CN105263509A - 使用工程改造的内含肽生产肽的方法 - Google Patents
使用工程改造的内含肽生产肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105263509A CN105263509A CN201480030331.8A CN201480030331A CN105263509A CN 105263509 A CN105263509 A CN 105263509A CN 201480030331 A CN201480030331 A CN 201480030331A CN 105263509 A CN105263509 A CN 105263509A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- intein
- peptide
- seqidno
- fusion rotein
- target peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达。本发明还提供工程改造的内含肽、包含所述内含肽的融合蛋白和编码这些融合蛋白的DNA构建体。在硫醇基诱导切割融合蛋白时,得到靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端α-硫酯原则上可与任何亲核体反应,因此该策略允许更大范围的羧基端修饰例如化学连接、生物缀合或酰胺化。本发明的工程改造的内含肽在大小上被减到最小,并且通过与<i>Mxe</i>?GyrA内含肽(SEQ?ID?NO:1)的3位的比对在相应位置上具有半胱氨酸突变,导致融合蛋白的表达水平提高和分离靶肽的产量较高,因此使本发明的方法适于生产规模。
Description
技术领域
本发明涉及生产肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达,其中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽。
发明背景
肽是一类快速发展的治疗剂,目前市场上有超过50种基于肽的产品,在涵盖诸如免疫学、肿瘤学、神经病学和内分泌学等疾病领域的开发中甚至更多。肽主要通过与特定细胞受体的相互作用调节许多生理机能,籍此它们诱导细胞信号转导事件,例如神经传递和激素的释放。由于其有限的体内稳定性和生物利用度所致,内源性肽作为治疗剂具有挑战。然而,高特异性和低毒性结合选择性修饰和改进肽的治疗性质的改进能力提高肽在药物研发中的关联性。
在内分泌学中,疾病常常由肽激素水平失衡引起或与之有关,正如诸如糖尿病和肥胖症等疾病中所见。值得注意的是,内分泌和神经系统中大约一半的肽激素在其C端是α-酰胺化的,而α-酰胺部分对于生物活性和稳定性常常是决定性的。某些治疗性肽,包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素(例如肽YY(PYY)、胰肽(PP)、α-降钙素基因相关肽(α-CGRP)、降钙素(CT)和胰岛淀粉样多肽),需要在C端中的α-酰胺部分以获得完整的生物活性。
用于产生肽治疗剂的最广泛采用的技术是微生物表达系统和化学合成。虽然肽C端酰胺容易通过化学合成获得,但是不容易引入来源于缺乏α-酰胺化酶机制的微生物宿主的重组肽中。因此,α-酰胺必须作为翻译后修饰引入。
内含肽是在单细胞生物中表达的在氨基端和羧基端两端具有侧翼蛋白质序列的自身催化性蛋白质结构域。氨基端和羧基端序列被命名为外显肽,这与外显子和内含子的DNA命名法一致。内含肽新兴家族的一个看似典型的成员是蟾分支杆菌(Mycobacteriumxenopi)的GyrA基因产物(MxeGyrA)。其分子量为约22kDa,在氨基端(半胱氨酸)和在羧基端(组氨酸和天冬酰胺)含有多个决定性的氨基酸。另外,羧基端外显肽必须始于半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在完成翻译后的某个点上,氨基端外显肽和内含肽间的肽键通过涉及内含肽氨基端半胱氨酸的N至S酰基转移而转化成硫酯键。该键然后在羧基端外显肽的开端与亲核残基(丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸)交换,然后随着天冬酰胺在内含肽C端的参与,内含肽将自身切割出来,同时第二酰基转移在氨基端和羧基端外显肽之间产生天然肽键。这些协同反应的整体作用是两个外显肽无缝连接,且释放出内含肽。
设计了突变型内含肽,其中通过突变使自我剪接功能失效,以在氨基端或羧基端剪接点任一个上允许切割。对于MxeGyrA内含肽,通过N198A突变使得氨基端切割成为可能。氨基端外显肽被另一多肽序列即靶肽置换,使得在所得融合蛋白用亲核化学剂(例如2-巯基乙磺酸钠(MESNa))切割后能够制备具有反应性羧基端α-硫酯柄(handle)的靶肽。所述内含肽来源的α-硫酯可与任何亲核体反应,并可用作用于化学连接、生物缀合或酰胺化的化学柄(chemicalhandle)。基于内含肽的方法已被用来重组生产实验室规模的α-酰胺化的肽(WO98/50563A1;WO00/00625A1;CottinghamI.R.等,Nat.Biotechnol.2001,19,974-977)。
应用该技术大规模生产C端α-酰胺化肽的主要限制是通常观察到的低产量,这可归因于大的内含肽大小和内含肽融合蛋白水解不稳定性的组合。在MxeGyrA内含肽中引入T3C突变已表明与成熟前裂解降低有关(CuiC.等,ProteinExpr.Purif.2006,50,74-81)。此外,内含肽的大小比肽激素的大小大,且内含肽大小的降低通过更经济地利用宿主蛋白质合成机制,可潜在地改进肽激素的最终产量。
发明概述
本发明提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达,且在硫醇基诱导切割融合蛋白时,获得靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端α-硫酯原则上可与任何亲核体反应,因此该策略允许更大范围的羧基端修饰,例如化学连接、生物缀合或酰胺化。基于内含肽的策略的另一个优势是肽α-硫酯通过肽-内含肽融合蛋白的硫解作用产生,潜在地避免了对加工酶的需要。
一方面,本发明提供用于生产肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
另一方面,本发明提供包含靶肽和内含肽的融合蛋白,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
另一方面,本发明提供内含肽,其大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
另一方面,本发明提供编码包含至少靶肽和内含肽的融合蛋白的DNA构建体,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
由于靶肽的低产量所致,采用基于内含肽的方法的肽α-硫酯的重组生产限于实验室规模,该方法涉及将靶肽作为内含肽的氨基端融合物的表达。
本发明的工程改造的内含肽在大小上被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上具有半胱氨酸突变,导致融合蛋白的表达水平提高和分离靶肽的产量较高,因此使本发明的方法适于生产规模。
附图简述
图1:编码在含有蛋白酶位点(SEQIDNO:8)的氨基端标签(SEQIDNO:4)和羧基端GyrA内含肽变体(SEQIDNO:17)之间融合的[Gly4]-hPYY4-36(SEQIDNO:10)的质粒1A的代表性pET11a载体图。整个融合蛋白用特征蛋白质1A标记。描绘了NdeI、NheI、NsiI、XhoI和BamHI限制性内切酶位点。载体图中还显示了T7启动子区、氨苄西林抗性基因、lacI阻抑物区和复制起点。
图2:制备羧基端修饰的靶肽的基本原理的代表性示意图。使靶肽与可通过亲核切割释放的羧基端内含肽融合,产生作为α-硫酯、α-酰胺或具有合成羧基端片段的靶肽。如本文所示,靶肽进一步与氨基端亲和标签融合,所述标签可以通过通过酶促切割除去。该纯化标签还可置于内含肽的羧基端,避免对加工酶的需要。
发明描述
肽作为治疗剂在包括代谢疾病(例如糖尿病和肥胖症)在内的广泛范围的疾病中越来越有益。包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素(例如PYY、PP、α-CGRP、CT和胰岛淀粉样多肽)的某些治疗性肽在羧基端需要α-酰胺部分以获得完整的生物活性。一个挑战是通过重组手段且特别是呈生产规模地生产所述肽。
本发明提供工程改造的内含肽,其在大小上被减到最小并在通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应的位置上携带半胱氨酸点突变。内含肽可用于肽的重组生产,其中肽作为包含靶肽和本发明的工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达(参见图2)。通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应的位置上的半胱氨酸突变与内含肽最小化的组合增加内含肽融合蛋白的表达产量及由此增加靶肽的产量。后者通过如下获得:融合蛋白的硫醇基诱导的切割产生靶肽的α-硫酯,其可通过加入铵亲核体(例如碳酸氢铵(ammoniabicarbonate))被转化为靶肽相应的α-酰胺。本发明的工程改造的内含肽因此提供产生α-酰胺化的肽激素(例如PYY、PP、胰岛淀粉样多肽和α-CGRP)的优化策略。由于较高的表达产量和分离靶肽的较高产量,本发明因此提供以生产规模重组生产α-酰胺化的肽的方法。
通过该方法产生的α-硫酯还可用于化学连接或生物缀合,且一方面,本发明提供用于重组生产羧基端生物缀合的蛋白质和肽的方法。
一方面,本发明涉及用于生产肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上具有半胱氨酸突变。
一方面,本发明提供包含靶肽和内含肽的融合蛋白,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。一方面,本发明提供内含肽,其大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。一方面,本发明提供编码包含靶肽和内含肽的融合蛋白的DNA构建体,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
内含肽是在单细胞生物表达的在氨基端和羧基端两端具有侧翼蛋白质序列的自身催化性蛋白质结构域。一方面,内含肽是GyrA内含肽。GyrA内含肽是一类被插入编码一些细菌的DNA促旋酶A亚基的基因序列内的内含肽,所述细菌通常为分支杆菌属(Mycobacterium)菌株。这类内含肽由共享高序列同源性且特征为在氨基端具有Cys和在羧基端具有His-Asn的16种不同的内含肽组成。而且,所有这些内含肽通过在氨基端-外显肽的羧基端中具有Tyr和羧基端-外显肽的氨基端中具有Thr来识别。一般而言,这些内含肽的大小约420个氨基酸且氨基端和羧基端剪接区被DOD归巢内切核酸酶结构域中断。然而,MxeGyrA内含肽缺乏DOD回归内切核酸酶结构域,并且与其它GyrA内含肽相比,在氨基和羧基剪接结构域之间具有较少量的残基,这导致整体大小为198个氨基酸。该内含肽的X射线晶体结构显示,与氨基酸残基107-164对应的这个区由两个α-螺旋以及非结构化区域组成,所述非结构化区域从内含肽特有的HINT剪接结构域中突出出来并且不是HINT剪接结构域的一部分。
一方面,内含肽是MxeGyrA内含肽,其广泛用于实验室规模以生产蛋白质α-硫酯用于化学连接目的。该内含肽具有几个有利的性质(例如从细菌包含体中重折叠的能力),在变性剂存在下保持活性和对氨基端-外显肽的羧基端残基的低序列要求。在SEQIDNO:1中显示了MxeGyrA内含肽的氨基酸序列。
一方面,内含肽是通过切除残基107-164的一部分或用序列GSGSGSGS的接头置换切除的残基使大小减至最小的MxeGyrA内含肽。
一方面,内含肽是通过切除残基107-160且用序列GSGSGSGS的接头置换切除的残基被使大小减至最小的MxeGyrA内含肽。
一方面,内含肽是具有SEQIDNO:20的序列的携带T3C突变的最小化的MxeGyrA内含肽。
一方面,靶肽是在其羧基端被α-酰胺化的肽激素。全部哺乳动物肽激素的大约50%在其羧基端被α-酰胺化,这种α-酰胺官能团对生物活性常常是决定性的。几个肽激素现今在代谢疾病例如糖尿病和/或肥胖症的治疗中用作药物。实例为胰岛淀粉样多肽(例如Symlin?,醋酸普兰林肽,一种人胰岛淀粉样多肽的类似物)。人胰岛淀粉样多肽是一种37个残基α-酰胺化的肽激素,其可用于治疗或预防糖尿病和/或肥胖症。因此,胰岛淀粉样多肽的羧基端需要被α-酰胺化以获得完整的生物活性。同样,PYY、PP、CT和α-CGRP应α-酰胺化以获得完整的生物活性。羧基端α-酰胺部分还可用来保护不受蛋白水解性降解。羧基端α-酰胺化和非酰胺化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的比较表明酰胺化不影响所观察到的对胰岛素和胰高血糖素分泌的总体生物作用。然而,对于非酰胺化变体,广泛的羧基端降解发生在血浆中。因此,对于一些肽和蛋白质,作为延长全长和生物活性蛋白质在血浆中的存在的手段引入羧基端酰胺化可能是有益的。本发明因此提供用于获得这样的肽或蛋白质的备选方法,所述肽或蛋白质是针对生物活性被羧基端α-酰胺化的或防止血浆中的羧肽酶降解的。
靶肽作为羧基端α-硫酯从融合蛋白中释放,这可通过亲核酰基取代反应与许多亲核体反应,本发明因此还提供用于生产范围更广的包含羧基端修饰的肽方法,所述羧基端修饰例如通过化学连接、与生物学或非生物学部分生物缀合的肽延长和酰胺化。
肽YY(PYY)和胰肽(PP)两者属于一类PP折叠家族的肽,神经肽Y(NPY)也属于该家族。它们全作为具有羧基端酰胺的36个氨基酸肽天然分泌。它们的特征在于共同的三维折叠,即PP折叠,其被视为对其生物功能是重要的稳定元件。SEQIDNO:2和SEQIDNO:14分别显示了人PYY(1-36)和人PP(1-36)的氨基酸序列。根据这些肽的某些在动物模型和人中显示厌食作用,PP折叠肽或其类似物被提议用于治疗肥胖症和相关疾病。
所谓PYY意指人肽激素及其物种变体。一方面,靶肽是PYY或其类似物。PYY在餐时从远端小肠和结肠的L细胞中释放。PYY作为PYY(1-36)释放,但被二肽基肽酶IV(DPPIV)切割成PYY(3-36),其构成循环PYY的约50%。已知PYY(3-36)在GI道中具有外周作用,还在中枢起饱满感信号的作用。术语“人PYY”和“hPYY”欲指SEQIDNO:2的hPYY(1-36)或备选SEQIDNO:11的hPYY(3-36),其在1和2位具有氨基端氨基酸缺失。一方面,术语PYY意指人PYY。一方面,靶肽是PYY(3-36)。一方面,靶肽是hPYY(3-36)。一方面,靶肽是PYY的类似物。一方面,靶肽是hPYY的类似物。一方面,靶肽是[Gly4]-PYY(4-36)。一方面,靶肽是SEQIDNO:10的[Gly4]-hPYY(4-36)。一方面,靶肽是[Arg4,Gln18,Lys30]-PYY(3-36)。一方面,靶肽是SEQIDNO:15的[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)。
一方面,靶肽是PP或其类似物。胰腺多肽(PP)PP是一种从胰岛内分泌细胞中分泌的激素,且释放受食物摄取刺激。已知PP减少食物摄取,并潜在地增加能量消耗。所谓PP是指人肽激素及其物种变体。一方面,靶肽是PP。一方面,靶肽是hPP。一方面,靶肽是SEQIDNO:14的hPP(1-36)。
降钙素基因相关肽(CGRP)在几个物种中是以两种形式存在的肽,所述形式命名为α-CGRP和β-CGRP(或分别为CGRP-I和CGRP-II)。CGRP肽在物种内是高度保守的。CGRP从例如感觉神经、运动神经和肠神经中释放。CGRP引发多种药理作用,例如:1)血管扩张,2)肌肉和肝AMP激酶(AMPK)活化和脂解和/或脂肪氧化,3)减少食物摄取,4)抑制胃排空和改变肠功能,和5)增加糖酵解并抑制糖原合成。而AMPK活化、脂肪氧化和食物摄取减少在代谢疾病中可能是有益的,已表明糖酵解和糖原合成的抑制介导胰岛素抵抗。
所谓α-CGRP是指人肽激素及其物种变体。一方面,靶肽是α-CGRP或其类似物。一方面,靶肽是α-CGRP。一方面,靶肽是SEQIDNO:12的hα-CGRP。
降钙素(CT)在临床上用于治疗钙代谢障碍和疼痛,哺乳动物中其与葡萄糖水平升高的关系已经是各种报告的主题。还描述了降钙素在糖尿病治疗中的用途。
降钙素是一种通过哺乳动物中的甲状腺滤泡旁细胞和通过鸟和鱼后鳃腺产生的小肽。已分离出许多类型的降钙素,例如人降钙素、鲑鱼降钙素、鳗鱼降钙素、麋降钙素(elkatonin)、猪降钙素和鸡降钙素。各种降钙素类型中有明显的结构非同源性。例如,构成人降钙素的氨基酸和构成鲑鱼降钙素的氨基酸之间仅有50%同一性。人降钙素(hCT)是一种含有32个氨基酸残基的肽激素,主要由甲状腺的滤泡旁(亦称C)细胞产生。鲑鱼降钙素也是32聚体多肽。
所谓“降钙素”或“CT”意指人肽激素及其物种变体,包括人降钙素(hCT)或鲑鱼降钙素(sCT)。一方面,靶肽是CT或其类似物。一方面,靶肽是CT。一方面,靶肽是人CT。一方面,靶肽是SEQIDNO:13的hCT。
一方面,靶肽是胰岛淀粉样多肽或其类似物。人胰岛淀粉样多肽(hAmylin)是37个氨基酸长的SEQIDNO:3的多肽,其与两个不同的受体复合物结合。这两个复合物含有降钙素受体加受体活性修饰性蛋白质,RAMP1或RAMP3。从降钙素受体和胰岛淀粉样多肽受体的紧密关系来看,可预期胰岛淀粉样多肽受体激动剂与降钙素受体的某种交叉反应性。降钙素受体存在于整个机体的许多组织中,且被认为参与调节骨代谢。对降钙素受体有活性的多肽可用于治疗血钙过多、骨质疏松、佩吉特病、肥胖症或肥胖症相关疾病以及用于预防肥胖症相关疾病。
所谓胰岛淀粉样多肽意指人肽激素及其物种变体。一方面,靶肽是胰岛淀粉样多肽。一方面,靶肽是[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-胰岛淀粉样多肽。一方面,靶肽是SEQIDNO:16的[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽。
一方面,内含肽序列位于靶肽的羧基端。
本文所用术语“多肽”和“肽”意指由通过肽键连接的至少5个组分氨基酸组成的化合物。未规定旋光异构体的所有氨基酸要理解为意指L-异构体。然而,本发明范围内还考虑的是一个或多个氨基酸的D-氨基酸残基。
本发明的肽的组分氨基酸可来自由遗传密码编码的氨基酸,它们可以是不是遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸为例如γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体,例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
22种蛋白生成的氨基酸是:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
因此,非蛋白生成的氨基酸是可以通过肽键掺入肽中但不是蛋白生成的氨基酸的部分。实例为γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸,例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺,合成非蛋白生成的氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸,即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体,例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱-氨基-组氨酸、氨基酸的β类似物(例如β-丙氨酸等)、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸。
用于本发明的非天然氨基酸包括但不限于-硫基酪氨酸、鸟氨酸、3-巯基苯丙氨酸、3-或4-氨基苯丙氨酸、3-或4-乙酰基苯丙氨酸、2-或3-羟基苯丙氨酸(邻-或间-酪氨酸)、羟基甲基甘氨酸、氨基乙基甘氨酸、1-甲基-1-巯基乙基甘氨酸、氨基乙基硫基乙基甘氨酸和巯基乙基甘氨酸。可用于本发明的许多非天然氨基酸是市购可获得的。其它可通过本领域已知方法制备。
本文提及肽使用的术语“类似物”意指其中肽的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代和/或其中至少一个氨基酸残基从肽中缺失和/或其中至少一个氨基酸残基添加至肽中和/或其中肽的至少一个氨基酸残基被修饰。氨基酸残基的这类添加、取代或缺失可发生在肽的氨基端和/或羧基端和/或发生在多肽序列内。
术语“取代”意指天然序列中的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换。
术语“缺失”意指从天然序列中脱去一个或多个氨基酸。
术语“插入”意指将一个或多个氨基酸添加到天然序列中。
术语“修饰”意指与天然肽序列中的一个或多个氨基酸的侧链或一个或多个氨基酸的α氮原子共价连接的变化。
采用简单的命名法描述本发明的肽,例如[Gly4]-hPYY(4-36)指示人PYY(hPYY)ID:SEQIDNO:2的类似物,其中4位的天然存在的赖氨酸被甘氨酸取代,1、2和3位的天然存在的酪氨酸、脯氨酸和异亮氨酸分别缺失。一方面,靶肽可来源于脊椎动物,例如哺乳动物,包括人、小鼠、绵羊、山羊、牛或马。术语“脊椎动物”意指脊椎动物亚门(脊索动物门的一个主要部(division))的成员,其包括鱼、两栖动物、爬行动物、禽和哺乳动物,其所有的特征在于分段的脊柱和明显的充分分化的头。术语“哺乳动物”意指人以及具有哺乳动物纲中内环境稳定的动物界的其它所有温血成员,例如陪伴哺乳动物、动物园哺乳动物和食物来源的哺乳动物。陪伴哺乳动物的一些实例为犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)和马;食物来源的哺乳动物的一些实例为猪、牛、绵羊等。一方面,哺乳动物是人或陪伴哺乳动物。一方面,哺乳动物是人、雄性或雌性。
在系统的进一步改进中,融合蛋白还包含标签,其允许通过亲和色谱法或其它色谱方法鉴定和/或纯化融合蛋白以及由此鉴定和/或纯化肽。合适标签的实例包括特定的壳多糖结合结构域或其部分、酸性或碱性氨基酸的重复、谷胱甘肽转移酶标签、用抗体回收的标签例如FLAG标签、HA标签、MYC标签、生物素或链霉抗生物素和含有至少5个组氨酸的小的多肽序列、用于固定化金属亲和色谱法的His-标签。纯化标签也可包括以编号WO2006/108826和WO2008/043847公开的国际专利申请中描述的来源于嗜热细菌的高度碱性的核糖体蛋白质。例如,融合蛋白可包括His-标签,其与可用于完整融合蛋白的亲和纯化的固定化金属离子亲和色谱法柱紧密结合。
一方面,融合蛋白还包含允许通过亲和色谱法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。一方面,纯化标签是碱性的。一方面,纯化标签包含组氨酸标签。一方面,纯化标签和任选蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
可商业规模操作的任何表达系统都是合适的,但设计了上述基于内含肽的载体用于大肠杆菌(E.coli)。可设计最适用于特定表达系统中的其它载体。例如,如果选择哺乳动物表达系统,则蛋白质编码区应具有用于该特定系统的优化的密码子使用。可用于表达肽融合蛋白的表达系统的实例包括细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等)、酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoralis)等)、昆虫细胞(草地贪夜蛾(S.frugiperda))、哺乳动物表达系统(中国仓鼠卵巢、幼仓鼠肾等)、乳或其它体液中的转基因哺乳动物表达(优选猪、牛、绵羊、山羊、兔等)。在大肠杆菌表达系统的情况下,起始密码子甲硫氨酸可保留在表达产物中。一个实例为具有氨基端异亮氨酸的PYY(3-36),预期在大肠杆菌中表达后其不会导致起始密码子甲硫氨酸被甲硫氨酸氨基肽酶有效去除。然而,靶肽的天然氨基端可通过使具有含有蛋白酶位点的间插接头的标记(例如纯化标签)与氨基端融合来获得。通过使用合适的蛋白酶(例如alp、肠激酶或人鼻病毒-143C(HRV14-3C))或肽酶(例如二肽基氨基肽酶1(DAP1))随后除去纯化标签会产生靶肽的天然氨基端。或者,可通过与溴化氰接触,用化学法除去起始密码子甲硫氨酸。
一方面,融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。一方面,融合蛋白在细菌或酵母中表达。一方面,融合蛋白在细菌中表达。一方面,融合蛋白在大肠杆菌中表达。
与肽键或氧-酯相比,硫酯是相对易起反应的化学基团,因此在温和反应条件下易转化成酰胺。优选的试剂是MESNa,但是许多其它含有巯基(硫氢基、硫醇基)的试剂也可有效地起作用。释放的MESα-硫酯对因水引起的水解(其会不可逆地产生不需要的游离酸)是相对稳定的,并适于以会促进酰胺形成的任何化学条件反应。
一方面,所述方法包括硫醇基诱导切割融合蛋白,产生靶肽的α-硫酯。一方面,所述方法另外包括α-硫酯转化成靶肽相应的α-酰胺。一方面,酰胺化步骤在铵亲核体存在下发生。一方面,铵亲核体作为碳酸氢铵水溶液提供。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:10的[Gly4]-hPYY(4-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:10的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:4的纯化标签和SEQIDNO:8的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:11的hPYY(3-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:11的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:12的hα-CGRP的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:12的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:14的hPP的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:14的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:15的[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:15的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:6的纯化标签,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签位于靶肽的氨基端。
一方面,本发明提供用于生产SEQIDNO:16的[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:16的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:7的纯化标签,其中所述内含肽序列位于靶肽的氨基端,所述纯化标签位于靶肽的羧基端。
可通过适当选择前导序列、密码子使用、内含肽或其突变体和纯化策略,针对这些系统的任一个并针对胞内或胞外生产优化表达。技术人员应了解,本发明不限于任何特定的靶肽或作为来源的任何物种。
本发明的实施方案
本发明的非限制性实施方案为:
1.一种用于生产肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
2.实施方案1的方法,其中所述内含肽是GyrA内含肽。
3.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽是MxeGyrA内含肽。
4.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小的MxeGyrA内含肽。
5.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被包含1-10个氨基酸的接头置换的MxeGyrA内含肽。
6.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被包含6-10个氨基酸的接头置换的MxeGyrA内含肽,其中至少6个接头的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。
7.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置换的MxeGyrA内含肽。
8.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
9.前述实施方案中任一个的方法,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端。
10.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是参与糖尿病或肥胖症控制的肽激素。
11.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是参与糖尿病控制的肽激素。
12.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是参与肥胖症控制的肽激素。
13.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是α-酰胺化肽。
14.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽的内源形式是α-酰胺化肽。
15.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是羧基端生物缀合的肽。
16.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽选自PYY、PP、α-CGRP、CT和胰岛淀粉样多肽或其类似物。
17.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽选自PYY、PP、α-CGRP和胰岛淀粉样多肽或其类似物。
18.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是PYY或其类似物。
19.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是hPYY或其类似物。
20.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Gly4]-PYY(4-36)。
21.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Gly4]-hPYY(4-36)。
22.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是PYY(3-36)。
23.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是hPYY(3-36)。
24.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Arg4,Gln18,Lys30]-PYY(3-36)。
25.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)。
26.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是α-CGRP或其类似物。
27.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是α-CGRP。
28.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是hα-CGRP。
29.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是CT或其类似物。
30.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是CT。
31.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是hCT。
32.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是PP或其类似物。
33.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是PP。
34.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是hPP。
35.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是胰岛淀粉样多肽或其类似物。
36.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是人胰岛淀粉样多肽或其类似物。
37.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-胰岛淀粉样多肽。
38.前述实施方案中任一个的方法,其中所述靶肽是[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽。
39.前述实施方案中任一个的方法,其中所述融合蛋白另外包含允许通过亲和色谱方法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。
40.实施方案39的方法,其中所述纯化标签是碱性的。
41.实施方案39的方法,其中所述纯化标签包括组氨酸标签。
42.实施方案39-41中任一个的方法,其中所述纯化标签和任选蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
43.实施方案39-42中任一个的方法,其中所述纯化标签可用合适的蛋白酶切割除去以得到所述靶肽。
44.前述实施方案中任一个的方法,其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
45.前述实施方案中任一个的方法,其中所述融合蛋白在细菌或酵母中表达。
46.前述实施方案中任一个的方法,其中所述融合蛋白在细菌中表达。
47.前述实施方案中任一个的方法,其中所述融合蛋白在大肠杆菌中表达。
48.前述实施方案中任一个的方法,所述方法还包括硫醇基诱导切割融合蛋白,产生靶肽的α-硫酯。
49.实施方案48的方法,所述方法还包括α-硫酯转化为靶肽相应的α-酰胺。
50.实施方案49的方法,其中所述酰胺化步骤在铵亲核体存在下发生。
51.实施方案50的方法,其中所述铵亲核体是碳酸氢铵。
52.一种用于生产α-酰胺化肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和SEQIDNO:20的内含肽。
53.实施方案52的方法,其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端。
54.实施方案52-53中任一个的方法,其中所述融合蛋白还包含允许通过亲和色谱方法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。
55.实施方案54的方法,其中所述纯化标签包括组氨酸标签。
56.实施方案55的方法,其中所述纯化标签包括碱性标签。
57.实施方案54-56中任一个的方法,其中所述纯化标签和任选蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
58.实施方案54-57中任一个的方法,其中所述纯化标签可用合适的蛋白酶切割除去以得到所述靶肽。
59.实施方案52-58中任一个的方法,其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
60.实施方案59的方法,其中所述融合蛋白在细菌或酵母中表达。
61.实施方案59的方法,其中所述融合蛋白在细菌中表达。
62.实施方案59的方法,其中所述融合蛋白在大肠杆菌中表达。
63.一种用于生产[Gly4]-hPYY(4-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:10的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:4的纯化标签和SEQIDNO:8的蛋白酶位点,且其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
64.一种用于生产hPYY(3-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:11的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
65.一种用于生产hα-CGRP的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:12的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
66.一种用于生产hPP的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:14的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
67.一种用于生产[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:15的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:6的纯化标签,且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
68.一种用于产[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽生的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:16的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:7的纯化标签,且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
69.一种包含靶肽和内含肽的融合蛋白,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
70.实施方案69的融合蛋白,其中所述内含肽是GyrA内含肽。
71.实施方案70的融合蛋白,其中所述内含肽是MxeGyrA内含肽。
72.实施方案71的融合蛋白,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置换的MxeGyrA内含肽。
73.实施方案72的融合蛋白,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-160大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置换的MxeGyrA内含肽。
74.实施方案73的融合蛋白,其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
75.实施方案69-74中任一个的融合蛋白,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端。
76.实施方案69-75中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽是参与糖尿病或肥胖症控制的肽激素。
77.实施方案69-76中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽是参与糖尿病控制的肽激素。
78.实施方案69-76中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽是参与肥胖症控制的肽激素。
79.实施方案69-78中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽是α-酰胺化肽。
80.实施方案69-78中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽的内源形式是α-酰胺化肽。
81.实施方案69-78中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽是羧基端生物缀合的肽。
82.实施方案69-78中任一个的融合蛋白,其中所述靶肽选自PYY、PP、α-CGRP和胰岛淀粉样多肽或其类似物。
83.实施方案82的融合蛋白,其中所述靶肽是PYY或其类似物。
84.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是hPYY或其类似物。
85.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是[Gly4]-PYY(4-36)。
86.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是[Gly4]-hPYY(4-36)。
87.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是PYY(3-36)。
88.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是hPYY(3-36)。
89.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是[Arg4,Gln18,Lys30]-PYY(3-36)。
90.实施方案83的融合蛋白,其中所述靶肽是[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)。
91.实施方案82的融合蛋白,其中所述靶肽是α-CGRP或其类似物。
92.实施方案91的融合蛋白,其中所述靶肽是α-CGRP。
93.实施方案91的融合蛋白,其中所述靶肽是hα-CGRP。
94.实施方案82的融合蛋白,其中所述靶肽是CT或其类似物。
95.实施方案94的融合蛋白,其中所述靶肽是CT。
96.实施方案94的融合蛋白,其中所述靶肽是hCT。
97.实施方案82的融合蛋白,其中所述靶肽是PP或其类似物。
98.实施方案97的融合蛋白,其中所述靶肽是PP。
99.实施方案97的融合蛋白,其中所述靶肽是hPP。
100.实施方案82的融合蛋白,其中所述靶肽是胰岛淀粉样多肽或其类似物。
101.实施方案100的融合蛋白,其中所述靶肽是[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-胰岛淀粉样多肽。
102.实施方案100的融合蛋白,其中所述靶肽是[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽。
103.实施方案69-102中任一个的融合蛋白,其还包含允许通过亲和色谱方法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。
104.实施方案103的融合蛋白,其中所述纯化标签是碱性的。
105.实施方案104的融合蛋白,其中所述纯化标签包括组氨酸标签。
106.实施方案103-105中任一个的融合蛋白,其中所述纯化标签和任选蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
107.实施方案103-106中任一个的融合蛋白,其中所述纯化标签可用合适的蛋白酶切割除去以得到所述靶肽。
108.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:10的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:4的纯化标签和SEQIDNO:8的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
109.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:11的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
110.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:12的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
111.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:14的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽、SEQIDNO:5的纯化标签和SEQIDNO:9的蛋白酶位点,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
112.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:15的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:6的纯化标签,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
113.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:16的靶肽、SEQIDNO:20的内含肽和SEQIDNO:7的纯化标签,其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基端,所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
114.一种内含肽,其大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
115.实施方案114的内含肽,其中所述内含肽是GyrA内含肽。
116.实施方案115的内含肽,其中所述内含肽是MxeGyrA内含肽。
117.实施方案116的内含肽,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置换的MxeGyrA内含肽。
118.实施方案117的内含肽,其中所述内含肽是通过切除MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-160大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置换的MxeGyrA内含肽。
119.实施方案118的内含肽,其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
120.一种SEQIDNO:20的内含肽。
121.一种DNA构建体,其编码实施方案69-113中任一个限定的融合蛋白。
122.实施方案121的DNA构建体,其呈载体的形式。
实施例
本发明的实施例基于PYY(hPYY)、PP(hPP)、胰岛淀粉样多肽(人胰岛淀粉样多肽)、CT(hCT)和α-CGRP(hα-CGRP)的人变体。称为天然内含肽的MxeGyrA内含肽变体(SEQIDNO:17)携带N198A突变,这使其天然自我剪接功能丧失,并致使它易受分子间硫醇基诱导的切割。设计了包含共35个载体的7组质粒(表1)。
表1.具有如实施例中提及时的各自编号的融合蛋白列表。
蛋白质编号 | 质粒编号 | N端标签 | 蛋白酶位点 | 靶肽 | 内含肽 |
1A | p1A | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 17 |
1B | p1B | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 19 |
1C | p1C | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 20 |
1D | p1D | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 18 |
1E | p1E | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 21 |
1F | p1F | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 22 |
1G | p1G | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 23 |
1H | p1H | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 24 |
1I | p1I | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 25 |
1J | p1J | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 26 |
1K | p1K | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 27 |
1L | p1L | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 28 |
1M | p1M | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 29 |
1N | p1N | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 30 |
1O | p1O | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 31 |
1P | p1P | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 32 |
1Q | p1Q | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 33 |
2A | p2A | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 17 |
2B | p2B | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 19 |
2C | p2C | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 20 |
3A | p3A | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 17 |
3B | p3B | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 19 |
3C | p3C | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 20 |
4A | p4A | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 17 |
4B | p4B | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 19 |
4C | p4C | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 20 |
5A | p5A | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 17 |
5B | p5B | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 19 |
5C | p5C | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 20 |
6A | p6A | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 17 | |
6B | p6B | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 19 | |
6C | p6C | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 20 | |
7A | p7A | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 17 | |
7B | p7B | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 19 | |
7C | p7C | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 20 |
材料与方法
缩略语列表
Amp 氨苄西林
E.coli 大肠杆菌
GyrA 来自蟾分枝杆菌的DNA促旋酶A内含肽
hα-CGRP 人α-降钙素基因相关肽
hAmylin 人胰岛淀粉样多肽
hCT 人降钙素
HPLC 高效液相色谱法
hPP 人胰肽
hPYY 人肽YY
IB 包含体
IPTG 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷
LB 肉汤(Luria-Bertani)
LC-MS 液相色谱-质谱法
MESNa 2-巯基乙磺酸钠
OD600 600nm处的光密度
RP-UPLC 反相超高效液相色谱法
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
TAP 耐热碱性蛋白
TFA 三氟乙酸
T.Maritima 海栖热袍菌(ThermotogaMartima)。
制备融合蛋白的通用方法
构建体的克隆:
通过生产商描述或由Geneart提供的方法,使用XhoI/BamHI、NheI/BamHI或NheI/NsiI限制性内切酶位点和T4DNA连接酶(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA),将获自Geneart(Regensburg,Germany)的合成基因片段克隆到作为亚克隆载体的pET11a载体(Novagen)中,产生质粒。在任一种情况下,编码融合蛋白的基因针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。图1举例说明了质粒的载体图。
使用质粒转化感受态TOP10(Invitrogen)大肠杆菌细胞,并在含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基琼脂平板上孵育过夜。从阳性克隆中获得编码各个目标蛋白质的质粒,接着让所述质粒在液体LB/Amp(100μg/ml氨苄西林)培养基中增殖和标准小量制备。使用T7启动子/终止子序列特异性引物,通过DNA测序证实核苷酸序列的正确性(由EurofinsMWGOperon,Ebersberg,Germany进行)。
摇瓶中融合蛋白的表达:
将质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,将菌株置于LB/Amp板上,在37℃下孵育过夜。使用摇瓶使含有合适质粒的BL21(DE3)细胞在37℃下在LB/Amp培养基中生长至OD600为0.4-0.6。细胞用0.5mMIPTG在37℃下诱导3小时。在诱导后,细胞通过离心收获(4000×g,4℃,15分钟,HeraeusMultifuge3S-R,DJBLabcareLtd.,NewportPagnell,England)。在25mM磷酸钠pH5缓冲液中,将收获的细胞通过超声裂解(40%功率,以15秒钟开和关的脉冲在冰上进行20分钟,BandelinSonopuls,BuchogHolm)。将不溶性蛋白质离心下来(4000×g,4℃,15分钟),倾析细胞裂解物。
SDS-PAGE分析:
在样品缓冲液(BioRadXT样品缓冲液+4mMTCEP)中进行裂解物样品的考马斯染色的SDS-PAGE分析,所述裂解物样品包括诱导和未诱导细胞,以及诱导细胞的溶解和不溶解流分(所述裂解物样品通过在含有25mM磷酸钠pH5缓冲液的缓冲液中超声和离心获得)。应用ImageJ,通过SDS-PAGE凝胶的光密度分析,估算融合蛋白和内含肽的条带强度。
检测和表征的通用方法
UPLC方法A:融合蛋白的量化
采用AcquityUPLCSystem(Waters)和参比标准物1(纯化的融合蛋白1B,0.169mg/ml),通过RP-UPLC定量融合蛋白的蛋白质浓度。采用AcquityUPLCBEH300C4(1.7um,2.1x100mm,1.7μm)(Waters)柱,使用0.1%TFA/水(洗脱液A)和0.08%TFA/乙腈(洗脱液B)的梯度洗脱以0.4ml/分钟和40℃的柱温用214nm检测如下进行样品分析:
时间(分钟) | %洗脱液B |
0 | 20 |
5 | 20 |
20 | 60 |
20.5 | 99 |
23 | 99 |
23.1 | 20 |
26 | 20 |
样品组以单次注射Std1开始以控制系统,以双注射Std1结束用于样品校准。
UPLC方法B:分析硫醇基诱导的切割
采用AcquityUPLCSystem(Waters)和与BEHC18(2.1x5mm1.7μm,Waters)vanguardTM前置柱(precolumn)连接的AcquityUPLCBEHC18,(2.1x150mm柱,1.7μm,Waters)柱,通过RP-UPLC分析自融合蛋白的切割反应收集的等量样品。如下采用使用0.1%TFA/水(洗脱液A)和0.08%TFA/乙腈(洗脱液B)以0.4ml/分钟和50℃的柱温用214nm检测的两步梯度洗脱:
时间(分钟) | %洗脱液B |
0 | 28 |
2 | 28 |
12 | 33 |
23 | 53 |
23.1 | 99 |
24.9 | 99 |
25 | 28 |
27 | 28 |
UPLC方法C:肽α-硫酯的量化
采用AcquityUPLCSystem(Waters)和参比标准物2(融合蛋白1A的纯化的肽α-硫酯,0.144mg/ml),通过RP-UPLC定量α-硫酯的浓度。应用与BEHC18(2.1x5mm1.7μm,Waters)vanguardTM前置柱连接的AcquityUPLCBEHC18,(2.1x150mm柱,1.7μm,Waters)柱。如下使用0.1%TFA/水(洗脱液A)和0.08%TFA/乙腈(洗脱液B)以0.4ml/分钟和50℃的柱温用214nm检测的线性梯度洗脱:
时间(分钟) | %洗脱液B |
0 | 28 |
2 | 28 |
12 | 33 |
12.1 | 90 |
13.5 | 28 |
15.0 | 28 |
样品组以双重注射Std2结束用于样品校准。
LC-MS分析A:融合蛋白和内含肽的表征
采用LC-MSD-TOF(AgilentTechnologies)仪器,使用Zorbax300SB-C18快速分辨(2.1x50mm,3.5μm,AgilentTechnologies)柱和40℃的柱温,通过LC-MS分析进行融合蛋白和切割混合物的表征。MS电离方式设置为阳离子。扫描100-3000amu。如下使用8.8mM甲酸铵/0.1%甲酸/水(洗脱液A)和0.1%甲酸/乙腈(洗脱液B)的线性梯度以0.3ml/分钟的流速和在214nm处的检测:
LC-MS分析B:酶促切割的分析
采用LC-MSD-TOF(AgilentTechnologies)仪器和柱温为40℃的Zorbax300SB-C18快速分辨(2.1x50mm,3.5μm,AgilentTechnologies)柱,通过LC-MS分析,对用蛋白水解酶除去纯化标签的酶消化物进行分析。MS电离方式设置为阳离子。扫描100-3000amu。如下使用8.8mM甲酸铵/0.1%甲酸/水(洗脱液A)和0.1%甲酸/乙腈(洗脱液B)的线性梯度以0.3ml/分钟的流速和在214nm处的检测:
时间(分钟) | %洗脱液B |
0 | 5 |
3 | 5 |
18 | 70 |
18.1 | 90 |
22 | 90 |
22.1 | 5 |
25 | 5 |
实施例1.测量的工程改造的内含肽的活性
目标是产生大小被减到最小并携带T3C突变的功能性MxeGyrA内含肽。为此,产生了各自携带不同的MxeGyrA内含肽变体的一组17种融合蛋白,其硫醇基诱导的切割反应的速率常数被用作内含肽活性的度量。
所有17种融合蛋白(蛋白质1A-1Q,表1)均包含通过蛋白酶位点在氨基端延伸之间融合的靶肽[Gly4]-hPYY(4-36)(SEQIDNO:10)和羧基端MxeGyrA内含肽变体。氨基端延伸是允许通过阳离子交换色谱法纯化的来自海栖热袍菌的核糖体蛋白质L27的变体(RL27tm,SEQIDNO:4)。蛋白酶位点(SEQIDNO:8)含有被HRV14-3C蛋白酶识别并允许除去氨基端延伸的EVLFQ序列。蛋白质1A含有天然MxeGyrA内含肽变体,蛋白质1D含有[Cys3]-MxeGyrA内含肽变体,蛋白质1B和1E-1S含有最小化MxeGyrA内含肽变体,蛋白质1C含有具有T3C突变的最小化MxeGyrA内含肽变体。最小化的内含肽在氨基端和羧基端剪接区之间的46-57个氨基酸被除去或被小的接头取代(表2)。更具体地说,被除去的区域包含MxeGyrA内含肽的残基103-164的一部分,其按照晶体结构(KlabundeT.(1998)NatureStructuralBiology,5,31-36)位于羧基端剪接区的β链(strand)9和10之间。经检查的接头包括连接MxeGyrA内含肽的N端剪接结构域β链4和5的LDRHGN序列、来自接头数据库的α-螺旋ADNLALA接头序列(GeorgeRA.和HeringaJ.(2002)ProteinEngineering,15,871-879)、连接黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的hedgehog蛋白质的β链9和10的RDVETGE接头(如Hiraga,K.等(2005)J.Mol.Biol.354,916-926所述)和柔性GSGSGSGS接头。
表2.具有各自的缺失大小、接头和突变的内含肽变体的列表。
融合蛋白的硫醇基诱导的切割:
如通用方法中所述,使融合蛋白1A至1Q在含有200mLLB培养基的摇瓶中表达。不溶性蛋白质用MQ洗涤两次,分成较小的部分并储存在-20℃下。将不溶性蛋白质沉淀在增溶缓冲液[100mM磷酸钠,pH7.5,5M脲]中重新悬浮,在冰上孵育1小时后过滤(0.45μm)。蛋白质浓度通过RP-UPLC方法A测定,接着用增溶缓冲液稀释成0.6mg/ml的终浓度。通过在485μL含水稀缓冲液A[100mM磷酸钠,pH7.5,250mMNaCl]和190μL缓冲液B[100mM磷酸钠pH7.5,2M脲,150mMNaCl]的混合物中稀释,产生在100mM磷酸钠pH7.5,2M脲,150mMNaCl中0.2mg/ml蛋白质的终浓度,使等分的蛋白质溶液(325μL)重新折叠。通过用缓冲液B中的2M原液将MESNa加至100mM而诱导切割。让反应在5℃下在Eppendorf管中伴随着搅拌(300rpm)过夜进行。随时间推移收集等量样品,用1体积的含1.7%HCl的6M盐酸胍猝灭至约pH3,并通过RP-UPLC方法B分析,通过LC-MS方法A表征。进行一式三份的测定,产物形成计算为面积α-硫酯产物/(面积α-硫酯产物+面积蛋白质),其中α-硫酯产物为氨基端带标签的[Gly4]-PYY(4-36)α-硫酯,蛋白质为融合蛋白。将产物形成作图为时间函数。使用极大摩尔过量的MESNa达到准一级反应,速率常数(k obs)通过将数据拟合至方程式P=P 0 (1-e-kt)来测定,其中P是在时间t时形成的肽α-硫酯产物的百分比,P 0是所获得的肽α-硫酯产物的最大百分比,k是使用GraphPadPrism5.01(GraphPadSoftwareInc.,LaJolla,CA)的观察速率。
1.1.测量的功能性最小化的内含肽的活性:
最初,MxeGyrA内含肽就其大小而言被优化。截短的内含肽变体在MxeGyrA内含肽序列的Ala103和Ala164之间除去最少46个残基(相当于整个内含肽大小的23%)。与蛋白质1A相比,蛋白质1E中除去内含肽的残基112-157(46个氨基酸)(SEQIDNO:21)略微降低剪接活性,而蛋白质1F中除去内含肽的残基107-160(54个氨基酸)(SEQIDNO:22)导致无活性的内含肽(表3)。蛋白质1E和1F的差异是蛋白质1E的内含肽具有一些非结构化的氨基酸保留在β链9和10之间,而β链9和10之间的整个非结构化区域在蛋白质1F中被除去。蛋白质1F的内含肽残基Gln106和Phe161之间引入柔性GSGSGSGS接头,导致蛋白质1B含有具有SEQIDNO:19的工程改造的内含肽序列,导致重新获得与蛋白质1A的天然内含肽相当的水平的活性(表3)。为了检查蛋白质1B中的内含肽是否可被甚至进一步最小化,系统地除去在GSGSGSGS接头任一端的残基,产生6种融合蛋白1N-1S。在蛋白质1L、1M和1N中,分别从内含肽的GSGSGSGS接头的氨基端除去1、2和3个氨基酸(SEQIDNO:28-30),这引起内含肽活性显著降低,其中蛋白质1N未观察到切割(表3)。相比之下,与蛋白质1B相比,分别在蛋白质1O、1P和1Q(其中从内含肽的GSGSGSGS接头的羧基端除去1-3个氨基酸)中观察到内含肽(SEQIDNO:31-33)活性适度的1.1、1.2和1.7倍下降。
为了评价接头区的结构完整性和电荷的差异的作用,将多个其它接头插入缺失位点之间。在蛋白质1G和1H中,将LDRHGN接头分别插入内含肽的Asp158和Ser111(SEQIDNO:23)或Gln106和Phe161(SEQIDNO:24)之间。与其中不存在接头的蛋白质1E和1F的相应内含肽相比,蛋白质1G和1H的LDRHGN接头不改变内含肽活性(表3)。当hedgehogRDVETGE接头(SEQIDNO:25中)、α-螺旋ADNLALA接头(SEQIDNO:26中)或碱性GRGSGRGS接头(SEQIDNO:27中)代替蛋白质1B的GSGSGSGS接头被引入时,分别产生蛋白质1I、1J和1K,内含肽活性降低达适度的1.8、4.8和1.5倍(表3)。
最大活性的最小化的内含肽是蛋白质1B中的一种,其中残基107-160被GSGSGSGS接头取代(SEQIDNO:19)。
1.2.将T3C突变引入最小化的内含肽中:
接下来,将T3C突变引入蛋白质1B的最小化的内含肽中,产生蛋白质1C,其含有[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)。蛋白质1D中全长T3C内含肽变体、[Cys3]-MxeGyrA(SEQIDNO:18)被用作对照。与蛋白质1A的天然内含肽相比,蛋白质1D和1C的T3C突变分别导致内含肽活性降低(表3)。与蛋白质1D中的全长内含肽相比,蛋白质1C中最小化的内含肽活性的降低更显著。
鉴定出了大小被减小约25%的几个有活性的MxeGyrA内含肽变体。这些最小化的内含肽在Gln106和Phe161之间的46-57个氨基酸被除去或用接头取代。有最大活性的最小化的内含肽是具有引入的柔性GSGSGSGS接头而不是残基107-160的[106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:19)。具有T3C突变的相应内含肽[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)也是有活性的,但是产生较慢的硫醇基诱导的切割。
表3.融合蛋白及其相应的内含肽变体的分子量列表。还列举了硫醇基诱导的切割的反应速率。
实施例2.使用工程改造的内含肽的蛋白质表达水平
目标是测定工程改造的内含肽[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)如何影响含有所需靶肽的融合蛋白的表达水平。
对于每个靶肽,[Gly4]-hPYY(4-36)(SEQIDNO:10)、hPYY(3-36)(SEQIDNO:11)、hα-CGRP(SEQIDNO:12)、hCT(SEQIDNO:13)、hPP(SEQIDNO:14)、[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)(SEQIDNO:15)和[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽(SEQIDNO:16),构建了3种不同的融合蛋白。所有融合蛋白都包含氨基端延伸、靶肽和MxeGyrA内含肽变体。每一个靶肽的A、B和C融合蛋白分别含有天然MxeGyrA(SEQIDNO:17)、[106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:19)和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)内含肽。
融合蛋白的表达:
使用TPP细胞悬浮管,使含有合适质粒的BL21(DE3)细胞在LB培养基(100μg/mL氨苄西林)中在37℃下生长至约0.4的OD600。使细胞培养物冷却至18℃维持20-30分钟,通过在0.4-0.6的OD600时加入0.5mMIPTG,诱导融合蛋白的表达。使蛋白质表达在18℃下过夜。通过离心以1mL等量收获细胞。如通用方法所述进行SDS-PAGE分析。从诱导的裂解物样品的条带强度估算水解和表达水平百分比(表4)。具体地说,水解计算为面积内含肽/(面积蛋白质+面积内含肽),相对表达水平表示各组中融合蛋白A和B的面积相对于融合蛋白C的面积。根据可溶性和不溶性部分估算溶解度百分比,并计算为面积可溶性蛋白质/(面积可溶性蛋白质+面积不溶性蛋白质),其中面积可溶性蛋白质和面积不溶性蛋白质分别表示可溶性和不溶性样品中内含肽和融合蛋白的总面积。
2.1.PYY-内含肽融合蛋白的表达
包含蛋白质1A、1B和1C的蛋白质1家族包括在氨基端延伸(通过HRV14-3C蛋白酶位点(SEQIDNO:8)含有碱性标签(SEQIDNO:4))和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的[Gly4]-hPYY(4-36),所述MxeGyrA内含肽变体分别为天然MxeGyrA(SEQIDNO:17)、[106(GS)4161]-Mxe(SEQIDNO:19)和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)。蛋白质1A-1C主要在可溶性部分中获得(表4)。约50%的蛋白质1A和蛋白质1B被水解,而对于蛋白质1C的工程改造的内含肽而言未观察到水解。与蛋白质1A和1B相比,对于蛋白质1C而言,没有水解与表达水平提高约30%有关。
包含2A、2B和2C的蛋白质2家族包括在氨基端延伸(通过肠激酶蛋白酶位点(SEQIDNO:9)含有His标签(SEQIDNO:5))和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的hPYY(3-36),所述MxeGyrA内含肽变体分别为天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA。蛋白质2A-2C主要在可溶性部分中获得(表4)。分别约60%和50%蛋白质2A和2B被水解,而对于蛋白质2C而言未观察到水解。这和与2A和2B相比蛋白质2C的表达水平提高30-40%有关。
包含6A、6B和6C的蛋白质6家族包括分别在可通过DAP1除去的氨基端富含组氨酸的十二肽延伸(SEQIDNO:6)和羧基端MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA之间融合的[Arg4,Gln18,Lys30]-hPYY(3-36)。所有3种融合蛋白主要在可溶性部分中获得(表4)。约50%的蛋白质6A和6B被水解,而对于蛋白质6C而言未观察到水解。这与相对于6C,蛋白质6A和6B的表达水平降低15-30%进一步有关。
2.2.α-CGRP-内含肽融合蛋白的表达
包含3A、3B和3C的蛋白质3家族包括在氨基端延伸(含有His标签(SEQIDNO:5)和肠激酶蛋白酶位点(SEQIDNO:9))和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的hα-CGRP,所述MxeGyrA内含肽变体分别是天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA。所有3种融合蛋白主要在可溶性部分中获得(表4)。约50%的蛋白质3A和3B被水解,而对于蛋白质3C而言未观察到水解。这与相对于3C,蛋白质3A和3B的表达水平降低约30%进一步有关。
2.3.CT-内含肽融合蛋白的表达
包含4A、4B和4C的蛋白质4家族包括在氨基端延伸(含有His标签(SEQIDNO:5)和肠激酶蛋白酶位点(SEQIDNO:9))和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的hCT,所述MxeGyrA内含肽变体分别为天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA。所有3种蛋白质主要在可溶性部分中获得,无任何水解(表4)。在这种情况下,与蛋白质4C相比蛋白质4A和4B的表达水平更高。
2.4.PP-内含肽融合蛋白的表达
包含5A、5B和5C的蛋白质5家族包括在氨基端延伸(含有His标签(SEQIDNO:5)和肠激酶蛋白酶位点(SEQIDNO:9))和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的hPP,所述MxeGyrA内含肽变体分别为天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA。蛋白质5A-5C在可溶性部分中获得(表4)。虽然对于蛋白质5A和5B而言观察到约50%水解,但对于蛋白质5C而言未观察到水解。这与较之于5A和5B,蛋白质5C的表达水平提高约10-20%有关。
2.5.胰岛淀粉样多肽-内含肽融合蛋白的表达
包含7A、7B和7C的蛋白质7家族包括在可通过alp蛋白酶除去的氨基端富含组氨酸的十三肽延伸(SEQIDNO:7)和羧基端MxeGyrA内含肽变体之间融合的[Asp14,Arg17,Pro21,Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽,所述MxeGyrA内含肽变体分别为天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA。虽然蛋白质7A和7B两者主要在可溶性部分中获得,蛋白质7C作为可溶性和不溶性蛋白质的混合物获得(表4)。对于蛋白质7A和蛋白质7B二者而言,观察到大量水解,但未观察到蛋白质7C的工程改造的内含肽水解。这导致与7A和7B相比,蛋白质7C表达水平提高7-13%。
综上所述,与野生型MxeGyrA(SEQIDNO:17)和最小化[106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:19)内含肽相比,[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:20)一般导致水解降低和融合蛋白表达水平的相伴的提高。
表4.天然MxeGyrA、[106(GS)4161]-MxeGyrA和[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA内含肽的融合蛋白的水解水平、表达水平和溶解度。
实施例3.使用工程改造的内含肽的肽α-硫酯形成
为了检查工程改造的[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA内含肽对靶肽的产量的作用,从分别含有天然MxeGyrA(SEQIDNO:17)、[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)和[Cys3]-MxeGyrA(SEQIDNO:18)的融合蛋白1A、1C和1D中分离氨基端带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)α-硫酯。
如通用方法所述,使融合蛋白1A、1C和1D在含有200mLLB培养基的摇瓶中表达。如通用方法所述进行SDS-PAGE分析,表明>90%的融合蛋白在不溶性部分中。在25mM磷酸钠pH5缓冲液中通过超声裂解收获的细胞,将不溶性部分在洗涤缓冲液[25mM磷酸钠,1mMEDTA,1%TritonX-100,pH7]中洗涤两次,接着在100mM磷酸钠pH7.5缓冲液中洗涤一次。将分离的包含体在增溶缓冲液[100mM磷酸钠,8M脲,1mMTCEP,1mMEDTA,pH7.5](20mL)中重新悬浮,并在轻轻搅拌下在5℃下孵育2小时。表达产量通过RP-UPLC方法A估算。样品经过滤(0.45μm),通过快速稀释入9体积的冷的重折叠缓冲液[100mM磷酸钠,1.3M脲,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMTCEP,pH7.5]中重折叠,产生135mMNaCl和2M脲的浓度。紧接稀释之后,通过将MESNa加至100mM的终浓度,开始切割。使反应在5℃、pH7.3下进行20小时。通过RP-UPLC方法B和LC-MS方法A监测硫醇基诱导的切割。融合蛋白及其相应的内含肽的观测质量与预期相关(表3)。
硫醇基诱导的反应混合物通过3体积的缓冲液A[50mM磷酸钠,1mMEDTA,pH7]稀释以降低电导率至约12mS/cm,随后采用AKTAexplorer100系统(GEHealthcare),以5mL/分钟加载到HiTrapSPSepharoseHP(16×25mm,5mL,GEHealthcare)柱中。柱用9柱体积的缓冲液A洗涤,使用超过20柱体积的含有1MNaCl的0-100%缓冲液A线性梯度以3mL/分钟洗脱氨基端带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)α-硫酯。合并含有α-硫酯的部分,通过RP-UPLC方法C对量进行估算。产物的特性通过ESI-MS确认,得到12315.35Da的去卷积质量(deconvolutedmass)(预期:12315.09)。产量列于表5。
表5.使用不同的内含肽变体的N-带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)α-硫酯的纯化a。
综上所述,获自含有野生型MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:14)的蛋白质1A的氨基端带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)α-硫酯的产量与含有[Cys3]-MxeGyrA(SEQIDNO:18)的蛋白质1D的产量类似,这表明T3C突变本身不增加靶肽的量(表5)。然而,当从含有[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:20)的蛋白质1C中分离时,与蛋白质1A相比,产量增加约80%,表明了包含大小被减到最小和T3C突变的工程改造的内含肽正向地影响靶肽产量。重要的是,与1A相比,蛋白质1C和1D的氨基端带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)α-酸副产物的量降低,表明了T3C突变在纯化期间也有有益作用。
[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:20)内含肽提高融合蛋白的表达水平,并增加靶肽的产量。由于这对于[Cys3]-MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:18)而言未观察到,所以大小被减到最小有助于这些提高的性质。
实施例4.使用[Cys3,106(GS)
4
161]-MxeGyrA内含肽的α-酰胺化肽的产生
用于大规模生产α-酰胺化肽的包含工程改造的内含肽的融合蛋白的潜在应用取决于其在高细胞密度条件下表达的能力。对于在生物反应器中分批补料发酵后从蛋白质1C中分离的[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2而言,这一点被证实。
4.1.融合蛋白1C的分批补料发酵
使含有质粒p1C的BL21(DE3)细胞的预先培养物在摇瓶中在补充100μg/mL氨苄西林的LB培养基中生长6-8小时。在需氧条件下在500mL生物反应器(DasGibTechnology)中用最初体积为200mL的成分确定的发酵培养基的进行发酵,所述成分确定的发酵培养基含有葡萄糖和氨分别作为碳源和氮源,并在灭菌(在121℃下高压灭菌30分钟)后加入100μg/mL氨苄西林。将预先培养物接种在生物反应器中以达到约0.2的起始OD600。通过加入5NNH4OH保持pH在7.0下,保持温度在37℃下,在整个发酵期内,让0.4L/分钟的流速的空气吹泡通过肉汤平培养基。控制振荡速度(400-1200rpm)以达到至少30%O2饱和度的溶解氧水平。发酵培养基中的起始葡萄糖浓度为10g/L,从发酵5小时起,持续以逐步递增的方式(inincreasingsteps)加入与镁和痕量金属一起供应的葡萄糖进料,直至10g葡萄糖/L/小时的最终进给速率,该速率被保持直到发酵停止。在OD60050-60时通过加入0.5mMIPTG诱导融合蛋白的产生。在4小时诱导后停止发酵。在具有F10-6x500y转子(13000×g)的SorvallRC6Plus离心机中通过离心收获细胞,并保存在-20℃下。使细胞在裂解缓冲液[25mM磷酸钠,pH5]中重新悬浮至40-50的OD600,并在4℃下搅拌1小时。在持续细胞破坏系统E615中在1.36Kbar的压力下裂解细胞。将裂解的细胞离心下来,倾析上清液。让不溶性包含体在洗涤缓冲液[25mM磷酸钠,pH7,5mMEDTA,1%TritonX-100]中洗涤,在5℃下搅拌2小时,接着在MilliQ水中洗涤一次。将包含体等分为20个较小的部分。
4.2.[Gly4]-hPYY(4-36)-酰胺([Gly4]-hPYY(4-36)-NH
2
)的分离
策略概述于图2。使来自1/20分批补料培养的包含体在变性缓冲液[25mM磷酸钠,8M脲,1mMTCEP,1mMEDTA,pH7.5](30mL)中重新悬浮,轻轻搅拌的同时在5℃下孵育3.5小时。融合蛋白的产量通过RP-UPLC方法A估算,并用变性缓冲液将样品稀释至约1.2mg/mL的浓度。通过在搅拌的同时在5分钟内将蛋白质加入8.5体积的稀释缓冲液[25mM磷酸钠,1mMTCEP,1mMEDTA,0.5MNaCl,pH7.5]中,使蛋白质重折叠。通过用在稀释缓冲液中的2M原液将MESNa加至100mM,立即开始硫醇基诱导的切割。在搅拌的同时,使反应在0.8M脲和0.5MNaCl溶液中在5℃和pH7.3下过夜进行。
通过加入固体NH4HCO3至1M的终浓度,来进行酰胺化。用1NNaOH调节溶液的pH至8.5,使反应在5℃下过夜进行。通过LC-MS方法A监测硫醇基诱导的切割和酰胺化反应(表6)。
表6.在蛋白质1C的硫解作用和酰胺化后的质量
酰胺化混合物经过滤(0.22μm),滤器用8M脲洗涤。将脲洗涤物加载到PhenomenexLuna柱(15μm和300?;10×250mm)中,接着酰胺化混合物使用?KTAExplorer100(GEHealthcare)。使用0.1%TFA/水(溶剂A)和0.1%TFA/乙腈(溶剂B)以25-45%B的线性梯度,洗脱氨基端带标签的[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2。在冻干后,将蛋白质溶于25mM磷酸钠pH7.5缓冲液中,使用特异性识别序列EVLFQ/GP的HRV14-3C蛋白酶,通过酶促切割除去氨基端标签。使用1:12(w/w)的酶与底物比率,允许在室温下孵育至少48小时。在调节消化物的pH至4.3后,通过以下回收[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2:以3mL/分钟加载到用洗脱液A[10mMNH4HCO3,pH5.5]平衡的预充填的HiTrapSPsepharoseHP柱(5mL)中,接着超过5柱体积的0-100%洗脱液B[10mMNH4HCO3,pH8.5]的梯度,并使用等度洗脱液B达10CV,洗脱[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2。[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2的特性和纯度通过RP-UPLC方法C测定,通过LC-MS方法B表征,同时通过化学发光氮检测估算产量(表7)。
[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2以99%的纯度和184mg/L的产量分离(表7)。
综上所述,含有[Cys3,106(GS)4161]-MxeGyrA(SEQIDNO:20)的融合蛋白1C在高细胞密度条件下成功表达并转化成[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2,表明了工程改造的内含肽用于大规模生产α-酰胺化肽的适用性。
表7.从含有工程改造的内含肽的融合蛋白1C的分批补料培养生产α-酰胺化[Gly4]-hPYY(4-36)-NH2 a
虽然本文说明和描述了本发明的某些特征,但是本领域普通技术人员现将想到许多修饰、取代、变化和等同内容。因此,要了解,随附权利要求书旨在涵盖落入本发明真实精神内的所有这类的修饰和变化。
Claims (15)
1.一种用于生产肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
2.权利要求1的方法,其中所述内含肽是GyrA内含肽。
3.权利要求2的方法,其中所述内含肽是MxeGyrA内含肽。
4.权利要求3的方法,其中所述内含肽是通过切除相当于MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164的残基或相当于MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164的残基的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被包含1-10个氨基酸的接头置换的MxeGyrA内含肽。
5.权利要求4的方法,其中所述接头包含6-10个氨基酸,且其中接头的至少6个氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。
6.权利要求5的方法,其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
7.前述权利要求中任一项的方法,其中所述靶肽是α-酰胺化肽,例如PYY、PP、α-CGRP、CT和胰岛淀粉样多肽或其类似物。
8.前述权利要求中任一项的方法,其中所述融合蛋白还包含允许通过亲和色谱法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点,且其中所述蛋白酶位点允许所述纯化标签的连接。
9.前述权利要求中任一项的方法,所述方法还包括的硫醇基诱导切割融合蛋白,产生靶肽的α-硫酯。
10.一种用于生产α-酰胺化肽的方法,所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤,其中所述融合蛋白包含靶肽和SEQIDNO:20的内含肽。
11.前述权利要求中任一项的方法,其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
12.一种包含靶肽和内含肽的融合蛋白,其中所述内含肽的大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
13.一种内含肽,其大小被减到最小,并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
14.权利要求13的内含肽,其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
15.一种DNA构建体,其编码权利要求12限定的融合蛋白。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13170009 | 2013-05-31 | ||
EP13170009.8 | 2013-05-31 | ||
US201361833046P | 2013-06-10 | 2013-06-10 | |
US61/833046 | 2013-06-10 | ||
PCT/EP2014/061048 WO2014191455A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-05-28 | Methods for producing peptides using engineered inteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105263509A true CN105263509A (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=48536725
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480030331.8A Withdrawn CN105263509A (zh) | 2013-05-31 | 2014-05-28 | 使用工程改造的内含肽生产肽的方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9670257B2 (zh) |
EP (1) | EP3003357A1 (zh) |
JP (1) | JP2016519950A (zh) |
CN (1) | CN105263509A (zh) |
WO (1) | WO2014191455A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021047559A1 (zh) * | 2019-09-09 | 2021-03-18 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种断裂型内含肽、使用其的重组多肽的制备方法 |
US11136360B2 (en) | 2018-12-19 | 2021-10-05 | Tsinghua University | Fusion proteins comprising a Mtu ΔI-CM intein variant and methods of protein purification |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9771412B2 (en) * | 2014-10-31 | 2017-09-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Engineered intein for improved production of protein-intein fusions |
KR101891455B1 (ko) | 2014-11-03 | 2018-08-27 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 생체분자를 정제하기 위한 가용성 인테인 융합 단백질 및 방법 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9708918D0 (en) | 1997-05-01 | 1997-06-25 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Methods |
WO2000000625A1 (en) | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Ppl Therapeutics (Scotland) Limited | Methods for production of recombinant polypeptides |
DE69931382T2 (de) | 1998-09-30 | 2007-05-03 | New England Biolabs, Inc., Ipswich | Intein vermittelte peptidligation |
FI20021726A0 (fi) * | 2002-09-27 | 2002-09-27 | Ctt Cancer Targeting Tech Oy | Menetelmä peptidien tuottamiseksi |
WO2012036962A2 (en) | 2010-09-13 | 2012-03-22 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | C-terminal amidation of polypeptides |
EP2665744B1 (en) * | 2011-01-20 | 2015-04-08 | University Of Rochester | Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation |
CA2850411C (en) * | 2011-09-28 | 2023-08-15 | Era Biotech, S.A. | Split inteins and uses thereof |
-
2014
- 2014-05-28 JP JP2016516145A patent/JP2016519950A/ja not_active Withdrawn
- 2014-05-28 EP EP14727800.6A patent/EP3003357A1/en not_active Withdrawn
- 2014-05-28 CN CN201480030331.8A patent/CN105263509A/zh not_active Withdrawn
- 2014-05-28 WO PCT/EP2014/061048 patent/WO2014191455A1/en active Application Filing
- 2014-05-28 US US14/893,349 patent/US9670257B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11136360B2 (en) | 2018-12-19 | 2021-10-05 | Tsinghua University | Fusion proteins comprising a Mtu ΔI-CM intein variant and methods of protein purification |
WO2021047559A1 (zh) * | 2019-09-09 | 2021-03-18 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种断裂型内含肽、使用其的重组多肽的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2014191455A1 (en) | 2014-12-04 |
US20160096872A1 (en) | 2016-04-07 |
US9670257B2 (en) | 2017-06-06 |
JP2016519950A (ja) | 2016-07-11 |
EP3003357A1 (en) | 2016-04-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11124788B2 (en) | Asx-specific protein ligase | |
Satakarni et al. | Production of recombinant peptides as fusions with SUMO | |
JP6714902B2 (ja) | ペプチドおよびタンパク質の発現のための方法 | |
US7544512B2 (en) | Method of producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptide and/or GLP-1 analogs | |
AU2011208620B2 (en) | Stable growth hormone compounds | |
JP5368450B2 (ja) | ペプチドの高発現に適した融合タンパク質システム | |
Liew et al. | Preparation of recombinant thioredoxin fused N-terminal proCNP: analysis of enterokinase cleavage products reveals new enterokinase cleavage sites | |
CN105263509A (zh) | 使用工程改造的内含肽生产肽的方法 | |
US20160083713A1 (en) | Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases | |
US11952602B2 (en) | Variants of porcine trypsin | |
Bosse-Doenecke et al. | High yield production of recombinant native and modified peptides exemplified by ligands for G-protein coupled receptors | |
CN110257347B (zh) | 硫氧还蛋白突变体、其制备方法及其在重组融合蛋白生产中的应用 | |
JP7266325B2 (ja) | 蛍光タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質およびその用途 | |
Liu et al. | Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1–84 from Escherichia coli | |
KR20080094766A (ko) | 새로운 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
US11179444B2 (en) | Glucagon analogs and methods of use thereof | |
KR20230165291A (ko) | 폴리펩티드의 발현 증가를 위한 구축물 및 방법 | |
Zhang et al. | Expression, purification, and C-terminal amidation of recombinant human glucagon-like peptide-1 | |
JP2005527632A (ja) | ポリペプチド切断方法 | |
CN102558356A (zh) | 一种人胰岛素原融合蛋白及人胰岛素的制备方法 | |
KR100407792B1 (ko) | 인간 글루카곤 유사펩타이드를 융합파트너로 이용한재조합 단백질의 제조방법 | |
US20230272004A1 (en) | Ramp tag for insulin overexpression and method for manufacturing insulin using same | |
KR20040007892A (ko) | 재조합 인간 훼리틴 단백질 및 그 제조방법 | |
WO2012098009A1 (en) | Chimeric polypeptide comprising a membrane protein and an insulin precursor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20160120 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |