JPH11510683A

JPH11510683A - エピトープタギングシステム

Info

Publication number: JPH11510683A
Application number: JP8529754A
Authority: JP
Inventors: ワン，リンファ
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1995-08-15
Filing date: 1996-08-15
Publication date: 1999-09-21
Also published as: CA2229540A1; WO1997007132A1; EP0845004A4; AUPN480095A0; EP0845004A1

Abstract

(57)【要約】目的の分子に結合したときにエピトープタグとして機能するヘキサペプチドを記載する。配列Q-Y、F、HまたはW-P-A、S、またはV-LまたはV-T、L、VまたはQを有するようなエピトープタグは、目的のタンパク質の精製、または目的の分子の研究および特徴付けに有用である。好ましくは、QYPALT、QYPSLL、QYPSLQ、QFPALL、QYPVLVおよびQYPSLTである。最も好ましくはQYPALTである。

Description

【発明の詳細な説明】エピトープタギングシステム技術分野本発明は、エピトープタギング(tagging)システムに関し、そして特にエピトープタギングにおける使用に適切なペプチド、エピトープタグ化分子、エピトープタグを含むハイブリッドポリペプチド、ハイブリッドポリペプチドをコードする発現ベクター、および目的のタンパク質を精製するプロセスに関する。本発明はまた、本発明のペプチドタグに特異的な抗体に及ぶ。発明の背景エピトープタギング（免疫タギング、エピトープフラッギング(flagging)、またはペプチドタギングとしてもまた公知である）は、抗原決定基として認識されるアミノ酸残基の１セットと目的のタンパク質とを結合させるプロセスである（米国特許第4782137号；KolodzieおよびYoung、1991；Fieldら、1988；Pati、199 2；SoldatiおよびPerriard、1991；Geliら、1988；Yeeら、1987；ならびにLinds leyおよびWang、1993）。エピトープを用いてタンパク質をタギングすることは、特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）によるタンパク質の監視を可能にする。このアプローチは、タグ化タンパク質の大きさ、ならびにその量、細胞局在性、翻訳後修飾および他のタンパク質との相互作用などを解明し得る。特に、エピトープタギングは、その機能をアッセイする方法が存在しない場合でさえもタンパク質が精製されることを可能にする。このエピトープタギングアプローチは、目的のタンパク質に対して直接生じさせた抗体の使用を上回る顕著な利点を提供する。これは：１）モノクローナル抗体(mAb)の作製において費やされる時間および供給源を節約する；２）タグ化タンパク質を、非タグ化タンパク質との交差反応性のスペクトルがすでに公知である良く特徴付けられたmAbを用いてモニターし得る；３）比較可能なネガティブコントロールを用い得る。これは抗体を独立して惹起し得ない；４）目的の分子中のエピトープの位置をエピトープタギングにより正確に制御し得る。これは、構造-機能研究に非常に重要であり得る；および５）エピトープタギングは類似の遺伝子産物間の区別のために特に有用であり得る。要約すれば、エピトープタギングアプローチは、目的のタンパク質に対して直接惹起した抗体の使用を上回る普遍性、正確性および経済性の利点を提供する。エピトープ-タギングストラテジーにおける主要な不明確性は：１）タグ化タンパク質のその生物学的機能を維持する能力、および２）標的タンパク質配列のエピトープの抗原性への影響である。これらの理由から、タギングの適用における成功の機会を増大させるために、短い長さおよび異なる配列の特徴（例えば、異なる正味の電荷、疎水性および側鎖）を有するエピトープタグを開発することがときに不可欠である。現在までのところ、多くの他のシステムが記載されているが、４つのタギングシステムのみが市販されている。これらのシステムの２つは10より多いアミノ酸残基のエピトープタグを含む。10アミノ酸残基より少ないエピトープを有する唯一の市販のシステムは、Hoppら(1988；Prickettら、1989)により開発されたFLAG^TM システムである。FLAGは小さなタグ（８アミノ酸残基）であるが、その高度に荷電した性質が、電荷の正味の変化に感受性であるタンパク質分子をタギングするその適用を妨げ得る。表１は、文献に記載されるエピトープタグ配列の要約であり、そしてこれらを本発明の好ましい配列QYPALTと比較する。本発明は、現在利用可能なタギングシステムに対する代替を提供することに努める。 349アミノ酸のタンパク質である、VP7は、ブルータングウイルス(BTV)の主要な構造タンパク質である。VP7は、群特異的血清型試験においてBTV特異的な抗体により認識されるが、アフリカウマ疫ウイルスおよび流行性出血症ウイルスに対する抗体と交差反応し、そして従って厳密に言えば血清群-特異的抗原ではない。本発明者らは、配列Gln-Tyr-Pro-Ala-Leu-Thr(QYPALT)を有するヘキサペプチド、およびBTVのVP7分子由来の関連ペプチドは、２つのmAbにより抗原エピトープとして認識され、そしてタグ化分子においてヘキサペプチドの抗原性に実質的に影響することなくタグペプチドとして用いられ得ることを見出した。本発明者らはこの配列をBTagと称した。発明の要旨第１の局面において、本発明は、目的の分子に結合するときにエピトープタグとして機能するペプチドを提供する。このペプチドは、配列Q-Y、F、HまたはW-P -A、SまたはV-LまたはV-T、L、VまたはQを有する。より好ましくは、このペプチドは、QYPALT、QYPSLL、QYPSLQ、QFPALL、QYPVLVおよびQYPSLTから成る群より選択される配列を有する。最も好ましくは、このペプチドは配列QYPALTを有する。観察された有益な効果についての任意の提案されるメカニズムにより限定されることを望むことなく、本発明者らは１位および３位におけるアミノ酸がこのペプチドに重要であり、そして２位のアミノ酸は芳香族であるべきであるということを確信する。第２の局面において、本発明は、エピトープタグ化分子を提供する。ここで、このエピトープタグは、本発明のヘキサペプチドであるか、またはこれを含む。本発明は本発明のヘキサペプチドに結合し得る任意の他の分子を包含し得るが、好ましくは、タグ化分子はタンパク質である。このタンパク質は、例えば、酵素、ホルモン、F_C領域を欠損する遺伝子操作された単鎖抗体分子、または任意の他のタンパク質であり得る。より好ましくは、このタンパク質は組換えタンパク質である。いくつかの目的については、このエピトープを炭水化物に結合し得る。タグを任意の簡便な手段により目的の分子に結合し得る。例えば、ポリペプチドを、従来の固相法を用いて、そしてペプチドタグを合成へ組込んで化学的に合成し得る。タグ化ポリペプチドまたはタンパク質を、本明細書中に記載されるように、従来の組換え法により融合タンパク質として合成し得る。タグを、カルボジイミドのような従来の架橋剤を用いて、または酵素法を用いてタンパク質または炭水化物に結合し得る。本発明のタグ化分子は、上述の特異的な抗体により分子の監視を可能にする。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。第３の局面において、本発明は、本発明のヘキサペプチドを含むハイブリッドポリペプチド、目的のタンパク質、およびこのヘキサペプチドとこの目的のタンパク質との間に挿入されたアミノ酸の１以上の結合配列を提供する。この結合配列は、タンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得る。タンパク質分解薬剤は、エンテロキナーゼのような酵素またはシアノゲンブロミドのような化学薬剤であり得る。種々の適切な切断薬剤は当該分野において公知である。例えば、米国特許第4782137号；Hoppら、1988およびWalkerら、1994 を参照のこと。第４の局面において、本発明は、以下；１）本発明のヘキサペプチド、２）目的のポリペプチド；および必要に応じて３）このヘキサペプチドとこの目的のタンパク質との間に挿入されたアミノ酸の少なくとも一つの結合配列であって、この結合配列は、タンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得る、を含むハイブリッドポリペプチドをコードするDNAを含むDNA発現ベクターを提供する。本発明はまた、以下；１）本発明のヘキサペプチド、および必要に応じて２）アミノ酸の少なくとも１つの結合配列であって、この結合配列はタンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得る、を含むハイブリッドポリペプチドをコードするDNAを含むDNA発現ベクターを提供する。所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列は、ベクターのDNA へ挿入され得るので、次いでヘキサペプチド、および所望であれば、結合配列を目的のポリペプチドとともに同時発現させ得る。結合配列を用いる場合、結合配列はヘキサペプチドと目的のタンパク質との間に挿入され、そして容易に切断され得る。本発明のヘキサペプチドタグを、所望のタンパク質中の任意の部位（すなわち、Ｎ末端）、配列内の任意の部位、またはハイブリッドポリペプチドのＣ末端に位置し得る。特別な目的については、Ｎ末端またはＣ末端は特に簡便であり得る。なおさらなる局面において、本発明は、第３の局面のDNA発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そしてこのハイブリッドポリペプチドを発現させることによって第２の局面のハイブリッドポリペプチドを産生するための方法を提供する。宿主細胞は、任意の適切な細胞タイプ（例えば、細菌、酵母のような真核生物細胞、または哺乳動物細胞）であり得る。さらに、本発明のエピトープタグは、ファージディスプレイ発現系における使用に適切である。従って、本発明のエピトープタグを、組換えウイルスの構造成分をタギングするために使用し得る。本発明はまた、本発明のヘキサペプチドをコードし、そして１以上のクローニング部位を有する配列を含む発現ベクターを提供する。このベクターは、３つのリーディングフレーム中に複数のクローニング部位を有し得る。なおさらなる局面において、本発明は、本発明のハイブリッドポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を包含する、目的のタンパク質を精製するかまたは単離するための方法を提供する。アフィニティー分離は、例えば、ハイブリッドポリペプチドと、本発明のヘキサペプチドタグに特異的な、固定化した抗体（特にモノクローナル抗体）とを接触させることにより達成され得る。アフィニティークロマトグラフィーに適切な支持体を形成するための種々のカップリング法および抗体を固定化するための固相支持体が公知である。当業者は適切な系を容易に選択し得る。次いで、精製したタンパク質をペプチドタグから切断し得る。さらなる局面において、本発明は抗体を提供する。これは、本発明のヘキサペプチドタグを認識し得るモノクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生およびスクリーニングの方法は当業者に周知である。特に好ましい抗体は、本明細書中以下に記載されるようなF10およびD11と称されるモノクローナル抗体である。本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞、および組換え抗原を利用する競合ELISAアッセイのような、アッセイ系に及ぶ。ここで、本発明のエピトープは標的タンパク質の免疫原性領域に隣接して位置する。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドでタグ化された組換えタンパク質または他のタンパク質の精製およびアッセイにだけではなく、このようにタグ化された種々の他のタイプの種々の化合物検出にもまた適用され得ることが認識される。例えば、放出物の流れを環境的にモニターすることは、放出物の成分をタギングするか、または放出物にタグ化マーカーを添加し、そしてタグの存在について環境サンプルをアッセイすることにより達成され得る。本発明の抗体を、上述の検出方法において使用するために、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような、当該分野で一般的に使用される酵素または他のシグナル系に結合し得る。別の局面において、本発明は、本発明のエピトープタグ、および本発明のタグまたはヘキサペプチドに対する抗体を含むキットに関する。さらなる局面において、本発明は、複数のエピトープタグ化分子を含むキットを提供する。ここで、タグ化分子は、一連の分子量基準またはマーカーである。好ましくは、このエピトープタグは配列QYPALTを有するヘキサペプチドである。このようなキットは、タンパク質の大きさを評価するための精製したタンパク質のウェスタンブロット検出において有用である。発明の詳細な説明本発明を、以下の非制限的な実施例に関して詳細に本明細書中以下に記載する。本発明のこのより詳細な説明において、添付する図面が参照される。図１は、pGEXベクターにおける欠失マッピングを示す。図の上部の黒い矢印の棒は、BTV VP7のコード領域を表し、その上部に重要な制限部位を示す。制限酵素の略語は以下の通りである：B、BamHI；Bg、BgIII；Bs、BsmI；E、EcoRI；H、 HindIII；N、NdeI；Na、NaeI；R、RsaI；S、Sau3A；括弧は、制限酵素部位が元の遺伝子配列中には存在せず、そしてPCT変異誘発により作製されたことを示す。３つの重要な残基（Cys-15、Cys-65およびLys-255）を、上向きの白抜き矢印により示す。中央の点を付した棒は、遺伝子フラグメントが下部の塩基対(bp)で与えられることを表す。プラスミド名を左に示す一方、これらのプラスミド内の各挿入物に対する対応するアミノ酸数(AA#)を右に示す。D11およびF10に対する各組換え融合タンパク質の反応性を、「＋」（反応性）および「−」（非反応性）により示す。図２は、GST融合タンパク質のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析の結果を示す。パネルＡは、クマシーブルー染色されたゲルであり、一方パネルＢはウェスタンブロットである。レーン１：コントロールベクターpGEX-1N由来のGST；レーン２〜４：それぞれ、発現プラスミドpGEX-BR、pGEX-BB、およびpGEX-BS由来のGST融合タンパク質（上記の図１を参照）。図３は、種々の長さの重複する合成ペプチドに結合するmAbのELISA分析の結果を示す。D11について得られた結果を左の４つのパネルに示し、一方F10について得られた結果を右側に示す。ペプチドの長さを各パネルの上右角に示す。Ｙ軸上の数字はOD読み取り値を表し、一方、Ｘ軸上の基数１〜20は、BTV-1 VP7分子の残基256〜275に対応する(Eatonら、1991)。図４は、タグ化QYPALTエピトープおよび３つのリーディングフレーム中のマルチクローニング部位を示す、９つの発現ベクターの配列を提供する。図５は、pGDベクター由来のGSTタグタンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す。パネルＡは、クマシーブルー染色されたゲルであり、一方、パネルＢおよびＣは、それぞれD11およびF10を用いたウェスタンブロットである。レーン０：コントロールベクターpGEX-1Nから発現したGST；レーン１〜３：それぞれ、 pGD1、pGD2およびpGD3由来のGST-タグタンパク質（配列については図４を参照）。図６は、BTV-0と称される以前は未知であった血清型由来の組換えVP7タンパク質、およびBTV-15由来の組換えVP7タンパク質のウェスタンブロットを示す。パネルＡおよびＢは、それぞれD11およびF10でプローブしたウェスタンブロットである。レーン１：ポジティブコントロールとして用いたpGEX-BS由来のGST融合タンパク質（図１および図２を参照）；レーン２：pETベクターから発現したBTV-0 VP7(Studierら、1990)；レーン３：同じpET系から発現したBTV-15 VP7。図７は、BTV-1、BTV-0およびBTV-15のVP7分子の推定のアミノ酸配列の比較を示す。同一のアミノ酸残基を点で示し、一方BTV-1と異なるアミノ酸残基を１文字表記のアミノ酸コードで示す。図８は、競合ELISAアッセイのメカニズムを例示する。パネルＡは、同じエピトープに結合する抗体間での競合を示す。パネルＢは、近傍のエピトープに結合する抗体間の競合を示す。実施例１２つのモノクローナル抗体により認識されるブルータングウイルスVP 7分子のエピトープの同定 BTVウイルスタンパク質の構造的および機能的研究のために、mAbのパネルを主要なコアタンパク質VP7に対して作製した。マウスを、ドデシル硫酸ナトリウムで変性したオーストラリアBTV血清型１で免疫化し、そしてハイブリドーマ細胞を、Luntら(1988)により一般的に記載されるように、従来の方法を用いて、マウスの腹水の細胞として確立しそして維持した。免疫化したBalb/cマウス由来の脾臓細胞を、融合薬剤としてポリエチレングリコールMW1500(BDH)を用いて、マウス骨髄腫細胞株Ag14-Sp2/0の細胞と融合した(Schulmanら、1978)。ハイブリドーマ細胞株を、40％スクロースによる遠心分離により部分的に精製したBTV抗原を用いて間接ELISAによりスクリーニングした。サブクローンを、親株の限外希釈によりポジティブクローンから作製し、そしてポジティブなサブクローンを同定するために、酵母で産生した組換えVP7を用いてELISAおよびウェスタンブロッティングによりスクリーニングした。モノクローナル抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてマウス腹水液から精製した。これらのmAbのうち、２つの特定のmAb(D11およびF10)は、ウェスタンブロット分析で強力な結合活性を示した。これは、それらがVP7分子上の線状エピトープを認識することを示す。 pGEXベクター中のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた組換えペプチドを用いて(SmithおよびJohnson、1988)、D11 およびF10の両方が、VP7分子中の残基256と275との間の20アミノ酸(aa)ペプチドに結合することが示された。これを図１および図２に例示する。これらのmAb-規定されたエピトープの分子構造のさらなる特徴づけを、Geysenら(1984)のPepSca n法、およびランダムエピトープライブラリー法(Scottら、1990；Devlinら、199 0；Cwirlaら、1990)により重複する合成ペプチドを組織的に調べることにより行った。これらの技術は、６つの連続するアミノ酸残基からなるエピトープを正確に示した。さらに、エピトープライブラリーは、認識のために重要ないくつかの残基の同定、ならびにEHDV上の潜在的な交差反応決定基の存在を予測することを可能にした。 PepScan分析のために、ELISAアッセイによるD11およびF10のハイブリドーマ細胞培養上清を、１：20希釈にて使用した。重複ペプチド（５〜８マー）を合成し、そしてmAb結合について試験した。結果（図３に表す）は、両抗体はアミノ酸位259〜263に位置するペンタペプチドQYPALを認識するが、ヘキサペプチドQYPAL Tがより高いシグナルを生じたということを示す。mAb F10は、またTAEIFNV、および隣接のヘプタペプチドと反応し、これは、mAb F10が、おそらく、潜在的な βターンにより並列される、両ペプチド上の不連続的なエピトープ組込み接触部位を認識し得ることを示唆している(ChouおよびFasman、1974)。従って、PepSca n分析は、両方のmAbがVP7の同じ領域を認識することを示したが、これらがわずかに異なる特異性を有し得ることを示した。従って、両mAbの主要な抗原決定基は、配列QYPALTを有する６-aaのペプチドであった。実施例２ MAb により認識される種々の配列の同定糸状ファージライブラリーが提示するランダムヘキサペプチド(ScottおよびSm ith、1990)由来のペプチドの選択を、良好なエピトープマッピングのためのPepS canの補助として使用した。結合ファージのアフィニティー精製は、本質的に、S cottおよびSmith(1990)、ならびにParmleyおよびSmith(1988)により記載される通りであり、そして３回の生物選抜(biopanning)および各々のMabを用いる１回のマイクロ選抜にライブラリーを供することにより行った。アフィニティー選択されたファージのDNAを、製造者により記載されるように、fUSE配列決定プライマー(ParmleyおよびSmith、1988)およびTaq Track配列決定システム(Promega)を用いて配列決定した。３回の連続的な生物選抜の後、93の異なるテトラサイクリン耐性の形質導入細菌コロニーにより産生されたファージをマイクロ選抜のために拾い、それらが提示したヘキサペプチドがそれぞれの抗体により個々に認識されることを確認した。20μlスポットあたり100を超えるの形質導入コロニーを生じたマイクロ選抜コロニーのみをDNA配列決定のために拾った。それらの推定のアミノ酸配列の比較は、MAb D11が、表２に示されるように、３つの非常に類似するヘキサペプチドを提示するファージを選択したことを示した。各々のヘキサペプチドクラスを提示するファージクローンの数を、括弧中に示す。259位〜264位における真正のVP7配列(QYPALT)に類似するかまたは同一の残基を太字で示す。 BTVのVP7のアミノ酸配列の観察は、これらのヘキサペプチドが、今までに特徴づけられたBTV VP7配列の８つにおいて259〜264位に位置する残基QYPAL(T)に最もよく似ていることを明らかにした。本発明者らは、２つの単離体がこの領域中で異なることを見出した；BTVOは配列QYPSLTを有し、そしてBTV-15はQYPALAを有する。MAb F10はまた、ライブラリーから非常によく似たペプチドを選択した。Q YPALTにまったく同一の物はなかった。なぜなら、おそらく多くのヘキサペプチドが、単に偶然により、このようなライブラリーから欠失し得るためである(Sco ttおよびSmith、1990)。それにもかかわらず、エピトープライブラリーから単離したペプチドの配列は、PepScan法により認識されたペプチドの配列とよく相関していた。しかし、MAb F10はまた、PepScan中のヘキサペプチドTAEINBFVに結合し（図３）、一方アフィニティー精製したファージはどれも、比較可能な配列を発現しなかった。この見かけ上の矛盾に対する可能性のある理由は、ライブラリーが遠い関係のヘキサペプチドのみを含有する場合、それらはパラトープ(parat ope)に対して低い親和性を有し得、そして従って生物選択の間に排除されたことである。さらに、PepScanおよびファージディスプレイペプチドを示す方法は、おそらく厳密には比較できない。それにもかかわらず、両方の技術は、QYPALT（以前に同定されたVP7上の３つの抗原領域由来とは異なるエピトープ）を同定した(LiおよびYang、1990；Eatonら、1991)。それらの表示されたペプチドがBTVエピトープを表すことを確認するために、アフィニティ選択された配列の各々を発現するファージを増殖し、ScottおよびS mith(1990)により記載されるように精製し、そしてウサギにおいてBTVに対して惹起された２つのMAbおよびポリクローナル抗血清を用いたELISAにより試験した。表３に表された結果は、MAb F10が全ての４つの生物選択されたペプチドと反応するが、D11はQWAVL（MAb F10によってのみ単離されていた配列）を認識しなかったことを示す。 ELISAプレートウェルを、0.25のA₂₈₈に調節したファージ調製物で被覆した。モノクローナル抗体を10μg/mlの濃度で、そしてウサギ抗血清を1/100の希釈度で添加した。MAbをペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG(Dakopatts)で検出し、そしてウサギ抗体はペルオキシダーゼ結合プロテインＡ(Cappel)であった。結果は３つの測定の平均を表す。従って、エピトープライブラリーは、２つのmAbの微細な特異性が異なることを確認した。D11またはF10のいずれもBTV-15のVP7に結合せず、一方F10（D11ではない）はBTV-0のVP7に結合するという本発明者らの発見によりさらに支持された結果であった。単離BTV4に対するウサギ抗血清はまた、すべての選択されたペプチドを認識した。これは、QYPALT領域が、免疫原として用いられた精製ウイルス調製物中で抗原性であったことを示す。正確なエピトープマッピングに加えて、アフィニティー精製されたペプチド配列の比較は、残基を同定されるべき抗体抗原相互作用に対して重要にし得る(Sco tt、1992)。BTV特異的なMAb F10およびD11については、QおよびPはおそらく重要であり、２位での芳香族残基は明らかに重要であり、一方、５位は、関連するＬまたはＶにより優先的に占められる。６位のＬ（またはD11により選抜された１つのクローン中のＶ）はまた、VP7においてこの位置がＴによって占められるために興味深く、ファージ系において重要であるように思われる（表３）。４位は、Ａ、Ｖ（両方とも脂肪族であり、非極性）、またはＳ（極性、ヒドロキシル基）を取り得るので、いずれの抗体に対する重要な接触残基も提示しない。しかし、ファージディスプレイ系は、ウイルスタンパク質における状況を正確に反映しない。例えば、両方のMAbは、関連した領域におけるQYPALAを有するBTV-15のVP7 に結合しない。６位においてＴを提示している選抜されたファージがないにもかかわらず、真正のエピトープの第６番目の残基におけるＴからＡへの変化は認識に対して明らかに非常に重要である。この発見は、ランダムエピトープライブラリーは所定のエピトープ中のいくつかの重要な残基を同定し得るが、おそらく隣接する配列の予測できない効果のためにその能力は限定され得るということを意味する。実施例３ヘキサペプチドQYPALTがD11およびF10の両方の結合に対する重要な決定基であることの確認ヘキサペプチドQYPALTがmAb D11およびF10の結合に対して重要な決定基であるということを証明するために、合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製して、 6-aaのエピトープタグを異なる発現ベクターへ導入し、そしてタグ化組換えタンパク質におけるその抗原性を試験した。これは、オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR; Saikiら、1985)を用いて達成した。エピトープをコードする小さなPCRフラグメントを、発現ベクターへ挿入した。本実施例中で用いられる３つのクラスのエピトープタギングベクター(pD、pTDおよびpYD と称する）は、３つの広範に用いられるE．coliおよび酵母発現ベクター由来であった：pGDは、pGEX-1N由来であった(SmithおよびJohnson、1988)、pTDは、pET -5b由来であった(Studierら、1990)、そしてPYDはpYELC5由来であった(Macreadi eら、1989；Macreadie 1990)。これらの元のベクターのすべては、唯一のBamHI クローニング部位を含む。構築プロセスは、各々の３つのクラスについて同じであった。QYPALTのコード配列をマルチクローニング部位の上流に挿入するために、３つの小さなDNAフラグメントを合成した。３つのフラグメントの各々はQYPALTコード領域の３'末端における単一の塩基対により異なり、そのためこれらの各々は外来遺伝子の融合に対して異なるリーディングフレームを生成する。これらの３つの小さな遺伝子カセットの３つの元の発現ベクターの各々の唯一のBamHI部位への挿入は、９つの新規のベクターを生じ、それらの配列を図４に示す。３つのベクター（例えば、pGD1、２、３）の各クラスについて、マルチクローニング部位に存在する特定の制限部位のいずれかに対する３つの可能なリーディングフレームのいずれか１つを用いて融合を行い得る。 pGEX由来のベクター(pGD1、pGD2およびpGD3)から発現したタグ化GSTタンパク質の抗原性を、ウェスタンブロットにより試験した。図５に示される結果は、すべての３つのGSTタグタンパク質がタグの抗原性を維持していたことを示した。しかし、pGD1の場合においては、おそらくエピトープ配列の下流の高度に正に荷電したLys残基の存在のために、抗原性は弱められるように思わた（図４を参照）。これは、所定のエピトープタグの抗原性が、標的タンパク質の配列環境により影響され得ることを示す。結果はまた、pGD1における弱まった効果はD11に対するよりもF10に対してより厳密ではないということを実証した。実施例４組換えタンパク質のモニターおよび精製におけるタギング系の適用 pGDベクターにおけるエピトープタグの抗原性が保持されていることを確認して、種々のタグ化タンパク質を、細菌Escherichia coliおよびBacillus subtili sで、酵母Saccharomyces cerevisiaeで、そしてベビーハムスター腎臓(BHK)細胞で発現した。本発明者らは、現在、本発明のエピトープタグを用いて23個の異なるタンパク質を発現させている。すべての実験において、本発明者らは、例えば、ウェスタンブロット、ELISA、免疫沈降、または免疫蛍光顕微鏡検査法の免疫学的方法により検出され得る機能的なエピトープタグを生成し得た。交差反応性のタンパク質バンドは、試験した宿主系のいずれにおいても検出されなかった。さらに、公共の配列データバンク（GenBankを含む）の配列ホモロジー検索は、配列QYPALT を含むタンパク質を示さなかった。本発明者らは、タンパク質分泌、膜挿入、およびウイルスアセンブリのような複雑な機能を含む、タグ化組換えタンパク質の発現または機能のいずれにおいても不都合な影響を観察しなかった。本発明者らは、Escherichia coli（プラスミド系およびファージ系の両方を用いる）、Bacillus subtilis、酵母Saccharomyces cerevisiae、ならびにBHK細胞のような哺乳動物細胞株を含む、種々の発現系および組換え宿主において本発明のエピトープタグを利用し得た。本発明者らは、本発明のエピトープタグは、一般に適用可能であり、そしてまたバキュロウイルスのような系においても使用し得ると考える。本発明者らが行ったタギング実験において、エピトープタグを、Ｎ末端、Ｃ末端、または組換えタンパク質の配列の内部に配置した。本発明者らの結果は、本発明のエピトープタグが強力な抗原決定基であり、これは抗原性を有意に欠失することなく種々の隣接配列環境に隣接して利用し得るということを示す。実施例５Ｃ末端タギング図４に示すように、BTagを、３つのすべてのリーディングフレームで、３つの異なる発現系（pGEXベクター、T7 RNAポリメラーゼベースのpETベクター、および酵母の発現ベクターであるpYELC）に最初に組み込み、従って９つの異なる融合ベクターを生じさせた。 pGDベクターの場合、BTagをpGEXベクター中のGSTタンパク質のＣ末端に配置した（いわゆる、「Ｃ末端タギング」）。３つのすべてのベクター中のBTagの抗原性を、ウェスタンブロットにより試験しそして確認した。 mAb D11でプローブした場合、pGD1中のBTagの抗原性は、pGD2およびpGD3中のものと比較して弱く、これはおそらくすぐ下流のGlu(E)およびLys(K)残基の存在による（図５を参照）。しかし、mAb 20F10をウェスタンブロットにおいて用いた場合、この差はほとんど問題ではない。pGD1中のBTagの抗原性の減少は、BTag とGlu(E)コドンとの間にGCG(Ala)コドンを挿入して小さなAla残基（BTV VP7タンパク質の天然の配列中に存在した）を導入し、そしてリーディングフレームを維持することにより克服され得る。 pGDベクターでのGST-BTag発現のこれらの例に加えて、本発明者らまた、E．co li中でＣ末端タグ化scFv抗体分子を発現させた。この実験において、本発明のペプチドが、FLAGのような、scFvの発現に対して以前に使用されていた他のタギング系よりも優れていることを見出した。すなわち、抗原性が安定しており、そして組換えscFv分子の発現について、不都合な効果が観察されなかった。Ｃ末端タギング実験を表４に要約する。 pPOWは、単鎖抗体の発現のためのE．coliベクターである(Powerら；Gene、1992 113 95-99)。実施例６Ｎ末端タキング２つの群のＮ末端融合を行った。第１の群は、pTDまたはpYDベクターへの標的遺伝子（フラグメント）のクローニングにより得られた。これらの場合、BTagは、Ｎ末端に正確には配置されず、Ｎ末端からそれぞれ13位および６位のアミノ酸に位置された。第２の群のＮ末端タギングタンパク質は、重複プライマーのPCR により生成された小さな二本鎖DNAフラグメントの挿入により得られた。これは、タンパク質コード領域のちょうど最初のBTag配列をコードし、従って真正な「Ｎ末端タグ」を形成する。５つの融合タンパク質を第１の群で発現させた（pTD ベクターより３つ、およびpYDベクターより２つ）。それらのすべては、ウイルス表面タンパク質であった。第２の群において、BTagを糸状ファージfdコートタンパク質pIIIおよびpVIII のＮ末端に配置した。４つの異なる融合タンパク質を構築した。これは、pIII融合に対して２つ、およびpVIII融合に対して２つであった。これらの場合に、BTa gをシグナルペプチド切断部位の直後に配置した。BTagのファージ粒子への機能的な組込みは、BTag化融合コートタンパク質が、正常な野生型タンパク質として分泌され、プロセスされそしてアセンブルされたことを示す。結果を表５に要約する。 fd-tetは糸状ファージfd由来のベクターのクラスである（ParmleyおよびSmith、 1988）。実施例７内部タグギング内部タグギングはまた、２つの群に分けられ得る。第１の群はpGDベクター中の組換えタンパク質の発現を含み、一方、第２の群はBTagコードフラグメントの挿入により得られた。３つのウイルス構造タンパク質がpGDベクターにおいて発現され、GST-BTag-標的タンパク質融合体を形成する。第２の群において、３つの異なる融合タンパク質を発現させた。これらの２つを、Bacillus subtilisにおいて発現させた。これは、BTagが細胞外タンパク質のプロペプチド領域に挿入されている。融合タンパク質の機能は完全に維持され、このことはBTagがタンパク質の分泌およびプロセシングに影響しないことを示した。３つ目の融合体の受容タンパク質はウイルス膜糖タンパク質であり、この場合、BTagは細胞表面に曝されていると推定される小さなドメイン中に挿入された。融合構築物は組換えワクシニアウイルスにおいて発現され、そしてBTagは、感染された細胞表面で免疫蛍光的に顕微鏡によって検出された。結果を表６にまとめる。 pNC3は、細胞外中性プロテアーゼの遺伝子を含むB．subtilis発現ベクターである（Wuら；Gene，1991 106 103-107）。実施例８抗原性における配列多様性の効果上記のように、pGD1において、エピトープタグの抗原性はいくらか弱められていた（図５）が、この効果は、mAb D11ほどmAb F10では厳密でなかった（図5Bおよび5Cそれぞれのレーン１を比較）。さらなる証拠は、２つの異なる血清型由来のBTV VP7分子のウェスタンブロット分析から得られる。この結果を図６に示す。BTV-0 VP7のエピトープ領域における単一の点変異（QYPALTからQYPSLTへの変化、配列比較については図７を参照のこと）はD11の結合を排除したが、F10は減少した効率であるが結合することがなお可能であった。実施例９エピトープタグ化タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製アフィニティーカラムを、製造者により使用された手順を使用してMAb D11およびAffi-Gel樹脂（Bio-Rad）を用いて調製し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.2）で平衡化した。組換えタンパク質は、酵母由来のBTV-1 VP7であった。これは、配列中にQYPALTタグを有する。総粗細胞溶解物を、超音波処理および遠心分離によって調製した。粗細胞溶解物をリン酸緩衝化生理食塩水中で調製した。この緩衝液は、カラムを平衡化するのに用いたものである。溶解物を２度カラムにアプライした。カラムを２倍のベッド容量の0.5ギ酸（pH約2.5）で溶出した。溶出物を８つの画分に回収し、そしてNaOHで中和した。画分を３つの異なる方法によってアッセイした：１）OD₂₈₀；２）mAb D11および溶出物の１：400希釈を用いるELISA；３）mAb D11および５μlの溶出物を用いるウェスタンブロット。結果を表７にまとめる。この予備実験においては、カラムの調製中に精度管理は行われず、そして固定化したD11の組換え抗原に対する比が最適化されなかったが、この結果は、D11が使用した条件下で組換えBTV-VP7に結合し得たこと、および組換えタンパク質がキ酸で溶出され得たことを示した。実施例10 本発明のモノクローナル抗体を用いる競合ELISAアッセイ抗体検出は、ヒトおよび動物においてウイルスまたは細菌感染を診断またはモニターするための最も便利な方法の１つである。組換えDNA技術の進歩により、組換え抗原は、現在では、このような目的のために容易に利用可能である。しかし、血清抗体は、直接アッセイされる場合に高いバックグラウンドの問題を引き起こし得る。図８に示すように、競合ELISA（C-ELISA）は、特異的抗原へのmAb の結合が、血清抗体を同一のエピトープ（図8A）または非常に近接したエピトープ（図8B）に競合結合させることによってブロックまたは逆転され得るという事実に基づく。有効なC-ELISAの考案における主要な困難は、このような適用のために適切なm Abを産生し、そしてスクリーニングする多くの時間を要するプロセスである。本発明者らは、小さなBTagが任意の標的タンパク質の免疫原性領域の隣りに配置されるように組換え抗原を操作することによってC-ELISAを考案することが可能であると考える。この場合、C-ELISAは主に、図8Bに概説されるメカニズム、すなわち、BTagへのmAbの結合と標的抗原上の近傍のエピトープへのポリクローナル抗体の結合との間の競合を利用する。２つの特定の例を試みた：ａ）第１の例は以下の立体配置を有する組換えタンパク質CSFV-gp55を使用した： N--T7 tag::BTag::CSFV-gp55(分子のC-末端側1/3)--C mAb D11を用いてELISAアッセイを行った場合、ウサギ抗Ｔ７タグ抗体（Novage nから購入）により約60〜70％の阻害が引き起こされた。コントロールのウサギ血清が全く阻害を生じず、そしてこれは、mAbが指向するエピトープが、アッセイされる標的エピトープ（この場合はT7タグエピトープ）に無関係である「異種の」競合システムであったことを考慮すれば、このことは重要であった。ｂ）本発明者らはまた、以下の立体配置を有するRCV-VP60のGST融合タンパク質である、他の組換えタンパク質を使用した： N--GST::BTag::RCV-VP60--C ヒツジ抗RCVポリクローナル抗体と競合させてmAb D11を用いてアッセイした場合、コントロールのヒツジ血清と比較して75％の平均の阻害が観察された。本発明者らは、これらの結果は競合が達成されたこと、そしてその異種の性質のために、阻害は、同種のC-ELISAの場合のような100％には決して到達し得ないことを示唆すると結論する。本発明のエピトープタギングシステムの独特の特徴の１つは、タグペプチドが２つの別のmAbによって認識され、なおさらにその高い特異性を維持することである。異なる結合親和性が必要とされる場合の特定の適用（例えば、mAbの過剰な結合が試験血清における抗体によるエピトープについての競合を妨げ得る競合 ELISA分析）において、これは非常に有用である。さらに、エピトープタグに隣接するか、またはエピトープタグ内の配列の多様性が、mAbの結合に影響し得る。タギングシステムにおいて２つのmAbを有することは、一方のmAbによる結合の失敗が他方の成功によって補われ得るように、タギング適用における成功の機会を増大する。実施例11 アフィニティーカラムアフィニティー精製カラムを、シアノゲンブロミド活性化セファロース樹脂（ Pharmacia）にカップリングさせたD11およびF10モノクローナル抗体のそれぞれを用いて、製造者のプロトコルに従って調製した。各抗体についての最適なカップリングレベルは５mg/ml樹脂であると決定した。表８は、作製したエピトープタグQYPALTを含むE．coli組換えタンパク質を示す。粗細胞溶解物を、先のタンパク質それぞれについて、超音波処理および遠心分離によって調製した。 500μlの各溶解物を、100mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したD11カップリング樹脂500μlとともにインキュベートした。さらに、GSTについて溶解物500 μlを、F10カップリングアフィニティー樹脂500μlとともにインキュベートした。溶解物および樹脂を穏やかに撹拌しながら30分間室温でインキュベートして結合させた。30分を超えるインキュベーションは、不可逆結合のために収量の減少を生じることが示された。溶出を、100mMのグリシン（pH3.5）の使用を通じて達成した。3.5より大きいp H値はタンパク質収量の減少を生じる。溶出画分を以下の方法によって、純度、免疫反応性、および収量について分析した：１．OD280 ２．ブラッドフォードタンパク質定量法（Bradford protein estimation）３．クマシー染色したPAGE ４．ウェスタンブロット（西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたmAb D11 およびF10を用いる）。得られた結果を表９に示す。本発明は、特徴づけられたタンパク質のタギング、分子生物学の現在の進歩、および小さなタグ配列が任意の未知のランダムなクローン化された遺伝子配列中にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術により挿入され得る容易さに関して記載されているが、本発明は一般的に適用可能なエピトープタギングシステムを提供する。本発明は、明確にすることおよび理解の目的のためにいくらか詳細に記載されているが、本明細書中に記載の実施態様および方法についての種々の改変および変更が本明細書中に開示される発明の概念の範囲を逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。本明細書中に引用される参考文献を以下のページに列挙し、これらは参考として本明細書中で援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．配列Q-Y、F、HまたはW-P-A、SまたはV-LまたはV-T、L、VまたはQを有するペプチドを含むエピトープタグであって、該ペプチドは分子に結合される、エピトープタグ。２．前記ペプチドがQYPALT、QYPSLL、QYPSLQ、QFPALL、QYPVLVおよびQYPSLTから成る群より選択される配列を有する、請求項１に記載のエピトープタグ。３．前記ペプチドが配列QYPALTを有する、請求項２に記載のエピトープタグ。４．前記エピトープタグが請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘキサペプチドを含む、エピトープタグ化分子。５．前記エピトープタグが請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘキサペプチドである、エピトープタグ化分子。６．請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘキサペプチド、該ヘキサペプチドでタグ化された分子、および、必要に応じて、ヘキサペプチドとタグ化分子との間に挿入されたアミノ酸の１以上の結合配列を含むハイブリッドポリペプチドであって、該結合配列がタンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得る、ハイブリッドポリペプチド。７．DNA発現ベクターであって、以下：１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘキサペプチド、２）該ヘキサペプチドでタグ化されるポリペプチド；および必要に応じて３）該ヘキサペプチドと該ポリペプチドとの間に挿入されたアミノ酸の少なくとも１つの結合配列、該結合配列はタンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得るを含むハイブリッドポリペプチドをコードするDNAを含む、ベクター。８．DNA発現ベクターであって、以下：１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘキサペプチド；および必要に応じて２）アミノ酸の少なくとも１つの結合配列、該結合配列はタンパク質分解薬剤により特異的なアミノ酸において切断され得るを含むハイブリッドポリペプチドをコードするDNAを含む、ベクター。９．エピトープタグ化分子を含むハイブリッドポリペプチドの産生方法であって、請求項７または８に記載のDNA発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、および該ハイブリッドポリペプチドを発現させる工程を包含する、方法。１０．前記宿主細胞が、細菌、真核生物細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。１１．前記宿主細胞が、E．coli、B．subtilis、S．cerevisiaeおよびベビーハムスター腎臓細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。１２．前記タグ化分子が、酵素、ホルモン、F_C領域を欠損する遺伝子操作された単鎖抗体分子、および組換えタンパク質からなる群より選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタグ化分子。１３．前記タグ化分子が組換えウイルスの構造成分である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタグ化分子。１４．前記タグ化分子が炭水化物である、請求項４または５に記載のタグ化分子。１５．前記ヘキサペプチドタグがタンパク質のＮ末端、タンパク質の配列内の任意の部位、またはタンパク質のＣ末端に位置する、請求項１２に記載のタグ化分子。１６．タンパク質またはタグ化タンパク質を精製または単離する方法であって、請求項１２に記載のタグ化タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を包含する、方法。１７．前記ヘキサペプチドタグを前記アフィニティークロマトグラフィーの後にタグ化タンパク質から切断する、請求項１６に記載の方法。１８．前記タグ化タンパク質をヘキサペプチドタグに特異的な固定化した抗体と接触させ、そして該タンパク質をタンパク質からヘキサペプチドタグを切断することにより精製または単離する、請求項１６に記載の方法。１９．請求項１〜３のいずれか一項に記載のエピトープタグを認識する抗体。２０．モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の抗体。２１．酵素またはシグナル系に結合された、請求項１９または２０に記載の抗体。２２．請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の抗体が固相支持体に結合されている、アフィニティークロマトグラフィー支持体。２３．請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、および請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。２４．請求項８に記載の発現ベクターおよび請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。２５．前記抗体が請求項２２に記載のアフィニティークロマトグラフィー支持体上に存在する、請求項２３または２４に記載のキット。２６．前記タグ化分子が一連の分子量基準またはマーカーである、複数のエピトープタグ化分子を含むキット。２７．前記エピトープタグが配列QYPALTを有するペプチドである、請求項２６に記載のキット。