CN117551678A - 一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法 - Google Patents
一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法。本发明是以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签，通过引入SlyD融合标签来提高SsPDC蛋白的可溶性表达量，具体是在SsPDC序列的N端加上一个融合标签SlyD序列构建新的质粒SlyD‑SsPDC，得到新的质粒后，重新在大肠杆菌中进行转化表达。本发明通过增加一个融合标签SlyD，使SsPDC在大肠杆菌中的蛋白表达量极大提升，有效提高了蛋白的可溶性表达，同时也解决了包涵体表达的难题。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法。
背景技术
蛋白的异源表达是目前生物技术领域中极其重要的一环，涉及生物制药、医美、疫苗药物、体外诊断等多个行业，外源重组蛋白的成功生产包括基因的表达、蛋白的溶解性控制及其纯化。
目前，可溶性表达一直是蛋白质高效生产中的一个难以解决的问题，尤其是在大肠杆菌表达系统中，受限于蛋白的溶解性，许多较复杂的重组蛋白在表达上都会遇到形成包涵体这一问题，很多重要的蛋白质家族包括磷酸酶、羧化酶、激酶、膜相关蛋白以及许多其他类型的酶都是难以在大肠杆菌表达系统中作为可溶性蛋白质表达生产。
融合标签是一些蛋白质或多肽，将合适的融合标签与目的蛋白融合表达，这些蛋白质或多肽能够帮助目的蛋白进行正确的折叠，从而提高蛋白的可溶性，融合标签通过与目标重组蛋白的N端或C端相连共同表达，从而发挥其作用。
丙酮酸脱羧酶（Pyruvate decarboxylase，PDC）是硫胺素焦磷酸（ThDP）依赖型酶，SsPDC是来自磺酸杆菌属的丙酮酸脱羧酶，能够高效催化糠醛和甲醛C-C键形成反应制备2-呋喃基羟基甲基酮，2-呋喃基羟基甲基酮可以代替乙酰呋喃为原料合成呋喃铵盐。呋喃铵盐是合成头孢呋辛类药物的中间体，由于头孢呋辛类药物具有广谱的抗菌作用，所以在医药领域的市场需求巨大。
然而，丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达系统中的蛋白可溶性表达很差，表达的蛋白多为包涵体，从而极大地限制了丙酮酸脱羧酶SsPDC应用前景。
发明内容
为了提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达系统中的可溶性蛋白表达量，本发明提出了一种促进丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的融合标签序列及构建的重组质粒，这对SsPDC在大肠杆菌表达系统中的高效表达具有很好的实际应用价值。
聚集抗性蛋白（Aggregation-resistant protein，SlyD)是大肠杆菌来源的基因序列，其可以作为融合标签，它的分子量达到20.9 kDa，不仅能够提高重组蛋白的溶解性，而且还可以增加蛋白产量。
本发明所提供的一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法，具体是：以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签，以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段，以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上，构成SlyD-SsPDC重组质粒，此重组质粒即为pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体，将该原核表达载体导入大肠杆菌表达系统中，得重组菌，诱导表达SlyD-SsPDC蛋白。
本发明在一个方面，提供了一种聚集抗性蛋白融合标签SlyD的基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
本发明所提供的聚集抗性蛋白SlyD融合标签的氨基酸序列，如SEQ.ID.NO.2所示。
在另一个方面，本发明提供了上述聚集抗性蛋白SlyD融合标签基因或氨基酸序列在提高SsPDC蛋白可溶性表达量中的应用。
优选的，上述的重组菌是将SlyD-SsPDC重组质粒导入基因工程菌OverExpressC43中培养获得。
并且，包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体或SlyD-SsPDC重组质粒，同样是本发明所重点保护的内容，其表达所述的重组蛋白，命名为SlyD-SsPDC蛋白。
同时，所述SlyD-SsPDC重组质粒或pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体在提高SsPDC蛋白可溶性表达中的应用同样落入本发明所要保护的技术范围之中。
进一步的，所述的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）扩增SlyD的编码基因；
（2）将SlyD与SsPDC构建在同一个质粒上，构建成pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体。
更具体的，本发明所提供的一种提高SsPDC蛋白表达量的方法，用设计SlyD基因（SEQ.ID.NO.1）的上下游引物，以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段，以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上，构成SlyD-SsPDC重组质粒，将SlyD-SsPDC重组质粒导入基因工程菌OverExpress C43(DE3)中诱导表达SlyD-SsPDC蛋白。
本发明的有益效果在于：
（1）通过在SsPDC序列的N端加上融合标签SlyD序列构建新的质粒，得到新的质粒后，重新在大肠杆菌中进行转化表达，使SsPDC在大肠杆菌中的蛋白表达量极大提升，仅30min蛋白表达量就高达97.04%，不仅有效提高了蛋白的可溶性表达，同时也解决了包涵体表达的难题；
（2）提供了一种验证SlyD-SsPDC蛋白可溶性表达的方法，用SDS-PAGE蛋白电泳技术以及构建全细胞催化反应，验证了融合标签SlyD提高了SsPDC蛋白的可溶性表达，同时也提高了同一菌浓的反应效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中聚集抗性蛋白SlyD融合标签经PCR扩增得到的SlyD基因琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例3中SlyD-SsPDC融合蛋白的SDS PAGE电泳图；
图3为本发明实施例4中的全细胞酶催化底物的转化率情况。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中使用的方法均为本领域常规方法，使用的实验条件均为本领域常规实验条件，可参考相关实验手册或厂商说明书。
实施例1 SlyD基因的获得
一、设计引物及SlyD基因扩增
以大肠杆菌（E.coli）全基因组为模板，扩增来自于E.coli的融合标签SlyD(SEQ.ID.NO.1)，设计引物，并在引物F的5’端添加同源臂AAGAAGGAGATATACCATGGGC，在引物R的5’端添加同源臂CCACCGCTGCCGCCACCGCC；引物如下：
SlyD-F：AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAAAGTAGCAAAAGACCTGG；
SlyD-R：CCACCGCTGCCGCCACCGCCGTGGCAACCGCAACCGCCGT；
PCR反应体系包括：超纯水17 μL、引物F 2.5 μL、引物R 2.5 μL、dNTPs 1 μL、模板1 μL、2×Phana Max Buffer 25 μL、Phana Max Super-Fidelity DNA Polymerse 1μL。
二、SlyD基因做胶回收
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，将目的条带的聚集抗性蛋白SlyD进行胶回收（DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司）；切胶回收后，称重，将胶切碎在离心管，加入等体积的溶液I（融胶液），颠倒混匀，50-60℃水浴加热约10 min至胶全融，期间，颠倒混匀3-4次，以加速凝胶融解；胶全融后在50-60℃水浴加热2 min，加入到DNA纯化柱内，室温放置1 min，于12000 rpm离心1 min，倒弃收集管内的液体，在DNA纯化柱内加入700 μL溶液II（洗涤液），室温放置1 min，于12000 rpm离心1 min，洗去杂质，倒弃收集管内的液体，再加入500 μL溶液II，最高速离心1 min，进一步洗去杂质，倒弃收集管内的液体，12000 rpm离心1 min，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。将DNA纯化柱置于1.5mL离心管上，加入30 μL溶液III（洗脱液）至管内柱面上，放置1 min，用1.5ml离心管作为收集管，溶液III需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收，于12000 rpm离心1 min，所得液体即为高纯度DNA。
上述的操作中所采用的溶液I、溶液II、溶液III等均为基因做胶回收时所采用的常规溶液，在此不再详细赘述。
对SlyD基因做胶回收琼脂糖凝胶电泳图，得SlyD片段，见附图1。
附图1表明，明亮条带在500-750 bp之间，即通过引物SlyD-F、SlyD-R成功扩增得到了SlyD片段。
实施例2 构建SlyD-SsPDC重组质粒
一、设计引物及基因扩增
以pET28a-SsPDC为模板，扩增SlyD片段需要连接的质粒片段，其中的SsPDC序列为SEQ.ID.NO.3，设计引物并在引物F的5’端添加同源臂CAGGTGCTGGTGCGGGATCC，在引物R的5’端添加同源臂GTGGTGGTGGTGGTGCT；设计引物如下：
SsPDC-F：CAGGTGCTGGTGCGGGATCCACCACCCCGTATACCGTTGGT；
SsPDC-R：GTGGTGGTGGTGGTGCTGAGGTAACGGTTCTGCGCCGCCA；
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，将目的条带进行胶回收（DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司）得质粒片段；
二、构建重组质粒SlyD-SsPDC
使用ClonExpress试剂盒（购自诺唯赞公司）于冰上配制以下反应体系：模板片段1.5 μL、SlyD片段5.5 μL、5×CE Ⅱ Buffer 缓冲液 2 μL、重组酶ExnaseⅡ 1 μL；使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心（掌中宝）将反应液收集至管底；37℃水浴反应30 min，结束后立即冰浴2 min，得重组质粒SlyD-SsPDC。
三、重组质粒转化及蛋白诱导表达
从-80℃超低温冰箱中取出Overexpress C43（DE3）感受态细胞，冰上放置，待细胞融化后，分别向感受态细胞中加入2 μL SlyD-SsPDC重组质粒，冰上放置30 min，42℃热激50 s，然后冰上放置3 min，涂布于含有Kana抗性（50 μg/mL）的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜；
同时，将不含有融合标签的SsPDC进行复苏活化，次日挑斑后摇菌，将上述菌液取1mL转入100 mL LB（Kana），37℃摇床培养3 h后加入100 uL IPTG（0.1 mM），28℃诱导20 h，使用离心机7000 rpm，离心10 min收菌，然后放入-20℃保存。
实施例3 SDS-PAGE蛋白电泳验证
统一菌浓，将菌体沉淀用10 mL PBS缓冲液重悬，再用PB缓冲液重悬稀释20倍后，用酶标仪测OD 600，得SsPDC的菌浓为0.81，SlyD-SsPDC的菌浓为0.48；将原液按比例稀释至OD 600值为2.5，稀释后取出40 uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴10 min即为全细胞蛋白样品。
将1 mL全细胞蛋白样品进行超声破碎1 min，离心机12000 rpm离心10 min，取40uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴10 min即为上清蛋白样品。
用1mL PBS缓冲液重悬洗两遍，再用1 mL PBS缓冲液重悬取40 uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴10 min即为沉淀蛋白样品。
将Marker与上述样品进行SDS-PAGE电泳实验，结果见附图2。
附图2中，从左至右依次是蛋白Marker、SsPDC全细胞菌液、SsPDC全细胞菌液破碎后上清液、SsPDC全细胞菌液破碎后沉淀、SlyD-SsPDC全细胞菌液、SlyD-SsPDC全细胞菌液破碎后上清液、SlyD-SsPDC全细胞菌液破碎后沉淀。
附图2显示，融合标签SlyD能够提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达系统中的蛋白表达量，同时表达的蛋白几乎为可溶性蛋白。
实施例4 全细胞酶催化反应
将冻存一天的湿菌体称取0.1 g用PBS缓冲液重悬，统一稀释至OD600为7.0，取5mL做酶催化反应，反应体系如下：糠醛40 Mm；甲醛120 mM；ThDP 0.1 mM；Mg2+2.5 mM；反应温度38℃，反应转速800 rpm；金属浴预热，最后加入甲醛开始反应；在反应开始后10min，30min时检测反应效率，结果如附图3所示。
附图3中显示了全细胞酶催化底物的转化率情况，从图3中可以看出：10 min时，SsPDC的反应效率为31.59%，SlyD-SsPDC的反应效率为55.95%；30 min时，SsPDC的反应效率为77.15%，SlyD-SsPDC的反应效率为97.04%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签，以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段，以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上，构成SlyD-SsPDC重组质粒，此重组质粒即为pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体，将该原核表达载体导入大肠杆菌表达系统中得重组菌，诱导表达SlyD-SsPDC蛋白。
2.如权利要求1所述的一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，所述聚集抗性蛋白SlyD融合标签的基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
3.如权利要求1所述的一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，所述聚集抗性蛋白SlyD融合标签的氨基酸序列，如SEQ.ID.NO.2所示。
4.如权利要求1所述的一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，所述的重组菌是将SlyD-SsPDC重组质粒导入基因工程菌OverExpress C43中培养获得。
5.一种包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体。
6.权利要求5中所述的一种包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）扩增SlyD的编码基因；
（2）将SlyD与SsPDC构建在同一个质粒上，构建成pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体。
7.权利要求5中所述的一种包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体在提高SsPDC蛋白可溶性表达中的应用。
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