CN112111598A - 检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

一种检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法，引物对具有正向引物及反向引物，试剂盒具有引物对及探针。检测方法包括利用正向引物、反向引物、及探针进行实时逆转录聚合酶链锁反应来扩增兹卡病毒的核酸分子。正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列，探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。

Description

检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法
【技术领域】
本案系关于一种检测黄病毒(Flavivirus)的引物对、试剂盒及方法，尤指一种检测兹卡病毒(Zika virus)的引物对、试剂盒及方法。
【现有技术】
兹卡病毒是一种经由蚊子传播的黄病毒，于1947年在乌干达首次于猴子中发现，之后于1952年在乌干达和坦桑尼亚联合共和国于人类中发现。此病毒经由携带病毒的斑蚊(Aedes mosquitoes)的叮咬而在人与人之间传播。
在2015年之前，兹卡病毒爆发通常发生在非洲，东南亚及太平洋岛屿。然而，由于全球化现象，2015年3月发生了最严重的疫情，从巴西开始爆发，不久便蔓延到了美洲、非洲、亚洲和欧洲。此疾病的症状从无症状到轻度症状，例如发烧、皮疹、头痛、关节痛、以及结膜炎和肌肉痛。通常，轻度症状会持续几天到一周，且感染者甚至可能没有意识到自己已被感染。然而，根据最近的发现，兹卡病毒感染可引起神经系统疾病，例如格林-巴利症候群(Guillain-Barrésyndrome)，以及称为先天性兹卡症候群(congenital Zika syndrome)的严重先天性缺陷，其在感染母亲的新生儿中，最明显的症状就是会有严重的小头畸形。
目前常用于兹卡病毒诊断的两种技术为血清学检测和实时逆转录聚合酶链锁反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)，这些技术分别通过对兹卡病毒具特异性的抗体检测以及病毒RNA检测来确认兹卡病毒的感染。血清学检测虽然可以在10分钟到几小时内提供确定结果，但此方法涉及检测病人血清中的IgM抗体，而这种抗体仅在临床症状(例如发烧)出现几天后才出现。另外，由于会有其他虫媒病毒与IgM发生交叉反应而产生假阳性的可能性(特别是如果病人先前有其他黄病毒的感染史)，使得血清学检测的特异性仍受到质疑。实时逆转录聚合酶链锁反应是一种较新的诊断法，可解决上述方法的缺点。由于具有较高的灵敏度，实时逆转录聚合酶链锁反应可以更快速地检测兹卡病毒基因组，即使在感染初期也是如此，且由于具有较高的特异性，假阳性的可能性也较低。
尽管近年来兹卡病毒检测的灵敏度和特异性已经提高了，但是现行的实时逆转录聚合酶链锁反应检测所提供的速度仍然不足，因为典型的逆转录聚合酶链锁反应处理时间几乎为一个半小时。因此，目前仍迫切需要提供一种实时就地照护(Point-of-Care，POC)诊断方法，以灵敏且特异地检测兹卡病毒，且提供较快的处理时间。
【发明内容】
本案之一实施例的目的在于提供一种用以检测兹卡病毒的引物对，其具高灵敏度、高特异性、以及缩短的反应时间。
本案之一实施例的另一目的在于提供一种用以检测兹卡病毒的试剂盒，其具高灵敏度、高特异性、以及缩短的反应时间。
本案之一实施例的又一目的在于提供一种用以检测兹卡病毒的方法，其具高灵敏度、高特异性、以及缩短的反应时间。
为达上述目的，本案之一实施例提供一种用以检测兹卡病毒的引物对，包括一正向引物及一反向引物，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，且反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
承上，正向引物及反向引物系用于实时逆转录聚合酶链锁反应。
又，本案之一另实施例为提供一种用以检测兹卡病毒的试剂盒，包括一正向引物、一反向引物、及一探针，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，且反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
承上，探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。
抑或是，探针包含SEQ ID NO:3的互补序列。
承上，探针的5’端接上报导染剂，且3’端接上淬灭体。
承上，正向引物、反向引物、及探针系用于实时逆转录聚合酶链锁反应。
又，本案之另一实施例为提供一种用以检测兹卡病毒的方法，包括利用一正向引物、一反向引物、及一探针进行实时逆转录聚合酶链锁反应来扩增兹卡病毒的核酸分子，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，且反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
承上，探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。
抑或是，探针包含SEQ ID NO:3的互补序列。
承上，探针的5’端接上报导染剂，且3’端接上淬灭体。
承上，兹卡病毒的核酸分子为RNA。
承上，检测兹卡病毒的方法更包括下列子步骤：将兹卡病毒的一基因组RNA逆转录成一互补DNA；以及利用正向引物、反向引物、及探针进行实时聚合酶链锁反应对互补DNA进行扩增及检测。
可预期的是，本文描述的方法或组合物的任何实施例可以本文描述的其他方法或组合物来实施。
当用语「一」在申请专利范围及/或说明书中与用语「包括/包含」结合使用时，可能表示「一」，但也与「一或更多」、「至少一」、及「一或大于一」的含义一致。
在申请专利范围中的用语「或」意指「及/或」，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的，即使揭露内容支持仅指替代方案与「及/或」的定义。
藉由以下详细说明，本发明的其他目的、特征及优点将变得显而易见。然应理解的是，尽管详细说明及特定范例指出本发明的特定实施例，但这些特定实施仅为说明例示之用，因为通过此详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化及修饰对于熟悉本技艺人士而言是显而易见的。
【附图说明】
图1显示包膜基因的部分序列，以及正向引物、反向引物及探针于包膜基因序列上的结合位置。
图2显示正向引物、反向引物及探针的DNA序列。
图3显示快速循环模式下实时逆转录聚合酶链锁反应的温度曲线。
图4显示特异性分析的结果。
图5显示估算检测限(LoD)的S形曲线。
图6显示从不同拷贝数的兹卡RNA所产生的扩增曲线。
图7显示由图6结果产生的兹卡分析标准曲线。
【实施方式】
体现本案特征与优点的一些实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本案能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本案的范围，且其中的说明及图式在本质上为说明之用，而非用以限制本案。
本案之一实施例系利用实时逆转录聚合酶链锁反应(real-time reversetranscription polymerase chain reaction，简称real-time RT-PCR)，又称定量逆转录聚合酶链锁反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，简称qRT-PCR)，配合探针检测系统(probe-based detection)来对人类的兹卡病毒感染进行快速、灵敏及特异的诊断。实时逆转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)主要包括两个步骤，第一个步骤乃将兹卡病毒基因组RNA(viral genomic RNA)逆转录成互补DNA(complementary DNA，cDNA)，接着于第二个步骤利用实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerase chain reaction，real-time PCR)配合引物对来将cDNA进行扩增。特别是，在实时聚合酶链锁反应(real-time PCR)中，具有特异性的正向引物、反向引物及探针会杂合到兹卡的cDNA目标上，其中探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，3’端接上淬灭体(quencher)。在PCR扩增反应过程中，探针会被切割，使得报导染剂与淬灭体分离，即可检测到报导染剂所发出的荧光。在一实施例中，报导染剂为FAM荧光基团，淬灭体为BHQ1基团，但不以此为限。
兹卡病毒为单链RNA病毒，具有10675个碱基(兹卡病毒株PRVABC59；NCBI参考序列数据库KU501215.1)。在本案实施例中，兹卡病毒的包膜基因(envelope(E)gene)系被选为检测目标。图1显示包膜基因的部分序列(以SEQ ID NO:4标示，对应KU501215.1基因序列第2101至2275个位置)，以及正向引物、反向引物及探针于包膜基因序列上的结合位置。图2显示正向引物、反向引物及探针的DNA序列。正向引物具有SEQ ID NO:1的序列(5’-GGAGTGGCAGCACCATTG-3’)，起始于基因序列第2181个位置，大小为18-mer。反向引物具有SEQ ID NO:2的序列(5’-CAGGCTGTGTCTCCCAAGA-3’)，起始于基因序列第2262个位置，大小为19-mer。探针为逆向探针，具有SEQ ID NO:3的序列(5’-TTCTCTTGGCACCTCTCACAGTGGCTTCAA-3’)，起始于基因序列第2237个位置，大小为30-mer。利用前述正向引物及反向引物将可扩增产生大小为82-bp的扩增子(amplicon)。
为确认所采用的引物及探针对兹卡病毒具有特异性，图2所示的每一个引物及探针皆利用NCBI BLAST系统对人类基因组加转录(human genomic plus transcript)及核苷酸收集(nucleotide collection)等两个数据库进行比对，且比对结果显示没有其他相近的物种具有与本案设计的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3完全相同的序列片段，然而，SEQ IDNO:2则与登革热病毒第三血清型(Dengue serotype 3)具有100％相似度。由于引物和探针系成组进行检测，故即使反向引物(SEQ ID NO:2)可与登革热病毒第三血清型的基因组材料结合，正向引物(SEQ ID NO:1)和逆向探针(SEQ ID NO:3)也不会与登革热病毒第三血清型的基因组材料结合。亦即，本案实施例的引物及探针组合不会对登革热病毒第三血清型产生假阳性检测结果，并仍可特异地检测兹卡病毒的包膜基因。换句话说，本案设计的引物及探针对兹卡病毒的特异性非常高，且可用于扩增及检测兹卡病毒的包膜基因。在本案之一实施例中，前述引物及探针仅可用于扩增及检测兹卡病毒的包膜基因。
因此，本案实施例提供了一种用以检测兹卡病毒的引物对，包括正向引物及反向引物，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。本案实施例同时提供一种用以检测兹卡病毒的试剂盒，包括正向引物、反向引物、及探针，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列，探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。另一方面，本案实施例亦提供一种用以检测兹卡病毒的方法，此方法包括利用正向引物、反向引物、及探针进行实时逆转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)来扩增兹卡病毒的核酸分子，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列，探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。特别是，检测方法更包括将兹卡的病毒基因组RNA逆转录成互补DNA(cDNA)，以及利用正向引物(SEQ ID NO:1)、反向引物(SEQ ID NO:2)、及探针(SEQ ID NO:3)进行实时聚合酶链锁反应(real-time PCR)对互补DNA进行扩增及检测等子步骤。
在本案另一些实施例中，由于引物对可特异地检测兹卡病毒，故只要是位于正向引物及反向引物序列位置之间的序列，皆可设计为探针序列，因此，探针序列不受限于前述探针序列(SEQ ID NO:3)。此外，由于探针可选择杂合至DNA的任一链上，故相同位置的互补序列皆可做为探针序列，故与前述探针序列互补的序列亦可做为检测兹卡病毒的探针序列。因此，本案实施例亦提供一种用以检测兹卡病毒的方法，此方法包括利用正向引物、反向引物、及探针进行实时逆转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)来扩增兹卡病毒的核酸分子，其中正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列，探针包含SEQ ID NO:3的互补序列。
本案实施例所提供之引物对及探针系优化用于透过实时逆转录聚合酶链锁反应来快速检测兹卡病毒，且此实时逆转录聚合酶链锁反应系以快速循环模式(fast cyclingmode)进行。图3显示快速循环模式下实时逆转录聚合酶链锁反应的温度曲线。在一实施例中，快速循环模式系指实时逆转录聚合酶链锁反应的温度曲线架构如下：(1)42℃ 5分钟的逆转录保持阶段；接着(2)95℃ 30秒的初始变性和酶活化保持阶段；再接着40个循环的(3)PCR阶段，此阶段系于95℃变性1秒，及60℃结合/延伸5秒。在此快速循环模式下，以下四个方面可节省大量时间。首先，结合/延伸时间缩短为5秒而节省了时间，反观目前市售的竞争产品通常需要60秒。第二，变性时间缩短为1秒而节省了时间，反观目前市售的竞争产品通常需要15秒。第三，反转录时间缩短为5分钟，反观目前市售的竞争产品通常需要20分钟。第四，初始变性和酶活化时间缩短为30秒，反观目前市售的竞争产品通常需要2分钟。
因此，在相同类型的热循环仪上，采用本案实施例的引物对及探针的快速循环模式所节省的时间，使得总反应时间相较于标准逆转录聚合酶链锁反应缩短至少50％，故本案实施例能够在不到30分钟的时间内完成兹卡病毒的检测。换句话说，透过优化设计减少每个循环的变性/结合/延伸时间，减少逆转录时间以及减少初始变性时间，造成总反应时间缩短至少50％，使得本案实施例的引物对及探针可藉由实时逆转录聚合酶链锁反应达成兹卡病毒的快速检测，且这些都是在不影响兹卡病毒检测的灵敏度和特异性的前提下实现的。
以下将以实例说明本案检测兹卡病毒的方法，其中反应混合物如表1所示。实时逆转录聚合酶链锁反应利用上述的快速循环模式来进行，且反应混合物包括购自Takara的One Step PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time；#RR064A)、500nM的正向引物(SEQ ID NO:1)、500nM的反向引物(SEQ ID NO:2)和200nM的探针(SEQ ID NO:3)，总体积为20μL。然而，反应混合物并不限于上述的酶和缓冲系统。
表1
Figure BDA0002545380460000081
Figure BDA0002545380460000091
为了进一步以实验确认引物对及探针对兹卡病毒检测的特异性，本案检验了引物对及探针与几种常见的蚊媒病毒的交叉反应性，包括登革热病毒第一至第四血清型、以及屈公病毒(Chikungunya virus)。图4显示特异性分析的结果，其中CHIK、DEN1至DEN4、以及ZIKA表示分别来自屈公病毒、登革热病毒第一至第四血清型、以及兹卡病毒的基因组RNA样本，而NTC表示无模板对照组。从图4可见，除了兹卡基因组RNA样本有扩增反应外，其他组皆未观察到扩增反应，亦即没有交叉反应发生，因此证实了本案引物对及探针仅会靶向兹卡病毒包膜基因的特异性。
本案实施例能够在不到30分钟的时间内检测到每个反应仅有数个拷贝的兹卡基因组RNA。在灵敏度分析中，每个样本中含有1、3、5、8、10及15个拷贝的兹卡基因组RNA的样本分别进行6重复测试，且阳性检测的临界值设定为Ct值38。结果显示，每个样本中含有1、3、5、8、10及15个拷贝的样本的阳性检出率分别为1/6、2/6、4/6、5/6、6/6及6/6。如图5所示，将测得的检出率拟合到S形曲线以估算检测限(limit of detection，LoD)，其中在95％信赖度下，LoD为每个反应9.36个拷贝的基因组RNA。也就是说，本案实施例的引物对及探针能够检测每个反应低至10个拷贝的兹卡基因组RNA，显示出相当高的灵敏度。
本案实施例也能够在不到30分钟的时间内定量兹卡RNA。图6显示从不同拷贝数的兹卡RNA所产生的扩增曲线。采用本案实施例的引物对及探针，并对具有体外转录的兹卡RNA的连续稀释拷贝数(每个反应10至107个拷贝)的样本分别进行2重复测试，以确定兹卡分析的线性度。图7显示由图6结果产生的兹卡分析标准曲线。根据所得的标准曲线，扩增效率为105％，R2值为0.99。由于R2值接近最佳理论值1.0，此兹卡分析可以扩展为定量分析，以在POC检测时估算兹卡基因组RNA的数量。
本案一实施例中，正向引物基本上具有SEQ ID NO:1的序列(5’-GGAGTGGCAGCACCATTG-3’)；反向引物基本上具有SEQ ID NO:2的序列(5’-CAGGCTGTGTCTCCCAAGA-3’)；探针为逆向探针，基本上具有SEQ ID NO:3的序列(5’-TTCTCTTGGCACCTCTCACAGTGGCTTCAA-3’)。利用前述正向引物及反向引物将可扩增产生大小为82-bp的扩增子(amplicon)。
综上所述，本案实施例提供检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法，其系利用实时逆转录聚合酶链锁反应及具有特异性的引物对及探针来进行检测。本案实施例之引物对、试剂盒及方法具有高灵敏度的优点，可检测低拷贝数的兹卡RNA。本案实施例之引物对、试剂盒及方法更具有高特异性的优点，能够区别兹卡病毒与其他蚊媒病毒，这对于选择适当的兹卡感染治疗是很重要的。此外，本案实施例之引物对、试剂盒及方法具有减少反应时间的优点，并且能够在不到30分钟的时间内检测到兹卡病毒。因此，本案对于兹卡的POC分子诊断测试提供了一种可行方案。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附申请权利要求书所欲保护者。
序列表
<110> 台达电子国际（新加坡）私人有限公司（Delta Electronics Intˇl(Singapore) Pte Ltd）
<120> 检测兹卡病毒的引物对、试剂盒及方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成产生的序列
<400> 1
ggagtggcag caccattg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成产生的序列
<400> 2
caggctgtgt ctcccaaga 19
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成产生的探针
<400> 3
ttctcttggc acctctcaca gtggcttcaa 30
<210> 4
<211> 175
<212> DNA
<213> 兹卡病毒（Zika Virus）
<400> 4
gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 60
gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 120
gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatca 175

Claims (13)

1.一种用以检测兹卡病毒的引物对，包括一正向引物及一反向引物，其中该正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，且该反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
2.如权利要求1所述的引物对，其中该正向引物及该反向引物系用于实时逆转录聚合酶链锁反应。
3.一种用以检测兹卡病毒的试剂盒，包括一正向引物、一反向引物、及一探针，其中该正向引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，且该反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中该探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其中该探针包含SEQ ID NO:3的互补序列。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其中该探针的5’端接上报导染剂，且3’端接上淬灭体。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其中该正向引物、该反向引物、及该探针系用于实时逆转录聚合酶链锁反应。
8.一种用以检测兹卡病毒的方法，该方法包括利用一正向引物、一反向引物、及一探针进行实时逆转录聚合酶链锁反应来扩增兹卡病毒的核酸分子，其中该正向引物包含如SEQID NO:1所示的序列，且该反向引物包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
9.如权利要求8所述的方法，其中该探针包含如SEQ ID NO:3所示的序列。
10.如权利要求8所述的方法，其中该探针包含SEQ ID NO:3的互补序列。
11.如权利要求8所述的方法，其中该探针的5’端接上报导染剂，且3’端接上淬灭体。
12.如权利要求8所述的方法，其中该兹卡病毒的核酸分子为RNA。
13.如权利要求8所述的方法，更包括下列子步骤：
将该兹卡病毒的一基因组RNA逆转录成一互补DNA；以及
利用该正向引物、该反向引物、及该探针进行实时聚合酶链锁反应对该互补DNA进行扩增及检测。
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