KR20190059842A - 표지용 염료 및 이를 포함하는 표지용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광 세기가 우수한 표지용 염료 및 이를 포함하는 표지용 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 형광 세기가 우수한 표지용 염료 및 이를 포함하는 표지용 키트에 관한 것이다.
바이오 분야에서 생체 내(in vivo), 생체 외(in vitro)에서 세포수준의 생물학적인 현상을 관찰하거나, 생체 조영 및 질환부위를 검시하기 위해, 이를 가시화할 수 있는 수단으로 형광 염료가 사용되고 있다.
그린형광단백질(GFP) 등의 자체적으로 발광하는 생체 분자도 존재하지만, 일반적으로는 생체 조직이나 세포 및 그 이하 단계의 생체 분자를 형광 염료로 염색하거나, 단백질, 핵산 등의 생체 분자에 형광 염료를 표지한 후, 형광 신호를 검출할 수 있는 광학장비를 동반하여, 다양한 기법으로 영상화한 자료를 얻고 있다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flow cytometry), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(quantitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
바이오 분야에 형광 염료를 적용하기 위해서는, 일반적으로 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 광표백(photo bleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)및 양자효율(quantum efficiency)이 크며, 다양한 pH 조건에서 안정한 것이 바람직하다.
여러 연구분야에서 다양한 형광 염료가 이용되어 오고 있으나, 바이오 분야에서 상술한 조건들을 모두 만족시키는 형광 염료는 드물며, 현재 사용되고 있는 대표적인 구조로는 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridines) 등이 있다. 이 중에서도 특히 로다민 유도체와 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체가 주를 이루고 있다.
특히, 시아닌계 형광 염료는, 폴리메틴 양쪽 말단 부위에 질소를 포함한 헤테로 고리로 연결되어 있으며, 폴리메틴 길이를 조절함으로써 450nm에서 800nm의 가시광선, 근적외선 전영역에 걸쳐 다양한 형광을 구현할 수 있는 구조적 장점뿐만 아니라, 일반적으로 매우 높은 흡광계수를 가지는 광학적 특징이 있다.
본 발명에 관련된 배경기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0026245호(2017.03.08. 공개)가 있으며, 상기 문헌에는 페릴렌계 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 형광 염료가 기재되어 있다.
본 발명은 광학 영상 분야에서 생체 분자를 포함한 다양한 타겟의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 화합물로서 신규한 표지용 염료 및 이를 포함하는 표지용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 표지용 염료가 제공된다.
하기의 화학식 1로 표시되는 표지용 염료:
[화학식 1]
여기서,
L1은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L2는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
R1은 카복실, 숙신이미딜 에스터, 설포-숙신이미딜 에스터, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 할로아세트아마이드, 하이드라자이드, 바이닐설폰, 다이클로로트리아진, 포스포라미다이트, 알킬 할라이드, 아실 할라이드, 카보하이드라자이드, 하이드록실아미노, 케톤, 알카인, 아자이드, 지방족 및 방향족 아미노, 설포테트라플루오로페닐 에스터, 설포다이클로로페닐 에스터(, 카보닐 아자이드, 설포닐 클로라이드, 설포닐 플루오라이드, 보론산, 이소시아네이트, 할로겐-치환 트리아진, 할로겐-치환 피리딘, 할로겐-치환 다이아진, 테트라플루오로페닐 에스터, 이미도 에스터, 아지도나이트로페닐, 글리옥살 및 알데하이드로부터 선택되는 반응성기 또는 아미노, 하이드록실, 포스포릴, 알데하이드, 카르복실 및 설프하이드릴로부터 선택되는 작용기와 공유 결합가능한 작용기이며,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 황, 산소, NR2 및 CR2R3로부터 선택되며, X3은 황, 산소, NR2 또는 N-NR2이며,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되며,
Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되며,
Ar1 또는 Ar2가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소는 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C40 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤, 알데하이드, 에스터, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 게르마늄, 에테르, 나이트릴, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택되는 작용기로 치환되며,
상기 L은 단결합 또는 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이다.
본 발명에 따른 표지용 염료는 형광 세기가 우수하여 생체 분자를 포함한 다양한 타겟을 표지하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
신규한 표지용 염료
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 표지용 염료가 제공된다.
[화학식 1]
여기서, L1은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L2는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이다.
R1은 반응성기로서, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 표지용 염료가 반응성기를 통해 타겟 생체 분자와 결합하여 표지하도록 기능한다.
여기서, X는 카복실, 숙신이미딜 에스터, 설포-숙신이미딜 에스터, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 할로아세트아마이드, 하이드라자이드, 바이닐설폰, 다이클로로트리아진, 포스포라미다이트, 알킬 할라이드, 아실 할라이드, 카보하이드라자이드, 하이드록실아미노, 케톤, 알카인, 아자이드, 지방족 및 방향족 아미노, 설포테트라플루오로페닐 에스터, 설포다이클로로페닐 에스터, 카보닐 아자이드, 설포닐 클로라이드, 설포닐 플루오라이드, 보론산, 이소시아네이트, 할로겐-치환 트리아진, 할로겐-치환 피리딘, 할로겐-치환 다이아진, 테트라플루오로페닐 에스터, 이미도 에스터, 아지도나이트로페닐, 글리옥살 및 알데하이드로부터 선택되는 반응성기 또는 아미노, 하이드록실, 포스포릴, 알데하이드, 카르복실 및 설프하이드릴로부터 선택되는 작용기와 공유 결합가능한 작용기이다.
상술한 반응성기들은 타겟 생체 분자의 아미노기, 이미노기, 티올기 또는 하이드록실기 등과 같은 작용기와 반응할 수 있는 관능기로서, 표지용 염료와 타겟 생체 분자 사이에 아미드 결합, 이미드 결합, 우레탄 결합, 에스터 결합 또는 구아니딘 결합과 같은 공유결합을 형성할 수 있다.
아울러, 반응성기(X)는 링커(L1 및 L2)를 매개로 하여 표지용 염료의 본 골격에 결합됨으로써 생체 분자와 표지용 염료 사이의 입체 장애를 완화할 수 있으며, 이에 따라 복잡한 구조를 가지는 핵산, 단백질, 탄수화물 등과 같은 생체 분자에 대한 표지율을 향상시킬 수 있다.
X1 및 X2는 각각 독립적으로 황, 산소, NR2 및 CR2R3로부터 선택되며, X3은 황, 산소, NR2 또는 N-NR2이며, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.
또한, R2 또는 R3가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있다. 이 때, R3 또는 R4가 아마이드로 치환된 경우, 1 내지 4개의 아마이드기를 포함할 수 있다.
또한, R2 또는 R3가 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 경우, 상기 치환기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 수용성기(water soluble group)로 치환될 수 있다. 상기 수용성기는 설폰산, 설폰산염, 인산, 인산염, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염 등을 예로 들 수 있다.
또 다른 예에 있어서, X1 또는 X2가 CR2R3인 경우, R2 및 R3는 서로 결합하여 4원자, 5원자 또는 6원자 탄화수소 고리를 형성할 수 있다.
Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.
Ar1 또는 Ar2가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소는 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C40 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤, 알데하이드, 에스터, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 게르마늄, 에테르, 나이트릴, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택되는 작용기로 치환될 수 있다.
또한, Ar1 또는 Ar2가 치환 또는 비치환된 C1- C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1- C40 할로알킬, 치환 또는 비치환된 알킬아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 케톤, 알데하이드, 에스터, 폴리알킬렌 옥사이드 및 아실클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 경우, 상기 치환기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 수용성기(water soluble group)로 치환될 수 있다.
또 다른 예에 있어서, Ar1 또는 Ar2가 치환된 경우, 인접한 2개 이상의 치환기는 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있으며, 인접한 2개 이상의 치환기가 서로 결합하여 형성한 고리를 방향족성이거나 비방향족성일 수 있다.
상기 L은 단결합 또는 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이다. 이러한 형광단으로는 쿠마린, 시아닌, 보디피, 플로세인, 로다민, 피렌, 카르보피로닌, 옥사진, 잔텐, 티오잔텐 또는 아크리딘이 선택될 수 있다.
다른 예에 있어서, 상기 L은 탄소, 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1-20개의 비수소 원자를 포함하거나, -NHCOO-, -CONH-, -CH2NH-, -CH2NR6-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -NR6-, -(CH2-CH2-O-)p-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR6-으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에 있어서, 상기 L은 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
-L3-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L4-
여기서, L3 및 L4는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
본원에서, Ra가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 40개 이하(예를 들어, C1-C10의 직쇄, C3-C10의 분쇄)의 탄소 원자를 가진다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o- 터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3--페난트레닐, 4--페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로 아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로 아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로 아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌 옥사이드는 수용성 폴리머 작용기로서 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리에틸렌 글라이콜-폴리프로필렌 글라이콜(PEG-PPG) 코폴리머 및 N-치환된 메타크릴아마이드-함유 폴리머 및 코폴리머를 포함한다.
폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
또한, 화학식 1로 표시되는 표지용 염료는 카운터 이온을 더 포함하는 구조를 가질 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 표지용 염료의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 표지용 염료의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
화학식 1로 표시되는 표지용 염료의 구체적인 예는 다음과 같다.
[화합물 1]
[화합물 2]
[화합물 3]
[화합물 4]
[화합물 5]
[화합물 6]
[화합물 7]
[화합물 8]
[화합물 9]
본원에서 개시된 화학식 1로 표시되는 표지용 염료의 타겟이 되는 생체 분자는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 핵산(뉴클레오타이드 포함)로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
지질의 구체적인 예로는 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 리포폴리당류(lipopolysaccharides) 등이 있으며, 탄수화물의 구체적인 예로는 단당류, 이당류, 다당류(예를 들어, 덱스트란)을 포함한다.
이 때, 생체 분자는 화학식 1로 표시되는 표지용 염료의 임의의 작용기 또는 화학식 1로 표시되는 표지용 염료에 결합된 반응성기와 반응하기 위한 작용기로서, 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가질 수 있다.
또한, 생체 분자는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가지는 옥시 또는 디옥시 폴리핵산일 수 있다.
아울러, 화학식 1로 표시되는 표지용 염료는 상술한 생체 분자 이외에 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬(수용체 리간드 포함), 수용성 비타민, 지용성 비타민, 무기염류, 수용체, 효소 또는 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물 또는 나노 바이오 소재(폴리스타이렌 마이크로스피어 등) 등을 표지하기 위해 사용될 수 있다.
여기서, 수용성 비타민은 비타민 B군, 비타민 C, 판토텐산, 나이아신, 엽산, 비오틴 및 이노시톨 등을 포함하며, 지용성 비타민은 비타민 A, 비타민 E, 비타민 D 및 비타민 K 등을 포함할 수 있다. 또한, 무기염류로는 산칼슘, 제일인산칼슘, 제이인산칼륨, 염화칼륨, 제이인산마그네슘, 탄산수소나트륨, 산화아연, 피로인산제이철, 황산망간 및 요오드칼륨 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
표지용 키트
본 발명의 다른 측면에 따르면, 화학식 1로 표시되는 표지용 염료를 포함하는 표지용 키트가 제공될 수 있다.
또한, 필요에 따라, 표지용 키트는 타겟과의 반응을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 표지용 염료에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 표지용 키트는 타겟을 크기별로 분리한 후 상기 표지용 염료로 표지하는 전기영동 키트로 구성될 수도 있으며, 이에 따라 단백질의 크기를 동정하거나 핵산의 시퀀싱 용도로 사용할 수 있다.
또한, 상기 실시예에 따른 표지용 키트는 고상(solid phase) 또는 반-고상(semi-solid phase)의 지지 매트릭스와 상기 지지 매트릭스 상에 고착화된 화학식 1로 표시되는 표지용 염료를 포함할 수 있다.
이에 따라, 표지용 키트 내로 주입된 샘플 내 타겟은 지지 매트릭스 상에 고착화된 표지용 염료와의 상호작용을 통해 지지 매트릭스 상에 고정될 수 있다.
상기 지지 매트릭스는 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 및 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으며, 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
이하에서는 상술한 표지용 염료 또는 표지용 키트를 이용한 타겟의 표지 방법에 대하여 설명하도록 한다.
표지용 염료를 이용한 타겟의 표지 방법
화학식 1로 표시되는 표지용 염료로 타겟을 표지하는 방법으로는 표지된 고체 또는 반고체 상태의 타겟의 형광을 측정하는 표지 방법이 가능한 모든 타겟의 표지에 적용될 수 있다.
종래의 형광 염료 대신 표지용 염료를 사용함으로써, 고감도로 화학적으로 안정적이고 조작성이 뛰어난 표지 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 타겟에 표지용 염료를 직접 반응시켜 타겟을 표지하거나 타겟과 표지용 염료로 표지된 프로브를 반응시켜 표지하는 방법 등이 구현될 수 있다.
또한, 타겟의 종류에 따라 표지용 염료에 적절한 반응성기를 도입함으로써 타겟-특이적 상호작용을 이용한 타겟의 표지 방법이 구현될 수도 있다.
아울러, 표지용 염료로 표지한 타겟을 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로 어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응시켜 표지하는 한편, 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬으로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화하여, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
한편, 단일사슬으로 변성시킨 표적 핵산과 표지용 염료를 혼합하여 반응시킴으로써, 표지용 염료에 의해 표지된 표적 핵산을 조제한다. 반응온도는 실온~60℃, 반응시간은 2~48시간으로 하는 것이 바람직하다.
이어서, 표지된 표적 핵산을 기판 위에 점적하고, 혼성화한다.
혼성화는 실온~70℃, 그리고 2~48시간의 범위에서 하는 것이 바람직하다. 혼성화에 의해 프로브 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산이 선택적으로 프로브 핵산과 결합한다. 그 후, 기판을 세정하고 실온에서 건조한다.
이어서, 건조한 기판 표면의 형광강도를 형광 레이저 스캐너법에 의해 측정한다. 형광강도에 의해 유전자 발현의 레벨을 모니터링할 수 있다.
한편, 상기 혼성화는 프로브 핵산을 기판에 고정하는 방법에 대해서 설명하였지만, 미리 염료로 표지한 표적 핵산을 기판에 고정하고, 프로브 핵산을 기판 위에 점적하는 방법을 이용할 수도 있다.
PCR 법
PCR법은, 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 염료로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 염료를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다.
또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 표지용 염료를 결합하여, 표지용 염료가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다.
이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다.
통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확율로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 표지용 염료로 표지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 표지용 염료를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다.
또한, 터미네이터 대신에 미리 표지용 염료로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH (in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 표지용 염료로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다.
이를 위해, 형광염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다.
예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
또한, 단백질을 표지대상으로 하는 경우, 전기영동 후의 단백질의 표지에는 염색염료가 사용되고 있다.
통상, 전기영동 후의 겔 안에 염색염료 예를 들어, CBB (Coomassie Brilliant Blue)를 침투시켜 단백질을 염색하고, UV를 조사하여 발광시키는 방법이 사용된다.
다만, 종래의 염색 염료를 사용하는 방법은 간단하지만, 감도가 100ng 정도로 낮아, 미량의 단백질 표지에는 적합하지 않다. 또한, 겔을 통하여 염색염료를 침투시키기 때문에, 염색에 많은 시간을 요한다는 문제도 있다.
이에 대하여, 본 발명에서는 단백질을 전기영동에 의해 크기 분리한 후, 분리한 단백질에 표지용 염료를 결합시킴으로써 단백질을 표지한다.
본 발명의 표지용 염료는 반응성기를 가지고 있으며, 단백질과 빠르게 정량적으로 반응하고, 더욱이 고감도이어서, 미량의 단백질 표지에 적합하다. 더욱이, 크기 분리한 단백질을 질량 분석하여 동정(同定)할 수도 있다.
여기서, 단백질에는 알부민, 글로불린, 글루테린, 히스톤, 프로타민, 그리고 콜라겐 등의 단순 단백질, 핵단백질, 당단백질, 리보단백질, 인단백질, 금속단백질 등의 복합 단백질 중 어느 것이든 표지대상으로 할 수 있다.
예를 들어, 인단백질, 당단백질, 총단백질의 염색염료에 대응시켜 3종의 표지용 염료를 사용하고, 2차원 전기영동으로 분리한 단백질 시료에 있어서, 인단백질, 당단백질 및 총단백질을 염색할 수 있다.
또한, TOF-Mass 등의 질량분석을 함으로써 단백질을 동정할 수 있기 때문에, 특수한 단백질을 생성시키는 암이나 바이러스에 의한 감염증 등의 질병의 진단이나 치료에 응용할 수 있다.
또한, 콜라겐은 동물의 결합조직을 구성하는 단백질이며, 독특한 섬유형상 구조를 가진다. 즉, 3중 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 그 펩티드 사슬이 모여 3중 사슬을 형성한다. 콜라겐은 일반적으로 매우 면역원성이 낮은 단백질로서, 식품, 화장품, 의약품 등의 분야에서 널리 사용되고 있다.
또한, 프로브에 압타머(aptamer)를 사용할 수도 있다. 압타머는 올리고 핵산으로 이루어지며, 염기서열에 의존하여 여러가지 특징있는 입체구조를 가질 수 있기 때문에, 그 입체구조를 통하여 단백질을 포함하는 모든 생체 분자에 결합할 수 있다. 이 성질을 이용하여, 표지용 염료로 표지한 압타머를 특정 단백질에 결합시켜, 피검체와의 결합에 의한 단백질의 구조 변화에 따른 형광 변화로부터 간접적으로 피검체를 표지할 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 표지용 염료를 특이결합을 사용한 타겟의 표지 방법에도 사용할 수 있다.
즉, 타겟을 포함하는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 표지에 있어, 피검체에 특이적으로 결합하는 결합 물질 또는 수식 물질에 특이적으로 결합하는 결합물질 중 하나를, 표지용 염료로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합에는, 항원-항체, 합텐-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag 항원, Tag항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체를 사용할 수 있다.
구체적으로는 기판, 용액, 비즈 또는 항체에 존재하는 항원에 대하여 표지용 염료로 표지한 항체 등의 결합 물질을 반응시켜, 항체의 항원 특이적 상호작용을 통해 특정 항원을 표지할 수 있다.
항원으로는 단백질, 다당류, 핵산, 펩티드 등이 가능하며, 항원 이외에 FITC나 디니트로페닐기 등의 저분자량 분자과 같은 합텐도 사용 가능하다. 이 때, 항원(또는 합텐)과 항체의 조합으로는 GFP와 항 GFP항체, FITC와 항FITC 항체 등이 있다.
표지된 항원들은 면역염색, ELISA, Western blotting 또는 Flow cytometry 등과 같은 각종 측정 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지용 염료를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다.
뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 표지용 염료를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지용 염료를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다.
RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 표지용 염료로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 표지용 염료는 조직 또는 세포 내의 표적 핵산 또는 표적 단백질을 표지할 수 있는 반응성기를 포함함으로써 표적 핵산의 전사 수준 또는 표적 단백질의 발현 수준을 확인하기 위한 염료로서 사용될 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 구체적인 표지용 염료의 합성방법 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
제조예
1) [화합물 8]의 제조
1의 합성
100 mL 1구 반응기에 2-메틸벤조싸이아졸 (5 g, 0.0335 mol), 2-(2-브로모에틸)-1,3-디옥소란 (9 g, 0.0502 mol), 포타슘 아이오다이드 (11 g, 0.067 mol), 아세토니트릴 (50 mL)을 넣고 환류하에 12시간 교반하였다. 냉각 후 농축하고 컬럼정제하여 1 (10.4 g, 0.0275 mol, 82%)을 얻었다.
2의 합성
100 mL 1구 반응기에 1 (2 g, 5.3 mmol), 메틸 4-(클로로포밀)벤조에이트 (1.05 g 5.03 mmol), 피리딘 (20 mL)을 넣고 60℃에서 12시간 교반하였다. 냉각 후 농축하고 컬럼정제하여 2 (300mg, 0.729 mol, 14%)을 얻었다.
화합물 8의 합성
100 mL 1구 반응기에 2 (300mg, 0.729 mmol), 트리플릭 언하이드라이드 (122 uL, 0.729 mmol), 디클로로메탄 (5 mL)을 넣고 상온에서 1시간 교반하였다. 농축 후 반응기에 1 (275 mg, 0.729 mmol), 트리에틸아민 (107 uL, 1.458 mmol), 디클로로메탄 (5 mL)을 넣고 상온에서 12시간 교반하였다. 반응기에 50% 황산 수용액 (1.5 mL)을 넣고 상온에서 12시간 교반하였다. 반응기에 물을 넣고 디클로로메탄으로 추출한 후 유기층을 농축하고 컬럼정제하여 화합물 8 (220 mg, 0.331 mmol, 45%)을 얻었다.
2) [화합물 9]의 제조
5의 합성
100 mL 1구 반응기에 Journal of Medicinal Chemistry, 34(8), 2468-73; 1991 을 참고하여 합성한 3 (2.6 g, 0.014 mol), 4 (2 g, 0.010 mol), 아세틱언하이드라이드(25 mL)을 넣고 환류 하에 3시간 교반하였다. 냉각 후 농축하고 컬럼정제하여 5 (3.5 g, 0.01mol, 49.4%)을 얻었다.
6의 합성
반응기에 5 (3.5g, 0.01mol) 넣고 클로로포름 300ml를 넣고 교반하였다. 50% 황산 수용액(15 mL)을 넣고 상온에서 12시간 교반한 후 반응기에 물을 넣고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 농축하고 컬럼정제하여 6 (500 mg, 0.001 mol, 18.1%)을 얻었다.
화합물 9의 합성
6 (150.0 mg, 0.249mmol)과 N,N'-다이석시니미딜 카보네이트(191.3 mg, 0.747mmol), 다이아이소프로필에틸아민(96.5mg, 0.75mmol)을 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 다이에틸에테르로 침천 후 역상 컬럼 정제하여 화합물 9을 얻었다.
실험예
제조예에서 얻어진 [화합물 8] 및 [화합물 9]에 대하여 광물리적 특성을 평가하였으며, 평가 결과는 하기의 표 1에 나타내었다. 최대 흡수 파장(λabs, max), 최대 형광 파장(λPL, max), 몰 흡광계수(ε at λmax) 및 양자효율(Φ)을 각 용매별로 측정하였다. 측정은 DMSO, 에탄올(EtOH), 메틸렌클로라이드(MC), 물(water) 및 PBS에서 수행되었다.
| 구분 | DMSO | EtOH | MC | Water | PBS | |
| 화합물 12 | λabs, max/ ε at λmax |
584/ 129,000 |
578/ 137,000 |
582/ 150,000 |
572/ 107,000 |
572/ 126,000 |
| λPL, max/ Φ |
609/ 0.843 |
597/ 0.796 |
599/ 0.904 |
590/ 0.544 |
592/ 0.468 |
|
| 화합물 13 | λabs, max/ ε at λmax |
576/ 64,000 |
570/ 65,000 |
576/ 66,000 |
564/ 46,000 |
564/ 57,000 |
| λPL, max/ Φ |
595/ 0.525 |
588/ 0.493 |
592/ 0.579 |
581/ 0.295 |
582/ 0.290 |
|
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 [화합물 8] 및 [화합물 9]는 최대 흡수 파장과 최대 형광 파장이 각각 500 nm 이상에서 나타나는 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 하기의 화학식 1로 표시되는 표지용 염료:
[화학식 1]
여기서,
L1은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L2는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
R1은 카복실, 숙신이미딜 에스터, 설포-숙신이미딜 에스터, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 할로아세트아마이드, 하이드라자이드, 바이닐설폰, 다이클로로트리아진, 포스포라미다이트, 알킬 할라이드, 아실 할라이드, 카보하이드라자이드, 하이드록실아미노, 케톤, 알카인, 아자이드, 지방족 및 방향족 아미노, 설포테트라플루오로페닐 에스터, 설포다이클로로페닐 에스터(, 카보닐 아자이드, 설포닐 클로라이드, 설포닐 플루오라이드, 보론산, 이소시아네이트, 할로겐-치환 트리아진, 할로겐-치환 피리딘, 할로겐-치환 다이아진, 테트라플루오로페닐 에스터, 이미도 에스터, 아지도나이트로페닐, 글리옥살 및 알데하이드로부터 선택되는 반응성기 또는 아미노, 하이드록실, 포스포릴, 알데하이드, 카르복실 및 설프하이드릴로부터 선택되는 작용기와 공유 결합가능한 작용기이며,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 황, 산소, NR2 및 CR2R3로부터 선택되며, X3은 황, 산소, NR2 또는 N-NR2이며,
R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되며,
Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되며,
Ar1 또는 Ar2가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소는 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C40 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤, 알데하이드, 에스터, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 게르마늄, 에테르, 나이트릴, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택되는 작용기로 치환되며,
상기 L은 단결합 또는 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이다.
- 제1항에 있어서,
Ar1 또는 Ar2가 치환된 경우, 인접한 2개 이상의 치환기는 서로 결합하여 고리를 형성하는,
표지용 염료.
- 제1항에 있어서,
상기 L은 하기의 화학식 2로 표시되는 표지용 염료:
[화학식 2]
-L3-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L4-
여기서,
L3 및 L4는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며,
A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며,
x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
- 제1항에 있어서,
상기 Z는 쿠마린, 시아닌, 보디피, 플로세인, 로다민, 피렌, 카르보피로닌, 옥사진, 잔텐, 티오잔텐 및 아크리딘으로부터 선택되는 형광단인,
표지용 염료.
- 제1항에 있어서,
상기 염료는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물 및 핵산으로부터 선택되는 적어도 하나의 생체 분자를 표지하는,
표지용 염료.
- 제1항에 있어서,
상기 염료는 아미노, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬, 수용성 비타민, 지용성 비타민, 무기염류, 수용체, 효소, 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물, 폴리스타이렌 및 마이크로스피어로부터 선택되는 적어도 하나를 표지하는,
표지용 염료.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 표지용 염료를 포함하는 표지용 키트.
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|---|---|---|---|---|
| KR20230120998A (ko) * | 2022-02-10 | 2023-08-17 | 에스에프씨 주식회사 | 신규한 화합물 및 이의 용도 |
-
2018
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