JP2020089361A - クエンチャー及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は励起エネルギー準位で発光特性を示す蛍光物質に対する消光効果を示すクエンチャーとその多様な用途に関する。【解決手段】本発明によるクエンチャーは、従来のクエンチャーに比べて消光効率が高いほど優れた消光特性を示し、下記の式１で表されるクエンチャーである。【選択図】図１

Description

本発明は、励起エネルギー準位における発光特性を示す蛍光物質に対して消光効果を示すクエンチャーとその多様な用途に関する。

本研究は、大韓民国通商産業資源部による「高度技術センター（ＡＴＣ）プログラム（１００７６９８８、分子診断のための蛍光体とその応用技術の開発）」からの助成金の支援を受けたものである。

クエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）とは、蛍光分子の蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）させる分子を意味し、通常、光を吸収できる特性を有する染料が用いられる。

消光現象のメカニズムとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）、光誘起電子移動（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及びＨ−二量体形成のような染料の凝集によって起こると知られている。

蛍光染料の蛍光を制御または消滅させるためにクエンチャーを用いる場合、消光染料の吸収波長範囲が蛍光染料の示す蛍光波長領域の相当部分或いは全体領域を包括（重畳）するか否かが最も重要である。

また、消光効果を得るには蛍光染料とクエンチャー間の長さも重要であるが、例えば、ＤＮＡの場合は塩基数、ペプチド／タンパク質の場合はアミノ酸数などが考慮されており、より高い消光効果を得るために蛍光染料及びクエンチャーが標識されるリンカーの長さを調節したりもする。

主にバイオ分野で商業的に使用されるクエンチャーの場合、通常、光を発せず吸収のみ可能な染料の構造が選択されるが、ＦＲＥＴ現象を利用した蛍光−蛍光染料の組み合わせも多く活用されている。このように組み合わされた蛍光−消光、蛍光−蛍光染料は、相互間の距離が遠くなるか、生体分子内から離脱する場合、元の蛍光が復元されたり強くなったりするため、一種の蛍光のオン／オフ機能を付与することができるようになり、このような特性を考慮して、特定タンパク質／酵素などのバイオマーカーに感応できるバイオセンサーや活性化プローブなどを設計する際に多く使用されている。

バイオ分野で使用される蛍光又は消光染料の場合、単独使用される場合は、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）やメチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ）のようにＦＤＡ承認を受けた限定された染料に限り、通常は、生体分子の有する置換基に結合できる反応性基が導入される。前記反応性基としては、色々知られているが、置換基選択性、反応速度、収率、再現性、安全性などが大勢の研究者たちによって長期間に渡り検証されて来ており、最近は、実際の研究や商業的な目的で染料に導入される反応性基は、幾つかに限定されている。

例えば、タンパク質分子のアミン基との結合を目的とする反応性基として最も多く利用されるものは、スクシンイミジルエステルとイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）であり、タンパク質分子のチオール基との結合を目的とする反応性基として最も多く使用されるものはマレイミドであり、タンパク質分子のヒドロキシ基との結合を目的とする反応性基としては、主にジクロロトリアジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅ）が選択される。

但し、前記反応性基は、置換反応で結合されるか、水溶性条件下で長時間反応及び保管安全性を維持し難い場合がほとんどである。本発明と関連した先行技術としては、特許文献１があり、前記先行技術にはアントラキノン部分（ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が開示されている。

米国特許出願公開第２００５−０２２７２５４号

本発明は、光学映像分野で生体分子の同定を観察するために広範囲に使用され得る化合物であり、新規なクエンチャーを提供することを目的とする。

また、本発明は、前記新規なクエンチャーを含む核酸検出用オリゴヌクレオチド、組成物、支持体及び核酸検出方法を提供することを目的とする。

前述した技術的課題を解決するための本発明の一側面によれば、下記の式１で表されるクエンチャーが提供される。

ここで、
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ下記の式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、

Ａｒ_１は置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールおよび式２から選択され、
ｎは１〜３の整数であり、
ＸおよびＹはそれぞれ独立的にＯ、Ｓ、ＣＲ_１２Ｒ_１３またはＮＲ_１２であり、
Ｒ_３〜Ｒ_１７はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルキニル、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カバーメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシ、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、ホスフェート、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホン酸（亜ホスフェート）、ハイポ亜ホスフェート、スルホヒドロキシ、サルフェート、アジド、グアニジニウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキサイド、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基または前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択され、
Ｒ_５とＲ_６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ_７とＲ_８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｌ_１およびＬ_３は単結合または１〜４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ_２およびＬ_４は１〜４０個の非水素原子を含むリンカーであり、
Ｒ_３〜Ｒ_１７およびＡｒ_１の置換基のうち少なくとも一つは、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。

また、本発明のさらに他の側面によれば、前記クエンチャーとマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）及び蛍光団を含むオリゴヌクレオチドが提供される。

また、本発明のさらに他の側面によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。

また、本発明のさらに他の側面によれば、前記クエンチャー、支持体及び前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。

また、本発明のさらに他の側面によれば、（ａ）標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬及びオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備するステップ、（ｂ）前記反応混合物のうち、標的核酸を重合酵素連鎖反応によって増幅するステップ、及び（ｃ）前記反応混合物の蛍光強度を測定するステップを含む核酸検出方法が提供される。

本発明は、励起エネルギー準位における発光特性を示す蛍光物質に対して消光効果を示すクエンチャーとその多様な用途に関し、本発明によるクエンチャーは、従来のクエンチャーに比べて消光効率が高いほど優れた消光特性を示す。

本発明の実施例に係るクエンチャーである化合物５を含むオリゴヌクレオチドの吸収スペクトルを示したものである。 クエンチャーとしての化合物５を含むオリゴヌクレオチドの２６０ｎｍでの吸光度を示したものである。 本発明の他の実施例に係るクエンチャーである化合物４の吸収スペクトルを示したものである。 本発明の一実施例に係るクエンチャーである化合物５を含む二重標識プローブを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示したものである。 本発明の他の実施例に係るクエンチャーである化合物４を含む二重標識プローブを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示したものである。

本発明をさらに容易に理解するために便宜上、特定の用語を本願に定義する。本願において別途に定義しない限り、本発明に使われた科学用語及び技術用語は、当該技術分野で通常の知識を有する者に一般的に理解される意味を有し得る。

また、文脈上特に指定しない限り、単数形態の用語は、その複数形態も含むものであり、複数形態の用語は、その単数形態も含み得る。

[新規クエンチャー]
本発明の一側面によれば、下記の式１で表されるクエンチャーが提供される。

［化１］
ここで、
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ下記の式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、

［化２］
Ａｒ_１は置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールおよび式２から選択され、
ｎは１〜３の整数であり、
ＸおよびＹはそれぞれ独立的にＯ、Ｓ、ＣＲ_１２Ｒ_１３またはＮＲ_１２であり、
Ｒ_３〜Ｒ_１７はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルキニル、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カバーメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシ、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、ホスフェート、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホン酸（亜ホスフェート）、ハイポ亜ホスフェート、スルホヒドロキシ、サルフェート、アジド、グアニジニウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキサイド、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基または前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択され得る。

また、Ｒ_３〜Ｒ_１８のうちＲ_５とＲ_６は前述した作用基としてそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。

このとき、Ｒ_３〜Ｒ_１８のうちＲ_７とＲ_８は前述した作用基としてそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。

さらに他の実施例において、Ｒ_３〜Ｒ_１８のうちＲ_５とＲ_６とＲ_７とＲ_８はいずれも互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。

この時、Ｒ_５とＲ_６および／またはＲ_７とＲ_８が互いに連結されて環を形成する場合、環内の任意の炭素は重水素、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_４０アルケニル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_４０アルキニル、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カバーメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシ、カルボキシ酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、ホスフェート、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸およびスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_２０シクロアルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_２０ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_２０シクロアルケニル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_２０ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキサイド、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも一つで置換され得る。

Ｌ_１およびＬ_３は単結合または１〜４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ_２およびＬ_４は１〜４０個の非水素原子を含むリンカーである。ここで、非水素原子を含むリンカーとは水素ではなく、炭素、窒素、酸素などのような原子の結合からなるグループを意味する。したがって、リンカーは炭素、窒素、酸素などのような非水素原子の結合からなる鎖および／または環（例えば、芳香族姓環および／または脂肪族性環）を含むことができる。

Ｒ_３〜Ｒ_１７およびＡｒ_１の置換基のうち少なくとも一つは、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基である。特に、Ｒ_３およびＲ_４のうち少なくとも一つはカルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基であり得る。

ここで、反応性基としては、（ａ）カルボキシ基とその誘導体：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、アシルハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル及び芳香族性エステル；（ｂ）エーテル、エステル、アルデヒドに転換され得るヒドロキシ；（ｃ）ハロゲンが例えば、アミン、カルボン酸塩アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン又はアルコキシドイオンのような求核性作用基に置換されることによって、他の作用基に共有して付着され得るハロアルキル；（ｄ）例えば、マレイミド基とディールス・アルダー反応ができる親ジエン体；（ｅ）イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムのようなカルボニル誘導体を形成できるアルデヒド又はケトン；（ｆ）アミンと反応してスルホアマイドを形成するハロゲン化スルホニル；（ｇ）ジスルフィドに転換されるか、アシルハライドと反応できるチオール；（ｈ）アシル化、アルキル化又は酸化され得るアミン又はスルフヒドリル；（ｉ）環化付加、アシル化、マイケル反応などのような反応を遂行できるアルケン；（ｊ）アミン又はヒドロキシ化合物と反応できるエポキシド；（ｋ）ホスホロアミダイト及び核酸反応に有用な他の標準作用基などが用いられ得る。このような反応性基は、反応性クエンチャーを合成するに必要な反応に参加するか干渉しないように適宜選択され得る。

他の実施例において、このような反応性基は、保護基で保護されることによって、反応性基が保護基の存在下で任意の反応に参加しないようにすることができる。例えば、反応性基がヒドロキシである場合、保護基としては、トリアルキルシリル、４，４−ジメトキシトリチル又はその類似体が用いられ得る。好ましい保護基の例としては、次の参考文献に記載されている内容を参考すればよい（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。

本発明の多様な実施例によるクエンチャーは、前述した反応性基を介して標的生体分子（例えば、核酸）と結合して標識することが可能である。

前述した反応性基は標的生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基またはヒドロキシ基などのような作用基と反応できる作用基であって、クエンチャーと標的生体分子の間にアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、ホスファイト結合、ホスフェート結合またはグアニジン結合のような共有結合を形成することができる。

また、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され得る。例えば、Ｒ_１が式２のａと接合され、Ｒ_２が式２のｂと接合され得、その逆で接合されてもよい。

また、Ｒ_３〜Ｒ_１７のうち任意の作用基が置換された場合、前記作用基内の任意の炭素は重水素、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_４０アルケニル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_４０アルキニル、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カバーメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシ、カルボキシ酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、ホスフェート、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸およびスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_４０アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_２０シクロアルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_２０ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_２０シクロアルケニル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_２０ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキサイド、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも一つで置換され得る。

本願において、Ｒ_ａがアルケニル又はアルキニルであるとき、アルケニルのｓｐ^２混成炭素又はアルキニルのｓｐ混成炭素が直接に結合されるか、アルケニルのｓｐ^２−混成炭素又はアルキニルのｓｐ混成炭素に結合されたアルキルのｓｐ^３混成炭素によって間接に結合された形態であり得る。

本願におけるＣ_ａ−Ｃ_ｂ作用基は、ａ〜ｂ個の炭素原子を有する作用基を意味する。例えば、Ｃ_ａ−Ｃ_ｂアルキルは、ａ〜ｂ個の炭素原子を有する、直鎖アルキル及び分鎖アルキルなどを含む飽和脂肪族基を意味する。直鎖又は分鎖アルキルは、この主鎖に４０個以下（例えば、Ｃ_１−Ｃ_１０の直鎖、Ｃ_３−Ｃ_１０の分鎖）であり得る。

具体的には、アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペント−１−イル、ペント−２−イル、ペント−３−イル、３−メチルブト−１−イル、３−メチルブト−２−イル、２−メチルブト−２−イル、２，２，２−トリメチル−１−エチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル及びｎ−オキチルであり得る。

また、本願におけるアルコキシは、−Ｏ−（アルキル）基と−Ｏ−（非置換されたシクロアルキル）基の両方を意味するものであって、１つ以上のエステル基及び１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分鎖炭化水素である。

具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどを含むが、これに限定されるものではない。

また、本願におけるハロゲンは、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）又はヨード（−Ｉ）を意味して、ハロアルキルは、上述したハロゲンに置換されたアルキルを意味する。例えば、ハロメチルは、メチルの水素のうち少なくとも１つがハロゲンに切り換えられたメチル（−ＣＨ_２Ｘ、−ＣＨＸ_２又は−ＣＸ_３）を意味する。

本願におけるアラルキルは、アリールがアルキルの炭素に置換された形態の作用基であって、−（ＣＨ_２）_ｎＡｒの総称である。アラルキルの例として、ベンジル（−ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）又はフェネチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）などがある。

本願におけるアリールは、別途に定義されない限り、単一環または相互接合または共有結合で連結された多重環（好ましくは、１〜４個の環）を含む不飽和芳香族性環を意味する。アリールの非制限的な例としては、フェニル、ビフェニル、ｏ−テルフェニル（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）、ｍ−テルフェニル、ｐ−テルフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントレニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、２−フェナントレニル、３−フェナントレニル、４−フェナントレニル、９−フェナントレニル、１−ピレニル、２−ピレニル及び４−ピレニルなどがある。

本願におけるヘテロアリールは、前記で定義されたアリール内の１つ以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄のような非−炭素原子に置換された作用基を意味する。ヘテロアリールの非制限的な例としては、フリル（ｆｕｒｙｌ）、テトラヒドロフリル、ピロリル（ｐｈｒｒｏｌｙｌ）、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）、チエニル（ｔｈｉｅｎｙｌ）、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌ）、イソオキサゾリル（ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、トリアゾリル（ｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、チアゾリル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、イソチアゾリル（ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリル（ｐｙｒａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリジニル（ｐｙｒａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ）、オキサジアゾリル（ｏｘａｄｉａｚｏｌｙｌ）、チアジアゾリル（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌ）、ピリジル（ｐｙｒｉｄｙｌ）、ピリダジイル（ｐｙｒｉｄａｚｉｙｌ）、トリアジニル（ｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、ピラジニル（ｐｙｒａｚｉｎｙｌ）、ピペライニル（ｐｉｐｅｒａｉｎｙｌ）、ピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル（ｉｎｄｏｌｙｌ）、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、キヌクリジニル（ｑｕｉｎｕｃｌｉｄｉｎｙｌ）、カルバゾイル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチジニル（ｐｈｅｎｏｔｈｉｚｉｎｙｌ）、フェノキサジニル、フリニル、ベンズイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）及びベンゾチアゾリルなどと、これらが接合した類似体がある。

本願における炭化水素環（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）又はヘテロ原子を含む炭化水素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）は、別途に定義されない限り、それぞれアルキル又はヘテロアルキルの環型構造に理解されてもよい。

炭化水素環の非制限的な例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル及びシクロヘプチルなどがある。ヘテロ原子を含む炭化水素環の非制限的な例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどがある。

また、炭化水素環又はヘテロ原子を含む炭化水素環は、ここに炭化水素環、ヘテロ原子を含む炭化水素環、アリール又はヘテロアリールが接合されるか、共有結合で連結された形態を有してもよい。

ここで、ポリアルキレンオキシドは、水溶性ポリマー作用基であって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ−ＰＰＧ）コポリマー及びＮ−置換されたメタクリルアマイド−含有ポリマー及びコポリマーを含む。

ポリアルキレンオキシドは、ポリマーの特性を維持する限度内で、必要によって追加して置換されてもよい。例えば、前記置換は、ポリマーの化学的又は生物学的安全性を増加又は減少させるための化学的結合であってもよい。具体的な例として、ポリアルキレンオキシド内の任意の炭素又は末端炭素は、ヒドロキシ、アルキルエーテル（メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテルなど）、カルボキシルメチルエーテル、カルボキシエルエーテル、ベンジルエーテル、ジベンジルメチレンエーテル又はジメチルアミンに置換されてもよい。一実施例において、ポリアルキレンオキシドは、メチルエーテルに終結されるポリエチレンオキシド（ｍＰＥＧ）であり得、ここで、ｍＰＥＧは、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_３の化学式で表され、エチレングリコール繰り返し単位数に相当するｎの大きさによってｍＰＥＧの大きさが異なり得る。

また、式１で表されるクエンチャーは、カウンターイオンをさらに含む構造を有してもよい。カウンターイオンは、有機又は無機アニオンであって、クエンチャーの溶解度及び安全性などを考慮して適宜選択されてもよい。

本発明の一実施例によるクエンチャーのカウンターイオンの例として、リン酸６フッ化物イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、過ヨード酸イオン、アンチモン６フッ化物イオン、酒石酸６フッ化物イオン、フルオロホウ酸イオン及び４フルオロイオンなどのような無機酸アニオンとチオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボキシル酸イオン、アルキルカルボキシル酸イオン、３ハロアルキルカルボキシル酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、トリハロアルキルスルホン酸イオン、及びニコチン酸イオンなどのような有機酸イオンがある。また、チオビスフェノールキレート又はビスジオル−α−ジケントンなどのような金属化合物イオン、ソジウム及びポタシウムなどのような金属イオンと４次アンモニウム塩もカウンターイオンとして選択されてもよい。

式１で表されるクエンチャーの具体的な例は次の通りである。下記に例示されたクエンチャーは式１で表されるクエンチャーのいくつかの例示であって、本願に係るクエンチャーは式１で表される基本骨格を有するクエンチャーをその対象とする。すなわち、下記に例示したクエンチャーだけでなく、式１で表される基本骨格を有する化合物は励起エネルギー準位で発光特性を示す蛍光物質に対して同等または類似する水準の消光効果を示すものと理解されるべきである。

［化合物１］

［化合物２］

［化合物３］

［化合物４］

［化合物５］

［化合物６］

［化合物７］

［化合物８］

［化合物９］

［化合物１０］

本願に開示されている式１で表されるクエンチャーの標的になる生体分子は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸（ヌクレオチドを含む）から選択される少なくとも１つであり得る。

脂質の具体的な例としては、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）、燐脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）などがあり、炭水化物の具体的な例としては、単糖類、二糖類、多糖類（例えば、デキストラン）を含む。

このとき、生体分子は、式１で表されるクエンチャーの任意の作用基又は式１で表されるクエンチャーに結合された反応性基と反応するための作用基であって、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシ、カルボキシ、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含むか、その誘導体の形態を有し得る。

また、生体分子は、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシ、カルボキシ、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含むか、その誘導体の形態を有するオキシ又はジオキシポリ核酸であり得る。

また、生体分子のほか、式１で表されるクエンチャーは、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシ、カルボキシ、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含む薬物、ホルモン（水溶体リガンドを含む）、水溶体、酵素又は酵素基質、細胞、細胞膜、毒素、微生物又はナノバイオ素材（ポリスチレンミクロスフェアなど）などを標識するために用いられ得る。

［新規クエンチャーを含むオリゴヌクレオチド、核酸検出用組成物、核酸検出用支持体］

本発明の他の側面によれば、式１で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチドが提供される。

オリゴヌクレオチドは、一つ〜数百個のヌクレオチドのポリマーを意味するものであって、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡを全て含む。また、これらの類似体例えば、前記ヌクレオチドに化学的変更を加えたもの、又は糖を結合したものなど、通常の技術者が容易に変形を加えられるものなどを全て含み、単一筋又は二重筋からなったあらゆるものを含むことを意味する。

オリゴヌクレオチドは、プローブを含むものが好ましい。このようなプローブは、標的となる核酸と相補的に結合できるプローブであるものがさらに好ましいが、これに限定されるものではない。ここで、プローブは、核酸、ペプチド、糖類、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体又はこれらの組み合わせから選択されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

一実施例において、オリゴヌクレオチドは、蛍光団を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識され、３’末端には式１で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つが標識され得る。５’末端と３’末端の間には、標的となる核酸と相補的に結合できるプローブが位置し得る。

蛍光団は、次の参考文献に公開されている蛍光団の種類を参考すればよい（Ｃａｒｄｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９０−８７９４（１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２１：８３６−８５０（１９５３）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５：１３３−１４１（１９９２）；Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２４６：３００−３３４（１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０：８３−１１４（１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９−８４６（１９７８）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ３１：６４９３−６４９６（１９９０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１９７−１２０３（１９９５））。

また、本願に使用できる蛍光団の非制限的な例としては、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及びその誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、ブリリアントイエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ）、クマリン（７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ１５１））及びその誘導体、シアン染料、シアノシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ））、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（５’，５”−ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ））、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル クロライド（ＤＮＳ、ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン及びその誘導体（エオシンイソシアネート）、エリスロシン及びその誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソシアネート）、イチジウム、フルロセイン及びその誘導体（５−カルボキシフルロセイン（ＦＡＭ））、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレセアミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアナート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノルレッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン及びその誘導体（ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、量子ドット、リアクティブレッド４（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ３Ｂ−Ａ））、ローダミン及びその誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソシアネート）、リボフラビン、ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン及びｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓなどがある。

また、本発明によるオリゴヌクレオチドは、核酸との結合力を向上させるためにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）をさらに含むことができる。

このようなオリゴヌクレオチドは、化学的、生物学的領域で多様に活用することができる。特に、リアルタイム重合酵素連鎖反応又はマイクロアッセイ（ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ）などに有用に用いられるが、これに限定されるものではない。

また、本発明の他の側面によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。

本発明の一実施例による核酸検出用組成物は、式１で表されるクエンチャーとマイナーグルーブバインダー及び蛍光団を共に含むオリゴヌクレオチドとともに、標的生体分子との反応のための酵素、溶媒（緩衝液など）及びその他試薬などをさらに含むことができる。

ここで溶媒としては、ホスフェート緩衝液、カーボネート緩衝液及びトリス緩衝液で構成された群から選択される緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、メタノール、エタノール及びアセトニトリルから選択される有機溶媒又は水などを用いてもよく、溶媒の種類によってクエンチャーに様々な作用基を導入することによって溶解度を調節することが可能である。

また、本発明のさらに他の側面によれば、式１で表されるクエンチャー、支持体及び前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。

これにより、サンプル内の生体分子は、支持体上に固着化したクエンチャーとの相互作用によって支持マトリックス上に固定され得る。

前記支持マトリックスは、ガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアマイドゲル、デキストラン、ポリスチレン、アルジネート、コラゲン、ペプチド、ピブリン、ヒアルロン酸、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングライコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングライコールジアクリレート、ゼラチン、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ポリ乳酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、キトサン、ラクテックス及びセファロースから選択される少なくとも１つで製造されてもよいし、ビーズまたはメンブレンの形態であり得る。

ここで、リンカーは、クエンチャーと支持体を連結する部分であって、クエンチャーと支持体を連結できる任意の物質は、いずれも本願で意図したリンカーとして用いることができる。

例えば、リンカーは、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_３０アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_３０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_６−Ｃ_３０アリール及び置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_３０ヘテロアリールから選択されてもよいし、より具体的には、１〜６個のエチレングリコールが連結された鎖であり得る。

このようなリンカーは、クエンチャーと支持体を連結するだけであり、クエンチャー又は蛍光団の他の反応または蛍光及び消光作用に影響を及ぼさない。

［核酸検出方法］
本発明の一実施例によれば、標的核酸にクエンチャーで標識されたプローブを反応させて標識する方法を具現することができる。また、標的生体分子の種類によってクエンチャーに適宜な反応性基を導入することで、標的−特異的相互作用を利用した生体分子の標識方法を具現することもできる。また、クエンチャーで標識した生体分子を電気泳動によって同定する方法を具現することもできる。

（ＤＮＡマイクロアレイ法）
ＤＮＡマイクロアレイ法は、標識すべきである標的核酸に染料を反応させて標識する一方、標的核酸に対して相補的塩基配列を有する単一鎖のプローブ核酸を準備し、単一鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板上で混成化して、標的核酸の蛍光を測定する。

本標識方法において、基板に固定するプローブ核酸としては、遺伝子の発現を調査する場合、ｃＤＮＡなどのｃＤＮＡのライブラリ、ゲノムのライブラリ又はあらゆるゲノムを鋳型にしてＰＣＲ法によって増幅して調剤したものを用いることができる。

また、遺伝子変異などを調査する場合、標準となる既に知られた配列に基づいて、変異などに対応する様々なオリゴヌクレオチドを合成したものを用いることができる。

プローブ核酸を基板上に固定することは、核酸の種類や基板の種類によって適宜な方法を選択してもよい。例えば、ＤＮＡの電荷を用いてポリリジンなどのカチオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いることができる。

単一鎖に変性させた標的核酸を基板上に固定して、オリゴヌクレオチドと混成化する。ここで、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識されて、３’末端には式１で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つが標識される。５’末端と ３’末端の間には、標的となる核酸と相補的結合できるプローブが位置し得る。

混成化は、室温〜７０℃、そして、２〜４８時間の範囲で行うことが好ましい。混成化によってプローブ核酸と相補的塩基配列を有する標的核酸が選択的にプローブ核酸と結合する。その後、基板を洗浄して室温で乾燥する。

このとき、オリゴヌクレオチドは、プローブによって標的核酸に混成化されるが、５’末端の蛍光団は、３’末端のクエンチャーによって消光された状態で存在する。

次いで、標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドは、重合酵素によって伸長されるが、オリゴヌクレオチドは、重合酵素のエクソヌクレアーゼ活性によって標的核酸から分離及び分解され、オリゴヌクレオチドの５’末端の蛍光団と３’末端のクエンチャーは、互いに分離されて、これにより蛍光団は、蛍光を発するようになる。

このとき、発生する蛍光強度を測定して、標的核酸の増幅量を測定することができるようになる。

以下では、本発明の具体的な実施例を提示する。但し、下記に記載されている実施例は、本発明を具体的に例示するか説明するためのものに過ぎず、これによって本発明が制限されてはならない。

［製造例１．化合物５の合成］

（中間体１の合成）
５００ｍＬ３口反応器に６−ブロモ−２，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１Ｈ−インデン１−オン（１２．６ｇ、０．０５２７ｍｏｌ）、フェニルヒドラジン塩酸塩（９．１４ｇ、０．０６３２ｍｏｌ）、メタンスルホン酸（１５．２ｇ、０．１５８ｍｏｌ）、エタノール（１２０ｍＬ）を入れて還流下で７時間撹拌して冷却後濃縮させた。水（３００ｍＬ）を入れて水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９を合わせた後エチルアセテートで抽出し、濃縮後コラム精製した（１２ｇ、０．０３８４ｍｏｌ、７３％）。

（中間体２の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体１（６ｇ、０．０１９２ｍｏｌ）、６０％水素化ナトリウム（１．５４ｇ、０．０３８４ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）を入れて常温で１０分間撹拌した後反応器にヨードメタン（１．８ｍＬ、０．０２８８ｍｏｌ）を入れて常温で３時間撹拌した。濃縮後エチルアセテート（２００ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を入れて強撹拌した後有機層を分離した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて撹拌した後濾過し、濃縮後コラム精製した（６ｇ、０．０１８４ｍｏｌ、９６％）。

（中間体３の合成）
２５０ｍＬ３口反応器に中間体２（６ｇ、０．０１８４ｍｏｌ）、ベンゾフェノンヒドラゾン（４．３３ｇ、０．０２２１ｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）３（０．６７ｇ、０．０００７ｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（０．４６ｇ、０．０００７ｍｏｌ）、ソジウムターシャリーブトキシド（２．４７ｇ、０．０２５７ｍｏｌ）、トルエン（６０ｍＬ）を入れて７０℃で１２時間撹拌した。冷却、濾過、濃縮後コラム精製した（６．３ｇ、０．０１４２ｍｏｌ、７７％）。

（中間体４の合成）
２５０ｍＬ３口反応器に中間体３（６．３ｇ、０．０１４２ｍｏｌ）、３−メチル−２−ブタンオン（１．８４ｇ、０．０２１４ｍｏｌ）、メタンスルホン酸（４．１１ｇ、０．０４２８ｍｏｌ）、エタノール（６０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹拌、冷却後濃縮させた。水（３００ｍＬ）を入れて水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９を合わせた後エチルアセテートで抽出、濃縮後コラム精製した（２．５ｇ、０．００７６１ｍｏｌ、５３％）。

（中間体５の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体４（５ｇ、１５．２２３ｍｍｏｌ）、３−プロモプロピルアセテート（４．１３ｇ、２２．８３５ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（５．０５ｇ、３０．４４６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹拌した。冷却、濾過、濃縮後コラム精製した（８．２２ｇ、１４．７７１ｍｍｏｌ、９７％）。

（中間体６の合成）
２５０ｍＬ１口反応器に中間体５（８．２２ｇ、１４．７７１ｍｍｏｌ）、マロンアルデヒドジアニリド塩酸（１．９１ｇ、７．３８５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５．２ｍＬ、３６．９２ｍｍｏｌ）、無水酢酸（２．１ｍＬ、２２．１５５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹拌した。引き続き、冷却後濃縮させた。

（中間体７の合成）
中間体６濃縮液に６Ｎ塩酸水溶液（１２０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌した。引き続き、濃縮、固体濾過後コラム精製した（３．８ｇ、４．４９４ｍｍｏｌ）。

（化合物５の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体７（１．３２ｇ、１．５６１ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルをクロライド（０．５８２ｇ、１．７１７ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌、濃縮後コラム精製した（７００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、３９％）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ ８．３９−８．２４（ｍ、２Ｈ）、７．８９−７．８５（ｍ、２Ｈ）、７．７２−７．６１（ｍ、４Ｈ）、７．５６−７．５２（ｍ、２Ｈ）、７．４０−７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．３１−７．１７（ｍ、９Ｈ）、７．１７−７．０９（ｍ、２Ｈ）、６．８５−６．７６（ｍ、４Ｈ）、６．３１−６．０６（ｍ、３Ｈ）、４．８７（ｂｓ、１Ｈ）、４．３６−４．２８（ｍ、４Ｈ）、４．１１（ｓ、３Ｈ）、４．０１（ｓ、３Ｈ）、３．６９（ｓ、６Ｈ）、３．５８ ｍ（ｍ、２Ｈ）、３．０６−３．０２（ｍ、２Ｈ）、２．１７−２．１５（ｍ、２Ｈ）、１．９９−１．９５（ｍ、２Ｈ）、１．７８（ｓ、６Ｈ）、１．６０−１．５７（ｍ、１８Ｈ）。

［製造例２．化合物４の合成］

（中間体８の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体５（３．８ｇ、７ｍｍｏｌ）、オルトギ酸トリエチル（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍＬ）を入れて還流下で３時間撹拌した。引き続き、濃縮後コラム精製した。

（中間体９の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体８（２ｇ、２．３ｍｍｏｌ）、４Ｎ塩酸（１０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）、メタノール（２０ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌した。引き続き、濃縮後生成された固体を濾過した。

（化合物４の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体９（１．５ｇ、２ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルをクロライド（０．７ｇ、２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１５ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌した。引き続き、濃縮後コラム精製した。

［製造例３．化合物１０の合成］

（中間体１０の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体４（２．５ｇ、７．６ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（２．４ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（２５ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹拌した。引き続き、冷却後固体を濾過した。

（中間体１１の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体１０（２．５ｇ、５ｍｍｏｌ）、マロンアルデヒドジアニリド塩酸塩（１．４ｇ、５ｍｍｏｌ）、酢酸無水物（２５ｍＬ）を入れて還流下で１時間撹拌した。引き続き、濃縮後エチルアセテートで結晶化した後固体を濾過した。

（中間体１２の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体１１（３．０ｇ、５ｍｍｏｌ）、１−（５−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｙｌ）−２，３，３−ｔｒｉｍｅｔｈｌｙｌｉｎｄｏｌｅｎｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（１．９ｇ、５ｍｍｏｌ）、ピリジン（３０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹拌した。引き続き、濃縮コラム精製した。

（化合物１０の合成）
１００ｍＬ１口反応器に中間体１２（１．５ｇ、２ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）を入れて常温で２時間撹拌した。引き続き、個体を除去した後コラム精製した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ ８．１６−８．０３（ｍ、２Ｈ）、７．６５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ）、７．４４−７．３４（ｍ、５Ｈ）、７．２５−７．１８（ｍ、２Ｈ）、７．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４ Ｈｚ）、６３８７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１２．３ Ｈｚ）、６．４７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．８ Ｈｚ）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．５ Ｈｚ）、４．１４（ｓ、３Ｈ）、４．０５（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．９ Ｈｚ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、２．９０（ｓ、４Ｈ）、２．６９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ）、１．９１−１．７８（ｍ、１６Ｈ）、１．６２（ｍ、８Ｈ）。

［製造例４．クエンチャー−ＣＰＧの合成］

１０ｍＬバイアルに化合物５（９０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、無水こはく酸（９．９ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１２．１ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）を入れて常温で１．５時間ローリングした。完全に濃縮して１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５２．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２８μｌ）、ピリジン（５ｍｌ）、ＣＰＧ−ＮＨ２（１ｇ）を入れて常温で２時間ローリングした。粉体を濾過してアセトニトリル、メタノール、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗浄した。乾燥後ＣａｐＡ／ＣａｐＢ＝１ｍｌ／１ｍｌを入れて常温で２時間ローリングし、アセトニトリル、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗浄した後乾燥した。また、前記と同じ方法で化合物４−ＣＰＧを合成した。

［製造例５．単一標識オリゴヌクレオチドの合成］
化合物５−ＣＰＧを利用して１０−Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで単一標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した単一標識オリゴヌクレオチドの配列は下記の表１の通りである。

合成後単一標識オリゴヌクレオチドは一般的な方法を通じて脱保護して逆相ＨＰＬＣ精製をした。精製後合成された単一標識オリゴヌクレオチドの吸収スペクトルは図１に示した。図１の吸収スペクトルの２６０ｎｍでの吸光係数を測定し（図２参照）、その値は３６，５８０と測定された。

［製造例６．二重標識オリゴヌクレオチドの合成］
化合物５−ＣＰＧとＣｙ５−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を利用して１０−Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表２の通りである。

［実験例．クエンチャーの消光特性測定］
（実験例１）
製造例１および製造例２によりそれぞれ製造された化合物４および化合物５のλ_{ａｂｓ、Ｍａｘ}（ｎｍ）、吸収係数を確認した。その結果は下記の表３に示した。

表３の結果を参照すれば、化合物４および化合物５によるクエンチャーは５８０ｎｍ以上の波長帯での吸収特性を示すことができ、これに伴い、多様な蛍光団との組み合わせを通じて二重標識プローブを設計することが可能であることを確認することができる。

また、製造例２により製造された化合物４の吸収スペクトルを示した図３を参照すれば、化合物４によるクエンチャーは５３０〜６１０ｎｍ、特に５５０〜６００ｎｍ範囲の波長帯で吸収特性を示すことを確認することができる。

実験例２
二重標識プローブに対する消光特性を確認するために下記の表４に示した通り、実施例および比較例に係る二重標識プローブを設計した。引き続き、下記の表５に記載された組成でリアルタイムＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ−９６使用）。リアルタイムＰＣＲ結果は図４に示した。

蛍光団とクエンチャーがそれぞれＣｙ５と化合物５で構成された二重標識プローブのリアルタイムＰＣＲ結果を示した図４を参照すれば、化合物５がＣｙ５の蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。

（実験例３）
化合物４を使って合成した二重標識プローブに対する消光特性を確認するために、下記の表６に示した通り、二重標識プローブを設計した。引き続き、下記の表７に記載された組成でリアルタイムＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ−９６使用）。リアルタイムＰＣＲ結果は図５に示した。

蛍光団とクエンチャーがそれぞれＦＡＭと化合物４で構成された二重標識プローブのリアルタイムＰＣＲ結果を示した図５を参照すれば、化合物４がＦＡＭの蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。

以上、本発明の一実施例について説明したが、該当技術分野で通常の知識を有する者であれば特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除または追加などによって本発明を多様に修正および変更でき、これも本発明の権利範囲内に含まれるものと言える。

Claims (15)

1. 下記の式１で表されるクエンチャー。
   ［化１］
   （式１中、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ下記の式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、
   ［化２］
   Ａｒ_１は置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールおよび式２から選択され、
   ｎは１〜３の整数であり、
   ＸおよびＹはそれぞれ独立的にＯ、Ｓ、ＣＲ_１２Ｒ_１３またはＮＲ_１２であり、
   Ｒ_３〜Ｒ_１７はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_１０アルキニル、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カバーメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシ、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、ホスフェート、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホン酸（亜ホスフェート）、ハイポ亜ホスフェート、スルホヒドロキシ、サルフェート、アジド、グアニジニウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキサイド、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基または前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択され、
   Ｒ_５とＲ_６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
   Ｒ_７とＲ_８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
   Ｌ_１およびＬ_３は単結合または１〜４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ_２およびＬ_４は１〜４０個の非水素原子を含むリンカーであり、
   Ｒ_３〜Ｒ_１７およびＡｒ_１の置換基のうち少なくとも一つは、カルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基である。）
2. Ｒ_１およびＲ_２がａおよびｂと接合される、請求項１に記載のクエンチャー。
3. Ｒ_１およびＲ_２がｂおよびｃと接合される、請求項１に記載のクエンチャー。
4. Ｒ_１およびＲ_２がｃおよびｄと接合される、請求項１に記載のクエンチャー。
5. Ｒ_３およびＲ_４のうち少なくとも一つはカルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基である、請求項１に記載のクエンチャー。
6. 前記反応性基はカルボキシ、カルボキシ誘導体、ヒドロキシ、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択され、前記反応性基は保護基で保護される、請求項１に記載のクエンチャー。
7. 請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載されたクエンチャー；
   マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）；および
   蛍光団；を含む、オリゴヌクレオチド。
8. 前記蛍光団はクマリン、シアニン、ボディピー、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン、アクリジンおよびまたはその誘導体から選択される少なくとも一つである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 請求項７に記載されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸検出用組成物。
10. 請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載されたクエンチャー；
    支持体；および
    前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカー；を含む、核酸検出用支持体。
11. 前記支持体はガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、デキストリン、ポリスチレンまたはレジンである、請求項１０に記載の核酸検出用支持体。
12. 前記リンカーは置換または非置換されたＣ_１−Ｃ_３０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ_２−Ｃ_３０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ６−Ｃ_３０アリールおよび置換または非置換されたＣ_３−Ｃ_３０ヘテロアリールから選択される、請求項１０に記載の核酸検出用支持体。
13. 段階（ａ）：標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬および請求項７に記載されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備する段階；
    段階（ｂ）：前記反応混合物のうち前記標的核酸を重合酵素連鎖反応によって増幅する段階；および
    段階（ｃ）：前記反応混合物の蛍光強度を測定する段階；を含む、核酸検出方法。
14. 前記段階（ｂ）は、
    段階（ｂ−１）：前記標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドが重合酵素によって伸張する段階；
    段階（ｂ−２）：前記重合酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって前記標的核酸から前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーと前記蛍光団が分離される段階；および
    段階（ｂ−３）：前記クエンチャーから離れた前記蛍光団が蛍光を発する段階；を含む、請求項１３に記載の核酸検出方法。
15. 前記段階（ｃ）で測定された蛍光強度から前記標的核酸の増幅量を測定する段階（ｄ）をさらに含む、請求項１３に記載の核酸検出方法。