细胞筛查试剂盒和酶标液基细胞保存液 |
WO2015021346A1 (en) * | 2013-08-08 | 2015-02-12 | The Research Foundation For The State University Of New York | Keratins as biomarkers for cervical cancer and survival |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
EP3090063B1 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detection of latent retrovirus |
ES2948803T3 (es) | 2014-09-17 | 2023-09-19 | Hologic Inc | Método de lisis parcial y ensayo |
CN104483472B (zh) * | 2014-12-19 | 2016-03-30 | 武汉大学 | 一种用于宫颈癌变细胞检测的诊断试剂及其制备方法 |
ES2806498T3 (es) | 2015-06-08 | 2021-02-17 | Arquer Diagnostics Ltd | Métodos para el análisis de una muestra de orina |
US11391744B2 (en) | 2015-06-08 | 2022-07-19 | Arquer Diagnostic Limited | Methods and kits |
GB201511196D0 (en) | 2015-06-25 | 2015-08-12 | Cytosystems Ltd | Monoclonal antibodies |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
US11013466B2 (en) | 2016-01-28 | 2021-05-25 | Healoe, Llc | Device and method to control and manipulate a catheter |
US11662564B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-05-30 | Shenzhen Prs Limited | Paraffin shield coating for microscope slide |
CN110741302B (zh) * | 2017-06-15 | 2021-11-16 | 深圳市诺高实验器材有限公司 | 用于免疫组化染色的过程记录玻片 |
US10998178B2 (en) | 2017-08-28 | 2021-05-04 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for sample analysis using swabs |
CN111458500A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-07-28 | 苏州百道医疗科技有限公司 | 人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒 |
WO2021241061A1 (ja) * | 2020-05-29 | 2021-12-02 | ソニーグループ株式会社 | 情報処理装置、情報処理方法、コンピュータプログラム、およびターゲット分子検出システム |
CN114217064A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-22 | 重庆沃康生物科技有限公司 | 以p16/Ki-67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法 |
CN114732907B (zh) * | 2022-01-21 | 2023-06-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | Ddx11蛋白作为dna损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用 |
CN114672566A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-06-28 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | Rfc4基因作为宫颈病变诊断标志物的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1360059A (zh) * | 2000-12-18 | 2002-07-24 | 拜尔公司 | 通过同时测量至少2种不同分子标记物而特异性检测子宫颈涂片中肿瘤细胞及其前体的方法 |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US630332A (en) * | 1898-10-14 | 1899-08-08 | Plano Mfg Company | Truck for grain-binders. |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4820504A (en) | 1986-02-12 | 1989-04-11 | City Of Hope | Multi-specimen tissue blocks and slides |
US4843155A (en) | 1987-11-19 | 1989-06-27 | Piotr Chomczynski | Product and process for isolating RNA |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
CA1340288C (en) | 1988-09-02 | 1998-12-29 | Robert Charles Ladner | Generation and selection of novel binding proteins |
US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
DE69129154T2 (de) | 1990-12-03 | 1998-08-20 | Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. | Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften |
US5244787A (en) | 1991-01-31 | 1993-09-14 | Biogenex Laboratories | Antigen retrieval in formalin-fixed tissues using microwave energy |
EP0575485A1 (en) | 1991-03-01 | 1993-12-29 | Dyax Corp. | Process for the development of binding mini-proteins |
ATE269401T1 (de) | 1991-04-10 | 2004-07-15 | Scripps Research Inst | Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden |
WO1992019952A1 (en) * | 1991-05-07 | 1992-11-12 | Wescor, Inc. | Improved staining method for histology and cytology specimens |
US5316814A (en) | 1991-05-14 | 1994-05-31 | Ricoh Company, Ltd. | Optical information recording medium |
DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
US5770358A (en) | 1991-09-18 | 1998-06-23 | Affymax Technologies N.V. | Tagged synthetic oligomer libraries |
US5384261A (en) | 1991-11-22 | 1995-01-24 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths |
US5677195A (en) | 1991-11-22 | 1997-10-14 | Affymax Technologies N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
US5346831A (en) | 1992-09-29 | 1994-09-13 | Hoffman-La Roche Inc. | Cytorich process system |
US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
US5658636A (en) | 1995-01-27 | 1997-08-19 | Carnegie Mellon University | Method to prevent adhesion of micromechanical structures |
US5545531A (en) | 1995-06-07 | 1996-08-13 | Affymax Technologies N.V. | Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays |
US5856174A (en) | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
EP0880598A4 (en) | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
US5858683A (en) | 1996-08-30 | 1999-01-12 | Matritech, Inc. | Methods and compositions for the detection of cervical cancer |
US6303323B1 (en) * | 1997-10-21 | 2001-10-16 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Detection of dysplastic or neoplastic cells using anti-MCM5 antibodies |
GB2332515B (en) * | 1997-10-21 | 1999-12-15 | Cancer Res Campaign Tech | Determination of cellular growth abnormality |
DE69829402T2 (de) | 1997-10-31 | 2006-04-13 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corp.), Santa Clara | Expressionsprofile in adulten und fötalen organen |
US6020135A (en) | 1998-03-27 | 2000-02-01 | Affymetrix, Inc. | P53-regulated genes |
DE19829473C2 (de) | 1998-07-01 | 2000-08-10 | Magnus Von Knebel Doeberitz Ch | Verfahren zur frühen Diagnose von Carcinomen |
GB0018140D0 (en) * | 2000-07-24 | 2000-09-13 | Medical Res Council | Screening for abnormalities |
IT1317881B1 (it) * | 2000-07-31 | 2003-07-15 | Euroiset Italia S R L | Composizione per la neutralizzazione degli acidi inorganici e organiciforti. |
US7125663B2 (en) | 2001-06-13 | 2006-10-24 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
EP1497469A4 (en) * | 2002-04-04 | 2005-06-08 | Achillion Pharmaceuticals Inc | TEST FOR ASSESSING THE ACTIVITY OF COMPOUNDS AGAINST HCV USING A NOVEL DETECTION SYSTEM IN THE HCV REPLICIC |
ATE261126T1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-03-15 | Mtm Lab Ag | Verfahren für lösung-basierte diagnose |
US7361460B2 (en) * | 2003-04-11 | 2008-04-22 | Digene Corporation | Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases |
US7595380B2 (en) * | 2005-04-27 | 2009-09-29 | Tripath Imaging, Inc. | Monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
US7632498B2 (en) * | 2005-12-19 | 2009-12-15 | Tripath Imaging, Inc. | MCM6 and MCM7 monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
-
2005
- 2005-03-23 ES ES05732112T patent/ES2381644T3/es active Active
- 2005-03-23 WO PCT/US2005/009740 patent/WO2005095964A2/en active Application Filing
- 2005-03-23 KR KR1020087018983A patent/KR20080075045A/ko active Application Filing
- 2005-03-23 AT AT05732112T patent/ATE549625T1/de active
- 2005-03-23 US US11/087,227 patent/US7157233B2/en active Active
- 2005-03-23 AU AU2005228026A patent/AU2005228026B2/en active Active
- 2005-03-23 EP EP10012137A patent/EP2293069A3/en not_active Withdrawn
- 2005-03-23 BR BRPI0509193A patent/BRPI0509193B8/pt active IP Right Grant
- 2005-03-23 KR KR1020067022111A patent/KR100882249B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-03-23 EP EP05732112A patent/EP1756577B1/en active Active
- 2005-03-23 CA CA2560782A patent/CA2560782C/en active Active
- 2005-03-23 MX MXPA06011020A patent/MXPA06011020A/es active IP Right Grant
- 2005-03-23 JP JP2007505150A patent/JP4545189B2/ja active Active
- 2005-03-23 CN CN2005800163173A patent/CN1957256B/zh active Active
- 2005-03-23 KR KR1020117002467A patent/KR20110027823A/ko not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-08-17 US US11/506,012 patent/US7455973B2/en active Active
- 2006-09-14 US US11/521,144 patent/US7510838B2/en active Active
-
2008
- 2008-10-31 US US12/263,139 patent/US20090075300A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-03 US US12/263,942 patent/US20090148864A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-12-01 JP JP2009273812A patent/JP2010091577A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1360059A (zh) * | 2000-12-18 | 2002-07-24 | 拜尔公司 | 通过同时测量至少2种不同分子标记物而特异性检测子宫颈涂片中肿瘤细胞及其前体的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BALDWIN P. ET AL..TRANSLATIONAL APPROACHES TO IMPROVING CERVICAL SCREENING.《NATURE REVIEWS. CANCER》.2003,第3卷第217-226页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005228026A1 (en) | 2005-10-13 |
CA2560782C (en) | 2013-05-21 |
US20060286595A1 (en) | 2006-12-21 |
EP1756577B1 (en) | 2012-03-14 |
US20090075300A1 (en) | 2009-03-19 |
US20070009885A1 (en) | 2007-01-11 |
KR100882249B1 (ko) | 2009-02-06 |
WO2005095964A3 (en) | 2006-03-02 |
US20050260566A1 (en) | 2005-11-24 |
BRPI0509193B8 (pt) | 2021-07-27 |
AU2005228026B2 (en) | 2011-03-24 |
EP1756577A2 (en) | 2007-02-28 |
CA2560782A1 (en) | 2005-10-13 |
KR20070026475A (ko) | 2007-03-08 |
US7455973B2 (en) | 2008-11-25 |
BRPI0509193B1 (pt) | 2019-03-26 |
JP4545189B2 (ja) | 2010-09-15 |
ATE549625T1 (de) | 2012-03-15 |
KR20110027823A (ko) | 2011-03-16 |
US7157233B2 (en) | 2007-01-02 |
US20090148864A1 (en) | 2009-06-11 |
JP2007530949A (ja) | 2007-11-01 |
CN1957256A (zh) | 2007-05-02 |
MXPA06011020A (es) | 2007-08-14 |
WO2005095964A2 (en) | 2005-10-13 |
ES2381644T3 (es) | 2012-05-30 |
JP2010091577A (ja) | 2010-04-22 |
BRPI0509193A (pt) | 2007-08-28 |
KR20080075045A (ko) | 2008-08-13 |
US7510838B2 (en) | 2009-03-31 |
EP2293069A2 (en) | 2011-03-09 |
EP2293069A3 (en) | 2011-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1957256B (zh) | 用于子宫颈疾病检测的方法和组合物 | |
EP1025444B1 (en) | Determination of cellular growth abnormality | |
US6303323B1 (en) | Detection of dysplastic or neoplastic cells using anti-MCM5 antibodies | |
Queiroz et al. | Comparative study of the expression of cellular cycle proteins in cervical intraepithelial lesions | |
Muntean et al. | Cytological and histopathological aspects concerning preinvasive squamous cervical lesions | |
AU2011202593A1 (en) | Methods and compositions for the detection of cervical disease | |
Galati | Prevalence of Human Papillomaviruses (HPV) in Triple Negative (TN) Breast Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |