JPWO2006049297A1 - 新規なヌクレオシド若しくはヌクレオチド誘導体及びその利用 - Google Patents
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- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Abstract
Description
天然の二本鎖DNA中のAとT及びGとCは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。近年、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、Ohtsuki et al.,2001及びHirao et al.,2002では、プリンの6位にかさ高い置換基を導入した2−アミノ−6−ジメチルアミノプリン(x)と2−アミノ−6−チエニルプリン(s)、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもった2−オキソ(1H)ピリジン(y)をデザインし、このx−y、s−y塩基対形成をKlenowフラグメントによるDNA中への取り込み効率により調べた。その結果、鋳型中のxに対するyの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、sに対するyの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されていた(図1)。
従来より、放射性元素、蛍光色素等を用い核酸を標識することが行われている。しかし、天然型の塩基を含む核酸の場合は、核酸の末端のみが標識されるか、あるいは天然型塩基(A、T、G、C)のいずれか標識されたものを核酸内部に取り込む場合は、標識核酸が多数ランダムに取り込まれる、という本質的な問題がある。核酸の内部を、例えば蛍光色素を用いて、部位特異的に標識する方法が希求される。
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の5位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合していることを特徴とする。
及び
−NH−(CH2CH2O)n−NH−
(Barnacchi et al.,2001参照)、又は、
−[PO3]−(CH2)6−S−CH2−CO−、もしくは
−[PO3]−(CH2)7−NH−
(Tyagi et al.,1996参照)、のような構造のものが利用できる。
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、1より多くのヌクレオチドが、5’→3’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAを含む。二本鎖は、DNA/DNA、RNA/RNA、又はDNA/RNAであってもよい。また、DNAには、RNAを鋳型として逆転写してなるcDNAも含まれる。あるいは、核酸は3本鎖、4本鎖等も形成しうる。
本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、DNA又はRNA等の核酸に取り込むことが可能である。具体的には、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、sあるいはvを含む鋳型DNAを用いてT7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行うと、yの基質(yTP)が部位特異的に、sあるいはvに相補して、RNA中に取り込まれる。yは、その5位を化学的に修飾することができるので、種々の機能性のy誘導体をRNA中の特定の部位に取り込ませることが出来る。
本発明の一態様において、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はRNAi(RNA干渉)に用いられるRNAとして使用されうる。アンチセンスDNA若しくはRNAとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるDNA又はRNAである。標的とする遺伝子配列(センス鎖)の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスDNA又はRNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、RNAを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、in vitroセレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。RNAiとは、細胞内で見つかったシステムで、短いRNA断片が翻訳を制御するシステムであり、外部から標的遺伝子に対応した短いRNA断片を細胞内に加えたり、発現させたりすることで、標的遺伝子の発現を抑える手法である。
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
本発明の方法は、標的タンパク質の濃度を好ましくは0pmol−1000pmol、より好ましくは0pmol−500pmol、最も好ましくは1pmol−100pmolの範囲で、定量的に検出することが可能である。
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでよい。限外濾過膜は標的タンパク質のサイズに応じて適宜公知のものを使用することが可能である。
本発明はさらに、本発明の核酸を利用した核酸の二本鎖の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法I又はIIの方法を用いて行うことができる。
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
本発明はさらにまた、低分子化合物を検出する方法を提供する。
1)本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
(b)i)(CH3CO)2O、ピリジン、室温、ii)C2H5OH、還流、84%;
(c)CuI、Pd[P(C6H5)3]4、DMF、(C2H5)3N、室温、次いで、6−(トリフルオロアセタミド)カプロン酸 プロプ−2−イニルアミド、88%;
(d)CHCl2COOH、CH2Cl2、0℃、74%;
(e)2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オン/ジオキサン、トリ−n−ブチルアミン、ビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート、I2/H2O/ピリジン、ジオキサン、ピリジン、室温、次いでNH4OH;
(f)R−N−スクシンイミジルエステル/DMF、0.1M NaHCO3、aq.、室温、次いでNH4OH。
5−修飾塩基の導入部位に対して相補的な位置にsを含む2本鎖鋳型DNAを用いて、yTPまたは5位置換yTP(Ph−yTPおよびI−yTP)存在下で転写を行った。テオフィリン結合性アプタマー(41ヌクレオチド)中の番号付けは、非特許文献43に記載された33ヌクレオチドからなるアプタマーでの番号付けと対応させた。転写は20μlスケールで行い、反応組成は、40mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01%TritonX−100、1mM 天然型ヌクレオチド(NTP)および1mM yTP若しくは1mM Ph−yTP若しくは0.25mM I−yTP、2μCi[α−32P]ATP、2μM 鋳型DNAおよび2.5単位/μlのT7 RNAポリメラーゼである。
ピンク線:TAMRA−y(6); 水色線:Ph−y(6)
うす茶色:I−y(6); 黒色線:y(6)
点線白丸:y(23); 波線×:y(24)
オレンジ線:非修飾
3−(β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(178mg,505μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(5ml,0.1μM)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(183mg,540μmol)を加え、室温で1時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0→100:2)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(272mg,416μmol,収率82%)として得た。
実施例2 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例1で合成した3−(5−O−ジメトキシトリチルl−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(266mg,406μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(4ml,0.1μM)に溶解させ、酢酸無水物 (110μl,1.17mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をエタノール(50ml)に溶解させ、1時間半還流させた。濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:1→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(253mg,342μmol,収率84%)として得た。
実施例3 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例2で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(244mg,330μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を2回行った。ヨウ化銅(13.3mg,69.8μmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(36.4mg,31.5μmol)を加え、これらを無水DMF(2ml)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン(85μl,610μmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これにN−(2−プロピニル)−6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド(240mg,908μmol)のDMF(1.5ml)溶液を滴下し、室温で3.5時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/ヘキサン(1:1)で希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:3)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(255mg,291μmol,収率88%)として得た。
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C46H49F3N3O11 [M+1]+: calcd,876.3319; found,876.3369.
実施例4 3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例3で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(245mg,279μmol)を無水ジクロロメタン(46ml)に溶解させ、0℃で攪拌させながらジクロロ酢酸(470μl,5.69mmol)を加え、15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に室温で滴下し、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで20回以上抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(119mg,207μmol,収率74%)として得た。
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C25H31F3N3O9 [M+1]+: calcd,574.2012; found,574.2061.
実施例5 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (NH 2 −yTP)の合成
実施例4で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(58.3mg,102μmol)を50mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水に溶解させて室温で3時間攪拌した後に、凍結乾燥させた。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―15% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.19(t,1H,J=20.1Hz), −10.60(d,1H,J=20.1Hz), −8.84(d,1H,J=20.1Hz).
MS(ESI) for C19H29N3O15P3 [M?1]?: calcd,632.08 ; found,631.84.
実施例6 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (FAM−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(10μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.5ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5.5mg,11.6μmol)のDMF溶液(200μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(3.0μmol,30%)を得た。
31P NMR (109MHz,D2O) δ −21.75, −10.40, −9.38.
MS(ESI) for C40H39N3O21P3 [M−1]-: calcd,990.13; found,989.98.
実施例7 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (TAMRA−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(8μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.2ml)に溶解させ、5−カルボキシテトラメチルローダミン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5mg,9.5μmol)のDMF/水混合溶液(150/150μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液) 及びC18−HPLC (濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(4.0μmol,50%)を得た。
31P NMR (109MHz, D2O) δ −23.00− −22.00(m,1H), −11.50− −10.50(m,1H), −10.50− −9.50(m,1H).
MS(ESI) for C44H49N5O19P3 [M?1]-: calcd,1044.22; found,1043.90.
実施例8 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−[6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサンアミド]ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (Dansyl−x−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(9μmol)を50mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M ホウ酸ナトリウム水溶液(pH8.5, 1.8ml)に溶解させ、6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサン酸 N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(20mg,44μmol)のDMF溶液(1.8ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で48時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら1時間反応させた。これを減圧濃縮させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(6.2μmol,68%)を得た。
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.56, −10.54, −10.09. MS (ESI) for C37H51N5O18P3S1 [M−1]-: calcd,978.22; found,978.34.
実施例9 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP) の合成
1)3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン
実施例2で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(268mg、362μmol)を、CH3CN中に溶解し、乾燥するまで真空内で2回蒸発させた。残渣をDMF(2ml中)に、Cu(I)I(12.4mg、65.2μmol)及びPd[P(C6H5)3]4(37.7mg、32.6μmol)と共に溶解した。トリエチルアミン(91μl、652μmol)を加えた後、暗がりで、室温で攪拌した。溶液に、DMF(1,5ml)中の2,2−ジクロロ−N−プロプ−2−イニル−アセタミド(162mg、978μmol)を滴下して加え、溶液を室温で3.5時間攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈した。溶液をH2O及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の0.5−3%CH3OH)によって、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、89%)を精製した。ジクロロメタン(32ml)中の3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、323μmol)に、ジクロロ酢酸(323μl、3.92mmol)を加え、そして、0℃で15分間攪拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液に注ぎ、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで5回抽出した。混合した有機層をMgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の2−10%CH3OH)によって、産物(136mg、88%)を精製した。
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C19H21Cl2N2O8 (M+1): calcd, 475.0675; found, 475.0689.
2)3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP)
3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(47.5mg,100μmol)を50ml ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水(3ml)に溶解させて55℃で3時間攪拌した後に、減圧濃縮した。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)にて精製し、3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−アミノ−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸を得た。これを50mlの滅菌済みチューブに移し、0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,4ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(14.5mg,30.6μmol)のDMF溶液(1ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で12時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら30分反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(10.1μmol,10%)を得た。
31P NMR (109MHz, D2O) δ −22.40, −10.38, −10.38.
MS (ESI) for C34H28N2O20P3 [M?1]-: calcd,877.04; found,877.07.
実施例10 yTP誘導体の量子収率測定
蛍光スペクトルは、FAM−yTP(1.0μM)、TAMRA−yTP(1.0μM)、short FAM−yTP(1.0μM)及びDansyl−x−yTP(1.0μM)の10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)の溶液を25℃で、FP−6500蛍光測定装置(日本分光)により測定した。測定には3x3mmセルを用い、レスポンス 1.0s、感度low、スリットは励起側・蛍光側ともに3nmに固定してスペクトル測定を行った。結果を図4に示す。
F; 蛍光スペクトルの面積
A; 励起波長での吸光度
η; 屈折率(水: 1.33)
s; 標準物質
NH2−yTP、FAM−yTP、TAMRA−yTPのそれぞれを用いて、T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。
5’−CACTNCTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT−3’
N(5)=v(本発明)、s(本発明)又はA(対照)
T7プロモーターの非鋳型鎖21−mer(配列番号2)
5’−ATAATACGACTCACTATAGGG−3’
転写物(配列番号3)
5’−GGGAAUCCCGAGN’AGUG−3’
N’(13)=NH2−y、FAM−y又はTAMRA−y
天然型の基質と等量の修飾基質を加え、37℃、3時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液(20μl)を加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、20% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した。
実施例11に次いで、NH2−yが取り込まれたRNAについて、ヌクレオチドの組成分析を行った。
NH2−yが取り込まれたRNAを用いて、RNA転写後にFAM、あるいは、TAMRAによる修飾も行った。
A)転写反応用鋳型の調製
本実施例に使用するRaf−1タンパク質及びRNAアプタマーについては、本明細書中に参考文献として援用されるWO2004/007713の参考例1を参照されたい。
T7転写反応は、40mM Tris−HCl 緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、1mM natural NTPs、1mM FAM−yTP、25ng/μl 鋳型DNA、及び2.5U/μl T7 RNAポリメラーゼ(TaKaRa)を含む溶液で行った。37℃、6時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液を反応溶液と等量加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、10% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写反応産物(9A90F;100−mer)が含まれるゲルを切り出した。目的産物を滅菌水でゲルから溶出した後、エタノール沈殿を行い、RNA 9A90Fを回収した。
結合実験には、human Raf−1のRBD(アミノ酸残基51−131番)のGST融合タンパク質(Raf−1タンパク質)を用いた。本手法では、ニトロセルロースフィルターがタンパク質を吸着する一方、FAM標識されたRNA 9Aは吸着しない性質を利用し、タンパク質−RNA複合体をニトロセルロースフィルターにより単離した。
1)本実施例では、本発明の部位特異的な蛍光標識の可能性を調べるために、気管支拡張剤テオフィリン(非特許文献37、41−46)に特異的に結合する別のアプタマーに、蛍光色素−結合yを導入した(図9a)。RNA分子中の特異的な位置の蛍光色素は、蛍光強度における変化を測定することによって立体構造の変化を検出するために、あるいは、標的分子を検出するために有用である。
sを有する化学的に合成された二本鎖鋳型DNAを用いて、y又はその修飾塩基(Ph−y、I−y及び蛍光色素−結合y)を、6U、23U又は24Uの代わりに導入した。
特定部位にy又はその5−修飾塩基を有するRNAアプタマーによるテオフィリンとの結合を、平衡濾過アッセイ(非特許文献41)によって分析した。種々の濃度のアプタマーを含む溶液(54μl、100mM Hepes(pH7.3)、50mM NaCl及び5mM MgCl2中、25−1500nM)を、6μlの200nM 3H−標識テオフィリン溶液(Moravek)と混合し、そして混合物を25℃で5分間インキュベートした。次いで、混合物をMicrocon YM−10濾過装置(Amicon)に装填し、そして濃縮した。濾液の10μl試料を回収し、そして、シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。各RNAアプタマーに対するテオフィリン結合の比率は、RNAの存在下及び非存在下で得られた濾液中のテオフィリンの濃度の差から決定された。テオフィリン結合に関する解離定数(Kd)は、以下の式を用いたKALEIDAGRAPHプログラムによって決定した。
[ここにおいて、
yは、テオフィリン結合の比率であり;
M0は、RNA濃度であり;
M1は、テオフィリンの結合容量であり;そして、
M2は、Kdである]。
U6の代わりにshort FMA−y、FAM−y又はTAMRA−yを有する各テオフィリン結合性アプタマーの蛍光プロフィールは、テオフィリン(0−20μM)又はカフェイン(20μM)の存在下で、FP−6500蛍光測定装置(JASCO)を用いて25℃で測定された。蛍光スペクトル測定では、100nMの濃度のアプタマーも用い、励起波長は5nmスペクトルバンド幅で434nm(short FAM−y若しくはFAM−yを有するアプタマー)、又は500nm(TAMRA−yを有するアプタマー)に設定した。
[ここにおいて、
yは、FAMについては522nmであり、そしてTAMRAについては578nmにおける相対蛍光強度(テオフィリン非存在下での蛍光強度を「1」と設定する)であり;
C0は、テオフィリン濃度であり;
C1は、テオフィリンの飽和濃度における相対的増加値に該当し;そして、
C2は、Kfである]。
Claims (15)
- 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
- 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位が、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
- 前記塩基の5位の蛍光色素又は消光色素が、下記の化学式I−III:
及び
- 前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項4に記載の核酸。
- 前記6位置換された2−アミノプリン−9−イル基が2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基又は2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基である、請求項5に記載の核酸。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸。
- アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項4ないし7のいずれか1項に記載の核酸。
- 1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。 - 1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。 - I−1)請求項1に記載のヌクレオチドを含む核酸と、請求項2に記載のヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。 - II−1)各々異なる蛍光色素であって、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、2種の請求項1に記載の核酸をハイブリダイズさせ、そして
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。 - 1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、低分子化合物の検出方法。 - 前記試料が溶液であり、工程2)において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む、請求項13に記載の方法。
- 低分子化合物が、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びアミノ酸からなるグループから選択される、請求項13または14に記載の方法。
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