CN102257160A - 用于缩短杂交分析中的培养时间的方法和试剂 - Google Patents

用于缩短杂交分析中的培养时间的方法和试剂 Download PDF

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Abstract

在此描述的方法和试剂可用于缩短杂交分析中的培养时间。如实施例中说明的，我们已经确定导致培养时间显著缩短(例如三小时之后的信号(signal)可与传统仅可在培养一夜之后获得的信号堪相比较)的特殊磺酸聚合物和杂交条件。在一些实施方案中，通过在杂交方法期间添加一种或多种磺酸聚合物获得更短的培养时间。可选地或另外地，在一些实施方案中，通过改变杂交条件，例如通过降低杂交体积，增加盐浓度，和/或增加探针浓度(捕获扩展物探针和/或标记扩展物探针)来获得更短的培养时间。

Description

用于缩短杂交分析中的培养时间的方法和试剂
相关申请的引用
本申请要求2008年12月18日提交的美国临时申请序列号61/138,601的优先权，在此将其全部内容引入作为参考。
背景技术
本领域中已经研发许多分析用于检测试样中目标核酸(例如DNA或RNA)的存在和任选定量测量其数量。例如，已经研发许多聚合酶链式反应(PCR)基分析，所述分析包括扩增目标核酸区域，然后检测扩增产物存在的初始步骤。
已经研发许多杂交分析作为PCR基分析的替代(例如参见Collins等人的Nucleic Acids Research，(1997) 25：2979-2984和 US 5,635,352；5,124,246；5,681,697；5,681,702；5,780,610和5,624,802)。杂交分析不依赖目标核酸的扩增。相反，如图1和2中说明的，它们依赖一系列复杂的核酸杂交。使用捕获探针(capture probe)的组合在固相上捕获独立目标核酸。一些捕获探针结合至固相(固相捕获探针)，而其它在溶液中游离(捕获扩展物探针(capture extender probe))。捕获扩展物探针具有两个区段。一个区段杂交至固相捕获探针，而另一区段杂交至目标核酸的区域。使用在溶液中游离的更多探针的组合完成捕获的目标核酸的检测。标记扩展物探针(label extender probe)包括分别杂交至目标核酸区域和核酸多聚体的预扩增探针部分的区域。除了预扩增探针部分之外，核酸多聚体也包括许多非共价杂交(例如图1所示)或共价键合(例如图2所示)的扩增探针。检测多聚体可以是支化的，如图1和2所示，或者它们可以是线型的。最后，杂交至核酸多聚体的扩增探针的标记的低聚核苷酸允许检测捕获的目标核酸。
因为杂交分析依赖这种复杂的和缠结的杂交步骤序列，它们可能需要很长时间来完成以及目前需要一夜的培养。这种漫长的培养期迫使分析成为两天方法。使用杂交分析(例如测定HIV或HCV病毒载量(viral load))的许多临床医生和临床实验室将显著得益于一天杂交分析。因此在本领域中需要缩短杂交分析中的培养时间的方法和试剂。
发明内容
在此描述的方法和试剂可用于缩短杂交分析中的培养时间。如实施例中说明的，我们已经确定导致培养时间显著缩短(例如三小时之后的信号(signal)可与传统仅可在培养一夜之后获得的信号堪相比较)的特殊磺酸聚合物和杂交条件。在一些实施方案中，通过在杂交方法期间添加一种或多种磺酸聚合物获得更短的培养时间。可选地或另外地，在一些实施方案中，通过改变杂交条件，例如通过降低杂交体积，增加盐浓度，和/或增加探针浓度(捕获扩展物探针和/或标记扩展物探针)来获得更短的培养时间。
附图简述
图1显示可以根据在此描述的方法使用的杂交分析架构的实施方案。如所示的，这种特殊的分析架构使用非共价核酸多聚体用于检测。该非共价核酸多聚体包括杂交至许多扩增探针的预扩增探针。
图2显示可以根据在此描述的方法使用的杂交分析架构的另一个实施方案。如所示的，这种特殊的分析体系使用共价核酸多聚体用于检测。该非共价核酸多聚体包括共价键合至支化“梳状”架构中的许多扩增探针的预扩增探针。
化学定义
如在此使用的，术语“脂族”或“脂族基团”表示可以是直链(即未支化)、支化或环状(包括稠合、桥键和螺稠合多环)并且可以是完全饱和或可以包含一个或多个不饱和单元，但是不是芳族的烃部份(moiety)。除非另作说明，脂族基团包含1-6个碳原子。在一些实施方案中，脂族基团包含1-4个碳原子，并且在其它实施方案中，脂族基团包含1-3个碳原子。适合的脂族基团包括但不限于线型或支化烷基、烯基和炔基，及其杂化物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
如在此使用的，术语“不饱和”表示某部份具有一个或多个不饱和单元。
如在此使用的，术语“烷基”表示衍生自包含一至六个碳原子的脂族部份通过去除单个氢原子得到的一价饱和直链或支链烃基。在一些实施方案中，烷基包含1-5个碳原子。在另一个实施方案中，烷基包含1-4个碳原子。在其它实施方案中，烷基包含1-3个碳原子。在另一个实施方案中，烷基包含1-2个碳。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等。
如在此使用的，术语“烯基”表示衍生自具有至少一个碳-碳双键的直链或支链脂族部份通过去除单个氢原子得到的一价基团。在一些实施方案中，烯基包含2-6个碳原子。在一些实施方案中，烯基包含2-5个碳原子。在一些实施方案中，烯基包含2-4个碳原子。在另一个实施方案中，烯基包含2-3个碳原子。烯基包括例如乙烯基(ethenyl)(“乙烯基(vinyl)”)、丙烯基(“烯丙基”)、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
如在此使用的，术语“炔基”表示衍生自具有至少一个碳-碳三键的直链或支链脂族部份通过去除单个氢原子得到的一价基团。在一些实施方案中，炔基包含2-6个碳原子。在一些实施方案中，炔基包含2-5个碳原子。在一些实施方案中，炔基包含2-4个碳原子。在另一个实施方案中，炔基包含2-3个碳原子。代表性的炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(“炔丙基”)、1-丙炔基等。
术语“亚烷基”表示二价烷基。“亚烷基链”为聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n为正整数，优选为1至6、1至4、1至3、1至2或2至3。
单独使用的或作为较大部份的一部分(part)使用的术语“环烷基”和“环烯基”表示具有3至10个成员的饱和或部分不饱和环状脂族单环或双环体系，如在此描述的。环烷基和环烯基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基和环辛二烯基。在一些实施方案中，环烷基具有3-6个碳。
术语“杂芳基”表示具有5至10个环原子，优选5、6或9个环原子；具有在环状排列中共用的6、10或14个π电子；和除了碳原子之外，具有1至5个杂原子的基团。术语“杂原子”表示氮、氧或硫，以及包括氮或硫的任何氧化形式，和碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、                                                
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE001
唑基、异
Figure 953732DEST_PATH_IMAGE001
唑基、
Figure 808555DEST_PATH_IMAGE001
二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和喋啶基。6-元杂芳基包括例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。如在此使用的，术语“杂芳基”还包括其中杂芳基环稠合至一个或多个芳基、脂环基或杂环基环的基团，其中连接基团或连接点在杂芳基环上。非限制性实例包括吲哚基、异氮杂茚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩
Figure 588292DEST_PATH_IMAGE001
嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-
Figure 983502DEST_PATH_IMAGE001
嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环或双环的。
各实施方案的详细说明
本申请引用许多文献，包括专利和非专利文献。在此将这些文献全部引入作为参考。
在此描述的方法和试剂可用于缩短杂交分析中的培养时间。如实施例中说明的，我们已经确定导致培养时间显著缩短(例如三小时之后的信号(signal)可与传统仅可在培养一夜之后获得的信号堪相比较)的特殊磺酸聚合物和杂交条件。在一些实施方案中，通过在杂交方法期间添加一种或多种磺酸聚合物获得更短的培养时间。可选地或另外地，在一些实施方案中，通过改变杂交条件，例如通过降低杂交体积，增加盐浓度，和/或增加探针浓度(捕获扩展物探针和/或标记扩展物探针)来获得更短的培养时间。
在更详细地论述这些方法和试剂之前，介绍本公开内容的分析中涉及的各组分和步骤。
目标核酸
在核酸杂交分析中，通过在一组互补核酸探针之间发生的一系列杂交反应，在试样中检测目标核酸。如在此使用的，术语“目标核酸”表示包含目标核苷酸序列的一个或多个单-和/或双-链(strand)核酸分子。在一些实施方案中，目标核酸为RNA、DNA，或其组合。在一些实施方案中，目标核酸可以包括一个或多个改性核苷酸。
目标核酸可以来自许多来源，包括来自一种或多种生物试样。在这里，术语“生物试样”表示由任何生物来源分离的试样。例如，生物试样可以从动物，例如人类，例如血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤的表层区域、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官等中获得。在一些实施方案中，生物试样可以为体外细胞培养构成物(包括由细胞在细胞培养介质中生长产生的调理介质、推定滤过性毒菌感染的细胞、重组细胞和细胞成分)的试样。在一些实施方案中，生物试样可以包括例如来自乙型肝炎病毒(“HBV”)、丙型肝炎病毒(“HCV”)、丁型肝炎病毒(“HDV”)、人类免疫缺陷性病毒(“HIV”)的病毒核酸，和病毒的疱疹属，包括带状疱疹(水痘)、单纯疱疹病毒I & II、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、疱疹VI病毒，或任何其它病毒。在一些实施方案中，生物试样可以包括例如来自例如衣原体、结核杆菌的细菌，或任何其它细菌的细菌核酸。在一些实施方案中，目标核酸可以来自环境试样，例如来自污垢、水、菌群等试样。
在一些实施方案中，在加入到杂交分析之前，将目标核酸从生物和/或环境试样中分离。在一些实施方案中，通过细胞溶解作用和/或化学萃取将目标核酸从试样剥离。在优选实施方案中，将试样溶解在包含促进试样溶解和目标核酸剥离的盐、洗涤剂和/或其它组分的缓冲剂中。在一些实施方案中，可以通过标准克隆或扩增方法由试样制备目标核酸。
在一些实施方案中，目标核酸可以通过许多手段进一步制备用于杂交分析，所述手段包括但不限于添加蛋白酶K/SDS、离液盐(chaotropic salt)等，或苯酚/氯仿萃取。
在一些实施方案中，可能希望通过酶促、物理或化学手段减小分析物核酸的平均尺寸。这些技术包括但不限于限制酶、超声处理和化学降解。各区段可以小至0.1 kb，通常为至少0.5 kb和可以为1 kb或更高。优选以单链的形式提供目标序列用于分析。其中序列以单链的形式天然存在，不需要变性。但是，当序列以双链形式存在时，可以将序列变性。变性可以通过各种技术进行，例如碱，通常0.05至0.2 M氢氧化物，甲酰胺，盐，离液盐，加热，或其组合。
目标核酸捕获
在杂交分析的第一步中，在杂交条件下使单链目标核酸(如上所述制备)与沿着目标核酸在不同部位杂交的低聚核苷酸探针混合(图1和2)。
捕获扩展物(CE)探针在目标核酸和固相之间起桥梁的作用，并且由此在固相上捕获目标核酸(图1和2)。在一些实施方案中，CE探针包括与目标核酸的序列互补的区段，和与连接至固相的低聚核苷酸捕获探针互补的区段。另外，在一些实施方案中，CE探针可以包括配体-受体对的一个成员，而固相包括该对的另一成员。配体-受体对的亲合性引起CE探针变得与固相连接。这种对的实例包括生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)，甲状腺素/甲状腺素结合球蛋白(globulin)，抗原/抗体，碳水化合物(carbohydrate)/凝集素(lectin)。
分析中使用的固相可以为多孔材料的颗粒状(例如珠粒形式)暴露表面，或者可以为许多容器的任一种的表面，包括但不限于离心管、柱、微量滴定板孔、过滤器、管，或低聚核苷酸捕获探针可以连接的其它表面。当使用颗粒时，它们应优选具有0.4至200微米，更通常0.8至4.0微米的尺寸。颗粒可以为任何常规的材料，例如胶乳或玻璃。在一些实施方案中，微量滴定板用作固相。在一些实施方案中，固相捕获探针可以由本领域中的已知步骤，通过共价键合至固相表面上的官能团而连接至固相。
标记扩展物( LE)探针也通过互补序列杂交至目标核酸。与CE探针相似，LE探针是双功能的。除了结合目标核酸之外，LE探针具有与核酸多聚体的预扩增(PA)探针杂交的区段。PA探针的作用是形成信号扩增网络的第一个叉尖(prong)，其还包括扩增探针和杂交至扩增探针的标记的低聚核苷酸(图1和2)。在一些实施方案中，每个PA探针与两个不同的LE探针杂交，如图1和2所示。由两个LE探针形成的基序被称作十字形，并且已经显示改善结合至目标核酸的敏感性。在一些实施方案中，PA探针可以与单个LE探针杂交。
与目标核酸序列互补的CE和LE探针的区段通常将为至少15个核苷酸(nt)长，通常为至少25个nt，例如30个nt。在一些实施方案中，区段不超过100个nt。它们通常应加以选择以结合不同的目标核酸序列。通常，它们可以基于许多考虑因素加以选择。例如，根据目标核酸的特性和/或分析的目的，人们可能在交感序列、与多态性有关的序列、特殊显型或遗传型、特殊株系等方面感兴趣。为了保证该分析仅识别目标核酸，可以选择与目标核酸互补的CE和LE探针的区段，使得序列的组合对于目标核酸是唯一的。
通常选择分别与核酸多聚体的固相捕获探针和预扩增探针互补的CE和LE的区段，以避免可能存在于试样中的目标核酸或其它核酸的序列。第二区段可以与第一区段相邻，或者通过中间非互补序列与其隔开。如果需要，探针可以包括其它非互补序列。优选，这些非互补序列不阻碍互补区段的杂交或者导致发生非特异性结合。
应理解各互补区段不必为了杂交而具有完美的互补性。在许多情况下，当不超过10%的碱基(base)不匹配时，会发生杂交，忽略五个或更多核苷酸环不计。因此，如在此使用的，术语“互补”表示在该分析的杂交条件下，足以提供杂交的互补性程度。
分析中使用的探针可以使用本领域中已知的标准方法，由低聚核苷酸合成步骤或通过克隆制备。在一些实施方案中，分析中使用的探针可以为DNA、RNA或其组合。在一些实施方案中，探针可以包括一种或多种改性核苷酸。
在一些实施方案中，分析的第一步包括在杂交条件下使目标核酸与CE和LE探针。与预期的目标核酸摩尔数相比，杂交缓冲剂中CE探针和LE探针各自的比率为至少化学计算量，和优选为过量。杂交可以在适度升高温度进行，通常为20至80℃、30至80℃、35至75℃、40至70℃、50至70℃、55至70℃、60至70℃，特别是65℃。
在一些实施方案中，在CE和LE探针与目标核酸杂交一段时间之后，使产物在杂交条件下与固相接触。分析中的这一步骤过程中，CE探针与结合至固相的固相捕获探针杂交。在一些实施方案中，当CE和LE探针与目标核酸混合时，可以存在固相。
CE探针-目标核酸LE探针复合物与固相捕获探针杂交之后，洗涤固相以去除任何未结合的材料。接下来，使用一种或多种可用的检测方法检测捕获的目标核酸。
目标核酸检测 
在一些实施方案中，使用包括预扩增(PA)探针和多个扩增探针的核酸多聚体检测捕获的目标核酸(如图1或2中)所示。PA探针包括具有允许特定地结合至与目标核酸不互补的LE探针区段的序列、长度和组成的区段。在一些实施方案中，为了获得这种特性，PA探针区段为15至50，优选15至30个核苷酸(nt)长，并且具有40%至60%的GC含量。进而设计扩增探针，使得它们能够特定地和稳定地与标记的低聚核苷酸杂交。在一些实施方案中，扩增探针可以为15至50，优选15至30个核苷酸(nt)长，并且具有40%至60%的GC含量。在一些实施方案中，核酸多聚体可以用来与另一个核酸多聚体杂交。
应理解多聚体的探针可以由DNA、RNA或其组合组成。同样应理解多聚体的探针可以包括改性核苷酸。
非共价多聚体
在一些实施方案中，使用非共价支架(scaffold)产生核酸多聚体(例如参见图1)。在非共价多聚体支架中，在杂交条件下向固相结合目标核酸-探针复合物中加入PA探针。在这些条件下，PA探针与LE探针的可用区段杂交(图1)。所得具有结合PA探针的固相复合物可以通过洗涤与任何未结合的PA探针分离。
PA探针杂交至固相结合目标核酸之后，添加扩增探针。这些扩增探针在其序列中具有与PA探针区段互补的区域。作为设计PA探针和扩增探针两者的序列的结果，多个扩增探针可以退火(anneal)至单个PA探针(图1)。允许扩增探针经由PA探针退火至固相结合目标核酸之后，可以通过洗涤去除任何未结合的扩增探针。
向分析中添加扩增探针使得能够在检测期间扩增信号。实际上，多个扩增探针各自用作标记的低聚核苷酸的模板，所述标记的低聚核苷酸用来检测捕获的目标核酸的存在。
共价多聚体 
在一些实施方案中，核酸多聚体具有共价支架(例如参见图2)。在这种实施方案中，PA探针和扩增探针可以通过磷酸二酯键，或通过插入的连接试剂，例如核酸、氨基酸、碳水化合物或多元醇桥键，或通过能够交联核酸或改性核酸链的其它交联剂彼此共价键合。键的一个或多个部位可以在单元末端(正常的3'-5'取向或随机取向)和/或在链中的一个或多个内部核苷酸。图2显示一种共价核酸多聚体，其具有PA探针主链以及许多侧挂扩增探针(“梳状”构架)。侧挂扩增探针通常将从改性核苷酸或具有适当官能团的PA探针的其它有机部分悬挂(depend)，扩增探针可以与所述官能团缀合(conjugated)或以其它方式连接。在一些实施方案中，可以使用线型多聚体，其中单独的扩增探针与预扩增探针以末端末端方式相连，形成线型聚合物。在一种共价核酸多聚体中，两个或更多个PA探针从起点发散，形成支化结构(“叉状”架构)。起点可以为另一个低聚核苷酸单元或至少三个探针可以以共价键方式结合的多官能分子。通常，多聚体可以是完全线型、完全支化的，或者具有线型和支化部分的组合。
多聚体合成
可以通过克隆(如果是线型的)、酶促组装、化学交联技术、直接化学合成或其组合制备多聚体。在通过克隆制备线型多聚体的情况下，编码整个多聚体或其区段的核酸序列可以通过常规克隆步骤，以单-或双链的形式制造。当以双链形式制造时，多聚体/区段最终加以变性，以提供单链多聚体/区段。多聚体可以使用常规单链噬菌体媒介，例如M13，以单链形式克隆。区段可以酶催或化学连接，形成多聚体。当酶催组装时，可以用连接酶，例如T4 DNA或RNA连接酶连接单个单元。当通过化学交联制备时，可以用一个或多个核酸合成单个单元，所述核酸已经衍生化为具有提供连接部位的官能团，或者在已合成低聚核苷酸来提供此类部位之后衍生化。在一些实施方案中，通过将N4-改性胞嘧啶碱基引入核苷酸来完成化学交联，如US 5,093,232中所述。当通过直接化学合成制备时，可以通过常规低聚核苷酸合成技术制备包含衍生化核酸或官能团被阻断的等效多官能分子的低聚核苷酸。官能团被开启并且从一个或多个开启部位合成低聚核苷酸单元。用于在多聚体中产生支化点的分子的一般结构和制备这些分子的一般方法在US 5,124,246、5,635,352和5,681,697以及其中引用的参考文献中描述。
标记的低聚核苷酸
一旦核酸多聚体经由LE探针结合至目标核酸，可以洗去未结合的核酸多聚体。然后向分析添加具有与扩增探针互补的序列的标记的低聚核苷酸。这些标记的低聚核苷酸变得经由与扩增探针杂交而结合至核酸多聚体(例如参见图1和2)。
标记的低聚核苷酸与扩增探针中的序列互补并且用一个或多个标记官能化，直接或间接地提供可检测信号。标记可以结合至互补序列的独立部份，或者可以以具有多个标记的末端部份或末端链端的形式存在。文献中已经报告多种提供标记的手段。例如参见Leary等人，Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80：4045；Renz和Kurz，Nucl Acids Res (1984) 12：3435；Richardson和Gumport，Nucl Acids Res (1983) 11：6167；Smith等人，Nucl Acids Res (1985) 13：2399；Meinkoth和Wahl，Anal Biochem (1984) 138：267。标记可以共价或非共价结合。可以使用的标记包括放射性核素、荧光剂、化学发光剂、染料、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、酶亚单元、金属离子等。特殊标记的实例包括但不限于荧光素、若丹明、Texas红、藻红蛋白、伞形酮(umbelliferone)、鲁米诺(luminol)、NADPH、α,β-半乳糖苷酶和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)。
标记的低聚核苷酸在允许标记的低聚核苷酸与扩增探针的互补序列杂交的条件下添加。所得固相标记的核酸复合物然后通过洗涤与过量的标记的低聚核苷酸分离，以去除未结合的标记的低聚核苷酸。
应理解分析的这一和任一前述分离步骤中使用的工序将根据固相的特性改变。对于颗粒，可以提供离心、磁力或过滤用于分离颗粒，丢弃上清液或分离上清液。当分析颗粒时，可以用合适的缓冲介质，例如包含例如SDS的洗涤剂的PBS将颗粒充分洗涤例如1至5次。当固相为壁或载体时，可以用和对于颗粒说明的一样的方法分离或丢弃上清液，以及洗涤壁。
在一些实施方案中，一旦已经通过洗涤去除未结合的标记的低聚核苷酸，使用合适的检测方法检测来自结合的标记的低聚核苷酸的信号。分析中用于确定目标核酸存在的检测方法将取决于标记的低聚核苷酸的特性。例如，在其中标记的低聚核苷酸用荧光团官能化的实施方案中，可以使用本领域中可用的各种检测方法检测荧光团的荧光。对于用化学发光剂标记的低聚核苷酸，光度计或薄膜可用于分析物检测。对于酶，可以形成荧光、化学发光(chemiluminiscent)或显色产物，并且可以荧光(fluorometrically)、发光(luminometrically)、分光(spectrophotometrically)或视觉检测。应理解对于本主题分析，可以使用任何已经用于免疫测定的各种标记和适用于免疫测定的技术。在一些实施方案中，使用合适的检测方法量化信号，并用于计算存在于原始试样中的目标核酸的量。
因为核酸多聚体包括较大量的可用于结合标记的低聚核苷酸的扩增探针，所以与结合至目标核酸的多聚体相比，更多的标记基团变得结合至复合物。大量标记基团降低了可检测的目标核酸的阈值水平。
另外，扩增可以通过在分析中使用超过一种多聚体而倍增。在这种情况下，第一种多聚体设计为起结合至扩增探针和第二种多聚体的作用，第二种多聚体设计为结合至第一种多聚体和标记的低聚核苷酸。任何量的多聚体可以用这样的方式串联结合，以实现大的多的信号扩增。
标记的低聚核苷酸可以通过例如US 5,093,232中描述的化学合成方便地制备。通过提供具有适当官能度的端基，各种标记可以经由该官能度相连。因此，人们可以提供羧基、硫醇、胺、肼或其它官能度，各种标记可以与其相连，而不有害地影响与扩增探针的双螺旋(duplex)形成。如上所述，可以得到具有一个或多个直接可检测标记的低聚核苷酸。另外，可以得到具有一个或多个配体的低聚核苷酸，并且使用标记的受体用于结合至配体，以提供标记的分析物复合物。
磺酸聚合物添加剂
分析的时间限制步骤是在LE探针和目标核酸之间，在目标核酸和CE探针之间，以及在CE探针和结合至固相的捕获探针之间发生的一系列杂交反应。在一个方面，提供各种方法，其中通过使目标核酸在杂交条件下，在磺酸聚合物或其盐存在下与LE和CE探针接触，来促进杂交步骤。
如实施例中说明的，我们发现在分析中聚乙烯基磺酸，以及在较低程度上，聚茴香脑磺酸(聚茴香脑磺酸)表现最好。因此，在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐涉及聚乙烯基磺酸，并且具有以下通式(I)：
Figure 984825DEST_PATH_IMAGE002
或其盐，其中：
R1为氢或C1-6脂族基团；
L为共价键或C1-6亚烷基；和 
n为大于10的整数。
在一些实施方案中，R1为氢。在一些实施方案中，R1为C1-6脂族基团。
在一些实施方案中，L为共价键。在一些实施方案中，L为C1-6亚烷基。在一些实施方案中，L为亚甲基。
在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐具有以下通式(Ia)：
Figure 807287DEST_PATH_IMAGE003
或是其盐，其中：R1为氢或C1-6脂族基团。
在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐为聚乙烯基磺酸或其盐。
在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐涉及聚茴香脑磺酸，并且具有以下通式(II)：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE004
或其盐，其中：
R1为氢或C1-6脂族基团；
R3为氢或C1-6烷基；和 
n为大于10的整数。
在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐具有以下通式(IIa)：
Figure 12003DEST_PATH_IMAGE005
或是其盐。
在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐为聚茴香脑磺酸或其盐。
在任何上述实施方案中，n可以为10至200、10至150、10至100、10至90、10至80、10至70、20至150、30至150、40至150、50至150、60至150、70至150、80至150、90至150、100至150、50至120、60至120、70至120、80至120、90至120等的整数。
在上述实施方案的任一个中，磺酸聚合物或其盐可以具有500至1,000 Da、1,000至2,000 Da、2,000至4,000 Da、3,000至5,000 Da、4,000至6,000 Da、5,000至7,000 Da、6,000至8,000 Da、7,000至9,000 Da、8,000至10,000 Da、2,000至10,000 Da、3,000至10,000 Da、4,000至10,000 Da、5,000至10,000 Da、6,000至10,000 Da、7,000至10,000 Da、2,000至9,000 Da、3,000至9,000 Da、4,000至9,000 Da、5,000至9,000 Da、6,000至9,000 Da、7,000至9,000 Da或8,000至9,000 Da的平均分子量。在一些实施方案中，平均分子量低于1,000 Da、低于2,000 Da、低于3,000 Da、低于4,000 Da、低于5,000 Da、低于6,000 Da、低于7,000 Da、低于8,000 Da、低于9,000 Da或低于10,000 Da。
如实施例中说明的，我们还发现较低分子量的磺酸聚合物表现比其它较高分子量阴离子聚合物更好。因此，在一些实施方案中，磺酸聚合物或其盐具有以下通式(III)：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE006
其中：
R1为氢或C1-6脂族基团；
R2为共价键、C1-6脂族基团、苯基或具有1-3个氮的6元杂芳基环，其中：
R2用1或2个-SO3H基团或其盐取代，条件是当R2为共价键时，仅存在1个-SO3H基团或其盐，以及 
R2任选用1-2个独立地选自-R3、卤素、-CN、-NO2、-OR3、-N(R3)2和-SR3的基团取代，其中各R3独立地为氢或C1-6烷基；和 
n使得磺酸聚合物或其盐具有低于10,000 Da的平均分子量。
在一些实施方案中，式(III)的磺酸聚合物或其盐具有500至1,000 Da、1,000至2,000 Da、2,000至4,000 Da、3,000至5,000 Da、4,000至6,000 Da、5,000至7,000 Da、6,000至8,000 Da、7,000至9,000 Da、8,000至10,000 Da、2,000至10,000 Da、3,000至10,000 Da、4,000至10,000 Da、5,000至10,000 Da、6,000至10,000 Da、7,000至10,000 Da、2,000至9,000 Da、3,000至9,000 Da、4,000至9,000 Da、5,000至9,000 Da、6,000至9,000 Da、7,000至9,000 Da或8,000至9,000 Da的平均分子量。在一些实施方案中，平均分子量低于1,000 Da、低于2,000 Da、低于3,000 Da、低于4,000 Da、低于5,000 Da、低于6,000 Da、低于7,000 Da、低于8,000 Da、低于9,000 Da或低于10,000 Da。
在一些实施方案中，通式(III)中的n可以为10至200、10至150、10至100、10至90、10至80、10至70、20至150、30至150、40至150、50至150、60至150、70至150、80至150、90至150、100至150、50至120、60至120、70至120、80至120、90至120等的整数。
如实施例中论述的，我们已经发现杂交缓冲剂中磺酸聚合物的浓度可以影响分析中核酸的杂交程度。在一些实施方案中，杂交缓冲剂中聚合物的浓度为0.1至20容重%、0.2至15容重%、0.2至10容重%、0.2至9容重%、0.2至8容重%、0.2至7容重%、0.2至6容重%、0.2至6容重%、0.5至5容重%、1至5容重%、1至4容重%、0.5至4容重%、0.5至3容重%或1至2.5容重%。
杂交条件
在另一个方面，本公开内容提供改进的杂交条件(杂交体积减少、盐浓度增加和/或探针浓度增加)，所述改进的杂交条件在分析中的核酸之间提供增加的杂交反应速率。通常，应理解可以组合这些改进的杂交条件的任何一个，以实现分析的杂交时间减少(例如盐浓度增加和探针浓度增加，盐浓度增加和杂交体积减少，探针浓度增加和杂交体积减少，或盐浓度增加、探针浓度增加和杂交体积减少)。通常，还应理解前述磺酸聚合物的任一种可以与这些改进的杂交条件的任一个结合，以实现分析的杂交时间减少。
在一些实施方案中，改进的杂交条件用于包括以下的分析步骤：(a) CE和LE探针杂交至目标核酸和(b) CE探针(作为CE探针-目标核酸-LE探针复合物的一部分)杂交至固相捕获探针。在一些实施方案中，改进的杂交条件用于分析的其它步骤，例如检测步骤。
盐浓度
当LE和CE探针在本公开内容的磺酸聚合物存在下与目标核酸接触时，则可以宽范围的盐浓度。例如，在一些实施方案中，杂交条件可以包括100 mM至2 M、100 mM至1.5 M、100 mM至1 M、100 mM至750 mM等盐浓度。
如实施例中论述的，我们也已经发现即使在没有磺酸聚合物的情况下，可以通过增加盐浓度(任选与如在此描述的增加探针浓度和/或减少杂交体积组合)，显著缩短培养时间。因此在一些其中可以存在或不存在磺酸聚合物的实施方案中，杂交条件可以包括350 mM至2 M、350 mM至1.5 M、350 mM至1 M、350 mM至750 mM、350 mM至650 mM、450 mM至2 M、450 mM至1.5 M、450 mM至1 M、450 mM至750 mM、450 mM至650 mM、550 mM至2 M、550 mM至1.5 M、550 mM至1 M、550 mM至750 mM、550 mM至650 mM等盐浓度。
在一些实施方案中，分析中使用的盐选自LiCl、NaCl、KCl或CaCl2。在一些实施方案中，盐为LiCl。在一些实施方案中，盐浓度为500至700 mM。
探针浓度
当LE和CE探针在本公开内容的磺酸聚合物存在下与目标核酸接触时，则可以使用宽范围的探针浓度。例如，在一些实施方案中，LE和/或CE探针浓度可以独立地为0.1 nM至100 nM、0.3 nM至100 nM、0.5 nM至100 nM、0.7 nM至100 nM、1 nM至100 nM、1.5 nM至100 nM、2 nM至100 nM、5 nM至100 nM、10 nM至100 nM、25 nM至100 nM、50 nM至100 nM、0.1 nM至10 nM、0.3 nM至10 nM、0.5 nM至10 nM、0.7 nM至10 nM、1 nM至10 nM、1.5 nM至10 nM、2 nM至10 nM、5 nM至10 nM、0.1 nM至5 nM、0.3 nM至5 nM、0.5 nM至5 nM、0.7 nM至5 nM、1 nM至5 nM、1.5 nM至5 nM、2 nM至5 nM等。
如实施例中论述的，我们也已经发现即使在没有磺酸聚合物的情况下，可以通过增加探针浓度(任选与如在此描述的增加盐浓度和/或减少杂交体积组合)，显著缩短培养时间。因此在一些其中可以存在或不存在磺酸聚合物的实施方案中，杂交条件可以包括如下浓度的LE和/或CE探针：1 nM至100 nM、1.3 nM至100 nM、1.5 nM至100 nM、1.7 nM至100 nM、2 nM至100 nM、2.5 nM至100 nM、3 nM至100 nM、5 nM至100 nM、10 nM至100 nM、25 nM至100 nM、50 nM至100 nM、1 nM至50 nM、1.3 nM至50 nM、1.5 nM至50 nM、1.7 nM至50 nM、2 nM至50 nM、2.5 nM至50 nM、3 nM至50 nM、5 nM至50 nM、10 nM至50 nM、25 nM至50 nM、1 nM至25 nM、1.3 nM至25 nM、1.5 nM至25 nM、1.7 nM至25 nM、2 nM至25 nM、2.5 nM至25 nM、3 nM至25 nM、5 nM至25 nM、10 nM至25 nM、25 nM至25 nM、1 nM至10 nM、1.3 nM至10 nM、1.5 nM至10 nM、1.7 nM至10 nM、2 nM至10 nM、2.5 nM至10 nM、3 nM至10 nM、5 nM至10 nM、1 nM至5 nM、1.3 nM至5 nM、1.5 nM至5 nM、1.7 nM至5 nM、2 nM至5 nM、2.5 nM至5 nM、3 nM至5 nM等。
在一些实施方案中，CE和LE探针的浓度不同。在一些实施方案中，CE和LE探针的浓度相同。在一些实施方案中，CE和/或LE探针浓度为1.5至2.5 nM。
体积
当LE和CE探针在本公开内容的磺酸聚合物存在下与目标核酸接触时，则可以使用宽范围的杂交体积(即使用的溶液的体积)。例如，在一些实施方案中，杂交条件可以包括10 uL至1000 uL、20 uL至1000 uL、30 uL至1000 uL、40 uL至1000 uL、50 uL至1000 uL、60 uL至1000 uL、70 uL至1000 uL、80 uL至1000 uL、90 uL至1000 uL、100 uL至1000 uL、250 uL至1000 uL、500 uL至1000 uL、750 uL至1000 uL、10 uL至250 uL、20 uL至250 uL、30 uL至250 uL、40 uL至250 uL、50 uL至250 uL、60 uL至250 uL、70 uL至250 uL、80 uL至250 uL、90 uL至250 uL、100 uL至250 uL、500 uL至1000 uL、750 uL至1000 uL等杂交体积。
如实施例中论述的，我们也已经发现即使在没有磺酸聚合物的情况下，可以通过降低杂交体积(任选与如在此描述的增加盐浓度和/或增加探针浓度组合)，显著缩短培养时间。因此在一些其中可以存在或不存在磺酸聚合物的实施方案中，杂交条件可以包括低于100 uL、95 uL、90 uL、85 uL、80 uL、75 uL、70 uL、65 uL、60 uL、55 uL、50 uL、45 uL、40 uL、35 uL、30 uL、25 uL、20 uL或10 uL的杂交体积。在一些实施方案中，杂交体积为至少80 uL、70 uL、60 uL、50 uL、40 uL、30 uL、20 uL或10 uL。在一些实施方案中，杂交体积为10至100 uL、20至100 uL、30至100 uL、40至100 uL、50至100 uL、60至100 uL、70至100 uL、80至100 uL、90至100 uL、10至90 uL、20至90 uL、30至90 uL、40至90 uL、50至90 uL、60至90 uL、70至90 uL、80至90 uL、10至50 uL、20至50 uL、30至50 uL、40至50 uL等。在一些实施方案中，杂交体积为40至60 uL。
组合
如上所述，应理解本公开内容包括上述变量范围的各个和每个组合。因此任何一个公开的盐浓度范围可以与任何一个探针浓度范围组合。类似地，任何一个盐浓度范围可以与任何一个杂交体积范围组合；任何一个探针浓度范围可以与任何一个杂交体积范围组合。最后，任何一个盐浓度范围、探针浓度范围和杂交体积范围可以组合。
举例来说和没有限制地，该本公开内容包括以下组合，例如：
(1) 500至700 mM的盐浓度，连同1.5至2.5 nM的CE和/或LE探针浓度；
(2) 500至700 mM的盐浓度，连同40至60 uL的杂交体积；
(3) 1.5至2.5 nM的CE和/或LE探针浓度，连同40至60 uL的杂交体积；和
(4) 500至700 mM的盐浓度，连同1.5至2.5 nM的CE和/或LE探针浓度和40至60 uL的杂交体积。
还应理解这些组合条件可以与任何本公开内容的磺酸聚合物(或其盐)组合使用。
实施例
实施例1
本实施例描述我们进行的实验，以便研究Siemens HIV bDNA RNA 3.0分析的目标核酸捕获步骤中使用的不同组分的影响。为了检验扩散对杂交速率的作用，我们进行实验，其中标准反应体积减半(100 ul至50 ul)。为了检验探针浓度的作用，我们进行实验，其中标记扩展物(LE)探针(1.2 nM)和捕获扩展物(CE)探针(0.9 nM)的标准浓度各自加倍。最后，为了研究各组分在工作杂交缓冲剂中的作用(即盐、缓冲剂、洗涤剂等)，我们将其浓度由其标准值加倍(盐：317 mM LiCl，缓冲剂：21 mM HEPES钠盐，21 mM HEPES游离酸，洗涤剂：4.23%月桂基硫酸锂盐，其它：7.6 mM EDTA和0.169%酪蛋白)。
测试的第一个条件为对照条件，包括100 uL标准工作杂交缓冲剂(WHB)，补充以标准浓度的LE和CE探针(以下表1中的1x WHB/1x探针(100 uL))。控制反应与反应体积减半(50 uL)和LE和CE探针浓度增加到两倍(表1中的1x WHB/2x探针(50 uL))进行比较。另外，在其中50 uL反应中工作杂交缓冲剂组分的浓度增加到两倍(表1中的2x WHB/2x探针(50 uL))的条件下，研究杂交的速率。仅1.5小时培养时间之后，使用未处理的光单位(RLU)信号测量各分析中核苷酸杂交的程度。
表1：
Figure 397854DEST_PATH_IMAGE007
如表1所示，当与对照条件相比，反应体积降低至50 uL和LE和CE探针浓度增加到两倍(即1x WHB/2x探针(50 uL)对比1x WHB/1x探针(100 uL))时，观察到未处理的光单位(RLU)信号增加～15%。另外，与对照杂交反应相比(即2x WHB/2x探针(50 uL)对比1x WHB/1x探针(100 uL))，WHB组分浓度增加到两倍导致RLU信号增加～150%。这些结果暗示降低杂交反应的体积，组合LE和CE探针浓度增加到两倍和/或WHB组分浓度增加，使分析中的杂交速率增加。
实施例2
在该实施例中，我们研究与标准反应条件相比，来自实施例1的优选杂交条件(即2x WHB/2x探针(50 uL))的杂交速率如何。进行三个实验，通过在特殊时间点测量的未处理光单位(RLU)信号的数值量化核苷酸杂交速率的变化。
首先根据标准条件，在三和十六小时时间点测量RLU信号(分别为以下表2中的1x WHB/1x探针(100 uL)-3小时，和1x WHB/1x探针(100 uL)-16小时)。接下来，在三小时时间点，根据来自实施例1的优选杂交条件测量RLU信号(表2中的2x WHB/2x探针(50 uL)-3小时)。
表2：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE008
如表2所示，十六小时培养(即一夜)之后标准条件的RLU信号是三小时时间点处RLU信号的两倍。有趣地，来自实施例1的优选杂交条件(2x WHB/2x探针(50 uL))导致仅三小时培养之后几乎相同的RLU信号(参见表2)。这些数据暗示使用来自实施例1的优选杂交条件，仅三小时就可以达到标准杂交条件下十六小时之后达到的平衡。这些结果暗示LE和CE探针浓度增加到两倍，连同反应体积减少到二分之一，以及工作杂交缓冲剂(WHB)的各组分的浓度增加到两倍可用于显著缩短该分析所需的培养时间。
实施例3
为了确定2x工作杂交缓冲剂(WHB)的不同组分如何影响分析中的杂交，我们比较两个杂交条件。首先，我们使用来自实施例1的优选杂交条件(以下表3中的2x WHB/2x探针(50 uL))。其次，我们将2x WHB中的盐浓度减少一半(即我们使用表3中的标准盐浓度，2x WHB，以及1x盐/ 2x探针(50 uL))。在降低的盐条件中，从2x减少至1x的2x WHB的唯一组分为盐(即LiCl)。三小时之后，使用未处理的光单位(RLU)信号量化两种条件下的核苷酸杂交量。对于两种不同的目标核酸水平重复实验(75,000拷贝/mL和1,000拷贝/mL)。
表3：
Figure 4416DEST_PATH_IMAGE009
如表3所示，当盐浓度减半时，当分别测试1,000和75,000拷贝/mL的目标核酸时，RLU存在～12%和～49%减少。这些结果暗示工作杂交缓冲剂中的盐浓度变化对杂交速率具有显著的影响。
实施例4
除了研究体积、探针浓度和WHB组分浓度的作用之外，我们还研究向用于制备目标核酸试样的裂解(lysis)稀释剂中添加某些阴离子聚合物的影响。传统上，Siemens HIV bDNA RNA 3.0分析中使用的裂解稀释剂包含低于1% w/v的不带电烃聚合物，羟乙基淀粉(亦称Hespan)，其起体积排阻试剂(volume exclusion agent)的作用。体积排阻试剂已经报告提高核酸杂交的速率(例如参见US 专利号4,302,204和5,853,986)。在我们的实验中，我们用不同的阴离子聚合物替代裂解稀释剂中的羟乙基淀粉，并测量三小时培养期之后的未处理的光单位(RLU)信号(使用标准WHB和LE/CE探针浓度)。裂解稀释剂中测试的阴离子聚合物包括1% w/v的聚乙烯基磺酸(Sigma # 278424-5ML，平均分子量为3,000至10,000 Da)，1% w/v的聚茴香脑磺酸 (Sigma # 444464-5G，平均分子量为9,000至11,000 Da)，和1% w/v的高分子量聚丙烯酸(Sigma # 523925-100ML，平均分子量为～100,000 Da)。对于两种不同的目标核酸水平重复实验(75,000拷贝/mL和10,000拷贝/mL)。CV为RLU平均值的偏差的统计量度。
表4：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE010
用低分子量聚磺酸聚合物聚乙烯基磺酸和聚茴香脑磺酸替代羟乙基淀粉对三小时培养时间之后的RLU信号具有积极影响。值得注意地，用更高分子量聚丙烯酸替代羟乙基淀粉不具有相同的作用。与具有羟乙基淀粉的标准裂解稀释剂相比，聚乙烯基磺酸显示最强的作用，RLU增加～32-45%。
实施例5
本实施例描述确定阴离子聚合物(包括实施例4的那些)对Siemens HCV 3.0 bDNA分析中的杂交方法是否具有积极影响的实验。同样，用1% w/v的不同阴离子聚合物替代标准裂解稀释剂中的羟乙基淀粉。这次我们使用三种不同的聚磺酸聚合物，即：实施例4的聚乙烯基磺酸和聚茴香脑磺酸和高分子量聚苯乙烯磺酸(Sigma # 561223-100G，平均分子量为～75,000 Da)。三小时之后，使用未处理的光单位(RLU)信号测量这些分析中的核苷酸杂交。
表5：
Figure 997780DEST_PATH_IMAGE011
如表4所示，虽然磺酸聚合物导致信号增大，但是与实施例4中的HIV分析相比，其稍微降低。同样值得注意的是低分子量聚乙烯基磺酸和聚茴香脑磺酸优于高分子量聚苯乙烯磺酸。结果同样与实施例4的结果一致，也即向裂解稀释剂中添加聚乙烯基磺酸有助于RLU的最大增加。
实施例6
本实施例描述确定裂解稀释剂中使用的阴离子聚合物的量是否影响Siemens HCV 3.0 bDNA分析中的杂交方法的实验。用聚乙烯基磺酸或聚茴香脑磺酸以1%或0.5% w/v的百分比配制裂解稀释剂。三小时之后，使用未处理的光单位(RLU)信号测量核苷酸杂交。RLU信号与使用具有羟乙基淀粉的标准裂解作用稀释剂的对照分析的那些进行比较。
表6：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE012
如凭RLU信号测量的，1%或0.5% w/v的阴离子聚合物具有积极影响。与实施例4的结果一致，添加聚乙烯基磺酸有助于RLU的最大增加。另外，与用0.5%相应聚合物进行的分析相比，用1% w/v聚乙烯基磺酸或聚茴香脑磺酸进行的分析显示RLU信号增加较大。
实施例7
前述实施例已经确定聚乙烯基磺酸(PVSA)为减少培养时间的优选阴离子聚合物。在本实验中，我们使用Siemens HIV bDNA RNA 3.0分析，以及三小时培养时间，测试一定范围的PVSA浓度(2.5、1.0和0.5% w/v)。将RLU信号与使用具有羟乙基淀粉的标准裂解稀释剂的对照分析的那些进行比较。
表7：
Figure 939060DEST_PATH_IMAGE013
用0.5、1.0和2.5% w/v PVSA配制的裂解稀释剂进行的分析各自显示RLU信号增加。另外，本实验的结果暗示如RLU信号测量的杂交速率增加与加入到裂解稀释剂中的PVSA量有关。
实施例8
在最后的一系列实验中，我们着手确定前述实施例中观察到的不同影响是否可以组合(即减少体积、提高探针浓度、提高WHB盐浓度和添加例如PVSA聚合物的阴离子聚合物的影响)。
我们首先研究添加1.25% PVSA是否可以进一步增加用来自实施例1的优选杂交条件(即2x WHB/2x探针(50 uL))观察到的RLU。测试两小时培养时间。利用1x工作杂交缓冲剂的标准100 uL反应用作对照(1x WHB/1x探针(100 uL))。使用Siemens HIV bDNA RNA 3.0分析测试这些条件。
表8：
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE014
如表8所示，观察到RLU信号比来自使用2x WHB/2x探针(50 uL)的分析的RLU信号增加～25%。这一数据支持着添加例如PVSA的阴离子聚合物可以进一步增加分析中的杂交速率。
表9、10、11和12显示我们使用各种培养时间进行的其它实验的结果。这些实验的结果通常与表8成为结果一致。
Figure 613755DEST_PATH_IMAGE015
Figure 200980151016X100002DEST_PATH_IMAGE016
其它实施方案
本发明的其它实施方案对于考虑在此公开的本发明说明书或实践的本领域技术人员而言将是显而易见的。希望说明书和实施例被认为仅是示例性的，本发明的实际范围和精神通过以下权利要求书指明。

Claims (39)

1.用于检测包括第一和第二核酸序列的目标核酸的溶液核酸杂交分析方法，包括：
(a) 在杂交条件下使目标核酸接触磺酸聚合物或其盐以及过量的(i)包括第一和第二区段的标记扩展物探针，其中第一区段与目标核酸的第一核酸序列互补和(ii)包括第一和第二区段的捕获扩展物探针，其中第一区段与目标核酸的第二核酸序列互补；
(b) 在杂交条件下使步骤(a)的产物与结合至与所述捕获扩展物探针的第二区段互补的固相的捕获探针接触；
(c) 去除未结合至该固相的材料；
(d) 在杂交条件下使步骤(c)的固相复合产物接触核酸多聚体，所述核酸多聚体包括(i)与标记扩展物探针的第二区段互补的预扩增探针和(ii)许多扩增探针；
(e) 去除未结合的核酸多聚体；
(f) 在杂交条件下使步骤(e)的固相复合产物接触与该核酸多聚体的扩增探针互补的标记的低聚核苷酸；
(g) 去除未结合的标记的低聚核苷酸；和
(h) 检测步骤(g)的固相复合产物中标记的低聚核苷酸的存在，其中步骤(a)中的磺酸聚合物或其盐具有通式(I)或(II)：
或是其盐，其中：
R1为氢或C1-6脂族基团；
L为共价键或C1-6亚烷基；
R3为氢或C1-6烷基；和 
n为大于10的整数。
2.权利要求1的分析方法，其中所述许多扩增探针杂交至该核酸多聚体的第一预扩增探针。
3.权利要求1的分析方法，其中所述许多扩增探针以共价键连接到所述核酸多聚体的所述预扩增探针。
4.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有通式(I)。
5.权利要求4的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有通式(Ia)：
Figure 981727DEST_PATH_IMAGE002
或是其盐。
6.权利要求4的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚乙烯基磺酸或其盐。
7.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有通式(II)。
8.权利要求7的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有通式(IIa)：
Figure 761464DEST_PATH_IMAGE003
或是其盐。
9.权利要求7的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚茴香脑磺酸或其盐。
10.权利要求1的分析方法，其中n为10至200的整数。
11.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于10,000 Da的平均分子量。
12.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于8,000 Da的平均分子量。
13.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于6,000 Da的平均分子量。
14.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于4,000 Da的平均分子量。
15.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以0.2至10容重%的浓度存在。
16.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以0.5至5容重%的浓度存在。
17.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以1至2.5容重%的浓度存在。
18.权利要求1的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于10,000 Da的平均分子量并以0.2至10容重%的浓度存在。
19.权利要求1的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的杂交条件包括500至700 mM的盐浓度。
20.权利要求1的分析方法，其中步骤(a)中的标记扩展物探针和/或捕获扩展物探针浓度为1.5至2.5 nM。
21.权利要求1的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的杂交条件包括40至60 uL的杂交体积。
22.权利要求1的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的杂交条件包括500至700 mM的盐浓度和40至60 uL的杂交体积；和步骤(a)中的标记扩展物探针和/或捕获扩展物探针浓度为1.5至2.5 nM。
23.权利要求22的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于10,000 Da的平均分子量并以0.2至10容重%的浓度存在。
24.权利要求23的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚乙烯基磺酸或其盐。
25.权利要求23的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚茴香脑磺酸或其盐。
26.用于检测包括第一和第二核酸序列的目标核酸的溶液核酸杂交分析方法，包括：
(a) 在杂交条件下使该目标核酸接触磺酸聚合物或其盐以及过量的(i)包括第一和第二区段的标记扩展物探针，其中第一区段与该目标核酸的第一核酸序列互补和(ii)包括第一和第二区段的捕获扩展物探针，其中第一区段与所述目标核酸的第二核酸序列互补；
(b) 在杂交条件下使步骤(a)的产物与结合至与所述捕获扩展物探针的第二区段互补的固相的捕获探针接触；
(c) 去除未结合至所述固相的材料；
(d) 在杂交条件下使步骤(c)的固相复合产物接触核酸多聚体，所述核酸多聚体包括(i)与所述标记扩展物探针的第二区段互补的预扩增探针和(ii)许多扩增探针；
(e) 去除未结合的核酸多聚体；
(f) 在杂交条件下使步骤(e)的固相复合产物接触与核酸多聚体的扩增探针互补的标记的低聚核苷酸；
(g) 去除未结合的标记的低聚核苷酸；和
(h) 检测步骤(g)的固相复合产物中的标记的低聚核苷酸的存在，
其中步骤(a)中的磺酸聚合物或其盐具有通式(III)：
Figure 218991DEST_PATH_IMAGE004
其中：
R1为氢或C1-6脂族基团；
R2为共价键、C1-6脂族基团、苯基或具有1-3个氮的6元杂芳基环，其中：
R2用1或2个-SO3H基团或其盐取代，条件是当R2为共价键时，仅存在1个-SO3H基团或其盐，以及
R2任选用1-2个独立地选自-R3、卤素、-CN、-NO2、-OR3、-N(R3)2和-SR3的基团取代，其中各R3独立地为氢或C1-6烷基；和 
n使得所述磺酸聚合物或其盐具有低于10,000 Da的平均分子量。
27.权利要求26的分析方法，其中n为10至200的整数。
28.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于8,000 Da的平均分子量。
29.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于6,000 Da的平均分子量。
30.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐具有低于4,000 Da的平均分子量。
31.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以0.2至10容重%的浓度存在。
32.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以0.5至5容重%的浓度存在。
33.权利要求26的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐以1至2.5容重%的浓度存在。
34.权利要求26的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的杂交条件包括500至700 mM的盐浓度。
35.权利要求26的分析方法，其中步骤(a)中的所述标记扩展物探针和/或捕获扩展物探针浓度为1.5至2.5 nM。
36.权利要求26的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的所述杂交条件包括40至60 uL的杂交体积。
37.权利要求26的分析方法，其中步骤(a)和(b)中的所述杂交条件包括500至700 mM的盐浓度和40至60 uL的杂交体积；和步骤(a)中的所述标记扩展物探针和/或捕获扩展物探针浓度为1.5至2.5 nM。
38.权利要求37的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚乙烯基磺酸或其盐。
39.权利要求37的分析方法，其中所述磺酸聚合物或其盐为聚茴香脑磺酸或其盐。
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