KR20220089636A - 리포터 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA를 포함한 핵산의 표지가 가능함과 동시에 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광성 리포터 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 DNA를 포함한 핵산의 표지가 가능함과 동시에 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광성 리포터 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
생명 공학 분야에서 생체 내(in vivo), 생체 외(in vitro)에서 세포수준의 생물학적인 현상을 관찰하거나, 생체 조영 및 질환부위를 검시하기 위해, 이를 가시화할 수 있는 수단으로 형광 염료가 사용되고 있다.
그린형광단백질(GFP) 등의 자체적으로 발광하는 생체 분자도 존재하지만, 일반적으로는 생체 조직이나 세포 및 그 이하 단계의 생체 분자를 형광 염료로 염색하거나, 단백질, 핵산 등의 생체 분자에 형광 염료를 표지한 후, 형광 신호를 검출할 수 있는 광학장비를 동반하여, 다양한 기법으로 영상화한 자료를 얻고 있다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flow cytometry), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(quantitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
바이오 분야에 형광 염료를 적용하기 위해서는, 일반적으로 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 광표백(photo bleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)및 양자효율(quantum efficiency)이 크며, 다양한 pH 조건에서 안정한 것이 바람직하다.
여러 연구분야에서 다양한 형광 염료가 이용되어 오고 있으나, 바이오 분야에서 상술한 조건들을 모두 만족시키는 형광 염료는 드물며, 현재 사용되고 있는 대표적인 구조로는 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridines) 등이 있다. 이 중에서도 특히 로다민 유도체와 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체가 주를 이루고 있다.
특히, 시아닌계 형광 염료는, 폴리메틴 양쪽 말단 부위에 질소를 포함한 헤테로 고리로 연결되어 있으며, 폴리메틴 길이를 조절함으로써 450nm에서 800nm의 가시광선, 근적외선 전영역에 걸쳐 다양한 형광을 구현할 수 있는 구조적 장점뿐만 아니라, 일반적으로 매우 높은 흡광계수를 가지는 광학적 특징이 있다.
본 발명에 관련된 배경기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0026245호(2017.03.08. 공개)가 있으며, 상기 문헌에는 페릴렌계 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 형광 염료가 기재되어 있다.
본 발명은 광학 영상 분야에서 생체분자의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 화합물로서 신규한 리포터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 신규한 리포터의 다양한 용도로서, 상기 신규한 리포터를 포함하는 핵산 검출용 올리고뉴클레오티드, 핵산 검출용 조성물, 핵산 검출용 지지체 및 핵산 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 리포터가 제공된다.
[화학식 1]
[화학식 2]
여기서,
Ar1은 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C6-C20의 헤테로아릴이며,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성하며,
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
또한, 상기 리포터는 하기의 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시될 수 있다.
[화학식 5]
[화학식 6]
여기서,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R15은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성하며,
R1 내지 R15 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본원에 정의된 리포터 및 소광자를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본원에 정의된 리포터 또는 리포터와 소광자로 이중 표지된 프로브; 지지체; 및 상기 리포터 또는 상기 프로브와 상기 지지체를 연결하는 링커를 포함하는 핵산 검출용 지지체가 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (a) 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약 및 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계, (b) 상기 반응 혼합물 중 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭하는 단계 및 (c) 상기 반응 혼합물의 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 리포터는 물에 대한 용해도 및 형광 세기가 우수하여 생체 분자를 포함한 다양한 타겟을 표지하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 3은 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 RFU 값을 나타낸 것이다.
도 4는 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 6은 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 RFU 값을 나타낸 것이다.
도 2는 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 3은 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 RFU 값을 나타낸 것이다.
도 4는 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 6은 CT (Chlamydia trachomatis) 타겟에 대하여 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 RFU 값을 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
신규 핵산 표지용 리포터
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 핵산 표지용 리포터가 제공된다.
[화학식 1]
[화학식 2]
여기서,
Ar1은 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C6-C20의 헤테로아릴이며,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있다.
이 때, R1 내지 R11 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
또한, 상기 R1 내지 R11 중 임의의 작용기가 치환된 작용기인 경우, 상기 작용기 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 (1) 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 임의의 작용기로 치환되거나, (2) 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 리포터는 R1 내지 R11 중 적어도 하나에 존재하는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기를 통해 표적 생체분자(예를 들어, 핵산)와 결합하여 표지하는 것이 가능하다.
이 때, R1 내지 R11 중 적어도 하나는 말단이 포스포아미디트 또는 활성 에스터로 치환된 작용기일 수 있다.
상기 활성 에스터는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide) 유도체, 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole) 유도체, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole) 유도체, 나이트로페놀(nitrophenol) 유도체 및 펜타플루오로페놀(pentafluorophenol) 유도체로부터 선택될 수 있다.
[활성 에스터 - N-하이드록시석신이미드 유도체]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타낸다.
[활성 에스터 - 하이드록시벤조트리아졸 유도체]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타낸다.
[활성 에스터 - 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 유도체]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타낸다.
[활성 에스터 - 나이트로페놀]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타낸다.
[활성 에스터 - 펜타플루오로페놀]
다른 실시예에 있어서, R1 내지 R11 중 적어도 하나는 하기의 화학식 3으로 표시되는 작용기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타낸다.
[화학식 3]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타내며, x는 2 내지 10 사이의 정수이며, E는 포스포아미디트 또는 활성 에스터이다.
상기 화학식 3으로 표시되는 작용기 중 말단이 포스포아미디트인 경우, 상기 작용기는 하기의 화학식 3-1로 표시될 수 있다.
[화학식 3-1]
또 다른 실시예에 있어서, R1 내지 R11 중 적어도 하나는 하기의 화학식 4로 표시되는 작용기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
[화학식 4]
여기서, *는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타내며, x는 2 내지 10 사이의 정수이며, y는 1 내지 5 사이의 정수이며, z는 0 내지 5 사이의 정수이며, R'은 수소, 중수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬이며, E는 포스포아미디트 또는 활성 에스터이다.
상기 화학식 4로 표시되는 작용기 중 말단이 포스포아미디트인 경우, 상기 작용기는 하기의 화학식 4-1로 표시될 수 있다.
[화학식 4-1]
R1 내지 R11은 상기에 정의된 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서, R1 내지 R11 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다. 또한 상기 고리는 지방족 또는 방향족 고리일 수 있으며, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함할 수도 있다.
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 때, R1 내지 R11 중 적어도 하나가 C, N, O, S, Se 또는 Si를 매개로 인접한 치환기와 서로 결합하거나, 단결합에 의해 직접적으로 인접한 치환기와 결합할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 리포터는 화학식 1로 표시되며, Z1은 NR5R6인 경우, R5 또는 R6는 R3 또는 R4와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다.
상기 R5 및 R6에 의한 치환 또는 비치환된 고리의 형성은 서로 독립적인 것으로서, 하나의 화합물 내 R5 및 R3 (또는 R4)이 서로 결합하여 형성된 고리와 R6 및 R4 (또는 R3)가 서로 결합하여 형성된 고리가 동시에 존재할 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 리포터는 화학식 1로 표시되며, Z1은 OR7인 경우, R7은 R3 또는 R4와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 리포터는 화학식 2로 표시되며, Z2는 NR8 인 경우, R8은 R3 또는 R4와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다.
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환된 고리를 형성할 경우, 상기 고리 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 (1) 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 임의의 작용기로 치환되거나, (2) 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 표지용 리포터는 하기의 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시될 수도 있다. 본원에 달리 정의되지 않는 한 하기의 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 핵산 표지용 리포터는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 핵산 표지용 리포터와 중복되는 범위 내에서 동일하다.
[화학식 5]
[화학식 6]
여기서,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R15은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있다.
이 때, R1 내지 R15 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
또한, 상기 R1 내지 R15 중 임의의 작용기가 치환된 작용기인 경우, 상기 작용기 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 (1) 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 임의의 작용기로 치환되거나, (2) 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 리포터는 R1 내지 R15 중 적어도 하나에 존재하는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기를 통해 표적 생체분자(예를 들어, 핵산)와 결합하여 표지하는 것이 가능하다.
이 때, R1 내지 R15 중 적어도 하나는 말단이 포스포아미디트 또는 활성 에스터로 치환된 작용기일 수 있다.
R1 내지 R15는 상기에 정의된 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서, R1 내지 R15 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다. 또한 상기 고리는 지방족 또는 방향족 고리일 수 있다.
R1 내지 R15 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 때, R1 내지 R11 중 적어도 하나가 C, N, Se 또는 Si를 매개로 인접한 치환기와 서로 결합하거나, 단결합에 의해 직접적으로 인접한 치환기와 결합할 수 있다.
또한, 일 실시예에 있어서, R12 내지 R15 중 인접한 두 치환기는 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다.
상기 R12 내지 R15 중 인접한 두 치환기에 의한 치환 또는 비치환된 고리의 형성은 서로 독립적인 것으로서, 예를 들어, 하나의 화합물 내 R12 및 R13이 서로 결합하여 형성된 고리와 R14 및 R15가 서로 결합하여 형성된 고리가 동시에 존재할 수 있다.
R1 내지 R15 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환된 고리를 형성할 경우, 상기 고리 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 (1) 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 임의의 작용기로 치환되거나, (2) 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환될 수 있다.
본원에서, Ra (a는 1 내지 14 사이의 임의의 정수임)가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 40개 이하(예를 들어, C1-C10의 직쇄, C3-C10의 분쇄)일 수 있다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o- 터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3--페난트레닐, 4--페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로 아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로 아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로 아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌 옥사이드는 수용성 폴리머 작용기로서 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리에틸렌 글라이콜-폴리프로필렌 글라이콜(PEG-PPG) 코폴리머 및 N-치환된 메타크릴아마이드-함유 폴리머 및 코폴리머를 포함한다.
폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카르복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
또한, 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터는 카운터 이온을 더 포함할 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 리포터의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 리포터의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 및 화학식 6으로 표시되는 리포터의 구체적인 예는 다음과 같다. 다만, 하기의 예시 화합물들은 본원에 정의된 리포터의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본원에 정의된 리포터의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 하기의 예시 화합물들은 본원에 개시된 제조예 또는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 및 화학식 6으로 표시되는 리포터와 관련하여 본원에 정의된 내용을 참고하여 공지된 합성법을 통해 합성될 수 있다.
[화합물 1]
[화합물 2]
[화합물 3]
[화합물 4]
[화합물 5]
[화합물 6]
[화합물 7]
[화합물 8]
[화합물 9]
[화합물 10]
[화합물 11]
[화합물 12]
[화합물 13]
[화합물 14]
[화합물 15]
[화합물 16]
[화합물 17]
[화합물 18]
본원에서 개시된 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터의 표적이 되는 생체분자는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 핵산(DNA, RNA 또는 뉴클레오티드 포함)로부터 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 핵산(DNA, RNA 또는 뉴클레오티드 포함)일 수 있다.
지질의 구체적인 예로는 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 리포폴리당류(lipopolysaccharides) 등이 있으며, 탄수화물의 구체적인 예로는 단당류, 이당류, 다당류(예를 들어, 덱스트란)을 포함한다.
이 때, 생체분자는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터의 임의의 작용기 또는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터에 결합된 반응성기와 반응하기 위한 작용기로서, 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가질 수 있다.
또한, 생체분자는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가지는 옥시 또는 디옥시 폴리핵산일 수 있다.
아울러, 생체분자 이외에 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬(수용체 리간드 포함), 수용체, 효소 또는 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물 또는 나노 바이오 소재(폴리스타이렌 마이크로스피어 등) 등을 표지하기 위해 사용될 수 있다.
신규 리포터를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 핵산 검출용 조성물, 핵산 검출용 지지체
본 발명의 다른 측면에 따르면, 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
올리고뉴클레오티드는 1 내지 수백개의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하는 것으로, DNA, RNA, 또는 PNA를 모두 포함한다. 또한 이들의 유사체들, 예를 들어 상기 뉴클레오티드에 화학적 변경이 가해진 것, 또는 당이 결합된 것들 등 통상의 기술자가 용이하게 변형을 가할 수 있는 것들을 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 된 것을 모두 포함하는 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 프로브는 핵산, 펩타이드, 사카라이드, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 항체 또는 이들의 조합에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 소광자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터가 표지되고, 3' 말단에는 소광자가 표지될 수 있다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
본원에서 사용 가능한 소광자의 최대 흡광도는 620 내지 700 nm, 바람직하게는 660 내지 680일 수 있으며, 상기 소광자의 흡광도 범위는 530 내지 730 nm일 수 있다. 또한, 상기 소광자가 가지는 최대 흡광도 및 흡광도 범위는 본원에 정의된 리포터의 형광 특성을 고려하여 적절히 선택될 수 있을 것이다.
상기 프로브는 상기 리포터가 신호 혼선을 최소화한 상태로 상기 소광자에 의해 충분히 소광될 수 있도록 설계되는 것이 중요하다. 이에 따라, 프로브를 설계할 때, 타겟으로 하는 생체 분자(예를 들어, 핵산)의 유형에 따라 상기 프로브의 5' 말단과 3' 말단에 각각 표지된 상기 리포터와 상기 소광자가 호환되는 것을 확인하는 것이 필요하다.
상기 소광자로는 공지된 또는 상용화된 다양한 소광자(예를 들어, BHQ0, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ650, DABCYL, TAMRA, MGBEclipse, Atto540Q, Atto575Q, Atto612Q, QSY7, QSY21 등)가 사용될 수 있다. 또한, 상기 소광자로는 한국공개특허공보 제10-2020-0067733호에 기재된 소광자가 사용될 수 있다. 한국공개특허공보 제10-2020-0067733호에 기재된 소광자의 대표적인 예는 다음과 같다.
[소광자 1]
[소광자 2]
[소광자 3]
[소광자 4]
[소광자 5]
[소광자 6]
[소광자 7]
[소광자 8]
[소광자 9]
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 핵산과의 결합력을 향상시키기 위해 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder)를 더 포함할 수 있다.
상기 마이너 그루브 바인더는 DNA와 같은 핵산 내 포함된 마이너 그루브(예를 들어, DNA helix 내 shallow furrow)에 선택적으로 비공유결합을 할 수 있는 반월형(crescent-shaped) 프로브이다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 화학적, 생물학적 영역에서 다양하게 활용할 수 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 또는 마이크로어세이(microassay) 등에 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물은 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터와 마이너 그루브 바인더 및 소광자를 동시에 포함하는 올리고뉴클레오티드와 함께 표적 생체분자와의 반응을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 리포터에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터, 지지체 및 상기 리포터와 상기 지지체를 연결하는 링커를 포함하는 핵산 검출용 지지체가 제공된다.
이에 따라, 샘플 내 생체분자는 지지체 상에 고착화된 리포터와의 상호작용을 통해 지지체 상에 고정될 수 있다.
이 때, 상기 지지체에 상기 링커를 매개로 하여 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터만 연결되는 대신 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터와 소광자로 이중 표지된 프로브가 연결될 수도 있다.
이 때, 상기 프로브는 전술한 바와 같이 5' 말단에 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터가 표지되고, 3' 말단에 소광자가 표지되고, 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치한 형태를 가질 수 있다.
상기 지지체는 유리(예를 들어, CPG (controlled pore glass)), 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌, 레진, 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 또는 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 지지체는 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
여기서, 링커는 리포터와 지지체를 연결하는 부분으로서, 리포터와 지지체를 연결할 수 있는 임의의 물질은 모두 본원에서 의도한 링커로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 링커는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C30 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로아릴, 아마이드(-CONH-), 에스터(-COO-), 케톤(-CO-), 뉴클레오사이드 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 링커를 매개로 한 상기 지지체와 상기 소광자의 연결 구조의 예시는 아래와 같다.
[연결 구조 1]
[연결 구조 2]
[연결 구조 3]
[연결 구조 4]
[연결 구조 5]
[연결 구조 6]
[연결 구조 7]
[연결 구조 8]
[연결 구조 9]
[연결 구조 10]
[연결 구조 11]
[연결 구조 12]
[연결 구조 13]
이러한 링커는 리포터와 지지체를 연결할 뿐 리포터 또는 형광단의 다른 반응 또는 형광 및 소광 작용에 영향을 미치지 않는다.
핵산 검출 방법
본 발명의 일 실시예에 따르면, 표적 핵산에 리포터로 표지된 프로브 또는 리포터와 소광자로 이중 표지된 프로브를 반응시켜 표지하는 방법이 구현될 수 있다. 또한, 표적 생체분자의 종류에 따라 리포터에 적절한 반응성기를 도입함으로써 표적-특이적 상호작용을 이용한 생체분자의 표지 방법이 구현될 수도 있다. 아울러, 리포터로 표지한 생체분자를 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로 어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응시켜 표지하는 한편, 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬으로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화하여, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
단일사슬로 변성시킨 표적 핵산을 기판 위에 고정하고, 올리고뉴클레오티드와 혼성화한다. 여기서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 형광단이 표지되고, 3' 말단에는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터로부터 선택되는 적어도 하나가 표지된다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
혼성화는 실온~70℃, 그리고 2~48시간의 범위에서 하는 것이 바람직하다. 혼성화에 의해 프로브 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산이 선택적으로 프로브 핵산과 결합한다. 그 후, 기판을 세정하고 실온에서 건조한다.
이 때, 올리고뉴클레오티드는 프로브에 의해 표적 핵산에 혼성화되지만 5' 말단의 형광단은 3' 말단의 리포터에 의해 소광된 상태로 존재한다.
이어서, 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오티드는 중합 효소에 의해 신장되는데, 올리고뉴클레오티드는 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 표적 핵산으로부터 분리 및 분해되며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 형광단과 3' 말단의 리포터는 서로 분리되며, 이에 따라 형광단은 형광을 발할 수 있게 된다.
이 때, 발생하는 형광 강도를 측정하여 표적 핵산의 증폭량을 측정할 수 있게 된다.
PCR법
PCR법은 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 리포터로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 리포터를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다.
또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 리포터를 결합하여, 리포터가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다.
이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다.
통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확률로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 리포터로 표지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 리포터를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다.
또한, 터미네이터 대신에 미리 리포터로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH (in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 리포터로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다.
이를 위해, 형광염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다.
예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 리포터를 특이결합을 사용한 타겟의 표지 방법에도 사용할 수 있다.
즉, 타겟을 포함하는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 표지에 있어, 피검체에 특이적으로 결합하는 결합 물질 또는 수식 물질에 특이적으로 결합하는 결합물질 중 하나를, 리포터로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합에는, 항원-항체, 합텐-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag 항원, Tag 항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체를 사용할 수 있다.
구체적으로는 기판, 용액, 비즈 또는 항체에 존재하는 항원에 대하여 리포터로 표지한 항체 등의 결합 물질을 반응시켜, 항체의 항원 특이적 상호작용을 통해 특정 항원을 표지할 수 있다.
항원으로는 단백질, 다당류, 핵산, 펩티드 등이 가능하며, 항원 이외에 FITC나 디니트로페닐기 등의 저분자량 분자과 같은 합텐도 사용 가능하다. 이 때, 항원(또는 합텐)과 항체의 조합으로는 GFP와 항GFP항체, FITC와 항FITC 항체 등이 있다.
표지된 항원들은 면역염색, ELISA, Western blotting 또는 Flow cytometry 등과 같은 각종 측정 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다.
뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 리포터를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다.
RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 리포터로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 리포터는 조직 또는 세포 내의 표적 핵산 또는 표적 단백질을 표지할 수 있는 반응성기를 포함함으로써 표적 핵산의 전사 수준 또는 표적 단백질의 발현 수준을 확인하기 위한 염료로서 사용될 수 있다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다. 또한, 본원의 청구항 및 상세한 설명에 정의된 리포터 중 하기의 제조예를 통해 합성 방법이 개시되지 않은 화합물은 하기의 제조예를 참고하여 합성될 수 있을 것이다.
제조예 1. 화합물 1의 합성
중간체(intermediate) 2의 합성
1L 1구 반응기에 중간체 1 (국제공개특허공보 2004-039894를 참조하여 합성)(26 g, 0.113 mmol), 트리에틸아민(34 g, 0.341 mmol), 무수아세트산(23 g, 0.227 mol), N, N-디메틸아미노피리딘(1.4 g, 0.0113 mol), 디클로로메탄(300 mL)를 넣고 상온에서 2시간 교반하였다. 반응기에 물(300 mL)을 넣고 강하게 교반하고 유기층을 분리하였다. 무수황산마그네슘을 넣고 5분간 교반한 후 고체를 여과하고, 여액을 농축하였다.
중간체(intermediate) 3의 합성
500 mL 1구 반응기에 중간체 2 (29 g, 0.107 mol), 2-(2-브로모에틸)-1,3-다이옥소란(29 g, 0.160 mol), 포타슘 아이오다이드(35 g, 0.213 mol)를 아세토니트릴(300 mL)에 넣고 12시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후 고체를 여과하고, 여액은 농축 후 컬럼정제하였다.
중간체(intermediate) 4의 합성
500 mL 1구 반응기에 중간체 3 (33 g, 0.0668 mol), 8-히드록시주롤리딘-9-카복스알데히드(13 g, 0.0601 mol), 에탄올(300 mL)에 넣고 12시간 동안 환류 교반하고, 냉각 후 농축하였다.
중간체(intermediate) 5의 합성
1L 1구 반응기에 중간체 4 (46 g, 0.0668 mol), 50% 황산수용액(90 mL), 클로로포름(470 mL)을 넣고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응기에 물(300 mL)을 넣고 강하게 교반한 후 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 후 고체를 여과하고, 여액은 농축 후 컬럼정제하였다.
화합물 1의 합성
500 mL 1구 반응기에 중간체 5 (13 g, 0.0219 mol), 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미디트(6.7 g, 0.0285 mol), 트리에틸아민(34 g, 0.341 mmol), 디클로로메탄(260 mL)를 넣고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응기에 물 (300 mL)을 넣고 강하게 교반한 후 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 후 고체를 여과하고, 여액은 농축 후 컬럼정제하였다.
수득한 화합물 1의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.72-7.71 (m, 1H), 7.46-7.32 (m, 4H), 6.93 (d, 1H, J = 11.1 Hz), 5.64-5.50 (m, 1H), 4.65-4.42 (m, 2H), 3.83-3.70 (m, 2H), 3.55-3.42 (m, 8H), 3.10-2.90 (m, 1H), 2.81-2.54 (m, 6H), 2.41-2.09 (m, 2H), 1.80-1.66 (m, 3H), 1.48-1.08 (m, 16H), 0.97-0.94 (m, 1H), 0.68-0.53 (m, 1H)
제조예 2. 화합물 2의 합성
중간체(intermediate) 7의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 6 (한국공개특허공보 제10-2017-0009795호를 참조하여 합성) (3.5 g, 5.41 mmol), 2-(메틸아미노)에탄올 (0.4 g, 5.41 mmol), N-메틸몰폴린(1.6 g, 16.24 mmol), HATU (CAS No.148893-10-1) (2.4 g, 6.49 mmol), 디메틸포름아미드(35 mL)를 넣고 상온에서 1시간 교반하고 농축 후 컬럼정제하였다.
화합물 2의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 7 (2.2 g, 3.14 mmol), 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미디트(0.8 g, 3.458 mol), 트리에틸아민(0.8 g, 7.86 mmol), 디클로로메탄(45 mL)를 넣고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응기에 물 (50 mL)을 넣고 강하게 교반한 후 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 후 고체를 여과하고, 여액은 농축 후 컬럼정제하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.72-7.70 (m, 1H), 7.48-7.26 (m, 4H), 6.95-6.90 (m, 1H), 5.36-5.29 (m, 1H), 4.43-4.08 (m, 2H), 3.86-3.65 (m, 4H), 3.63-3.44 (m, 8H), 3.02-2.90 (m, 3H), 2.80-2.56 (m, 7H), 2.47-2.05 (m, 1H), 2.29-1.97 (m, 8H), 1.73-1.65 (m, 3H), 1.50-1.12 (m, 16H), 0.98-0.87 (m, 1H), 0.67-0.57 (m, 1H)
제조예 3. 이중 표지 프로브(올리고뉴클레오티드)의 합성
Universal UnyLinker Support (Chemgene, 500Å)를 사용하여 BQCV (black queen cell virus)에 대한 forward primer로서 5'-GCGGGAGATGATATGGACTT-3' 및 reverse primer로서 5'-CCGTCTGAGATGCATGAATAC-3'를 각각 1 μmol scale로 합성하였다.
우선, 소광자-CPG를 사용하여 단일 표지 프로브로서 5'-CCATCTTTATCGGTACGCCGCCC-소광자-3'를 합성한 다음(한국공개특허공보 제10-2020-0067733호를 참조하여 합성함), MerMadeTM 48X DNA Synthesizer를 사용하여 5'-CCATCTTTATCGGTACGCCGCCC-소광자-3'의 5' 말단에 리포터로서 화합물 1과 상용화된 형광 물질인 Cal Fluor® Red 610, Texas Red® 및 ROX를 각각 표지한 이중 표지 프로브를 합성하였다.
합성된 이중 표지 프로브의 형태는 하기의 표 1에 나타내었다.
| 구분 | 이중 표지 프로브 |
| 실시예 1 | 5'-화합물 1-프로브-소광자-3' |
| 비교예 1 | 5'- Cal Fluor® Red 610-프로브-소광자-3' |
| 비교예 2 | 5'- Texas Red®-프로브-소광자-3' |
| 비교예 3 | 5'-ROX-프로브-소광자-3' |
상기 제조예 3에서 사용된 소광자-CPG의 구조는 다음과 같다.
상기 제조예 3에서 리포터로서 사용된 화합물 1, Cal Fluor® Red 610, Texas Red® 및 ROX의 흡수/발광 파장 영역은 하기의 표 2에 나타내었으며, 소광자의 흡수 파장 영역은 하기의 표 3에 나타내었다.
| 리포터 | Excitationmax (nm) | Emissionmax (nm) |
| 화합물 1 | 602 | 628 |
| Cal Fluor® Red 610 | 590 | 610 |
| Texas Red® | 595 | 615 |
| ROX | 588 | 608 |
| 구분 | λMax(nm) | ε (mol-1·cm-1) |
| 소광자 | 660-680 | 140,000 |
제조예 4. 이중 표지 프로브(올리고뉴클레오티드)의 합성
Universal UnyLinker Support (Chemgene, 500Å)를 사용하여 CT (Chlamydia trachomatis)에 대한 forward primer로서 5'-ATGCAACATTAACCCGAGATACG-3' 및 reverse primer로서 5'-ACTCGGCTTGGGAAGAGCTT-3'를 각각 1 μmol scale로 합성하였다.
우선, 소광자-CPG (제조예 3에서 사용된 것과 동일함)를 사용하여 단일 표지 프로브로서 5'-TTGTCCATATCTTTGATACGACGCCGC-소광자-3'를 합성한 다음(한국공개특허공보 제10-2020-0067733호를 참조하여 합성함), MerMadeTM 48X DNA Synthesizer를 사용하여 5'-TTGTCCATATCTTTGATACGACGCCGC-소광자-3'의 5' 말단에 리포터로서 화합물 2와 상용화된 형광 물질인 Cal Fluor® Red 610, Texas Red® 및 ROX를 각각 표지한 이중 표지 프로브를 합성하였다.
합성된 이중 표지 프로브의 형태는 하기의 표 4에 나타내었다.
| 구분 | 이중 표지 프로브 |
| 실시예 2 | 5'-화합물 2-프로브-소광자-3' |
| 비교예 1 | 5'- Cal Fluor® Red 610-프로브-소광자-3' |
| 비교예 2 | 5'- Texas Red®-프로브-소광자-3' |
| 비교예 3 | 5'-ROX-프로브-소광자-3' |
상기 제조예 4에서 리포터로서 사용된 화합물 2의 흡수/발광 파장 영역은 하기의 표 5에 나타내었다.
| 리포터 | Excitationmax (nm) | Emissionmax (nm) |
| 화합물 2 | 602 | 628 |
실험예 1. 이중 표지 프로브를 사용한 Real-Time PCR 실험
제조예 3에 따라 합성된 각각의 이중 표지 프로브를 사용하여 하기의 표 6에 기재된 조성으로 BQCV (black queen cell virus) plasmid DNA에 대한 Real-Time PCR을 2회 반복 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). 상기 Real-Time PCR 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
| 구분 | 함량(μl) |
| (Enzynomics)TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (TaqMan Probe) | 10 |
| gDNA (10ng/μl) | 1 |
| Beta-actin F/R MIX (5pmole/μl) | 1 |
| 이중 표지 프로브(3pmole/μl) | 3 |
| DEPC water | 5 |
실험예 2. 이중 표지 프로브를 사용한 Real-Time PCR 실험
제조예 4에 따라 합성된 각각의 이중 표지 프로브를 사용하여 하기의 표 7에 기재된 조성으로 CT (Chlamydia trachomatis) plasmid DNA에 대한 Real-Time PCR을 2회 반복 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). 상기 Real-Time PCR 결과는 도 4 내지 도 6에 나타내었다.
| 구분 | 함량(μl) |
| (Bioline)SensiFASTTM Probe No-ROX Mix (2X) | 10 |
| CT plasmid DNA (20 fg/μl) | 1 |
| CT F/R primer mix (10 pmole/μl) | 1 |
| CT Dual-labeled probe (5 pmole/μl) | 3 |
| DEPC water | 5 |
상기 Real-Time PCR 결과를 참조하면, 화합물 1 및 화합물 2와 상용화된 형광 물질인 Cal Fluor® Red 610, Texas Red® 및 ROX를 각각 리포터로서 포함하는 이중 표지 프로브를 사용한 Real-Time PCR의 평균 Ct 및 RFU 값을 고려할 때, 거의 유사한 수준의 PCR 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
다만, 리포터로서 화합물 1 또는 화합물 2를 사용한 이중 표지 프로브의 경우, 상용화된 다른 형광 물질 대비 상대적으로 낮은 Ct 값을 나타내고, 최종적으로 증폭되는 RFU 값이 높게 형성된 것을 확인할 수 있다.
이는 분자 진단 측면을 고려할 때, 화합물 1 또는 화합물 2의 검출 한계(LoD, Limit of Detection)가 기존 상용화된 다른 형광 물질 대비 낮기 때문에 화합물 1 또는 화합물 2를 이중 표지 프로브의 리포터로서 사용할 경우, 샘플 내 타겟 DNA 또는 RNA가 상대적으로 낮은 농도로 존재하더라도 상용화된 다른 형광 물질 대비 검출 용이성이 높을 수 있음을 의미한다.
따라서, 본원에 정의된 핵산 표지용 리포터는 기존 핵산 표지 및 검출 분야(예를 들어, PCR 실험 등)에 적용하거나, 기존 상용화된 형광 물질을 충분히 대체할 수 있을 것이다.
이상, 본 발명의 몇몇 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
Claims (19)
- 하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 핵산 표지용 리포터.
[화학식 1]
[화학식 2]
여기서,
Ar1은 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C6-C20의 헤테로아릴이며,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성하며,
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
- 제1항에 있어서,
상기 리포터는 화학식 1로 표시되며,
Z1은 NR5R6이며,
R5 또는 R6는 R3 또는 R4와 서로 결합하여 고리를 형성하는,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
상기 리포터는 화학식 1로 표시되며,
Z1은 OR7이며,
R7은 R3 또는 R4와 서로 결합하여 고리를 형성하는,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
상기 리포터는 화학식 2로 표시되며,
Z2는 NR8이며,
R8은 R3 또는 R4와 서로 결합하여 고리를 형성하는,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
상기 활성 에스터는 N-하이드록시석신이미드 유도체, 하이드록시벤조트리아졸 유도체, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 유도체, 나이트로페놀 유도체 및 펜타플루오로페놀 유도체로부터 선택되는,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 말단이 포스포아미디트 또는 활성 에스터로 치환된 작용기인,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 하기의 화학식 3으로 표시되는 작용기로 치환된 임의의 작용기인,
핵산용 리포터.
[화학식 3]
여기서,
*는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타내며,
x는 2 내지 10 사이의 정수이며,
E는 포스포아미디트 또는 활성 에스터이다.
- 제1항에 있어서,
R1 내지 R11 중 적어도 하나는 하기의 화학식 4로 표시되는 작용기로 치환된 임의의 작용기인,
핵산 표지용 리포터.
[화학식 4]
여기서,
*는 상기 작용기가 결합되는 위치를 나타내며,
x는 2 내지 10 사이의 정수이며,
y는 1 내지 5 사이의 정수이며,
z는 0 내지 5 사이의 정수이며,
R'은 수소, 중수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬이며,
E는 포스포아미디트 또는 활성 에스터이다.
- 제1항에 있어서,
Y는 CR9R10이며,
R9 및 R10 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기인,
핵산 표지용 리포터.
- 제1항에 있어서,
하기의 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 핵산 표지용 리포터.
[화학식 5]
[화학식 6]
여기서,
Z1은 NR5R6 또는 OR7이며,
Z2는 NR8 또는 O이며,
X는 O 또는 S이며,
Y는 CR9R10, NR11, O 또는 S이며,
R1 내지 R15은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C20 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나, 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성하며,
R1 내지 R15 중 적어도 하나는 포스포아미디트 또는 활성 에스터(active ester)로 치환된 작용기이다.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 리포터; 및
소광자;
를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 제11항에 있어서,
상기 리포터와 상기 소광자 사이에 개재된 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder)를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 제11항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 리포터 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 리포터와 소광자로 이중 표지된 프로브;
지지체; 및
상기 리포터 또는 상기 프로브와 상기 지지체를 연결하는 링커;
를 포함하는,
핵산 검출용 지지체.
- 제14항에 있어서,
상기 지지체는 유리, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌 또는 레진인,
핵산 검출용 지지체.
- 제14항에 있어서,
상기 링커는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C30 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로아릴, 아마이드(-CONH-), 에스터(-COO-), 케톤(-CO-), 뉴클레오사이드 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는,
핵산 검출용 지지체.
- (a) 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약 및 제11항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계;
(b) 상기 반응 혼합물 중 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 반응 혼합물의 형광 강도를 측정하는 단계;
를 포함하는,
핵산 검출 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 단계 (b)는,
(b-1) 상기 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오티드가 중합 효소에 의해 신장되는 단계;
(b-2) 상기 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 표적 핵산으로부터 상기 올리고뉴클레오티드의 리포터와 소광자가 분리되는 단계; 및
(b-3) 상기 리포터로부터 떨어진 상기 리포터가 형광을 발하는 단계;
를 포함하는,
핵산 검출 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 단계 (c)에서 측정된 형광 강도로부터 표적 핵산의 증폭량을 측정하는 단계 (d)를 더 포함하는,
핵산 검출 방법.
Priority Applications (2)
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-
2021
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Patent Citations (2)
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