ES2323706T3 - Metodo de ligacion. - Google Patents

Abstract

Un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primero oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi; b) proporcionar un segundo oligopéptido, teniendo el segundo oligopéptido un resto éster activado, en el que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto Oacilisourea; c) permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con el resto éster activado del segundo oligopéptido para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III. ** ver fórmula**

Description

Método de ligación.

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere a un método de ligación de dos o más moléculas, por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas, marcadores, péptidos, etc. En particular, se refiere a un método para ligar un péptido, tal como ligación de un péptido sintético con un péptido recombinante.

Antecedentes de la invención

Las metodologías de modificación de proteínas han demostrado ser inestimables para generar herramientas basadas en proteínas para aplicación en investigación básica, diagnóstico, descubrimiento de fármacos y como terapéuticos proteicos. La capacidad para manipular la estructura primaria de una proteína de una forma controlada abre muchas nuevas posibilidades en las ciencias biológicas y médicas Como consecuencia, existe un esfuerzo coordinado por desarrollar metodologías para la modificación específica de sitio de proteínas y su aplicación posterior.

Los dos enfoques principales para generar proteínas son mediante métodos recombinantes o síntesis química. Hasta la fecha, los dos métodos han demostrado ser complementarios; las metodologías recombinantes permiten que se generen proteínas de cualquier tamaño pero, en general, se limitan al ensamblaje de los aminoácidos proteinogénicos. Por lo tanto, en general, la introducción de marcadores y sondas en proteínas recombinantes debe llevarse a cabo postraduccionalmente y no permite modificaciones en la estructura proteica.

Los métodos más comunes para marcar una proteína recombinante usan una versión reactiva con amino o con tiol del marcador que reaccionará covalentemente con una cadena lateral de lisina/grupo amino N^{\alpha} o una cadena lateral de cisteína dentro de la proteína, respectivamente. Para que dichos métodos de marcaje sean específicos de sitio, debe modificarse un derivado apropiado de la proteína para que contenga una funcionalidad reactiva única en la posición a modificar. Esto requiere que se eliminen todas las demás funcionalidades reactivas de origen natural dentro de la secuencia primaria mediante mutagénesis de aminoácidos. En el caso de funcionalidades amino de proteínas, esto es esencialmente imposible debido a la abundancia de restos de lisina en proteínas y a la presencia de la funcionalidad amino en el extremo N-terminal de la secuencia. Asimismo, para la cisteína, este proceso es laborioso y con frecuencia perjudicial para la función de la proteína.

La producción de proteínas que tienen modificaciones específicas de sitio y/o marcadores se puede conseguir más fácilmente usando métodos de síntesis química. La síntesis química de proteínas permite que se incorporen múltiples modificaciones en restos tanto de la cadena lateral como de la estructura de la proteína de una forma específica de sitio pero, en general, el tamaño máximo de secuencia que se puede sintetizar y aislar es de aproximadamente 50-100 aminoácidos.

Ligación de proteínas

Un enfoque adicional para la generación de proteínas es la ligación de proteínas/péptidos. En este enfoque, se incorporan funcionalidades químicas mutuamente reactivas (ortogonales a la química de los aminoácidos de origen natural, es decir, que reaccionan mediante químicas mutuamente excluyentes en comparación con las reacciones de los restos reactivos de los aminoácidos de origen natural) en los extremos N- y C-terminales de fragmentos polipeptídicos no protegidos, de modo que cuando se mezclan, reaccionan de una forma quimioselectiva para unir las dos secuencias entre sí (Cotton GJ y Muir TW. Chem. Biol., 1999, 6, R247-R254). El principio de la ligación química se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

Se han utilizado varias químicas para la ligación de dos péptidos sintéticos, en la que pueden incorporarse un intervalo diverso de funcionalidades químicas diferentes en los extremos terminales de polipéptidos usando síntesis de péptidos en fase sólida. Éstas incluyen la reacción entre un tioácido y bromo-alquilo para formar un tioéster (Schnolzer M y Kent SBH, Science, 1992, 256, 221-225), la reacción de un aldehído con una cisteína o treonina N-terminal para formar tiazolidina u oxazolidina, respectivamente (Liu C-F y Tam J P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6584-6588), la reacción entre una hidrazida y un aldehído para formar una hidrazona (Gaertner HF et al, Bioconj. Chem., 1992, 3, 262-268), la reacción de un grupo aminooxi y un aldehído para formar una oxima (Rose K. J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 30-33), la reacción de azidas y aril fosfinas para formar un enlace amida (ligación de Staudinger) (Nilsson BL, Kiessling LL y Raines RT. Org. Lett., 2001, 3, 9-12, Kiick et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 19-24) y la reacción de un tioéster C-terminal de un péptido y un péptido con cisteína N-terminal para formar un enlace amida nativo (Dawson et al. Science, 1994, 266, 776) (ligación química nativa, documentos US6184344, EP 0832 096 B1). Este método de ligación química nativa es una ampliación de estudios de Wieland y colaboradores, que demostraron que la reacción de VaISPh y CysOH en tampón acuoso daba el dipéptido ValCysOH (Wieland T et al., Liebigs Ann. Chem., 1953, 583, 129-149).

Aunque el método de ligación química nativa ha resultado ser popular, requiere un péptido que contenga una cisteína N-terminal para la reacción y, por lo tanto, si no existe una cisteína en la posición apropiada de la proteína, debe introducirse una cisteína en el sitio de ligación. Sin embargo, la introducción de grupos tiol extra en una secuencia proteica puede ser perjudicial para su estructura/función, especialmente puesto que la cisteína tiene propensión a formar enlaces disulfuro que pueden alterar la ruta de plegamiento o comprometer la función de la proteína plegada.

Como consecuencia de las dificultades y problemas asociados con técnicas de ligación conocidas, generalmente la ligación de dos fragmentos sintéticos sólo permite que se sinteticen químicamente proteínas de aproximadamente 100-150 aminoácidos. Aunque se han sintetizado proteínas de mayor tamaño por ligación entre sí de más de dos fragmentos, esto ha resultado ser técnicamente difícil (Camarero et al. J. Pept. Res., 1998, 54, 303-316, Canne LE et al, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 8720-8727).

Semisíntesis de proteínas

Se han descrito tecnologías de ligación de proteínas que permiten que se unan entre sí fragmentos proteicos tanto sintéticos como obtenidos de forma recombinante. Esto permite que se construyan proteínas de gran tamaño a partir de combinaciones de fragmentos sintéticos y recombinantes, permitiendo que las proteínas se modifiquen de forma específica de sitio con entidades tanto naturales como no naturales. Mediante la utilización de dicha denominada semisíntesis de proteínas, pueden incorporarse de forma específica de sitio muchos restos sintéticos diferentes en múltiples sitios diferentes dentro de una proteína diana.

Para utilizar proteínas recombinantes en estrategias de ligación, los fragmentos recombinantes deben contener las funcionalidades reactivas apropiadas para facilitar la ligación. Un enfoque para introducir una funcionalidad reactiva única en una proteína recombinante ha sido a través de la oxidación con periodato de secuencias que contienen una serina N-terminal. Dicho tratamiento convierte la serina N-terminal en un resto glioxilo, que contiene un aldehído N-terminal. Después, se han ligado péptidos sintéticos que contienen hidrazida en el extremo N-terminal de estas proteínas de una forma quimioselectiva mediante la formación de un enlace hidrazona con el grupo glioxilo N-terminal de la proteína (Gaertner HF et al, Bioconj. Chem., 1992, 3, 262-268, Gaertner HF, et al. J. Biol. Chem., 1994, 269, 7224-7230). Otro enfoque ha sido generar proteínas recombinantes con restos de cisteína N-terminales. Después, péptidos sintéticos que contienen tioésteres C-terminales se han unido de forma específica de sitio con el extremo N-terminal de estas proteínas por formación de un enlace amida de una forma análoga a la "ligación química nativa" (Cotton GJ y Muir TVV. Chem. Biol., 2000, 7, 253-261). Sin embargo, como con la ligación de péptidos sintéticos usando técnicas de ligación química nativa, la tecnología requiere que se introduzca una cisteína en el sitio de ligación si la secuencia primaria no contiene una en la posición apropiada.

Técnicas de corte y empalme de proteínas

Recientemente se han desarrollado tecnologías que permiten que se generen proteínas recombinantes que contienen grupos tioéster C-terminales. La funcionalidad tioéster C-terminal proporciona un grupo químico reactivo único dentro de la proteína que puede utilizarse para ligación de proteínas. Se producen proteínas recombinantes con tioéster C-terminal por manipulación de un fenómeno biológico de origen natural conocido como corte y empalme de proteínas (Paulus H. Annu Rev Biochem 2000, 69, 447-496). El corte y empalme de proteínas es un proceso postraduccional en el que una proteína precursora experimenta una serie de reorganizaciones intramoleculares que dan como resultado la eliminación precisa de una región interna, denominada inteína, y ligación de las dos secuencias flanqueantes, denominadas exteínas (Figura 2). Aunque generalmente no existen requerimientos de secuencia en ninguna de las exteínas, las inteínas se caracterizan por varios motivos de secuencia conservada y actualmente se han identificado bastantes más de cien miembros de esta familia de dominios proteicos.

La primera etapa en el corte y empalme de proteínas implica un desplazamiento de acilo N\rightarrowS (o N\rightarrowO) en el que la unidad de N-exteína se transfiere al grupo SH u OH de la cadena lateral de un resto Cys/Ser/Thr conservado, siempre localizado en el extremo N-terminal inmediato de la inteína. Los conocimientos de este mecanismo han conducido al diseño de varias inteínas mutantes que sólo pueden promover la primera etapa del corte y empalme de proteínas (Chong et al Gene. 1997, 192, 271-281, (Noren et al., Anew. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 450-466). Las proteínas expresadas como fusiones N-terminales en la misma fase de lectura con una de estas inteínas modificadas pueden escindirse por tioles mediante una reacción de transtioesterificación intermolecular para generar el derivado de tioéster C-terminal de una proteína recombinante (Figura 3) (Chong et al Gene. 1997, 192, 271-281, (Noren et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 450-466) (New England Biolabs Impact System WO 00/18881, WO 0047751). Después, las secuencias peptídicas que contienen un resto de cisteína N-terminal pueden ligarse específicamente con los extremos C-terminales de dichas proteínas recombinantes con tioéster C-terminal (Muir et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, 95, 6705-6710, Evans Jr et al. Prot. Sci., 1998, 7, 2256-2264) en un procedimiento denominado ligación de proteínas expresadas (EPL) o ligación de proteínas mediada por inteínas (IPL).

La ligación quimioselectiva de péptidos que contienen cisteína N-terminal con péptidos que contienen tioéster C-terminal, ya sean sintéticos o recombinantes, se realiza típicamente a un pH ligeramente básico en presencia de un cofactor de tiol. La estrategia también requiere que se introduzca una cisteína en el sitio de ligación si no existe una convenientemente situada dentro de la secuencia primaria. Estos requerimientos de este enfoque de ligación tienen el potencial de alterar la estructura y/o función tanto del producto de ligación de proteína como de los reactivos iniciales.

Por ejemplo, la quimioquina RANTES es inestable en un tampón de NaCl 100 mM, fosfato de sodio 100 mM a pH 7,4 que contiene ácido 2-mercaptoetanosulfónico 100 mM (MESNA); un tampón usado típicamente para la ligación de moléculas tioéster C-terminales con moléculas que contienen cisteína N-terminal (ligación de proteínas expresadas y ligación química nativa). RANTES contiene dos enlaces disulfuro críticos para mantener la estructura y función de la proteína. En el tampón de ligación típico descrito anteriormente, se descubrió que la proteína plegada se convertía en 48 horas en una mezcla de la proteína reducida y aductos proteicos de MESNA. La mayor parte de la mezcla proteica formaba posteriormente un precipitado, que presumiblemente refleja la naturaleza no plegada de estas especies (Cotton, no publicado).

Por consiguiente, los inventores piensan que las reacciones de ligación que requieren tampones que contienen tiol, en general, no son adecuadas para mantener la integridad de proteínas que contienen enlaces disulfuro, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y dominios de anticuerpos, citoquinas, factores de crecimiento, etc. Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques de ligación que se realizan típicamente en ausencia de tioles. Por ejemplo, cuando se controlaba lo largo de varios días, se descubrió que RANTES era estable en NaCl 100 mM, tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,4 y tampón acetato de sodio 100 mM a pH 4,5 (resultados no publicados del inventor). Por lo tanto, las reacciones de ligación que pueden realizarse en dichas condiciones deberían ser aplicables tanto para proteínas que contienen disulfuros como que no contienen disulfuros.

\vskip1.000000\baselineskip

Marcaje de proteínas

Históricamente, la ligación de proteínas significa la unión entre sí de dos fragmentos peptídicos/proteicos, pero esto es sinónimo del marcaje de proteínas en el que el marcador es un péptido o péptido derivatizado. Igualmente, si una molécula sintética pequeña no peptídica contiene la funcionalidad química reactiva necesaria para la ligación de proteínas, entonces la ligación de la molécula sintética directamente con el extremo N- o C-terminal de la proteína proporciona el marcaje específico de sitio de la proteína. Por lo tanto, también pueden usarse tecnologías desarrolladas para ligación de fragmentos proteicos para el marcaje directo de los extremos N- o C-terminales de péptidos o proteínas de una forma específica de sitio independientemente de su secuencia.

Se han marcado N-terminalmente de forma específica de sitio proteínas recombinantes que contienen funciones glioxilo N-terminales (generadas mediante oxidación con periodato de la proteína con serina N-terminal correspondiente) por reacción con derivados de hidrazida o aminooxi del marcador (Geoghegan KF y Stroh JG. Bioconj Chem., 1992, 3, 138-146, Alouni S et al. Eur. J. Biochem., 1995, 227, 328-334). Además, se han marcado N-terminalmente proteínas recombinantes que contienen restos de cisteína N-terminales por reacción con marcadores que contienen funcionalidades tioéster, siendo el marcador el sustituyente acilo del tioéster (Schuler B y Pannell LK. Bioconjug. Chem., 2002, 13, 1039-43), y funcionalidades aldehído (Zhao et al. Bioconj. Chem., 1999, 10, 424-430) para formar amidas y tiazolidinas, respectivamente.

Aunque existen varios métodos para la ligación de proteínas, cada uno tiene sus desventajas potenciales. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas metodologías de ligación, especialmente las que sean compatibles con fragmentos tanto sintéticos como recombinantes, y que puedan usarse en la ligación de proteínas que contienen enlaces disulfuro, así como de proteínas que no contienen enlaces disulfuro, que complementarán las tecnologías existentes y añadirán otra metodología a las disponibles para el especialista en ingeniería de proteínas.

\vskip1.000000\baselineskip

Sumario de la invención

Los presentes inventores han superado varios problemas asociados con la técnica anterior y han desarrollado un nuevo método para ligar moléculas peptídicas que supera varios de los problemas de la técnica anterior.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primero oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi

b)

proporcionar un segundo oligopéptido, teniendo el segundo oligopéptido un resto éster activado, en el que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto o-acilisourea

c)

permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con el resto éster activado del segundo oligopéptido para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

1

101

2

En realizaciones preferidas, en la etapa (c), en la que dichos oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II y en el que dicho resto éster activado de la etapa (b) no es un tioéster, dicho éster activado es un resto éster activado terminal.

En realizaciones preferidas adicionales de la invención, dichos restos de unión se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I o Fórmula III.

A menos que el contexto requiera otra cosa, los términos péptido, oligopéptido, polipéptido y proteína se usan de forma intercambiable.

El resto éster activado del primer oligopéptido es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto O-acilisourea.

En realizaciones preferidas de la invención, el resto éster activado es un resto tioéster. Puede usarse cualquier péptido con tioéster adecuado, en el que el péptido es el sustituyente acilo del tioéster, en la presente invención (Figura 4).

Dichos péptidos tioéster pueden producirse de forma sintética o recombinante. El especialista conoce bien métodos conocidos en la técnica para generar tioésteres en péptidos sintéticos. Por ejemplo, pueden producirse tioésteres en péptidos sintéticos por síntesis sobre una resina que genera un tioéster C-terminal tras la escisión con HF (Hojo et al, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1993, 66, 2700-2706). Además, el uso de enlazadores "de seguridad" ha resultado ser popular para la generación de tioésteres C-terminales mediante la escisión de la resina inducida con tiol del péptido ensamblado (Shin Y et al, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 11684-11689).

Además, se han desarrollado recientemente tecnologías que permiten que se generen proteínas recombinantes con tioéster C-terminal. Pueden producirse proteínas recombinantes con tioéster C-terminal por manipulación de un fenómeno biológico de origen natural conocido como corte y empalme de proteínas. Como se ha descrito anteriormente, el corte y empalme de proteínas es un proceso postraduccional en el que una proteína precursora experimenta una serie de reorganizaciones intramoleculares que dan como resultado la eliminación precisa de una región interna, denominada inteína, y la ligación de las dos secuencias flanqueantes, denominadas exteínas.

Como se ha descrito anteriormente, se han diseñado varias inteínas mutantes que sólo pueden promover la primera etapa del corte y empalme de proteínas (Chong et al Gene. 1997, 192, 271-281, Noren et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 450-466). Las proteínas expresadas como fusiones N-terminales en la misma fase de lectura con una de estas inteínas modificadas pueden escindirse por tioles mediante una reacción de transtioesterificación intermolecular para generar el derivado de tioéster C-terminal de la proteína recombinante (Chong et al Gene. 1997, 192, 271-281, Noren et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 450-466) (New England Biolabs Impact System WO 00/18881, WO 0047751). Dichos tioésteres de proteínas pueden usarse en los métodos de la invención (véase la Figura 3).

Por consiguiente, en un aspecto preferido de la presente invención, en la etapa (b) se genera el segundo oligopéptido mediante escisión inducida con reactivo tiol de una proteína de fusión con inteína.

Por consiguiente, en un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primer oligopéptido un resto reactivo,

b)

(i) proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un segundo oligopéptido precursor fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína (ii) permitiendo la escisión dependiente de reactivo tiol de la molécula precursora para generar una segunda molécula oligopeptídica, teniendo dicha segunda molécula oligopeptídica un resto tioéster en su extremo C-terminal

c)

permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con la segunda molécula oligopeptídica para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, II o III.

En realizaciones preferidas de la invención, el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto amino-oxi o un resto hidrazida que tienen la fórmula general IV, V o VI, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

1000

\vskip1.000000\baselineskip

3

Por ejemplo, en una realización preferida particular, el resto reactivo tiene la Fórmula IV, y en el producto oligopeptídico producido por el método de la invención, el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I.

En una realización preferida adicional, el resto reactivo tiene la Fórmula V y, en el producto oligopeptídico producido por el método de la invención, el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II.

En otra realización preferida, el resto reactivo tiene la Fórmula VI y, en el producto oligopeptídico producido por el método de la invención, el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula III.

Como se ha descrito anteriormente, el primer oligopéptido comprende un resto reactivo que puede ser un resto hidrazina (por ejemplo, Fórmula IV), un resto amino-oxi (por ejemplo, Fórmula V) o un resto hidrazida (por ejemplo, Fórmula VI).

Una ventaja particular del método de ligación de la invención es que puede realizarse en ausencia de tioles. Esto permite una ligación eficaz de proteínas/péptidos que comprenden enlaces disulfuro, así como de proteínas sin dichos enlaces.

Por consiguiente, en una realización del primer y segundo aspectos de la invención, al menos uno del primero y segundo oligopéptidos comprende uno o más enlaces disulfuro.

Pueden producirse fácilmente derivados que contienen hidrazina, hidrazida o aminooxi de oligopéptidos sintéticos usando métodos conocidos, por ejemplo, técnicas de síntesis en fase sólida.

Además, los presentes inventores también han descubierto que las proteínas fusionadas N-terminalmente con un dominio de inteína pueden escindirse de la inteína por tratamiento con hidrazina de una forma selectiva para liberar la proteína deseada como su derivado de hidrazida correspondiente (por ejemplo, véase la Figura 5).

Por consiguiente, en realizaciones preferidas adicionales de la invención, el primer oligopéptido se genera por reacción de hidrazina con una molécula oligopeptídica que comprende el primer oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína.

De hecho, el descubrimiento de que dichas hidrazidas de proteínas pueden producirse por medio de dicha reacción constituye un aspecto independiente de la presente invención.

Por consiguiente, un tercer aspecto de la invención proporciona un método para generar una hidrazida de una proteína, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

proporcionar una molécula proteica que comprende un oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

(b)

hacer reaccionar dicha molécula proteica con hidrazina, de modo que el dominio de inteína se escinde del oligopéptido para generar una hidrazida de una proteína.

Es más, además de usar dicha reacción para generar un primer oligopéptido que tiene un resto hidrazida en su C-terminal, estando por lo tanto disponible el primer oligopéptido para la reacción con el segundo oligopéptido que tiene el resto éster activado, la presente invención incluye además un proceso de "una etapa" para ligar dos péptidos para generar un producto oligopeptídico.

Esto puede conseguirse haciendo reaccionar una proteína adecuada unida N-terminalmente a una inteína directamente con un polipéptido que tenga un resto hidrazina, hidrazida o amino-oxi.

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, en un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primer oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto amino-oxi;

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un segundo oligopéptido fusionado N- terminalmente con un dominio de inteína;

c)

permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con la molécula oligopeptídica precursora para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

\vskip1.000000\baselineskip

La tecnología de ligación de la presente invención puede utilizar por lo tanto proteínas y péptidos tanto sintéticos como recombinantes. Por lo tanto, permite la ligación de dos o más péptidos sintéticos, la ligación de dos o más péptidos recombinantes o la ligación de al menos un péptido sintético con al menos un péptido recombinante.

Es más, además de proporcionar un nuevo método de ligación de péptidos, la presente invención puede usarse para el marcaje de péptidos sintéticos o recombinantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, en un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método de marcaje de un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto reactivo, en la que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi

b)

proporcionar el oligopéptido, teniendo el oligopéptido un resto éster activado, en el que resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto o-acilisourea

c)

permitir que el resto reactivo de la molécula marcadora reaccione con el resto éster activado del oligopéptido para formar el oligopéptido marcado,

en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III como se ha definido anteriormente,

en el que en la etapa (c), en la que dicha molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II, dicho éster activado es un tioéster.

\vskip1.000000\baselineskip

En un aspecto preferido de la presente invención, en la etapa (b) el oligopéptido se genera mediante escisión inducida con tiol de una proteína de fusión con inteína.

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, en un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método de marcaje de un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto reactivo,

b)

(i) proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un oligopéptido precursor fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína

ii) permitiendo la escisión dependiente de reactivo tiol de la molécula precursora para generar una molécula oligopeptídica, teniendo dicha molécula oligopeptídica un resto tioéster en su extremo C-terminal

c)

permitir que el resto reactivo de la molécula marcadora reaccione con el oligopéptido para formar el oligopéptido marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, II o III.

\vskip1.000000\baselineskip

Como alternativa, puede usarse una molécula marcadora que tiene un resto éster activado terminal para marcar un oligopéptido que tiene un resto reactivo. Por lo tanto, en un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un método de marcaje de un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto éster activado de la que el marcador es el sustituyente acilo, en la que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto o-acilisourea

b)

proporcionar el oligopéptido, teniendo el oligopéptido un resto reactivo, en el que resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto o-acilisourea

c)

permitir que el resto éster activado de la molécula marcadora reaccione con el resto reactivo del oligopéptido para formar el oligopéptido marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III

en el que en la etapa (c), en la que dicha molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II y en el que dicho resto éster activado de la etapa (b) no es un tioéster, dicho éster activado es un resto éster activado terminal.

Como con la tecnología de ligación, un oligopéptido presente como una molécula precursora unida a una molécula de inteina puede marcarse directamente. Por lo tanto, un octavo aspecto de la presente invención proporciona un método de marcaje de un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto reactivo, en la que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto o-acilisourea,

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

c)

permitir que el resto reactivo de la molécula marcadora reaccione con la molécula oligopeptídica precursora para formar un producto oligopeptídico marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III, como se ha definido anteriormente.

Puede usarse cualquier molécula marcadora adecuada conocida para el especialista en los métodos de la invención. La selección del marcador dependerá del uso que se vaya a dar del péptido marcado. Por ejemplo, los marcadores que pueden usarse en los métodos de la invención pueden incluir fluoróforos, reactivos entrecruzantes, marcadores de espín, sondas de afinidad, reactivos de formación de imágenes, por ejemplo, radioisótopos, agentes quelantes tales como DOTA, polímeros tales como PEG, lípidos, azúcares, agentes citotóxicos y superficies sólidas y perlas.

En realizaciones particulares del quinto, sexto y séptimo aspectos de la invención, al menos uno del marcador y oligopéptidos comprende uno o más enlaces disulfuro.

Los métodos de la invención son particularmente útiles en la ligación de péptidos, en particular la ligación de péptidos que, usando técnicas de ligación convencionales, requerirán diversos grupos protectores. Los inventores han demostrado que los métodos de la invención pueden realizarse en condiciones de pH en las que solamente reaccionarán los restos reactivos.

En realizaciones preferidas del primer y segundo, y en realizaciones preferidas del cuarto al octavo aspecto de la invención, la etapa (c) del método se realiza a un pH en el intervalo de pH 4,0 a pH 8,5, preferiblemente de pH 4,0 a 8,0, por ejemplo, de pH 4,0 a 7,5, más preferiblemente en el intervalo de pH 5,0 a pH 8,0, más preferiblemente en el intervalo de pH 6,0 a pH 7,5, más preferiblemente en el intervalo de pH 6,5 a pH 7,5.

Por ejemplo, los inventores han demostrado que los tioésteres C-terminales de péptidos sintéticos reaccionan específicamente con hidrazina en condiciones acuosas a pH 6,0 para formar la correspondiente hidrazida del péptido. Esto permite que los métodos de ligación que se describen en este documento se realicen a un pH de 6,0 sin la necesidad de un cofactor de tiol potencialmente perjudicial (útil si cualquiera de los fragmentos o la construcción final es sensible a tiol) y no conduce a la introducción de grupos de cadena lateral potencialmente reactivos (tales como tiol) en la proteína. De forma similar, los inventores han demostrado que los tioésteres C-terminales de péptidos sintéticos reaccionan específicamente con hidroxilamina en condiciones acuosas a pH 6,0 y pH 6,8 para formar el correspondiente ácido hidroxámico del péptido. Además, como se describe a continuación, los inventores han demostrado que tanto los tioésteres C-terminales de péptidos sintéticos como los tioésteres C-terminales de proteínas recombinantes reaccionan específicamente con O-metil-hidroxilamina en condiciones acuosas a pH 7,5, para formar los derivados de N-metoxi amida C-terminal correspondientes. Esto permite que los métodos de ligación que se describen en este documento se realicen a un pH de 7,5, sin la necesidad de un cofactor de tiol potencialmente perjudicial.

Los péptidos y proteínas que contienen grupos tioéster (en los que el péptido es el sustituyente acilo del tioéster) pueden hacerse reaccionar con derivados de hidrazina, hidrazida o aminooxi de un marcador o un péptido para proporcionar un marcaje específico de sitio y una ligación quimioselectiva, respectivamente (véanse, por ejemplo, las Figuras 4 y 5).

De una forma análoga, pueden hacerse reaccionar péptidos que contienen grupos hidrazina, hidrazida o aminooxi con derivados de tioéster de un marcador o un péptido para proporcionar un marcaje específico de sitio y una ligación quimioselectiva, respectivamente (véanse, por ejemplo, las Figuras 4 y 5).

Además, habiendo demostrado que pueden generarse hidrazidas de proteínas recombinantes por escisión de fusiones de proteína-inteína con hidrazina, los inventores han demostrado que dichas hidrazidas de proteínas pueden ligarse por reacción del resto hidrazida con grupos reactivos distintos de restos éster activados, por ejemplo, una funcionalidad aldehído o una funcionalidad cetona. Por ejemplo, como se describe a continuación, los inventores han demostrado que un derivado de piruvoílo de un péptido sintético puede ligarse quimioselectivamente con el extremo C-terminal de hidrazidas de proteínas recombinantes usando el enfoque descrito y, de una forma análogo, se usó un derivado de piruvoílo de fluoresceína para marcar de forma específica de sitio el extremo C-terminal de hidrazidas de proteínas recombinantes usando el enfoque descrito.

Este aspecto de la invención proporciona un nuevo método adicional para ligar un péptido recombinante con un segundo péptido o, de hecho, un marcador.

Por lo tanto, un noveno aspecto de la invención proporciona un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporciona un primer oligopéptido, teniendo el primer oligopéptido un resto aldehído o cetona,

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un segundo oligopéptido fusionado N- terminalmente con un dominio de inteína,

c)

hacer reaccionar dicha molécula oligopeptídica precursora con hidrazina para generar una molécula oligopeptídica que comprende un oligopéptido intermedio, teniendo dicho oligopéptido intermedio un resto hidrazida C-terminal,

d)

permitir que el resto aldehído o cetona del primer oligopéptido reaccione con el resto hidrazida de la molécula oligopeptídica intermedia para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer oligopéptido y el segundo oligopéptido se unen mediante un resto de unión de hidrazona.

Se muestra un ejemplo de este aspecto en la Figura 6.

Un décimo aspecto de la invención proporciona un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un marcador molecular, teniendo el marcador molecular un resto aldehído o cetona,

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un primer oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

c)

hacer reaccionar dicha molécula oligopeptídica precursora con hidrazina para generar una molécula oligopeptídica que comprende un oligopéptido intermedio, teniendo dicho oligopéptido intermedio un resto hidrazida terminal,

d)

permitir que el resto aldehído o cetona de la molécula marcadora reaccione con el resto hidrazida de la molécula oligopeptídica intermedia para formar un producto oligopeptídico marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión de hidrazona.

En realizaciones preferidas del noveno y décimo aspectos de la invención, el resto de hidrazona tiene la Fórmula VII:

4

en la que R es H o cualquier grupo alquilo sustituido o no sustituido, preferiblemente no sustituido.

En aspectos preferidos del noveno y décimo aspectos de la invención, el método se realiza a un pH en el intervalo de pH 1,0 a pH 7,0, preferiblemente de pH 1,0 a pH 6,0, más preferiblemente en el intervalo de pH 2,0 a pH 5,5, más preferiblemente en el intervalo de pH 2,0 a pH 4,5.

En una realización particular del noveno y décimo aspectos de la invención, el resto que contiene aldehído o cetona del oligopéptido o del marcador es un grupo \alpha-dicetona o un grupo \alpha-ceto aldehído.

En un undécimo aspecto de la presente invención, se proporciona un producto oligopeptidico producido usando un método de acuerdo con el primer, segundo o cuarto aspecto de la invención en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II o Fórmula III.

En un duodécimo aspecto, se proporciona un oligopéptido marcado que comprende un oligopéptido marcado por el método de uno cualquiera del quinto al octavo aspecto de la invención, en el que el marcador y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II o Fórmula III.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos, cambiando lo que se deba cambiar.

La invención se describirá ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes haciendo referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 ilustra esquemáticamente el principio general de la ligación química.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente el mecanismo de corte y empalme de proteínas.

La Figura 3 ilustra la generación de proteínas recombinantes con tioéster C-terminal.

La Figura 4 ilustra la ligación de tioésteres de proteínas y péptidos con entidades que contienen hidrazina y aminooxi, tales como marcadores, péptidos y proteínas.

La Figura 5 ilustra la generación de hidrazidas de péptidos sintéticos y recombinantes para la ligación con moléculas que contienen tioéster. Obsérvese que el péptido o marcador es el sustituyente acilo del tioéster.

La Figura 6 ilustra la generación de hidrazidas de péptidos recombinantes para la ligación con moléculas que contienen aldehído y cetona.

La Figura 7 ilustra un análisis de SDS-PAGE de Grb2-SH2-GyrA-CBD (inmovilizada sobre perlas de quitina) tratada con DTT y MESNA. Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Grb2-SH2-GyrA-CBD purificada inmovilizada sobre perlas de quitina (carril 4). Grb2-SH2-GyrA-CBD tratada con DTT 100 mM (carriles 5 y 7) o MESNA 120 mM (carriles 8 y 10). Se analizaron tanto las suspensiones de reacción completas (carriles 5 y 8) como los sobrenadantes de reacción (carriles 7 y 10).

La Figura 8 ilustra un análisis de SDS-PAGE de Grb2-SH2-GyrA-CBD (inmovilizada sobre perlas de quitina) tratada con hidrazina. Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Grb2-SH2-GyrA-CBD purificada inmovilizada sobre perlas de quitina después de un tratamiento de 20 h con tampón fosfato solamente (carril 2). Grb2-SH2-GyrA-CBD tratada con hidrazina 200 mM en tampón fosfato durante 20 h. Se analizaron las suspensiones de reacción completas.

La Figura 9 ilustra un espectro de ESMS del derivado de hidrazida C-terminal de Grb2-SH2.

La Figura 10 muestra un análisis de SDS-PAGE de la reacción entre el péptido sintético que contiene cetona CH_{3}COCO-myc y Grb2-SH2-hidrazida C-terminal y Citocromo C. Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Grb2-SH2-tioéster de DTT C-terminal (carril 2). Reacción entre Grb2-SH2-hidrazida C-terminal y CH_{3}COCO-myc en los puntos de tiempo t = 0 h (carril 3), t = 24 h (carril 4), t = 48 h (carril 5) y t = 72 h (carriles 6). Reacción entre Citocromo C y CH_{3}COCO-myc en los puntos de tiempo t = 0 h (carril 7), t = 24 h (carril 8), t = 48h (carril 9) y t = 72 h (carriles 10).

La Figura 11 muestra la estructura de CH_{3}COCO-Lys(F1). Se muestra el isómero posicional de 5-carboxi fluoresceína.

La Figura 12 ilustra un análisis de SDS-PAGE de la reacción entre CH_{3}COCO-Lys(F1) y Grb2-SH2-hidrazida C-terminal en tampón acetato de sodio 50 mM pH 4,5. Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Grb2-SH2-hidrazida C-terminal (carril 2). Reacción entre Grb2-SH2-hidrazida C-terminal y CH_{3}COCO-Lys(F1) en los puntos de tiempo t = 4 h (carril 3), t = 24 h (carril 4), t = 48 h (carril 5).

La Figura 13 ilustra un análisis de SDS-PAGE de la reacción entre CH_{3}COCO-Lys(F1) y Citocromo C en tampón acetato de sodio 100 mM a pH 4,5. Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Citocromo C (carril 2). Reacción entre Citocromo C y CH_{3}COCO-Lys(F1) en los puntos de tiempo t = 4 h (carril 3), t = 24 h (carril 4), t = 48 h (carril 5).

La Figura 14 ilustra un análisis de SDS-PAGE de la reacción de CH_{3}COCO-Lys(F1) con Grb2-SH2-hidrazida C-terminal y con Citocromo C en tampón acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. (A) Tinción de proteína total del gel. Antes de esta tinción con coomassie (A), el gel se sometió a formación de imágenes para fluorescencia verde (B). Marcadores de pesos moleculares (carril 1); Grb2-SH2-hidrazida C-terminal (carril 2); reacción entre Grb2-SH2-hidrazida C-terminal y CH_{3}COCO-Lys(F1) en los puntos de tiempo t = 4 h (carril 3), t = 24 h (carril 4), t = 48 h (carril 5). Citocromo C (carril 6); reacción entre Citocromo C y CH_{3}COCOLys(F1) en los puntos de tiempo t = 4 h (carril 7), t = 24 h (carril 8) y t = 48 h (carriles 9).

La Figura 15 muestra un análisis de SDS-PAGE de la reacción entre CH_{3}COCO-Lys(F1) y Grb2-SH2-hidrazida C-terminal en acetonitrilo acuoso al 40% que contiene TFA al 0,1%; reacción después de 4 h (carril 1), 24 h (carril 2), 48 h (carril 3), Grb2-SH2-hidrazida C-terminal (carril 4).

\global\parskip0.900000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Ligación de proteínas/marcaje de proteínas específico de sitio usando la reacción de tioésteres de péptidos/proteínas con compuestos que contienen funcionalidades hidrazinalhidrazida o aminooxi A) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidrazina 100 mM a pH 6,0

Se añadió tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 6,0 que contenía hidrazina monohidrato 100 mM (200 \mul) a un péptido sintético modelo con tioéster C-terminal denominado AS626p1A (200 \mug) para dar una concentración final de péptido de 317 \muM. El AS626p1A tiene la secuencia ARTKQ TARK(Me)3 STGGKAPRKQ LATKAARK-COS-(CH_{2})_{2}-COOC_{2}H_{5} (SEC ID Nº: 1), en la que un solo resto de alanina (que puede ser uno cualquiera de los restos de alanina de la SEC ID Nº: 1) se sustituye por un resto de arginina. La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló en el tiempo mediante HPLC analítica de fase inversa. Columna Vydac C18 (5 \muM, 0,46 x 25 cm). Se usaron gradientes lineales de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1% para eluir los péptidos a un caudal de 1 ml min^{-1}. Los péptidos individuales que se eluían de la columna se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

B) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidroxilamina 100 mM a pH 6,0

Se añadió tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 6,0 que contenía hidroxilamina 100 mM en cloruro de hidrógeno (200 \mul) a AS626p1A (200 \mug) para dar una concentración final de péptido de 317 \muM. La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló en el tiempo mediante HPLC analítica de fase inversa. Columna Vydac C18 (5 \muM, 0,46 x 25 cm). Se usaron gradientes lineales de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1% para eluir los péptidos a un caudal de 1 ml min^{-1}. Los péptidos individuales que se eluían de la columna se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

C) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidroxilamina 100 mM a pH 6, 8

Se añadió tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 6,8 que contenía hidroxilamina 100 mM en cloruro de hidrógeno (200 \mul) a AS626p1A (200 \mug) para dar una concentración final de péptido de 317 \muM. La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló en el tiempo mediante HPLC analítica de fase inversa. Columna Vydac C18 (5 \muM, 0,46 x 25 cm). Se usaron gradientes lineales de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1% para eluir los péptidos a un caudal de 1 ml min^{-1}. Los péptidos individuales que se eluían de la columna se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

D) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidroxilamina 10 mM a pH 6,8

Se repitió el procedimiento como se ha descrito en C), sustituyendo la hidroxilamina 100 mM con hidroxilamina 10 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

E) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidroxilamina 10 mM a pH 7, 5

Se repitió el procedimiento como se describe en D) a pH 7,5.

\vskip1.000000\baselineskip

F) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con hidroxilamina 2 mM a pH 7, 5

Se repitió el procedimiento como se describe en E) sustituyendo la hidroxilamina 10 mM con hidroxilamina 2 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

G) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con O-metilhidroxilamina (NH_{2}-O-CH_{3}) 100 mM a pH 7, 5

Se añadió tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 7,5 que contenía O-metilhidroxilamina 100 mM (200 \mul) al péptido sintético con tioéster C-terminal AS626p1A (200 \mug) para dar una concentración final de péptido de 317 \muM. La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló en el tiempo mediante HPLC analítica de fase inversa. Columna Vydac C18 (5 \muM, 0,46 x 25 cm). Se usaron gradientes lineales de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1% para eluir los péptidos a un caudal de 1 ml min^{-1}. Los péptidos individuales que se eluían de la columna se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip1.000000\baselineskip

H) Reacción de un tioéster C-terminal de un péptido con O-metilhidroxilamina 10 mM a pH 7, 5

Se repitió el procedimiento como se ha descrito en G), sustituyendo la O-metilhidroxilamina 100 mM con O-metilhidroxilamina 10 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

I) Reacción de un tioéster C-terminal de una proteína recombinante con O-metilhidroxilamina 100 mM a pH 7, 5

El derivado de tioéster del ácido mercaptoetanosulfónico C-terminal de Grb2-SH2 recombinante se generó por escisión de la proteína de fusión Grb2-SH2-inteína de GyrA-CBD como se describe en el Ejemplo 2 a continuación. Esta proteína recombinante con tioéster C-terminal (100 \mug) se hizo reaccionar con O-metilhidroxilamina 100 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 7,5 (200 \mul). La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló en el tiempo mediante HPLC analítica de fase inversa. Columna Vydac C5 (5 \muM, 0,46 x 25 cm). Se usaron gradientes lineales de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1% para eluir los péptidos a un caudal de 1 ml min^{-1}. Los péptidos individuales que se eluían de la columna se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados

Estos ejemplos demuestran la nueva estrategia para ligación de proteínas/marcaje de proteínas específico de sitio de secuencias proteicas de la invención tanto sintéticas como recombinantes usando la reacción de tioésteres C-terminales de péptidos/proteínas con compuestos que contienen funcionalidades hidrazina/hidrazida o aminooxi.

Como se ha descrito anteriormente, se trató un péptido sintético purificado de 27 aminoácidos con tioéster C-terminal (el derivado de tioéster de 3-mercaptopropionato de etilo) con hidrazina e hidroxilamina en diversas condiciones (Tabla 1).

El tratamiento con hidrazina 100 mM a pH 6,0 formaba una especie peptídica que se eluía antes que el péptido con tioéster de partida cuando se analizaba mediante HPLC. Este material se identificó como la hidrazida del péptido esperada mediante ESMS: masa observada = 3054 Da, esperada (promedio comp. de isótopos) 3054 Da. La reacción del tioéster C-terminal de un péptido con hidrazina para formar la hidrazida del péptido se controló en el tiempo mediante HPLC de fase inversa. Solamente se formó el material deseado, sin formación de productos secundarios aun después de 3 días. La estabilidad de la hidrazida del péptido, en las condiciones de reacción, indica que la reacción se produce en el resto tioéster C-terminal y es quimioselectiva por naturaleza. También destaca la aplicabilidad de esta reacción para ligación y marcaje de proteínas (2 h conversión del 70%, 4h conversión >95%).

Para determinar si los compuestos que contienen aminooxi reaccionan quimioselectivamente con tioésteres C-terminales de péptidos/proteínas, para dar la ligación de proteínas y el marcaje específico de sitio, se trató un péptido sintético con tioéster C-terminal con hidroxilamina en diversas condiciones (Tabla 1).

Se incubó un péptido sintético purificado de 27 aminoácidos con tioéster C-terminal (tioéster de 3-mercaptopropionato de etilo, masa observada 3155 Da) a temperatura ambiente con diferentes concentraciones de hidroxilamina en tampones acuosos de pH variable. En todos los casos, el tioéster C-terminal del péptido reaccionaba para formar un solo producto que se eluía antes que el péptido con tioéster de partida, cuando se analizaba mediante HPLC de fase inversa. Este material corresponde al péptido con ácido hidroxámico esperado, como se determinó mediante ESMS: masa observada = 3052 Da, esperada (promedio comp. de isótopos) 3054 Da. La cinética de la reacción se controló usando HPLC de fase inversa. El tioéster C-terminal del péptido se convirtió en el ácido hidroxámico de péptido correspondiente de una forma limpia sin formación de productos secundarios. El aumento del pH del tampón de reacción aceleraba la velocidad de reacción. Por ejemplo, con una concentración de NH_{2}OH 100 mM, que se desplaza de pH 6,0 a pH 6,8, el porcentaje de formación de producto después de 1 h aumentaba del 25% al 91%. La velocidad de reacción con NH_{2}OH 100 mM a pH 6,0 era comparable a con NH_{2}OH 10 mM a pH 6,8.

La velocidad de reacción del tioéster C-terminal del péptido con hidroxilamina para formar el ácido hidroxámico correspondiente aumenta con un pH creciente y disminuye con concentraciones de NH_{2}OH decrecientes. Para identificar condiciones de pH y una concentración de reactivo adecuadas para el marcaje y la ligación de péptidos/proteínas, el marcaje se realizó en un pH creciente y concentraciones de NH_{2}OH decrecientes.

La reacción con NH_{2}OH 10 mM se había completado el 83% después de 4 h a pH 6,8, mientras que a pH 7,5 se había completado el 83% después de 2 h. Al disminuir adicionalmente la concentración de NH_{2}OH hasta 2 mM, la velocidad de reacción a pH 7,5 disminuía notablemente, convirtiéndose el 70% del \alpha-tioéster de péptido de partida en el ácido hidroxámico correspondiente después de 8 h. Se observó que se formaba durante la reacción una pequeña cantidad de un producto secundario que se correspondía en masa al ácido del péptido. Presumiblemente, éste se formaba por una reacción secundario de hidrólisis competitiva a pH 7,5, que no se observó con NH_{2}OH 10 mM a pH 7,5 debido a mayor rapidez de la reacción a esta concentración superior de reactivo.

TABLA 1

5

Para investigar adicionalmente la reacción quimioselectiva de compuestos que contienen aminooxi con tioésteres C-terminales de péptidos/proteínas, para dar la ligación de proteínas y el marcaje específico de sitio, el péptido sintético con tioéster C-terminal AS626p1 se trató con O-metilhidroxilamina.

El péptido sintético purificado de 27 aminoácidos con tioéster C-terminal (tioéster de 3-mercatopropionato de etilo, masa observada 3155 Da) se incubó a temperatura ambiente con O-metilhidroxilamina 100 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 7,5. El tioéster C-terminal del péptido reaccionó para formar un solo producto que se eluía antes que el péptido con tioéster de partida, cuando se analizaba mediante HPLC de fase inversa. Este material correspondía a la N-metoxi amida del péptido esperada, como se determinaba mediante ESMS: masa observada = 3070 Da, masa esperada 3068 Da. La cinética de la reacción se controló usando HPLC de fase inversa (Tabla II). El tioéster C-terminal del péptido se convirtió en el derivado de N-metoxi amida del péptido correspondiente de una forma limpia sin formación de productos secundarios, completándose el 75% de la reacción después de 24 h. En estas condiciones, no se observó hidrólisis del tioéster.

TABLA II

6

Cuando la reacción se repitió en las mismas condiciones pero con O-metilhidroxilamina 10 mM sustituyendo a la O-metilhidroxilamina 100 mM, la velocidad de reacción era menor. Sin embargo, después de 72 h, el 88% del péptido con tioéster C-terminal de partida había reaccionado. En estas condiciones, se observó formación de producto secundario, además de la formación del producto de reacción deseado. Aun así, después de 72 h, se estimaba que el 30-40% del producto de reacción era el producto de la reacción de ligación deseado (N-metoxi amida del péptido) a partir del análisis de HPLC de la mezcla de reacción.

También se investigó la reacción de O-metilhidroxilamina con proteínas recombinantes con tioéster C-terminal. Se generó Grb2-SH2 recombinante como el derivado de tioéster del ácido mercaptoetanosulfónico C-terminal por escisión mediada por tiol de la proteína de fusión Grb2-SH2-inteína de GyrA-CBD, como se describe en el Ejemplo 2. Esta proteína recombinante con tioéster C-terminal se hizo reaccionar con O-metilhidroxilamina 100 mM a pH 7,5. El análisis de la mezcla de reacción después de 18 h mediante HPLC y ESMS demostraba que toda la proteína con tioéster C-terminal se había convertido completamente en dos especies proteicas. Estos dos derivados proteicos se correspondían con el producto de la reacción de ligación deseado, en concreto la N-metoxi amida C-terminal de Grb2-SH2 (masa esperada 12067 Da; masa observada 12067 Da) y una forma oxidada del producto de reacción deseado (masa observada 12084 Da). No se observaron productos secundarios correspondientes a la hidrólisis del tioéster C-terminal de la proteína. Por lo tanto, toda la proteína recombinante con tioéster C-terminal se había ligado quimioselectivamente con O-hidroxilamina mediante un una reacción de formación de enlaces amida específicamente en el extremo C-terminal de la proteína, es decir, la reacción proporcionaba el marcaje C-terminal específico de sitio de la proteína recombinante.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Generación de proteína Grb2-SH2 recombinante con hidrazida C-terminal

Para investigar (i) la capacidad para generar proteínas recombinantes con hidrazida C-terminal mediante la escisión selectiva de fusiones de proteína-inteína con hidrazina, y (ii) su uso posterior en reacciones de ligación/marcaje, se seleccionó el dominio SH2 de la proteína adaptadora Grb2 como sistema de modelo.

Secuencia del dominio SH2 de Grb2 humana

100

Expresión de fusión de Grb2-dominio SH2-inteína de GyrA

La secuencia de ADN que codifica el dominio SH2 de la Grb2 humana que tiene añadido en su extremo C-terminal un resto de glicina extra se clonó en el plásmido de expresión pTXB1 (NEB). Este vector pTXB1_{Grb2-SH2(Gly)} codifica una proteína de fusión por la que el dominio SH2 de Grb2 se une mediante un resto de glicina al extremo N-terminal de la inteína de GyrA, que a su vez está fusionada con el extremo N-terminal de una región de dominio de unión a quitina (CBD). Se transformaron células de E. coli con este plásmido y se cultivaron en medio LB hasta una fase semilogarítmica y se indujo la expresión de proteína durante 4 h a 37ºC con IPTG 0,5 mM. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en tampón de tisis (EDTA 0,1 mM, NaCl 250 mM, glicerol al 5%, PMSF 1 mM, HEPES 25 mM, pH 7,4) y se lisaron por sonicación. La fracción soluble se cargó en una columna de quitina previamente equilibrada en tampón de tisis. Después, la columna se lavó con tampón de lavado (EDTA 1 mM, NaCl 250 mM, Triton-X 100 al 0,1%, HEPES 25 mM, pH 7,0) para dar Grb2-SHS-GyrA-CBD purificada inmovilizada sobre perlas de quitina (Figura 7).

Generación de tioésteres C-terminales de Grb2-SH2 por escisión inducida con tiol de la fusión de Grb2-SH2-inteína de GyrA

Para determinar que el dominio de inteína dentro de la proteína era funcional, la proteína de fusión se expuso a tioles para evaluar el grado de escisión mediante transtioesterificación. Se equilibraron perlas de quitina que contenían Grb2-SH2-GyrA-CBD inmovilizada en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM a pH 7,4. Después, se añadió ditiotreitol (DTT) o ácido 2-mercaptoetanosulfónico (MESNA) a las perlas en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM pH 7,4 para dar una suspensión al 50% con una concentración final de tiol de 100 mM o 120 mM, respectivamente. Después, las mezclas se agitaron por balanceo a temperatura ambiente y se analizaron alícuotas mediante SDS-PAGE. Después de 48 horas se aislaron los sobrenadantes de las reacciones y posteriormente se analizaron mediante HPLC y ESMS.

El tratamiento de la fusión de Grb2-SH2-inteína de GyrA-CBD tanto con DTT como con MESNA dio como resultado la escisión de la proteína de fusión en dos especies proteicas (Figura 7). El tamaño molecular de los dos fragmentos se corresponde con el de la fusión de Grb2-SH2 y la inteína de GyrA, indicativo de que la escisión había tenido lugar en la unión SH2-inteína. La escisión de la proteína de fusión precursora liberaba el dominio SH2 al sobrenadante, mientras que la porción de inteína de GyrA-CBD permanecía inmovilizada sobre las perlas de quitina. Después de la escisión tanto con DTT como con MESNA, el análisis de ESMS de los sobrenadantes confirmó que se generaba Grb2-SH2 como los derivados de tioésteres de DTT o MESNA C-terminales esperados, respectivamente.

Masa esperada del tioéster de DTT C-terminal de Grb2-SH2 = 12173,9 Da; masa observada 12173,5 Da. Masa esperada del tioéster de MESNA C-terminal de Grb2-SH2 = 12162,0 Da; masa observada 12163,0 Da.

Generación de hidrazida C-terminal de Grb2-SH2 por escisión inducida con hidrazina de la fusión de Grb2-SH2-inteína de GyrA

Los inventores formularon la hipótesis de que el enlace tioéster entre Grb2-SH2 y la inteína de GyrA en la proteína de fusión precursora se escindía con hidrazina. La reacción quimioselectiva de hidrazina en el resto tioéster que une la Grb2-SH2 a la inteína liberaría el dominio Grb2-SH2 en el sobrenadante como su derivado de hidrazida C-terminal correspondiente. Por lo tanto, se equilibraron perlas de quitina que contenían Grb2-SH2-GyrA-CBD inmovilizada en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM a pH 7,4 y se añadió hidrazina monohidrato en el mismo tampón para dar una suspensión al 50% con una concentración final de hidrazina de 200 mM. Después, la mezcla se agitó por balanceo a temperatura ambiente y se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 8). Después de 20 horas, se retiró el sobrenadante y se analizó mediante HPLC y ESMS.

El tratamiento de la fusión de Grb2-SH2-inteína de GyrA-CBD con hidrazina dio como resultado la escisión de la proteína de fusión en dos especies. El tamaño molecular de los dos fragmentos se correspondía, cuando se analizó mediante SDS-PAGE, con la fusión de Grb2-SH2 y la inteína de GyrA, indicativo de que la escisión había tenido lugar en el enlace tioéster único entre los dominios SH2 e inteína. La escisión de la proteína de fusión precursora liberaba el dominio SH2 al sobrenadante, mientras que la porción de inteína de GyrA-CBD permanecía inmovilizada sobre las perlas de quitina. El análisis de HPLC y ESMS del sobrenadante de la escisión confirmó que se generaba una sola especie proteica que se correspondía con el derivado de hidrazida C-terminal de Grb2-SH2. Masa esperada de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal = 12051,7 Da; masa observada 12053,0 Da (Figura 9).

Después de 20 h de reacción se aisló la Grb2-SHS2-hidrazida C-terminal del sobrenadante (i) usando RPHPLC seguida de liofilización o (ii) por filtración en gel. En este último enfoque, la solución de reacción de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal se cargó en una columna peptídica superdex (Amersham Biosciences) y se eluyó con un tampón de procesamiento de acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Esto daba una solución de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal purificada en acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Esta solución se concentró usando un filtro centricon (3000 MWCO), después se congeló instantáneamente y se almacenó a -20ºC hasta el uso.

Se trató una muestra de la Grb2-SHS2-hidrazida C-terminal purificada y liofilizada (100 \mug) con la proteasa Lys-C (5 µg) en tampón bicarbonato de amonio 100 mM a pH 8,2 (100 µl). Después de incubar a 30ºC durante una noche, la reacción se liofilizó y se analizó mediante espectrometría de masas de MALDI. La masa observada del fragmento proteolítico C-terminal (FNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIEQVPQQPTG) se corresponde con la del derivado de hidrazida C-terminal deseado (masa esperada del fragmento proteolítico de hidrazida C-terminal 4229 Da; masa observada 4231 Da).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Generación de proteína de unión a maltosa recombinante con hidrazida C-terminal

Como una demostración adicional del enfoque descrito, para generar proteínas recombinantes con hidrazida C-terminal mediante la escisión selectiva de fusiones de proteína-inteína con hidrazina, se investigó la generación del derivado de hidrazida C-terminal de la proteína de unión a maltosa (MBP). Secuencia de la MBP humana usada

7

Expresión de la fusión de MBP-inteína de VMA de Sce

El vector de expresión pMYB5 (New England Biolabs) codifica una proteína de fusión que comprende proteína de unión a maltosa (secuencia anterior) fusionada N-terminalmente con la inteína de VMA de Sce, que a su vez está fusionada con el extremo N-terminal de un dominio de unión a quitina (CBD) para facilitar la purificación.

Se transformaron células de E. coli con este plásmido y se cultivaron en medio LB hasta una fase semilogarítmica y se indujo la expresión de proteína durante 4 h a 37ºC con IPTG 0,5 mM. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en tampón de tisis (EDTA 0,1 mM, NaCl 250 mM, glicerol al 5%, PMSF 1 mM, HEPES 25 mM, pH 7,4) y se lisaron por sonicación. La fracción soluble se cargó en una columna de quitina previamente equilibrada en tampón de lisis. Después, la columna se lavó con tampón de lavado (EDTA 1 mM, NaCl 250 mM, Triton-X 100 al 0,1%, HEPES 25 mM, pH 7,0) para dar la proteína de fusión purificada (MBP-VMA-CBD) inmovilizada sobre perlas de quitina.

Generación de tioésteres C-terminales de MBP mediante escisión inducida con tiol de la proteína de fusión MBP-inteína de VMA

Para determinar que el dominio de inteina dentro de MBP-VMA-CBD era funcional, la proteína de fusión se expuso a ácido 2-mercaptoetanosulfónico (MESNA) para evaluar el grado de escisión mediante transtioesterificación. Se equilibraron perlas de quitina que contenían MBP-VMA-CBD inmovilizada en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM a pH 7,4. Después, se añadió MESNA a las perlas en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM, pH 7,4 para dar una suspensión al 50% con una concentración final de tiol de 120 mM. Después, la mezcla se agitó por balance a temperatura ambiente y se analizaron alícuotas mediante SDS-PAGE. Después de 48 horas, se aislaron los sobrenadantes de las reacciones y posteriormente se analizaron mediante HPLC y ESMS.

El tratamiento de la fusión de MBP-VMA-CBD con MESNA da como resultado la escisión de la proteína de fusión en dos especies proteicas. El tamaño molecular de los dos fragmentos se corresponde con el de la MBP y la porción VMA-CBD, indicativo de que la escisión había tenido lugar en la unión MBP-inteína de VMA. La escisión de la proteína de fusión precursora libera MBP al sobrenadante, mientras que la porción VMA-CBD permanece inmovilizada sobre las perlas de quitina. Esto se confirmó mediante análisis de ESMS del sobrenadante de escisión, que contenía una especie proteica. La masa esperada del tioéster de MESNA C-terminal de MBP = 43064 Da; masa observada 43098 Da.

Generación de hidrazida C-terminal de MBP por escisión inducida con hidrazina de la proteína de fusión de MBP-inteína de VMA

Se equilibraron perlas de quitina que contenían MBP-VMA-CBD inmovilizadas en NaCl 200 mM, tampón fosfato 200 mM a pH 7,4 y se añadió hidrazina monohidrato en el mismo tampón para dar una suspensión al 50% con una concentración final de hidrazina de 200 mM. Después, la mezcla se agitó por balanceo a temperatura ambiente y se analizó mediante SDS-PAGE y mediante HPLC y ESMS.

Después de 20 h de reacción, se aisló la hidrazida C-terminal de MBP del sobrenadante (i) usando RPHPLC seguida de liofilización o (ii) por filtración en gel. En este último enfoque, la solución de reacción de MBP-hidrazida C-terminal se cargó en una columna peptídica superdex (Amersham Biosciences) y se eluyó con un tampón de procesamiento de tampón acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Esto daba una solución de MBP-hidrazida C-terminal purificada en tampón acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Esta solución de proteína se concentró usando un filtro centricon (3000 MWCO), después se congeló instantáneamente y se almacenó a -20ºC hasta el uso.

El tratamiento de la fusión de MBP-VMA-CBD con hidrazina da como resultado la escisión de la proteína de fusión en dos especies. El tamaño molecular de los dos fragmentos cuando se analizó mediante SDS-PAGE se corresponde con MBP y la porción VMA-CBD, indicativo de que la escisión había tenido lugar en el enlace tioéster único entre la MBP-dominio de inteína de VMA. La escisión de la proteína de fusión precursora libera MBP al sobrenadante, mientras que la porción VMA-CBD permanece inmovilizada sobre las perlas de quitina. El análisis de HPLC-ESMS del sobrenadante de escisión confirma que se genera una sola especie proteica con una masa observada de 42988 Da. La diferencia de masa esperada entre el derivado de tioéster de MESNA C-terminal de una proteína y su hidrazida C-terminal correspondiente es de 111 Da. Se descubrió que la masa observada del tioéster de MESNA C-terminal de MBP era de 43098 Da. Por lo tanto, el producto de la escisión con hidrazina de MBP-VMA-CBD es 110 Da de menor tamaño, indicando que se había formado el derivado de hidrazida C-terminal deseado de MBP.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Ligación de péptidos y marcadores que contienen aldehído y cetona con proteínas recombinantes que contienen hidrazida C-terminal: Ligación de un péptido sintético c-myc con el dominio SH2 de Grb2 recombinante

Los inventores formularon la hipótesis de que las hidrazidas C-terminales de proteínas recombinantes, generadas por tratamiento con hidrazina del precursor de fusión con inteína correspondiente, pueden modificarse de forma específica de sitio mediante ligación quimioselectiva con péptidos y marcadores que contienen aldehído y cetona. Para demostrar dicho enfoque, se investigó la capacidad de un péptido sintético que contenía cetona para ligarse con la hidrazida C-terminal de Grb2-SH2 generada anteriormente. Se sintetizó un péptido sintético que se correspondía con la secuencia del epítopo c-myc GEQKLISEEDL-NH_{2}, por lo que se acopló ácido pirúvico en el extremo amino-terminal del péptido como la última etapa del ensamblaje. Este péptido (denominado CH_{3}COCO-myc) se purificó hasta una pureza >95% mediante RPHPLC y se liofilizó (masa monoisotópica esperada por ESMS 1328,6 Da; masa observada 1328,6 Da).

Se disolvió una muestra de péptido CH_{3}COCO-myc en tampón acetato de sodio 100 mM a pH 4,5 para dar una concentración de péptido de 4 mM. Esta solución de péptido (100 \mul) se añadió después a una alícuota de proteína Grb2-SH2-hidrazida C-terminal liofilizada (-250 \mug) y la reacción se controló mediante SDS-PAGE (Figura 10). Como control, también se incubó CH_{3}COCO-myc con Citrocromo C, una proteína tamaño igual similar a Grb2-SH2 pero carente de una funcionalidad hidrazida.

El análisis de SDS-PAGE muestra que el péptido CH_{3}COCO-myc se había ligado de hecho con la hidrazida C-terminal de Grb2-SH2, como se indicaba mediante la conversión de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal en una especie proteica de un peso molecular superior (aproximadamente 1000-2000 Da superior). La reacción prácticamente se completa después de 24 h y el producto de reacción parece ser estable. Por otro lado, no había cambios observables en el Citocromo C a lo largo del tiempo, es decir, ninguna ligación, estableciendo que la reacción de ligación estaba dándose en la funcionalidad hidrazida C-terminal de la Grb2-SH2.

Después de 96 h de reacción, el producto de la reacción de ligación de Grb2-SH2 se aisló mediante HPLC y se caracterizó mediante ESMS. La ligación quimioselectiva de CH_{3}COCO-myc con Grb2-SH2-hidrazida C-terminal mediante formación de un enlace hidrazona daría un producto de una masa esperada de 13363,7 Da. La masa de producto observada era de 13364,1 Da, indicando que se había formado el producto de ligación deseado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Ligación de péptidos y marcadores que contienen aldehído y cetona con proteínas recombinantes que contienen hidrazida C-terminal: Marcaje con fluoresceína de Grb2-SH2

En este ejemplo, el derivado de hidrazida C-terminal de Grb2-SH2 recombinante, generado por escisión con hidrazina de la proteína de fusión con inteína precursora, se hizo reaccionar con un derivado de fluoresceína que contenía cetona para proporcionar un marcaje fluorescente específico de sitio de la proteína.

Para facilitar el marcaje fluorescente de proteínas recombinantes con hidrazida C-terminal usando el enfoque descrito, el fluoróforo debe contener el grupo reactivo apropiado para la ligación, en concreto una funcionalidad aldehído o cetona. Con este fin, se sintetizó un derivado de fluoresceína que contenía un resto piruvoílo. Inicialmente, se acopló Fmoc-Lys(Mtt)-OH con una resina de Rink-amida y el grupo Mtt se eliminó usando procedimientos convencionales (TFA al 1%, triisopropilsilano al 4% en diclorometano). Después se acopló 5(6)-carboxifluoresceína con el grupo \varepsilon-amino de lisina. Después, se eliminó el grupo Fmoc y se acopló ácido pirúvico con el grupo \alpha-amino libre de la lisina. Después de la escisión de la resina, el derivado de fluoresceína deseado [denominado CH_{3}COCO-Lys(F1), véase la Figura 11] se purificó hasta una pureza de >95% mediante RPHPLC y se Iiofilizó (ESMS, masa monoisotópica esperada 576,2 Da; masa monoisotópica observada 576,0 Da).

Para establecer la reactividad de CH_{3}COCO-Lys(F1) con péptidos y proteínas con hidrazida C-terminal, se investigó la reacción de CH_{3}COCO-Lys(F1) con un péptido sintético pequeño con hidrazida C-terminal SLAYG-NHNH_{2}. Se codisolvió una muestra de CH_{3}COCO-Lys(F1) y péptido SLAYG-NHNH_{2} en tampón acetato de sodio 100 mM a pH 4,5 para dar concentraciones finales de 0,3 mM y 2 mM, respectivamente. Después de una incubación de 20 h a temperatura ambiente, la reacción se consideró completa, como se determinó mediante análisis de RPHPLC. Todo el CH_{3}COCO-Lys(F1) de partida había reaccionado para dar predominantemente un solo producto. La masa del mismo se corresponde con el producto de ligación deseado, en concreto conjugación de los dos reactivos mediante formación de enlaces hidrazona (masa monoisotópica esperada por ESMS 1079 Da; masa observada
1080 Da).

Habiendo establecido la reacción específica de CH_{3}COCO-Lys(F1) con péptidos que contienen hidrazida, se usó este derivado de fluoresceína para el marcaje específico de sitio de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal recombinante (generada por escisión con hidrazina de Grb2 SH2-GyrA-CBD).

Se emplearon dos métodos complementarios para la purificación de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal a partir de la reacción de escisión de la proteína de fusión (Ejemplo 2). La proteína purificada se aisló como un sólido liofilizado o en una solución de tampón acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Se seleccionó este último sistema tampón ya que el pH es apropiado para reacciones de formación de enlaces hidrazona. Se añadió directamente una alícuota de de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal en acetato de sodio 50 mM a pH 4,5 (250 \mug, 200 \mul) a una muestra de CH_{3}COCO-Lys(F1) para dar una concentración final de fluoróforo de aproximadamente 0,3 mM. La reacción se incubó a temperatura ambiente y se controló mediante SDS-PAGE. Como control también se incubó CH_{3}COCO-Lys(F1) en las mismas condiciones con Citrocromo-C, una proteína de un tamaño igual similar a Grb2-SH2 pero carente de una funcionalidad hidrazida.

El análisis de SDS-PAGE muestra que el CH_{3}COCO-Lys(F1) se había ligado de hecho con la hidrazida C-terminal de Grb2-SH2 (Figura 12), como se indicada por la conversión de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal en una sola especia proteica con un aumento aparente en el peso molecular (aproximadamente 1000-2000 Da superior). Después del análisis de SDS-PAGE de las reacciones, la formación de imágenes de fluorescencia del gel confirmó que el producto de reacción recién formado contiene un marcador de fluoresceína y que la reacción es limpia, formándose solamente un único producto de proteína fluorescente (Figura 14). La reacción se había completado prácticamente después de 24 h y el producto de reacción parece ser estable en estas condiciones.

Por otro lado, no había cambios observables en el Citocromo C a lo largo del curso de tiempo del experimento, es decir, ninguna ligación (Figura 13), con una ausencia completa de la formación de cualquier producto proteico fluorescente (Figura 14). Estableciendo por lo tanto que la reacción de ligación se estaba dando en la funcionalidad hidrazida C-terminal de la Grb2-SH2, para proporcionar el marcaje fluorescente C-terminal específico de sitio de la proteína recombinante. Después de 48 h de reacción, el producto de la reacción de ligación con Grb2-SH2 se aisló mediante HPLC. La masa de este producto, mediante ESMS, confirmaba la adición de un grupo fluoresceína a la proteína.

En otro ejemplo, la Grb2-SH2-hidrazida C-terminal liofilizada se disolvía directamente en acetato de sodio 100 mM a pH 4,5 y se añadía a CH_{3}COCO-Lys(F1). Aunque se observaba cierta precipitación de proteína, la fracción soluble de la proteína reaccionaba con CH_{3}COCO-Lys(F1) de la forma esperada descrita anteriormente.

En una estrategia alternativa, se disolvió una muestra liofilizada de Grb2-SH2-hidrazida C-terminal (250 \mug) en acetonitrilo acuoso al 40% que contenía TFA al 0,1% (200 µl). Después, esta solución se añadió a una muestra de CH_{3}COCO-Lys(F1) para dar una concentración final de fluoróforo de aproximadamente 0,3 mM. La solución se incubó a temperatura ambiente y la reacción se analizó periódicamente. El análisis de SDS-PAGE mostraba que la reacción de marcaje se había producido limpia y rápidamente en estas condiciones (Figura 15). La Grb2-SH2-hidrazida C-terminal se convirtió en una sola especie proteica con un peso molecular aumentado aparente esperado para el producto deseado, y esta proteína recién formada era verde fluorescente cuando se visualizaba bajo una lámpara UV. La ESMS del producto de reacción confirmó que se había añadido una molécula de fluoresceína a la proteína. La reacción se había completado prácticamente después de 4 h, pareciendo ser perjudicial una incubación prolongada para la formación del producto de ligación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Ligación de péptidos y marcadores que contienen aldehído y cetona con proteínas recombinantes que contienen hidrazida C-terminal: Marcaje con fluoresceína de MBP

Como un ejemplo adicional, se usó el enfoque descrito para el marcaje C-terminal específico de sitio de MBP con fluoresceína. Una muestra (250 \mug) de MBP-hidrazida C-terminal recombinante liofilizada (generada por escisión con hidrazina de la proteína de fusión precursora BMP-VMA-CBD) se disolvió en acetonitrilo acuoso al 40% que contenía TFA al 0,1% (200 A. Después, la solución se añadió a una muestra de CH_{3}COCO-Lys(F1) para una dar una concentración final de fluoróforo de aproximadamente 0,3 mM. Después, la reacción se incubó a temperatura ambiente y se analizó periódicamente mediante SDS-PAGE.

El análisis de SDS-PAGE mostraba que la reacción de marcaje con fluoresceína se había producido en estas condiciones, como indicaba la formación de una sola especie verde fluorescente con un peso molecular de aproximadamente 42 KDa. El análisis de MALDI 'de la mezcla de reacción después de 48 h concordaba con la adición de una molécula de fluoresceína a MBP.

En resumen, la presente invención proporciona nuevos métodos de ligación de proteínas y marcaje de proteínas. Estos permiten que se unan eficazmente entre sí fragmentos proteicos tanto sintéticos como obtenidos de forma recombinante de una forma regioselectiva. Por lo tanto, esto permite que se construyan proteínas de gran tamaño a partir de combinaciones de fragmentos sintéticos y recombinantes y permite que se modifiquen de forma específica de sitio proteínas de cualquier tamaño de una forma sin precedentes. Esto es de una gran importancia para las ciencias biológicas y biomédicas y el descubrimiento de fármacos cuando se consideran que los -30.000 genes humanos producen cientos de miles de especies proteicas diferentes por modificación postraduccional. Dichas proteínas modificadas postraduccionalmente no pueden conseguirse mediante las tecnologías recombinantes actuales.

La aplicación de dichas técnicas de ligación de proteínas puede usarse para herramientas basadas en proteínas, agentes terapéuticos proteicos y en el diseño de novo y pueden abrir muchas vías nuevas en las ciencias biológicas y biomédicas que hasta ahora no han sido posibles.

Diversas modificaciones y variaciones de las realizaciones descritas de las invenciones serán evidentes para los especialistas en la técnica. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debería entenderse que la invención que se reivindica no debería limitarse excesivamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son evidentes para los especialistas en la técnica estén incluidas en la presente invención.

Claims (24)

1. Un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primero oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi;

b)

proporcionar un segundo oligopéptido, teniendo el segundo oligopéptido un resto éster activado, en el que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto O-acilisourea; c) permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con el resto éster activado del segundo oligopéptido para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

8

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto éster activado terminal es un tioéster en el que el péptido es el sustituyente acilo del tioéster.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho segundo polipéptido se genera por escisión dependiente de reactivo tiol de una molécula precursora, comprendiendo dicha molécula precursora un segundo oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que el resto reactivo es un resto aminooxi y el resto éster activado es un tioéster.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho primer oligopéptido se produce por reacción de hidrazina con una molécula precursora, comprendiendo dicha molécula precursora un oligopéptido precursor fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína mediante un resto tioéster.

6. Un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primer oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto amino-oxi;

(b)

proporcionar una molécula oligopeptidica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptidica precursora un segundo oligopéptido fusionado N- terminalmente con un dominio de inteína;

c)

permitir que el resto reactivo del primer oligopéptido reaccione con la molécula oligopeptidica precursora para formar un producto oligopeptidico, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer oligopéptido o el segundo oligopéptido es un oligopéptido recombinante, y el otro del primer oligopéptido y del segundo oligopéptido es un polipéptido sintético.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer oligopéptido y el segundo oligopéptido son oligopéptidos recombinantes.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer oligopéptido y el segundo oligopéptido son oligopéptidos sintéticos.

10 Un método para generar una hidrazida de una proteína, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

proporcionar una molécula proteica que comprende un oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

(b)

hacer reaccionar dicha molécula proteica con hidrazina, de modo que el dominio de inteína se escinde del oligopéptido para generar una hidrazida de la proteína.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa (c) del método se realiza a un pH en el intervalo de pH 6,5 a 7,5.

12. Un método para producir un producto oligopeptídico, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un primer oligopéptido, teniendo el primer oligopéptido un resto aldehído o cetona,

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un segundo oligopéptido fusionado N- terminalmente con un dominio de inteína,

c)

hacer reaccionar dicha molécula oligopeptídica precursora con hidrazina para generar una molécula oligopeptídica que comprende un oligopéptido intermedio, teniendo dicho oligopéptido intermedio un resto hidrazida terminal,

d)

permitir que el resto aldehído o cetona del primer oligopéptido reaccione con el resto hidrazida de la molécula oligopeptídica intermedia para formar un producto oligopeptídico, en el que el primer oligopéptido y el segundo oligopéptido se unen mediante un resto de unión de hidrazona.

13. Un producto oligopeptídico producido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el primer y segundo oligopéptidos se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II o la Fórmula III.

14. Un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto reactivo, en la que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi;

b)

proporcionar el oligopéptido, teniendo el oligopéptido un resto éster activado, en el que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o un resto un resto o-acilisourea;

c)

permitir que el resto reactivo de la molécula marcadora reaccione con el resto éster activado del oligopéptido para formar el oligopéptido marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que en la etapa (c), en la que dicha molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II, y en el que dicho resto éster activado de la etapa (b) no es un tioéster, dicho éster activado es un resto éster activado terminal.

16. Un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto éster activado, en la que el marcador es el sustituyente acilo, en la que el resto éster activado es un resto tioéster, un resto éster fenólico, un resto hidroxisuccinimida o una o-acilisourea;

b)

proporcionar el oligopéptido, teniendo el oligopéptido un resto reactivo, en el que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi;

c)

permitir que el resto éster activado de la molécula marcadora reaccione con el resto reactivo del oligopéptido para formar el oligopéptido marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III.

en el que en la etapa (c), en la que dicha molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II, dicho éster activado es un tioéster.

\newpage

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho oligopéptido se produce por reacción de hidrazina con una molécula precursora, comprendiendo dicha molécula precursora un oligopéptido precursor fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína mediante un resto tioéster.

18. Un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar un marcador, teniendo el marcador un resto reactivo,

b)

(i) proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína (ii) permitiendo la escisión dependiente de reactivo tiol de la molécula precursora para generar la molécula oligopeptídica, teniendo dicha molécula oligopeptídica un resto tioéster en su extremo C-terminal,

c)

permitir que el resto reactivo del marcador reaccione con la molécula oligopeptídica para formar un oligopeptídico marcado, en el que el marcador y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, II o III.

19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el resto reactivo es un resto aminooxi y el resto éster activado es un tioéster.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el resto reactivo es un resto aminooxi.

21. Un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto reactivo, en la que el resto reactivo es un resto hidrazina, un resto hidrazida o un resto aminooxi;

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

c)

permitir que el resto reactivo de la molécula marcadora reaccione con la molécula oligopeptídica precursora para formar un producto oligopeptídico marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III, como se ha definido anteriormente.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en el que la etapa (c) del método se realiza a un pH en el intervalo de pH 6,5 a pH 7,5.

23. Un método para marcar un oligopéptido, comprendiendo el método las etapas de:

a)

proporcionar una molécula marcadora, teniendo la molécula marcadora un resto aldehído o cetona,

b)

proporcionar una molécula oligopeptídica precursora, comprendiendo la molécula oligopeptídica precursora un primer oligopéptido fusionado N-terminalmente con un dominio de inteína,

c)

hacer reaccionar dicha molécula oligopeptídica precursora con hidrazina para generar una molécula oligopeptídica que comprende un oligopéptido intermedio, teniendo dicho oligopéptido intermedio un resto de hidrazida terminal,

d)

permitir que el resto aldehído o cetona de la molécula marcadora reaccione con el resto hidrazida de la molécula oligopeptídica intermedia para formar un producto oligopeptídico marcado, en el que la molécula marcadora y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión de hidrazona.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 23, en el que el resto aldehído o cetona es una \alpha-dicetona o un grupo \alpha-ceto-aldehído.

25. Un oligopéptido marcado producido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que el marcador y el oligopéptido se unen mediante un resto de unión que tiene la Fórmula II o Fórmula III.