JP2000102384A

JP2000102384A - 完全ｎ量体アレイを用いる核酸分析

Info

Publication number: JP2000102384A
Application number: JP11261280A
Authority: JP
Inventors: L Gunderson Kevin; エル．ガンダーソンケビン; S Chii Mark; エス．チーマーク; J Lockhart David; ジェイ．ロックハルトデイビッド
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2000-04-11
Also published as: EP0995804A3; EP0995804A2; JP2006204302A; US20020012913A1; CA2282138A1

Abstract

(57)【要約】ポリヌクレオチドの変異を特徴付ける方法が提供され
る。このような方法は、参照ポリヌクレオチドのフラグ
メントおよび標的ポリヌクレオチドのフラグメントを完
全もしくは実質的に完全なｎ量体セットを構成する一本
鎖のオーバーハングを有する同一または実質的に同一な
ポリヌクレオチドプローブのアレイに、別々にライゲー
ションし、そしてそれらのハイブリダイゼーションパタ
ーンを比較する工程を包含する。この方法はまた、多型
性の存在を検出するために使用され得る。未知の配列の
２つ以上のポリヌクレオチドが同一であるかどうかを決
定するための方法もまた、提供される。さらに、末端配
列に基づいてポリヌクレオチドのフラグメントを列挙
し、そして区別するための方法が提供される。これらの
方法は、医学、薬理遺伝学、生化学、および法医科学に
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（関連出願）本願は、１９９
８年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／１
００，３９３号からの優先権を主張し、その内容は本明
細書中に参考として援用される。

【０００２】（発明の分野）本発明は、ポリヌクレオチ
ド配列の分析に関する。それゆえ、本発明は、分子生物
学、生化学、化学、医学、および医学診断学などの多様
な分野に関する。

【０００３】

【従来の技術】ゲノム配列決定プロジェクトの目的は、
参照ゲノムの完全配列を得ることである。次の、そして
おそらくより困難な段階は、配列のバリエーションを分
析すること、およびこの情報を重要な表現型に関連付け
ることである。一本鎖ポリヌクレオチドプローブの高密
度アレイ（Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ３６４：５
５５−６，１９９３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：５０
２２−６，１９９４）は、大規模ポリヌクレオチド配
列決定分析に高度に匹敵し、そして大規模に実現可能な
（ｓｃａｌａｂｌｅ）アプローチを提供する（Ｌｉｐｓ
ｈｕｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄ
ｙｎ．１１：６３７−５３，１９９３）。遺伝学
的分析についてのＤＮＡアレイの有用性は、変異の検
出、遺伝子型決定、物理的マッピングおよび遺伝子発現
モニタリングを含む、多数の適用において以前に確証さ
れている（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６
１０−１４，１９９６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−８０，１
９９６；Ｃｒｏｎｉｎら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．
７：２４４−５５，１９９６；Ｋｏｚａｌら、Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−５９，１９９６；Ｗ
ｏｄｉｃｋａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：
１３５９−７２，１９９７）。

【０００４】いくつかのアッセイ形式において、固体支
持体に固定された一本鎖ポリヌクレオチドプローブアレ
イが、標的ポリヌクレオチド中の特定のポリヌクレオチ
ド配列を検出するために使用されてきた。例えば、ＰＣ
Ｔ特許公開番号ＷＯ８９／１０９７７および８９／１１
５４８を参照のこと。ＶＬＳＩＰＳ^TM技術の開発は、非
常に小さい領域における一本鎖のポリヌクレオチドプロ
ーブの非常に大きいアレイの作製の方法を提供した。米
国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公開番
号ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２（こ
れらの各々は本明細書中で援用される）を参照のこと。
米国特許第５，８３７，８３２号は、「ＤＮＡチップ」
と呼ばれる一本鎖ポリヌクレオチドプローブの多数のア
レイの微小製作の方法を記載し、そこではプローブはア
レイのあらかじめ規定された位置に特定の配列を有し、
特定の標的ポリヌクレオチドの同定を容易にするか、ま
たはサンプル中の標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特
定の配列が、先に特徴付けた配列から変化しているかど
うかを検出する。

【０００５】今日まで首尾よく使用されてきた一本鎖ポ
リヌクレオチドプローブのアレイの大部分は、あらかじ
め規定された参照配列に基づいて特別に調製されたカス
タマイズされたプローブのセットを使用してきた。より
一般的には、アレイに基づく配列決定および遺伝的分析
（すなわち、変異および多型性分析）へのより効率よ
く、より迅速なアプローチは、所定の長さの一本鎖ポリ
ヌクレオチドプローブの完全セット（「ｎ量体セッ
ト」）を使用することであり得、その結果、この技術に
存在する問題が打破され得る場合は、原理的にはいかな
る標的配列も分析され得る。

【０００６】一本鎖ポリヌクレオチドの完全ｎ量体プロ
ーブセットの開発において主要な問題が存在する。第１
に、ｎ量体（４ⁿ）の完全セットのプローブの総数が、
「ｎ」が増加するにつれて非常に大きくなり得る。技術
的進歩がなされ、多数の核酸プローブアレイの合成が容
易になったのはようやく最近のことであった。

【０００７】さらに、ｎ量体プローブの完全セットへの
ハイブリダイゼーションに基づくＤＮＡ配列再構築を記
載するいくつかの理論的な提案が提出されたが（Ｂａｉ
ｎｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏ
ｌ．１３５：３０３−７，１９８８；Ｌｙｓｏｖ
Ｉｕら、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．ＮａｕｋＳＳＳ
Ｒ３０３：１５０８−１１，１９８８；Ｄｒｍａ
ｎａｃら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：１１４−２８，
１９８９）、これらの方法は成功しなかった。配列再構
成は、複合ポリヌクレオチドにおける配列反復の存在、
およびｎ量体の独自性の欠如から生ずる不明確さによっ
て妨害されてきた。さらなる問題には、必然的に不完全
であるハイブリダイゼーションデータを取り扱うための
コンピューター化された方法、および分析的方法の不足
が含まれる。

【０００８】米国特許第５，５０３，９８０号は、配列
決定および分析のための定常的な二本鎖領域および可変
的な一本鎖領域を有するポリヌクレオチドのアレイを記
載する。’９８０の方法はプローブアレイへの標的ポリ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使用した。ハ
イブリダイゼーションに続いてライゲーションを行っ
た。しかし、多くの工程を含む’９８０特許の方法論は
煩わしく、そしてプローブの単一のアレイ上で多くの異
なったサンプルを試験することを可能にするための標準
化はされていない。

【０００９】例えば、’９８０特許の方法は、プローブ
アレイをカスタマイズするために参照ポリヌクレオチド
を使用すること、次いで標的ポリヌクレオチド中の変異
を検出するためにそのカスタマイズされたプローブアレ
イを使用することを必要とした。結果として、’９８０
の方法論は、そのために設計された標的ポリヌクレオチ
ドのみにおける変異を検出するために有用であるプロー
ブアレイを産生する。さらに、この方法論は、単一の置
換変異のみ（挿入または欠失ではなく）を検出し得、そ
してそれが検出する変異を特徴付けし得ないし、またヌ
クレオチド配列中の変異の位置を同定し得ない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】ハイブリダイゼーショ
ンによる配列決定に固有の困難さを避ける一方、完全な
ｎ量体アレイの利点を保持るような配列分析の方法（例
えば、変異の特徴付け、多型性配列の検出など）が所望
される。特に、所定の長さのポリヌクレオチドの標準化
されたアレイの完全セットは、各々の標的に対する特異
的なアレイを構築する必要性なしで、高度に所望され
る。このような標準化されたアレイ方法論は、さまざま
な供給源由来の標的ポリヌクレオチド中における変異の
特徴付けおよび多型性配列のバリエーションの検出を含
む、直接的、正確、そして効率的な配列分析を可能にす
る。本発明はこれらの必要性を満たす。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下を提供す
る：１．標的ポリヌクレオチドの変異の存在を決定する方法
であって、以下の工程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）該標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイのプロ
ーブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリダ
イズさせ、標的ハイブリダイゼーションパターンを生成
する工程；（ｃ）参照ポリヌクレオチドを、第２のアレイのプロー
ブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリダイ
ズさせ、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成す
る工程；および（ｄ）該参照ハイブリダイゼーションパターンと該標的
ハイブリダイゼーションパターンとを比較することによ
って、該標的ポリヌクレオチド中の変異の存在を決定す
る工程、を包含する方法。

【００１２】２．前記工程ｂ）において、前記ハイブリ
ダイズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにライ
ゲートされる、項１に記載の方法。

【００１３】３．前記工程ｃ）において、前記ハイブリ
ダイズした参照ポリヌクレオチドが前記プローブにライ
ゲートされる、項１に記載の方法。

【００１４】４．前記オーバーハングが遊離の５’末端
を有する、項１に記載の方法。

【００１５】５．前記オーバーハングが遊離の３’末端
を有する、項１に記載の方法。

【００１６】６．前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオチ
ドを含む、項１に記載の方法。

【００１７】７．前記変異が置換変異である、項１に記
載の方法。

【００１８】８．前記変異が欠失変異である、項１に記
載の方法。

【００１９】９．前記変異が挿入変異である、項１に記
載の方法。

【００２０】１０．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞
性線維症膜貫通伝導性調節遺伝子、ｐ５３遺伝子、ミト
コンドリアＤＮＡ、またはＨＩＶ遺伝子からなる群から
選択される、項１に記載の方法。

【００２１】１１．前記アレイが平行に配置されてい
る、項１に記載の方法。

【００２２】１２．２つ以上の標的ポリヌクレオチドが
同一かどうかを決定する方法であって、以下の工程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）第１の標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイの
プローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブ
リダイズさせ、第１のハイブリダイゼーションパターン
を生成する工程；（ｃ）第２の標的ポリヌクレオチドを、第２のアレイの
プローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブ
リダイズさせ、第２のハイブリダイゼーションパターン
を生成する工程；および（ｄ）第１のハイブリダイゼーションパターンと第２の
ハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程、を
包含する方法。

【００２３】１３．前記工程ｂ）において、前記ハイブ
リダイズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにラ
イゲートされる、項１２に記載の方法。

【００２４】１４．前記工程ｃ）において、前記ハイブ
リダイズした参照ポリヌクレオチドが前記プローブにラ
イゲートされる、項１２に記載の方法。

【００２５】１５．前記オーバーハングが遊離の５’末
端を有する、項１２に記載の方法。

【００２６】１６．前記オーバーハングが遊離の３’末
端を有する、項１２に記載の方法。

【００２７】１７．前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオ
チドを含む、項１２に記載の方法。

【００２８】１８．前記アレイが平行に配置される、項
１２に記載の方法。

【００２９】１９．ポリヌクレオチドの混合物中の個々
のポリヌクレオチドを区別する方法であって、以下の工
程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全なまたは実質的
に完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）該混合物中のポリヌクレオチドを、該アレイのプ
ローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリ
ダイズさせる工程；および（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを決定する工
程、を包含する工程。

【００３０】２０．前記区別された個々のポリヌクレオ
チドを数え挙げる工程をさらに含む、項１９に記載の方
法。

【００３１】２１．前記工程ｂ）において、前記ハイブ
リダイズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにラ
イゲートされる、項１９に記載の方法。

【００３２】２２．前記オーバーハングが遊離の５’末
端を有する、項１９に記載の方法。

【００３３】２３．前記オーバーハングが遊離の３’末
端を有する、項１９に記載の方法。

【００３４】２４．前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオ
チドを含む、項１９に記載の方法。

【００３５】２５．前記アレイが平行に配置される、項
１９に記載の方法。標的ポリヌクレオチドにおける変
異の存在を決定する方法が提供される。この方法は以下
の工程を含む：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイ中のプロ
ーブポリヌクレオチドの前記オーバーハングにハイブリ
ダイズさせ、標的ハイブリダイゼーションパターンを生
成する工程；（ｃ）参照ポリヌクレオチドを、第２のアレイ中のプロ
ーブポリヌクレオチドの前記オーバーハングにハイブリ
ダイズさせ、参照ハイブリダイゼーションパターンを生
成する工程；および（ｄ）参照ハイブリダイゼーションパターンおよび標的
ハイブリダイゼーションパターンを比較することによっ
て、標的ポリヌクレオチド中の変異の存在を決定する工
程。

【００３６】以下の工程を包含する方法がまた、２つ以
上の標的ポリヌクレオチドが同一であるかどうかを決定
するために提供される：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブが
二本鎖領域、および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域を
含む、工程；（ｂ）第１の標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイの
プローブポリヌクレオチドの前記オーバーハングにハイ
ブリダイズさせ、第１のハイブリダイゼーションパター
ンを生成する工程；（ｃ）第２の標的ポリヌクレオチドを、第２のアレイの
プローブポリヌクレオチドの前記オーバーハングにハイ
ブリダイズさせ、第２のハイブリダイゼーションパター
ンを生成する工程；および（ｄ）第１および第２のハイブリダイゼーションパター
ンを比較する工程。

【００３７】さらに、以下の工程を包含する、ポリヌク
レオチドの混合物中の個々のポリヌクレオチドを区別お
よび列挙する方法が提供される：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブが
二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域を含
む、工程；（ｂ）混合物中のポリヌクレオチドを、アレイのプロー
ブポリヌクレオチドの前記オーバーハングにハイブリダ
イズさせる工程；および（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを決定する工
程。

【００３８】

【発明の実施の形態】本開示を通して、種々の刊行物、
特許、および公開特許明細書は、確認された引用によっ
て援用される。これらの刊行物、特許、および公開特許
明細書の開示は、本明細書中にその全体が本開示に対す
る参考として援用される。

【００３９】（Ａ．一般的技術）本発明の実施は、他に
断らない限り、有機化学、分子生物学（組換え技術を含
む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を
利用し得、これらは当該分野の範囲内である。このよう
な従来技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼー
ション、ライゲーション、標識を用いてのハイブリダイ
ゼーションの検出を含む。適切な技術の特定の例示は、
以下の実施例に参考として含まれ得る。しかし、他の等
価な従来手順もまた、当然ながら使用され得る。このよ
うな従来技術は、例えば、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓ
ｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒ
ｉｅｓ（Ｉ〜ＩＶ巻）、ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｅ
ｌｌｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、
ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（すべ
てＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓより）のような標準的な実験室マ
ニュアルに見出され得る。

【００４０】（Ｂ．定義）本明細書で使用されるよう
に、特定の用語は以下に定義する意味を有し得る。

【００４１】明細書および請求項で使用するように、単
数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に
別に指示しない限りは、複数の引用を含み得る。例え
ば、用語「ａｎａｒｒａｙ」は、文脈が明確に別に指
示しない限りは、複数のアレイを含み得る。

【００４２】「アレイ」は、意図的に作製した分子の収
集物を表し、これは合成的または生合成的に調製され得
る。特に、本明細書中で用語「アレイ」は、支持体上に
意図的に作製したポリヌクレオチドの収集物を意味し、
そこでは所定のあらかじめ定義した領域において各々の
ポリヌクレオチドの同一性が知られる。従って、用語
「アレイ」および「生物学的チップ」は、相互に交換可
能に用いられる。

【００４３】分子アレイは、種々の異なった形式（例え
ば、可溶性分子のライブラリー；および樹脂ビーズ、シ
リカチップ、または他の固体支持体につないだ化合物の
ライブラリー）において生物学的活性についてスクリー
ニングされ得る。固体基板上におけるポリヌクレオチド
アレイの作製、および異なったアッセイにおけるアレイ
の使用の方法は、以下：米国特許第５，６７７，１９５
号、同第５，６２４，７１１号、同第５，５９９，６９
５号、同第５，４４５，９３４号、同第５，４５１，６
８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４１２，
０８７号、同第５，４０５，７８３号、同第５，３８
４，２６１号、同第５，２５２，７４３号、同第５，７
４４，１０１号、同第５，１４３，８５４号、およびＰ
ＣＴＷＯ９２／１００９２に記載され、これらの各々
の開示は本明細書中に援用される。

【００４４】「固体支持体」「支持体」および「基板」
は、強固な、または半強固な１つまたは複数の表面を有
する物質または物質群をいう。多くの実施態様におい
て、少なくとも１つの固体支持体の表面は実質的に平坦
であり、しかしいくつかの実施態様においては、異なっ
た化合物のための合成領域を、例えば、ウェル、上昇さ
せた領域、ピン、刻印した溝などで物理的に分離するこ
とが所望され得る。他の実施態様に従って、固体支持体
は、ビーズ、樹脂、ゲル、微粒子または他の幾何学的な
構成をとる。

【００４５】「あらかじめ規定された領域」は、固体支
持体上の局在化した領域をいい、それは選択された分子
の形成に使用されるか、使用されたか、または使用され
るように意図され、そしてさもなくば、本明細書中で代
替的に「選択された」領域といわれる。あらかじめ規定
された領域は、例えば円形、長方形、楕円形、くさび型
などの任意の便利な形状を有し得る。本明細書では、簡
略化のために、「あらかじめ規定された領域」は、時々
単に「領域」といわれる。いくつかの実施態様におい
て、あらかじめ規定された領域、およびそれゆえに、各
々の別個の化合物が合成される領域は、約１ｃｍ²より
小さいか、または１ｍｍ²未満でさえある。さらなる実
施態様において、あらかじめ規定された領域は、領域
（すなわち、ビーズ、樹脂、ゲルなど）をウェル、トレ
イなどへと物理的に分離することによって達成され得
る。

【００４６】本明細書で使用されるように、「ポリヌク
レオチド」は、２つ以上のヌクレオチドの配列である。
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列を含み、これらは
天然の供給源から単離され得るか、組換え的に産生され
るか、または人工的に合成され得る。本発明のポリヌク
レオチドのさらなる例は、ポリアミドポリヌクレオチド
であり得る。本発明はまた、特定のｔＲＮＡ分子中で同
定されそして三重らせん中に存在することが仮定されて
いる、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対のような非従来的な塩
基対が存在する状況を包含する。

【００４７】用語「ヌクレオチド」は、デオキシヌクレ
オチドおよびそのアナログを含む。これらのアナログ
は、ポリヌクレオチド配列に組み込まれた場合、それら
が溶液中で相補的なポリヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションを可能にするような、天然に生じるヌクレオ
チドと共通したいくつかの構造的な特徴を有する分子で
ある。代表的には、これらのアナログは１つまたは複数
の修飾した塩基、ならびにリボースおよびホスホジエス
テル部分の修飾形態を有し得る。変化は、ハイブリッド
形成の安定化もしくは不安定化のために、または所望す
るように相補的ポリヌクレオチド配列とのハイブリダイ
ゼーションの特異性を増強するために、またはポリヌク
レオチドの安定性を増強するために、あつらえ仕立てに
作製され得る。

【００４８】アナログはまた、ポリヌクレオチド合成に
おいて便利に使用されるように、保護および／または修
飾されたモノマーを含む。当業者がよく気付いているよ
うに、ポリヌクレオチド合成は種々の塩基保護したヌク
レオシド誘導体を使用し、そこではプリンおよびピリミ
ジン部分の１つ以上の窒素が、ジメトキシトリチル、ベ
ンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、などといった
基によって保護される。

【００４９】例えば、構造的な基が、必要に応じてポリ
ヌクレオチドへの組み込みのためにヌクレオシドのリボ
ースまたは塩基に添加される（例えば、リボースの２’
−Ｏ位でのメチル基、プロピル基、またはアリル基、ま
たは２’−Ｏ基を置換するフルオロ基、またはリボヌク
レオシド塩基のブロモ基）。２’−Ｏ−メチルオリゴリ
ボヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮ）は、相補的ポ
リヌクレオチド（特にＲＮＡ）に対して、それらの修飾
していない対応物よりも高いアフィニティーを有する。
２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮＡホスホラミダイトモノマーは市
販されている（例えば、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓＣｏｒ
ｐ．またはＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．
より）。あるいは、プリンまたはピリミジン複素環の
１つ以上のＮ原子がＣ原子によって置換されているデア
ザプリンおよびデアザピリミジンがまた、使用され得
る。

【００５０】ポリヌクレオチドのホスホジエステル結
合、または「糖−リン酸骨格」はまた、例えば、メチル
ホスホン酸、Ｏ−メチルリン酸またはホスホロチオネー
トで置換または修飾され得る。本開示の目的のためのこ
のような修飾した結合を含むポリヌクレオチドの別の例
は、「ペプチドポリヌクレオチド」を含有し、ここでは
ポリアミド骨格がポリヌクレオチド塩基または修飾した
ポリヌクレオチド塩基に接続されている。天然に生じる
ヌクレオチドに見出されるポリアミド骨格および塩基を
含むペプチドポリヌクレオチドは、例えばＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市
販されている。米国特許第５，７７３，５７１号および
同第５，７８６，４６１号もまた参照のこと。

【００５１】修飾した塩基を有するヌクレオチドはま
た、本発明で使用され得る。塩基修飾のいくつかの例
は、２−アミノアデニン、５−メチルシトシン、５−
（プロピン−１−イル）シトシン、５−（プロピン−１
−イル）ウラシル、５−ブロモウラシル、５−ブロモシ
トシン、ヒドロキシメチルシトシン、メチルウラシル、
ヒドロキシメチルウラシル、およびジヒドロキシペンチ
ルウラシルを含み、これらは相補的なポリヌクレオチド
の結合アフィニティーを修飾するためにポリヌクレオチ
ドに組み込まれ得る。

【００５２】官能基はまた、ヌクレオシド糖の環または
プリン環もしくはピリミジン環の種々の位置にライゲー
トされ得、これは負に荷電したリン酸骨格との静電的な
相互作用によって、または主溝および副溝における相互
作用を通して二重鎖を安定化し得る。例えば、アデノシ
ンおよびグアノシンヌクレオチドは、イミダゾールイル
プロピル基を有するＮ²位で置換され得、二重鎖の安定
性を増加する。３−ニトロピロールおよび５−ニトロイ
ンドールのような汎用の塩基アナログもまた、含まれ得
る。本発明における使用に適する種々の修飾したポリヌ
クレオチドは、例えば、「ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ
ｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓ．
Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．ＬｅＢｌｅｕ（編）（ＣＲ
ＣＰｒｅｓｓ，１９９３）および「Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＡｎ
ｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ」ＡＣＳＳｙｍ
ｐ．Ｓｅｒ．＃５８０，Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉお
よびＰ．Ｄ．Ｃｏｏｋ（編）ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９４に記載される。

【００５３】「標的」ポリヌクレオチドは、例えば、そ
の変異によって特徴付けられるポリヌクレオチドであ
る。一般的に、標的ヌクレオチドの配列は未知である。
しかし、いくつかの局面において、例えば、複数の標的
ポリヌクレオチドが同一であるかどうかを決定する場
合、１つのポリヌクレオチドの配列が知られ得る。標的
は、任意の生物学的供給源に由来し得、さらに部分的ま
たは全体的に合成され得る。

【００５４】「参照」ポリヌクレオチドは、そのプロー
ブアレイに対するハイブリダイゼーションパターンが、
別の同一なまたは実質的に同一なプローブアレイに対す
る標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションパタ
ーンと比較されるポリヌクレオチドである。参照ポリヌ
クレオチドの配列は既知であり得るが、配列が既知であ
ることは必須ではない。

【００５５】ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、
任意の長さであり得るポリヌクレオチドの部分である。
このようなフラグメントは、一本鎖または二本鎖ポリヌ
クレオチドであり得、あるいは一本鎖および二本鎖部分
の両方を含有し得る。

【００５６】「ポリヌクレオチドプローブ」は、本明細
書中に記載されるハイブリダイゼーション工程およびラ
イゲーション工程に使用され得る一本鎖および二本鎖ポ
リヌクレオチドの任意の配列である。最も一般的には、
ポリヌクレオチドプローブは一本鎖ポリヌクレオチド領
域に共有結合した二本鎖ポリヌクレオチド領域からな
る。各プローブの二本鎖領域についてのポリヌクレオチ
ド配列は、同一であり得るか、または異なり得る。作製
の簡便さのため、二本鎖領域は各プローブにおいて同一
であり得、そしてこのような同一領域はまた、「定常」
領域として公知であり得る。

【００５７】一本鎖領域におけるヌクレオチドは好まし
くは可変性である。この一本鎖可変領域は「オーバーハ
ング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）」として公知であり、そして
このオーバーハングは５’配向性または３’配向性であ
り得る（すなわち、それぞれフリーの５’末端またはフ
リーの３’末端を所有し得る）。さらに、オーバーハン
グはいくつかのヌクレオチド（「ｎ量体」）のものであ
り得、例えば、約４〜約５０ヌクレオチドの範囲であり
得る。好ましくは、オーバーハングは約５〜約２０ヌク
レオチドであり、より好ましくは約６〜約１２ヌクレオ
チドであり、そして最も好ましくは８〜９ヌクレオチド
である。

【００５８】用語「ハイブリダイゼーション」は、２つ
の一本鎖ポリヌクレオチドが非共有的に結合して安定な
二本鎖ポリヌクレオチドを形成する工程をいい；三本鎖
ハイブリダイゼーションもまた、理論的に可能である。
得られる（通常の）二本鎖ポリヌクレオチドは「ハイブ
リッド」である。安定なハイブリッドを形成するポリヌ
クレオチドの集団の割合を、本明細書中では「ハイブリ
ダイゼーションの程度」という。

【００５９】ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション
アッセイを行う方法は、当該分野において十分開発され
ている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条
件は、適用に依存して変化し、そして以下に記載される
方法を含む、公知の一般的結合方法に従って選択され
る：Ｍａｎｉａｔｉｓら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ」第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ．，１９８９；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅ
ｌ、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｙｍｏｌｏｇｙ」１
５２巻、「ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．，１９８７；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
０：１９９４（１９８３）、これらはそれぞれ本明細書
中に、参考として援用される。

【００６０】２つの一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリ
ダイズする能力は、その相補性の程度およびハイブリダ
イゼーション反応条件のストリンジェンシーのような因
子に依存することが理解される。

【００６１】本明細書中で使用される場合、「ストリン
ジェンシー」とは、ポリヌクレオチドがハイブリダイズ
する程度に影響を与えるハイブリダイゼーション反応の
条件をいう。ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオ
チド二重鎖がそのミスマッチの程度に基づいて区別され
ることを可能にする条件が選択され得る。高いストリン
ジェンシーは、ミスマッチした塩基を含有する二重鎖の
形成についての低い可能性と、相関関係にある。従っ
て、ストリンジェンシーが高くなるほど、ミスマッチし
た二重鎖を形成し得る２つの一本鎖ポリヌクレオチドが
一本鎖のまま残る可能性が高くなる。逆に、より低いス
トリンジェンシーにおいては、ミスマッチした二重鎖を
形成する可能性は増加する。

【００６２】１つ以上のミスマッチを含有する二重鎖と
比較して、完全にマッチした二重鎖の選択を可能にする
適切なストリンジェンシー（または、高い程度のミスマ
ッチを含有する二重鎖と比較して、特定のミスマッチし
た二重鎖の選択を可能にする適切なストリンジェンシ
ー）は、一般に経験的に決定される。ハイブリダイゼー
ション反応のストリンジェンシーを調整する方法は、当
業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１
９８７、１９８８、１９８９、１９９０、１９９１、１
９９２、１９９３、１９９４、１９９５、１９９６およ
び定期的な最新刊まで；ならびにＨａｍｅｓら、「Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：
ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬＰ
ｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，１９８５を参照のこと。

【００６３】一般に、ストリンジェンシーを増加させる
（すなわち、より密接にマッチした二重鎖の形成を選択
する）条件は、より高い温度、より低いイオン強度、お
よび溶媒の存在または非存在を含み；より低いストリン
ジェンシーは、より低い温度、より高いイオン強度およ
びより低い濃度またはより高い濃度の溶媒（例えば、よ
り低い濃度のホルムアミドまたはジメチルスルホキシ
ド）により好都合とされる。ハイブリダイゼーション反
応の時間および反応物（すなわち、一本鎖ポリヌクレオ
チド）の濃度もまたストリンジェンシーに影響し、短い
反応時間および低い反応物濃度はより高いストリンジェ
ンシーを好む。

【００６４】用語「ライゲーション」とは、２つの別々
のポリヌクレオチド鎖上の２つの末端ヌクレオチドを共
有結合させ、それによって２つの鎖が１つの一本鎖に連
結されるプロセスをいう。本発明の方法論において、い
くつかの局面において、ハイブリダイゼーションおよび
ライゲーションは、１つの工程において達成される。

【００６５】「ｎ量体」とは、「ｎ」数のヌクレオチド
の一本鎖ポリヌクレオチドである。ｎ量体の「完全なセ
ット」とは、「ｎ」数のヌクレオチドの一本鎖ポリヌク
レオチドのセットをいい、ここでセットとは「ｎ」個の
ヌクレオチドの全ての可能な組合せを示す。例えば、
「ｎ」が８を示す場合、完全なｎ量体のセットとは、４
⁸の一本鎖ポリヌクレオチドを示す。ｎ量体の「実質的
に完全なセット」とは、「ｎ」個のヌクレオチドの全て
の可能な組合せを有さなくてもよいが、標的ポリヌクレ
オチド中の変異が特徴付けられるようにプローブとして
使用されるような一本鎖の十分な数を提供するセットを
表す。従って、いくつかの局面において、このような実
質的に完全なセットは一本鎖ポリヌクレオチドプローブ
のサブセットを含み得る。

【００６６】アレイの記載の状況において使用される場
合、用語「実質的に同一」とは、各プローブの構成に関
して同一でなくてもよいアレイをいう。しかし、このよ
うなアレイは、標的ポリヌクレオチドにおける変異が特
徴付けられ得るような本発明のハイブリダイゼーション
およびライゲーション工程に参加することに関しては、
機能的である。例えば、１つのアレイが特定の位置の特
定の塩基を有するプローブを提供し、そして他方のアレ
イが対応する位置の塩基のアナログを提供する場合、２
つのアレイは実質的に同一であり得る。

【００６７】用語「塩基呼び出し（ｂａｓｅｃａｌ
ｌ）」とは、標的ポリヌクレオチド中の未知の塩基の同
定の決定をいう。塩基呼び出し方法は、標的ポリヌクレ
オチドとプローブポリヌクレオチドとの間のハイブリダ
イゼーションの程度を、参照ポリヌクレオチドとプロー
ブポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの
程度と比較することによりなされ得る。所定の場合、塩
基呼び出しはハイブリダイゼーションの限界の程度を選
択することによりなされ得るかまたは抑制され得る。

【００６８】「塩基呼び出しセット」は、特定のヌクレ
オチド、または標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド
の配列のための塩基呼び出しを生じるポリヌクレオチド
の集団のセットである。従って、各塩基呼び出しセット
は単一の置換位置（図３において文字Ｎによって示す）
で異なる４つのプローブからなり、特定の標的塩基を問
いただすように配置される。

【００６９】「変異」は、正常な（「野生型」）集団の
ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列中の変化である。「置換」変異とは、あるヌクレ
オチドが別のヌクレオチドにより置換されたものであ
る。「欠失」変異とは、１つ以上のヌクレオチドが正常
な配列から欠失され、そして「挿入」変異とは、１つ以
上のヌクレオチドが正常な配列中に挿入されたものであ
る。「ホモ接合性」変異とは、２倍体生物中の両方の染
色体に現れる変異である。「ヘテロ接合体」変異とは、
２倍体生物中の１つの染色体のみに現れる変異であり、
他方の染色体は正常である。変異は、例えば、４３５位
でのＡ→Ｇ置換として特徴付けられ得る。

【００７０】「多型性」とは、同じ集団における、複数
の別々の対立遺伝子状態の発生であって、その状態の少
なくとも１つが高い頻度（通常は＞１％以上）を有する
状態である、発生である。当業者にとって、用語「多型
性」が変異に関することは公知である。

【００７１】本開示にわたって、本発明の種々の局面は
ある範囲の形式で存在する。ある範囲の形式における記
載は単に簡便さおよび簡潔さのためのものであり、なら
びに本発明の範囲における確固たる制限として構成され
るべきではないことが理解されるべきである。従って、
ある範囲の記載は、可能な部分集合ならびにその範囲内
の個々の数値を全て詳細に開示したと見なされるべきで
ある。例えば、４〜５０のような範囲の記載は４〜１
０、４〜２０、４〜３０、４〜４０、４〜５０、５〜１
０、５〜２０など、ならびに例えば、６、８、１５、２
０、３２、３９、４３、４８などの範囲内の個々の数の
ような全ての部分集合を詳細に開示したと見なされるべ
きである。この適応は範囲の広さとは見なされない。

【００７２】（Ｃ．方法）１．概要本発明は、標的ポリヌクレオチドにおける変異の存在
を、「ｎ量体オーバーハング」として公知の可変一本鎖
領域を有する二本鎖ポリヌクレオチド領域を有する完全
なまたは実質的に完全なｎ量体アレイのポリヌクレオチ
ドプローブを用いて、決定する方法を提供する。１つの
方法は標的ポリヌクレオチドのフラグメントを、アレイ
のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる工
程を包含する。別の同一なまたは実質的に同一なアレイ
のポリヌクレオチドプローブは、参照ポリヌクレオチド
のフラグメントと同様にハイブリダイズする。アレイ上
の標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーションパターンは直接比較され、変異の存
在の決定を可能にし得る。

【００７３】方法論の感度および精度は、ハイブリダイ
ゼーションパターンから「仮想タイリング（ｖｉｒｔｕ
ａｌｔｉｌｉｎｇ）」（以下を参照のこと）を作製
し、そして仮想タイリングを直接比較することによって
増加され得る。このような直接的な比較によって、全体
的および再生産可能な交差ハイブリダイゼーションなら
びに複数のプローブ標的相互作用から得られる、潜在的
に混乱させるシグナルを減算する。この方法は、２．５
ｋｂｐの標的において９０％より多くの変異検出感度を
与え（８量体のアレイ上で）、非常に正確性が高い（す
なわち、低い数の偽陽性、１塩基当たり＜０．０２
％）。仮想タイリング工程は、適切な照会プローブを電
子的に組み立てることによって標的内の、予測できない
変異（挿入、欠失、複数の点変異）の検出の焦点、を絞
った検索を可能にする。

【００７４】本明細書中に開示される場合、本発明の方
法は変異の存在の決定のみではなく、変異の位置および
型の同定（すなわち、変異が単一または複数の塩基の置
換、欠失、もしくは挿入であるかどうか）にも関する。
本方法はまた、ホモ接合型、およびヘテロ接合型変異の
両方ならびに多型性の検出にも使用され得る。さらに、
本方法は２つ以上の未知のポリヌクレオチド配列を比較
してこれらが同一であるかどうかを決定するためにも使
用され得、これはポリヌクレオチドの１つの配列を参照
として作用させるために知る必要がない。これらの方法
はこのような分析を可能にする。なぜならば、配列を比
較する伝統的な技術と異なり、これらの方法はハイブリ
ダイゼーションパターンを比較するからである。

【００７５】従って、複数のポリヌクレオチドを迅速に
および正確に比較し、これらが配列において同一である
かどうかを決定し得る。これらの迅速なおよび正確な方
法は、配列決定を行う必要性または任意のポリヌクレオ
チドの配列が公知である必要性を伴わずに種々の供給源
からのポリヌクレオチドを比較する、法医学的な目的に
特に有用である。これらの方法は、それらの正確さ、感
度、それゆえに法廷における広範な採用を得ることが期
待され得るという点で、従来の方法を越える利点を提供
し得る。さらに、本方法は、曝露の前後のハイブリダイ
ゼーションパターンを比較することによって、薬剤、化
学物質、放射能、ストレス、または環境因子の遺伝子に
対する変異性の影響を迅速にスクリーニングするために
使用され得る。本方法の汎用性は、さらに、以下に記載
される技術および米国特許第５，５４５，５３１号に記
載される技術を並行して処理することによって、利用さ
れ得、そしてそれによって複数のポリヌクレオチド配列
が同時に分析され得る。

【００７６】標準化された、完全なまたは実質的に完全
なアレイの使用は、分析されるべき各ポリヌクレオチド
に対してカスタマイズされたアレイを構築する必要性を
排除し、そしてこのことは「１つのサイズが全てに適合
する（ｏｎｅ−ｓｉｚｅ−ｆｉｔｓ−ａｌｌ）」方法論
（これは実質的にいずれのポリヌクレオチド分析にも使
用され得る）を提供する。従って、本方法は従来のゲル
に基づいた複雑なポリヌクレオチドサンプルの分析に代
わる、技術の開発に対する一般的な枠組み、および全体
的に配列決定に基づく方法を提供する。

【００７７】本発明を実施する１つの方法は、参照ポリ
ヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドとハイブリダ
イズする同一なプローブアレイまたは実質的に同一なプ
ローブアレイの使用に関する。本発明はまた、参照ポリ
ヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドが首尾良くハ
イブリダイズする単一のアレイを用いて、各々分析さ
れ、そして保存されたハイブリダイゼーションパターン
を用いて、実施され得る。あるいは、２つのセットのプ
ローブが１つの基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に提供さ
れ、ここで２つのプローブセットは明確に着色されるか
または標識化され、その結果として、標的および参照物
の両方について同時に本発明が行われ得る。

【００７８】本明細書中に記載される方法は、２つ以上
のアレイの使用がそれぞれ意図され、ここで各アレイは
完全なｎ量体のセットのプローブのポリヌクレオチドを
構築する。これは完全に当業者の範囲内であり、本方法
（ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび特徴
付け）は並行して行われ、ここで複数のアレイは、複数
の試験ウェルを有し、そして各試験ウェルは生物学的チ
ップまたはアレイを包含する１つのプレート（生物学的
チッププレート）上に提供され得る。このような分析の
並行法は、米国特許５，５４５，５３１号に記載され、
これは本明細書中においてその全体が参照として援用さ
れる。

【００７９】簡便には、標的ポリヌクレオチドおよび参
照ポリヌクレオチドは試験ウェル中に導入され得る。体
液操作デバイスは、例えば、体液をウェルに添加するこ
と、またはウェルから除去することによって、ウェル中
の液体を所定の温度に維持することによって、ならびに
必要な場合ウェルを撹拌し、それによって種々のハイブ
リダイゼーション、ライゲーションおよび洗浄工程を行
うことにより、試験ウェルを選択されたセットの反応条
件に曝露し得る。次いでアレイの読み取りは試験ウェル
中のプローブアレイを審問し得、それによりハイブリダ
イゼーションデータを得る。適切なプログラムを備えた
コンピューターは、さらに本明細書中に記載されるよう
なハイブリダイゼーションパターンを分析し得る。この
ような並行処理は効率を非常に改善させる。

【００８０】本発明の方法は任意のポリヌクレオチドに
関する変異を特徴付けるために使用され得る。例えば、
嚢胞性線維症に関する変異（ＣＦＴＲ遺伝子、腫瘍抑制
因子ｐ５３遺伝子およびＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子に関す
る変異を含む）が特徴付けられ得る。本方法はまた、Ｄ
ＮＡフィンガープリンティング、配列特異的５’末端サ
ンプリング、および異なる遺伝子発現アッセイに有用な
技術、酵素的および化学的なミスマッチの切断ならびに
ポリヌクレオチドスキャニングのような、法医学的な同
定目的のための、ミトコンドリアＤＮＡの特異的な配列
を検出する技術を提供する。

【００８１】２．完全なまたは実質的に完全なｎ量体ア
レイａ）アレイの特徴本発明のポリヌクレオチドプローブのアレイは予め規定
された領域で基板に付着されたポリヌクレオチドプロー
ブを包含する。ポリヌクレオチドプローブの１つの例が
図１に示されている。

【００８２】各プローブは二本鎖領域および一本鎖領域
を含む。一つの局面において、プローブの二本鎖部分は
固体基板上に共有結合されている。必要に応じて二本鎖
部分はソラレンのような架橋剤を用いて共有結合され
る。プローブの二本鎖部分は約４〜約２００以上のヌク
レオチド長であり得る。１つの局面において、ポリヌク
レオチドプローブの二本鎖部分は、定常である（すなわ
ち、所定のアレイにおいて、あるプローブから別のもの
に変化しない）ヌクレオチド配列からなる。しかし、プ
ローブからプローブへと異なる二本鎖部分を用いて本発
明を実施することは可能であり、いくつかの場合におい
て所望され得る。二本鎖領域の存在は、本方法における
ハイブリダイゼーション工程の後に行われるべきライゲ
ーション工程を可能にする。

【００８３】ポリヌクレオチドプローブの一本鎖領域は
「オーバーハング」として公知であり、そしてこれらの
オーバーハングは５’または３’配向性であり得る（す
なわち、それぞれフリーの５’末端またはフリーの３’
末端を有し得る）。図１は５’配向性であるオーバーハ
ングを示す。オーバーハングは任意の長さ（「ｎ」）の
異なるヌクレオチドであり得、「ｎ量体」として公知で
ある。本明細書中に記載される場合、完全な「ｎ量体ア
レイ」とは、プローブの一本鎖部分の「ｎ」長の配列の
全ての可能な組合せを包含する。４つの塩基のいずれも
オーバーハングの任意の部分に存在し得るので、完全な
アレイのプローブの一本鎖部分に対する可能なヌクレオ
チド配列の総数は、４ⁿである。例えば、ｎ＝８の場
合、プローブ配列の総数は４⁸＝６５，５３６である。
オーバーハングの長さは、例えば、約４〜約５０以上の
ヌクレオチドであるが、より短いおよびより長い鎖もま
た、使用され得る。好ましくは、オーバーハングは約６
〜約１２ヌクレオチドそしてより好ましくは約８〜約９
ヌクレオチドである。

【００８４】完全なアレイが好ましいが、本発明の実施
のためにアレイが完全である必要はない。アレイは実質
的に完全であり得、そして本発明はなお実施され得る。
ｎ量体の「実質的に完全なセット」は、「ｎ」ヌクレオ
チドの全ての可能な配列を有さないセットを示し得る
が、標的ポリヌクレオチド中の変異を特徴付けるための
プローブとして使用され得る十分な数の異なる配列が提
供される。

【００８５】ｂ）アレイ合成ポリヌクレオチドプローブの完全なまたは実質的に完全
なアレイは当該分野において公知の方法に従って合成さ
れ得る。ＤＭＴ−ヘキサエチレングリコール−（２−シ
アノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダ
イトのようなリンカーは、ガラスまたはシリカ基板のよ
うな誘導体化された固体支持体に付着され得る。二本鎖
アンカー領域の一本鎖のヌクレオチドのすべて（しかし
最後のもの）は、従来の化学合成法を用いて、例えば、
ＤＭＴＰＡＣホスホルアミダイトを用いて合成され
る。このような技術は当該分野において周知である。例
えば、米国特許第４，４５８，０６６号、同第４，５０
０，７０７号、同第４，７２５，６７７号、ならびにＪ
ｏｎｅｓ、第２章、およびＡｔｋｉｎｓｏｎら、第３
章、Ｇａｉｔ編、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏ
ａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，
Ｄ．Ｃ．，１９８４）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，２７：４６９−４７２
（１９８６）を参照のこと。

【００８６】二本鎖領域の一本鎖の最後のヌクレオチド
は、一本鎖に相補的な鎖（一本鎖ｎ量体のオーバーハン
グになる「ｎ」個のヌクレオチドに従う）は、例えば、
「光指向性」の写真平板技術によって、合成され得る。
プローブ上において、一方の鎖は他方よりも長く、その
結果として２つの鎖は短い方の鎖の全長にわたり相補的
であり（従って、プローブの二本鎖部分を形成する）、
そしてオーバーハングはハイブリダイゼーション部分を
超えて伸長するより長い鎖の部分であることが理解され
る。図１を参照のこと。

【００８７】光指向性核酸合成技術は当該分野において
周知である。例えば、米国特許第５，１４３，８５４
号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４４５，９３
４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，６７７，１
９５号および同第５，７７０，７２２号を参照のこと、
これらの開示は本明細書中において援用される。

【００８８】簡潔には、光指向性技術において、選択さ
れた領域の基板が光に曝露されてこれらの領域を活性化
し、そして光除去可能な基によりヌクレオチドモノマー
は活性化された領域に付着される。モノマーは感光性保
護基により５’ヒドロキシルで保護されたホスホルアミ
ダイト活性化ヌクレオシドであり得る。活性化および付
着の工程は、所望の長さおよび配列のポリヌクレオチド
が合成されるまで繰り返される。次いで、感光性の基は
必要に応じて除去され、その後、配列は必要に応じてキ
ャップ化される。側鎖保護基もまた、存在する場合は除
去される。

【００８９】これらの写真平板技術および製造技術によ
って、各プローブ配列が支持体上の非常に小さな領域を
占有することを可能にする。例えば、０．２５ｍｍ²の
プローブアレイは１０００〜１０⁴または１０００〜１
０⁵または１０００〜１０⁶の特徴を有し得る。さらに所
望のプローブ密度の達成における詳細は、米国特許第
５，５１０，２７０号に見出され得、これらの開示は参
考として援用される。

【００９０】コンピューターツールは、写真平板技術を
使用するアレイの形成に使用され得る。例えば、コンピ
ューターシステムは基板上のポリヌクレオチドまたは他
のポリマープローブを選択するため、ならびにアレイの
レイアウトを設計するために使用され得る。米国特許第
５，５７１，６３９号を参照のこと、これらの開示は本
明細書中に援用される。あるいは、アレイは本明細書中
に参照として援用される米国特許第５，３８４，２６１
号に開示される機械的技術を使用して合成され得る。

【００９１】基板は好ましくは平面であるが、種々の代
替的な表面配置を取り得る。基板およびその表面はま
た、適切な光吸収特徴を提供するように選択され得る。
例えば、基板は機能化されたガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｇａ
Ａｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ₂、ＳｉＮ₄、改変型シリコン、ま
たは任意の広範な種々のゲルもしくは（ポリ）テトラフ
ルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオライド、
ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ま
たはそれらの組み合せのようなポリマーであり得る。本
開示を考慮すると、他の基板物質が容易に当業者に明ら
かになり得る。好ましい実施態様において、基板は平面
ガラスかまたは平面シリカである。

【００９２】これらの使用のための種々の光開裂可能な
保護基および方法は、当該分野において公知である。例
えば、米国特許第５，４８９，６７８号、同第５，７４
４，１０１号、および同第５，７５３，７８８号を参照
のこと。保護基は代表的には光分解性、すなわち、約３
４０ｎｍ、好ましくは約３６５ｎｍより大きい波長での
照射により除去される。光分解は、通常、水、アルコー
ルもしくは混合型水−アルコールまたは混合型水−有機
溶媒混合物のような水酸化性溶媒あるいはプロトン性溶
媒の存在下で行われる。頻繁に使用されるアルコール性
溶媒には、メタノールおよびエタノールが挙げられる。
光分解は頻繁に中性ｐＨまたは塩基性ｐＨで行われる。
あるいは、酸性または塩基性触媒化開裂条件の使用が有
利であり得る。このような化学的開裂方法は、例えば、
米国特許第５，５９９，６９５号に記載される。

【００９３】いくつかの局面において、二本鎖領域およ
びｎ量体オーバーハング領域の合成に続いて、２塩基の
イノシンが、例えば、５’末端に、従来のＤＭＴホスホ
ルアミダイト化学を使用して付加され得る。２つのイノ
シンの付加は識別に大きく影響を与えることなく全体的
なアレイシグナル強度を改善する。

【００９４】アンカー二本鎖ポリヌクレオチドは適切な
塩基の組合せおよび／または適切な共有結合架橋（例え
ば、５’末端でのＡＴジヌクレオチド対とソラレンＣ６
部分）を可能にする化学的構成成分を含み得る。一般
に、ＡおよびＧ（プリン、好ましくはＧ）の３’塩基を
有するプローブのアンカー二本鎖ポリヌクレオチド部分
は、ＣおよびＴ（ピリミジン）３’塩基を有するポリヌ
クレオチドよりも高いシグナル強度を生成する。次い
で、一本鎖ｎ量体をアレイと接触し、そして相補的なア
ンカー配列とハイブリダイズさせて一本鎖オーバーハン
グを有する二本鎖部分を形成する。オーバーハングの配
向は、所望のように３’または５’へと変化され得る。
これは、オーバーハングがフリーの３’または５’末端
を有し得ることを意味する。３’ヒドロキシル末端は酵
素的ライゲーションに好ましいが、一方、３’ホスホリ
ルバージョンは化学的ライゲーションに好ましい。

【００９５】３．フラグメント化、ハイブリダイゼーシ
ョン、およびライゲーション標的およびまたは参照ポリヌクレオチドはフラグメント
化され、そして必要な場合には一本鎖フラグメントに変
性される。フラグメントはランダムまたは偽ランダムに
種々の長さのものであり得、好ましくはｎ量体オーバー
ハングよりも短くはない。いくつかの局面において、フ
ラグメントは約１００塩基対までかまたはそれより長
く、一方、約２０〜約６０塩基対のフラグメントが好ま
しくあり得る。当業者は、フラグメントサイズが容易に
所望のように最適化され得ることを理解する。フラグメ
ント化は、化学的に、酵素的に、または当該分野で公知
の他の手段によって達成され得る。１つの局面におい
て、ヌクレアーゼ、例えば、標的ポリヌクレオチドがＤ
ＮＡの場合はＤＮａｓｅＩが使用され得る。

【００９６】フラグメント化に続いて、ポリヌクレオチ
ドが二本鎖の場合、例えば、９５℃で１５分間加熱する
ことによって変性される。この手順によって、ポリヌク
レオチドはその配列全体を示すホスホリル末端一本鎖の
サブ配列のランダムなまたは偽ランダムな集団へと減少
される。ホスホリル末端一本鎖のサブ配列は３’または
５’配向型であり得るが、５’配向型であることが好ま
しい。相補鎖は両方とも示される。必要に応じて、フラ
グメントは、末端ジデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼおよびｄｄＡＴＰ−Ｎ６−ビオチンまたはポリ
ヌクレオチドキナーゼおよび亜リン酸標識化ＡＴＰのよ
うな、当該分野において公知の末端標識化薬剤で（その
３’末端またはその５’末端のいずれかで）末端標識さ
れ得る。

【００９７】フラグメント化参照および標的ポリヌクレ
オチドのプローブオーバーハングに対するハイブリダイ
ゼーションは当該分野において周知の条件下において行
われ得る。最適なストリンジェンシーの条件下でのハイ
ブリダイゼーションはミスマッチを減少させることが当
該分野において周知である。ハイブリダイゼーション反
応のストリンジェンシーを調節する手段は当業者に周知
である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９；Ａｕｓｕｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９６お
よび最新刊までの定期刊行物；ならびにＨａｍｅｓら、
「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」Ｉ
ＲＬＰｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，１９８５を参照のこと。

【００９８】１つの局面において、ハイブリダイゼーシ
ョンは６×ＳＳＰＥ緩衝液のような緩衝液中で約７．０
〜約８．０、好ましくは約７．４のｐＨで、約２５℃〜
４５℃の温度で、好ましくは約４０℃で、そして約１〜
２時間の間、行われ得る。別の局面において、本発明の
ハイブリダイゼーションは、シグナルエンハンサーとし
てベタインを使用して行われ得る。ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを改善するベタインの使用は、１９９６年
５月１６日に出願された同時継続出願の米国出願番号０
８／６４８，７０９号に記載される（現在許可されてい
る）。ハイブリダイゼーションに続いて、ライゲーショ
ンの調製において、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TMＦｌｕ
ｉｄｉｃｓＳｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，
Ｉｎｃ．から）上で６×ＳＳＰＥを用いて２２℃でアレ
イを洗浄する。

【００９９】全てのフラグメントの適切な末端での
「ｎ」のヌクレオチドにより、アレイが完全または実質
的に完全である場合にハイブリダイズするプローブの一
本鎖部分上に正確に相補的なｎ量体が見出される。フラ
グメントは「ｎ」のヌクレオチドより長くあり得るが、
ハイブリダイゼーションから得られるべき情報は、プロ
ーブ上のその正確に相補的な配列とハイブリダイズする
フラグメントの「ｎ」のヌクレオチドから生じる。それ
ゆえ、「ｎ」の長さの標的ポリヌクレオチドにおける全
ての末端ヌクレオチド配列はアレイ中でハイブリダイズ
したプローブによって表される。

【０１００】本方法はまた、プローブのライゲーション
のさらなる工程を包含し得、一方いくつかの局面におい
て、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの両
方を、単一の工程で達成し得る。用語「プローブとのラ
イゲーション」はハイブリダイズした標的または参照ポ
リヌクレオチドフラグメントがプローブのより短い鎖に
連結されるプロセスをいうことが理解される。図１を参
照のこと。鎖の末端ヌクレオチドのみが連結可能であ
る。さらに、標的および参照フラグメントは、異なる
が、同一または実質的に同一であるアレイに、別々にハ
イブリダイズされることが理解される。本方法を使用し
て２つ以上の未知のポリヌクレオチドを分析する場合、
各々の未知のポリヌクレオチドのフラグメントは、異な
るが同一または実質的に同一であるアレイに別々にハイ
ブリダイズする。

【０１０１】ライゲーションは、アレイの洗浄により、
ハイブリダイズしていないポリヌクレオチドフラグメン
トを除去し得る。従って、１つの局面において、フラグ
メント化した、または変性したポリヌクレオチドは氷上
で冷却されてライゲーションミックスに添加され、マイ
クロチューブ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で遠心されて任
意の沈殿物の存在にペレット化され、そしてポリヌクレ
オチドプローブアレイに適用される。

【０１０２】酵素的および化学的ライゲーション手順の
両方が満足のいく結果を生成する。酵素的ライゲーショ
ンは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＡＤ依
存型）ＤＮＡリガーゼ、またはＴａｑＤＮＡリガーゼ
のようなＤＮＡリガーゼを使用し得る。これらの酵素の
各々に適切な標準ライゲーション緩衝液および温度は、
当該分野において周知である。ライゲーション混合物は
代表的には一晩（１４〜１６時間）インキュベートされ
るが、２時間の短さのインキュベーションでも十分であ
り得る。

【０１０３】化学的ライゲーション反応は、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ヒドロクロリドのようなカルボジイミドを使用してフラ
グメントのホスホリル部分とアンカーポリヌクレオチド
プローブ上のホスホリル部分との間にピロホスフェート
結合を生成し得る。例えば、フラグメントのホスホリル
部分は５’配向型であり得、一方、アンカープローブの
ホスホリル部分は３’配向型である。代表的には、化学
的ライゲーションは、３０℃で１４時間の間進行され
る。１つの局面において、３〜４Ｍまでのテトラメチル
アンモニウムクロライド（ＴＭＡＣｌ）が、Ａ／Ｔ−リ
ッチおよびＧ／Ｃ−リッチなハイブリッドの安定性の標
準化を助けるためにライゲーション緩衝液中で使用され
得る。

【０１０４】ライゲーションに続いて、アレイは、例え
ば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TMｆｌｕｉｄｉｃｓｓｔａｔｉ
ｏｎ上で上述のように洗浄される。必要に応じて、アレ
イは当該分野で公知の染料で染色され、次いで洗浄され
得る。このような染色の１つの例は、ストレプトアビジ
ン−フィコエリトリン結合体である。

【０１０５】４．変異の存在の決定ａ）ハイブリダイゼーションパターンハイブリダイゼーションパターンが評価され得ることに
よって任意の方法が使用され得る。いくつかのこのよう
な方法が当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，５９９，６９５号を参照のこと。１つの好まし
い方法において、標的および参照ポリヌクレオチドのフ
ラグメントが標識化される。より好ましい局面におい
て、標識は蛍光標識であり、これはビオチン標識化に続
くストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体形成に
よって得られる。アレイからの蛍光シグナルは特別に設
計された共焦点スキャナーを用いて検出され得、これ
は、例えば、８量体のアレイを６．８〜７．５μｍの解
像度で画像化し、そして９量体のアレイを３．５μｍの
解像度で画像化する。画像は、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉ
ｐ^TM ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎ
ｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）で処理され、そ
して得られた強度のデータはプローブ配列のアルファベ
ット順のリストおよび対応する強度を含むテキストファ
イルに変換され得る。次いで、これらのデータは、例え
ば、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ^TM（ｖ．４．０，Ｍｉｃ
ｒｏｓｏｆｔ）に書き込まれたカスタムソフトウェアに
より分析される。

【０１０６】蛍光強度はバックグラウンドが減算され
て、次いで各プローブ（総数４ⁿプローブ）の強度を、
全ての関連する単一塩基ミスマッチ（ＭＭ）プローブの
強度の合計（８量体のアレイ上の各プローブについては
２４ＭＭプローブ）およびプローブ自身の強度で除する
ことによって標準化する。式は：Ｉ標準化＝Ｉ／（ΣＩ
_MM＋Ｉ）である。この標準化アルゴリズムは、プローブ
の配列依存的強度変動を和らげることにより、塩基呼び
出し法の精度を改善する（塩基呼び出し法の記載につい
ては以下を参照のこと）。標準化はまた、塩基呼び出し
セットのレベルで行われ、その結果として塩基呼び出し
セット中の４つのプローブの強度の合計は常に一貫して
いる。このことは、任意の１つの塩基呼び出しセットが
合成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）平均を優性に占めることを
防ぐ。

【０１０７】ｂ）塩基呼び出し「塩基呼び出し」とは、ヌクレオチド配列における特定
の位置でのヌクレオチド中の塩基を同定するプロセスで
ある。上記のように、各標的または参照ポリペプチドフ
ラグメントの末端での「ｎ」ヌクレオチドは、正確に相
補的なｎ量体オーバーハングとハイブリダイズする。さ
らに、フラグメントの末端のｎヌクレオチドにおける所
定の塩基について、その１つの塩基の同一性においての
み正確に相補的であるプローブとは異なるアレー上に３
つのプローブもまた存在する。例えば、塩基がアデニン
である場合、その相補塩基はチミンであり、そして相補
的ではない３つの他のプローブは、その位置にアデニ
ン、グアニン、またはシトシンを含む。それゆえ、
「ｎ」長サブ配列における所定の塩基について、１つの
完全に相補的なプローブおよび３つの相補的でなく、そ
の１つの塩基でのみ異なるプローブが存在する。プロー
ブのこのセットは、「塩基呼び出し」セットと呼ばれ
る。米国特許第５，８３７，８３２号を参照のこと。こ
れは、本明細書において参考として援用される。

【０１０８】ポリヌクレオチドサンプルにおける各ヌク
レオチドは、塩基呼び出しセットの「ｐ」数を生じる。
ここで「ｐ」は、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチ
ドの数を表す。塩基呼び出しセットの例については図３
ａを参照のこと。両方の相補鎖が分析される場合、各ヌ
クレオチドについての塩基呼び出しセットの数は、２ｐ
へと増加する。従って、各塩基は、縮重的に検索され、
これは、サンプルの比較の正確さを増加させる。所定の
４つのヌクレオチド塩基呼び出しセットにおいて、ハイ
ブリダイゼーションの程度は、ポリヌクレオチドサンプ
ルにおけるヌクレオチド配列に正確に相補的であるプロ
ーブについて最大である。図３ｂの例示を参照のこと。
所定のヌクレオチドについての塩基呼び出しセットの縮
重性のため、ヌクレオチドについてのすべての塩基呼び
出しセットを横切るハイブリダイゼーションの程度を合
計すると、ヌクレオチドを同定する非常に正確な方法が
与えられる。こでを、図３ｃに示す。この論法は、通常
のＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣ以外のヌクレオチド（例えば、
ヌクレオチドアナログ）にも拡張され得る。

【０１０９】このようにして得られた情報は、「トレー
ス」において連続的なヌクレオチド位置について表示さ
れ得る。トレースは、配列決定における各位置について
最も確からしい塩基呼び出しを示す。図４を参照のこ
と。配列決定トレースは、配列位置の関数として塩基呼
び出しセットの各メンバーについて強度の値をプロット
することによって構築される。図４において、６６位〜
６８位を、５４０塩基対の嚢胞性線維症遺伝子フラグメ
ントについてプロットする。強度を、各塩基対呼び出し
セット内の４つのプローブの強度が合計１となるように
基準化する。

【０１１０】ほとんどの場合、塩基呼び出しは、塩基呼
び出しセットの異なるメンバーに対するハイブリダイゼ
ーションの程度の比較から明らかであるが、いくつかの
場合、ハイブリダイゼーションの程度の差異が呼び出し
を行うのに充分に大きくない。呼び出しまたは非呼び出
しについてのカットオフ点は、信頼度の使用を通じて見
い出され得る。塩基呼び出しの信頼度（質）は、以下の
ように規定される：塩基呼び出しセット内のプローブに
ついてＩ_most-intense／Ｉ_{next-most-intense}。この値
が閾値１．１５未満である場合、塩基は、呼び出しなし
として分類される。この手段を用いて、ほとんどの正確
ではない呼び出しは低い信頼度によって特徴付けられ
る。図５ｂを参照のこと。

【０１１１】（ｃ）仮想タイリング所定の変異に対して正確に相補的であるプローブは、そ
の変異を含む標的ポリヌクレオチド由来のフラグメント
に対して、参照配列に対するよりも高い程度でハイブリ
ダイズする。これらのプローブは、さらなる分析につい
て選択され得る。所定のポリヌクレオチドにおける変異
を検査するための適切なプローブを選択するためのこの
戦略は、「仮想タイリング」と呼ばれ、これは、アレイ
中のプローブに実際に存在する物理的なタイリングに類
似する概念である。タイリングの基本は、Ｃｈｅｅら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：６１０−１４（１９９６）に
おいてさらに説明される。これは、本明細書において参
考として援用する。

【０１１２】物理的タイリングにおいて、プローブのア
レイは、特定の遺伝子における変異に対してのみ対応す
るプローブのセットを含むように構築される。すなわ
ち、尋問（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）プローブは、
分析される特定のヌクレオチド配列に基づくアレイ上で
の合成の前に、選択される。対照的に、仮想タイリング
は、完全なｎ量体プローブのセットに由来する適切な尋
問プローブを「電気的に」組立てることを含む。この設
計は、各標的塩基について複数の尋問プローブを生成
し、これは、単純な基準化合計（平均化）プロセスを通
して統合され得る縮重塩基呼び出しセットを生成する。
従って、ポリヌクレオチド配列における各塩基は、完全
なまたは実質的に完全なポリヌクレオチドプローブアレ
イから抽出した「ｎ」塩基呼び出しセットによって縮重
的にプロービングされ得る。

【０１１３】さらに、仮想タイリングの方法は、プロー
ブセットが参照ポリヌクレオチドと比較した標的ポリヌ
クレオチドにおける欠失または挿入について、そして高
度の正確さをもって試験するように構築することを可能
にする。このような直接の比較は、系統的かつ再現性の
よい交叉ハイブリダイゼーションならびに複数のプロー
ブ標的相互作用から生じる潜在的に混乱性のシグナルを
減少させる。従って、完全なまたは実質的に完全なｎ量
体アレイおよび仮想タイリングの方法を用いて、任意の
仮想ポリヌクレオチドについての変異を、そのポリヌク
レオチドについてカスタム化されたアレイを構築するこ
となく特徴付け得る。さらに、抽出された情報はまた、
ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡフラグメン
ト）についてハイブリダイゼーションによる一次配列決
定のために、または他の手段によって達成される配列番
号の正確さを評価するために使用され得る。

【０１１４】（ｄ）変異の存在を決定すること本発明は、配列決定の目的のために使用され得るが、そ
の最も強力な形態において、本発明は、標的ポリヌクレ
オチドの配列の決定を必要とせず、また参照ポリヌクレ
オチドの配列が公知であることも必要としない。むし
ろ、参照ポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチド
のハイブリダイゼーションパターンが直接比較される。
この比較から、標的ポリヌクレオチドを配列決定するこ
となく、高度の正確さをもって標的ポリヌクレオチドに
おける変異を決定し得る。

【０１１５】（ｉ）置換変異の特徴付け置換変異について参照ポリヌクレオチドと標的ポリヌク
レオチドとを比較するために、参照サンプルの公知の配
列についての塩基呼び出しセットの完全なグループを表
すプローブのグループを、プローブの各アレイから（好
ましくは電気的に）抽出する。各塩基呼び出しセットの
各メンバーについて、標識の強度によって表される場
合、標的ポリヌクレオチドフラグメントのハイブリダイ
ゼーションの程度は、算術的な差異をとることによっ
て、参照フラグメントのハイブリダイゼーションの程度
を比較する。配列における所定の位置での塩基は、標的
および参照の両方において同一である場合、塩基呼び出
しセットにおける４つすべての塩基についてのハイブリ
ダイゼーションの程度の差異がほぼゼロである。

【０１１６】しかし、標的ポリヌクレオチドが塩基にお
いて置換変異を含む場合、ハイブリダイゼーションの程
度の差異は、塩基呼び出しセットの４つのメンバーの２
つについて見られる。これは、もとの塩基を含むフラグ
メントに相補的なプローブおよび変異に存在する塩基を
含むフラグメントに相補的なプローブを表す。図６（こ
れは、ＨＩＶ遺伝子の４３５位でのＡ→Ｇ置換の特徴付
けを示す）を参照のこと。塩基呼び出しセットの２つの
メンバーの差異は、変異を含むサブ配列にハイブリダイ
ズするすべての「ｐ」塩基呼び出しセット（正方向およ
び逆方向の両方の鎖が分析される場合は２ｎである）に
おいて見られる。標的における変異の存在は、変異部位
を含む、広い（１０〜１４塩基）フットプリントとして
容易に視覚化される。図７ｃに示す配列トレースにおけ
る変異スキャンの差異を参照のこと。このフットプリン
トは、変異部位の上流および下流の重複するプローブに
影響を与える単一の塩基変化から生じる（両方の鎖が使
用される場合）。方法論はさらに、以下の実施例２で議
論する。

【０１１７】さらなる視覚単純化は、差異のトレースの
陽性および陰性エンベロープを単にプロットすることな
らびに関連する最大陽性値および最大陰性値を作成する
対応する塩基を記録することによって実現され得る。こ
の型のプロットは、「置換」変異スキャンと言われる。
これを、図８に示す。図は、この方法によって正確に同
定された１１個の一塩基置換を明らかに示す。同定され
た置換は：Ｇ１４Ａ、Ａ１２８Ｇ、Ｃ２０６Ｔ、Ａ４３
５Ｇ、Ｔ６１４Ｃ、Ａ６７９Ｇ、Ｇ６９３Ａ、Ａ８３２
Ｔ、Ａ８６５Ｇ、Ａ９２７Ｇ、Ｔ９５５Ｃ。

【０１１８】（ｉｉ）挿入および欠失変異の特徴付け上記の原理を用いて、挿入または欠失変異についての試
験をするための塩基呼び出しセットを、置換変異につい
て同時に試験するように構築し得る。検索される変異の
セットは、挿入および欠失のタイリングプローブの塩基
呼び出しセットを形成することによって拡張され得る。
差異分析は、挿入および欠失について、置換の分析と同
様に行い得る。図９（これは、ｐ５３遺伝子における挿
入の検出を示す）を参照のこと。変異スキャンを、置
換、欠失および挿入プローブセットについて同時に行い
得る。これらのスキャンは、ある標的において１つの置
換、および別の標的においては挿入を容易に同定し得
る。図９を参照のこと。

【０１１９】（ｉｉｉ）ホモ接合およびヘテロ接合変異
の特徴付け多くの変異がホモ接合形態またはヘテロ接合形態のいず
れかで存在し得る。本発明の方法は、ホモ接合変異およ
びヘテロ接合変異の両方を検出し得る。通常、変異染色
体からのポリヌクレオチドは常に、それがハイブリダイ
ズし得る完全なまたは実質的に完全なアレイにおいてプ
ローブに遭遇する。従って、これは、常に参照ポリヌク
レオチドの全体パターンとは異なる全体パターンを生成
する。しかし、ヘテロ接合変異において、標的の非変異
染色体からのポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチ
ドにマッチし得る。これらの差異は「完全マッチ（ｐｅ
ｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ）」（ＰＭ）プロットを用いて
検出し得る。ＰＭプロットにおいて、参照ポリヌクレオ
チドについて完全にマッチする塩基呼び出しセットにお
いて、標的ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチ
ドの両方のハイブリダイゼーションの程度が比較され
る。

【０１２０】図１０は、ＣＦＴＲ遺伝子の１０７９ｂｐ
領域におけるホモ接合シナリオおよびヘテロ接合シナリ
オを比較するＰＭプロットである。図１０ａは、野生型
ＣＦＴＲポリヌクレオチド配列を、３ｂｐＤＦ５０８
（ＴＴＴ）ホモ接合欠失を含む標的と比較する、１７０
ｂｐ領域の変異スキャンを示す。完全マッチ（ＰＭ）差
異プロットは、２つのアレイからの参照についての完全
マッチの間の差異を基準化した強度を表示する。変異ス
キャンはまた、置換（陽性エンベロープのみ）、挿入、
および欠失プローブについて示される。興味深いこと
に、３ｂｐ欠失（分析ソフトウェアで「ＴＴＴ」と同定
される）は、挿入スキャンによって容易に検出された。

【０１２１】ホモ接合変異と対照的に、差異は、ヘテロ
接合変異を含むＰＭプロットにおいては明らかではな
い。これは、上記で議論したように、ヘテロ接合変異に
おいて、参照染色体となお同一な染色体が１つ存在し、
これがＰＭ塩基呼び出しセットとハイブリダイズするポ
リヌクレオチドフラグメントを提供するからである；従
って、参照と標的との間には明らかな差異が存在しな
い。これを、図１０ｂに示す。フットプリントは、ＰＭ
差異スキャンにおいて検出可能ではなかった。なぜな
ら、野生型参照配列を有するＤＮＡが両方のサンプルに
存在するからである。しかし、興味深いことに、欠失ス
キャンは、ヘテロ接合サンプルにおいて３ｂｐ「ＴＴ
Ｔ」欠失を正確に同定した。

【０１２２】同様に、図１１は、２．５ｋｂｐミトコン
ドリアアンプリコンのホモ接合およびヘテロ接合変異ス
キャンを示す。図１１ａは、ホモ接合サンプルの３００
ｂｐ変異スキャンを示す。このスキャンは、３つの１塩
基置換を示した。８つの異なるサンプルの中で、合計１
７６個の配列差異が検査された。ホモ接合ポリヌクレオ
チドの変異スキャンは、これらの配列差異の９０％より
多く正確に同定された。さらに、偽陽性率は、非常に低
かった（スクリーニングした３９００ｂｐのうち＜
１）。図１１ｂは、図１１ａと同じ３００ｂｐスキャン
を示すがサンプルはヘテロ接合である。このスキャン
は、３つの１塩基置換を示すが、シグナル対ノイズ比は
減少した。一般に、２．５ｋｂｐアンプリコンにおける
ヘテロ接合変異は、減少した感度（７０％〜８０％）で
検出された。

【０１２３】まとめると、本発明の方法は、例えば、ホ
モ接合またはヘテロ接合のような変異の決定、ならびに
変異の位置および型の同定を可能にする。

【０１２４】（ｅ）未知の配列の２つ以上のポリヌクレ
オチドが同一であるか否かの決定上記の方法は、未知の配列の２つ以上のポリヌクレオチ
ドが同一であるか否かを決定するように容易に適合され
得る。例えば、未知の配列の２つのポリヌクレオチド
は、２つの異なる同一のまたは実質的に同一の、完全な
または実質的に完全なｎ量体プロープポリヌクレオチド
のアレイに別個にハイブリダイズされ得る。それらのハ
イブリダイゼーションパターンを、上記の方法を用いて
比較し得る。２つの配列が同一である場合、ＰＭプロッ
トにおける完全なマッチが予測される。上記のように、
この方法論は、見かけ上種々の供給源由来であるポリヌ
クレオチドが実は単一の供給源由来であるか否かを、い
ずれのポリヌクレオチドの配列を知ることなくして、迅
速にかつより正確に決定するのに使用し得る。

【０１２５】（ｆ）配列特異的末端サンプリングポリヌクレオチドの混合物における個々のポリヌクレオ
チドを識別する方法もまた提供される。ポリヌクレオチ
ドのこのような混合物は、例えば、部位特異的ＤＮＡヌ
クレアーゼを用いるＤＮＡ標的のフラグメント化から生
じ得る。このようなフラグメント化は、すべての可能な
５’末端サブ配列または３’末端サブ配列の小下位集団
を代表するのみであるフラグメントの集団を生成し得
る。ｎ量体アレイは、すでに上記に記載した方法論を用
いてこのような複合体サンプルにおける所望の末端を同
定するのに使用され得る。完全なまたは実質的に完全な
ｎ量体アレイに対して、ポリヌクレオチドまたはそのフ
ラグメントの複合体サンプルをハイブリダイズさせるこ
とによって観察されるハイブリダイゼーションパターン
は、それ自身を、目的のポリヌクレオチドまたはそのフ
ラグメントの数および型を決定するのに役立たせる。複
合体集団における特定のポリヌクレオチドを識別するこ
の方法は、ゲルベースまたは電荷ベースの方法のような
伝統的な方法と比較してより迅速かつより正確である。
潜在的な適用には、ＤＮＡフィンガープリントまたは差
示的ディスプレイのようなランダムまたは指向性ゲノム
サンプリング戦略によって生成されるＤＮＡフラグメン
トの分析が挙げられる。

【０１２６】

【実施例】以下の実施例は、アレイの合成、標的ポリヌ
クレオチドおよび参照ポリヌクレオチドのフラグメント
化、ハイブリダイゼーションおよび連結、アレイの洗浄
および染色、ならびにデータ分析を詳細に記載する。こ
れらの実施例は、本明細書に記載される方法をさらに明
らかにするが、それらは、本発明の範囲を限定するもの
とみなされるものではない。

【０１２７】（一般的技術）完全ｎ量体デオキシポリヌ
クレオチドを、Ｐｅａｓｅら（１９９４）、Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１、５０２２
−６（その全体を本明細書において参考として援用す
る。）によって以前に記載されるように、光指向性光化
学を用いて、誘導体化したガラス基板上で合成した。８
量体アレイを、５０×５０μｍプローブフィーチャーサ
イズを用いて、および９量体を２５×２５μｍプローブ
フィーチャーサイズを用いて合成する。光化学合成の前
に、ＤＭＴヘキサエチレングリコール−（２−シアノエ
チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトリ
ンカー（例えば、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからのもの、アセ
トニトリル中に２５ｍＭ）および１９塩基の定常アンカ
ーポリヌクレオチド（３’ＡＴＡＣＧＴＡＧＡＣＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＣ５’）を従来のＤＮＡＰＡＣホスホル
アミダイト（アセトニトリル中２５ｍＭ）；Ｔ βシア
ノエチル、ＩＢＵｄＣ βシアノエチル、ＰＡＣｄＡ
β−シアノエチル、およびｉＰｒ−ＰＡＣｄＧ β−ｇ
ａｌシアノエチルホスホルアミダイト（例えば、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈから入手可能なもの）
を用いてアレイ上で合成した。

【０１２８】アンカーポリヌクレオチドの最後の塩基お
よび続きのｎ（本実施態様においてｎ＝８または９）の
組合せ塩基を、光指向性光化学（Ｐｅａｓｅら、１９９
４）を用いて合成した。これらのｎ塩基の合成後、２塩
基のイノシン（例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈか
らの２’−デオキシイノシン）を従来のＤＭＴホスホル
アミダイト化学を用いて５’末端に付加した。２つのイ
ノシンの付加は、識別に多大な影響を与えることなくア
レイ全体のシグナル強度を改善する。合成後、アレイ上
のＤＮＡ分子を５０％エチレンジアミン（ＥＤＡ）／５
０％エタノール浴中で約１０時間脱保護化した。

【０１２９】プローブの定常アンカー配列に対して相補
的な２０量体アンカーポリヌクレオチド（５’ソラレン
−ＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＧ−３’）
を、標準的なポリヌクレオチド合成機を用いて合成し
た。２つのバージョンのポリヌクレオチドを異なる様式
の連結（酵素連結のための３’ヒドロキシルバージョン
および化学連結のための３’ホスホリルバージョン）の
ために合成した。アンカーポリヌクレオチドはまた、必
要に応じて、交叉連結プロトコルにおける使用のため
に、５’末端にＡＴジヌクレオチド対およびソラレンＣ
６（例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈから）部分を
含んだ。ポリヌクレオチドを疎水性５’ソラレン部分を
介してカートリッジ精製した。末端Ｇ３’塩基を有する
アンカーポリヌクレオチドを使用した。実際のアンカー
ベースの二重鎖プローブを、相補的２０量体アンカーポ
リヌクレオチド（５００ｎＭ）を、アレイ結合プローブ
の定常部分に対してハイブリダイズさせることによって
作製した。

【０１３０】ハイブリダイゼーション条件は以下のとお
りである：６×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４）、４０℃
で１〜２時間、続いてＧｅｎｅＣｈｉｐ液性ステーショ
ン（例えば、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．からの型
のもの）上での６×ＳＳＰＥで２２℃での洗浄。この実
施態様において使用した連結条件下（３０℃〜４０℃）
では、ソラレン交叉連結は、二重鎖安定性の維持のため
には不必要であった。

【０１３１】二本鎖ＤＮＡ標的（約５０〜１００ｆｍｏ
ｌ、約８０〜１６０ｎｇの２．５ｋｂ標的）を、緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム）中のＤＮａ
ｓｅＩ（０．５Ｕ／２０μｌ）で１５分間、３７℃で、
ランダムに断片化した。ＤＮａｓｅＩを熱不活化し、そ
してサンプルを、９５℃で１５分間でのインキュベーシ
ョンにより変性させた。サンプルを氷上で冷却し、そし
てターミナルジデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（５Ｕ／２０μｌ）（ＴｄＴ）（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ、ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）およびｄｄＡＴ
Ｐ−Ｎ６−ビオチン（２５μＭ）（ＮＥＮＬｉｆｅＳ
ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）を、３７℃で
６０分間用いて３’末端標識した。ＴｄＴを熱不活化
し、そしてＤＮＡを、９５℃で１０分間インキュベート
することによって変性させた。変性させたＤＮＡを氷上
で冷却し、連結混合物（総量２００μｌ、ＤＮＡ標的の
最終濃度約５００ｐＭ、以下を参照のこと）に添加し、
微量遠心分離機中で３分間、１４０００ｇでスピンし
て、存在する任意の沈澱物をペレット化しＤＮＡアレイ
に適用した。。連結溶液を、所望の温度に設定したイン
キュベーターに配置した回転器（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉ
ｅ）での回転（４０〜５０ｒ．ｐ．ｍ．）によってアレ
イの表面を横切って連続的に混合した。

【０１３２】酵素連結または化学連結のいずれかを使用
した。各々が、特定のプロトコルに従って使用した場合
に、満足のいく結果を生成した。酵素連結条件を、以下
の酵素について与える：Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ（ＮＡＤ依存性）ＤＮＡリガーゼ、およびＴａｑ
ＤＮＡリガーゼ。標準的なＴ４連結緩衝液は、以下から
なった：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、
１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、１００ｍＭＮａＣｌ、
０．１％ＴＸ−１００、および２．０Ｕ／μｌＴ４
ＤＮＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ、５０μｇ／ｍｌＢＤＡ、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、０．１％ＴＸ−１００、および２．０Ｕ／μｌ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ
緩衝液は、以下からなった：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤ
ＴＴ、０．５ｍＭＮＡＤＨ、０．５μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、０．１％ＴＸ−１００、および０．０２５Ｕ／μ
ｌＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）。

【０１３３】ＴａｑＤＮＡ連結緩衝液は以下からなる：
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭ
酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍ
ＭＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤＨ、５０μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ＰＥ
Ｇ、１００ｍＭＮａＣｌ、および１．０Ｕ／μｌＴａ
ｑＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ）。８量体および９量体の両方について、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ反応、およびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガ
ーゼ反応を３０℃で行い、そしてＴａｑＤＮＡリガー
ゼ反応を３７〜４０℃（３０℃でのＴａｑの低活性に起
因する）で行った。連結反応物を、代表的に、一晩（１
４〜１６時間）インキュベートしたが、２時間だけのイ
ンキュベーションもまた、満足のいく結果を与えた。

【０１３４】化学連結の間、３〜４Ｍ塩化テトラメチ
ルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）を、Ａ／Ｔリッチハイブ
リッドおよびＧ／Ｃリッチハイブリッドの安定性を標準
化するのを補佐するために、連結緩衝液中で使用した。
Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８２、１５８５−１５８８（１９８５）を
参照のこと。その全体を本明細書において参考として援
用する。新たに溶解した１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドジヒドロクロリド
（ＥＤＣ，ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
（１０倍ストックとしてＨ₂Ｏ中に２Ｍ）を使用して、
標的の５’ホスホリル部分と、相補的なアンカーオリゴ
ヌクレオチド（合成中に添加した）上の３’ホスホリル
部分との間のピロリン酸結合を生成した。例えば、Ｈｅ
ｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９
６）；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ７
０：１３２３−１３３４（１９８８）；Ｋｕｚｎｅｔｓ
ｏｖａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ．）２８：２
９０−２９９（１９９４）を参照のこと。これらはすべ
て、その全体を本明細書において参考として援用する。
化学連結条件は：５０ｍＭ２−［Ｎ−モルホリノ］エ
タンスルホン酸（ＭＥＳ）（ＫＯＨを用いてｐＨ６．
０）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００１％ＳＤＳ、
２００ｍＭＥＤＣ、５０ｍＭイミダゾール（ＨＣｌ
を用いてｐＨ６．０）、および３．０〜４．０Ｍ塩化
テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）（Ｓｉｇｍ
ａ）、３０℃で１４時間であった。

【０１３５】連結後、アレイを５〜１０回、１×ＳＳＰ
Ｅ（ｐＨ７．４、２２℃）で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録
商標）液性ステーション上で洗浄し、回転する回転器で
２２℃で５分間ストレプトアビジン−フィコエリトリン
結合体（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ、１×ＳＳＰ
Ｅ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ中に２ｎｇ／μｌ）を用い
て染色し、そしてさらに５〜１０回、１×ＳＳＰＥで洗
浄した。

【０１３６】アレイからの蛍光シグナルを、特別に設計
した共焦点スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎ
ｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を用いて検出し
た。Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４、６１０−６
１４（１９９６）を参照のこと。これは、本明細書にお
いて参考として援用する。スキャナーは、８量体アレイ
を６．８〜７．５μｍの解像度で画像化し、そして９量
体アレイを３．５μｍの解像度で画像化した。イメージ
を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｆ
ｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒ
ａ，ＣＡ）を用いて処理し、そして得られた強度データ
を、プローブ配列および対応する強度のアルファベット
化したリストを含むテキストファイルに変換した。次い
で、これらのデータを、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ（登
録商標）（ｖ．４．０、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で書かれ
た特注のソフトウェアにより分析した。

【０１３７】（実施例１：塩基呼び出しの正確さと、プ
ローブ長および標的長との間の関係）閾値に関して、標
的長またはプローブ長のいずれかに対する塩基呼び出し
の正確さの依存度を決定するべきである。この方法を使
用して、種々の長さのポリヌクレオチドを配列決定し、
次いで呼び出された配列を、実際の公知の配列と比較し
た。異なる長さのＤＮＡ配列を、８量体プローブアレイ
および９量体プローブアレイの両方にハイブリダイズさ
せ、そして酵素連結および化学連結を用いて連結させ
た。ヒトＣＦＴＲ遺伝子からの５３５ｂｐＰＣＲ産
物；ＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子からの１．２ｋｂｐＰ
ＣＲ産物；ミトコンドリアのシトクロームｂ遺伝子およ
び制御領域を跨ぐ２．５ｋｂｐＰＣＲフラグメント；
ならびにバクテリオファージ φＸ１７４の５．４ｋｂ
ｐゲノムを含む種々の配列を分析した。

【０１３８】結果は、標的長およびプローブ長が、塩基
呼び出しの正確度に有意に影響することを示す。表１を
参照のこと。標的長が増大するにつれて、塩基呼び出し
性格度は、５３５ｂｐにおける１００％から（９量体に
関して）５．４ｋｂｐにおける８９％にまで減少した。
信頼性閾値を使用することにより、不正確な塩基呼び出
しの数を、最小限に抑えた。８９％の正確度で呼び出さ
れた５．４ｋｂｐ標的の場合において、残りの１１％の
塩基呼び出しは、１０．６％の呼び出しなし、およびほ
んの０．４％の不正確な呼び出し（偽陽性）からなっ
た。さらに、８９．４％（８９．０％＋０．４％）の実
際に呼び出された塩基について、正確な呼び出し率は、
９９．４％（１００％×８９．０／８９．４）である。
従って、塩基呼び出しの呼び出し／非呼び出しカテゴリ
ーへの分類は、この塩基呼び出し情報の有用性を大いに
増大させた。

【０１３９】一般に、標的長の増大に伴う塩基呼び出し
正確度における減少は、プローブの独特性の欠如から生
じる呼び出しなしに主に起因している。プローブ長の増
大は、呼び出しなしの数を劇的に減少させ、そしてはる
かにより高い塩基呼び出し正確度をもたらす。以下の表
１に示すように、５．４ｋｂｐ標的についての８量体対
９量体のプローブでの塩基呼び出し正確度における対比
に特に注意されたい。他方、連結の様式は、ほんのわず
かの効果を有していた。酵素連結は、ほとんどの場合、
化学連結よりもわずかにより高い塩基呼び出し正確度を
有していた。

【０１４０】

【表１】

【０１４１】（実施例２：ＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子に
おける置換変異の特徴付け）ＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子
を、置換変異に供される遺伝子の例として使用した。例
示の目的で、２つの１．２ｋｂｐの遺伝子のアンプリコ
ンを分析した。

【０１４２】第一に、単一置換変異を分析した。トレー
スを、上記に記載のように、２つの異なる１．２ｋｂｐ
ＨＩＶサンプル（参照サンプルおよび標的サンプル）
におけるＡ→Ｇ塩基置換について、作製し、別個の８量
体アレイに連結し、構築した。図６を参照のこと。サン
プルを断片化し、そして上記に記載の技術を用いて別個
の８量体アレイに連結し、そして参照配列内の４３５位
で問い合わせを行う８塩基呼び出しセットを分析した。
（参照と比較して標的は、）Ｇ尋問プローブの強度が増
加し、そしてＡ尋問プローブ（の強度）が減少した。こ
のことは、Ａ→Ｇ塩基置換を示す。

【０１４３】この実施例において、最初の２つの塩基呼
び出しセットは、差を示さなかった；これは、おそら
く、これらのプローブに対するサンプル中の他のサブ配
列の結合に起因する。しかし、各塩基についての高度の
縮重度のために、４３５位についての他の塩基呼び出し
セットは、最初の２つの塩基呼び出しセットによって生
成される系統席な塩基呼び出し「誤差」を除去する。置
換変異は、変異部位の周りの１２から１４塩基を検査す
ることによって容易に特徴付けられる。なぜなら、変異
は、変異部位（Ａ４３５Ｇ）の周りに中心を置いた特徴
的な「フットプリント」を残すからである。これを、図
７ｃに示す。

【０１４４】さらなる実験において、２つの１．２ｋｂ
ｐＨＩＶポリヌクレオチド（参照および標的）を断片
化し、そして標準的なプローブアレイに連結した。図８
に示すように、１１／１１の変異を、偽陽性を伴うこと
なく変異スキャンによって正確に同定した。潜在的な偽
陽性変異は、７７０位（図８でアステリスクによって示
す）での狭いフットプリントとして観察された。しか
し、このフットプリントは、予め選択した閾値内に収ま
っており、そしてより重要なことに、このフットプリン
トは、実際の変異の広範なプロフィール特徴を示さなか
った。

【０１４５】ＨＩＶ遺伝子を用いる第三の例は、本発明
がまた、より多様なセットの標的の間の配列差異を検出
するのに適していることを実証する。２７の一塩基置換
を含む第二の１．２ｋｂｐＨＩＶ改変体サンプルの変
異スキャンを行った。８量体アレイにおいて、９６．３
％（２６／２７、１偽陽性）の変異を検出し、そして９
量体アレイにおいて、１００％（２７／２７、１偽陽
性）の変異を検出した。問い合わされた標的配列が参照
配列から分岐しているので、偽陽性の確率が塩基変化に
よって影響される多数のプローブの数に起因して増加す
ることに注意するべきである。これらの結果は、４０塩
基中多くて１塩基違うキロベースサイズの標的が、この
アプローチを用いて正確に特徴付けされ得ることを示
す。

【０１４６】（実施例３：より長いポリヌクレオチド配
列（ミトコンドリアＤＮＡ）における置換変異の特徴付
け）１７６の公知の配列差異について８つの異なる２．
５ｋｂｐのヒトミトコンドリアシトクロームｂアンプリ
コンをスクリーニングした。８量体アレイを用いて、９
０％を超える（１６０／１７６）配列差異を、３９００
塩基あたり１塩基未満の低い偽陽性率（＜０．０２％未
満）をともなって正確に同定した。比較アプローチ（す
なわち、別個に決定した配列と比較すること）をしなけ
れば、偽陽性率は、かなりより高かった（約１％〜２
％）。偽陰性（検出されない変異は、通常、低いプロー
ブシグナル強度を生成する標的領域（例えば、ＡＴリッ
チ領域）か、または反復配列を含む領域に生じた。この
アプローチを用いて有効にスクリーニングされ得る最大
の標的長は、寛容される偽陽性（不正確に変異として同
定される）数と偽陰性（検出されない変異）の数との間
のトレードオフ（訳注、すなわち、両者のどちらをとる
か）に依存する。従って、変異の見出しの目的のため
に、８量体アレイを使用して、高感度（代表的には、９
０％を超える）および最少数の偽陽性（３９００塩基あ
たり１未満）を伴って、標的２．５ｋｂｐ長をスキャン
し得る。

【０１４７】さらにより長い片のＤＮＡをスクリーニン
グを、１６．６ｋｂｐヒトミトコンドリアゲノムの全体
を用いて行った。２つの異なる個体からの３つの重複す
るＰＣＲアンプリコンからなる２つの１６．６ｋｂｐ標
的を使用した。配列の解像度を改良するために、調製し
た標的を９量体アレイに連結した。変異スクリーニング
は、１６，６００塩基あたり４塩基（０．０２４％）の
低い偽陽性率を伴って、６６％を超える（１６／２４）
の公知の配列差異を同定した。これらの結果は、完全な
ｎ量体ＤＮＡアレイにおける比較再配列決定を使用し
て、変異について非常に複雑なＤＮＡサンプルを迅速に
スクリーニングし得ることを示す。

【０１４８】（実施例４：ｐ５３遺伝子における挿入変
異および欠失変異の特徴付け）本明細書において記載さ
れる塩基呼び出し法および仮想タイリング法は、置換変
異についてのみならず、挿入変異および欠失変異につい
てもまた遺伝子を検査することを可能にする。この局面
を示すために、尋問変異のセットを、挿入タイリングプ
ローブおよび欠失タイリングプローブの塩基呼び出しセ
ットを形成することによって、拡張した。差異分析を、
置換の分析と同様に、挿入および欠失について行った。
未知の相同ｐ５３（１１エキソン）標的（１つのアレイ
に適用される）を、野生型ｐ５３参照（第二のアレイに
適用される）と比較した。変異スキャンを、置換プロー
ブセット、欠失プローブセット、および挿入プローブセ
ットについて行った。図９は、変異スキャンを示す。こ
れらのスキャンは、エキソン４におけるＧ→Ｃ置換およ
びエキソン５におけるＣ挿入を容易に同定した。図９ａ
を参照のこと。

【０１４９】他方、エキソン５における変異スキャン
は、置換スキャンおよび挿入スキャンの両方におけるフ
ットプリントを示した。図９ｂを参照のこと。エキソン
５の置換スキャンおよび挿入スキャンの両方におけるフ
ットプリントの存在は、どの型の変異が存在していたか
を決定する際に困難をもたらす。しかし、一塩基置換を
含むＨＩＶサンプルの以前の分析は、真正の置換変異
が、代表的には、挿入スキャンまたは欠失スキャンにお
けるフットプリントを表示しないことを示唆する。従っ
て、エキソン５スキャンにおける挿入フットプリントの
観察は、従来の配列決定によって検証された挿入呼び出
しを強く支持する。

【０１５０】（実施例５：ＣＦＴＲ遺伝子におけるホモ
接合型変異およびヘテロ接合型変異の特徴付け）８量体
アレイの、公知のΔＦ５０８欠失（３ｂｐ）を含む嚢胞
性線維症膜貫通伝達レギュレーター（ＣＦＴＲ）アンプ
リコン（約１．１ｋｂｐ）におけるホモ接合型変異およ
びヘテロ接合型変異を検出する能力を調べた。野生型
（正常）ＣＦＴＲサンプルを参照として用いた。変異ス
キャンを図１０に示す。ΔＦ５０８欠失を、ＰＭ参照プ
ローブスキャン（完全一致参照プローブにおける差異の
スキャン）、置換スキャン、および欠失スキャンにおけ
るフットプリントの存在によってホモ接合型サンプルに
おいて容易に検出した。図１０ａを参照のこと。図１０
ｂは、ヘテロ接合型サンプルについての変異スキャンを
示す。ヘテロ接合型欠失の場合において、フットプリン
トはＰＭ参照プローブスキャンにおいて見られなかっ
た。なぜなら、参照配列を有するＤＮＡが、比較してい
るサンプル両方に存在するからである。しかし、欠失ス
キャンは、良好に解明されたフットプリントをなお示
す。なぜなら、欠失された配列を含む標的がヘテロ接合
型サンプルに存在するが、参照サンプルからは完全に欠
如しているからである。従って、変異は、ヘテロ接合型
欠失として特徴付けられ得る。

【０１５１】方法を、２．５ｋｂｐミトコンドリアアン
プリコンのより長い「ヘテロ接合型」サンプルへと拡張
した。図１１は、２．５ｋｂｐミトコンドリアアンプリ
コン（ホモ接合型対ヘテロ接合型）の変異スキャンを示
す。ホモ接合型サンプル（野生型とホモ接合型ＤＮＡと
の５０：５０混合物）の３００ｂｐ変異スキャンによっ
て、３つの一塩基置換が明らかになった。図１１ａを参
照のこと。８つの異なるサンプルのうち合計１７６の配
列差異を検査した。ホモ接合型サンプルの変異スキャン
は、これらの配列差異の９０％を超える正確さで同定し
た。さらに、偽陽性率は、非常に低かった（スクリーニ
ングした３９００ｂｐあたり１未満）。

【０１５２】同じ３００ｂｐスキャンを、「ヘテロ接合
型」サンプル（野生型およびヘテロ接合型ＤＮＡの５
０：５０混合物）を用いたことを除いて、反復した。変
異スキャンを図１１ｂに示す。このスキャンによって、
３つの一塩基置換が明らかになったが、解像度は減少し
ていた。一般に、２．５ｋｂｐアンプリコンにおける接
合ヘテロ型変異は、感度を減少して検出された。

【０１５３】（実施例６：バクテリオファージφＸ１７
４の部位特異的末端サンプリング）部位特異的末端サン
プリングについての本発明の使用の例として、バクテリ
オファージφＸ１７４（約５．４ｋｂｐ）を、制限エン
ドヌクレアーゼＰａｌＩ（ＧＧ↓ＣＣ）およびＮｌａＩ
ＩＩ（ＣＡＴＧ↓）を用いて消化し、そして得られたフ
ラグメント集団を、８量体アレイに対して連結した。結
果は、３３の制限部位のうち３２を検出したことを示
し、このことは、ｎ量体アレイを、複合サンプルにおけ
る５’末端サブ配列を同定するのに使用し得ることを示
す。

【０１５４】上記の記載は、例示的であり、そして制限
的ではない。本発明の多くの改変は、本開示を参照すれ
ば、当業者には明らかとなる。例のためのみに、種々の
基質、ポリマー、連結基、合成開始部位、および他の材
料が本発明の範囲を逸脱することなく使用され得る。従
って、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定され
るべきではなく、代わりに、添付の請求の範囲を、それ
らの等価物の全範囲とともに参照して決定されるべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｎ量体アレイの設計の基礎を示す模式図であ
る。図解のために、５’一本鎖オーバーハングを有する
二本鎖定常アンカー領域が示される。この図はまた、必
要に応じた共有結合的架橋工程（ここではソラレンを用
いて例示した）を示す。

【図２】１．２ｋｂＨＩＶアンプリコンの８量体アレ
イへのライゲーションの効果を示す図である。図２ａは
リガーゼの非存在下でのハイブリダイゼーションを示
す。図２ｂは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下でのハイブ
リダイゼーションおよびライゲーションを示す。図２ｃ
は、個々のプローブの特徴を例示する図２ｂの拡大図を
示す。

【図３】参照配列を使用した、塩基呼び出しセットの構
築を示す図である。図３ａは、５４０ｂｐのＤＮＡ標的
の参照配列（順方向鎖）の部分がそこにライゲートして
いる、８量体アレイを示す。配列内の７７位を尋問する
８塩基呼び出しセットのプローブ配列が示される。各々
の塩基呼び出しセットは、単一置換位置（文字Ｎで示
す）が異なる４つのプローブから成り、特定の標的塩基
を尋問するように位置する。図３ｂは、アレイデータか
ら抽出され、そしてプロットされた、各々の塩基呼び出
しセット内のプローブの強度を示す。プローブは、Ａ−
プローブは実際に相補的な「Ｔ」塩基置換（順方向鎖照
会）または「Ａ」塩基置換（逆方向鎖照会）を含むよう
に、列挙される。図３ｃは、すべての８塩基呼び出しセ
ットを横断する尋問プローブ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の合計
を示す。この合計は、順方向鎖および逆方向鎖の両方に
ついて合計した塩基呼び出しセットを生じる。これらの
合計のセットに由来する複合性の塩基呼び出しセット
は、最終的な高度に正確な塩基呼び出しが作製されるこ
とを可能にする。

【図４】「配列決定トレース」における塩基呼び出し情
報の表示を示す図である。

【図５】呼び出しのないカットオフ点を提供するため
の、塩基呼び出し品質の使用法を示す図である。図５ａ
は、ＨＩＶ標的配列内のＡＴリッチな領域の配列トレー
スによって実証された、低品質塩基呼び出し（強度値間
の不十分な分離）を示す標的領域の例である。図５ｂ
は、カットオフの閾値がいくつかの不正確な塩基呼び出
しを排除したことを図示する。

【図６】別個のアレイ上のＤＮＡ標的の塩基呼び出しセ
ットを比較することによる変異の発見を示す図である。
図は、ＨＩＶ遺伝子の４３５位におけるＡ→Ｇ置換を図
示する。図６ａは、参照（左パネル）および標的（右パ
ネル）に対するアレイ像の小さい部分を示す。各々のア
レイ上の円で囲んだプローブ（尋問位置４３５）は、第
３の位置にある単一塩基置換によって異なる。図６ｂ
は、参照および標的の両方についての４３５位を尋問す
る８残基コールセットの標準化された強度を示す。これ
らの塩基呼び出しセット間の強度の違い（参照に対する
標的）がまた示される。図６ｃは、参照および標的ある
いはそれらの複合の差（Ｉ未知−Ｉ参照）に対する複合
の塩基呼び出しセット（組み合わせた両方の鎖）を示
す。

【図７】変異の容易な同定を可能にする配列トレースの
直接比較を示す図である。図７ａおよび７ｂは、２つの
１．２ｋｂＨＩＶ遺伝子ポリヌクレオチド（参照およ
び標的）から生じる配列トレースを示す。図７ｃは、配
列トレースにおける差異（変異スキャン）が、どのよう
に変異部位（Ａ４３５Ｇ）において１２〜１４塩基の幅
のフットプリントを示すかを図示する。

【図８】ＨＩＶｐｏｌ−１遺伝子中における１０４１
塩基の変異スキャンを示す図である。異なるトレースの
正および負の包絡線は、１．２ｋｂｐＨＩＶ配列の１
０４１塩基についてプロットされる。図は、この方法に
よって正しく同定された１１の単一の塩基置換を示す。
星印は、ピークが変異に特徴的な広範なプロフィールを
表示し損なうために負とスコアされる、潜在的な変異を
示す。

【図９】ｐ５３遺伝子における挿入の検出を示す図であ
る。ｐ５３遺伝子の１１のエキソンが同時にスキャンさ
れた（プライマーを含み約１７００塩基）。図９ａは、
エキソン４の置換スキャン（正の包絡）が、どのように
正しくＧ→Ｃ塩基変化を同定した変異フットプリントを
明らかにしたかを図示する。図９ｂは、エキソン５の変
異スキャンが置換スキャン（正の包絡）および挿入スキ
ャンの両方においてフットプリントを示すことを示す。
挿入スキャンは、変異を標的サンプルにおけるＣ挿入
（相補的なＧ挿入プローブの増加）として同定し、一方
置換スキャンは不明瞭であった。

【図１０】同型接合性欠失および異型接合性欠失につい
ての完全一致（ＰＭ）差プロットディスプレーを示す図
である。図１０ａは、野生型ＣＦＴＲポリヌクレオチド
配列を、３−ｂｐＤＦ５０８（ＴＴＴ）同型接合性欠
失を含む標的と比較する、１７０ｂｐ領域の変異スキャ
ンを示す。変異スキャンはまた、置換（正の包絡の
み）、挿入、および欠失プローブについて示される。３
−ｂｐ欠失（分析ソフトウェアによって「ＴＴＴ」とし
て同定される）は、欠失スキャンによって容易に検出さ
れた。図１０ｂは、ＣＦＴＲ遺伝子の１０７９ｂｐ領域
において野生型ＣＦＴＲ標的を３−ｂｐΔＦ５０８「人
工」異型接合性欠失変異体と比較する、変異スキャンを
示す。野生型参照配列を有するＤＮＡが両方のサンプル
において存在するため、ＰＭ差スキャンにおいてフット
プリントは検出されなかった。しかし、欠失スキャン
は、異種接合性サンプルにおいて３−ｂｐ「ＴＴＴ」欠
失を正しく同定した。

【図１１】２．５ｋｂｐミトコンドリアアンプリコンの
変異スキャンを示す図である（同型接合性対異型接合
性）。図１１ａは、同型サンプルの３００ｂｐ変異スキ
ャンを示す。このスキャンは３つの単一塩基置換を示し
た。８つの異なるサンプルの間で総計１７６の配列の差
異が試験された。同型ポリヌクレオチドの変異スキャン
は、これらの配列の差異を９０％以上も正しく同定し
た。さらに、偽陽性の割合は非常に低かった（スクリー
ニングされた３９００ｂｐあたり１未満）。図１１ｂ
は、サンプルが野生型および変異した異型ポリヌクレオ
チドの５０：５０混合物である以外は図１１ａと同様で
ある３００ｂｐスキャンを示す。このスキャンは３つの
単一の塩基置換を示したが、減少したシグナル／ノイズ
比を有した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マークエス．チーアメリカ合衆国カリフォルニア 92014, デルマー， 15ティーエイチストリートナンバー24 155 (72)発明者デイビッドジェイ．ロックハルトアメリカ合衆国カリフォルニア 92014, デルマー，トリーポイントロード 510

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的ポリヌクレオチドの変異の存在を決
定する方法であって、以下の工程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）該標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイのプロ
ーブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリダ
イズさせ、標的ハイブリダイゼーションパターンを生成
する工程；（ｃ）参照ポリヌクレオチドを、第２のアレイのプロー
ブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリダイ
ズさせ、参照ハイブリダイゼーションパターンを生成す
る工程；および（ｄ）該参照ハイブリダイゼーションパターンと該標的
ハイブリダイゼーションパターンとを比較することによ
って、該標的ポリヌクレオチド中の変異の存在を決定す
る工程、を包含する方法。
【請求項２】前記工程ｂ）において、前記ハイブリダ
イズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにライゲ
ートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記工程ｃ）において、前記ハイブリダ
イズした参照ポリヌクレオチドが前記プローブにライゲ
ートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記オーバーハングが遊離の５’末端を
有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記オーバーハングが遊離の３’末端を
有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオチド
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記変異が置換変異である、請求項１に
記載の方法。
【請求項８】前記変異が欠失変異である、請求項１に
記載の方法。
【請求項９】前記変異が挿入変異である、請求項１に
記載の方法。
【請求項１０】前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性
線維症膜貫通伝導性調節遺伝子、ｐ５３遺伝子、ミトコ
ンドリアＤＮＡ、またはＨＩＶ遺伝子からなる群から選
択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記アレイが平行に配置されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】２つ以上の標的ポリヌクレオチドが同
一かどうかを決定する方法であって、以下の工程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全または実質的に
完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）第１の標的ポリヌクレオチドを、１つのアレイの
プローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブ
リダイズさせ、第１のハイブリダイゼーションパターン
を生成する工程；（ｃ）第２の標的ポリヌクレオチドを、第２のアレイの
プローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブ
リダイズさせ、第２のハイブリダイゼーションパターン
を生成する工程；および（ｄ）第１のハイブリダイゼーションパターンと第２の
ハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程、を
包含する方法。
【請求項１３】前記工程ｂ）において、前記ハイブリ
ダイズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにライ
ゲートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記工程ｃ）において、前記ハイブリ
ダイズした参照ポリヌクレオチドが前記プローブにライ
ゲートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記オーバーハングが遊離の５’末端
を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】前記オーバーハングが遊離の３’末端
を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオチ
ドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】前記アレイが平行に配置される、請求
項１２に記載の方法。
【請求項１９】ポリヌクレオチドの混合物中の個々の
ポリヌクレオチドを区別する方法であって、以下の工
程：（ａ）少なくとも２つの同一または実質的に同一なポリ
ヌクレオチドプローブアレイを提供する工程であって、
ここで各アレイのオーバーハングが完全なまたは実質的
に完全なｎ量体のセットを構成するように、各プローブ
が、二本鎖領域および一本鎖ｎ量体オーバーハング領域
を含む、工程；（ｂ）該混合物中のポリヌクレオチドを、該アレイのプ
ローブポリヌクレオチドの該オーバーハングにハイブリ
ダイズさせる工程；および（ｃ）ハイブリダイゼーションパターンを決定する工
程、を包含する工程。
【請求項２０】前記区別された個々のポリヌクレオチ
ドを数え挙げる工程をさらに含む、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２１】前記工程ｂ）において、前記ハイブリ
ダイズした標的ポリヌクレオチドが前記プローブにライ
ゲートされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】前記オーバーハングが遊離の５’末端
を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記オーバーハングが遊離の３’末端
を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記ｎ量体が約４〜約５０ヌクレオチ
ドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】前記アレイが平行に配置される、請求
項１９に記載の方法。