CN102388150A

CN102388150A - 用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法

Info

Publication number: CN102388150A
Application number: CN2010800151567A
Authority: CN
Inventors: 凯瑟琳·利佩; 伊莎贝尔·迪托; 塞丽娜·罗歇-达尔贝特
Original assignee: GeneOhm Sciences Inc
Current assignee: GeneOhm Sciences Inc
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2012-03-21
Also published as: AU2010215827B2; JP2012518414A; EP2398921B1; ES2545793T3; CA2752913A1; CA2752913C; BRPI1008883A2; JP5766618B2; US20120070828A1; AU2010215827A1; US9650681B2; JP2015091255A; EP2398921A4; WO2010096723A1; EP2398921A1

Abstract

本发明这里所公开的实施方式涉及用于检测和/或鉴定携带有超广谱(extended spectrum)β-内酰胺酶基因的微生物的组合物。具体地，本发明提供寡核苷酸、探针以及包含它们的试剂盒，用于检测细菌的CTX-M序列。本发明还提供用于检测和/或扩增存在于微生物的超广谱β-内酰胺酶基因(包括CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因)的方法。

Description

用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法

相关申请

本申请要求由Lippe等人于2009年2月19日提交的美国临时申请序列号61/153,954的优先权，其发明名称为“用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法”，将其全部内容引入本文作为参考。

对序列表的参考

本申请与电子形式的序列表一同提交。序列表以名称为GENOM.097VPC.txt的文件提供，该序列表生成于2010年2月18日，大小为15.2KB。将电子形式的序列表中的全部信息引入本文作为参考。

本发明的背景

技术领域

本发明公开的实施方式涉及分子诊断，并且尤其是涉及用于检测和鉴定携带有超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的微生物的诊断，并且尤其是涉及用于检测和鉴定携带有CTX-M基因的微生物的诊断。

背景技术

β-内酰胺酶对于β-内酰胺药物具有抗性。这些酶破坏β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环，所述β-内酰胺抗生素例如青霉素、头孢菌素、头霉素和碳青霉烯(厄他培南(ertapenem))。这些抗生素在它们的分子结构中具有共同的单元：被称为β-内酰胺的四原子环。内酰胺酶破坏该环，使之开环，使所述分子的抗菌性质失活。

超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase，ESBL)日益成为全球出现的医院感染的原因，并还令人担忧地成为公共问题的原因(Rossolini等，2008，CMI)。ESBL是水解具有氧亚胺基侧链的超广谱头孢菌素的β-内酰胺酶。这些头孢菌素包括头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶，以及氧亚胺基单环内酰胺氨曲南。因此，ESBL对于这些抗生素和相关的氧亚胺基β-内酰胺类具有抗性。最为公众所知的ESBL来自于TEM-1、TEM-2或SHV-1基因，并包括改变这些β-内酰胺酶的活性位点附近的氨基酸的构型的突变。这扩展了易受这些酶水解的β-内酰胺抗生素的范围。

TEM和SHV典型变种例如TEM和SHV，在影响了欧洲大部后，目前正在美国迅速蔓延，而一种新型的ESBL，即CTX-M，则流行于南美、地中海和西欧国家(Govinden等，2007，AJB)。在20世纪80年代晚期的日本、欧洲和阿根廷，特别是在1989年的德国，发现了最新的变种，可将其名字归因于其对于头孢噻肟的高的抵抗活性(Naas等，2008，CMI)。其被认为是所有变种中最有影响的组(Rasmussen和Hoiby，2004，CJM)。它的出现可能是增加头孢曲松和/或头孢噻肟的使用以治疗细菌感染的结果，已知其来源于克罗非菌属的成员中的基因。到目前为止，根据Lahey Clinic网站(可登陆万维网址lahey.org/Studies)，已经记载了超过85种CTX-M衍生物，其可以分成5个种系组(phylogenetic group)(CTX-M-I、2、8、9和25)。

CTX-M抗性基因发现于肠杆菌科，其可以轻易地穿透物种之间的质粒。包括肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌等在内的具有CTX-M基因的肠细菌种被认为是尿路感染的主要原因。其它的肠杆菌科，例如阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌以及产酸克雷伯杆菌，也可以携带CTX-M基因。检测CTX-M抗性品系特别关键，因为需要与医院中的其他病人隔离，并且仅剩下碳青霉烯作为感染的主要治疗手段。

直到最近，获知品系抗性的唯一途径是进行手工抗微生物敏感性试验。敏感性试验有很多缺点，包括需要大量的时间获得结果，即48～96小时。首先，操作者需要从样本中分离出菌株，这可能需要48小时；然后，继续进行生化鉴定，这又需要18～24小时；然后进行手工抗微生物敏感性试验，这可能还需要占用24小时。除了在获得结果上的延误外，手工试验方法还遭遇其它问题，例如，由于抗生素盘的不适当储存和抗生素盘的不适当扩散造成的缺乏重现性，以及缺乏标准化方法。

ESBL检测的特异性和准确性非常重要，因为假阴性结果可能导致开业医生设计出不适当的抗生素疗法，例如采用第三代头孢菌素或氨曲南治疗ESBL感染的个体。这给治疗的个体带来了不必要的风险，并且还增加了临床环境(例如医院)中交叉污染的几率。由于一些产ESBL品系在体外不会对所有的采用建议的转效点的第三代或第四代头孢菌素显示抗性，因此临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推荐报道对于青霉素、头孢菌素和氨曲南耐受的产EBSL肠杆菌科(CLSI，M1 00-S1 8)，因为它们的结果可能是临床耐受。携带有CTX-M抗性基因的生物体水解较新的头孢菌素和氨曲南的能力使得它们的检测更加困难。CLSI指南提出，产CTX-M品系的存在的错误诊断取决于最初筛选和确认试验中所使用的药物。

本文所公开的实施方式提供了优于其他用于检测和鉴定具有ESBL例如CTX-M抗性基因的细菌的方法的优势，包括提高的精确性，可在较短时间内获得结果，以及不需要进行附加的步骤，例如用于检测ESBL的琼脂糖凝胶电泳(Lartigue等，2004，FEMS ML；Pitout等，2004，JCM；Pitout等，2007，CMI)。而且，本文所公开的实施方式提供了优于其他已报道的用于检测ESBL(包括CTX-M)的方法的优势，这是因为，本文所公开的方法和组合物明确设计用于检测和鉴定新发现的CTX-M基因的异构体，所述异构体在例如美国专利申请公开号US20070248954中所描述的分析方法开发时还是未知的。US20070248954中公开的方法使用与新发现的CTX-M异构体的序列不完全互补的引物，这样会损害特异性，或者甚至导致假阴性结果。

发明内容

提供了用于快速、灵敏地检测具有抗生素抗性的ESBL(包括CTX-M基因)的组合物和方法。所述组合物包括寡核苷酸引物和探针集，用于在样品中检测CTX-M核酸和/或其他ESBL核酸的存在。这些引物和探针集可以用在扩增方法(例如PCR，特别是定量PCR)中，并可以装入试剂盒中，以应用于目的是在测试样品(特别是病人样品)中检测ESBL基因存在的扩增方法中，由此，所述基因的检测表示所述样品中包含具有ESBL的细菌。

因此，在一个实施方式中，本发明提供寡核苷酸引物和探针，其包括SEQID NO：1～24所列出的序列中的至少10个保守核苷酸，或者基本由SEQ ID NO： 1～24所列出的序列中的至少10个保守核苷酸组成，或者由SEQ ID NO：1～24所列出的序列中的至少10个保守核苷酸组成。本文公开的引物和/或探针可以用在检测和/或鉴定样本中具有超广谱β-内酰胺酶(例如CTX-M)的微生物的存在的方法中。

本发明进一步提供用于在样品中检测ESBL基因(例如CTX-M)的试剂盒，其中，所述试剂盒包含本文公开的实施方式的组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可以包括将所提供的组合物用于基于聚合酶的扩增反应(例如PCR或QPCR)的说明。

其他的实施方式涉及检测的方法：从待分析超广谱β-内酰胺酶(例如CTX-M)的存在的样本中获得样品；在标准PCR条件下，将所述样品与扩增引物集接触，其中，所述扩增引物集包含至少一对引物对，其中，所述引物集包含一个以上的具有通用碱基的引物，其中，所述引物对与位于超广谱β-内酰胺酶基因(例如CTX-M)内的靶序列侧翼的核酸杂交，并且其中，所述引物对产生靶扩增产物；提供用于引物延伸的试剂和条件，以产生靶扩增产物；确定靶扩增产物的存在和/或量。

本发明还涉及本文公开的实施方式的引物和探针的用途，其中，所述引物或探针具有根据SEQ ID NO：1～24所限定的任意序列的序列。

附图说明

图1表示被分成4组的所有CTX-M基因的系统发育树，产酸克雷伯杆菌(Klebsiella oxytoca)是外类群。

图2表示序列排列，其显示了本文所公开的用于检测CTX-M-1组(ctxm1-616F/SEQ ID NO：1)(ctxm1-740R/SEQ ID NO：2)(ctxm1/2-657B/SEQID NO：5)的引物的位置。还显示了以前公开的扩增引物(CTXM1-F3/SEQ IDNO：40)(CTXM1-R2/SEQ ID NO：41)。所示出的参考序列是所有CTX-M-1序列排列的共有序列。所示出的共有序列对应于SEQ ID NO：48。

图3表示序列排列，其显示了本文所公开的用于检测CTX-M-2组(ctxm2-609F/SEQ ID NO：3)(ctxm2-776R/SEQ ID NO：4)(ctxm 1/2-657B/SEQID NO：5)的引物的位置。还显示了以前公开的扩增引物(TOHO1-2F/SEQ ID NO：42)(TOHO 1-1R/SEQ ID NO：43)。所示出的参考序列是所有CTX-M-2序列排列的共有序列。所示出的共有序列对应于SEQ ID NO：49。

图4表示序列排列，其显示了本文所公开的用于检测CTX-M-8组(ctxm8-119R/SEQ ID NO：7)(ctxm8-7F/SEQ ID NO：6)(ctxm8/9-42B/SEQ IDNO：10)的引物的位置。还显示了以前公开的扩增引物(CTXM825F/SEQ IDNO：44)(CTXM825/SEQ ID NO：45)。所示出的参考序列是所有CTX-M-8序列排列的共有序列。所示出的共有序列对应于SEQ ID NO：50。

图5表示序列排列，其显示了本文所公开的用于检测CTX-M-9组(ctxm9-7F/SEQ ID NO：8)(ctxm9-117R/SEQ ID NO：9)(ctxm8/9-42B/SEQ IDNO：10)的引物的位置。还显示了以前公开的扩增引物(CTXM914F/SEQ IDNO：46)(CTXM914R/SEQ ID NO：47)。所示出的参考序列是所有CTX-M-9序列排列的共有序列。所示出的共有序列对应于SEQ ID NO：51。

具体实施方式

本文公开的实施方式涉及用于有效和特异性检测和/或鉴定具有超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的微生物的方法和组合物。

在本文中所使用的术语“超广谱β-内酰胺酶”或“ESBL”意指这样的β-内酰胺酶：其能够通过水解青霉素、第一、第二和第三代头孢菌素和氨曲南(但不是头霉素和碳青霉烯)而对这些抗生素产生细菌抗性，并且其可以被β-内酰胺酶抑制剂例如克拉维酸所抑制。本领域技术人员可以理解，术语“ESBL”包括目前已知的和将来发现的所有超广谱β-内酰胺酶，其包括但不限于Lahey Clinic网站在万维网址lahey.org/Studies上列出的所有ESBL。因此，术语ESBL包括SHV或巯基可变型、TEM型、TOHO和CTX-M型的ESBL。

在一些实施方式中，将所述组合物和分析用于检测和鉴定CTX-Mβ-内酰胺酶。以前，已经对CTX-M酶进行了详细地综述(Bonnet，R.，等.(2004)，β-内酰胺酶生长组：CTX-M酶(Growing group of extended-spectrum beta-lactamases：the CTX-M enzymes).抗微生物制剂化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother).48：1-14)。CTX-Mβ-内酰胺酶的一些代表性的、非限制性的特征如下：头孢噻肟在抗性范围内的最低抑菌浓度(MIC)(＞64μg/ml)，而对于头孢他啶的MIC则显然在敏感范围(2～8μg/ml)。但是，CTX-M型ESBL实际上能水解头孢他啶，并对该头孢菌素产生抗性(MIC高达256μg/ml)。氨曲南MIC是可变的。CTX-M型β-内酰胺酶水解头孢吡肟，头孢吡肟的MIC高于在产生其他的ESBL型的细菌中观察到的MIC。他唑巴坦对于CTX-M型β-内酰胺酶显示了高于克拉维酸几乎10倍的抑制活性。一些细菌可能同时携带有CTX-M型和SHV型ESBL或者CTX-M型ESBL和AmpC型β-内酰胺酶，它们可能改变抗生素抗性表型。

本文所公开的实施方式能快速检测和/或鉴定CTX-Mβ-内酰胺酶，其包括被鉴定为CTX-M-1至CTX-M-82的CTX-Mβ-内酰胺酶，包括在表1列出的菌株中发现的一些或所有CTX-M型β-内酰胺酶。

表1

样本和样品

本文所公开的实施方式可以用于检测和/或鉴定样本中的ESBL。本文使用的术语“样本”可以指临床样本或来自于一个或任意数量的来源的样品，其包括但不限于实际上任何生物的体液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、腹腔液、胸水、积液、腹水、和化脓性分泌物、灌洗液、排出的液体、刷检细胞样本、活检组织、移植医疗设备、感染的导管、脓、生物膜和精液)，哺乳动物样品特别是人类样品以及环境样品(包括但不限于空气、农业、水和土壤样品)也可用于本发明。此外，样品可以取自食品加工，其可以包括输入样品(例如谷物、牛奶或动物尸体)、加工的中间步骤中的样品以及供给消费者的制成的食品。在一些实施方式中，本文所描述的方法和分析可以直接在样品或临床样本上进行，而不必对样本进一步操作。在一些实施方式中，可以对样本进行操作，例如培养、加工以提取核酸，或纯化、扩增或其他操作。

引物和探针

在一些实施方式中，样本或样品可以与扩增引物集进行接触。在一些实施方式中，样本或样品可以和探针进行接触。本文所使用的术语“引物”和“探针”包括但不限于寡核苷酸或核酸。术语“引物”和“探针”包括作为核苷类似物的分子以及核苷酸。本文所使用的核苷酸和多聚核苷酸是下述物质的上位概念：多聚脱氧核糖核苷酸(包括2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(包括D-核糖)，任意其他类型的多聚核苷酸(其是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)，以及其他包含非核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺(例如多肽核酸(PNA))和聚吗啉(可以购自Anti-Virals Inc.，Corvallis，Oreg.，为NEUGENE^TM聚合物)以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物以允许碱基配对和碱基堆积的构型包含核酸碱基(例如发现于DNA和RNA中)。

在一些实施方式中，本文所公开的“引物”和“探针”包含锁核酸(LNA)。“锁核酸”(LNA)是包含连接核糖的2’氧和4’碳的亚甲基桥的核糖核苷酸(参见图27)。Braasch D.A.和Corey，D.R.(2001)，锁核酸；细调DNA和RNA的识别(Locked nucleic acids(LNA)；fine-tuning the recognition of DNA and RNA).生物化学(Chem.Biol.)8，1-7提供了LNA的概述。将该文章明确地全部引入本文作为参考。LNA可以购自例如美国科罗拉多州博尔德的公司Proligo。硫代磷酸酯对于本领域技术人员也是已知的，还可以由德国埃伯斯贝格的MWG-Biotech AG订购。因此，本文所公开的“引物”和“探针”可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的LNA。

术语核苷酸和多聚核苷酸包括例如3’-脱氧-2’，5’-DNA、寡聚脱氧核糖核苷酸N3’→P5’磷酰胺酯、2’-O-烷基取代的RNA、双链或单链的DNA、和双链或单链的RNA、DNA:RNA杂交体、以及PNA和DNA或RNA之间的杂交体。该术语还包括：已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记，甲基化，“带帽”，采用类似物替代一个以上的天然核苷酸，采用例如不带电荷的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯和氨基甲酸酯等)、负电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和正电荷的键(例如氨基烷基磷酰胺酯、氨基烷基磷酸三酯)的核苷酸间修饰，含有例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的侧基的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性的金属等)的修饰，含有烷基化剂的修饰，具有修饰的键(例如α异头核酸等)的修饰；以及多聚核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。

可以理解的是，本文所使用的术语“核苷”和“核苷酸”将包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基还包括其他的经过修饰的杂环碱基的部分。这样的修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、或者其他杂环。修饰过的核苷或核苷酸还包括在糖基上的修饰，例如其中，一个以上的羟基被卤素、脂肪基替换，或者被官能化为醚、胺等。对于核苷酸或多聚核苷酸的其他修饰包括重排、附加、取代、或者在与各自互补的嘧啶或嘌呤形成氢键的嘌呤或嘧啶上改变官能团。得到的修饰过的核苷酸或多聚核苷酸可以和其他如此修饰过的核苷酸单元(但不是A、T、C、G或U)形成碱基对。例如，鸟苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以被修饰为异鸟苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。这样的修饰得到了不会再与胞嘧啶有效形成标准碱基对的核苷碱基。但是，将胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨基-嘧啶)修饰为异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)得到了不会与鸟苷有效形成标准碱基对但会与异鸟苷形成碱基对的核苷碱基。异胞嘧啶可以由西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)(密苏里州，圣路易斯)；异胞嘧啶(isocytidine)可以由[Switzer等，(1993)Biochemistry 32：10489-10496]及其中引用的文献进行制备；2’-脱氧-5-甲基-异胞嘧啶可以由[Tor等，(1993)J.Am.Chem.Soc.115：4461-4467]及其中引用的文献进行制备；异鸟嘌呤核苷酸可以采用上述的 [Switzer等，(1993)]和[Mantsch等，(1993)Biochem.14：5593-5601]描述的方法或者Collins等人的美国专利5780610描述的方法进行制备。非天然碱基对被称为κ和π，可以通过[Piccirilli等，(1990)Nature 343：33-37]描述的用于合成2，6-二氨基嘧啶及其互补1-甲基吡唑并[4，3]-嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮的方法进行合成。其他如此修饰的形成唯一碱基对的核苷酸单元已经描述于[Leach等，(1992)J.Am.Chem.Soc.114：3675-3683]和上述的Switzer等，或者对于本领域技术人员来说是显而易见的。

优选地，扩增引物集包括至少一种、两种、三种、或四种、或更多种含有通用碱基的引物和/或探针。本文所使用的术语“通用碱基”指可以和选自于A、T、C和G中的多于一个的核苷酸杂交的核苷酸类似物。在一些实施方式中，所述通用碱基可以选自于包含脱氧肌苷、3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、6-硝基吲哚的组。优选地，所述通用碱基是脱氧肌苷。在一些实施方式中，本文公开的扩增引物集和探针包括至少一种具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通用碱基的引物和/或探针。

所述引物和/或探针优选为10～45个核苷酸的长度。例如，所述引物和/或探针可以是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多个核苷酸的长度。引物和/或探针可以以任何适宜的形式提供，例如包括与固体载体、液体结合，以及冻干等。在一些实施方式中，所述引物和/或探针包括在寡核苷酸序列的整个长度上与靶核酸序列杂交的寡核苷酸。这样的序列可以称作彼此之间“完全互补”。如果寡核苷酸被称为与本文的核酸序列“实质互补”，则两个序列可以是完全互补，或者它们在杂交时形成错配，但保持了在下文讨论的严格条件或标准PCR条件下进行杂交的能力。本文使用的术语“标准PCR条件”包括例如本文所公开的或者描述于例如PCR1：实用入门(PCR 1：A Practical Approach)，M.J.McPherson，P.Quirke和G.R.Taylor，Ed.，(c)2001，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津(Oxford)，英国(England)以及PCR实验设计：现有方法和应用(PCRProtocols：Current Methods andApplications)，B.White，Ed.，(c)1993，Humana Press，特图瓦(Totowa)，新泽西(NJ)的现有技术中的任意的PCR 条件。

本文使用的术语“实质互补”指两个核酸(例如捕获探针和靶序列的互补区域)之间的互补性，和/或捕获探针的连接序列与竞争核酸的互补区域之间的互补性。互补性不必是完全的；在两个核酸之间可以有任意数量的碱基对错配。但是，如果突变的数量太大，以至于即使在最不严格的杂交条件下也不能发生杂交，则所述序列不是实质互补序列。当两个序列被称为本文的“实质互补”时，其意指所述序列彼此之间充分互补，以在选定的反应条件下杂交。足以实现特异性的核酸互补性和杂交严格性之间的关系在本领域是公知的，并且会在下面结合序列同一性、熔点温度和杂交条件进行进一步的描述。所以，可以在本文描述的任意方法中使用实质互补序列。只要杂交条件足以允许例如靶序列和非靶序列之间的辨别，这样的探针可以是例如完全互补或者可以包含1至许多个错配。因此，实质互补序列可以指：与参考序列相比，百分比同一性在100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75或以下的、或者任意两个之间的数值范围内的序列。

本文所限定的“严格条件”或“高严格性条件”可以通过如下条件确定：(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，例如甲酰胺，例如含有0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％菲柯尔(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH为6.5的含有750mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)采用50％甲酰胺，5×SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，超声鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，以及10％硫酸葡聚糖，42℃，42℃下在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中清洗以及55℃下在50％甲酰胺中清洗，然后是在55℃下由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格性清洗。

“中等严格条件”可以按照[Sambrook等，分子克隆实验手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，纽约：冷泉港出版社(NewYork：Cold Spring Harbor Press)，1989]的描述进行确定，并且包括使用不如上面所描述的严格的清洗液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个示例为在37℃下在包含如下组分的溶液中孵育过夜：20％甲酰胺，5×SSC(150 mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖，以及20mg/ml已变性剪切的鲑精DNA，然后在约37～50℃下在1×SSC中清洗过滤器。本领域技术人员会认识到必要时如何调节温度、离子强度等，以调整例如探针长度等因素。

引物对

在一些实施方式中，扩增引物集包括一个以上的例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多的引物对。本文使用的术语“引物对”可以指单独与靶核酸(例如编码ESBL的核酸，例如CTX-M基因或其片段，等等)的相对链杂交的两个引物，其中，例如在聚合酶链式反应(PCR)中，每个引物均可以在其3’-末端延伸，以形成靶扩增产物。引物对可以包括正向引物和反向引物。

在一些实施方式中，本文所公开的组合物和方法包括包含至少一种与CTX-M基因杂交的扩增引物集的引物对。例如，本文所公开的组合物和方法可以用于检测和/或鉴定来自于表1中列出的细菌的CTX-Mβ-内酰胺酶。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括多个扩增引物，其共同地使检测和/或鉴定来自于表1中列出的所有细菌的CTX-Mβ-内酰胺酶成为可能。在一些实施方式中，本文所公开的组合物和方法包括共同地与来自于至少两个CTX-M组的CTX-M核酸的核酸杂交以及扩增来自于至少两个CTX-M组的CTX-M核酸的核酸，所述至少两个CTX-M组选自于CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、和CTX-M-25。用于检测和鉴定CTX-M-1的引物包括例如，具有SEQ ID NO：1、2、5、11、12、13、14、32和33或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO：1、2、5、11、12、13、14、32和33或它们的互补序列实质上互补的寡核苷酸，和/或在严格条件下与SEQID NO：1、2、5、11、12、13、14、32和33或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。

用于检测和鉴定CTX-M-2的引物包括具有SEQ ID NO：3、4、5、15、16、17、18、32和33或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO：3、4、5、15、16、17、18、32和33或它们的互补序列实质上互补的寡核苷酸，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：3、4、5、15、16、17、 18、32和33或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。用于检测和鉴定CTX-M-8的引物包括具有SEQ ID NO：6、7、10、19、20、21、22、27、28和31或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO：3、4、5、15、16、17、18、32和33或它们的互补序列实质上互补的寡核苷酸，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：3、4、5、15、16、17、18、32和33或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。用于检测和鉴定CTX-M-9的引物包括具有SEQ IDNO：8、9、10、23、24、25、26、29、30和31或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO：8、9、10、23、24、25、26、29、30和31或它们的互补序列实质上互补的寡核苷酸，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：8、9、10、23、24、25、26、29、30和31或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。本领域的技术人员可以理解，一些实施方式包括本文公开的引物对的任意组合，例如，引物对SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQID NO：6和7、SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：27和28、以及SEQ ID NO：29和30的任意组合。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括引物和探针，所述引物和探针由SEQ ID NO：1～10组成、或基本由SEQ ID NO：1～10组成、或包含SEQ ID NO：1～10，或者具有SEQ ID NO：1～10的至少10、11、12、13、14、15或更多个保守核苷酸，或者与SEQ ID NO：1～10实质上互补以及在严格条件下与SEQ ID NO：1～10杂交。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括引物和探针，所述引物和探针由SEQ ID NO：1～5和27～31组成、或基本由SEQ ID NO：1～5和27～31组成、或包含SEQ ID NO：1～5和27～31，或者具有SEQ ID NO：1～5和27～31的至少10、11、12、13、14、15或更多个保守核苷酸，或者与SEQ ID NO：1～5和27～31实质上互补以及在严格条件下与SEQ IDNO：1～5和27～31杂交。

在一些实施方式中，所述组合物和方法包括用于检测和/或鉴定附加序列的引物和探针，其包括例如用于检测例如PCT公开号WO08/124670中公开的碳氢霉烯酶基因。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括具有SEQID NO：34和35或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的引物。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括具有SEQ ID NO：37和38或它们的互补序列的至少10个保守核苷酸的引物。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括与SEQ ID NO：34和35或它们的互补序列的序列实质上互补的引物，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：34和35或它们的互补序列的序列杂交的引物。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括与SEQ ID NO：37和38或它们的互补序列的序列实质上互补的引物，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：37和38或它们的互补序列的序列杂交的引物。

在本文公开的一些实施方式中，所述组合物和/或方法可以包括一个以上的引物，其中，所述引物包括SEQ ID NO：1～22或其互补序列的序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个保守核苷酸。

表2：引物/探针

序列号	引物名	序列
			1	ctxm1-616F	CYGCTTCCTGGGTTGTGG
2	ctxm1-740R	TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG

[0051]

序列号	引物名	序列
			3	ctxm2-609F	GGTMTGCCGAAATSWTGG
4	ctxm2-776R	CGCAGCCAGAAHATCCCGAC
			5	ctxm1/2-657B	ccagcgTATGGYACCACCAACGATATCGCGGcgctgg
6	ctxm8-7F	TGTRTGCSCAGGCGAACG
			7	ctxm8-119R	GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG
8	ctxm9-7F	TTTATGCGCAGACGAGTG
			9	ctxm9-117R	AAAGCACCTGCGTATTATCT
10	ctxm8/9-42B	cgaggcGCGGCGCTGGARAAAAGCAGgcctcg
			11	ctxm1-599F	GYATTCAGGCWGGACTGCC
12	ctxm1-633F	GGGGGATAAAACCGGCAG
			13	ctxm1-756R	GCTTTCTGCCTTAGGTTGRG
14	ctxm1-723R	ARTGACCAGAATCAGCGGC
			15	ctxm2-590F	TAGCGCGAGCATTCRGGC
16	ctxm2-624F	TGGGKAGTGGGCGATAAA
			17	ctxm2-791R	TACGATTTTCGCCGCCGCAG
18	ctxm2-759R	GACGGYTTTCCGCCTTCT
			19	ctxm8-1F	YGCCGCTGTRTGCSCAGGC
20	ctxm8-22F	ACGAYGTTCARCAAAAGC
			21	ctxm8-131R	CTCRTCGGCGCGGTAGAGC
22	ctxm8-102R	TATCGGCGGTGTYAATCARCG
			23	ctxm9-1F	CRMCGCTTTATGCGCAGAC
24	ctxm9-21F	ARTGCGGKGCARCAAAAG
			25	ctxm9-102R	TATCTKYGGTATCGATGAGC
26	ctxm9-132R	GTTCATCACCGCGATAAAGC
			27	ctxm8-146F	CAGCACCAGTAARGTGATG
28	ctxm8-256R	TTGTAGTTAAYCARGTCYGARG
			29	ctxm9-122F	CGGTGATGAACGCTTTCC
30	ctxm9-242R	ATCGGCAGGCTTGATCTC
			31	ctxm8/9-183B	cggcgatAAGCARAGTGAAACGCAAAAGatcgccg
32	ctxm1/2-664T-	cCaCcaAcgaTatcgCg

[0052]

序列号	引物名	序列
				LNA
33	ctxm1/2-659T	TGGYACCACCAACGATATCGCGGT
			34	KPC-2F	AACTGACACTGGGCTCTG
35	KPC-2R	ATACMCTCCGCAGGTTCC
			36	KPC-2B	cgcgatcACACGACCGGCAACCACCGCAgatcgcg
37	KPC-3F	GATRGATACCGGCTCAGG
			38	KPC-3R	GTAACGGATGGGTGTGTC
39	KPC-3B	cgcgatcGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGgatcgcg
			40	CTXMI-F3	GACGATGTCACTGGCTGAGC
41	CTXM1-R2	AGCCGCCGACGCTAATACA
			42	TOHO1-2F	GCGACCTGGTTAACTACAATCC
43	THOH1-1R	CGGTAGTATTGCCCTTAAGCC
			44	CTXM825F	CGCTTTGCCATGTGCAGCACC
45	CTXM825R	GCTCAGTACGATCGAGCC
			46	CTXM914F	GCTGGAGAAAAGCAGCGGAG
47	CTXM914R	GTAAGCTGACGCAACGTCTG

探针

在一些实施方式中，所述探针可以包括可检测的标记。重要的标记包括可直接检测和可间接检测的放射性或非放射性标记，例如荧光染料。可直接检测的标记是无需与一种或多种附加的化学剂相互作用而提供可直接检测信号的标记。可直接检测的标记的示例包括荧光标记。可间接检测的标记是与一种或多种附加组分相互作用以提供检测信号的标记。在该后面的实施方式中，所述信号是信号产生系统的一员，所述信号产生系统包括两种以上的共同工作以提供可检测信号的化学剂。可间接检测的标记的示例包括生物素或地高辛，其可以由偶联至荧光染料或酶(例如碱性磷酸酯酶)的合适的抗体进行检测。在许多优选的实施方式中，所述标记是可直接检测的标记。特别重要的可直接检测的标记包括荧光标记。可应用于本文公开的实施方式中的荧光标记包括荧光团部分。重要的具体荧光染料包括：呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)，2-[乙基氨基-3-乙基亚氨基-2，7-二甲基-3H-呫吨-9-基]苯甲酸乙酯单盐酸盐(R6G)(发射波长范围为约500～560nm的响应辐射)，1，1，3，3，3′，3′-六甲基吲哚双碳菁碘化物(HIDC)(发射波长范围为约600～660nm的响应辐射)，6-羧基荧光素(通常以缩写FAM和F表示)，6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)，6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE或J)，N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)，6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)，6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)，以及罗丹明110；菁染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩

嗪染料；卟啉染料；多次甲基染料，例如菁染料，例如Cy3(发射波长范围为约540～580nm的响应辐射)，Cy5(发射波长范围为约640～680nm的响应辐射)，等等；BODIPY染料和喹啉染料。重要的具体荧光团包括：芘、香豆素、二甲基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、荧光素、R110、Eosin、JOE、R6G、HIDC、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、ROX、萘基荧光素、德克萨斯红、萘基荧光素、SYBR绿、Cy3和Cy5，等等。

在优选的实施方式中，本文公开的组合物和方法包括分子信标探针、TAQMAN^TM探针或SCORPION^TM探针。例如，在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括一个以上的分子信标探针，其中，所述探针包含SEQ IDNO：5、10、31、32或33的序列，例如SEQ ID NO：25、26、27、28、32和/或33中任意一个所示的探针：

ccagcgTATGGYACCACCAACGATATCGCGGcgctgg(SEQ ID NO：5)

cgaggcGCGGCGCTGGARAAAAGCAGgcctcg(SEQ ID NO：10)

cgcgatcAC ACGACCGGC AACCACCGC Agatcgcg(SEQ ID NO：36)

cgcgatcGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGgatcgcg(SEQ ID NO：39)

cggcgatAAGCARAGTGAAACGCAAAAGatcgccg(SEQ ID NO：31)

cCaCcaAcgaTatcgCg(SEQ ID NO：32)

TGGYACCACCAACGATATCGCGGT(SEQ ID NO：33)

在一些实施方式中，采用FAM荧光团猝灭分子和DABCYL猝灭剂标记所述探针，例如SEQ ID NO：25～28和32～33。在一些实施方式中，所述探针是 TAQMAN^TM探针、分子信标探针或SCORPION^TM探针。在一些实施方式中，所述一个以上的扩增引物可以采用例如荧光部分例如SYBR绿等进行标记。

可以将本文公开的引物和探针序列修饰为在5’或3’末端包括附加的核苷酸。同样地，在一些实施方式中，可以通过将核苷酸取代在所述序列内部来修饰所述引物和探针序列。已经认识到，所述引物和探针序列必须含有足够的互补性，以与各自的靶核酸序列进行特异性杂交。以这种方式，至少1、2、3、4或者多达5个核苷酸可以被取代。

SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33均是对CTX-M族1和2特异性的。在一些实施方式中，探针SEQ ID NO 32可以含有5个锁核酸(LNA)。在一些实施方式中，SEQ ID NO：33是TAQMAN^TM探针。在一些实施方式中，SEQ ID NO33含有一个以上的简并的碱基，具体是对CTX-M 1和CTX-M 2进行退火(例如，在严格杂交条件和/或标准PCR条件下)。

可以用于制备本文公开的实施方式的引物的化学合成方法，包括但不限于，[Narang等，(1979)酶学中的方法(Methods in Enzymology)68：90]描述的磷酸三酯法，[Brown等，(1979)Methods in Enzymology 68：109]公开的磷酸二酯法，[Beaucage等，(1981)四面体通讯(Tetrahedron Letters)22：1859]公开的二乙基磷酰胺酯法，以及美国专利4458066描述的固体载体法。

还涉及使用自动寡核苷酸合成仪制备本文公开的实施方式的合成寡核苷酸引物。

退火和特异性结合

在一些实施方式中，通过杂交完成所述引物和/或探针对于靶核酸序列的结合或退火。本领域技术人员可以理解的是，通过选择与靶核酸序列或参考核酸序列至少实质上互补的序列实现特异性杂交。这包括所述寡核苷酸靶核酸序列在所述寡核苷酸序列的整个长度上的碱基配对。这样的序列可以称为彼此之间“完全互补”。如果寡核苷酸被称为与本文的核酸序列“实质互补”，则两个序列可以是完全互补，或者它们在杂交时形成错配，但保持了在下文讨论的严格条件或标准PCR条件下进行杂交的能力。

在一些实施方式中，所述样品或样本与扩增引物集和探针接触。优选地，所述扩增引物和探针在单组条件(即严格条件，包括下文讨论的标准PCR条件)下与靶核酸进行杂交。本文使用的术语“严格条件”、“严格杂交条件”可以发生变化(例如，小于约1M的盐浓度，更常见的是小于约500mM，优选小于约200mM)，温度可以波动(例如，从低达0℃至高于22℃，超过约30℃，最常见的是超过37℃)，这取决于所述探针的长度和/或核酸组成。较长的片段可能需要较高的杂交温度，以进行特异性杂交。作为影响杂交严格性的几个因素，参数的组合比单个因素的绝对测定更加重要。因此，作为示例，术语“严格杂交条件”可以指下列条件中的一个或两个：a)6×SSC，45℃，然后在65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次以上的清洗；和b)400mM NaCl，40mMPIPES，pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，进行12～16小时，然后进行清洗。在一些实施方式中，术语“严格条件”可以指标准PCR条件。

在一些实施方式中，样品或样本可以在标准PCR条件下与扩增引物集进行接触。对于包括标准PCR条件、适用于临床微生物学的PCR技术的综述，参见[临床微生物学中的DNA方法(DNA Methods in Clinical Microbiology)，Singleton P.，Dordrecht出版；Boston：Kluwer Academic，(2000)]，[分子克隆到遗传工程(Molecular Cloning to Genetic Engineering)White，B.A.Ed.in Methods in Molecular Biology 67：Humana Press，Totowa (1997)]，以及从1991～1995年的″PCR方法和应用(PCR Methods and Applications)″(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。“PCR条件”的非限制性示例包括公开于本文所引用的参考文献中的条件，例如50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 9.0)，0.1％TritonX-100，2.5mM MgCl₂，退火温度为72℃；或者4mM MgCl₂，100mM Tris，pH 8.3，10mM KCl，5mM(NH₄)₂SO₄，0.15mg牛血清白蛋白(BSA)，4％海藻糖(Trehalose)，退火温度为59℃；或者50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 9.0)，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，退火温度为55℃；等等。

在一些实施方式中，本文公开的方法包含采用本文公开的引物和探针，基于PCR例如QPCR的ESBL(例如CTX-M核酸)的扩增和检测方法。在各种实施方式中，本文公开的方法能在生理范围的细菌浓度(即从感染有所述细菌的受试者收集的样品中的细菌的浓度)下检测ESBL(例如CTX-M)的存在。因此，无需分离、浓缩或扩张(例如培养)菌群，就可以对样品进行筛选以检测ESBL(例如CTX-M)的存在。在各种实施方式中，本文公开的方法能在具有约1×10³CFU/ml、约1×10⁴CFU/ml、约1×10⁵CFU/ml、或约1×10⁶CFU/ml的细菌浓度的样品检测ESBL的存在。

大量的PCR或QPCR方案在本领域是已知的，并在下文进行举例说明，其可以直接用于或经过调整后用于本发明描述的用于在样品中检测ESBL(包括CTX-M)的组合物。

一般而言，在PCR中，靶多聚核苷酸序列通过与至少一种寡核苷酸引物或寡核苷酸引物对反应进行扩增。所述引物与靶核酸的互补区域进行杂交，并且DNA聚合酶延伸所述引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，同样大小的片段决定反应产物(扩增产物靶多聚核苷酸序列)。重复扩增循环以增加单一的靶多聚核苷酸序列的浓度。所述反应可以在通常用于PCR的任何的温度循环器中进行。但是，优选具有实时荧光检测能力的循环器，例如

(加拿大，森尼维尔，Cepheid)、ABI PRISM

(加拿大，福斯特城，Applied Biosystems)，ROTOR-GENE^TM(澳大利亚，悉尼，Corbett Research)，

(印度，印第安纳布里斯，罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Corp))，

(加拿大，Hercules，Biorad Laboratories)，和

(加拿大，拉荷亚，Stratagene)。

一些实施方式提供了包括定量PCR(QPCR)(也称作实时PCR)的方法。QPCR可以提供定量的测定，还提供减少时间和污染的有益效果。本文使用的术语“定量PCR”(或“实时QPCR”)指在PCR扩增进行过程中，对PCR扩增的过程进行直接监测，而不需要反应产物的反复取样。在QPCR中，当信号增加至高于背景水平后但在反应达到坪值前，在产生和跟踪反应产物时，采用信号机制(例如荧光)进行监测。达到荧光的可检测或“阈值”水平(本文称为循环阈值或“CT”)的循环的数量，直接随PCR过程开始时的可扩增靶点的浓度而变化，这使得可以实时地以信号强度的测定提供样品中靶核酸数量的测定。

在一些实施方式中，标记的探针可以用于检测由PCR扩增产生的延伸产物。利用包含本文公开的序列的标记探针的任意探针形式均可以使用，例如SCORPION^TM探针，或者现有技术中已知的或描述于本文其他地方的分子信标探针。在一些实施方式中，所述探针可以在如下浓度下使用：0.01μM、0.02μM、 0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.11μM、0.12μM、0.13μM、0.14μM、0.15μM、0.16μM、0.17μM、0.18μM、0.19μM、0.20μM、0.21μM、0.22μM、0.23μM、0.24μM、0.25μM、0.26μM、0.27μM、0.28μM、0.29μM、0.3μM、0.31μM、0.32μM、0.33μM、0.34μM、0.35μM、0.36μM、0.37μM、0.38μM、0.39μM、0.4μM、0.41μM、0.42μM、0.43μM、0.44μM、0.45μM、0.46μM、0.47μM、0.48μM、0.49μM、0.5μM、或更高，或两者之间的任意浓度。在一些实施方式中，所述反应可以包括约0.1μM的SEQ ID NO 32和/或约0.3μM的SEQ ID NO 33。

用于建立PCR的方法对于本领域技术人员来说是公知的。反应混合物最少包含模板核酸(除了下面描述的阴性对照的情况)和寡核苷酸引物和/或探针，同时还有合适的缓冲液、盐等，以及核酸聚合酶的适宜的浓度。本文使用的“核酸聚合酶”指催化三磷酸核苷聚合的酶。一般而言，该酶会在退火为靶序列的引物的3’末端起始合成，并且会沿着模板在5’方向上继续进行，直至合成终止。适宜的浓度包括在本发明描述的方法中催化该反应的浓度。用于本发明公开的方法中的已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、T7

DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶、极端嗜热菌DNA聚合酶、栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶、以及嗜热古细菌(Pfu)DNA聚合酶。

除了上面的组分，本发明方法的反应混合物包括引物、探针和三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)。

通常，所述反应混合物会进一步包含四种不同类型的dNTP，其对应于四种天然的核苷碱基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本文公开的一些实施方式中，每种dNTP存在的量一般在约10～5000μM的范围内，通常为约20～1000uM，约100～800uM，或约300～600μM。

在本文公开的实施方式的方法的第一步中所制备的反应混合物进一步包括缓冲介质水溶液，其包括单价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可以使用任何方便的单价离子源，例如氯化钾、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、氯化铵、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中，所述阳离子一般为镁。可以使用任何方便的镁阳离子源，包括氯化镁、乙酸镁等。缓冲液中镁的量可以在 0.5～10mM的范围内，可以在约1～约6mM的范围内，或者约3～约5mM。可能存在于缓冲液中的代表性的缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中，缓冲剂的量一般在约5～150mM范围内，通常为约10～100mM，更常见的是约20～50mM，其中，在某些优选的实施方式中，缓冲剂存在的量足以提供约6.0～9.5范围内的pH，例如pH约6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5。可以存在于缓冲介质中的其他试剂包括螯合剂，例如EDTA、EGTA等。在一些实施方式中，反应混合物可以包括BSA等。

在制备反应混合物时，各种构成组分可以以任意方便的顺序混合。例如缓冲液可以与引物、聚合酶混合，然后与模板核酸混合，或者可以将所有的各种构成组分同时混合以制备反应混合物。

可选地，可以按照生产商的说明书，将市场上购买得到的预混合的试剂用于本文公开的方法中，或者对其进行改进以改善反应条件(例如必要时，改变缓冲液浓度、阳离子浓度或dNTP浓度)，所述预混合的试剂包括，例如 Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)，或 (Cepheid)，IQ&#8482；Supermix(Bio-Rad Laboratories)，

FastStart(印度，印第安纳布里斯，Roche Applied Science)，或者

QPCR Master Mix(加拿大，拉荷亚，Stratagene)。

反应混合物制备之后，所述反应混合物可以进行引物延伸反应条件(“足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件”)，即，所述条件允许通过采用模板链作为模板，将核苷酸添加到引物分子的末端，进行聚合酶介导的引物延伸。在很多实施方式中，引物延伸反应条件是扩增条件，该条件包括多个反应循环，其中，每个反应循环包含：(1)变性步骤，(2)退火步骤，以及(3)聚合步骤。反应循环的数量会根据所进行的应用而有所变化，但通常是至少15个，更常见的是至少20个，并且可以高达60个以上，其中，不同循环的数量一般在约20～40个的范围内。对于进行大于约25个、通常大于约30个循环的方法，可能方便和希望的是：将附加的聚合酶引入到反应混合物中以维持适于酶促引物延伸的条件。

变性步骤包括将反应混合物加热至高温，并且在所述高温下维持一段时间，这段时间足以使存在于所述反应混合物中的任何双链或杂交的核酸解离。对于变性，反应混合物的温度通常会被升高至并保持在约85～100℃的温度范围，一般为约90～98℃，更常见为约93～96℃，保持的时间范围为约3～120秒，一般为约3秒。

在变性后，所述反应混合物将进行下列反应条件：其足以使引物退火为存在于所述混合物中的模板核酸(如果存在)，并且采用所述核酸(所述引物作为模板被杂交至所述核酸)，足以以将所述引物沿5’至3’的方向延伸的方式将核苷酸聚合至所述引物末端，也就是足以酶促产生引物延伸产物的条件。在该实施方式中，退火和延伸过程发生在相同的步骤中。通常选择温度(所述反应混合物被降低至该温度以实现这些反应条件)以提供最佳的效率和选择性，所述温度一般在约50～75℃的范围内，通常为约55～70℃，更常见为60～68℃，更具体为约60℃。退火条件维持的时间范围是约15秒～30分钟，一般为约20秒～5分钟，或约30秒～1分钟，或约30秒。

该步骤可以任选地包括每一个退火步骤和延伸步骤的中的一个，对于每一个步骤，温度和时间长度都进行了改变和优化。在两步退火和延伸中，退火步骤允许如上所述进行。引物退火为模板核酸后，将所述反应混合物进一步进行如下反应条件：其足以将核苷酸的聚合提供至如上所述的引物末端。为了实现聚合条件，反应混合物的温度通常会被升高至或保持在约65～75℃的温度范围，一般为约67～73℃，保持的时间范围为约15秒～20分钟，一般为约30秒～5分钟。

在一些实施方式中，所述循环可以包括在95℃的15分钟的初始变性，其仅进行一次，随后是在95℃进行1秒钟的变性步骤，以及在60℃进行25秒钟的退火/延长步骤。该两步循环可以重复多次，例如约45次。在一些实施方式中，可以增加最终的延长步骤，在72℃进行10分钟。

在一些实施方式中，所述循环可以包括在95℃的15分钟的初始变性，然后进行多次如下循环(例如约45个循环)：在95℃进行1秒钟变性，在60℃进行9秒钟退火，以及在72℃进行9秒钟延长。可以增加最终的延长步骤，在72℃进行10分钟。

上面的变性、退火和聚合可以采用自动装置进行，其一般被称作热循环仪。可以采用的热循环仪描述于本文的其它位置，以及美国专利5,612,473、 5,602,756、5,538,871、和5,475,610中，将它们的全文引入本文作为参考。

本文公开的方法还可以用在用于检测靶核酸序列的基于非PCR的应用中，其中，这样的靶点还可以固定在固体载体上。将核酸序列固定在固体载体上的方法在本领域是已知的，并描述于[Ausubel等，eds.(1995)分子生物学中的现有方法(Current Protocols in Molecular Biology)(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NY)]以及生产商提供的规程中，例如：对于膜，Pall Corporation，Schleicher&amp；对于磁性珠，Dynal；对于培养板Costar，Nalgenunc；对于珠阵列平台(bead array platforms)，Luminex和Becton Dickinson；以及其他用于本文公开的实施方式中的载体，CPG，Inc。

核酸扩增领域的技术人员知道还存在其他的快速扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)以及支链化DNA(bDNA)[Persing等，(1993)诊断分子为生物：原理和应用(Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications)(美国微生物协会，华盛顿(American Society for Microbiology，Washington，DC))。本文公开的实施方式的范围不限于使用由PCR进行的扩增，还包括使用任意的快速核酸扩增方法，或者可以将本文公开的实施方式的序列用于检测和/或定量ESBL抗生素抗性基因例如CTX-M基因的任何其他方法。

进一步地，对于各种试剂的提取量和用于PCR或其他合适的扩增方法的条件的改变(例如缓冲条件、循环次数等)，获得相似的扩增或检测/定量结果，这对于本领域技术人员来说是已知的，并认为是等同的。在一个实施方式中，所述受试QPCR检测的检测灵敏度少于样品中靶核酸(即ESBL核酸，包括CTX-M基因)的50个拷贝(优选少于25个拷贝，更优选少于15个拷贝，进一步优选少于10个拷贝)。在一个实施方式中，进行热启动PCR反应(例如采用热启动Taq DNA聚合酶)，以通过减少背景的非特异性扩增来改善PCR反应，并增加希望的延伸产物的扩增。

对照

在一些实施方式中，本文公开的PCR或QPCR反应可以包含各种对照。该对照可以包括“无模板”的阴性对照，其中，引物、缓冲液、酶、或其他必要的试剂(例如氯化镁、核苷酸)在不加入测试样品的情况下进行循环。阳性对照包括已知的靶核酸，其可以平行地进行操作。在一些实施方式中，扩增反应同时包括阳性对照和阴性对照。单反应可以包含阳性对照、阴性对照或样品模板，或者，单反应可以包含模板和阳性对照。

除了“无模板”对照，阴性对照还可以包括在反应中包含非特异性靶核酸的扩增反应，或者，可以是不加入测试样品(例如，每个步骤均不使用测试样品或者已知不含有ESBL例如CTX-M的样品)而采用样品制备(从核酸提取到扩增制备)的任意或所有步骤制备的样品。

阳性和阴性对照用于设定参数，在所述参数内，测试样品被划分为含有或不含有ESBL。

例如，在QPCR反应中，在阳性对照样品中检测到ESBL(例如CTX-M)时所在的循环阈值可以被用于设定将样品划分为“阳性”的阈值，而在阴性对照样品中检测到重要的ESBL(例如CTX-M)时所在的循环阈值可以被用于设定将样品划分为“阴性”的阈值。来自于单反应的CT可以用于每个对照，或者，可以使用复制样品的中位数或平均值。在另一些实施方式中，可以采用历史对照值(historical control value)。一般将每个阴性和阳性对照的最低检测水平设定在多个反应的平均CT的95％置信区间的低端。该值可以根据诊断分析的需要进行调节。

优选地，PCR对照应当与测试样品同时在相同的扩增反应中进行，并使用相同的试剂。

一些实施方式提供了靶扩增产物的同一性和/或数量的测定。引物延伸或扩增产物的同一性可以采用标准的分子技术(包括，例如DNA印迹分析)进行确认。在DNA印迹分析中，采用电泳分离扩增产物，将扩增产物转移到膜(即硝化纤维、尼龙等)，与寡核苷酸探针或目标核苷酸序列的任意部分进行反应。然后对所述探针进行修饰以能够进行检测。所述的修饰方法可以是结合放射标记的核苷酸或任意数量的非放射性标记(例如生物素)。DNA印迹分析中使用的寡核苷酸探针来自于所述核酸序列，因此对于CTX-M核酸是特异性的，并且可以是包含SEQ ID NO：5、10、31、32和33所列出的序列的探针。DNA印迹分析中使用的探针可以采用常规的标准方法进行制备。例如，所述探针可以采用本领域已知的常规技术进行分离、克隆和限制，或者可以采用本文上面描述的化学合成方法进行制备。

可选地，可以采用斑点印迹分析检测扩增产物。斑点印迹分析包括将寡核苷酸探针(例如前面所描述的寡核苷酸探针)粘附到硝化纤维或固体载体上，所述固体载体例如但不限于珠(例如但不限于聚苯乙烯珠、磁性珠或非磁性殊等)、反应盘的壁、条带(例如但不限于硝化纤维条带)、试管。加入含有标记的扩增产物的样品，进行反应，清洗以除去未结合的样品，并采用本领域已知的常规技术使连接至所述探针的标记的扩增的产物可视化。验证引物延伸产物或扩增产物的更严格的方法是采用本领域公知的技术进行直接测序。

试剂盒

本文还提供包含进行本文上面描述的方法所必需的成分的“试剂盒”。这样的试剂盒可以包含载体，将所述载体分隔以在其中严密地收纳一个以上的容器，例如管或瓶。其中一个容器可以容纳本文公开的至少一种未标记的或可检测标记的引物或探针。所述引物可以以冻干的形式存在，或者必要时存在于适宜的缓冲液中。一个以上的容器可以容纳在PCR反应中使用的一种或多种酶或试剂。这些酶可以单独存在或混合，以冻干形式存在或存在于适宜的缓冲液中。

最后，所述的试剂盒可以包括本文公开的对进行所述方法所必需的附加成分，例如缓冲液、提取试剂、酶、吸液管、平皿、核酸、三磷酸核苷、滤纸、凝胶材料、传导材料、自动射线照相装置等。

优选地，所述试剂盒包括：(a)标记的寡核苷酸，其中，所述试剂盒包括两个以上可辨别的寡核苷酸，例如与编码EMBL的核酸序列(例如CTX-M基因)杂交的寡核苷酸；(b)以高重现性扩增使用提供的标记的寡核苷酸的说明，例如PCR反应，例如QPCR。在一个实施方式中，所述两个可辨别的寡核苷酸选自于由SEQ ID NO：1～24组成的组。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括附加的试剂，在本文公开的方法过程中，所述附加试剂是必需的，或者方便和/或希望包含于制备的反应混合物中，其中，这样的试剂包括：一种以上的聚合酶；缓冲介质水溶液(或已制备或以其构成组分存在，其中，一种以上的组分可以预混合，或者全部组分可以是单独的)；等。所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于单独的容器中，或者全部预混合为试剂混合物，以用于与模板核酸混合。

除了上面的组分，在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括实践本文公开的方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于所述试剂盒中，其中的一个以上可以存在于试剂盒中。这些说明存在的一种形式是作为在合适的媒介或底物上的印刷信息，例如印刷有所述信息的纸，试剂盒的包装，药品说明书等。另一个手段是记录有所述信息的计算机可读介质，例如磁盘、CD等。可能存在的另一个手段是可以经因特网在远的站点获取所述信息的网址。在所述试剂盒中，可以存在任何方便的手段。

将下面每一篇文献公开的内容全部引入本文作为参考。

参考文献

1.Rasmussen and Bush.1997.碳青霉烯-水解[β]内酰胺酶(Carbapenem-Hydrolyzing[beta]-Lactamases).Antimicrob.Agents Chemother41：223-232.

2.Woodford等，2004.肺炎克雷伯杆菌的爆发产生新的A型碳青霉烯-水解[β]内酰胺酶，KPC-3，在纽约医学中心(Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New Carbapenem-Hydrolyzing Class A[beta]-Lactamase，KPC-3，in aNew York Medical Center).Antimicrob.Agents Chemother 48：4793-4799.

3.Yigit等，2001.新的碳青霉烯-水解[β]内酰胺酶，KPC-I，来自于肺炎克雷伯杆菌的碳青霉烯抗性菌株(Novel Carbapenem-Hydrolyzing[beta]-Lactamase，KPC-I，from a Carbapenem-Resistant Strain of Klebsiella pneumoniae).Antimicrob.Agents Chemother 45：1 151-1 161.

4.微生物学手册(Manual of Microbiology)，第八版(8th edition).Edited by PR Murray，EJ Baron，JH Jorgensen，MA Pfaller，and RH Yolken.ASM Press，Washington D.C.，2003.

5.临床和实验标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute).2008.用于抗微生物剂易感性测试的性能标准第十八的报告补充(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Eighteenth Informational Supplement M1 00-S 18).Clinical and Laboratory Standard Institute，Wayne，Pa.

6.Dieffenbach&Dveksler.2003.PCR引物实验手册(PCR Primer：ALaboratory Manual).冷泉港实验室(CSHL)Press，520p.

7.Devor，EJ.2005.锁核酸(Locked Nucleic Acids)(LNAs).分子遗传学和生物信息学：整合DNA技术(Molecular Genetics and Bioinformatics：Integrated DNA technologies).

本文所描述和主张要求的发明不应限于本文公开的具体实施方式的范围，因为这些实施方式目的是作为本发明多个方面的说明。任何等同的实施方式均落在本发明的范围内。事实上，除了本文所说明和描述的实施方式外，根据前面的描述，所述实施方式的各种改变对于本领域技术人员也变得明了。所附的权利要求即希望覆盖这样的改变。

Claims

1.用于检测和或鉴定样本中具有CTX-M超广谱β-内酰胺酶的微生物存在的方法，其包括：

从待分析CTX-M基因的存在的样本中获得样品；

在标准PCR条件下，将所述样品与扩增引物集接触，其中，所述扩增引物集包含至少一对引物对，其中，所述引物集包含一个以上的具有通用碱基的引物，其中，所述引物对与位于CTX-M超广谱β-内酰胺酶基因内的靶序列侧翼的核酸杂交，并且其中，所述引物对产生靶扩增产物；

提供用于引物延伸的试剂和条件，以产生靶扩增产物；以及

确定靶扩增产物的存在和/或量，其中，所述靶扩增产物的存在说明所述CTX-M基因的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将所述样品与至少一种与所述靶扩增产物杂交的探针进行接触。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物集包含多个扩增引物对，其中，在至少两个CTX-M基因的核酸的存在下，所述多个扩增引物对共同地与所述至少两个CTX-M基因的核酸杂交，并制备靶扩增产物，所述至少两个CTX-M基因来自于至少两个CTX-M组，所述至少两个CTX-M组选自于由CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25所组成的组中。

4.根据权利要求5所述的方法，其中，在所述CTX-M基因的核酸的存在下，所述多个扩增引物对共同地与所述CTX-M基因的核酸杂交，并制备靶扩增产物，所述CTX-M基因来自于CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25的组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物集包含多个扩增引物对，其中，在CTX-M异构体1～82的存在下，所述多个扩增引物对共同地与所述CTX-M异构体1～82杂交，并制备靶扩增产物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物集包含多个扩增引物对，其中，在来自于表1列出的每个菌株的CTX-M核酸的存在下，所述多个扩增引物对共同地与所述来自于表1列出的每个菌株的CTX-M核酸杂交，并制备靶扩增产物。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述探针选自于由分子信标探针、TAQMAN^TM荧光探针和蝎型荧光探针所组成的组中。

8.根据权利要求5所述的方法，进一步包括在标准PCR条件下将所述样品与至少一种与所述靶扩增产物杂交的探针接触，所述靶扩增产物来自于至少两个CTX-M组靶扩增产物。

9.根据权利要求5所述的方法，进一步包括在标准PCR条件下将所述样品与一种以上的探针接触，其中，所述一种以上的探针共同地与来自于CTX-M组CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25的靶扩增产物杂交。

10.根据权利要求5所述的方法，进一步包括在标准PCR条件下将所述样品与至少一种以上的探针接触，其中，所述一种以上的探针共同地与来自于CTX-M组CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、和CTX-M-25的靶扩增产物杂交。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物集包含至少两个引物，其中，每个引物包含选自于由下列序列组成的组中的至少12个保守核苷酸：

CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO：1)；

TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO：2)；

GGTMTGCCGAAATSWTGG(SEQ ID NO：3)；

CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO：4)；

TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO：6)；

GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO：7)；

TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO：8)；

AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO：9)；

或它们的互补序列。

12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括将所述样品与至少一种探针接触，其中，所述至少一种探针包含选自于由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组中的至少12个保守核苷酸。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物集包含至少两个引物，其中，每个引物包含选自于由下列序列组成的组中的至少12个保守核苷酸：

CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO：1)；

TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO：2)；

GGTMTGCCGAAATSWTGG(SEQ ID NO：3)；

CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO：4)；

TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO：27)；

GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO：28)；

TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO：29)；

AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO：30)；

或它们的互补序列。

14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括将所述样品与至少一种探针接触，其中，所述至少一种探针包含选自于由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组中的至少12个保守核苷酸。

15.用于检测和/或鉴定样本中具有CTX-M超广谱β-内酰胺酶的微生物存在的试剂盒，其包括：

扩增引物集，其中，所述扩增引物集包含至少一对引物对，并且其中，所述引物集包含一个以上的具有通用碱基的引物，其中，所述至少一对引物对与位于CTX-M超广谱β-内酰胺酶基因内的靶序列侧翼的核酸或包含部分CTX-M超广谱β-内酰胺酶基因的靶序列侧翼的核酸杂交。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，进一步包括与所述靶序列杂交的至少一种探针。

17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述扩增引物集包含多个扩增引物对，并且其中，在标准PCR条件下，在至少两个CTX-M基因的核酸的存在下，所述多个扩增引物对能够共同地与所述至少两个CTX-M基因的核酸杂交，并制备靶扩增产物，所述至少两个CTX-M基因来自于至少两个CTX-M组，所述至少两个CTX-M组选自于由CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、和CTX-M-25所组成的组中。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，在标准PCR条件下，在CTX-M基因的核酸的存在下，所述多个扩增引物对能够共同地与所述CTX-M基因的核酸杂交，并制备靶扩增产物，所述CTX-M基因来自于CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25组中。

19.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述扩增引物集包含多个扩增引物对，其中，在标准PCR条件下，在CTX-M异构体1～82的存在下，所述多个扩增引物对能够共同地与所述CTX-M异构体1～82杂交，并制备靶扩增产物。

20.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述探针选自于由分子信标探针、TAQMAN^TM荧光探针和蝎型荧光探针所组成的组中。

21.根据权利要求17所述的试剂盒，进一步包括至少一种能在标准PCR条件下与所述靶扩增产物杂交的探针，所述靶扩增产物来自于至少两个CTX-M组靶扩增产物。

22.根据权利要求19所述的试剂盒，进一步包括一种以上的探针，其中，所述一种以上的探针能在标准PCR条件下共同地与来自于CTX-M组CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25的靶扩增产物杂交。

23.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述扩增引物集包含至少两个引物，其中，每个引物包含选自于由下列序列组成的组中的至少12个保守核苷酸：

CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO：1)；

TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO：2)；

GGTMTGCCGAAATSWTGG(SEQ ID NO：3)；

CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO：4)；

TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO：6)；

GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO：7)；

TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO：8)；

AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO：9)；

或它们的互补序列。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，进一步包括至少一种探针，其中，所述至少一种探针包含选自于由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组中的至少12个保守核苷酸。

25.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述扩增引物集包含至少两个引物，其中，每个引物包含选自于由下列序列组成的组中的至少12个保守核苷酸：

CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO：1)；

TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO：2)；

GGTMTGCCGAAATSWTGG(SEQ ID NO：3)；

CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO：4)；

TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO：27)；

GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO：28)；

TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO：29)；

AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO：30)；

或它们的互补序列。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，进一步包括至少一种探针，其中，所述至少一种探针包含选自于由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组中的至少12个保守核苷酸。

27.根据权利要求15所述的试剂盒，进一步包括扩增引物对，其中，所述扩增引物对与位于碳青霉烯酶基因内的靶序列侧翼的核酸或包含部分碳青霉烯酶基因的靶序列侧翼的核酸杂交。