CZ58997A3 - Reduction of non-specific hybridization by making use of novel base matching schemes - Google Patents

Reduction of non-specific hybridization by making use of novel base matching schemes Download PDF

Info

Publication number
CZ58997A3
CZ58997A3 CZ97589A CZ58997A CZ58997A3 CZ 58997 A3 CZ58997 A3 CZ 58997A3 CZ 97589 A CZ97589 A CZ 97589A CZ 58997 A CZ58997 A CZ 58997A CZ 58997 A3 CZ58997 A3 CZ 58997A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleotide
oligonucleotide
base
nucleic acid
analyte
Prior art date
Application number
CZ97589A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark L Collins
Thomas Horn
Patrick E Sheridan
Brian D Warner
Michael S Urdea
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of CZ58997A3 publication Critical patent/CZ58997A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • User Interface Of Digital Computer (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se obecně týká chemie nukleových kyselin a testů hybridizace. Tento vynález se obzvláště týká způsobů vytváření signálu závislého na cílovém místě při testech hybridizace, snížením šumivého pozadí odvozeného především z nespecifické hybridizace. Vynález je možné také aplikovat při vývoji antimediátorových a aptamérových terapeutických prostředků a léčiv.
Dosavadní stav techniky
Testy hybridizace nukleové kyseliny se obecně používají v genetickém výzkumu, biologickém výzkumu v medicíně a v klinických diagnostických prostředcích. Při testu hybridizace základní nukleové kyseliny se jednořetězcový analyt nukleové kyseliny hybridizuje k značené nukleotidové sondě jednořetězcové nukleové kyseliny a stanoví se výsledné značené dvoušroubovice. Byly vyvinuty variace tohoto základního schématu, aby se zvýšila přesnost a usnadnilo dělení dvoušroubovic určených k detekci ze zevních materiálů a/nebo zesílil signál, který se má detekčně stanovit.
Tento vynález je zaměřen na způsob snížení šumivého pozadí, se kterým se setkáváme při libovolném testu hybridizace nukleové kyseliny. Obecné šumivé pozadí, které se určuje způsobem nyní popsaného technického postupu, vyplývá z nežádoucí interakce různých polynukleotidových komponent, které se používají při daném testu, to znamená z interakce, která zvyšuje signál, který nekoresponduje s přítomností nebo množstvím analytu. Vynález je vhodný se spojení s jakýmkoli počtem testovacích formátů, ve kterých se provádějí násobné hybridizačni stupně k přípravě detekovatelného signálu, který je v korelaci s přítomností nebo množstvím polynukleotidového analytu.
Jeden takový test je podrobně popsán v US patentu č.
868 105, původce Urdea a kol., postoupeném k obecnému použití, jehož obsah se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky. Tento test spočívá v použití dvojdílného zachycovacího systému, určeného k vázání polynukleotidového analytu k tuhému základu a dvojdílného značícího systému k vázání detekovatelného značení k polynukleotidovému analytu, který se má detekčně stanovit nebo u kterého se má stanovit jeho množství. Dvoudílný zachycovací systém zahrnuje použití zachycovací sondy vázané na tuhý základ a zachycení extenderových molekul, které hybridizují k segmentu zachycovacích nukleotidových sond a k segmentu polynukleotidového analytu. Dvoudílný značící systém zahrnuje použití značených extenderových molekul, které hybridizují k segmentu polynukleotidového analytu, a značených nukleotidových sond, které hybridizují k značeným extendérovým molekulám a obsahují nebo se váží k detekovatelnému značení. Výhodou takového systému je, že se musí provést větší počet hybridizačních stupňů pro značení určené k detekci způsobem, který je v korelaci s přítomností analytu, pokud musí nastat dvě odlišné hybridizační reakce pro zachycovaní analytu a podobně musí nastat dvě odlišné reakce pro značení analytu. Zbývá zde však řada cest, kterými se může vytvářet detekovatelný signál, které nekorespondují s přítomností nebo množstvím analytu a které budou dále rozebrány podrobně.
Jiný příklad testu, který je podle tohoto vynálezu vhodný, spočívá v metodě zesílení signálu, která je popsána v US patentu č. 5 124 246, původce Urdea a kol., postoupeném k obecnému použití, jehož obsah se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky. Při této metodě se signál zesiluje použitím amplifikátorových multimérů, polynukleotidů, které jsou konstruovány tak, že obsahují první segment, který hybridizuje specificky k značeným extendérům, a větší počet identických sekundárních segmentů, které hybridizují specificky k značené nukleotidové sondě. Stupeň zesílení je teoreticky proporcionální k počtu opakujících se druhých segmentů. Multiméry mohou být bud' přímé nebo rozvětvené. Rozvětvené multiméry mohou být ve tvaru vidličky nebo hřebene, přičemž multiméry typu hřebene jsou výhodné.
Jeden přístup k vyřešení problém překážejících signálů šumivého pozadí při testech hybridizace nukleové kyseliny je popsán v publikaci PCT č. WO 995/16055, postoupené k obecnému použití, kde alespoň dva zachycovací extendéry a/nebo alespoň dva značené extendéry musí se vázat k analytu, aby se spustil detekovatelný signál. Pro další snížení šumivého pozadí se test provádí za podmínek, které dávají přednost tvorbě multikomponetních komplexů.
Jiný přístup, který je navržen ke zvýšení cílové závislosti signálu při testu hybridizace, je popsán v evropské patentové publikaci č. 70 685, původce Heller a kol.
Tento literární odkaz popisuje homogenní test hybridizace, při kterém probíhá neradioaktivní přenos energie mezi proximálními nukleotidovými sondami, přičemž musí nastat dva odlišné případy, aby se vytvořil cílově generovaný signál, ke zvýšení přesnosti detekce.
Tento vynález je také určen ke zvýšení přesnosti detekce a ke stanovení množství polynukleotidových analytů při testu hybridizace. Vynález zvyšuje jak citlivost, tak specifičnost takových testů, snížením výskytu vytváření signálu, který nastává v nepřítomnosti cílové oblasti a nezahrnuje zvýšení buď spotřeby času nebo nákladů vzhledem k současně používaným uspořádáním testů.
Cíle tohoto vynálezu, kterým je snížení šumivého pozadí, zvýšení přesnosti detekce a určení množství analytů při testech hybridizace nukleové kyseliny, se z části dosáhné použitím nukleosidových variant, které tvoří páry bází v důsledku nepřirozených vzorů vázání vodíku. Pokud se zde používá výrazu nepřirozený pár bází, jde o pár vzniklý mezi nukleotidovými jednotkami odlišnými od adenosinu (A), thymidinu (T), cytidinu (C), guanosinu (G) nebo uridinu (U). Jeden takový nepřirozený pár bází se tvoří mezi isocytosinem (isoC) a isoguaninem (isoG). IsoC a isoG mohou tvořit pár bází s normalizovanou geometrií (například Watson-Crikův pár bází), ale zahrnutí vodíkové vazby odlišné od vazby, která zahrnuje vázání cytosinu (C) ke guaninu (G), jak ukazují vzorce
οΗ isoC isoG
Leach a kol. v J. Am. Chem. Soc., 114, 3675-3683 (1992) aplikuje výpočty molekulární mechaniky, molekulární dynamiky a poruch volné energie na studii struktury a stability isoC*isoG páru bází. Tor a kol. v J. Am. Chem. Soc., 115. 4461-4467 (1993) popisuje způsob, při kterém modifikovaný isoC v DNA matici bude zaměřen na inkorporaci isoG analogu do transkribovaného RNA produktu. Switzer a kol v Biochemistry, 32. 10489-10496 (1993) studuje podmínky, za kterých vytvořený pár bází mezi isoC a isoG může být inkorpo rován do DNA a RNA pomocí DNA a RNA polymeráz.
Zavedení nového páru bází do DNA oligomerů nabízí možnost, která dovoluje přesnější řízení hybridizace.
Podstata vynálezu
Tento vynález skýtá způsoby a soupravy pro detekci analytů nukleových kyselin ve vzorku. Obecně způsob představuje zlepšení testů hybridizace nukleové kyseliny, jako in šitu hybridizačních testů a Southernova přenosu, northernového přenosu, tečkového přenosu a reakčních testů polymerázového řetězce. Zvláště způsoby představují zlepšení sendvičových testů hybridizace v roztokové fázi, které spočívá ve vázání analytu k tuhému základu, značení analytu a detekci přítomnosti značení na základu. Výhodné metody zahrnují použití zesílených multimérů, které dovolují vázání signifikantně většího značení v komplexu analyt-nukleotidová sonda, co zvyšuje citlivost a specifičnost testu.
Z prvního hlediska vynálezu se dostává test, při kterém se alespoň jedna nukleotidová jednotka, která je schopna tvořit páry bází a která je odlišná od adenosinú (A), thymidinu (T), cytidinu (C), guanosinu (G) nebo uridinu (U), inkorporuje do necílových hybridizujících oligonukleotidových segmentů, to znamená univerzálních segmentů komponent pro test hybridizace nukleové kyseliny. Toto použití takových nukleotidových jednotek zvyšuje jedinečnost schémat párů bází jehož výsledkem je zvýšení specifičnosti vázání mezi univerzálními segmenty.
V souvisejícím aspektu vynález poskytuje test, při kterém se alespoň jedna první nukleotidová jednotka odlišná od A, T, C, G a U, schopná vytvářet pár bází, s druhou nukleotidovou jednotkou, která je odlišná od A, T, C, G a U, inkorporuje do segmentů nukleové kyseliny testovaných komponent, které jsou komplementární k segmentům nukleové kyseliny přítomným v testovaných komponentách, které jsou odlišné od cílového analytu. Příklady párů bázích vytvořených mezi dvěma takovými nukleotidovými jednotkami jsou dány dále uvedenými strukturami, odpovídajícími obecným vzorcům I až IV
(I)
(III)
(IV) ve kterýchžto vzorcích
R představuje hlavní řetězec, které dovolí bázím vytvořit pár bází s komplementární nukleotidovou jednotkou, pokud se inkorporuje do polynukleotidu, a
R' znamená například atom vodíku, methyl, a- nebo β-propinyl, atom bromu, fluoru, jodu nebo podobně.
Inkorporaci takových nukleotidových jednotek do tak zvaných univerzálních sekvencí, to znamená sekvencí, které nejsou zahrnuty do hybridizace k cílovému analytu, se možnost nespecifické hybridizace velmi sníží. Při jednom výhodném provedení první a druhé nukleotidové jednotky navzájem zaměnitelně zahrnují isocytidin a isoguanidin, jak je znázorněno v obecném vzorci I.
Související znak tohoto vynálezu poskytuje test, při kterém teplota tání Tml komplexu vytvořeného mezi analytem a zachycujícími nukleotidovými sondami vázanými na nosič, zprostředkovanými alespoň jednou odlišnou zachycovací extendérovou molekulou a/nebo značenými extendéry a amplifikátory nebo preamplifikátory, je signifikantně nižší než je teplota tání Tm2 komplexu vytvořeného mezi značenými nukleotidovými sondami a amplifikátory. Z tohoto hlediska se test provádí za podmínek, které na počátku podporují tvorbu všech hybridních komplexů. Podmínky se potom mění v průběhu testu tak, jak se destabilizují Tml hybridní komplexy.
Vynález dodatkově zahrnuje způsob provádění testu hybridizace, při kterém se každý z výše uvedených technických postupů kombinuje, to znamená, při kterém se nukleotidová jednotka odlišná od A, T, G, C nebo U inkorporuje do univerzálních segmentů testovaných složek a při kterém teplota tání Tml hybridních komplexů je signifikantně nižší než teplota tání Tm2 hybridních komplexů.
Z dalšího hlediska vynález zahrnuje nový způsob syntézy isoguanosinu nebo 2'-deoxyisoguanosinu.
Konečně tento vynález zahrnuje soupravy obsahující reakčni prostředky, které je nezbytné k provádění testů zde popsaných a nárokovaných.
Přehled výkresů na obrázcích
Obr. 1 je diagramem roztokové fáze při sendvičovém testu hybridizace podle dosavadního stavu techniky, na kterém silné čáry ukazují univerzální sekvence.
Obr. 2 zobrazuje způsob vázání nukleotidových sond na dvojřetězcovou DNA, na kterém silné čáry ukazují univerzální řetězce.
Obr. 3 znázorňuje použití nukleotidových sond obsahujících nepřirozené nukleotidy a kompetimérů k blokování nespecifické hybridizace.
Dále se uvádí podrobný popis vynálezu.
Definice a nomenklatura, používané v popise tohoto vynálezu, mají blíže vysvětlený význam.
Předtím než tento vynález bude objasněn a popsán podrobně, je třeba vzít v úvahu, že tento vynález není omezen na zvláštní testovací formáty, materiály nebo prostředky, které se samozřejmě mohou měnit. Mělo by se také vzít v úvahu, že terminologie zde používaná slouží pouze pro účely popsaných zvláštních ztělesnění a nemá být pokládána za omezení tohoto vynálezu.
V popise a v patentových nárocích, které za popisem následují, se bude provádět odkaz na řadu pojmů, které je třeba definovat tak, že mají dále uvedené významy:
Pokud se zde používá výrazů polynukleotid nebo oligonukleotid, má jít genericky o polydeoxyribonukleotidy (které obsahují 2-deoxy-D-ribózu), polyribonukleotidy (které obsahují D-ribózu), některé jiné typy polynukleotidů, kterými jsou N- nebo C-glykosid purinové nebo pyrimidinové báze, a o jiné polymery, které obsahují nenukleotidový hlavní řetězec, jako například o polyamidy (například peptidové nukleové kyseliny [PNA]) a polymorfolinové polymery (které jsou komerčně dostupné u společnosti Anti-Virals, lne., Corvallis, Oregon, USA, jako Neugene™ polymery) a o jiné syntetické polymery na bázi nukleových kyselin se specifickými sekvencemi, za předpokladu, že polymery obsahují nukleobáze v konfiguraci, která dovoluje párování bází a staking bází, jako se nachází v DNA a RNA. Přitom se neuvažuje s žádnými rozdíly v délce mezi výrazy polynukleotid a oligonukleotid a tyto výrazy se budou používat navzájem zaměnitelně. Tyto výrazy se vztahují pouze k primární struktuře molekuly. Tak tyto výrazy zahrnují dvojřetězcovou nebo jednořetězcovou DNA, stejně jako dvouřetézcové a jednořetězcové RNA, DNA:RNA hybridy a hybridy mezi PNA a DNA nebo RNA, a také zahrnují známé typy modifikací, například dosahované značením, které je známo v oboru, methylací, čepičkami, substitucí alespoň jedním v přírodě se vyskytujícím nukleotidem s analogy, internukleotidové modifikace, jako například modifikace s nenabitými vazbami (například methylfosfonáty, fosfotriestery, fosforamidáty, karbamáty a podobně), se záporné nabitými vazbami (například fosforthioáty, fosfordithioáty a podobně) a s kladné nabitými vazbami (například aminoalkylfosforamidáty, aminoalkylfosfotriestery), látkami obsahujícími připojené části, jako například proteiny (včetně nukleáz, toxinů, protilátek, signálních peptidů, poly-L-lysinu a podobně), látek s interkalčními prostředky (například akridinem, psoralenem a podobně), látkami obsahujícími chelatační prostředky (například kovy, radioaktivními kovy, borem, oxidativními kovy a podobně), látkami obsahujícími alkylační prostředky, látkami modifikujícími vazby (například α-anomerními nukleovými kyselinami a podobně), stejné jako nemodifikovanými formami polynukleotidů nebo oligonukleotidů.
Je třeba vzít v úvahu, že výrazy nukleosid a nukleotid zahrnují takové skupiny, které obsahují nejen známé purinové a pyrimidinové báze, ale také jiné heterocyklické báze, které se modifikují. Takové modifikace zahrnují methylované puriny a pyrimidiny, acylované puriny a pyrimidiny nebo jiné heterocykly. Modifikovaní nukleosidy nebo neukleotidy budou také zahrnovat modifikace na cukrové části, například kde alespoň jedna hydroxyskupina je nahrazena atomem halogenu, alifatickými skupinami nebo je provedena funkcionalizace na estery, aminy nebo podobně.
Výraz nukletidová jednotka je míněn tak, že zahrnuje jak nukleosidy, tak nukleotidy.
Kromě toho modifikace nukleotidových skupin zahrnují přesmyk, připojení, náhradu nebo jinou změnu funkčních skupin na purinové nebo pyrimidinové bázi, která tvoří vodíkové vazby k příslušnému komplementárnímu pyrimidinu nebo purinu. Výsledná modifikovaná nukleotidová jednotka může tvořit pár bází s jinými takto modifikovanými nukleotidovými jednotkami, ale bez A, T, C, G nebo U. Standardní A-T a G-C páry bází se tvoří za takových podmínek, které dovolují vznik vodíkových vazeb mezi N3-H a C4-oxyskupinou thymidinu a N1- a C6-NH2 adenosinu a mezi C2-oxyskupinou, N3 a C4-NH2 cytidinu a C2-NH2, Ν1-!! a C6-oxyskupinou guanosinu. Tak například guanosin (2-amino-6-oxy-9-p-n-ribofuranosylpurin) se může modifikovat za vzniku isoguanosinu (2-oxy-6-amino-9-3~D-ribofuranosylpurinu). Taková modifikace působí v nukleosidové bázi, která nebude déle účinně tvořit standardní pár bází s cytosinem. Avšak modifikace cytosinu (Ι-β-D-ribofuranosyl12
-2-oxy-4-arainopyrimidinu) za vzniku isocytosinu (Ι-β-Dribofuranosyl-2-amino-4-oxypyrimidinu) působí v modifikovaném, nukleotidu, který nebude účinně párem bází s guanosinem, ale bude tvořit pár bází s isoguanosinem. Isocytosin je dostupný od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Isocytidin se může připravit způsobem, který popsal Switzer a kol., citováno výše (1993), na kteroužto citaci se zde odkazuje.
2'-Deoxy-5-methylisocytidin se může připravit způsobem, který popsal Tor a kol., citováno výše (1993), na kteroužto citaci se zde odkazuje. Isoguaninové nukleotidy se mohou připravit za použití způsobu, který popsal Switzer a kol., citováno výše, a Mantsch a kol., Biochem., 14, 5593-5601 (1993) nebo způsobem, který je podrobně popsán dále. Nepřirozené páry bází, znázorněné strukturou obecného vzorce II, vztahující se ke kappa a π, se mohou syntetizovat způsobem, který popsal Piccirilli a kol. v Nátuře, 343, 33-37 (1990) pro syntézu
2,6-diaminopyrimidinu a jeho komplementu (1-methylpyrazolo[4,3]-pyrimidin-5,7-(4H,6H)-dionu. Jiné takové modifikované nukleotidové jednotky, které tvoří jedinečné páry bází, popsal Learch a kol. v J. Am. Chem. Soc., 114, 3675-3683 (1992) a Switzer a kol., citováno výše, nebo budou zřejmé odborníkovi v oboru.
Výraz polynukleotidový analyt se vztahuje k jednořetězcové nebo dvouřetězcové molekule nukleové kyseliny, která obsahuje cílovou nukleotidovou sekvenci. Analyt nukleových kyselin může pocházet z rozmanitých zdrojů, například z biologických tekutin nebo tuhých látek, hmot tvořcich potraviny, materiálů pro životní prostředí a podobné a může se připravit pro hybridizační analýzu různými prostředky, například za použití proteinázy K/SDS, chaotropních solí nebo podobné. Výraz polynukleotidový analyt se zde používá navzájem zaměnitelně s výrazy analyt, analyt nukleové kyseliny a cílová oblast resp. cíl.
Pokud se zde používá výrazu cílová oblast nebo cílová nukleotidová sekvence, vztahuje se k nukleotidové sondě vázající oblasti obsažené v cílové molekule. Výraz cílová sekvence se vztahuje k sekvenci, se kterou nukleotidová sonda vytvoří stabilní hybrid za požadovaných podmínek.
Pokud se zde používá výrazu nukleotidová sonda, vztahuje se ke struktuře zahrnující polynukleotid, jak je vymezen výše, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny komplementární k sekvenci nukleové kyseliny přítomné v cílovém analytu. Polynukleotidové oblasti nukleotidové sondy mohou sestávat z DNA a/nebo RNA a/nebo syntetických nukleotidových analogů.
Bude zřejmé, že spojující sekvence nepotřebují mít dokonalou komplementaritu, aby poskytly stabilní hybridy.
V mnoha situacích budou vznikat stabilní hybridy, u kterých je méně než přibližně 10 % bází chybně párovaných, bez ohledu na smyčky ze čtyř nebo více nukleotidů. Proto pokud se zde používá výrazu komplementární, vztahuje se k oligonukleotidu, který tvoří stabilní dvoušroubovice se svým komplementem za testovacích podmínek, obecně kde je přibližně 90% nebo větší homologie.
Výrazy multimér nukleové kyseliny nebo arnplifikátorový multimér jsou zde používány ve vztahu k lineárnímu nebo rozvětvenému polymeru ze stejného opakujícího se jednořetězcového oligonukleotidového segmentu nebo z rozdílných jednořetézcových polynukleotidových segmentů, z nichž každý obsahuje oblast, kde se může vázat značená nukleotidová sonda, to znamená, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny komplementární k sekvenci nukleové kyseliny obsažené ve značené nukleotidové sondě, přičemž oligonukleotidové segmenty mohou sestávat z RNA, DNA, modifikovaných nukleotidů nebo jejich kombinací. Alespoň jeden ze segmentů má sekvenci, délku a složení, které dovoluje, aby se specificky vázal ke značené nukleotidové sondě. Dodatkově alespoň jeden ze segmentů má sekvenci, délku a složení, které dovoluje, aby se specificky vázal ke značenému extendéru nebo preamplifikátoru. Obvykle takové segmenty budou obsahovat přibližně 15 až 50, s výhodou 15 až 30 nukleotidů a budou obsahovat GC v rozmezí od přibližně 20 % do zhruba 80 %. Celkový počet oligonukleotidových segmentů v multiméru bude obvykle v rozmezí přibližně od 3 do 1000, běžněji v rozmezí přibližně od 10 do 100 a nejběžněji okolo 50. Oligonukleotidové segmenty multiméru mohou být kovalentně vázány přímo ke každému jinému segmentu fosfodiesterovými vazbami nebo vsunutými spojovacími prostředky, jako jsou můstky z nukleové kyseliny, aminokyseliny, uhlohydrátu nebo polyolu, nebo jinými zesilujícími prostředky, které jsou schopny zesítěného vázání nukleové kyseliny nebo modifikovaných řetězců nukleové kyseliny. Podle jiného provedení multimér může zahrnovat oligonukleotidové segmenty, které nejsou kovalentně připojeny, ale jsou vázány nějakým jiným způsobem, například hybridizaci. Takový multimér je popsán například v US patentu č. 5 175 270, původce Nilsen a kol. Místo (místa) vazby mohou být na konci segmentu (bud v normální, 3',5' orientaci nebo v nahodilé orientaci) a/nebo na jednom nebo větším počtu vnitřních nukleotidů v řetězci. V lineárních multimérech jednotlivé segmenty jsou vázány koncem na konec za vzniku lineárního polymeru. V jednom typu rozvětveného multiméru tři nebo více oligonukleotidových segmentů emanuje z místa původu za vzniku rozvětvené struktury. Místem původu může být jiný nukleotidový segment nebo vícefunkční molekula, ke které mohou být alespoň tři segmenty kovalentně vázány. U jiného typu je hlavní řetězec oligonukleotidového segmentu s alespoň jedním zavěšeným oligonukleotidovým segmentem. Tento typ multiméru má strukturu podobnou vidličce, podobnou hřebeni nebo podobnou kombinaci vidličky a hřebene, přičemž multiméry podobné hřebeni jsou zde výhodné multiméry obsahující polynukleotidy, které mají přímý hlavní řetězec s násobnými bočními řetězci vystupujícími z hlavního řetězce. Zavěšené segmenty budou obvykle závislé na modifikovaném nukleotidu nebo jiné organické části obsahující příslušné funkční skupiny, ke kterým oligonukleotidy mohou být konjugovány nebo jinak připojeny. Multimér může být zcela lineární, zcela rozvětvený nebo může obsahovat kombinaci lineárních a rozvětvených částí. Obvykle budou alespoň dvě rozvětvená místa v multiméru, výhodněji přinejmenším tři taková místa a obzvláště výhodně od přibližně 5 do zhruba 30, třebaže v určitých případech jich může být i více. Multimér může zahrnovat alespoň jeden segment dvouřetězcové sekvence. Další informace, které se týkají se syntézy multimérů a zvláštních multimérových struktur, se dají najít v US patentu č. 5 124 246, původce Urdea a kol., kterýžto patent je v obecném vlastnictví.
PCT publikace č. WO 92/02526 popisuje rozvětvený multimér typu hřebene, který je obzvláště výhodný ve spojení s přítomným způsobem, a který sestává z lineárního hlavního řetězce a zavěšených vedlejších řetězců, přičemž hlavní řetězec obsahuje segment, který poskytuje zvláštní hybridizační místo pro analyt nukleové kyseliny nebo pro nukleovou kyselinu vázanou k analytu, zatímco zavěšené vedlejší řetězce zahrnují opakování segmentu, který skýtá zvláštní hybridizač16 ní místa pro značenou nukleotidovou sondu.
Jak již bylo uvedeno výše, preamplifikátorová molekula se může také použít, a slouží jako můstková část mezi značenými extendérovými molekulami a amplifikátorovými multiméry. Tímto způsobem se více amplifikátorů a tak větší počet značení váže v libovolném daném komplexu cílového místei a nukleotidové sondy. Preamplifikátorové molekuly mohou být bud přímé nebo rozvětvené a obvykle obsahují nukleotidy v rozmezí od přibližně 30 do zhruba 3000. Při výhodném provedení tohoto vynálezu, preamplifikátorová molekula se váže přinejmenším ke dvěma rozdílným značeným extendérovým molekulám, takže celková přesnost testu se zvýší (to je proto, že je znovu větší počet hybridizačních případů, které jsou vyžadovány pro vytvoření komplexu cílového místa a nukleotidové sondy).
Pokud se zde používá výrazu biologický vzorek, vztahuje se ke vzorku tkáně nebo k tekutině izolované z jednotlivce, včetně například plazmy, sera, spinální tekutiny, semene, lymfatické tekutiny, vnějších sekretů kůže, plic, střev a močopohlavního traktu, slz, slin, mléka, krevních buněk, tumorů a orgánů, na které výčet není omezen, a také složek vzorků buněčné kultury in vitro (včetně kondicionovaného prostředí vznikajícího růstem buněk v prostředí pro kultivaci buněk, buněk údajné infikovaných viry, rekombinantních buněk a buněčných komponent, na které však výčet není omezen). Výhodné použití způsobu podle tohoto vynálezu spočívá ve zjištění a/nebo kvantitativním stanovení nukleových kyselin, jako
a) nukleových kyselin virů, jako například viru hepatitidy B (HBV), viru hepatitidy C (HBC), viru hepatitidy D (HBD) a viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) a virů skupiny herpes, včetně viru herpes zoster (plané neštovice), herpes simplex viru I a II, cytomegaloviru, Epstein-Barrova viru a nedávno izolovaného viru herpes VI,
b) nukleových kyselin bakterií, jako Chalamydia, Mycobacterium tuberculosis a podobně, a
c) řady zajímavých lidských sekvencí.
Pokud se zde používá výrazu nespecifická hybridizace, používá se v souvislosti s hybridizací, při které segment prvního polynukleotidu, který je určen k hybridizací na segment zvoleného druhého polynukleotidu, se také hybridizuje k třetímu polynukleotidu, co vede ke spuštění chybného výsledku, co má znamená, že nastává zvýšení stavu, kdy značení se může zjistit v nepřítomnosti cílového analytu. Použití výrazu hybridizovat nemá znamená, že se vylučuje ne-Watson-Crickovo párování bází.
Jestliže se zde používá výrazu nespecifické vázání, používá se ve vztahu k výskytu okolností, při kterých se polynukleotid váže k tuhému základu nebo jiné testované komponentě opakováním, jež může být přímé nebo nepřímé, a které nezahrnuje vázání vodíku k polynukleotidům vázaným na základ.
Nyní v souvislosti s výhodným provedením uvedeným na obr. 1 se aplikují dále uvedené výrazy, ke zde znázorněnému testu hybridizace. Je třeba poznamenat, že na obr. 1 jsou univerzální sekvence, které jsou naznačeny pro objasnění silnými čárami.
Značené extendérové molekuly (LE), které jsou zde také označovány jako značené extendéry, obsahují oblasti komplementarity umístěné naproti analytu polynukleotidu a amplifikátorovému multiméru (AMP). Pokud se používá preamplifikátor (není znázorněn na obr.), značené extendérové molekuly se budou vázat k tomuto intermediátorovému druhu spíše než přímo k amplifikátorovému multiméru. Jestliže se nepoužije ani preamplifikátor ani amplifikátor, značené extendérové molekuly se budou vázat přímo k sekvenci ve značené nukleotidové sondě (LP). Tak značené extendérové molekuly jsou jednořetézcové polynukleotidové řetězce, které obsahují první sekvenci nukleové kyseliny L-l komplementárně k sekvenci analytu polynukleotidu, a druhou univerzální oblast, která má multimérovou poznávací sekvenci L-2 komplementární k segmentu M-l značené nukleotidové sondy, amplifikátorového multiméru nebo preamplifikátoru.
Značené nukleotidové sondy (LP) jsou určeny k vázání bud k značenému extendéru nebo, pokud se při testu použije zesílení multiméru, k opakování oligonukleotidových segmentů multiméru. Značené nukleotidové sondy bud obsahují značení nebo jsou strukturovány tak, že se váží ke značení. Tak značené nukleotidové sondy obsahují sekvence L-3 nukleové kyseliny komplementární k sekvenci nukleové kyseliny M-2 přítomné v opakujících se oligonukleotidových jednotkách multiméru a jsou vázány ke značení nebo strukturovány tak, že se váží ke značení, které skýtá, přímo nebo nepřímo, detekovatelný signál.
Zachycovací extendérové molekuly (CE), které se zde také označují jako zachycovací extendéry, se vážou k analytu polynukleotidu a k zachycovacím nukleotidovým sondám, které se naopak vážou k tuhému základu. Tak zachycovací extendérové molekuly jsou jednořetězcové polynukleotidové řetězce, které mají první oblast polynukleotidové sekvence obsahující sekvenci C-l nukleové kyseliny, která je komplementární k sekvenci analytu, a druhou, nekomplementární oblast, která má poznávací sekvenci C-2 zachycovací nukleoti dové sondy. Sekvence C-l a L-l jsou neidentické, nekomplemen tární sekvence, které jsou každá komplementární k fyzikálně odlišným sekvencím analytu.
Zachycovací nukleotidové sondy (CP) se váží k zachycovacím extendérům a k tuhému základu. Tak jak je ilustrováno na obr. 1, zachycovací nukleotidové sondy mají sekvenci C-3 nukleové kyseliny komplementární s C-2 a jsou kovalentně vázány k tuhému nosiči (nebo jsou schopné být kovalentně vázány k tuhému nosiči).
Obecně testy hybridizace roztokové fáze se provádějí za použití systému ilustrovaného na obr. 1, přičemž se postupuje, jak je uvedeno dále. Jednořetězcový analyt nukleové kyseliny se inkubuje za podmínek hybridizace se zachycovacími extendéry a značícími extendéry. Výsledným produktem je komplex nukleové kyseliny z analytu polynukleotidu, vázaný k zachycovacím extendérům a k značícím extenderům. Tento komplex se může následně přidat za podmínek hybridizace k tuhé fázi, která obsahuje zachycovací nukleoti dové sondy vázané ke svému povrchu, avšak při výhodném provedení se počáteční inkubace provádí v přítomnosti zachycovacích nukleotidových sond, které jsou vázány na základ. Výsledný produkt obsahuje komplex vázaný na tuhou fázi přes zachycovací extendérové molekuly a zachycovací nukleotidové sondy. Tuhá fáze s vázaným komplexem se potom oddělí od nevázaných materiálů. Zesílený multimér, výhodně multimér typu hřebene, jak je popsán výše, se potom popřípadě přidá ke komplexu tuhá fáze-analyt-nukleotidová sonda za podmínek hybridizace, aby se dovolilo multiméru hybridizovat k značeným extendérovým molekulám a jestliže se použilo předzesílených nukleotidových sond, komplex tuhá fáze-analyt-nukleotidová sonda se inkubuje s předzesílenými nukleotidovými sondami bud samotnými nebo se zesíleným multimérem, nebo výhodně před inkubací se zesíleným multimérem. Výsledný komplex tuhé látky se potom oddělí od zbývajícího nevázaného preamplifikátorů a/nebo multiméru promýváním. Značené nukleotidové sondy se potom přidají za podmínek, které dovolují hybridizaci, k značeným extendérovým molekulám, nebo pokud se použije zesíleného multiméru, k opakujícím se oligonukleotidovým segmentům multiméru. Výsledná tuhá fáze značeného komplexu nukleové kyseliny se potom promyje, k odstranění nevázaného značeného oligonukleotidu a čtení. Mělo by se poznamenat, že komponenty představené na obr. 1 nejsou nezbytně znázorněné v měřítku a že zesílené multiméry, pokud se použijí, obsahují daleko větší počet opakujících se oligonukleotidových segmentů než je znázorněno (jak je vysvětleno výše), přičemž každý z nich je určen k vázání značené nukleotidové sondy.
První středem zájmu u způsobu podle tohoto vynálezu je eliminace zdrojů šumivého pozadí, minimalizací interakce zachycovacích nukleotidových sond a zachycovacích extendérových molekul se značenými nukleotidovými sondami, značenými extendérovými molekulami a amplifikátory a snížení pravděpodobnosti, že nesprávné části budou vázány k zachycovacím nukleotidovým sondám vázaným na základ.
Předpokládá se, že hybridizace mezi komplementárními oligonukleotidovými sekvencemi je schopna u purinových a pyrimidinových nukleotidů v nich obsažených vytvořit stabilní páry bází. Pět v přírodě se vyskytujících nukleotidů, adenosin (A), guanosin (G), thymidin (T), cytidin (C) a uridin (U), tvoří purin-pyrimidinové páry bází G-C a A-T(U). Vazebná energie G-C páru bází je větší než A-T páru bází v důsledku přítomnosti tří částí vázajících vodík ve dříve uvedeném případě, v porovnání se dvěma v druhém případě, jak je znázorněno dále.
Tak v obvyklé roztokové fázi při sendvičovém testu nukleové kyseliny jsou oligonukleotidové molekuly určeny k tomu, aby obsahovaly sekvence nukleové kyseliny, které jsou komplementární, a proto se hybridizují se sekvencemi nukleové kyseliny v jiných testovaných komponentách nebo v cílovém analytu, jak je vysvětleno podrobně dále. Způsob podle tohoto vynálezu snižuje nespecifickou hybridizaci inkorporujícími nepřirozenými nukleotidovými jednotkami do univerzálních oligonukleotidových segmentů testovaných komponent, které jsou schopny tvořit jedinečné páry bází. Kromě toho způsob podle tohoto vynálezu snižuje příspěvek nespecifického vázání testovaných komponent oddělujícími detekovatelně značenými testovanými komponentami, které jsou spojeny s přítomností a/nebo množstvím cílového analytu z těch složek, které jsou nespecificky vázány a přispívají k šumivému pozadí při testu.
Při prvním provedení tohoto vynálezu se dostává test hybridizace, ve kterém nukleotidové jednotky, které jsou odlišné od A, T, C, GaUa které jsou schopné tvořit jedinečné páry bází, se inkorporují do hybridizujících oligonukleotidiových segmentů testovaných komponent, které nejsou specifickým cílovým analytem, a tak budou méně pravděpodobné tvořit stabilní hybridy se zvláštní sekvencí nukleotidové sondy a cílové oblasti nebo se zevními sekvencemi nukleové kyseliny necílové oblasti. Tak, jak je znázorněno na obr. 1, například takové nukleotidové jednotky se mohou inkorporovat do komplementárních sekvencí nukleové kyseliny C-2/C-3, L-2/M-1 a L-3/M-2. Hybridizující oligonukleotidové segmenty testovaných komponent, které jsou komplementární k segmentům nukleové kyseliny cílového analytu, jsou konstruovány z přirozeně se vyskytujících nukleotidů (to znamená A, T, C, G nebo U). Oligonukleotidové segmenty, které obsahují nukleotidové jednotky, mohou být konstruovány náhradou od přibližně 15 do zhruba 100 % přirozeně se vyskytujících nukleotidů s protějškem nukleotidové jednotky. Výhodně každá třetí nebo čtvrtá báze v oligonukleotidu bude nahrazena nukleotidovou jednotkou, která je schopna vytvořit jedinečný pár bází. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že jak se procento náhrady nukleotidových jednotek zvýší, jako průvodní jev poklesne nespecifická hybridizace. Avšak úplná náhrada bude vyžadovat alespoň dva nové páry bází, za účelem dosažení dostatečné sekvenční rozmanitosti, aby se vyloučila nespecifická hybridizace mezi univerzálními sekvencemi.
Při jiném provedení tohoto vynálezu jev vytvoření signálu nezávislého na cílové oblasti je určen k dosažení testu hybridizace, který se utváří tak, že teplota tání Tml C-2/C-3 hybridu nebo L-2/M-1 hybridu je signifikantně nižší než je teplota tání Tm2 L-3/M-2 hybridu. Tento způsob předpokládá záměr a konstrukci hybridních komplexů tak, že teplota tání je alespoň o 5 °C nižší, výhodně alespoň o 10 °C nižší, nejvýhodněji alespoň o přibližné 20 °C nižší, než je teplota tání Tm2.
Tento rozdíl ve stabilitě je využíván při provádění testu za přísně řízených podmínek, které z počátku upřednostňují tvorbu Tml a Tm2 hybridních komplexů. Toto přísné řízení se změní v následujícím stupni testu, který přitom dovolí fyzikální oddělení cílového analytu ze zachycovacích nukleotidových sond nebo fyzikální oddělení značených nukleotidových sond vázaných na amplifikátor z cílové oblasti. Přísnost řízení se může sledovat změnou parametrů, které jsou proměnné z termodynamického hlediska. Takové proměny jsou dobře známé v oboru a zahrnují koncentraci formaldehydu, koncentraci soli, koncentraci chaotropní soli, hodnotu pH (koncentraci vodíkových ionů). obsah organického rozpouštědla a teplotu. Výhodné přísné řízení se dosahuje hodnotou pH a koncentrací soli. Jeden stupeň testu se provádí při hodnotě pH nebo koncentraci soli, které destabilizují hybridní komplex vzniklý mezi zachycovací nukleotidovou sondou a zachycovacím extendérem nebo destabilizují hybrid vzniklý mezi značeným extendérem a amplifikátorem (nebo preamplifikátorem). Výhodný stupeň, při kterém se použije přísnost řízení, je přidání substrátu. Tak při výhodném provedení se test hybridizace provádí za podmínek, které podporují stabilitu hybridních komplexů vzniklých mezi všemi testovanými komponentami, a potom, s přídavkem značeného substrátu, přísnost řízení se změní k destabilizaci hybridních komplexů, jako zachycovací nukleotidové sondy a zachycovacího extendéru nebo značeného extendéru a amplifikátoru (nebo preamplifikátoru) a podobně, za předpokladu, že značená nukleotidová sonda se neuvolňuje ze značeného extendéru nebo amplifikátoru.
Jiné ztělesnění vynálezu představuje prostředek, kterým se může uskutečnit výše uvedené provedení tohoto vynálezu a spočívá v utvářením testu hybridizace, při kterém komplementární nukleotidové sekvence, které tvoří Tml hybridní komplexy, jsou kratší než komplementární nukleotidové sekvence, které tvoří Tm2 hybridní komplexy. Odborník v oboru vezme v úvahu, že s kratšími komplementárními nukleotidovými sekvencemi zde klesá příležitost pro rozmanitost sekvencí. Tato rozmanitost se však může udržovat inkorporací do komplementárních sekvencí a nepřirozeného páru bází, například isoC-isoG páru bází.
Odborníkovi v oboru bude hned zřejmé, že čím je větší teplotní rozdíl mezi Tml a Tm2, tím větší je účinnost tohoto technického postupu při odstraňování šumivého pozadí. Tak odborník v oboru rozpozná, že teplotní rozdíly menší než 10 °C, nebo rovněž menší než 5 °C, by také dovolily snížit šumivé pozadí, třebaže v menším rozsahu.
Způsob podle tohoto vynálezu, při kterém nepřirozené nukleotidové jednotky jsou inkorporovány do hybridizujících oligonukleotidových sekvencí ke zvýšení specifičnosti hybridizace s cílovým analytem, nacházejí použití při různých aplikacích.
V základním nebo zesíleném sendvičovém testu nukleové kyseliny v roztokové fázi se připojí větší počet zachycovacích nukleotidových sond k tuhému povrchu. Častěji plocha povrchu dostupná pro nespecifické vázání je řízena inkubací povrchu s DNA například ze spermatu lososa nebo brzlíku telete. Přítomnost této DNA však zvyšuje možnost nespecifické hybridizace testovaných komponent k tuhému základu, a proto zvýšené šumivé pozadí. Náhrada těchto přirozených DNA syntetickými DNA obsahujícími nepřirozené báze bude minimalizovat nespecifickou hybridizací a nespecifické vázání.
Výhodně se tyto polynukleotidy budou připravovat 3' tailingem krátkých oligonukleotidů se směsmi nukleotidů způsoby dobře známými v oboru. Alternativně krátké, takřka nahodilé sekvence oligonukleotidů obsahujících nepřirozené nukleotidy se mohou spojovat dohromady za vzniku polynukleotidů. K tomuto účelu se mohou běžně používat rozvětvené DNA. Například bloková sekvence -TNVN-F-TNVN-J-TNVN-, ve které F znamená isoC a a J představuje isoG, se může připravit a chemicky připojit za vzniku polymeru. Výhoda použití toho přístupu oproti použití enzymatického 3' tailingu je v eliminaci homopolymerních/homooligomerních sekvencí.
Jiná aplikace, ve které nachází použití konstrukce hybridizujících oligonukleotidů obsahujících nepřirozené nukleotidové jednotky, je v určení antimediátorových sloučenin. Antimediátorové sloučeniny, jak objasňuje například Ching a kol. v Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 86, 10006-10010 (1989), Broder a kol. v Ann. Int. Med., 113, 604-618 (1990), Loreau a kol. v FEBS Letters, 274, 53-56 (1990) a PCT publikace č. WO 91/11535, WO 91/09865, WO 91/04753, WO 90/13641, WO 91/13080 a WO 91/06629, jsou oligonukleotidy, které se váží k mRNA odpovědné za vznik zvláštního proteinu a znemožňují nebo brání produkci této látky. Běžné antimediátorové molekuly jsou obvykle schopny reagovat s různými druhy oligonukleotidů. Avšak v důsledku jejich délky (obvykle oligonukleotidové sekvence obsahují až 30 nukleotidových jednotek) takové antimediátorové molekuly představují problém spojený s nespecifickou hybridizaci s necílovými druhy. Jedno řešení spočívá v použití krátkých oblastí hybridizace mezi násobnými nukleotidovými sondami a cílovou oblastí, ke zpevnění celkového komplexu, a krátké dimerizační domény se používají mezi nukleotidovými sondami, jak popsal Distefano a kol. v J. Am. Chem. Soc.,
114, 1006-1007 (1992). Dimerizace domén může být určena k tomu, aby měly zadní části (tails) s komplementárními sekvencemi obsahující nepřirozené nukleotidové jednotky a přitom poskytovaly vysokou účinnost a specifické vázání k cílovému analytů bez zvýšení nespecifické hybridizace k necílovému analytů. Tato myšlenka je ilustrována na obr.
s dvoj řetězcovou DNA cílovou oblastí.
Jak je ilustrováno na obr. 2, náhrada řetězce se může použít k posunutí rovnováhy k dvouřetézcové DNA. AT-bohaté promotorové sekvence za nadšroubovicového napětí, které jsou SI citlivé na nukleázu a jsou tak již částečné jednořetězcové, jsou obzvláště výhodná místa pro tento typ aplikace antigenu. Krátké oligonukleotidy by se měly použít k dosažení maximální specifičnosti. Vazebná energie těchto oligonukleotidů k cílové oblasti by méla zvýšit jejich vzájemným vázáním za vzniku sítě oligonukleotidů.
V tomto konstruktu krátké univerzální sekvence, které nebudou tvořit stabilní páry bází v nepřítomnosti cílové oblasti, obsahují isoC a isoG k limitování nespecifické hybridizace nukleotidových sond s lidskými sekvencemi. Po vázání nukleotidových sond 1, 2 a 3 k cílové oblasti univerzální sekvence budou v dostatečně uzavřené blízkosti, aby se jejich účinná koncentrace významně zvýšila. Univerzální sekvence budou potom párové, z čehož vyplývá další zvýšení síly vázání. RNA cílové oblasti se mohou také použít ve spojení s tímto přístupem.
Postup SELEX, popsaný v US patentu č. 5 270 163, původce Gold a kol. [viz též Tuerk a kol., Science, 249, 505-510 (1990), Szostak a kol., Nátuře, 346, 818-822 (1990) a Joyce, Gene, 82, 83-87 (1989)], se může používat k selekci pro RNA a DNA sekvence, které zjišťují požadované cílové molekuly a vážou se na tyto molekuly na základě jejich tvaru. Výraz aptamér (neboli protilátka nukleové kyseliny) se zde používá pro takovou jednořetězcovou nebo dvoj řetězcovou DNA nebo jednořetězcovou RNA molekulu, viz například PCT publikace č. WO 92/14843, WO 91/19813 a WO 92/05285, jejichž obsah se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky. Cílové molekuly, pokud jsou odlišené od cílových analytů zahrnují polymery, jakou jsou proteiny, polysacharidy, oligonukleotidy nebo jiné makromolekuly, a malé molekuly, jako mají léčiva, metabolity, toxiny nebo podobně, ke kterým se má vázat aptamér.
Při postupu SELEX se oligonukleotid konstruuje v n-meru, výhodné randomizované sekvenci nukleotidů, přičemž tvořící se nahodilý pul (pool) oligonukleotidů, je lemován dvěma polymerázovými řetězcovými reakčními priméry (PCR). Konstrukt se potom uvádí do styku s cílovou molekulou za podmínek, které podporují vázání oligonukleotidů k cílové molekule. Takové oligonukleotidy, které váží cílové molekuly, jsou:
a) odděleny z těch oligonukleotidů, které neváží cílovou molekulu za použití obvyklých způsobů, jako je filtrace, odstřelování, chromatografie nebo podobně,
b) disociovány z cílové molekuly a
c) zesílené za použití obvyklé PCR technologie za vzniku obohaceného pulu oligonukleotidů o ligandy.
Další okruhy vázání, oddělování, disociace a zesílení se provádějí až aptamér, s požadovanou vazebnou afinitou, dosáhne specifičnosti nebo obojího. Identifikovaná koncová aptamérová sekvence se potom připraví chemicky nebo transkripcí in vitro. Když se připravují takové aptaméry, vybrané páry bází se nahradí nepřirozenými páry bází, pro snížení pravděpodobnosti aptamérů hybridizujících k lidským nukleovým kyselinám.
Tento vynález se může použít při alespoň dvou obecných cestách SELEX. První, isodG a isodC mohou být zahrnuty mezi sekvence v nahodile uspořádaném DNA sekvenčním pulu. Počet možných nahodilých struktur, které mohou zjistit proteiny nebo jiné důležité biomolekuly, se zvýší syntézou řetězce DNA ze šesti nebo více nukleotidů, spíše než z obvyklých čtyř nukleotidů A, T, G a C. To naopak zlepší naději identifikující sekvence, která se váže s větší afinitou a/nebo specifičností k cílové molekule.
V SELEX mohou zvolené konzervované oligonukleotidové sekvence podléhat nežádoucí hybridizací na celulární sekvence. Tato nespecifická hybridizace se může snížit za použití nepřirozených párů v selekčním procesu. Nukleotidy, které se nezjistí lidskou RNA a DNA polymerázou, ale které se zjistí určitými fágovými nebo bakteriálními polymerázami, jsou obzvláště vhodné při této aplikaci.
Druhé použití tohoto vynálezu v SELEX procesu spočívá v přípravě konečného aptamérového konstruktu s minimalizovanou nespecifickou hybridizací. Například aptaméry, které projevují předem stanovenou vazebnou afinitu, specifičnost nebo jiné charakteristické vlastnosti cílové molekuly, se vyberou z pulu RNA nebo DNA sekvencí za použití SELEX procesu. Tyto charakteristické vlastnosti cílové molekuly se stanovují na základě sekundární struktury aptaméru, která se z části udržuje tvorbou intramolekulárních oligonukleotidových hybridních komplexů. Po objasnění sekundární struktury aptaméru bude odborníkovi v oboru zřejmé, že specifičnost párů bází v určitých intramolekulárních hybridních komplexech je vysoce výhodná pro udržení sekundární struktury, a proto poznání cílové molekuly a vazebných charakteristik aptaméru, to znamená těch, které budou páry bází, vede výhodně k G-C nebo A-T. V těchto intramolekulárních hybridních komplexech se zde budou jiné páry bází, například v částech párujících báze ze stonku smyčky, které mohou být nahrazeny libovolným párem komplementárních nukleotidů, označovat jako Ν,Ν'-páry bází, bez měnící se sekundární struktury aptaméru.
Jednoduchá náhrada zvolených Ν,Ν'-párů bází a G-C a C-G párů bází v konečném aptamérovém konstruktu v isoG-isoC nebo isoC-isoG sníží nespecifickou hybridizací k necílovým oligonukleotidovým sekvencím. Protože isoC-isoG pár bází je isoenergetický s C-G párem bází, základní tvar molekuly a pevnost vlásenky budou velmi podobné. Pár bází isoenergetický s A-U by byl žádoucí pro náhradu párů bází, kde získání sekvence se projevuje silnou preferencí pro A-U nebo U-A, ve srovnání s C-G. Tyto substituce mají účinek na : přípravu aptamérů, které jsou specifičtější pro cílovou molekulu omezením její možnosti pro nežádoucí hybridizací k buněčným RNA a DNA sekvencím.
Při základním způsobu se zvolené páry bází nahrazují isoC-isoG nebo isoG-isoC páry bází. V konečném konstruktu isoC-isoG páry bází mohou obsahovat ribonukleotidy nebo deoxyribonukleotidy. Chimérická aptamérová (sestávající jak z ribonukleotidů, tak z deoxyribonukleotidů) molekula se může připravit chemicky. Podle jiného provedení se ribo-isoGTP a ribo-isoCTP (s vhodnou ochranou v poloze 2’) může použít pro přípravu aptamérů transkripcí DNA matice obsahujících isoC a isoG, provedenou in vitro.
Jiné aplikace, při kterých tento vynález může najít použití, zahrnují hybridizace in šitu, při snížení nespecifického vázání při testech hybridizace a testech řetězcových reakcí polymerázy (PCR).
Hybridizace in šitu porušuje dostatečnou citlivost k detekci jediné molekuly cílového analytu. PCR in sítu [viz například Bagasra a kol., J. Immunological Methods, 158. 131-145 (1993)] byl vyvinut k dosažení této potřebné citlivosti, avšak stanovení množství není tak přesné, pokud se použije PCR metody. Při jiném provedení by se mělo použít zesílených značených extendérových nukleotidových sond k vázání cílového analytu. Značené extendéry by měly vázat buď preamplifikátory nebo amplifikátory. Pokud se používají preamplifikátory, měly by tvořit můstek mezi značenými extendéry a amplifikátory. Amplifikátory mají vázat značené nukleotidové sondy, které by se výhodně stanovily luminiscencí (fluorescencí, pokud je dostatečně vysoká citlivost). Jak již bylo uvedeno výše, univerzální sekvence L-2/M-1 a M-2/L-3 mají sestávat z krátkých oligonukleotidů, které popřípadě obsahují 15 až 30 % isoC a isoG, ke snížení nežádoucí hybridizace na lidské sekvence. Čtvrtý pár bází se má použít k dalšímu snížení representace přirozených párů v těchto sekvencích.
Jak již bylo uvedeno dříve, nespecifické vázání, stejně jako nespecifická hybridizace se může snížit za použití nepřirozených párů bází. Nahodilé polymery nebo takřka nahodilé blokové kopolymery, sestávající ze 6 až 8 rozdílných nukleotidů, se mohou používat se snížení nespecifického vázání amplifikátorů a značených nukleotidových sond k buněčným složkám, které mají vysokou afinitu pro polynukleotidy. Tak nespecifické vázání se sníží bez rizika zvýšení nespecifické hybridizace zavedením přirozených sekvencí z telete nebo lososa, jak se obecně provádí.
Odborník v oboru sezná, že stejná strategie se může aplikovat na přenosové testy, jako tečkový přenos, Southernův přenos a northenový přenos, ke snížení nespecifické hybridizace a nespecifického vázání nukleotidových sond na tuhé základy.
Tento vynález také nachází několik použití při PCR a jiných exponenciálních zesilovacích technických postupech. Například v sadě PCR, poté co se cílový analyt z počátku zesílil a potom zředil několikatisícinásobně, se běžné používá 5' převis na jednom primérů pro zachycování a 5' převis na jiném primérů pro značení. Mezník, který nemůže být čten polymerázou, se zavede tak, že převisy zůstanou jednořetézcové [viz například Newton a kol., Nucl. Acids Res., 21, 1155-1162 (1993)]. Generické sekvence v těchto 5' převisech se mohou připravit tak, že obsahují modifikované páry bází ke snížení frekvence primérování na necílové oblasti. Opravdu přítomnost isodC nebo isodG v první bázi 5' převisu se může použít na místo současné používaných mezníků. Polymeráza se nemůže číst isodC nebo isodG, protože nebude mít žádný isodGTP nebo isodCTP, který by se dal na její místo. Protože polymeráza může vnést T do polymeru při nízké frekvenci, pokud se detekčně stanovuje isodG, ve kterém je primér, je výhodné používat isoC jako první bázi v 5' převisu.
Dále jsou uvedeny experimentální údaje.
Při praktickém provedení tohoto vynálezu se budou používat, pokud není uvedeno jinak, běžné technické postupy syntézy z organické chemie, biochemie, molekulární biologie a podobných oblastí, které jsou běžné odborníkovi v oboru. Takové technické postupy jsou plné vysvětleny v literatuře, viz například Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, (1989), Oligonucleotide Synthesis (vyd. M. J. Gait, 1984), Nucleic Acid Hybridization (vyd. B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984) a literární řady Methods in Enzymology (Academie Press, lne.).
Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace, které jsou uvedený výše i dále, se zahrnují do dosavadního stavu techniky.
Je třeba rozumět, že třebaže vynález je popsán v souvislosti s výhodnými zvláštními svými provedeními, přičemž popis uvedený výše, stejně jako příklady, které budou následovat, jsou zamýšleny k ilustraci a nejsou omezením rozsahu vynálezu. Jiné aspekty, výhody a modifikace v rozsahu tohoto vynálezu budou zřejmé odborníkovi v oboru, kterému je vynález určen.
Příklady provedení vynálezu
V dále uvedených příkladech se usiluje o zajištění přesnosti s ohledem na použité číselné údaje (například množství, teplotu a podobné), ale mělo by se počítat s určitou experimentální chybou a odchylkou. Teploty jsou udávány vždy ve stupních celsia (°C) a pokud není uvedeno jinak, tlak je atmosférický nebo se takovému tlaku blíží.
Způsob syntézy isoguanosinu nebo 2'-deoxyisoguanosinu
Dále se popisuje několik způsobů syntézy isoguanosinu nebo 2'-deoxyisoguanosinu. Například 2'-deoxyisoguanosin se syntetizuje
1) z 2'-deoxyadenosinu přes 2'-deoxyadenosin-(N^-oxid) přímou fotolýzou za použití bázických podmínek [Switzer a kol., citováno výše (1993)],
2) z 2-chlor-2'-deoxyadenosinu přímou fotolýzou za bázických podmínek [Seela a kol., Helv. Chim. Acta,
75, 2298-2306 (1992)] a
3) chemickou cestou z 6-amino-l-(2'-deoxy-3~D-erythropentofuranosyl)-lH-imidazol-4-karbonitrilu (AICA
2’-deoxynukleosid), který se nechá reagovat s benzoylisokyanátem, s následujícím zpracováním s amonikem, který působí anelaci pyrimidinového kruhu [Kazimierczuk a kol., Helv. Chim Acta, 74, 1742-1748 (1991)].
Avšak protože fotolytická konverze 2'-deoxyadenosin-(ř^-oxidu) na 2'-deoxyisoguanosin se sama neprovádí snadno ve větším měřítku, byla vyvinuta běžná chemická cesta pro přípravu 2'-deoxyisoguanosinu ze snadno dostupného 2'-deoxyribonukleosidu, jako výchozí sloučeniny.
Je popsáno několik způsobů konverze 2’-deoxyguanosinu na 2,6-diaminopurinový nukleosid a na N6-alkyl-2,6-diaminopurinový nukleosid přes zvláštní konvertibilní 2'-deoxyguanosinové deriváty, jako je O6-fenyl-2'-deoxyguanosin [MacMillan a kol., Tetrahedron, 47, 2603-2616 (1991), Gao a kol., J. Org. Chem., 57, 6954-6959 (1992) a Xu a kol., Tetrahedron, 48, 1729-1740 (1992)]. Dále Fathi a kol. v Tetrahedron Letters, 31, 319-322 (1990) popisuje běžnou syntézu O6-fenyl-2'-deoxyguanosinu, za použití způsobu zahrnujícího zpracování 2'-deoxyguanosinu s anhydridem kyseliny trifluoroctové a pyridinem, s následující náhradou in sítu fenolem. Alternativní zavedení 06-fenylové části do 2'-deoxyguanosinu popsal Reese a kol. v J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1263-1271 (1984), kde intermediární O6-(4-toluensulfonyl)-2'-deoxyguanosin se zpracuje s trimethylaminem a potom s fenolem, aby se dosáhlo náhrady O6-(4-toluensulfonylové) skupiny a došlo se k O6-fenyl-2’-deoxyguanosinu. Sloučenina podobná isoguanosinu se připravuje z 2-(methylmerkapto)-6-amino- pyrazolopyrimidinribonukleosidu S-oxidací za vzniku 2-(methylsulfonyl)-6-aminopyrazolopyrimidinribonukleosidu, s následujícím zpracováním hydroxidem sodným, aby se dostal isoguanosinový analog [Cottam a kol., Nucleic Acids Research, 11, 871-882 (1983)].
Je popsána přeměna 2-aminoskupiny v guanosinu a 2'-deoxyguanosinu za použití alkylnitritů. Tato přeměna zahrnuje konverzi 2-halogen- [Nair a kol., Synthesis,
670-672 (1982)] a 2-(methylmerkapto)-6-chlorpurinribonukleosidu [Trivedi v Nucleic Acid Chemistry, Townsend a kol. (vyd.), Wiley Inter-Science, část 4, str. 269 až 273 (1991)], při radikálových reakcích. Oxidaci 06-(p-nitrofenylethyl)-3',5'-O-di-terc.-butyl-dimethylsilan-2'-deoxyguanosinu čistým pentylnitritem, která poskytne 06-(p-nitrofenylethyl)-3',5'-O-di-TBDMS-2'-deoxyxantosin, popisuje Steinbrecher a kol. v Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32. 404-406 (1993).
Způsob syntézy 2'-deoxyisoguanosinu popisuje Seela a kol. v Helv. Chim. Acta, 77, 622-630 (1994). V prvním stupni se 2'-deoxyguanosin konvertuje na 2-amino-2'-deoxyadenosin a ve druhém stupni se získaný 2-amino-2'-deoxyadeno sin deaminuje diazotizací 2-aminoskupiny dusitanem sodným, aby se dostal 2'-deoxy-isoguanosin.
Popsaný a nárokovaný způsob syntézy sloučenin struktury odpovídající obecnému vzorci
ve kterém je zvolen ze souboru sestávajícího z atom vodíku hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, atomu halogenu, aminoskupiny, alkylové skupiny, allylu a skupiny
O vzorce -OR , o
kde znamena alkylovou skupinu, allyl, silyl nebo zbytek fosfátu, spočívá v tom, že se
a) nechá reagovat sloučenina struktury odpovídající obecnému vzorci
s reakčním prostředkem vhodným k ochraně hydroxyskupi ny jak v poloze 3', tak v poloze 5',
b) nechá reagovat sloučenina ze stupně a) s reakčním prostředkem vhodným k převedení 06-oxyskupiny na funkční skupinu, která je citlivá k náhradě nukleofil ní skupinou, za vzniku funkcionalizované O6-skupiny,
c) oxiduje 2-aminoskupina ve sloučenině ze stupně b),
d) nechá reagovat sloučenina ze stupně c) s nukleofilním prostředkem, k náhradě funkcionalizované O6-skupiny,
e) nechá reagovat sloučenina ze stupně d) s reakčním prostředkem, který je vhodný k odstranění chránící skupiny z chráněných hydroxyskupin v poloze 3' a 5' .
Konverze guanosinu nebo 2'-deoxyguanosinu na isoguanosin nebo 2'-deoxyisoguanosin se může provádět chráněním hydroxyskupin na cukrové části za použití vhodných reakčních prostředků, například TBDMS, benzoylchloridu, anhydridu kyseliny octové nebo podobných sloučenin. Jak již bylo uvedeno výše, alespoň jedna hydroxyskupina na cukrové části se může nahradit atomem halogenu nebo alifatickými skupinami, nebo se může převést na funkční skupinu, jako jsou estery, aminy a podobné. Výsledná sloučenina se izoluje a O6 se modifikuje tak, že může být nahrazena vhodnou nukleofilní skupinou. Příklady takových nahraditelných skupin zahrnují například skupiny vzorce CH-^-S-Cg^-O6-, CgH5-SO2-O6-, C6H5-O6-, 4-nitro-C6H4-06-, 2,4,6-trinitro-C6H2-06- nebo podobné skupiny. 2-Aminoskupina se potom přemění na alkoxylovou funkční skupinu za použití alkylnitritu nebo jiného vhodného prostředku, jaké jsou známy v oboru [viz Nair a kol., citováno výše (1982), Trevidi, citováno výše (1991) nebo Steinbrecher a kol., citováno výše (1993)]. Získaná sloučenina se nechá reagovat s vhodnou nukleofilní sloučeninou, jako je například hydroxid amonný nebo jiná sloučenina obsahující aminoalkylovou, aminoarylovou, aminoheteroalkylovou nebo aminoheteroarylovou skupinu, které obsahují koncovou skupinu vzorce -NH2, -SH-, -COOH nebo podobné, přičemž se z:
nahradí modifikovaná O odštěpitelná skupina. Odstraněni chránící skupiny z chráněné hydroxyskupiny se může provádět zpracováním například s bází nebo s fluoridem.
V dále uvedeném pojednání O6-(4-methylthiofenylová) skupina bude sloužit jako příklad nahraditelné skupiny, avšak její použití je uvedeno toliko pro účel popsaného zvláštního provedení a není zamýšleno jako omezení možností.
N6-Alkylované isoguanosinové deriváty se mohou snadno připravit synteticky za použití alkylaminu jako nukleofilního prostředku. Například hexandiamin se může použít k náhradě 06-(4-methylthiofenylové) skupiny za vzniku N6-(6-aminohexyl)isoguanosinu. Ochrana aminohexylové skupiny (například jako trifluoracetamidoderivát) a následující konverze na fosforamiditový reakční prostředek poskytuje možnost zavést funkční skupinu isoguanosinového analogu, který se může inkorporovat do libovolné požadované polohy v oligonukleotidu pro další postsyntetickou derivatizaci. Tak by bylo žádoucí specificky značit isoguanosinovou část zvoleného isoguanosinového/isocytidinového páru bází. Je také možné syntetizovat řadu N6-derivátů isoguanosinu, která vede k určité požadované funkcionalitě, jednoduše náhradou 06-(4-methylthiofenylové) skupiny vhodnou terminální nukleofilní skupinou, jako je například -COOH, -SH-, -NH2 nebo podobně, a deriváty se tak mohou snadno připravit.
Kromě toho se O2-(4-methylthiofenyl)-2'-deoxyxantosin, ve své plně chráněné fosforamiditové formě [O2-(4-methylthiofenyl ) -5 '-O-DMT-3 O-(BCE-diisopropylfosforamidit)-2'-deoxyxantosin], může použít jako konvertovatelný derivát pro inkorporaci do oligonukleotidu. Postsyntetická náhrada 02-(4-methylthiofenylové) skupiny z O2-(4-methylthiofenyl)-2'-deoxyxantosinu alkyldiaminem nebo jiným funkcionalizovaným alkylaminem vede k přípravě oligonukleotidů, které obsahují N6-(aminoalkyl)-2'-deoxyisoguanosin. Derivatizovaný isoguanosin může také sloužit jako místo pro zavedení značené nebo jiné reportážní molekuly, zvláště na funkcionalizovaném isoguanosinovém zbytku.
Nástin pokusu syntézy
Jak je znázorněno ve schématu 1, syntéza 2'-deoxyisoguanosinu se provádí v pěti dále uvedených stupních z 2'-deoxyguanosinu:
1) konverze 2'-deoxyguanosinu na 3',5'-O-(terc.-butyldimethylsilyl)2~2'-deoxyguanosin [Ogilvie a kol., Can.
J. Chem., 51, 3799-3807 (1973)], s čištěním rekrystalizací,
2) konverze O6-(4-toluensulfonyl)-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu , zr
3) náhrada 4-toluensulfonylové skupiny na 0° vhodným fenolem, například 4-(methylthio)fenolem nebo pentachlorfenolem, za použití Reeseova postupu, aby se dostal O6-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosin [Reese a kol., citováno výše (1984)],
4) oxidace 2-aminoskupiny na alkoxylovou funkční skupinu terč.-butylnitritem za neutrálních podmínek, aby se dostal O6-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyxantosin (Steinbrecher a kol., citováno výše (1993)] a
5) vytěsnění 02-(4-methylthiofenylové) skupiny hydroxidem amonným za zvýšené teploty, aby se dostal 3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyisoguanosin.
Syntéza isoguanosinu z guanosinu se může provést za použití podobného reakčního schématu
Schéma l
stupeň 3
Schéma 1
- pokračování
stupeň 5
Schéma 1 - pokračování
Λ
Získaná sloučenina je identická v každém ohledu (TLC, HPLC, UV a NMR) s autentickým vzorkem připraveným publikovanou fotolytickou cestou [Switzer a kol., citováno výše (1993)].
Způsob přípravy isocytidinových nebo 2'-deoxyisocytidinových derivátů
Mohou se připravit isocytidinové nebo 2'-deoxyisocytidinové deriváty, ve kterých glykosidová vazba je stabilizována proti působení zředěné kyseliny během syntézy oligonukleotidů. N2-Amidinové deriváty 2'-deoxyadenosinu popsal McBride a kol. v J. Am. Chem. Soc., 108, 2040-2048 (1986), Froehler a kol. v Nucleic Acids Res., 11, 8031-8036 (1983) a Pudlo a kol. v Biorg. Med. Chem. Lett., 4,
1025-1028 (1994). N2-(N,N-di(X)formiamidino)-2'-deoxyisocytidin se syntetizuje dále popsaným způsobem. Jako příklad zde slouží X ve významu n-butylové skupiny. X však může znamenat alkylovou skupinu se 2 až 10 atomy uhlíku, arylovou, heteroalkyIvou nebo heteroarylovou skupinu a podobně.
Dimethylacetal N-di-n-butylformamidu se syntetizuje transaminací dimethylacetalu N,N- methylformamidu di-n-butyl43 aminem, jak popsal McBrid a kol., citováno výše (1986), Froehler a kol., citováno výše (1983), a Pudlo a kol., citováno výše (1994). 10 mmol 2'-deoxy-5- methylisocytidinu se suspenduje ve 100 ml methanolu a k suspenzi se přidá 10 mmol dimethylacetalu N,N-di-n-butylformamidu. Po 2 hodinách za teploty místnosti při míchání se dostane čirý roztok. Analýza chromatografií na tenké vrstvě, za použití silikagelu 60H, při vyvíjení 10% methanolem v methylenehloridu, ukáže, že výchozí látka se kvantitativně spotřebovala. K reakční směsi se přidá 10 ml vody, aby se rozložil přebytek reakčních činidel, a rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. Dostane se 3,8 g surového N2-(N,N-dibutylformamidino)-2'-deoxyisocytidinu. Tento derivát se může přímo konvertovat na 5'-O-DMT-N2-(N,N-dibutylformamidino)-2'-deoxyisocytidin, pro inkorporaci do oligonukleotidů.
Mohou se také připravit jiné isocytidinové deriváty, které poskytují funkcionalizovatelné substituenty, pomocí kterých se může inkorporovat detekovatelné značení do specifické polohy oligonukleotidů. Například jsou popsány 5-alkylované 2'-deoxyuridinové deriváty, jako je například 5-[N-(6-trifluoracetylaminohexy1)-3-(E)akrylamido]-2'-deoxyuridin [Ruth, Oligodeoxynucleotids with Reportér Groups Attached to the Base, ve (vyd.) Eckstein, Oligonukleotids a Analogues, IRL press, str. 255 až 282 (1991)]. Bylo nalezeno, že takové deriváty v poloze 5 nepřekážejí párům bází hybridizačního vzoru. Ruthem popsaný chemický postup může se použít k syntéze 5-(N-(6-trifluoracetylaminohexyl)-3-(E)akrylamido]-2'-deoxyisocytidinu, přičemž se dostává funkcionalizovaný isocytidin, který může být detekčně značen ve zvolených isoguanosin*isocytidinových párech bází.
Tyto a jiné deriváty isocytidinu a 21-deoxyisocytidinu v poloze 5 vedou k další stabilizaci při tvorbě párů bázích. Mezi takové deriváty se zahrnuje 5-p-propinyl- [viz FrOehler a kol., Tetrahedron Lett., 34, 1003-1006 (1993)], 5-β-propenyl- nebo jiné 5-alkylisocytidinové nebo -2'-deoxyisocytidinové deriváty.
Soupravy pro provádění testů hybridizace nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu budou obsahovat zabalenou kombinaci alespoň jedné hybridizující oligonukleotidové sondy, jejíž segment je schopen tvořit hybridní komplex s analytem, a prostředek pro detekci hybridního komplexu, ve kterém alespoň jedna hybridizující oligonukleotidové sonda obsahuje první nukleotidovou jednotku, která za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází, nebude účinně párovat báze s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U). Reakční prostředky budou obvykle v oddělených zásobnících v soupravě. Souprava může také zahrnovat denaturační prostředky denaturující analyt, hybridizačni pufry, promývací roztoky, enzymové substráty, negativní a positivní kontrolní prostředky a psané instrukce k provedení testu.
Polynukleotidy podle tohoto vynálezu se mohou sestavit za použití kombinace oligonukleotidové syntézy přímo v tuhé fázi, enzymatických metod ligace a chemické syntézy v roztokové fázi, jak je podrobně popsáno v US patentové přihlášce č. 07/813 588, která je postoupena k obecnému použití.
Všechny chemické syntézy oligonukleotidů se mohou provádět na automatickém DNA syntetizátoru (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division model 380 B). Používá se fosforamiditová chemie β-kyanethylového typu včetně
5'-fosforylace, která používá reakční prostředek PHOSTEL™ (DMT-O-CH2CH2-(S02)-CH2CH2-O-P(N(ÍPr)2)(-O-CH2CH2CN), ve kterém DMT znamená dimethoxytrityl a iPr představuje isopropyl). Pokud není uvedeno jinak, používá se normalizovaný výrobní postup.
Příklad 1
Test šumivého pozadí způsobeného nespecifickou hybridizací extendérových sekvencí specifické cílové oblasti s komponentami pro generické testování
Za účelem stanovení, jak test šumivého pozadí může být způsoben cross-hybridizací extendérových sekvencí specifické cílové oblasti s komponentami pro generické testování, se provádí test hybridizace zesílené DNA ke kvantitativnímu stanovení M13 fágu za použití pulů ze zachycovacích extendérů a značených extendérů, jak je uvedeno v tabulkách 1, 2 a 3.
SEQ ID č. Tabulka 1 Pul A zachycovacího extendérů
1 ATTGCGAATAATAATTTTTTCACGTTGAAAATC TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
2 GAATTTCTTAAACAGCTTGATACCGATAGTTG TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
1 3 ATTGTATCGGTTTATCAGCTTGCTTTCGAGGT TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
1 4 CCGCTTTTGCGGGATCGTCACCTTCTC TTGGAAAGAAAGTGAT
1 5 GCTGAGGCTTGCAGGGAGTTAAAGG TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
1 6 ATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGT TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
1 7 TCGCCTGATAAATTGTGTCGAAATCC TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
SEQ Tabulka 2
ID č. Pul B zachycovacího extendéru
8 TCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTA TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
9 CGCCGACAATGACAACAACCATCGC TTCTCTTG^—
ID č. Tabulka 3 Pul značeného extendéru
10 ATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGT TTAGGCAT
11 GAGGCTTTGAGGACTAAAGACTTTTTC TTAGGCr.„-
12 CCCAGCGATTATACCAAGCGCG TTAGGCATAGG ~
AAGAATACACTAAAACACTCATCTTTGACC TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
14 CTTTGAAAGAGGACAGATGAACGGTG TTAGGCA
15 GGAACGAGGCGCAGACGGTCA TTAGGCATAGG.il-
1 16 ACGAGGGTAGCAACGGCTACA TTAGGCATAGG/ —
1 17 GCGACCTGCTCCATGTTACTTAGCC TTAGGCAlrx —
1 18 CTC AGC AGCG AAAGACAGCATCGGA TTAGGCA1 „r
1 19 ATC ATAAGGGAACCG AACTG ACC AA TTAGGCAl rď
20 CCACGCATAACCGATATATTCGGTC TTAGGCAI r>~
21 TACAGACCAGGCGCATAGGCTGGC TTAGGCATA~
22 AAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCA TTAGG “
23 CACCAACCTAAAACGAAAGAGGCGA TTAGGCAI r~
24 AAAATACGTAATGCCACTACGAAGG TTAGGCAl r~
K ilustrativním účelům se prostorové separáty 3'
necílové nukleotidové sondy oddělí pro oddělí od cílové vazebné oblasti každé nukleotidové sondy.
Test se provádí v podstatě jak je popsáno v PCT publikaci
Uvedeno v krátkosti, po celonoční hybridizací za teploty 63 °C se mikrotitrační jamky komplementární k necílové vazebné oblasti zachycovací extendérové molekuly ochladí na teplotu místnosti na dobu 10 minut, dvakrát promyjí pufrem, který obsahuje 0,1 x SSC (15 mM chloridu sodného a 1,5 mM citrátu sodného, hodnota pH 7,0) a 0,1 % dodecylsulfátu sodného. Do jamek se přidá 15 x 3 [15 ramen (arms) každé ze 3 nukleotidových sond alkalické fosfatázy s vazebnými místy] rozvětveného DNA amplifikátoru (100 fm) komplementárního k 3' necílové vazebné oblasti značeného extendéru a v inkubaci se pokračuje za teploty 53 °C po dobu 30 minut a potom se desky ochladí a promyjí, jak je uvedeno výše. Poté se do každé jamky přidá nukleotidová sonda alkalické fosfatázové a dále se inkubuje za teploty 53 °C po dobu 15 minut. Potom se desky znovu ochladí a promyjí, jak uvedeno výše. Tři další promývání se provedou s 0,1 x SSC pufrem. Signály se podrobí detekci na luminometru Chiron za 20 minut v roztoku dioxetanfosfátového substrátu Lumiphos 530 (Lumigen). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
Test šumivého pozadí při nespecifickém vázání
Pul zachycovacího extendéru
Signál (+13 fág)
Šum (-13 fág)
Pul A samotný 293, 306, 337, 359 1,1, 0,9, 1,1, 2,0
Pul A + pul B 390, 393, 379, 376 103, 130,,436,,172
Přidání pulu B zachycovacích extendérů nezvýší skutečný signál, ale provede zvýšení šumu přibližně stonásobně. Počítačová analýza zahrnutých sekvencí ukazuje, že zachycovací extendér # 8 z pulu B má rozsáhlou homologii s T20—LLA2 sekvencí rozvětveného DNA amplifikátoru [včetně 9mer oligo(dA)—oligo(dT)], zatímco zachycovací extendér #9 pulu 9 má rozsáhlou homologii s BLA3c sekvencí rozvětveného DNA amplifikátoru.
Tento vynález určuje problém testu šumivého pozadí v závislosti na hybridizací. Jsou konstruovány nukleotidové sekvence, které jsou přerušeny nukleotidy, které netvoří stabilní pár bází s přirozenými nukleobázemi, přičemž inhibují hybridizací takových sekvencí s přirozenými sekvencemi. V ideálním případě, každá třetí nebo čtvrtá báze v univerzální sekvenci by byla modifikovaným nukleotidem, který nepáruje s A, C, G nebo T (U). Použitím párů bází isoenergetických s C*G párem bází se může také snížit délka univerzálních sekvencí. Statistické důkazy ukazují, že se tím také snižuje frekvence nežádoucí cross-hybridizace mezi univerzálními sekvencemi a mezi univerzálními sekvencemi a necílovými sekvencemi ve vzorku a mezi univerzálními sekvencemi a specifickými sekvencemi cílové oblasti v extendérových nukleotidových sondách. V případě, že se spoléhá na multidentátní vázání za vzniku stabilních hybridů, délky univerzálních sekvencí mohou být dále sníženy (viz WO 95/16055). Všechny univerzální sekvence mají být určeny alespoň 6 a výhodně 8 nukleotidy: zachycovací nukleotidovou sondou, zachycovacími extendérovými zadními částmi, značenými extendérovými zadními částmi, amplifikátory, značenými nukleotidovými sondami a preamplifikátory (pokud jsou aplikovatelné).
Příklad 2
Specifičnost a pevnost isoC-isoG párů bází
Za účelem stanovení specifičnosti a pevnosti isoC-isoG párů bází se provede tepelná analýza taveniny na následujících oligonukleotidech:
1) 5' (L) CA CCA CTT TCT CC (T) 3 ' [SEQ ID č. 25] ,
2) 5' (L) CA CFA CTT TCT CC (T) 3 ' [SEQ ID Č. 26] ,
3) 3 ' (T) GT GGT GAA AGA GG 5' [SEQ ID Č. 27] t
4) 3 ' (T) GT GJT GAA AGA GG 5' [SEQ ID č. 28] a
5) 5' CA CTA CTT TCT CC (T) 3 ' [SEQ ID Č. 29] •
Jádro hybridu těchto oligonukleotidů sestává ze třinácti nukleotidů. Nukleotidy nezahrnuté do párování bází jsou uvedeny v závorkách. L znamená primární amin, F představuje isoC a J představuje isoG. Tepelná analýza taveniny se provádí na spektrofotometru Cary 3E v 3 x SSC (0,45 mM chloridu sodného a 0,45 mM citrátu sodného, hodnota pH 7,9). Každý ze dvou oligonukleotidů inkubovaných dohromady je přítomen v koncentraci přibližně 1,5 μΜ. Hodnoty Tm se vypočítají jako maxima dosažená při vynesení dA2gg/dT proti teplotě. Výsledky uvedené v tabulce 4 ukazují, že isoC*isoG
pár bází je isoenergetický s přirozeným C*G párem bází.
Tabulka 4 Tm analýza specifičnosti isoC*isoG párování bází
pár/chybný pár, párované o1igonukleotidy Tml Tm2 Průměr T Lm
C*G pár, 1*3 60 60 60
isoC*isoG pár, 2*4 60 61 60
isoC*G chybný pár, 2*3 52 52 52
isoG*C chybný pár, 1*4 52 52 52
G*T chybný pár, 3*5 50 49 49
isoG*T chybný pár, 4*5 53 53 53
Proto univerzální sekvence obsahující přibližně ekvimolární množství C, G, isoC, isoG, A a T mohou být kratší než sekvence, které obsahují pouze A, T, C, G v přibližné stejných poměrech. To omezuje možnost vzájemné reaktivity s přirozenými necílovými sekvencemi ve vzorku a s LE a CE cílovými vazebnými sekvencemi, které jsou více nebo méně omezeny na případy, které mají sestávat z A, T(U), CaG.
Údaje také ukazují specifičnost isoC*isoG párů bází. isoC*G a isoG*C páry se chovají jako chybně párované. Typicky destabilizace vyjádřená ve stupních celsia přibližné odpovídá procentu chybného párování. Tak přibližně změna v Tm o 7,5 °C bude předpokládat, že nastane 1 chybné párování na 13 nukleotidů (7,5 % chybného párování). Pozorovaná změna o 8 °C, pokud se C*G nebo isoC*isoG párování porovná s chybným párováním, je podobná změně, která by nastala při průměrném chybném párování s A, T, C a G kódem.
isoG existuje přinejmenším ve dvou tautomerních formách, v ketoformé a enolové formě. Ketoforma je podporová na ve vodných roztocích a enolovou formu podporují organická rozpouštědla [Sepiol a kol., Zeitschrift fůr Naturforschung, 31C, 361-370 (1976)]. isoG enolový tautomer může v podstatě tvořit dvě vodíkové vazby k dT, co vytváří analogii k A*T páru bází. Pokud by byl enolový tautomer přítomen v signifikantní úrovni v hybridizačním pufru, specifičnost isoC*isoG páru bází by byla omezená. Avšak pozorované Tm v isoG*T chybném párování je 53 °C, co je v podstatě stejné jako jiné chybné párování.
Tyto údaje podporují závěr, že enolový tautomer je přítomen ve velmi nízké koncentraci v 3 x SSC při hodnotě pH 7,9 nebo pokud je přítomen, stále tvoří hybrid s Tm nižší o 7 až 8 °C, než má isoC-isoG hybrid. Kontrolní stanovení s G*T chybným párováním má Tm přibližně 49 °C. To je poněkud nižší hodnota, než se očekává pro průměrné G*T chybné párování, ale je blízko k isoG-Τ chybnému párování.
Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že pokud jsou ještě jiné kombinace párování bází (například 8 bází, 4 páry), ač již jsou isoenergetické s C*G nebo tomu tak není, dojde k dalšímu zlepšení specifičnosti párování bází mezi univerzálními sekvencemi. V tomto případě by takřka nastala eliminace A, T, C a G z univerzálních sekvencí. Avšak vzhledem k tomu, že je malá representace těchto bází, přispívá to k rozmanitosti knihovny možných univerzálních sekvencí, co umožňuje určit univerzální sekvence, které jsou jak neinterakční, tak schopné reakce mezi nimi.
Například se 4 kódy bází se mohou stanovit pouze dva páry univerzálních 15mer, které nemají rovněž jediný 3mer cross-hybrid. To znamená, že s přidáním třetího páru 15mer sekvencí musí být alespoň nějaké 3 nukleotidové cross-hydridy. Se 6 kódy bází se může určit 8 párů 15mer sekvencí bez rovněž jednoho 3mer Watson-Crikova typu cross-hybridu. S 8 kódy bází se může určit 19 takových párů 15mer.
Příklad 3
Účinek hodnoty pH na isoC*isoG párování bází
Za účelem zjištění chování isoC*isoG páru bází jako funkce hodnoty pH se provede Tm analýza oligonukleotidů získaných v příkladu 2. Účinek hodnoty pH na Tm oligonukleotidů obsahujících komplementární isoC*isoG pár bází (sekvence 2 a 4) a C*G pár bází (sekvence 1 a 3) se stanoví (n = 2 nebo 3) při 0,5 M soli a přibližně 1,5 μΜ oligonukleotidu.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.
Tabulka 5
Tm analýza citlivosti k hodnotě pH isoC*isoG páru bází
Průměr
Hybrid, párované oligonukleotidy PH Tml Tm2 Tm3 T xm
isoG*isoC, 2*4 7,9 62 60 62 61
isoG*isoC, 2*4 5,1 60 59 60 60
ÍSOG*1SOC, 2*4 9,5 53 51 52 52
G*C, 1*3 9,5 52 52 52
Obecně oligonukleotidové hybridy jsou stabilní při hodnotě pH 5 a 10. Při hodnotě pH nižší než 5, C a A začnou protonovat, zatímco při hodnotě pH vyšší než 10 začne G a T ztrácet své iminoprotony. Tak při hodnotě pH pod 5 a nad 10 hybridy nukleové kyseliny projevují sníženou stabilitu. Údaje z tabulky 2 ukazují, že isoC*isoG pár bází má normální stabilitu za kyselých podmínek. Avšak jak isoC*isoG hybrid, tak G*C hybrid projevují obvykle změnu -9 °C v Tm nad 1,6 jednotky zvýšení hodnoty pH. To je pravděpodobně v důsledku jejich velmi krátké délky.
Teoreticky se mohou vybrat hybridy s ještě větší citlivostí k hodnotě pH za použití pracovního postupu SELEX, který popsal v US patentu č. 5 270 163 Gold a kol., Tuerk a kol. v Science, 249, 505-510 (1990), Szostak a kol. v Nátuře, 346, 818-822 (1990) a Joyce v Gene, 82, 83-87 (1989), ve kterém se shluk DNA nebo RNA randomerů může vybrat pro vázání při neutrální hodnotě pH a pro disociaci od cílové sekvence při středně alkalické hodnotě pH nebo při středně kyselé hodnotě pH. Po následujícím zesílení se výběrový proces může znovu opakovat. Po konečném opakování se oligomery, které projevují požadovanou citlivost při dané hodnotě pH, mohou klonovat a sekvencovat. Uvedené sekvence by se mohly syntetizovat a nej lepší provedení se vybere pro přímý soutěžní test.
Labilita ve střední bázi se může využít při současném testovacím formátu zesílené DNA ke snížení šumivého pozadí při testu. V konečném stupni má použitý substrátový pufr obvykle hodnotu pH 9,5 až 10,5. Se zachycovací nukleotidovou sondou s vlastní labilitou báze bude cílová oblast mimo povrch a může se stanovit v jiné jamce. Pozadí bude zůstávat vzadu. Minimalizace zachycovacího extendéru vázajícího se k základu způsoby uvedenými ve WO 95/16055 bude snižovat šumivé pozadí uvolňováním molekul nespecificky vázaných k zachycovacím nukleotidovým sondám přes zachycovací extendéry.
Protože se nemůže potřebovat uvolnění nukleotidových sond alkalické fosfatázy hybridizovaných k nespecificky vázán amplifikátorům, výhodně by se hybridy zachycovacího extendéru a zachycovací nukleotidové sondy měly vybrat tak, aby měly značně větší labilitu bází (to znamená vyšší Tm při dané hodnotě pH) než amplifikátor a značená nukleotidová sonda a amplifikátor a značené extendérové hybridy. Podle jiného provedení L-2/M-2 hybrid z obr. 1 by byl hybrid labilní báze. V libovolném případě M-2/L-3 hybrid musí být stabilnější, jinak by se uvolňovala značená nukleotidová sonda hybridizovaná k nespecificky vázanému amplifikátoru.
Ám
Jak již bylo uvedeno výše, mohl by být také možný přenos uvolněné cílové oblasti do čerstvých jamek k přečtení.
Bylo by však výhodné číst uvolněný roztok v jamce, kde se vytvořil. Tak by se vyhnulo přídavnému stupni pipetování a vyloučila se nepřesnost, která je spojena s dodatečným stupněm přenosu kapaliny. Je několik způsobů, pomocí kterých se přenos může uskutečnit, jak je popsáno dále.
K dalšímu zvýšení specifičnosti testu se specifické uvolňování cílové oblasti může spojit a maskováním pozadí na povrchu. V tomto případě přenos na jiný základ by nebyl nezbytný. Například povrch tuhého základu by se povlékl inhibitory značené nukleotidové sondy a/nebo různými luminiscenčními inhibitory, absorbéry nebo zhášejícími látkami. Jako povrchový povlak se v současné době používá poly(phe-lys). Fenylalanin je známý inhibitor alkalické fosfatázy, obzvláště výhodný značící enzym. Mezi polymerní peptidové povlaky se mají zahrnout jiné inhibitory alkalické fosfatázy, jako je tryptofan a cystein. Příklady luminiscenčních inhibitorů zahrnují sloučeniny s nízkými výtěžky, to znamená libovolné sloučeniny, které výhodně vydávají teplo spíše než světlo poté, co jsou excitovány kolizí s defosforylovaným dioxetanem.
Jsou alespoň dvě jiné obvyklé cesty k provedení detekce uvolňovaného roztoku, které jsou selektivnější k tomu, aby se vyhnulo přenosu uvolněné cílové oblasti do jiné jamky. Signály spojené s cílovou oblastí se mohou číst v roztoku přípravou tuhé fáze nedosažitelné pro vizualizační prostředky nebo maskováním signálu vytvářejícího reakce, které nastávají na tuhém základu. Izolace tuhé fáze z následujících vizualizačních stupňů by se mohla provádět přidáním do reakční nádoby oleje nemísitelného s vodou, který je těžší než voda. Tento olej by pokryl dno nádoby, zatímco by dovolil sledovanému roztoku dostat se nahoru. Pro jednoduchou kolorimetrickou detekci vizuálně nebo měřením lomu, se opakní substance může přidat k oleji, aby sloužila jako neutrální pozadí pro vizualizaci.
Pro detekci chemickou luminiscencí se olej může plnit opticky opakní látkou. Pokud by se použila tuhá bílá látka, jako je oxid titaničitý, světlo emitované z impregnační vodné vrstvy by se lomilo směrem vzhůru ze zásobníku pro detekci. Tmavá tuhá látka nebo molekuly barviva rozpuštěné v oleji by se také mohly použít k maskování stacionární fáze. Třebaže rovněž olejový roztok není úplný izolát tuhé fáze z vizualizačnich prostředků, suspendované tuhé látky nebo rozpuštěná barviva by blokovaly přenos tohoto světla z povrchu.
Je také možné, aby stacionární fáze byla obarvena barvivém, které by blokovalo emisi světla z reakčních prostředků, které působí blízko svého povrchu. To by bylo zvláště vhodné s barevnými kuličkami, jako tuhou fází obsaženou v opakní jamce.
Příklad 4
Účinek soli na isoC*isoG pár bází při neutrální a alkalické hodnotě pH
Za účelem zjištění chování isoC*isoG páru bází jako funkce koncentrace soli se provede Tm analýza oligonukleotidů získaných v příkladu 2. Účinek koncentrace soli na Tm oligonukleotidů obsahujících komplementární isoC*isoG pár bází (sekvence 2 a 4) a C*G pár bází (sekvence 1 a 3) se stanoví (n = 3) při hodnotě pH 7,9 nebo 9,5 a přibližně 1,5 μΜ oligonukleotidů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.
Typicky polynukleotidy projevují změnu přibližně o 16 až 17 °C v Tm pro každou logaritmickou změnu koncentrace soli. Oligonukleotidy projevují poněkud sníženou závislost na koncentraci soli. Změna o 10 až 11 °C v Tm na logaritmickou změnu v koncentraci soli při hodnotě pH 7,9, vypočtená pro isoC*isoG hybrid, aproximuje, jak by se očekávalo pro 13mer. Avšak změna při hodnotě pH 9,5 pouze o 3 °c pro isoC*isoG hybrid o 5 °C pro C*G hybrid na logaritmickou změnu v koncentraci soli je překvapivě nízká.
Tyto skutečnosti se také dají vysvětlit specifickým uvolněním cílové oblasti. Obecně se použije málo soli pro specifické uvolnění cílové oblasti. Na neštěstí často se také uvolní signifikantní frakce pozadí.
Tabulka 6
IsoC*isoG stabilita jako funkce koncentrace soli
Hybrid, párový oligonukleotid Průměr
sůl (M) pH Tm (°c) dTm
dlog[Na+]
isoC*isoG, 2*4 0,5 7,9 61
isoC*isoG, 2*4 0,17 7,9 56 10-11
isoC*isoG, 2*4 0,5 9,5 52
isoC*isoG, 2*4 0,17 9,5 50 3
C*G, 1*3 0,5 9,5 52
C*G, 1*3 0,1 9,5 48,5 5
Protože teplota tání isoC*isoG páru bází nezávisí na koncentraci soli při středně alkalické hodnotě pH, nezískají se žádné další výhody z snížení koncentrace soli, stejně jako ze zvýšení hodnoty pH. Tak se může použít vysoké koncentrace soli (která je také výhodná pro alkalickou fosfatázu) pro uvolnění a minimalizaci uvolnění pozadí.
Jak je vysvětleno v příkladu 3, postup SELEX se může použít k nalezení DNA nebo RNA sekvencí, co ukazuje zvýšenou nezávislost koncentrace soli na její teplotě tání při libovolné zvolené hodnotě pH.
Příklad 5
Účinek chybného párování bází na hybridizací
Předcházející příklad ukazuje, že oligomer s isoG páry bází je specifický se svým komplementem obsahujícím isoC. Oligomer obsahující isoG je destabilizován o přibližně 7 až 8 °C, pokud je hybridizován k jinému oligomeru obsahujícímu jediné isoG*T nebo isoG*C chybné párování. Obvykle nastává přibližné desetinásobný pokles vázání pro každých 10 °C změny v Tm·
Účinek chybného párování dvou bází na vázání 13mer hybridu se testuje za použití nukleotidových sond znázorněných v tabulce 7.
Tabulka 7 j
SEQ ID č. Sekvence1
I 30 5’ GATGTGGTTGTCGTACTTTTTTTGACACTCCACCAT 1
1 31 5' GATGTGGTTGTCGTACTTTnTTGACAFTCCJCCAT |
| 32 ALK. PHOS.- CTACACCAACAGCATGAA 5’ |
33 3' TCACTAAGTACCACCTCACAG |
34 5' I AGTGATTCATGGTGGAGTGTCTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
35 3' GAGAACCTTTCTTTCACTX |
1 F = isoC, J = isoG,
ALK. PHOS. = alkalická fosfatáza a
X — mezníková sekvence obsahující amin pro připojení k tuhému nosiči
Značená nukleotidová sonda 32, konjugát oligonukleotidu alkalické fosfatázy, se připraví jako je popsáno [Urdea a kol., Nukl. Acids Res., 16, 4937-4955 (1988)]. Značená nukleotidová sonda 32 se hybridizuje s kontrolní nukleotidovou sondou 30 za vzniku nukleotidové sondy alkalické fosfatázy 30*32. Značená nukleotidová sonda 32 se hybridizuje s modifikovanou nukleotidovou sondou 31, aby vznikla isoC,isoG-alk. fosf.-nukleotidová sonda 31*32.
Nukleotidová sonda 35, zachycovací nukleotidová sonda, se váže k mikrotitračním jamkám, jak je popsáno (PCT publikace č. WO 93/13224, jejíž obsah se zahrnuje do dosavadního stavu techniky), aby se vytvořil tuhý základ pro hybridizací. Nukleotidová sonda 34, zachycovací extendér, se hybridizuje k nukleotidové sondě 35. Tento zachycovací extendér je komplementární k nukleotidové sondě alkalické fosfatázy 30*32 a částečně komplementární k nukleotidové sondě alkalické fosfatázy 31*32. Nukleotidová sonda 33 je kompetimér, který se může vázat k zachycovacímu extendéru a blokovat vázání k libovolné nukleotidové sondě alkalické fosfatázy.
Následující inkubace se provádějí za teploty 53 °C po dobu 30 minut v přibližně 1,0 M roztoku chloridu sodného:
1) 250 fmol nukleotidové sondy 34 v jamkách obsahujících pmol imobilizované nukleotidové sondy 35,
2) 250 fmol nukleotidové sondy 34 a 5 pmol nukleotidové sondy 33 v jamkách obsahujících 1 pmol imobilizované nukleotidové sondy 35,
3) 5 pmol nukleotidové sondy 33 v jamkách obsahující 1 pmol imobilizované nukleotidové sondy 35 a
4) toliko pufr.
Po dvojnásobném promytí s 0,1 x SSC, 0,1% SDS, jak je definováno v příkladu 1, každá z výše uvedených prvních inkubací se podrobí druhé inkubaci v trvání 15 minut, za stejných podmínek s každým z následujících preparátů:
1) 25 fmol nukleotidové sondy 30 a 500 attomol nukleotidové sondy 32,
2)
3) fmol nukleotidové sondy 31 a 500 attomol nukleotidové sondy 32,
500 attomol nukleotidové sondy 32 a
4) toliko pufr.
Desky se promyjí dvakrát jak je uvedeno výše a třikrát stejným pufrem doplněným 10 mM chloridu hořečnatého, 1 mM chloridu zinečnatého a 0,1 % Brij-35. Po inkubaci v trvání 25 minut s Lumiphos Plus (Lumigen), se desky vyhodnotí na luminometru Chiron.
Hybridy, které se mohou tvořit, jsou znázorněny na obr. 3, kde Z představuje nepřirozený nukleotid, jak je formou příkladu zde uvedeno na isoC a isoG. Nukleotidová sonda 33, kompetimér, může tvořit 21 pár bází se zachycovacím extendérem a teoreticky může blokovat obě nukleotidové sondy alkalické fosfatázy z vázání. Modifikovaná nukleotidová sonda*značená nukleotidová sonda (31*32) může hybridizovat k zachycovacímu extendéru, tvořícímu 11 párů bází a dvě chybná párování (například G*isoC a isoG*T). Kontrolní nukleotidová sonda*značená nukleotidová sonda (30*32) může tvořit 13 párů bází se zachycovacím extendérem.
Jak je uvedeno v tabulce 8, zachycovací extendér (34) tvoří silný hybrid s kontrolní nukleotidovou sondou*značenou nukleotidovou sondou (30*32) [vzorek 1 = 399 relativních jednotek světla (RLU)]. Preinkubace zachycovacího extendéru s dvacetinásobným molárním přebytkem kompetiméru, vzorek 2, snižuje toto šumivé pozadí přibližné desetinásobně (30 RLU). Modifikovaná nukleotidová sonda*značená nukleotidová sonda (31*32) vykazuje čtyřicetinásobné zmenšení hybridizace (vzorek 3=9 RLU) k zachycovacímu extendéru než kontrolní nukleotidové sondy*značené nukleotidové sondy (30*32). Dvě chybná párování se uvažují na čtyřicetinásobnou změnu hybridizace. To znamená, jak očekáváno pro 2 chybná párování, že každé z nich destabilizuje Tm o 7 až 8 °C (srovnej 7x8= 56-krát). Použitím kompetiméru a chybně párované nukleotidové sondy alkalické fosfatázy (vzorek 4 = 0,4 RLU) se sníží šumivé pozadí přibližně tisícinásobně. Vzorek 5 je kontrolní a v podstatě nemá šumivé pozadí (0,1 RLU). To je podle očekávání, protože značená nukleotidová sonda 32 nemá detekovatelnou homologii se zachycovacím extendérem.
Tabulka 8
Účinek chybného párování pár bází na hybridizaci
Průměr
Vzorek První Druhá RLU1 %
č. hybridizace hybridizace (n = 6) CV2
1 34+35 30+32 399 7
2 33+34+35 30+32 30 9
3 34+35 31+32 9 6
4 33+34+35 31+32 0,4 4
5 34+35 32 0,1 11
RLU = relativní jednotky světla % CV (relativní chyba) = směrodatná odchylka/průměr x 100
Při testech hybridizace je použití kompetimérů pro všechny zachycovací extendéry nepraktické, protože je obvykle 5 až 10 zachycovacích extendérů na test. Kromě toho tento příklad ukazuje, že preinkubace s kompetimérem není ani účinná, ani jednoduše nevyužívá 15 % substituce bází (s isoC, iso G), například 2 bází ze 13, v univerzálních sekvencích. Očekávalo by se použití 30 % substituce bází (3 z 10), ke snížení nespecifické hybridizace jinak bezvadného komplementu párovaných bází na přibližně tisícinásobek (30% chybné párování odpovídá přibližně změně 30 °C v Tm a zde nastává přibližně desetinásobný pokles vázání na každých 10 °C změny v Tm).
Příklad 6
Chemická syntéza 2'-deoxyisoguanosinu
Syntéze 2'-deoxyisoguanosinu z 2'-deoxyguanosinu se provádí dále popsaným způsobem.
Stupeň 1
Monohydrát 2'-deoxyguanosinu (50 mmol) a imidazol (200 mmol) se vysuší společným odpařením s 500 ml dimethylformamidu (DMF) a odparek se rozpustí v 500 ml dimethylformamidu. K tomuto roztoku se přidá terc.-butyldimethylsilylchlorid (150 mmol) a reakční směs se nechá míchat za teploty místnosti po dobu 18 hodin. K reakční směsi se přidá methanol (30 mmol) a po 25 minutách se rozpouštědla odpaří za sníženého tlaku. Poté co se rozpouštědla odpařila, odparek se rozpustí v 1 litru dichlormethanu, vzniklý roztok se promyje 1 litrem 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 1 litrem z 80 % nasyceného roztoku chloridu sodného, organická fáze se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha. Dostane se surová látka (30 g), která se přímo rozpustí ve 2 litrech horkého ethanolu. Pomalým ochlazováním na teplotu 20 °C, s následujícím uložením za teploty 4 °C po dobu 20 hodin, se připraví čistý 3',5'-TBDMS2-2'-deoxyguanosin (výtěžek odpovídá 65 %).
Stupeň 2
3',5'-TBDMS2-2'-deoxyguanosin (12 mmol) se suspenduje ve 125 ml dichlormethanu, který obsahuje triethylamin (150 mmol) a N,N-dimethylaminopyridin (100 mg). K reakční směsi se přidá 4-toluensulfonylchlorid (40 mmol) za teploty 0 °C a reakční směs se míchá za teploty místnosti po dobu 20 hodin. Po této době se veškerá tuhá látka rozpustí a dostane se světle žlutý roztok. Reakce se přeruší přidáním 50 ml 5 % vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného za míchání během 1 hodiny. Reakční směs se zředí 300 ml dichlormethanu, promyje 300 ml 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 300 ml z 80 % nasyceného roztoku chloridu sodného, organická fáze se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha. Dostane se surová látka (8,9 g), která se podrobí velmi rychlé chromátografii za použití gradientu 1 až 4 % methanolu v dichlorraethanu. Tak se získá 7,95 g čistého O6-(4-toluensulfonyl)-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu (11 mmol).
Stupeň 3 g O6-(4-toluensulfonyl)-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu (17 mmol) se suspenduje ve 300 ml acetonitrilu.
K suspenzi se potom přidá methylpyrrolidin (17 ml) a suspenze se míchá po dobu 1 hodiny, aby se dostal čirý roztok. Chromatografická analýza na tenké vrstvě ukazuje, že veškerá výchozí látka se konvertovala na základní linii materiálu.
K reakční směsi se přidá 11 g 4-(methylthio)fenolu (85 mmol) a roztok se míchá po dobu 60 hodin. Po odpaření roztoku na malý objem se k odparku přidá 600 ml ethylacetátu. Získaný roztok se třikrát extrahuje vždy 400 ml 0,3 M roztoku hydroxidu sodného a 400 ml z 80 % nasyceného roztoku chloridu sodného, organická fáze se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha, aby se dostalo 11,55 g požadované sloučeniny. Velmi rychlou chromatografií na silikagelu, za použití 4 až 5% methanolu v dichlormethanu při gradiuentovém eluování, se dostane 8,16 g O6-[4-methylthio)fenyl]-3’,5'-O-TBDMS2~2'-deoxyguanosinu (11 mmol).
Stupeň 4 g O6-[4-methylthio)fenyl]-3',5'-O-TBDMS2~2'-deoxyguanosinu (6,5 mmol) se rozpustí v 65 ml dichlormethanu za teploty 0 °C a k roztoku se přikape 6,5 ml terc.-butylnitritu. Roztok se nechá ohřát na teplotu místnosti a přitom se ze směsi uvolňuje plyn (dusík). Po 40 minutách, když chromatografická analýza na tenké vrstvě ukazuje na kvantitativní spotřebu výchozí sloučeniny a na vývoj nové, pomaleji migrující skvrny, se přebytek terč.-butylnitritu odstraní dvojnásobným společným odpařením vždy se 100 ml toluenu za sníženého tlaku. Odparek sestávající surové sloučeniny se vyčistí tím, že se podrobí velmi rychlé chromatografií na silikagelu, za použití 4 až 5% methanolu v dichlormethanu při gradientovém eluování, aby se dostalo 2,75 g O6-[(4-methylthio ) fenyl ] -3 ', 5 ' -O-TBDMS2-2 ' -deoxanthosinu (4,45 mmol).
Stupeň 5
Všechen vyčištěný (2,75 g) O6-[(4-methylthio)fenyl]-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxanthosinu (4,45 mmol) se rozpustí v 50 ml methanolu. K roztoku se přidá koncentrovaný vodný roztok hydroxidu amonného (50 ml) a smés se zahřívá v těsně uzavřené tlakové nádobě za teploty 100 °C po dobu 4 hodin. Po ochlazení se rozpouštědla společně odpaří s ethanolem za sníženého tlaku a dostane se 1,8 g surové sloučeniny (3,6 mmol). Čištěním rekrystalizací z horkého ethanolu se dostane vzorek čistého 3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyisoguanosinu. Tato sloučenina je v každém ohledu (UV, TLC, NMR a MS) identická se vzorkem připraveným publikovanou, fotolytickou cestou [Switzer a kol., citováno výše (1993)].
Příklad 7
Kontrola nespecifické hybridizace amplifikátoru a nukleotidové sondy alkalické fosfatázy k zachycovacím extendérům
A. Konstrukce isoC,isoG bDNA amp a isoC,isoG ap nukleotidové sondy
Zesílený multimér podobný hřebenu s 15 místy (amp) se konstruuje jak již bylo popsáno v PCT publikaci č. WO 92/02526. Ramena se ligují na hřeben za použití 12-nukleotidového linkéru a T4 DNA ligázy, jak je popsáno. Nukleotidová sonda alkalické fosfatázy (ap) se konstruuje z oligonukleotidu, který obsahuje aminovou funkční skupinu, jak je popsáno v US patentu č. 5 124 246. Použijí se tyto sekvence:
Sekvence (5 . -> 3 . ) Sekvence ID
AGT FAJ CGC TJC......... FGT AFC AAJ amp opakovaná sekvence (rameno)
ATC ACG AAC TCA TCA CGA ACT C amp vedoucí sekvence (hřeben)
GFA FTT GJT ACJ GCG FTJ ACT......L ap sekvence nukleotidové sondy
F = isoC,
J = isoG,
L = amin s dlouhým řetězcem
B. Příprava zachycovací extendérových (CE) sekvencí
Zachycovací extendéry pro TNF-α, interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-6 a τ-interferon (IFNt) cílové oblasti se připraví za použití normalizovaných metod pro přípravu fosforamiditu. Testované zachycovací extendérové sekvence jsou:
TNF-α CE pul
TCCAGCTGGAAGACCCCTCCCAGATAGATGGGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7140.tnf.21 CGATTGATCTCAGCGCTGAGTCGGTCACCCTTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7141.tnf.22 TGCCCAGACTCGGCAAAGTCGAGATAGTCGGGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7142.tnf.23 CCTCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGACCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7143.tnf.24 CAGGGGAGGCGTTTGGGAAGGTTGGATGTTCGTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7144.tnf.25 TGTCTGAAGGAGGGGGTAATAAAGGGATTGGGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7145.tnf.26 CAATTCTCTTTTTGAGCCAGAAGAGGTTGAGGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7146.tnf.27 AAGTTCTAAGCTTGGGTTCCGACCCTAAGCCCCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7147.tnf.28
IL-6 CE pul
CTGGACAGCTCTGGCTTGTTCCTCACTACTCTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
CTGCAGGAACTGGATCAGGACTTTTGTACTCATZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
GGTGGTTATTGCATCTAGATTCTTTGCCTTTTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
CGTCAGCAGGCTGGCATTTGTGGTTGGGTCAGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
GTCCTGCAGCCACTGGTTCTGTGCCTGCAGCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
CTTAAAGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGTCATZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
CCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTGCAGGAACTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
7270.116.15
7271.116.16
7272.116.17
7273.116.18
7274.116.19 7275.il6.20; 7276.il6.21
IFNt CE pul
CATCGTTTCCGAGAGAATTAAGCCAAAGAAGTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8013.infg.1 GAGCTGAAAAGCCAAGATATAACTTGTATATTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8014. infg. 2 GCAGTAACAGCCAAGAGAACCCAAAACGATGCAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8015.infg.3 AAGGTTTTCTGCTTCTTTTACATATGGGTCCTGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8016. inf g. 4 TACATCTGAATGACCTGCATTAAAATATTTCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8017 . infg. 5 CAAAATGCCTAAGAAAAGAGTTCCATTATCCGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8018. infg. 6
IL-2 CE pul
GAGTTGAGGTTACTGTGAGTAGTGATTAAAGAGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8428. ii-2.1 AAGACAGGAGTTGCATCCTGTACATTGTGGCAGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8429. il-2.2 TGTTTGTGACAAGTGCAAGACTTAGTGCAATGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8430. il-2.3 GTGTTTTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCACZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8431.il-2.4 GTAAATCCAGMAGTAAATGCTCCAGTTGTÁGCTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8432. il-2.5
IL-4 CE pul
ACACTTTGAATATTTCTCTCTCATGATCGTCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8720. il-4.15 TCAAAAACTCATAAATTAAAATATTCAGCTCGAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8721. il-4.16 TATAAATATATAAATACTTAAAAAATAAAGCTAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8722. il-4.17 TAGATTCTATATATACTTTATTTTATGATGAGTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8723. il-4.18
Poznámka:
Z = triethylenglycerolový mezník
C. Způsob měření nespecifické hybridizace (NSH) mezi CE a amp a CE a ap
Celkem 100 fmol jednotlivých zachycovacích extendérových nukleotidových sond nebo pulu sestávajícího z celkem 100 fmol každého zachycovacího extendéru se inkubuje v mikrojamkách za teploty 53 °C po dobu 1 hodiny. Po dvojím promytí promývacím roztokem A (0,1 x SSC, 0,1 % SDS) se jamky inkubují po dobu 30 minut v zesíleném zředěném +/ne-isoC,isoG amp, popsaném ve WO 95/16055, nebo isoC,isoG amp, popsaném v příkladu 7A výše. Po dvou dalších promytích promývacím roztokem A, se jamky inkubují po dobu 15 minut v amp ředidle (5 x SSC, 50% proteináza K, digerováno koňským šerem) s obsahem bud ne-isoC,isoG ap nukleotidové sondy, jako je popsáno ve WO 95/16055, nebo isoC,isoG ap nukleotidové sondy, jak je popsáno v příkladu 7A výše.
Používají se tyto definice:
AP NSB = pozadí ap nukleotidové sondy, pokud není přítomen žádný CE amp NSB = pozadí amp a ap nukleotidové sondy, pokud není přítomen žádný CE, menší ap NSB
AP NSH = RLU z CE vzorku méně amp, menší ap NSB
AMP NSH = RLU z CE vzorku - ap NSH - amp NSB - ap NSB.
D. Výsledky
Pět jednotlivých CE nukleotidových sond se testuje na nespecifickou hybridizací pozadí za použití 100 fm látky na jamku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce dále.
Nukleotidová
sonda,
oligo # AMP NSH iC AMP NSH AP NSH ÍC AP NSH
7,273 11,2 (0,2) 6,1 (0,2)
7,274 1,2 (0,1) 0,1 (0,2)
7,144 13,1 0,1 0,1 (0,2)
8,015 37,4 0,1 (0,0) (0,2
8,018 0,2 (0,1) 0,1 (0,1)
AMP NSB: ÍC AMP NSB: AP NSB: ÍC AP NSB:
žádná DNA 1,1 0,6 0,7 0,5
Hodnoty v závorkách jsou menší než 0 RLU.
AMP = ne-isoC,isoG amp, iC AMP = isoC,isoG amp,
AP = ne-isoC,isoG ap, iC AP = isoC,isoG ap
Nespecifické vázací pozadí v nepřítomnosti CE nukleotidových sond (AP-NSB a AMP-NSB) je zanedbatelné (< 1 RLU) pro všechny amp a ap nukleotidové sondy. Tři z extendérů projevují silnou (> 10 RLU) vzájemnou reaktivitu se současnou amp nukleotidovou sondou, která není vidět s isoC,isoG amp. Nukleotidová sonda ukazuje 6 RLU vzájemnou reaktivitu se současnou AP nukleotidovou sondou, která není vidět s isoC,isoG AP nukleotidovou sondou. Ve všech případech NSH s isoC,isoG nukleotidovou sondou je zanedbatelné. RLU hodnoty
- 71 menší než 1,0 jsou pokládány za nesignifikantní vzhledem k NSB.
Testuje se 5 pulů CE nukleotidových sond na nespecifickou hybridizaci pozadí se stejnými molekulami. Výsledky se uvádějí dále.
Oligo CE pul, (počet CE) AMP NSH ÍC AMP NSH AP NSH ÍC AP NSH
IL-2(5) 2,3 0,2 1,2 0,0
IL-4(4) (0,2) 0,2 0,0 0,0
IL-6(7) 16,0 0,2 4,7 0,0
TNF (8) 14,6 0,0 0,0 0,3
IFNg(6) 34,9 AMP NSB: (0,1) ÍC AMP NSB: 0,2 AP NSB: 0,1 ÍC AP NSB:
žádná DNA 1,7 1,1 0,4 0,5
vysvětlení zkratek viz legenda k předcházející tabulce.
Znovu, NSB všech amp a ap nukleotidových sond je zanedbatelné v porovnání s NSH. Čtyři z pěti pulů projevují signifikantní amp NSH, které jsou v rozmezí od 2,3 do 34,9 RLU, zatímco žádný z CE pulů nemá signifikantní NSH (< 1) s isoC,isoG amp. Dva z pulů mají signifikantní NSH s ap nukleotidovou sondou, zatímco žádný z pulů nemá signifikantní interakci s isoC,isoG ap nukleotidovou sondou. V tomto experimentu se na vzájemnou reaktivitu vyšetřuje 30 CE sekvencí.
Odborník v oboru, vyzbrojen schopností inkorporovat nové páry bází do formátů pro testy hybridizace, bude provádět náhradu amp vedoucí sekvence isoC,isoG vedoucí sekvencí a bude očekávat výsledek v nižších NSH hodnotách pro zde použitý isoC,isoG amp.
E. Kompletní křivky dávky a odezvy pro IL-2 a IL-6 s isoC,isoG amp a ap
Kompletní křivky dávka-odezva se vytvářejí pomocí testovacích řad ředění lidských buněk IL-2 a IL-6 mRNA.
Mez citlivosti se vypočítá jako počet buněk při S = 0. S je definována jako pos RLU - 2 std dev - (neg RLU + 2 std dev).
Výsledky jsou uvedeny v dále zařazené tabulce.
Test Současná mez citlivosti isoC/G mez citlivosti Násobek zlepšení
IL-2 41 000 3 000 12,6
IL-6 34 000 11 000 3,0
Citlivost se zlepší 12,6-násobně při testu IL-2
a trojnásobně při testu IL-6 za použití isoC/G amp a ap na místo nyní používaných molekul, které mají přirozené sekvence. Čím je větší šum s přirozenými sekvencemi, tím je větší zlepšení testu.
Tak byly objeveny nové způsoby pro vytváření signálu, který je více závislý na cílové oblasti při sendvičových testech hybridizace v roztokové fázi. Kromě toho je nalezen nový způsob syntézy 2'-deoxyisoguanosinu. Třebaže se výhodná
- 73 provedení předmětu vynálezu popisují s určitými podrobnostmi, je třeba vzít v úvahu, že se mohou provést zřejmé změny, aniž by se vybočilo ze smyslu a rozsahu tohoto vynálezu, jak je vymezen v připojených patentových nárocích.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Test hybridizace nukleové kyseliny, pro detekci analytů nukleové kyseliny za použití většího počtu testovaných komponent, z nichž každá obsahuje alespoň jeden hybridizu jící oligonukleotidový segment, vyznačující se tím, že se inkorporuje do alespoň jednoho hybridizujícího oligonukleotidového segmentu první nukleotidová jednotka, která nebude účinně párovat bázi s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U) za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází.
  2. 2. Způsob podle nároku l,vyznačující se tím, že první nukleotidová jednotka je schopna tvořit pár bází s druhou, komplementární nukleotidovou jednotkou.
  3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že první a druhé nukleotidové jednotky jsou navzájem zaměnitelně zvoleny ze souboru komplementárních párů bází, který sestává z látek obecného vzorce I až IV (III) (iv) ve kterýchžto vzorcích
    R představuje hlavní řetězec, které dovolí prvním a druhým nukleotidovým jednotkám vytvořit pár bází s komplementární nukleotidovou jednotkou, pokud se inkorporuje do polynukleotidu, a
    R' znamená atom vodíku, methyl, a- nebo β-propinyl nebo atom bromu, fluoru nebo jodu.
  4. 4. Test hybridizace nukleové kyseliny, pro detekci analytu nukleové kyseliny za použití většího počtu testovaných komponent, z nichž každá obsahuje alespoň jeden hybridizující oligonukleotidový segment, vyznačující se tím, že se inkorporuji Tml hybridní komplexy a Tm2 hybridní komplexy tak, že přísně řízený test se může řídit k selektivní destabilizaci Tml hybridních komplexů.
  5. 5. Sendvičový test hybridizace v roztokové fázi, pro detekci analytu nukleové kyseliny ve vzorku, za použití většího počtu testovaných komponent, z nichž každá obsahuje alespoň jeden hybridizující oligonukleotidový segment, který zahrnuje a) vázání analytu přímo nebo nepřímo k tuhému základu, b) značení analytu a c) detekci přítomnosti značení spojeného s analytem, vyznačující se tím, že se inkorporuje do alespoň jednoho hybridizujícího oligonukleotidového segmentu první nukleotidová jednotka, která nebude účinně párovat bázi s adenosinem (A), thymidinera (Τ), cytidinem (c), guanosinem (G) nebo uridinem (U) za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází.
  6. 6. Sendvičový test hybridizace v roztokové fázi, pro detekci analytu nukleové kyseliny ve vzorku, za použití většího počtu testovaných komponent, z nichž každá obsahuje alespoň jeden hybridizující oligonukleotidový segment, který zahrnuje a) vázání analytu přímo nebo nepřímo k tuhému základu, b) značení analytu a c) detekci přítomnosti značení spojeného s analytem, vyznačující se tím, že se inkorporuji Tml hybridní komplexy a Tm2 hybridní komplexy tak, že přísně řízený test se může řídit k selektivní destabilizaci Tml hybridních komplexů.
    Způsob syntézy sloučeniny struktury obecného vzorce ve kterém
    R1 je zvolen ze souboru sestávajícího z atom vodíku, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, atomu halogenu, aminoskupiny, alkylové skupiny, allylu a skupiny vzorce -OR2, kde R2 znamená alkylovou skupinu, allyl, silyl nebo zbytek fosfátu, vyznačující se tím, že se
    a) nechá reagovat sloučenina struktury obecného vzorce s reakčním prostředkem vhodným k ochraně hydroxyskupi78 ny jak v poloze 3', tak v poloze 5',
    b) nechá reagovat sloučenina ze stupně a) s reakčním prostředkem vhodným k převedení 06-oxyskupiny na funkční skupinu, která je citlivá k náhradě nukleofilní skupinou, za vzniku funkcionalizované O6-skupiny,
    c) oxiduje 2-aminoskupina ve sloučenině ze stupně b),
    d) nechá reagovat sloučenina ze stupně c) s nukleofilním prostředkem, k náhradě funkcionalizované O6-skupiny, a
    e) nechá reagovat sloučenina ze stupně d) s reakčním prostředkem, který je vhodný k odstranění chránící skupiny z chráněných hydroxyskupin v poloze 3' a 5'.
  7. 8. Způsob syntézy 2'-deoxyisoguanosinu, v y z na čujícísetím, žese
    a) konvertuje 2'-deoxyguanosinu na 3',5'-O-(terc.-butyldi methylsilyl)2-2'-deoxyguanosin, reakcí 2'-deoxyguanosinu s TBDMSchloridera, kde TBDMS představuje terc.-butyldimethylsilyl,
    b) konvertuje 3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosin na 06-(4-toluensulfonyl)-3',5'-O-TBDMS2“2'-deoxyguanosin, reakcí 3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu se 4-toluensulfonylchloridem,
    c) nahradí O6-(4-toluensulfonylová) skupina zpracováním O6-(4-toluensulfonyl)-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu s fenolem, za vzniku 06-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'-0-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu,
    d) oxiduje 2-aminoskupina 06-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'
    -O-TBDMS2-2'-deoxyguanosinu na alkoxylovou funkční skupinu, zpracováním O6-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'-O -TBDMS2-2'-deoxyguanosinu s terč.-butylnitritem za neutrálních podmínek, za vzniku O6-[4-(methylthio)fenyl]-3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyxantosinu, a
    5) vytěsní O2-[4-(methylthio)fenylová] skupina O6-[4-(methylthio)fenyl]-3',5’-O-TBDMS2-2'-deoxyxantosinu hydroxidem amonným za zvýšené teploty, za vzniku 3',5'-O-TBDMS2-2'-deoxyisoguanosinu.
  8. 9. Souprava pro detekci analytu nukleové kyseliny ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu hybridizující oligonukleotidovou sondu, jejíž segment je schopen tvořit hybridní komplex s analytem, a prostředek pro detekci hybridního komplexu, ve kterém alespoň jedna hybridizující oligonukleotidová sonda obsahuje první nukleotidovou jednotku, která za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází, nebude účinně párovat báze s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U).
  9. 10. Souprava podle nároku 9,vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje
    a) sadu zachycovacích nukleotidových sond, přičemž zachycovací nukleotidové sondy obsahují první nukleotidovou jednotku, která nebude účinně párovat báze s A, T, C, G nebo U za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází,
    b) sadu zachycovacích extendérových molekul, obsahujících první a druhé hybridizující oligonukleotidové segmenty, kde první hybridizující oligonukleotidový segment je schopen tvořit hybridní komplexy se zachycovacími nukleotidovými sondami a druhý hybridizující oligonukleotidový segment je schopen tvořit hybridní komplexy s předem určenými segmenty analytu nukleové kyseliny,
    c) značené extendérové molekuly obsahující třetí a čtvrté hybridizující oligonukleotidové segmenty, kde třetí hybridizující oligonukleotidový segment je schopen tvořit hybridní komplexy se segmenty analytu nukleové kyseliny odlišnými od segmentů, ke kterým se váže sada zachycovacích extendérových molekul,
    d) popřípadě preamplifikátorovou molekulu obsahující páté a šesté hybridizující oligonukleotidové segmenty, kde hybridizující oligonukleotidové segmenty obsahují první nukleotidovou jednotku, která nebude účinné párovat báze s A, T, C, G nebo U za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází, a kde preamplifikátorová molekula je schopna vytvářet hybridní komplexy se značenými extendérovými molekulami a větším počtem amplifikátorových multimérů,
    e) amplifikátorový multimér obsahující sedmé a osmé hybriL dizující oligonukleotidové segmenty, kde hybridizující oligonukleotidové segmenty obsahují první nukleotidovou jednotku, která nebude účinně párovat báze s A, T, C, G nebo U za podmínek, při kterých se tvoří A-T a G-C páry bází, a kde amplifikátorový multimér je schopen tvořit hybridní komplexy se značenými extendérovými molekulami nebo preamplifikátorovými molekulami a větším počtem identických oligonukleotidových subjednotek, a
    f) značené nukleotidové sondy obsahující značení, které jsou určeny k vytvoření hybridních komplexů s identickými oligonukleotidovými subjednotkami a které přímo nebo nepřímo poskytují detekovatelný signál.
  10. 11. Oligonukleotid vhodný jako aptamér, vyznačující se tím, že zahrnuje intramolekulární oligonukleotidový hybridní komplex obsahující větší počet komplementárních párů bází, z nichž alespoň jedna obsahuje komplementární nepřirozené nukleotidové jednotky, které nebudou účinně párovat bázi s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U) za podmínek, při kterých se běžně tvoří A-T a G-C páry bází, a ve které nepřirozená nukleotidová jednotka je obsažena v oligonukleotidovém segmentu, v němž specifičnost párů bází není udržována pro uchování sekundární struktury aptaméru.
  11. 12. Způsob přípravy aptaméru, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje
    a) získání cílové molekuly,
    b) uvedení cílové molekuly do styku s randomizovaným pulem oligonukleotidů za podmínek, které podporuji vázání oligonukleotidů k cílové molekule,
    c) oddělení oligonukleotidů, které se váží k cílové molekule a vytváří komplex oligonukleotidů s cílovou oblastí z oligonukleotidů, který není vázán k cílové molekule,
    d) disociací oligonukleotidu z komplexu oligonukleotidu s cílovou oblastí,
    e) zesílení oligonukleotidu za použití reakce polymerázového řetězce,
    f) opakování stupňů b)) až e) alespoň jednou za vzniku konečného aptamérového konstruktu a
    g) náhradu alespoň jedné nukleotidové jednotky v konečném aptamérovém konstruktu nepřirozenými nukleotidovými jednotkami, které nebudou účinně párovat bázi s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U) za podmínek, při kterých se běžně tvoří A-T a G-C páry bází.
  12. 13. Antimediátorová molekula obsahující první a druhé hybridizující segmenty, vyznačující se tím, že první hybridizující segment je schopen tvořit hybridní komplex s cílovým oligonukleotidem a druhý segment zahrnuje alespoň jednu nukleotidovou jednotku, která nebude účinně párovat bázi s adenosinem (A), thymidinem (T), cytidinem (C), guanosinem (G) nebo uridinem (U) za podmínek, při kterých se běžně tvoří A-T a G-C páry bází, a je schopen vytvářet hybridní komplex s druhou antimediátorovou molekulou.
CZ97589A 1994-08-30 1995-08-30 Reduction of non-specific hybridization by making use of novel base matching schemes CZ58997A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/298,073 US5681702A (en) 1994-08-30 1994-08-30 Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
PCT/US1995/011115 WO1996006950A1 (en) 1994-08-30 1995-08-30 Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ58997A3 true CZ58997A3 (en) 1997-07-16

Family

ID=23148897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ97589A CZ58997A3 (en) 1994-08-30 1995-08-30 Reduction of non-specific hybridization by making use of novel base matching schemes

Country Status (21)

Country Link
US (4) US5681702A (cs)
EP (2) EP0778898B1 (cs)
JP (4) JP4461278B2 (cs)
KR (1) KR100218113B1 (cs)
CN (1) CN100335649C (cs)
AT (2) ATE259374T1 (cs)
AU (1) AU708194B2 (cs)
BG (1) BG101246A (cs)
BR (1) BR9508674A (cs)
CA (1) CA2197901A1 (cs)
CZ (1) CZ58997A3 (cs)
DE (2) DE69532565T2 (cs)
ES (2) ES2187571T3 (cs)
FI (1) FI970803A (cs)
HU (1) HUT77754A (cs)
MX (1) MX9701419A (cs)
NO (1) NO970884L (cs)
NZ (1) NZ292451A (cs)
PL (1) PL318933A1 (cs)
SK (1) SK25497A3 (cs)
WO (1) WO1996006950A1 (cs)

Families Citing this family (300)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4140463A1 (de) * 1991-12-09 1993-06-17 Boehringer Mannheim Gmbh 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben
CA2206451C (en) * 1994-12-09 2002-11-26 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for suppressing nonspecific hybridization in primer extension method
US5631146A (en) * 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
JP2000500342A (ja) 1995-11-15 2000-01-18 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブおよび関連する方法およびキット
DE69719057T2 (de) * 1996-07-12 2003-12-04 Tm Technologies Inc., Woburn Verfahren zur signalverstärkung
WO1998002582A2 (en) 1996-07-16 1998-01-22 Gen-Probe Incorporated Methods for detecting and amplifying nucleic acid sequences using modified oligonucleotides having increased target specific t¿m?
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
US6009480A (en) * 1997-09-12 1999-12-28 Telxon Corporation Integrated device driver wherein the peripheral downloads the device driver via an I/O device after it is determined that the I/O device has the resources to support the peripheral device
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
ES2320604T3 (es) * 1997-10-28 2009-05-25 Los Alamos National Security, Llc Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo.
BR9814271A (pt) * 1997-12-12 2001-03-20 Digene Corp Determinação de doenças relacionadas com o vìrus do papiloma humano
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US20070166741A1 (en) * 1998-12-14 2007-07-19 Somalogic, Incorporated Multiplexed analyses of test samples
EP1051517A2 (en) 1998-01-27 2000-11-15 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6686150B1 (en) 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6458559B1 (en) 1998-04-22 2002-10-01 Cornell Research Foundation, Inc. Multivalent RNA aptamers and their expression in multicellular organisms
CA2365125A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Paul D. Grossman Probe/mobility modifier complexes for multiplex nucleic acid detection
US7960540B2 (en) * 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
AU777499B2 (en) * 1999-04-08 2004-10-21 Gen-Probe Incorporated Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
EP1181304B1 (en) 1999-04-08 2007-10-10 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US20080318889A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US20080318890A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US8114850B2 (en) * 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
WO2000063437A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8080380B2 (en) 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US20020045182A1 (en) * 1999-07-16 2002-04-18 Lynx Therapeutics, Inc. Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
US7078167B2 (en) * 1999-09-17 2006-07-18 Agilent Technologies, Inc. Arrays having background features and methods for using the same
US7122303B2 (en) 1999-09-17 2006-10-17 Agilent Technologies, Inc. Arrays comprising background features that provide for a measure of a non-specific binding and methods for using the same
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
WO2003074738A1 (en) * 2000-01-18 2003-09-12 Quantom Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
DK1259643T3 (da) 2000-02-07 2009-02-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming
EP1967595A3 (en) 2000-02-16 2008-12-03 Illumina, Inc. Parallel genotyping of multiple patient samples
CA2403708A1 (en) 2000-03-22 2001-09-27 Quantum Dot Corporation Methods of using semiconductor nanocrystals in bead-based nucleic acid assays
AU7125401A (en) * 2000-05-19 2001-12-03 David J Marshall Materials and methods for detection of nucleic acids
WO2001094632A2 (en) * 2000-06-02 2001-12-13 Bayer Corporation Highly sensitive gene detection and localization using in situ branched-dna hybridization
EP1313881A2 (en) * 2000-06-06 2003-05-28 TM Bioscience Corporation Capture moieties for nucleic acids and uses thereof
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US6548251B1 (en) 2000-09-05 2003-04-15 Fidelity Systems, Inc. Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides
US20020164576A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-07 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of Nrf2
US20020115058A1 (en) * 2000-09-22 2002-08-22 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of Pik3r1
US20030044803A1 (en) * 2000-09-22 2003-03-06 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of JAK1
AU2001296305B2 (en) * 2000-09-26 2007-12-06 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
CA2424817A1 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Quantum Dot Corporation Cells having a spectral signature, and methods of preparation and use thereof
US20050059031A1 (en) 2000-10-06 2005-03-17 Quantum Dot Corporation Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes
EP1325457A4 (en) * 2000-10-10 2007-10-24 Genencor Int LIBRARIES RICH IN INFORMATION
AU2002213175B2 (en) * 2000-10-14 2007-09-13 Luminex Corporation Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
US7374882B2 (en) * 2000-11-28 2008-05-20 Riken Method for base sequencing and biologically active nucleic acids
US20030232334A1 (en) 2000-12-22 2003-12-18 Morris David W. Novel compositions and methods for cancer
US20030165878A1 (en) * 2000-12-22 2003-09-04 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of MCM3AP
US7645441B2 (en) * 2000-12-22 2010-01-12 Sagres Discovery Inc. Compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRLR
US20030099963A1 (en) * 2000-12-22 2003-05-29 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of TBX21
US20030087252A1 (en) * 2000-12-22 2003-05-08 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRDM11
US7892730B2 (en) * 2000-12-22 2011-02-22 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods for cancer
US7820447B2 (en) * 2000-12-22 2010-10-26 Sagres Discovery Inc. Compositions and methods for cancer
US7700274B2 (en) * 2000-12-22 2010-04-20 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods in cancer associated with altered expression of KCNJ9
GB0101397D0 (en) * 2001-01-19 2001-03-07 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Suppression of non-specific nucleic acid amplication
US20030092157A1 (en) * 2001-03-16 2003-05-15 Hayden Michael R. Compositions, screening systems and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US20050003356A1 (en) * 2001-05-25 2005-01-06 Hayden Michael R. Diagnostic methods for cardiovascular disease, low hdl-cholesterol levels, and high triglyceride levels
EP2070939B1 (en) * 2001-05-25 2014-04-02 Duke University Modulators of pharmacological agents
CA2348042A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-04 Ann Huletsky Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus
EP2246438B1 (en) 2001-07-12 2019-11-27 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US20070098728A1 (en) * 2001-09-24 2007-05-03 Pedersen Finn S Novel compositions and methods in cancer
JP2005524384A (ja) * 2001-09-24 2005-08-18 ボストン　プローブス，インコーポレイテッド ゲノム核酸におけるランダム分布反復配列への検出可能なプローブ結合の抑制に関する方法、キットおよび組成物
US7070933B2 (en) * 2001-09-28 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Inversion probes
US20040126762A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
US20040166490A1 (en) * 2002-12-17 2004-08-26 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
EP1442137A4 (en) * 2001-11-07 2005-08-31 Applera Corp UNIVERSAL NUCLEOTIDES FOR NUCLEIC ACID ANALYSIS
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040197778A1 (en) * 2002-12-26 2004-10-07 Sagres Discovery, Inc. Novel compositions and methods in cancer
US20040180344A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-16 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
WO2003052128A1 (en) * 2001-12-19 2003-06-26 Quantibact A/S A method and a kit for determination of a microbial count
US20070184474A1 (en) * 2002-01-10 2007-08-09 Nichirei Corporation Process for amplifying DNA
AU2003217379A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Somalogic, Inc. Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US20030194705A1 (en) * 2002-03-01 2003-10-16 Schroth Gary P. Methods of using unnatural nucleobases for decoding
ATE419536T1 (de) 2002-03-05 2009-01-15 Univ Texas Biospezifische kontrastmittel
DE10211321A1 (de) * 2002-03-14 2003-09-25 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Abfangsonden beim Nachweis von Nukleinsäuren
US20040023267A1 (en) * 2002-03-21 2004-02-05 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
AU2003222117A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-13 Genentech, Inc. Methods and compositions for detection and quantitation of nucleic acid analytes
US7094537B2 (en) * 2002-04-30 2006-08-22 Agilent Technologies, Inc. Micro arrays with structured and unstructured probes
EP1534857B1 (en) 2002-06-20 2010-08-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotides using light harvesting multichromophores
US7144950B2 (en) 2003-09-17 2006-12-05 The Regents Of The University Of California Conformationally flexible cationic conjugated polymers
US7435542B2 (en) * 2002-06-24 2008-10-14 Cornell Research Foundation, Inc. Exhaustive selection of RNA aptamers against complex targets
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
EA007653B1 (ru) 2002-08-26 2006-12-29 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции обнаружения и анализа полинуклеотидов с помощью светособирающих полихромофоров
US20040157238A1 (en) * 2002-09-20 2004-08-12 Quinn John J. Method for detection of multiple nucleic acid sequence variations
US8394944B2 (en) * 2002-09-20 2013-03-12 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation
AU2004206246B2 (en) * 2003-01-17 2009-10-01 Luminex Corporation Nucleic acid amplification using non-standard bases
CA2860151A1 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein named 158p1d7 useful in the treatment and detection of bladder and other cancers
WO2004077014A2 (en) 2003-02-13 2004-09-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotide-binding protein interactions using light harvesting multichromophores
US20040170982A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
WO2004074321A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic gpcr targets in cancer
US7767387B2 (en) * 2003-06-13 2010-08-03 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
US20070218071A1 (en) * 2003-09-15 2007-09-20 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
EP1615942B1 (en) 2003-04-01 2016-03-16 Luminex Corporation Polymerase inhibitor and method of using same
US20040241661A1 (en) * 2003-05-29 2004-12-02 Arindam Bhattacharjee Pseudo single color method for array assays
SI1629088T1 (sl) 2003-05-30 2012-08-31 Agensys Inc Antigen izvornih celic prostate (psca) in njegova podzaporedja
US20050239089A1 (en) * 2003-06-06 2005-10-27 Johnson Martin D Mobility cassettes
US20040259100A1 (en) 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
DE20310332U1 (de) * 2003-07-04 2004-11-11 Mwg-Biotech Ag Vorrichtung zum automatischen Öffnen und Schließen von Reaktionsgefäßen
EP1939779A3 (en) 2003-08-01 2009-04-01 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
EP2434420A3 (en) 2003-08-01 2012-07-25 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US20090163375A1 (en) 2003-09-09 2009-06-25 Bowman Christopher N Use of Photopolymerization for Amplification and Detection of a Molecular Recognition Event
US20070281896A1 (en) * 2003-09-30 2007-12-06 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20050136414A1 (en) * 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
WO2005081776A2 (en) * 2004-01-30 2005-09-09 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for the detection of sars
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
PT2860251T (pt) * 2004-02-12 2018-06-07 Archemix Llc Terapêuticas com aptâmeros úteis no tratamento de desordens relacionadas com o complemento
US20050266432A1 (en) * 2004-02-26 2005-12-01 Illumina, Inc. Haplotype markers for diagnosing susceptibility to immunological conditions
WO2005106035A2 (en) * 2004-04-09 2005-11-10 Cornell Research Foundation, Inc. Modular design and construction of nucleic acid molecules, aptamer-derived nucleic acid constructs, rna scaffolds, their expression, and methods of use
CN103045601B (zh) * 2004-04-22 2015-04-01 雷加多生物科学公司 改良的凝血因子调节物
EP2441769B1 (en) 2004-05-04 2014-05-07 Repligen Corporation Design, synthesis and assembly of synthetic nucleic acids
EP2322654A1 (en) 2004-05-14 2011-05-18 Rosetta Genomics Ltd MicroRNAs and uses thereof
AU2005243410B2 (en) 2004-05-14 2010-04-22 Rosetta Genomics Ltd. Micronas and uses thereof
US20060052947A1 (en) * 2004-05-17 2006-03-09 Evelyn Hu Biofabrication of transistors including field effect transistors
EP1756562A1 (en) 2004-05-21 2007-02-28 Atonomics A/S Surface acoustic wave sensor comprising a hydrogel
EP2583981A3 (en) 2004-05-28 2013-07-31 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
US7827558B2 (en) * 2004-06-30 2010-11-02 Devicevm, Inc. Mechanism for enabling a program to be executed while the execution of an operating system is suspended
KR100663992B1 (ko) 2004-07-05 2007-01-02 (주)바이오메드랩 인유두종 바이러스의 유전형을 분석하기 위한 특이도 높은 프로브 선택방법 및 그 선택된 프로브
US20060024677A1 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
CA2594458C (en) 2005-01-10 2016-08-23 The Regents Of The University Of California Cationic conjugated polymers suitable for strand-specific polynucleotide detection in homogeneous and solid state assays
US8063196B2 (en) * 2005-02-01 2011-11-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Highly orthogonal universal sequences for use in nucleic acid assays
DE602006012455D1 (de) * 2005-03-03 2010-04-08 Ca Nat Research Council Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis und zur analyse von nukleinsäuren mittels signalverstärkung
WO2006101913A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 Eragen Biosciences, Inc. Methods for detecting multiple species and subspecies of neiserria
EP1863848A4 (en) 2005-03-31 2009-09-23 Agensys Inc CORRESPONDING ANTIBODIES AND MOLECULES THAT ATTACH PROTEINS 161P2F10B
US20090214536A1 (en) 2005-04-07 2009-08-27 Guoying Yu CACNA1E in Cancer Diagnosis, Detection and Treatment
US20090220495A1 (en) 2005-04-07 2009-09-03 Abdallah Fanidi Cancer Related Genes (PRLR)
WO2006122002A2 (en) * 2005-05-09 2006-11-16 Panomics, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
DE602006020715D1 (de) 2005-05-12 2011-04-28 Affymetrix Inc Multiplex-assays für verzweigtkettige dna
CA2610863C (en) 2005-06-07 2017-01-17 Eragen Biosciences, Inc. Methods for detection and typing of nucleic acids
US20070087360A1 (en) * 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
WO2007001986A2 (en) 2005-06-20 2007-01-04 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations
US8481697B2 (en) 2005-07-01 2013-07-09 Dako Denmark A/S Nucleic acid base pairs
US7927798B2 (en) * 2005-10-05 2011-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
US7838221B2 (en) 2005-10-11 2010-11-23 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
US11834720B2 (en) 2005-10-11 2023-12-05 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) of MREJ types xi to xx
EP1951905B1 (en) 2005-11-10 2012-04-11 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids
EP2952894B1 (en) * 2006-01-17 2017-08-30 Somalogic, Inc. Kits comprising aptamers
US20070264694A1 (en) * 2006-04-07 2007-11-15 Eragen Biosciences, Inc. Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis
US8383338B2 (en) * 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
WO2008029295A2 (en) 2006-06-30 2008-03-13 Rosetta Genomics Ltd A method for detecting nucleic acids
JP2008043332A (ja) 2006-08-17 2008-02-28 Panomics Inc 組織スライドからの核酸定量
WO2009024834A2 (en) * 2006-12-05 2009-02-26 Rosetta Genomics Ltd Nucleic acids involved in viral infection
EP2118311B1 (en) 2006-12-19 2013-07-03 GeneOhm Sciences, Inc. Detection of staphylococcus aureus and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US7855054B2 (en) * 2007-01-16 2010-12-21 Somalogic, Inc. Multiplexed analyses of test samples
US7964356B2 (en) * 2007-01-16 2011-06-21 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US20080241140A1 (en) 2007-02-12 2008-10-02 Medical College Of Georgia Gene amplification of coactivator coaa and uses thereof
WO2008118844A1 (en) 2007-03-23 2008-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods involving aldose reductase inhibitors
EP2203749B1 (en) * 2007-10-05 2012-08-29 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed particle-based assays
US8906700B2 (en) 2007-11-06 2014-12-09 Ambergen, Inc. Methods and compositions for phototransfer
US20090131351A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-21 Antisoma Research Limited Methods, compositions, and kits for modulating tumor cell proliferation
US20090137405A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-28 Christopher Bowman Detection of nucleic acid biomarkers using polymerization-based amplification
EP2268664B1 (en) * 2007-12-03 2017-05-24 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Doc1 compositions and methods for treating cancer
ES2916498T3 (es) 2007-12-06 2022-07-01 Genalyte Inc Método para identificar una secuencia de nucleótidos en una especie desconocida de ácido nucleico; y dispositivo para llevar a cabo el método
US20090215050A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
US9249455B2 (en) * 2008-04-18 2016-02-02 Luminex Corporation Methods for detection and quantification of small RNA
US9051610B2 (en) * 2008-05-19 2015-06-09 Celish Fd, Inc. RNA in situ hybridization
US20090298709A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
US8703416B2 (en) 2008-07-17 2014-04-22 Somalogic, Inc. Method for purification and identification of sperm cells
WO2010062627A2 (en) 2008-10-27 2010-06-03 Genalyte Inc. Biosensors based on optical probing and sensing
CA2741650C (en) 2008-10-27 2017-09-05 Qiagen Gaithersburg Inc. Fast results hybrid capture assay and system
CA2747479C (en) * 2008-12-18 2017-11-21 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods and reagents for shortening incubation times in hybridization assays
CA2750338C (en) * 2009-01-28 2019-06-25 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
CN102388150A (zh) 2009-02-19 2012-03-21 吉恩奥姆科技公司 用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法
EP2399129B1 (en) 2009-02-20 2015-11-25 Michael P. Lisanti A method of diagnosis or prognosis of a neoplasm comprising determining the level of expression of a protein in stromal cells adjacent to the neoplasm
JP5419138B2 (ja) * 2009-03-27 2014-02-19 Ｎｅｃソフト株式会社 検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キット
WO2010117620A2 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
WO2010127228A1 (en) 2009-05-01 2010-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
US20100291706A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Millipore Corporation Dye conjugates and methods of use
CA2773320C (en) 2009-09-14 2018-02-20 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
US20130023433A1 (en) 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
WO2011050278A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Eragen Biosciences, Inc. Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity
CA2787781A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an hpv in a sample
ES2615728T3 (es) * 2010-01-29 2017-06-08 Qiagen Gaithersburg, Inc. Métodos y composiciones para una purificación y un análisis múltiple específico de secuencia de ácidos nucleicos
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
CA2798123C (en) 2010-05-05 2020-06-23 The Governing Council Of The University Of Toronto Method of processing dried samples using digital microfluidic device
US9422593B2 (en) 2010-05-19 2016-08-23 Qiagen Gaithresburg, Inc Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
US20120003648A1 (en) * 2010-07-01 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Signal Multiplexing and Signal Amplification
US9803236B2 (en) 2010-08-06 2017-10-31 Tsinghua University Microarray-based assay integrated with particles for analyzing molecular interactions
EP2612146A2 (en) * 2010-09-02 2013-07-10 Heed Diagnostics ApS Electrochemical detection of analyte
EP3034625B1 (en) 2010-10-21 2017-10-04 Advanced Cell Diagnostics, Inc. An ultra sensitive method for in situ detection of nucleic acids
WO2012055069A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Capitalbio Corporation Luminophore-labeled molecules coupled with particles for microarray-based assays
US9921165B2 (en) 2010-11-05 2018-03-20 Genalyte, Inc. Optical analyte detection systems and methods of use
EP2481812A1 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Molecular sexing of avian subjects
CN103403188B (zh) 2011-01-31 2016-03-30 伊鲁米那股份有限公司 用于降低核酸损伤的方法
JP2014511182A (ja) 2011-02-24 2014-05-15 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． Ｈｐｖ核酸を検出するための材料及び方法
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
EP2773650A1 (en) 2011-11-04 2014-09-10 Ohmx Corporation Novel chemistry used in biosensors
CN104040238B (zh) 2011-11-04 2017-06-27 汉迪拉布公司 多核苷酸样品制备装置
CA2856288A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Ichiro Hirao Nucleic acid fragment binding to target protein
US20130150426A1 (en) 2011-11-22 2013-06-13 Intermune, Inc. Methods of diagnosing and treating idiopathic pulmonary fibrosis
WO2013112881A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Thomas Jefferson University Mct protein inhibitor-related prognostic and therapeutic methods
EP3907506A1 (en) 2012-03-12 2021-11-10 The Board of Trustees of the University of Illinois Optical analyte detection systems with magnetic enhancement and methods of their use
US10870099B2 (en) * 2012-07-26 2020-12-22 Illumina, Inc. Compositions and methods for the amplification of nucleic acids
US9783841B2 (en) 2012-10-04 2017-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of target nucleic acids in a cellular sample
WO2014066704A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Genmark Diagnostics, Inc. Integrated multiplex target analysis
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
WO2014074785A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Methods of predicting outcome and treating breast cancer
US20140272959A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods of Hybridizing Probes to Genomic DNA
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
US20140274811A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
CN105228748B (zh) 2013-03-15 2017-10-10 金马克诊断股份有限公司 用于操纵可变形流体容器的系统、方法和设备
WO2014143637A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and compositions for enhancing immunoassays
EP2986290A4 (en) 2013-04-19 2017-01-04 Thomas Jefferson University Caveolin-1 related methods for treating glioblastoma with temozolomide
DK2992115T3 (da) 2013-04-30 2020-06-02 California Inst Of Techn Multipleksmærkning af molekyler ved stregkodning med sekventiel hybridisering
US10510435B2 (en) 2013-04-30 2019-12-17 California Institute Of Technology Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
WO2015157579A2 (en) 2014-04-09 2015-10-15 Dna2.0, Inc. Enhanced nucleic acid constructs for eukaryotic gene expression
WO2016077123A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
JP2018502309A (ja) 2014-11-11 2018-01-25 ジェンマーク ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 閉止サンプル調製・反応システムにおいて、アッセイを実行するための装置及びカートリッジ
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
EP3303548A4 (en) 2015-06-05 2019-01-02 Miroculus Inc. Evaporation management in digital microfluidic devices
CN108026494A (zh) 2015-06-05 2018-05-11 米罗库鲁斯公司 限制蒸发和表面结垢的空气基质数字微流控装置和方法
MX2018000729A (es) 2015-07-17 2018-09-06 Harvard College Métodos para amplificar las secuencias de ácido nucleico.
CN108368543B (zh) 2015-10-12 2023-06-13 领先细胞医疗诊断有限公司 高噪声样品中原位检测核苷酸变体及相关的组合物和方法
SI3394093T1 (sl) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx, Inc. Metode uporabe liganda OX40, ki kodira polinukleotid
US20190241658A1 (en) 2016-01-10 2019-08-08 Modernatx, Inc. Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies
BR112018067903A2 (pt) * 2016-02-29 2019-04-16 Iridia, Inc. métodos, composições e dispositivos para armazenamento de informações
US10859562B2 (en) 2016-02-29 2020-12-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
US10640822B2 (en) 2016-02-29 2020-05-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer
US10438662B2 (en) 2016-02-29 2019-10-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
WO2017180917A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
MA45051A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant la relaxine
CA3024509A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Mrna combination therapy for the treatment of cancer
JP7194594B2 (ja) 2016-05-18 2022-12-22 モデルナティエックス インコーポレイテッド 免疫調節ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの組み合わせ及びその使用
EP3463388B1 (en) 2016-05-24 2024-09-11 Emory University Particles with rna cleaving nucleobase polymers and uses for managing inflammatory disorders
IL302802A (en) 2016-07-05 2023-07-01 California Inst Of Techn Hybridization chain reaction based on a minimal initiator
CN109715781A (zh) 2016-08-22 2019-05-03 米罗库鲁斯公司 用于数字微流控设备中的并行液滴控制的反馈系统
US11300578B2 (en) 2016-09-19 2022-04-12 Roche Molecular Systems, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US20230192896A1 (en) 2016-11-23 2023-06-22 Bioverativ Therapeutics Inc. Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
CN110383061A (zh) 2016-12-28 2019-10-25 米罗库鲁斯公司 数字微流控设备和方法
JP7335165B2 (ja) * 2017-03-15 2023-08-29 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション デノボ合成されたコンビナトリアル核酸ライブラリー
US11623219B2 (en) 2017-04-04 2023-04-11 Miroculus Inc. Digital microfluidics apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
MA49395A (fr) 2017-06-14 2020-04-22 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour le facteur viii de coagulation
CN110892258A (zh) 2017-07-24 2020-03-17 米罗库鲁斯公司 具有集成的血浆收集设备的数字微流控系统和方法
CN111587149B (zh) 2017-09-01 2022-11-11 米罗库鲁斯公司 数字微流控设备及其使用方法
WO2019104152A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
MA50802A (fr) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des sous-unités alpha et bêta de propionyl-coa carboxylase pour le traitement de l'acidémie propionique
EP3714047A2 (en) 2017-11-22 2020-09-30 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
CA3096855A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Miroculus Inc. Control of evaporation in digital microfluidics
CN110577981B (zh) * 2018-06-07 2023-04-07 北京福安华生物科技有限公司 一种基于人工模拟核酸的分子信标
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
EP3846776A1 (en) 2018-09-02 2021-07-14 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
JP2022500436A (ja) 2018-09-13 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. 糖原病を処置するためのグルコース−６−ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド
MA53608A (fr) 2018-09-13 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour les sous-unités e1-alpha, e1-beta et e2 du complexe alpha-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée pour le traitement de la leucinose
AU2019339430A1 (en) 2018-09-14 2021-04-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide A1 for the treatment of Crigler-Najjar Syndrome
US20220152225A1 (en) 2018-09-27 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
TW202039531A (zh) 2018-11-14 2020-11-01 瑞士商優洛凡特科學公司 用於治療平滑肌功能不良之組成物及方法
JP7542444B2 (ja) 2018-12-14 2024-08-30 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 配列決定の間のアンラベル化ヌクレオチドによるフェージング減少
EP3899040A1 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Illumina Cambridge Limited Compositions for use in polyunucleotide sequencing
JP2022512265A (ja) 2018-12-17 2022-02-03 イルミナ ケンブリッジ リミテッド シーケンシング用プライマーオリゴヌクレオチド
CN111378746A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京福安华生物科技有限公司 检测CASP7基因rs12415607位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
WO2020210292A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Miroculus Inc. Multi-cartridge digital microfluidics apparatuses and methods of use
US11655465B1 (en) 2019-05-02 2023-05-23 Iridia, Inc. Enzymes and systems for synthesizing DNA
WO2020227642A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Modernatx, Inc. Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
WO2021016614A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Miroculus Inc. Digital microfluidics devices and methods of use thereof
US20220389412A1 (en) 2019-10-25 2022-12-08 Changping National Laboratory Methylation detection and analysis of mammalian dna
EP3859012A1 (en) 2020-02-03 2021-08-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Methods for amplification of genomic dna and preparation of sequencing libraries
US20230174567A1 (en) * 2020-05-22 2023-06-08 Merck Sharp & Dohme Llc Synthesis of fluorinated nucleotides
JP2023527875A (ja) 2020-06-01 2023-06-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルアラニンヒドロキシラーゼバリアント及びその使用
WO2022029159A1 (en) * 2020-08-04 2022-02-10 Theraxen S.A. Xeno-nucleotide based branched dna assay for the detection of nucleic acids
KR20230087443A (ko) 2020-08-06 2023-06-16 모더나티엑스, 인크. 페이로드 분자를 기도 상피로 전달하기 위한 조성물
US11837302B1 (en) 2020-08-07 2023-12-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels
EP4284925A1 (en) 2021-01-26 2023-12-06 California Institute of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204371A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
EP4314260A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
JP2024512463A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 イルミナ インコーポレイティッド 増幅されたライブラリからの望ましくない断片の選択的枯渇のためのブロッキングオリゴヌクレオチド
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4376815A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 ModernaTX, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2023009421A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
EP4408871A1 (en) 2021-10-01 2024-08-07 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
WO2023076605A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Modernatx, Inc. Lipid amines
TW202332467A (zh) 2021-10-29 2023-08-16 美商現代公司 脂質胺
EP4429644A1 (en) 2021-11-12 2024-09-18 ModernaTX, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2023126457A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Cambridge Ltd. Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
US11772093B2 (en) 2022-01-12 2023-10-03 Miroculus Inc. Methods of mechanical microfluidic manipulation
TW202345863A (zh) 2022-02-09 2023-12-01 美商現代公司 黏膜投與方法及調配物
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
CN115060912B (zh) * 2022-06-23 2024-02-02 南京浦光生物科技有限公司 检测目标抗体的试剂组合、试剂盒、检测系统及检测方法
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease
WO2024182301A2 (en) 2023-02-27 2024-09-06 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase (galt) for the treatment of galactosemia

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5135917A (en) * 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
JPH06508022A (ja) * 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
DE4140463A1 (de) * 1991-12-09 1993-06-17 Boehringer Mannheim Gmbh 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben
US5681697A (en) * 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor

Also Published As

Publication number Publication date
KR970705644A (ko) 1997-10-09
ES2215797T3 (es) 2004-10-16
EP1097939B1 (en) 2004-02-11
NO970884D0 (no) 1997-02-27
ES2187571T3 (es) 2003-06-16
BG101246A (en) 1998-03-31
FI970803A (fi) 1997-04-23
PL318933A1 (en) 1997-07-21
JP2008043341A (ja) 2008-02-28
NZ292451A (en) 1999-09-29
DE69528839T2 (de) 2003-03-27
US5681702A (en) 1997-10-28
NO970884L (no) 1997-04-28
CA2197901A1 (en) 1996-03-07
EP0778898B1 (en) 2002-11-13
US5780610A (en) 1998-07-14
WO1996006950A1 (en) 1996-03-07
ATE259374T1 (de) 2004-02-15
EP1097939A3 (en) 2001-05-30
DE69532565D1 (de) 2004-03-18
KR100218113B1 (ko) 1999-10-01
MX9701419A (es) 1997-05-31
JPH10506270A (ja) 1998-06-23
DE69528839D1 (de) 2002-12-19
HUT77754A (hu) 1998-07-28
JP2006217925A (ja) 2006-08-24
FI970803A0 (fi) 1997-02-26
AU3463195A (en) 1996-03-22
JP2008048741A (ja) 2008-03-06
BR9508674A (pt) 1997-11-18
CN100335649C (zh) 2007-09-05
EP1097939A2 (en) 2001-05-09
DE69532565T2 (de) 2004-12-16
CN1164260A (zh) 1997-11-05
AU708194B2 (en) 1999-07-29
SK25497A3 (en) 1997-12-10
US20010026918A1 (en) 2001-10-04
ATE227778T1 (de) 2002-11-15
US6232462B1 (en) 2001-05-15
EP0778898A1 (en) 1997-06-18
JP4461278B2 (ja) 2010-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ58997A3 (en) Reduction of non-specific hybridization by making use of novel base matching schemes
WO1996006950A9 (en) Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
JP3802925B2 (ja) バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ
JP3512818B2 (ja) 合成触媒オリゴヌクレオチド及び核酸の目標配列の切断方法
WO1990014353A1 (en) Crosslinking oligonucleotides
JP4398517B2 (ja) 新規な３′−変性されたオリゴヌクレオチド誘導体
JPH07504087A (ja) 蛍光性ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用
GB2479833A (en) Modified nucleotides
JPH01500353A (ja) ２′‐デオキシアデノシン誘導体を含む核酸検出用プローブ

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic