KR0126107B1 - 비-a 비-b형 간염 바이러스 유전자에서 유래하는 dna 및 구성 폴리펩티드 - Google Patents
비-a 비-b형 간염 바이러스 유전자에서 유래하는 dna 및 구성 폴리펩티드Info
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Abstract
본 발명은 비-A 비-B형 간염 바이러스 게놈 유전자와 상기 바이러스를 구성하는 폴리펩티드를 제공하며, 상기 바이러스에 의해 유발되는 간염의 진단을 가능하게 한다.
RNA는 비-A 비-B형 간염환자의 혈장으로 부터 추출되고 정제된다. 주형으로서 이 RNA를 사용하여, 1중 가닥 DNA를 제조한다. 그 다음, DNA를 적당히 선택된 프라이머를 사용하는 PCR법에 의하여 증폭시킨다. 상기 언급된 바이러스의 부분 DNA 서열을 그 구조를 분석하여 확인하고 이 바이러스의 구성 폴리펩티드를 추론한다. 따라서 항원 부위를 확인한다.
Description
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 비-A 비-B형(非-A 非-B型) 간염 바이러스에 관한 폴리펩티드와 그것을 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항 비-A 비-B형 간염 간염 바이러스 항체와 비-A 비-B형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 시약에 관한 것이다.
[관련분야]
비-A 비-B형 간염은 현 단계에서 수혈 후 간염의 약 95%에 이른다고 생각된다. 따라서 비-A 비-B형 간염 바이러스에 감염된 환자를 발견하여서 수혈할 혈액으로 부터 그들의 혈액을 제거하고, 이 질병을 막기 위하여 백신을 개발하는 것이 긴급히 요구된다. 최근에, 호우튼 등(Houghton et al.)은 이 바이러스의 유전자의 분리를 보고하였으며[유럽 특허 공개-A 제318216호(1989년 5월 31일 공개됨) 참조], 재조합 바이러스 항원에 대한 항 비-A 비-B형 항체를 검출하는 시약을 시판하였다. 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체가 존재하는 혈액을 이 항체검출시약으로 발견하여 수혈할 혈액으로 부터 그러한 혈액을 제거하여 수혈 후 비-A 비-B형 간염을 예방할 수 있을 것이다. 그러나 이 간염은 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체 양성 공혈자의 혈액을 제거한 후에도 심지어 5 내지 7%의 발병률이 일어난다.
따라서 이 질병은 아직은 박멸되지 않고 있다. 실로, 그것에 대한 가능한 이유의 한 가지는 바이러스에 의한 간염과 이 바이러스에 대한 항체 생성 간의 관계가 여전히 불명료한 상태로 남아 있다는 사실에 기인한다.
그러나 그것에 대한 또 다른 이유는 이 바이러스 게놈의 핵산 서열이 상당히 다양해 보인다는 사실에 기인한다.
이러한 발견은, 호우트 등이 보고한 핵산 서열에 기초하여 PCR 방법 또는 프라이머 신장방법(primer extension method)에 의해 클론하는 실험을 수 많이 하여 얻은 결과에 기초한 것이다[Kubo et al.,Nucleic Acid Reserch, 17, 10367-10372(1989) ; Kato 등., Proc. Japan Acad., 65B, 219-223(1989) ; Maeno et al., Nucleic Acid Reserch, 18, 2685-2689(1990) ; Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528(1990)참조].
따라서, 비-A 비-B형 간염의 진단과 수혈에 의해 발생하는 비-A 비-B형 간염 발생에 대한 예방이 완성되었다고 결론을 내릴 수도 없으며, 유전자 진단을 포함하는 신규한 비-A 비-B형 간염의 진단방법을 개발하는 것이 필요하다.
호우튼 등과는 무관하게, 그러나 동시에, 본 발명의 한 사람인 아리마 데루카츠(Arima Terukastu)는, RNA 공급원과 항체 공급원으로 비-A 비-B형 간염 인간환자의 혈청을 사용하여 면역 스크리닝(immuno screening)법으로 HCV(C형 간염 바이러스)의 코아부위의 에피토프 하나를 클론하였다[Arima et al. Gastroenterologia Japanica. 25, 218-222(1990) 참조].
[발명의 요약]
본 발명은 비-A 비-B형 간염 바이러스에 대한 신규한 항원 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 항원 폴리펩티드 또는 DNA를 사용하는 비-A 비-B형 간염 진단시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 언급된 환경 하에서, 본 발명자들은 비-A 비-B형 간염 바이러스의 연구를 시작하였다. s-GPT 레벨이 높은 일본 내 제공자의 혈장을 사용하여 집중연구한 결과, 지금까지 보고된 바이러스와는 다른 신규한 비-A 비-B형 간염 바이러스에서 유래하는 DNA를 분리하여 그 구조를 확인하는데 성공하였다.
또한 본 발명자들은 이들 DNA와 그것에 의해 코딩된 폴리펩티드를 사용하여 비-A 비-B형 간염 바이러스를 진단할 수 있음을 발견함으로서 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 아미노산 서열 중 일부로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 적어도 여섯개 이상의 연속적인 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.
더욱, 본 발명은 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(완전길이의 DNA, 그리고 상기 언급된 완전길이의 DNA 염기 서열 중 일부로 이루어진 DNA에 관한 것이다. 즉 본 발명은 SEQ ID NO : 4 SEQ ID NO : 5 또는 SEQ ID NO : 6으로 표시되는 염기 서열에서 적어도 열개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 DNA를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 면역학적 방법으로 샘플에서 상기 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드의 일부를 사용하여 항 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체의 존재를 확인하여 항 비-A 비-B형 간염 바이러스를 항체를 검출하는 시약, 상기한 DNA 총길이 중 일부를 프라이머로 사용하여 비-A 비-B형 간염 바이러스에서 유래하는 DNA를 증폭시켜 DNA를 검출하는 방법으로 비-A 비-B형 간염 바이러스 유전자를 검출하는 시약 및 상기한 DNA 총길이 중 일부를 프로브로 사용하여 비-A 비-B형 간염 바이러스에서 유래하는 DNA와 혼성화시켜 비-A 비-B형 간염 바이러스 유전자를 검출하는 시약에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(들)를 함유하는 생물학적 샘플에서 항 비-A 비-B형 간염 바이거스 항체를 검출하기 위한 면역화학적 시약, 그리고 본 발명의 DNA를 함유하는 비-A 비-B형 간염 바이러스의 검출시약을 제공한다.
또한, 상기 비-A 비-B형 간염 바이러스 구성 폴리펩티드 항원에 대한 다클론 항체 또는 단일클론항체, 면역화학적 방법에 의하여 샘플에서 상기 항체를 사용하여 비-A 비-B형 간염 바이러스의 존재를 확인하여 비-A 비-B형 간염의 존재를 확인하여 비-A 비-B형 간염 바이러스 항원을 검출하는 시약, 그리고 상기 항원 폴리펩티드를 사용하여 생성되는 비-A 비-B형 간염 백신에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 항원에 대한 다클론 항체, 본 발명의 폴리펩티드 항원에 대한 단일클론항체, 그리고 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 생성되는 비-A 비-B형 간염 백신을 제공한다.
본 발명의 범위와 응용성은 이하에 주어지는 상세한 설명으로 부터 더욱 명백하게 될 것이다.
그러나 상세한 설명과 바람직한 실시예의 특정예들은, 단지 예시에 불과한 것으로, 본 발명의 사상과 범위내의 다양한 변화 및 변형이 당업자에게는 명백할 수 있을 것이다.
[발명의 상세한 설명]
이제 본 발명은 상세히 기술될 것이다.
(1) 비-A 비-B형 간염 바이러스 RNA 제조
비-A 비-B형 간염 바이러스를 추출하는 물질로서, 고 s-GTP 수준을 갖는 공혈자의 혈장이 유용하다. 공지된 방법에 따라, 혈장에 폴리에틸렌 글리콜을 가하여 바이러스 분획물을 수집하여 원심분리한다.
예를 들면, 구아니딘 티오시아네이트, 계면활성제, 킬레이트화제 및 환원제를 함유하는 용액으로 바이러스 분획물로 부터 RNA를 추출을 할 수 있다.
즉, 상기한 용액으로 바이러스 분획에서 RNA를 추출하고 다음에 페놀로 처리하고 유기용매로 추출물을 분획하고[Chamezynski et al., Anal. Biochem., 162, 156(1987) 참조], RNA를 함유하는 분획물로 밀도 구배 초원심분리하여 정제된 RNA를 제조할 수 있다.
(2) 이중가닥 DNA의 제조와 클론
얻어진 RNA를 주형으로 사용하여, 예를 들면 임의의 프라이머, 역전사효소 및 DNA 중합효소를 사용하는 것과 같은 관용적인 cDNA 합성방법에 의하여 이중사슬 DNA를 제조할 수 있다[Gubler, U., et al., Gene, 25, 263(1983) 참조].
종래 방법에 따르면, 이와 같이 얻어진 이중가닥 DNA를 λzap 및 λgt11과 같은 박테리오파지에 통합시키고, 통합된 이중가닥 DNA를 갖는 박테리오 파지로 대장균을 감염시키고, 그 다음 이와 같이하여 얻어진 형질전환체인 대장균을 배양한다.
스크리닝 후에, 목적하는 클론을 얻을 수 있다.
이중 RNA닥 DNA를 파지벡터로 통합시키는 방법의 예로써, 훈 등의 방법(Hyunh, T.V., et al,; DNA cloning, a practical approach에 기술됨)을 인용할 수도 있다.
목적하는 클론의 스크리닝은 예를 들면, 다음과 같은 공지된 방법에 따라서 실행될 수도 있다. 이중가닥 DNA를 파지 벡터 λgt11에 통합시킬 때에는, E. coli Y1090을 이 벡터로 감염시키고, 이렇게 하여 형성되는 플라크 중에 함유되어 있는 폴리펩티드를 니트로셀룰로스 막 위로 옮긴다. 다음, 항체 공급원으로서 비-A 비-B형 간염 바이러스성 간염 환자의 혈청을 사용하는 면역화학적 방법에 의해 이 막을 스크리닝한다.
그러나 이 방법에 의하여 비-A 비-B형 간염 바이러스에서 유래하는 DNA의 완전한 서열을 분석하기는 어렵다. 그러므로 다음 방법이 응용될 수도 있다.
우선, 상기 방법에 의하여 비-A 비-B형 간염 바이러스에 감염된 것으로써 확인된 환자의 신선한 혈장으로 부터 RNA를 제조한다.
그 다음, 상기한 RNA를 주형으로 하여 적당한 기지의 프라이머를 사용하여 단일가닥 DNA를 만들고, 관용적인 PCR 방법을 사용하여 DNA를 증폭시킨 후, 서브클론한다.
이와 같이하여 비-A 비-B형 간염 바이러스에서 유래하는 DNA를 얻을 수 있다. 프라이머로는, 기지의 비-A 비-B형 간염 바이러스의 DNA 서열에서 잘 유지되는 적당한 부분을 선택하여 합성된 올리고뉴클레오티드가 유용하다. 보통, 비-A 비-B형 간염 바이러스 DNA로 부터 유도되는 10 내지 30 염기로 이루어지는 분획이 프라이머로써 사용된다.
본 발명에서 사용된 프라이머는 이미 보고된 HC-J8(Okamoto, H., et al., Virology, 188, 331-341(1992) 참조), HCV-J[Kato., N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528(1990) 참조] 및 HC-J6(Okamoto, H., et al., J. Gen. Virol., 72, 2697-2704(1991) 참조]의 염기 서열에 기초하여 합성한 올리코 뉴클레오티드이다. 더욱, 비-A 비-B형 간염 바이러스의 부분 염기 서열이 상기 기술된 프라이머를 사용하는 실험에 의해 결정되었으며, 이와 같이 하여 결정된 비-A 비-B형 간염 바이러스의 부분 염기 서열에서 적당히 선택된 부위의 염기 서열을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 프라이머로서 사용하였다.
염기 서열의 구조는 맥삼-길버트 법[Maxam, A. M., and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560(1977) 참조] 또는 디디옥시 법[Sanger, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977) 참조]에 의해 확인되었다.
(3) 항 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체의 검출 및 검출 시약
본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드 또는 구성 펩티드의 일부를 에피토프로 사용하여 생물학적 샘플 예를 들면, 환자의 혈청 중의 비 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체의 존재를 면역화학적 방법에 의하여 실험하여 이 바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.
에피토프라는 용어는 폴리펩티드의 항원 결정기를 의미한다.
에피토프는 일반적으로 적어도 5개 이상의 아미노산으로 구성되면 6개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드가 항체와 결합한다는 것을 잘 공지되어 있다[유럽 특허공보-A 제138855호(1985년 5월 2일 공보됨) 참조].
여기에서 사용되는 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 및 SEQ ID NO : 3에 기술된 아미노산 배열에 기초하는, 적어도 3내지 5 이상, 바람직하게는 8내지 10 그리고 보다 바람직하게는 11 내지 20의 연속적인 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 말할 필요도 없이, 약 20 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드도 사용할 수 있다.
면역화학적 방법의 예로써, ELISA법, 웨스턴 블로팅(Western blotting)법 및 응집법과 같은 공지된 방법을 들 수 있다.
편리성과 실용성의 관점에서, ELISA법이 바람직하다.
예를 들어 다음과 같은 방법으로 ELISA법을 행한다. 하나 또는 그 이상의 에피토프가 흡착된 고체 상으로 이루어진 각각의 웰에 시료를 가하고 반응시킨다.
웰을 세척한 후에, 효소-표식 항-인간 IgG 단일 클론 항체를 웰에 가하여 반응시킨다.
웰을 세척한 후에, 결합된 효소의 양을 결정한다.
또한 시스테인을 에피토프의 N-말단부에 부착시켜 에피토프가 고체 상에 흡착되는 것을 촉진시킬 수도 있다.
항-인간 IgG 항체를 표식하기 위한 물질로서, 형광물질, 방사성 물질, 생-또는 화학적 발광물질, 전기화학적 발광물질, 색소, 효소 및 금속과 같은 어떠한 물질도 분석할 수만 있다면 사용할 수 있다. 효소와 전기화학적 발광물질을 사용하는 것이 바람직하다.
에피토프를 위한 고체 지지체로서, 마이크로타이터 플레이트, 플라스틱 비드, 적혈구, 젤라틴 입자, 라텍스 입자와 자기입자를 들 수 있으며 모두 사용할 수 있다.
에피토프의 선택에 대하여, 에피토프로서 적당한 부위를 ELISA법에 시초하여 다수의 비-A 비-B형 간염환자의 혈청을 사용하여 확인하는 것이 바람직하다.
이제, 본 발명의 분석 시약의 특정예를 기술한 것이다.
본 발명의 분석 시약은 필수성분으로써, 완전 길이의 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드 또는 에피토프인 비-A 비-B형 간염 바이러스 구성 폴리펩티드의 일부분으로 각각 이루어진 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드, 그리고 비-A 비-B형 간염 바이러스 환자의 표준 혈청(항체), 항-인간 IgG 항체, 효소 및 효소기질 중에서 임의적으로 선택되는 적어도 하나 이상의 부가 성분(들)을 함유하는 키트의 형태이다.
이 키트가 고체상을 더 함유할 때에는, 이 고체 상은 에피토프로 이루어진 폴리펩티드로 코팅되어 있는 상태로 제공될 수 있다. 항-인간IgG 항체와 효소를 함유할 때에는, 이들 물질을 결합된 상태(conjugated state)로 제공될 수 있다.
이들 세트는 또한 본 발명의 분석 시약의 구체예의 범위 내에 포함된다.
더욱이, 이 키트는 분석의 구체예에서 반응편이를 위하여 적당한 항원 희석액, 반응 희석책, 기질 또는 반응정지용액을 위한 용매를 함유할 수도 있다.
이들 구체예는 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
분석 시료에는 소위 생물학적 샘플이라고 불리는 혈청, 혈장, 척수액, 림프, 침 및 세포들이 있지만 이들에게 제한되는 것은 아니다.
(4)항 비-A 비-B형 간염 바이러스 폴리펩티드 항체의 제조
항체는 항원으로서, 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스 폴리펩티드 또는 그 일부분으로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 기술된 폴리펩티드 또는 단백질은 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스 폴리펩티드 또는 그 일부분과 담체 단백질과의 복합체일 수도 있다.
복합체는, 필요하다면, 축합첼를 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들면, 글루타르알데히드, 카르보디이미드 및 말레이미드 활성 에스테르가 사용될 수 있다.
담체 단백질의 예로써, 소혈처 알부민, 티로글로불린 및 헤모시아닌을 들 수도 있다. 보통 사용되는 경우에서, 담체 단백질을 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스 폴리펩티드 또는 그 일부분의 1 내지 5배의 양으로 사용한다.
면역시키는 동물의 예로서, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그를 들 수도 있다.
접종은 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여로 실행할 수도 있다.
접종은 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여로 실행할 수 있다.
접종 전에, 항원을 완전 프로인트(Freunt) 보조제 또는 불완전 프로인트 보조제에 섞을 수도 있으며 그 다음 투여할 수 있다.
보통 접종은 1 내지 5주의 간격을 두고 두 번 또는 그 이상 실행한다.
충분히 면역을 한 후에, 면역된 동물의 혈액을 수집하고 혈청을 분리하면 다클론 항체가 얻어진다. 필요하면 정제하여 면역글로불린 분획을 얻을 수 있다.
면역된 동물의 비장 또는 림프절로 부터 얻은 항체생산세포와 골수종 세포를 세포통합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 항체생산세포를 분리시킨다.
골수중 세포로는, 마우스, 래트 또는 인간에서 유래하는 것들을 사용할 수도 있다.
비록 이들 골수종 세포는 동종의 항체-생산 세포의 것이 바람직하지만, 경우에 따라서는 이종에서 유래하는 것들도 서로서로 세포 통합시킬 수 있다.
세포 통합은 공지된 방법, 예를 들면 쾰러와 밀슈타인의 방법[Khler 와 Milstein ; Nature, 256, 495(1975) 참조]으로 실행할 수 있다.
통합 촉진제의 예로서, 폴리에틸렌 글리콜과 센다이 바이러스를 들 수 있다.
약 20 내지 50% 최종 농도의 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 : 1,000 내지 4,000)을 사용하여 약 1 : 1 내지 10 : 1의 세포수 비율로 20 내지 40℃ 온도(바람직하게는 30 내지 37℃)에서 항체생산세포와 골수종 세포를 반응시킴으로써 세포 통합을 실행할 수 있다.
항체-생산 하이브리도마를 스크리닝하기 위하여, 여러가지 면역화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 면역 항원으로 코팅된 마이크로플레이트를 사용하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법, 항면역글로블린 항체로 코팅된 마이크로플레이트를 사용하는 EIA(enzyme immunosorbent assay)법과 고체상 형태의 항원을 포함된 니트로 셀룰로스 막을 사용하는 웨스턴 블로팅법을 사용할 수 있다. 웰 내의 항체 생산 하이브리도마에 대하여 상기한 면역화학적 방법으로 항체생산을 확인하고, 더하여 예를 들면 한계희석분석법에 의하여 목적하는 클론을 클로닝한다. 목적하는 하이브리도마를 선택하고 성장시키기 위하여, 보통 HAT(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)을 첨가한 소태아 혈청 10 내지 20%를 함유하는 동물세포용 배지(예를 들면, PRMI 1640)를 사용한다.
이와 같이 하여 얻어진 클론은 프리스탄을 투여한 BALB/c 마우스의 복강 내로 이식한다. 10 내지 14일 후에, 면역된 마우스로 부터 단일클론 항체를 고농도로 함유하는 복수를 수집하여 항체의 정제를 위한 재료로서 사용한다. 또한, 이와 같이 하여 얻어진 클론을 배양하여 얻어진 배양물을 항체의 정제를 위한 재료로 사용할 수 있다.
단일클론 항체를 회수하기 위하여, 공지된 면역 글로불린의 정제방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 그것은 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, 음이온 교환수지 및 친화 크로마토그래피의 사용으로 쉽게 도달할 수 있다.
이들 항체는 공지된 면역학적 방법에 의하여 생물학적 샘플 내의 비-A 비-B형 간염 바이러스를 확인하고 분석하는 것을 가능하게 만든다. 따라서, 이들 항체는 비-A 비-B형 간염 바이러스 항원에 대한 진단시약으로 사용할 수 있다.
(5) 비-A 비-B형 간염 바이러스 유전자 분석
호우튼 등이 보고한 상기 언급된 바이러스(HCV-1), 카토(Kato)가 보고한 바이러스(HCV-J), 오카모토 등(Okamoto et al)이 보고한 바이러스(HC-J6)와 본 발명의 바이러스를 포함하여 4가지 형의 비-A 비-B형 간염 바이러스가 보고되었다.
이들 사실이 명백히 나타내는 바와 같이, 비-A 비-B형 간염 바이러스에는 몇 가지 서브타입이 있다는 것을 알 수 있다.
상기 논의된 것과 같이, 생물학적 샘플 내에서 바이러스 또는 이 바이러스의 항원 폴리펩티드에 대한 항체의 면역학적 분석이 비록 이 바이러스 감염의 진단에 유용하다고 할 지라도, 이러한 면역학적 분석에 의하여 이들 바이러스 서브타입을 확인하고 구분하는 것은 어렵다.
SEQ ID NO : 4 에 기술된 DNA는 바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 영역의 부분에 해당하며, 반면에 SEQ ID NO : 5와 SEQ ID NO : 6에 기술된 DNA는 각각 바이러스의 비구조 단백질을 코딩하는 영역의 부분에 해당한다.
비-A 비-B형 간염 바이러스의 서브타입 각각의 DNA 염기 서열과 본 발명의 DNA 염기 서열을 비교해 보면 70 내지 80%상의 상동성을 나타낸다.
이러한 사실은, 비-A 비-B형 간염 바이러스의 해당 부분의 DNA 염기 서열에 기초하여 프라이머로서 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자 분석을 하면, 비-A 비-B형 간염 바이러스의 서브타입을 서로 구별될 수 있다는 것을 지적한다.
프라이머로서 사용하는 올리고뉴클레오티드는, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내에 함유되어 있는 적어도 6개의 염기로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로 부터 유도된 올리고뉴클레오티드의 염기의 수는 바람직하게는 최소한 8 이상, 보다 바람직하게는 적어도 10 내지 12, 그리고 가장 바람직하게는 15 내지 25이다.
즉, 프라이머의 염기서열은 각 서브타입의 바이러스의 염기서열(DNA 서열)에 기초하여 적당히 선택될 수 있다. 비-A 비-B형 간염 바이러스의 서브타입의 확인은, 주형으로서 혈장 표본과 같은 생물학적 샘플로 부터 제조된 RNA를 사용하고, 적당한 안티센스 프라이머, 센스 프라이머, 역전사효소와 열안정성 DNA폴리머라제를 사용하는 RT-PCR법에 의하여 DNA를 증폭시키고 그 다음 DNA를 분석하는 종래 방법으로 확인할 수 있다.
주어진 크기의 DNA가 증폭되었는가 여부를 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로즈 겔 전기영동법으로 조사하여 바이러스의 타입을 확인할 수 있다.
또한 서브타입의 확인은, 각 서브타입의 바이러스에서 유도되고 사용되는 두 프라이머 사이에 위치한 서열을 갖고 있는 합성 올리고뉴클레오티드를 표식하여 프로브로 사용하는 방법에 의해서도 할 수 있다.
증폭된 DNA의 구조는 PCR 생성물로 부터 염기 서열을 직접 분석하므로서 분석될 수도 있다. 필요하다면, 적당한 벡터에 DNA를 통합하고 그 다음 이 벡터를 적당한 숙주에 도입하여 DNA를 복제시키는 것을 추천한다.
이와 같이하여 DNA의 염기 서열을 분석할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스 폴리펩티드의 사용은 비-A 비-B형 간염예방 또는 치료 약제로서 사용할 수 있는 백신의 생산을 가능하게 한다.
본 발명의 DNA, 그것에 대해 상보적인 RNA, 또는 본 발명의 항원 폴리펩티드의 사용은 비-A 비-B형 간염의 진단을 가능하게 하며, 예를 들면 수혈을 통한 바이러스 감염을 예방하고 그것에 대한 백신과 항 바이러스제를 개방할 수 있게 한다.
[실시예]
이제 본 발명은 다음 실시예르 참고로 더 자세히 기술된 것인데, 본 발명의 범위를 한정시키는 것으로 생각해서는 안된다.
[실시예 1]
혈장으로 부터 비-A 비-B형 간염 바이러스 RNA의 제조
소위 호우튼 등의 바이러스 항원으로 이루어진 항체 검출 시약을 사용하여 C100-3 항체(2.00≥)에 대하여 강 양성으로 판정된 공혈자의 혈장과 다양한 간염환자의 혈장에서, 국제 공개 제WO 92/18532호(1992년 10월 20일 공개), 그에 해당하는 유럽 특허 공개-A 제580754호(1994년 2월 2일 공개)에 개시된 방법에 따라 서브타입을 확인할 수 있었다.
그 다음, 국제 공개 제WO 92/18532호에 개시된 것과 같이 단지 바이러스 2-22만을 함유하는 혈장을 출발물질로 사용하여 RNA를 제조하였다.
공혈자의 혈장 1ml에 최종농도 4%가 되게 폴리에틸렌 글리콜 4000을 가하였다. 4℃에서 90분 동안 교반하여 용해시킨 후, 얻어진 용액을 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 6M 구아니딘 이소시아네이트 200μl, β-메르캅토에탄올 2.1μl, 이스트 t-RNA(10mg/ml) 5μl, 2M 시트르산나트륨(pH 4.0) 22μl와 페놀/클로로포름(5 : 2) 350μl을 가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 1분간 교반하고 0℃에서 15분간 방치한 후 14,000rpm에서 10분간 원심분리하였다.
이 반응 혼합물의 수성층을 취하고 페놀/클로로포름(5 : 2) 350μl를 가하였다. 실온에서 1분간 교반한 후, 혼합물을 0℃에서 15분간 방치하고 14,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 반응 혼합물의 수성층을 취하고 페놀/클로로포름으로 다시 추출하였다. 거기에서 취한 수성층에 등량의 2-프로판올을 가하고 이와 같이 하여 얻어진 혼합물을 -20℃에서 12시간 이상 방치하였다.
그 다음 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 4M 구아니딘 이소티오시아네이트 85μl, β-메르캅토에탄올 0.7μl, 2M 시트르산 나트륨(pH4.0) 15μl아 2-프로판올 100μl를 가하고, 이 소프로판올로 침전시켜 RNA를 제조하였다.
[실시예 2]
[RT-PCR법에 의한 유전자 증폭과 구조분석]
이렇게 얻어진 RNA 용액 20μl를 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켰다.
다음 시약 혼합물[10mM 트리스 HCI(pH 8.3), 50mM KCI, 4mM MgCL2, 1mM DTT, 0.001% 젤라틴] 26μl, 이하에 기술될 3'-하류측 내의 안티센스 프라이머 용액(10μM) 2μl와 4 디옥시뉴클레오티드 혼합 용액[dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 1.25mM] 10μl를 가하여 용액 27μl를 얻었다.
이 용액을 70℃에서 1분간 그리고 55℃에서 1분간 연속적으로 가열하고 그 다음 0℃로 냉각하였다. RNase 억제제(프로메가사제) 2μl(80U)와 역전사효소(BRL 사제) 1μl(200U)를 가한 후에, 이렇게 얻어진 혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 95℃로 가열하고 그 온도에서 5분 동안 유지시켜서 효소를 비활성화시켰다. 이 반응 혼합물 4μl에 PCR 용액[10mM 트리스 HCI(pH 8.3), 50mM KCI, 1.5mM MgCL2, 0.001% 젤라틴, dNTP 혼합물 각각 125μM] 44.2μl를 가하였다.
그 다음 유전자 증폭을 시키는 영역의 5'-상류측에서 센스 가닥의 염기 서열을 갖는 프라이머의 용액(10μM) 0.5μl와 상기 언급된 영역의 3'-하류측에서 안티센스 가닥의 염기 서열을 갖는 프라이머 용액(10μM) 0.3μl를 가하여 전체부피가 49μl인 용액을 얻었다.
여기서 사용된 프라이머는 HC-J8, HC-J6, HCV-J의 DNA 서열에 기초하여 합성하고 실험을 통해 확인된 것들이다. 이들 센스 프라이머와 안티센스 프라이머가 유래된 바이러스, 염기 위치 번호 및 이들 프라이머를 사용하여 확인된 구조체의 염기 서열을 서열표에 주어진 염기번호에 따라서 표 1과 2에 열거하였다.
이들 표에서, J, J6 및 J8은 각각 상기한 HCV-J, HC-J6 및 HC-J8을 의미하며, 한편 Seq. 4, Seq. 5 및 Seq. 6은 각각 이하에 기술될 SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6을 의미한다. 클로닝 효과를 위하여, 제한효소 Sma I와 Bam HI에 의해 인식된 서열을 몇몇 센스 프라이머의 5'-측에 가했고, 한편, 제한효소 Sal I와 Pst I에 의하여 인식된 다른서열을 몇몇 안티센스 프라이머의 3'-측에 가했다.
[표 1]
[표 2]
Taq 폴리머라제(0.5U, Perkin-Elmer Cetus 사제) 1μl를 상기 기술된 용액에 가한 후, 변성(94℃, 1분) 어닐링(45℃, 1분)과 중합반응(72℃, 3분)을 30회 반복하였다. 이렇게 얻어진 반응 혼합물 4μl에 상기 언급된 PCR 용액 90μl, 센스 프라이머 용액 1μl, 안티센스 프라이머 용액 1μl와 Taq 폴리머라제 2μl를 더 가하고 그 다음 DNA를 변성(94℃, 1분), 어닐링(45℃, 1분)과 중합반응(72℃, 3분)을 30회 반복하여 증폭시켰다.
이제 RT-PCR법에 의해 증폭된 유전자 생성물의 클로닝을 설명한 것이다.
증폭된 유전자 조각을 폴리아크릴아미드 겔(4 내지 5%)에서 전기영동을 하고 브롬화에티듐으로 염색하였다. 그 다음 목적하는 길이의 DNA를 회수하였다. 이 DNA를 제한효소 Bam HI와 Sal I로 절단하고 그 결과로서 생긴 조각을 파지 벡터 M13mp18과 M13mp19의 Bam HI-Sal I 부위에 삽입하였다. 그 다음 유전자를 종래 방법에 의하여 클론하였고 염기 서열을 분석하였다.
염기 서열을 M13 파지를 사용하는 관용적 방법인 디디옥시 종결법(dideoxy termination method)으로 확인하였다. 얻어진 클론의 염기 서열에 기초하여 중복된 부분을 대조하였다.
이와 같이 SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5와 SEQ ID NO : 6으로 표시되는 염기 서열을 확인하였다. 이들 서열을 기초로 하여, 이들 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열에서 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 서열들을 추론하였다.
SEQ ID NO : 1 은 구조 영역에 해당하며, 한편 SEQ ID NO : 2와 DWQ ID NO : 3는 비구조 영역에 해당한다.
[실시예 3]
에피토프 부위의 확인
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 3에 기술된 본 발명의 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드의 어느 아미노산 서열 부위가 에피토프로서 적당한가를 확인하였다. 먼저, 표 3에 열거된 폴리펩티드를 본 발명의 아미노산 서열에 기초하여 합서하고 스크리닝하였다.
[표 3]
먼저, 합성 펩티드를 함유하는 각각의 용액 5.0μl/ml를 마이크로플레이트의 웰에 100μl씩을 피펫으로 넣고 이 용액으로 웰을 코팅하였다.
차단 완충제(10mM PBS, 1% BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.4) 100μl으로 차단시킨 후 반응 용액(50mM Tris, 1mM EDTA, 0.1% NaN3,10% NRS, pH 8.0) 100μl들 웰에 가하였다.
다음, 공혈자의 혈장 20μl를 가하고 마이크로플레이트를 37℃에서 60분간 배양하였다. 배양 후에, 웰을 세척 완충제(10mM PBS, 0.1% BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.4)로 세척하고 알카리성 포스파테이즈 표식된 항-인간 IgG 항체 100μl를 웰에 가하였다.
37℃에서 60분간 배양하고 세척 완충제로 세척한 후, 효소기질 용액(p-니트로페닐 포스페이트 1.0mg/ml, 탄산염 완충제, pH 9.8) 100μl를 웰에 가하였다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 웰 내의 반응용액의 흡광도를 405nm 파장에서 측정하였다.
표 3의 우측란에는, 제 2 세대 시약, 즉, 제 2 세대 항 HCV 항체 검출 시약으로 양성으로 판정받은 공혈자에서 측정된 혈장(검체 130개)에 대한 양성율이 주어졌다.
표 3에 나타난 것과 같이, 펩티드 CL, M1 및 57을 사용하여 측정된 양성율은 각각 100%, 94.6% 및 84.6%임이 확인되었다.
따라서 이들 3개의 펩티드들이 에피토프로서 효과적이라는 것이 증명되었다. 즉, 이 결과는 에피토프로서 본 발명의 아미노산 서열의 부분으로 이루어진 시약이 비-A 비-B형 간염의 진단에 효과적이라는 것을 의미한다.
신규한 에피토프를 본 발명의 진단시약으로 사용함에 있어서, 임상 시험 데이타를 좀 더 축적하면, 이 진단 시약이 종래의 것으로는 결코 달성할 수 없었던 유용성에 좋은 영향을 미치리라 기대된다. 펩티드 CL, M1 및 57의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 및 SEQ ID NO : 9로 표시된다.
[서열표]
(2) SEQ ID NO : 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 328 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 1 :
(2)SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1211 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(vi) 기원 :
(A)유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 547 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 3:
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1246 아미노산
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 2중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : cDNA 내지 게놈 RNA
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 4:
(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 3633 아미노산
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 2중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : cDNA 내지 게놈 RNA
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 5 :
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1696 아미노산
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 2중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : cDNA 내지 게놈 RNA
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 비-A 비-B형 간염 바이러스
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 6 :
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 7 :
(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D)토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 8 :
(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 40 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 9 :
(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 10 :
(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 11 :
(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 12 :
(2) SEQ ID NO : 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 17 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 13 :
(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 14 :
(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 15 :
(2) SEQ ID NO : 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 16 :
(2) SEQ ID NO : 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : 펩티드
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 17 :
(2) SEQ ID NO : 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 18 :
TACTGTCTTC ACGCAGAAAG CGTC24
(2) SEQ ID NO : 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 19 :
GATCCAAGAA AGGACCCGGT CGT23
(2) SEQ ID NO : 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 20 :
GAGCTCGGAT CCCGGAACCG GTGAGTACAC CGGAA25
(2) SEQ ID NO : 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 21 :
GGTACCGTCG ACATTTACCC CGTCTTCCAG GAC33
(2) SEQ ID NO : 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 22 :
CCCGGGGATC CCGCCGACCT CATGGGGTAC AT32
(2) SEQ ID NO : 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 23 :
GGTACCGTCG ACAAATTCCC TGTTGCGTAA TT32
(2) SEQ ID NO : 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 24 :
GAGCTCGGAT CCACGGTGTT AGGGTCCTGG AAG33
(2) SEQ ID NO : 25에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 25 :
GGTACCGTCG ACCGAGGATC ATGGTAAGAG TT32
(2) SEQ ID NO : 26에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 35 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 26 :
CCCGGGGATC CCAAGAGCAC CAAAGTCCCT GTCGC35
(2) SEQ ID NO : 27에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 27 :
GGTACCGTCG ACACGCATAT GATGATGTCA TA32
(2) SEQ ID NO : 28에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 28 :
GAGCTCGGAT CCCCACCGGG GACCCTATCA CCTA34
(2) SEQ ID NO : 29에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 29 :
GGTACCGTCG ACCGGCATCA TAGCACTCGC AGAG34
(2) SEQ ID NO : 30에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 30 :
GAGCTCGGAT CCTCGTCAGG TGAAAGGCCG TCTG34
(2) SEQ ID NO : 31에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 31 :
GGTACCGTCG ACACCCGATC GTTCAGGTGT AG32
(2) SEQ ID NO : 32에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 32 :
GAGCTCGGAT CCCGAAATAC ATCGCCACGT GCAT34
(2) SEQ ID NO : 34에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 33 :
GGTACCGTCG ACCCTCATAT AAGATTTCCT TGTC34
(2) SEQ ID NO : 34에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 34 :
GAGCTCGGAT CCTCATTGGC CGCCTACACC TGAA34
(2) SEQ ID NO : 35에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 35 :
GGTACCGTCG ACTCAGACTC CACCACGTAG TG32
(2) SEQ ID NO : 36에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 36 :
GAGCTCGGAT CCGATGAATA GACTGATCGC TTT33
(2) SEQ ID NO : 37에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 37 :
GGTACCGTCG ACGAGAAAAA TTCTGGAGCT GGTA34
(2) SEQ ID NO : 38에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D)토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 35 :
GAGCTCGGAT CCTGGCTCCT TCTCGTACGT AA32
(2) SEQ ID NO : 39에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 39 :
GGTACCGTCG ACCGACGGAT CTGTCAGCAT GGA33
(2) SEQ ID NO : 40에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 40 :
GAGCTCGGAT CCCTTCTTTC GGGATGAGGT30
(2) SEQ ID NO : 41에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 41 :
GGTACCGTCG ACTGAAAAGG TTGGCATCCA CCAT34
(2) SEQ ID NO : 42에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 31 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 42 :
GAGCTCGGAT CCCCGTCTTT GAAGGCTATC T31
(2) SEQ ID NO : 43에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 43 :
GGTACCGTCG ACACTCTGAT GGTACAGAAG GCT33
(2) SEQ ID NO : 44에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 44 :
GAGCTCGGAT CCGATGTGAC CCGGATTGAG TC32
(2) SEQ ID NO : 45에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 45 :
GGTACCGTCG ACGTACACCTT CTTTGCCCTC AGAG34
(2) SEQ ID NO : 46에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 46 :
CCCGGGGATC CGGCCCTCAT AACACCATGT GGGC34
(2) SEQ ID NO : 47에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 47 :
GGTACCGTCG ACTATAAGCT CCAAGTCATA TT32
(2) SEQ ID NO : 48에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 48 :
CCCGGGGATC CAGCCTTCAC GGAGGCTATG AC32
(2) SEQ ID NO : 49에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥수 : 1중
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 종류 : SEQ ID NO : 49 :
CTGCAGGTCG ACCCCCAAAA AAAAAAAA28
Claims (7)
- SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15 SEQ ID NO : 16 또는 SEQ ID NO : 17로 표시되는 아미노산 서열에서 적어도 6개 이상의 연속적인 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 또는 SEQ ID NO : 17로 표시되는 비-A 비-B형 간염 바이러스-구성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 또는 SEQ ID NO : 17로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열에서 적어도 10개의 연속적인 염기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA.
- 제 1 항의 폴리펩티드들로 부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 생물학적 샘플에서 항 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 면역 검출시약.
- 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9로 표시되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 항 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체를 검출하기 위한 면역 검출시약.
- 제 3 항의 DNA들로 부터 선택되는 하나 이상의 DNA를 함유하는 비-A 비-B형 간염 바이러스 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 시약.
- SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 및 SEQ ID NO : 9로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 항 비-A 비-B형 간염 바이러스 항체를 검출하기 위한 면역 검출방법.
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