KR20230120998A - 신규한 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 화합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230120998A
KR20230120998A KR1020230015331A KR20230015331A KR20230120998A KR 20230120998 A KR20230120998 A KR 20230120998A KR 1020230015331 A KR1020230015331 A KR 1020230015331A KR 20230015331 A KR20230015331 A KR 20230015331A KR 20230120998 A KR20230120998 A KR 20230120998A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
compound
protecting groups
functional group
Prior art date
Application number
KR1020230015331A
Other languages
English (en)
Inventor
이도민
시호영
고우탐 마산타
엄민수
송주만
신봉기
제종태
Original Assignee
에스에프씨 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에스에프씨 주식회사 filed Critical 에스에프씨 주식회사
Publication of KR20230120998A publication Critical patent/KR20230120998A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/319—Exonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 화합물 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 생체 분자(예를 들어, 핵산, 단백질 등)의 표지가 가능한 화합물, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 조성물, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 지지체 및 상기 화합물을 사용하여 생체 분자를 표지 또는 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 화합물 및 이의 용도{NOVEL COMPOUNDS AND THEIR APPLICATIONS}
본 발명은 신규한 화합물 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 생체 분자(예를 들어, 핵산, 단백질 등)의 표지가 가능한 화합물, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 조성물, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 지지체 및 상기 화합물을 사용하여 생체 분자를 표지 또는 검출하는 방법에 관한 것이다.
생명 공학 분야에서 생체 내(in vivo), 생체 외(in vitro)에서 세포수준의 생물학적인 현상을 관찰하거나, 생체 조영 및 질환부위를 검시하기 위해, 이를 가시화할 수 있는 수단으로 형광 염료가 사용되고 있다.
그린형광단백질(GFP) 등의 자체적으로 발광하는 생체 분자도 존재하지만, 일반적으로는 생체 조직이나 세포 및 그 이하 단계의 생체 분자를 형광 염료로 염색하거나, 단백질, 핵산 등의 생체 분자에 형광 염료를 표지한 후, 형광 신호를 검출할 수 있는 광학장비를 동반하여, 다양한 기법으로 영상화한 자료를 얻고 있다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flow cytometry), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(quantitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
바이오 분야에 형광 염료를 적용하기 위해서는, 일반적으로 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 광표백(photo bleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)및 양자효율(quantum efficiency)이 크며, 다양한 pH 조건에서 안정한 것이 바람직하다.
여러 연구분야에서 다양한 형광 염료가 이용되어 오고 있으나, 바이오 분야에서 상술한 조건들을 모두 만족시키는 형광 염료는 드물며, 현재 사용되고 있는 대표적인 구조로는 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridines) 등이 있다. 이 중에서도 특히 로다민 유도체와 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체가 주를 이루고 있다.
특히, 시아닌계 형광 염료는, 폴리메틴 양쪽 말단 부위에 질소를 포함한 헤테로 고리로 연결되어 있으며, 폴리메틴 길이를 조절함으로써 450nm에서 800nm의 가시광선, 근적외선 전영역에 걸쳐 다양한 형광을 구현할 수 있는 구조적 장점뿐만 아니라, 일반적으로 매우 높은 흡광계수를 가지는 광학적 특징이 있다.
본 발명에 관련된 배경기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0026245호(2017.03.08. 공개)가 있으며, 상기 문헌에는 페릴렌계 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 형광 염료가 기재되어 있다.
본 발명은 광학 영상 분야에서 생체 분자(예를 들어, 핵산, 단백질 등)의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 신규한 화합물의 다양한 용도로서, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 조성물, 상기 화합물을 포함하는 생체 분자 표지 또는 검출용 지지체 및 상기 화합물을 사용하여 생체 분자를 표지 및 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물이 제공된다.
[화학식 1]
여기서,
Ar1 및 Ar2은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 헤테로아릴이며,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
Q는 O, S 또는 NRd이며,
X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R3은 각각 독립적으로,
(1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
(4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이며,
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
구체적으로, 상기 화합물은 하기의 화학식 2 내지 화학식 4 중 적어도 하나로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
여기서,
X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
[화학식 3]
여기서,
X1 내지 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
[화학식 4]
여기서,
X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
또한, 상기 화합물은 하기의 화학식 5로 표시될 수 있다.
[화학식 5]
여기서,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
Q는 O, S 또는 NRd이며,
X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R11은 각각 독립적으로,
(1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
(4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이며,
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
또한, 전술한 화학식 1 내지 화학식 5에 따른 화합물은 전자의 이동에 따라 공명 구조의 형태로서 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 화합물은 기존 상용화된 형광 물질 대비 낮은 검출 한계(Limit of Detection)를 가짐에 따라 시료 내 타겟 생체 분자가 낮은 농도로 존재하더라도 검출 용이성이 높다는 이점이 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 신규한 화합물은 기존 상용화된 형광 물질을 대체하여 생체 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 표지 및 검출 분야에 적용될 수 있을 것이다.
도 1 내지 도 3은 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1 내지 실시예 9 및 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 각각 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 6은 BQCV (black queen cell virus) 타겟에 대하여 실시예 1 내지 실시예 9 및 비교예 1 내지 비교예 3에 따른 이중 표지 프로브를 각각 사용하여 2회 반복한 Real-Time PCR의 평균 RFU 값을 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
신규한 화합물
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 신규한 화합물이 제공된다.
[화학식 1]
여기서,
Ar1 및 Ar2은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 헤테로아릴이며,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
Q는 O, S 또는 NRd이며,
X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R3은 각각 독립적으로,
(1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
(4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이다.
Ar1 및/또는 Ar2이 치환된 아릴인 경우, Ar1 및/또는 Ar2의 임의의 탄소에 결합된 작용기는 전술한 (1) ~ (4)에 열거된 작용기 또는 (1) ~ (4)에 열거된 작용기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
상기 화학식 1에서 m 및 n은 헤테로 원자로서 Q가 존재하는 고리와 N이 존재하는 고리 사이에 존재하는 고리의 수를 의미하는 것으로서, 각각 독립적으로 0 또는 1일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서 X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다. 즉, 상기 화학식 1에서 X1 내지 X6는 임의의 작용기가 결합된 탄소로서, X1 내지 X6 중 적어도 하나는 수소가 아닌 작용기로 이중 치환된 탄소로서 존재할 것이다. 이와 같이, 상기 화학식 1에서 X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아닌 상태로 존재함에 따라 다양한 용매에 대한 상기 화합물의 용해도를 개선하는 것이 가능하다. 상기 화합물의 용해도가 개선됨에 따라 상기 화합물의 취급성이 향상될 수 있다.
상기 화학식 1에서 (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기로 치환된 임의의 작용기는 전술한 (1), (3) 및 (4)에 열거된 작용기로부터 선택될 수 있다.
상기 화학식 1에서 (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기로 치환된 임의의 작용기는 전술한 (1), (2) 및 (4)에 열거된 작용기로부터 선택될 수 있다.
상기 화학식 1에서 (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기로 치환된 임의의 작용기의 종류는 전술한 (1) ~ (3)에 열거된 작용기로부터 선택될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화합물 내 전자의 이동에 따라 하기의 화학식 1-1와 같은 공명 구조의 형태로서 존재할 수도 있다.
[화학식 1-1]
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 1의 이성질체의 형태로서 존재할 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1 중 m 및 n이 모두 0인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 2 또는 화학식 2-1 (화학식 2의 공명 구조)로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 2-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
다른 실시예에 있어서, 상기 화학식 1 중 m이 1이고, n이 0인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 3 또는 화학식 3-1 (화학식 3의 공명 구조)로 표시될 수 있다. 상기 화학식 1 중 m이 0이고, n이 1인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 3 또는 화학식 3-1 (화학식 3의 공명 구조)의 이성질체로서 존재할 수 있다.
[화학식 3]
[화학식 3-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1 내지 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 화학식 1 중 m 및 n이 모두 1인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 4 또는 화학식 4-1 (화학식 4의 공명 구조)로 표시될 수 있다.
[화학식 4]
[화학식 4-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
일 실시예에 있어서, Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R3 중 임의의 작용기가 치환된 작용기인 경우, 상기 작용기 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 전술한 (1) ~ (4)에 열거된 작용기 또는 (1) ~ (4)에 열거된 작용기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
다른 실시예에 있어서, Ra 내지 Rf, R1 내지 R3, Ar1의 임의의 탄소에 결합된 작용기 및 Ar2의 임의의 탄소에 결합된 작용기 중 적어도 하나는 (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나, (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는 (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
또한, X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf로부터 선택되는 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 아이오도(-I)일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화합물은 하기의 화학식 5로 표시될 수 있다. 하기의 화학식 5로 표시되는 화합물과 관련하여, 달리 정의되지 않는 한 전술한 화학식 1과 동일하게 중복되는 부분은 동일하게 해석될 수 있을 것이다.
[화학식 5]
여기서,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
Q는 O, S 또는 NRd이며,
X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R11은 각각 독립적으로,
(1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
(4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이며,
m 및 n은 0 또는 1이며,
X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
상기 화학식 1과 마찬가지로, 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 화합물 내 전자의 이동에 따라 하기의 화학식 5-1와 같은 공명 구조의 형태로서 존재할 수도 있다.
[화학식 5-1]
또한, 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 상기 화학식 5의 이성질체의 형태로서 존재할 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학식 5 중 m 및 n이 모두 0인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 6 또는 화학식 6-1 (화학식 6의 공명 구조)로 표시될 수 있다.
[화학식 6]
[화학식 6-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
다른 실시예에 있어서, 상기 화학식 5 중 m이 1이고, n이 0인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 7 또는 화학식 7-1 (화학식 7의 공명 구조)로 표시될 수 있다. 상기 화학식 5 중 m이 0이고, n이 1인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 7 또는 화학식 7-1 (화학식 7의 공명 구조)의 이성질체로서 존재할 수 있다.
[화학식 7]
[화학식 7-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1 내지 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 화학식 5 중 m 및 n이 모두 1인 경우, 상기 화합물은 하기의 화학식 8 또는 화학식 8-1 (화학식 8의 공명 구조)로 표시될 수 있다.
[화학식 8]
[화학식 8-1]
전술한 상기 화합물에 대한 정의에 따라, X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
일 실시예에 있어서, Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R11 중 적어도 하나는
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는 (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
R4 내지 R11은 상기에 정의된 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서, R4 내지 R11 중 서로 인접한 두 작용기는 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다. 또한 상기 고리는 지방족 또는 방향족 고리일 수 있으며, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함할 수도 있다.
R4 내지 R11 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 때, R4 내지 R11 중 적어도 하나가 C, N, O, S, Se 또는 Si를 매개로 인접한 치환기와 서로 결합하거나, 단결합에 의해 직접적으로 인접한 치환기와 결합할 수 있다.
R4 내지 R11 중 적어도 하나는 인접한 치환기와 서로 결합하여 치환된 고리를 형성할 경우, 상기 고리 중 적어도 하나의 임의의 탄소는 전술한 (1) ~ (4)에 열거된 작용기 또는 (1) ~ (4)에 열거된 작용기로 치환된 임의의 작용기일 수 있다.
이하에서는 본원에 언급된 몇몇 작용기들에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다. 하기에 언급되지 않은 작용기는 해당 기술 분야에서 통용되는 일반적인 정의에 따른다.
본원에서 "치환 또는 비치환된"이란 용어는 임의의 작용기가 비치환된 상태로 존재하거나, 본원에 정의된 화합물의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 적어도 하나의 치환기로 치환된 상태로 존재 가능함을 의미하는 것이며, "치환 또는 비치환된"이란 용어는 임의의 작용기를 정의함에 있어 해당 기술 분야에서 통용되는 일반적인 표현에 해당하며, 달리 정의되지 않는 한 "치환 또는 비치환된"이란 용어로서 해석되는 임의의 작용기의 범위 역시 해당 기술 분야에서 통용되는 일반적인 정의에 따른다.
본원에 정의된 임의의 작용기가 치환된 작용기인 경우, 상기 작용기의 임의의 탄소는 적어도 하나의 치환기로 치환될 수 있다.
예를 들어, 상기 치환기는 전술한 (1) ~ (4)에 열거된 작용기로부터 선택될 수 있다.
(1) 수소, 중수소, C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C1-C40 헤테로알킬, C2-C40 알케닐, C2-C40 알키닐, C3-C20 사이클로알킬, C3-C20 사이클로알케닐, C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), C1-C40 알콕시, C3-C40 사이클로알킬옥시, C5-C40 아릴옥시, C2-C40 헤테로아릴옥시, C5-C50 아릴, C2-C50 헤테로아릴, C5-C50 아르알킬, C1-C40 알킬티오, C5-C40 아릴티오, C3-C40 사이클로알킬티오, C2-C40 헤테로아릴티오, 아실아미노, 아실옥시, 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 게르마늄, 붕소, 알루미늄, 실릴, 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 포스핀, 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기;
(2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기;
(3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기;
(4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기.
본원에서 반응성기와 상기 반응성기에 의한 반응의 종류는 일반적으로 바이오컨쥬게이트 화학 분야에 잘 알려진 것들이다. 상기 반응의 종류로는 친핵성 치환(예를 들어, 아실 할라이드 및/또는 활성 에스터와 아민 및/또는 알코올의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 엔아민(enamine) 반응), 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 첨가(예를 들어, Michael 반응, Diels-Alder 첨가) 반응 등이 있다.
여기서, 반응성기로는 (a) 카르복실 그룹과 이의 유도체 : N-하이드록시숙신이미드 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터, 테트라플루오로페닐 에스터, 설포테트라플루오로페닐 에스터, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스터, 아실 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스터, p-나이트로페닐 에스터, 알킬 에스터, 알케닐 에스터, 알키닐 에스터 및 방향족성 에스터; (b) 에스터, 에테르, 알데하이드로 전환될 수 있는 하이드록실; (c) 할로겐이 예를 들어, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 또는 알콕사이드 이온과 같은 친핵성 작용기로 치환됨으로써 다른 작용기에 공유적으로 부착될 수 있는 할로알킬; (d) 예를 들어, 말레이미도기와 다이엘스-엘더 반응을 할 수 있는 친다이엔체; (e) 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체를 형성하는 것이 가능한 알데하이드 또는 케톤; (f) 아민과 반응하여 설포아마이드를 형성하는 설포닐 할라이드; (g) 다이설파이드로 전환되거나 아실 할라이드와 반응할 수 있는 티올; (h) 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민; (i) 고리화첨가, 아실화, 마이클 반응 등과 같은 반응을 수행할 수 있는 알켄; (j) 아민 또는 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드; (k) 포스포아미디트 및 핵산 반응에 유용한 다른 표준 작용기 등이 사용될 수 있다. 이러한 반응성기는 본원에 정의된 화합물을 합성하는데 필요한 반응에 참여하거나 간섭하지 않도록 적절히 선택될 수 있다.
또한, 필요한 경우, 상기 반응성기는 보호기의 존재에 의해 반응에 참여하지 않도록 보호될 수 있다.
상기 보호기(protecting group)는 연속적인 화학적 또는 생물학적 반응 과정 동안 적어도 일부의 반응성기의 반응 선택성을 부여하기 위해 반응성기를 화학적으로 변환시켜 도입되는 것이다.
상기 보호기로는 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기 등이 있다. 또한, 상기 보호기는 본원에 달리 정의되지 않는 한 상기에 예시로 든 보호기 이외 특정 반응성기로 도입 및 제거가 가능한 작용기가 사용될 수 있다.
예를 들어, 반응성기가 하이드록실인 경우, 보호기로는 아세틸, 벤조일, 벤질, β-메톡시에톡시메틸 에터, 다이메톡시트리틸, 메톡시메틸 에터, 메톡시트리틸, p-메톡시벤질 에터, p-메톡시페닐 에터, 메틸티오메틸 에터, 실릴 에터, 트리틸 또는 그의 유사체가 사용될 수 있다.
또한, 반응성기가 아미노인 경우, 보호기로는 tert-뷰틸 카바메이트, 벤질 카바메이트, 아세트아마이드, 프탈이미드, p-톨루엔설폰아마이드 또는 그의 유사체가 사용될 수 있다. 바람직한 보호기의 예로는 다음 참조 문헌에 기재된 내용을 참고할 수 있다(Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991; https://en.wikipedia.org/wiki/Protecting_group).
본원에서 Rx (x는 1 내지 11로부터 선택되는 임의의 정수 또는 a 내지 f로부터 선택되는 임의의 문자임)가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 40개 이하(예를 들어, C1-C10의 직쇄, C3-C10의 분쇄)일 수 있다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.　
본원에서 아미노는 질소 원자에 결합된 수소 원자의 수에 따라 1차 내지 3차 아미노로 분류될 수 있다. 또한, 필요시 상기 아미노는 4차 암모늄 형태로 제공될 수도 있다.
본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o- 터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3--페난트레닐, 4--페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
본원에서 사이클로알켄 또는 사이클로알카인은 달리 정의되지 않는 한 적어도 하나의 불포화 결합(이중결합 또는 삼중결합)을 포함하는 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다. 또한, 사이클로알켄 또는 사이클로알카인의 탄소 중 적어도 하나는 헤테로 원자로 치환될 수 있다. 사이클로알켄 또는 사이클로알카인은 C3-C30 또는 C3-C20의 탄소 원자를 가질 수 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
본원에서 유도체는 임의의 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 지칭한다.
예를 들어, 본원에서 카르복실 유도체는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터, 테트라플루오로페닐 에스터, 설포테트라플루오로페닐 에스터, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스터, 아실 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스터, p-나이트로페닐 에스터, 알킬 에스터, 알케닐 에스터, 알키닐 에스터 또는 방향족성 에스터일 수 있다.
또한, 본원에서 1,2,4,5-테트라진 유도체는 3,6-다이메틸-1,2,4,5-테트라진, 3,6-다이페닐-1,2,4,5-테트라진 또는 3-메틸-6-페닐-1,2,4,5-테트라진일 수 있다.
또한, 본원에서 사이클로알카인 유도체는 bipolar cycloaddition, inverse-electron demand Diels-Alder 또는 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 반응에 참여하는 화합물일 수 있다.
예를 들어, SPAAC 반응에 참여하는 사이클로알카인 유도체로는 OCT, COMBO (ALO), MOFO, DIFO, DIBO, BARAC, DIBAC (ADIBO), DIMAC, BCN 또는 TMTH와 같은 사이클로옥타인이 사용될 수 있다.
이외에도 본원에서 명시된 임의의 유도체의 예시는 해당 기술 분야에서 공지된 문헌을 통해 확인될 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌 옥사이드는 수용성 폴리머 작용기로서 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리에틸렌 글라이콜-폴리프로필렌 글라이콜(PEG-PPG) 코폴리머 및 N-치환된 메타크릴아마이드-함유 폴리머 및 코폴리머를 포함한다.
폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카르복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다. 상기 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n은 1 내지 30 사이의 정수일 수 있다.
또한, 화학식 1 내지 화학식 8로 표시되는 화합물은 카운터 이온을 더 포함할 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 화합물의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 리포터의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
본원에 정의된 화합물의 구체적인 예는 다음과 같다. 다만, 하기의 예시 화합물들은 본원에 정의된 화합물의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본원에 정의된 화합물의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 하기의 예시 화합물들 및 본원에 정의된 화합물의 범위에 따라 하기의 예시 화합물들과 균등하다고 인정되는 화합물들은 모두 본원에 정의된 화합물로서의 효과를 나타낼 것이라 기대할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 제조예를 통해 합성 단계가 상세하게 기재된 화합물 2, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 50 및 화합물 51를 제외한 나머지 예시 화합물들 역시 본원에 개시된 제조예를 참고하여 합성하거나, 본원에 정의된 내용을 참고하여 공지된 합성법을 통해 합성할 수 있다.
본원에 정의된 화합물은 생체 분자를 표지 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 생체 분자로는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물 및/또는 핵산(DNA, RNA 또는 뉴클레오티드 포함) 등이 있다.
지질의 구체적인 예로는 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 리포폴리당류(lipopolysaccharides) 등이 있으며, 탄수화물의 구체적인 예로는 단당류, 이당류, 다당류(예를 들어, 덱스트란)을 포함한다.
아울러, 본원에 정의된 화합물은 생체 분자 이외에 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬(수용체 리간드 포함), 수용체, 효소 또는 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물 또는 나노 바이오 소재(폴리스타이렌 마이크로스피어 등) 등을 표지 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다.
신규 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 핵산 검출용 조성물, 핵산 검출용 지지체
본 발명의 다른 측면에 따르면, 핵산 표지용 리포터로서 본원에 정의된 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
올리고뉴클레오티드는 1 내지 수백개의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하는 것으로, DNA, RNA, 또는 PNA를 모두 포함한다. 또한 이들의 유사체들, 예를 들어 상기 뉴클레오티드에 화학적 변경이 가해진 것, 또는 당이 결합된 것들 등 통상의 기술자가 용이하게 변형을 가할 수 있는 것들을 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 된 것을 모두 포함하는 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 프로브는 핵산, 펩타이드, 사카라이드, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 항체 또는 이들의 조합에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 소광자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 리포터가 표지되고, 3' 말단에는 소광자가 표지될 수 있다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
본원에서 사용 가능한 소광자의 최대 흡광도는 620 내지 700 nm, 바람직하게는 660 내지 680일 수 있으며, 상기 소광자의 흡광도 범위는 530 내지 730 nm일 수 있다. 또한, 상기 소광자가 가지는 최대 흡광도 및 흡광도 범위는 본원에 정의된 리포터의 형광 특성을 고려하여 적절히 선택될 수 있을 것이다.
상기 프로브는 상기 리포터가 신호 혼선을 최소화한 상태로 상기 소광자에 의해 충분히 소광될 수 있도록 설계되는 것이 중요하다. 이에 따라, 프로브를 설계할 때, 타겟으로 하는 생체 분자(예를 들어, 핵산)의 유형에 따라 상기 프로브의 5' 말단과 3' 말단에 각각 표지된 상기 리포터와 상기 소광자가 호환되는 것을 확인하는 것이 필요하다.
상기 소광자로는 공지된 또는 상용화된 다양한 소광자(예를 들어, BHQ0, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ650, DABCYL, TAMRA, MGBEclipse, Atto540Q, Atto575Q, Atto612Q, QSY7, QSY21 등)가 사용될 수 있다. 또한, 상기 소광자로는 한국공개특허공보 제10-2020-0067733호에 기재된 소광자가 사용될 수 있다. 한국공개특허공보 제10-2020-0067733호에 기재된 소광자의 대표적인 예는 다음과 같다.
[소광자 1]
[소광자 2]
[소광자 3]
[소광자 4]
[소광자 5]
[소광자 6]
[소광자 7]
[소광자 8]
[소광자 9]
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 핵산과의 결합력을 향상시키기 위해 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder)를 더 포함할 수 있다.
상기 마이너 그루브 바인더는 DNA와 같은 핵산 내 포함된 마이너 그루브(예를 들어, DNA helix 내 shallow furrow)에 선택적으로 비공유결합을 할 수 있는 반월형(crescent-shaped) 프로브이다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 화학적, 생물학적 영역에서 다양하게 활용할 수 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 또는 마이크로어세이(microassay) 등에 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물은 핵산 표지용 리포터로서 본원에 정의된 화합물 및 소광자를 동시에 포함하는 올리고뉴클레오티드와 함께 표적 생체 분자와의 반응을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 리포터에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본원에 정의된 화합물로 단일 표지된 프로브 또는 본원에 정의된 화합물과 소광자로 이중 표지된 프로브; 지지체; 및 상기 프로브와 상기 지지체를 연결하는 링커;를 포함하는 핵산 검출용 지지체가 제공된다.
이에 따라, 샘플 내 생체 분자는 지지체 상에 고착화된 리포터와의 상호작용을 통해 지지체 상에 고정될 수 있다.
상기 링커에 결합되는 프로브가 이중 표지된 프로브인 경우, 상기 이중 표지된 프로브는 5' 말단에 본원에 정의된 화합물이 표지되고, 3' 말단에 소광자가 표지되고, 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치한 형태를 가질 수 있다.
상기 지지체는 유리(예를 들어, CPG (controlled pore glass)), 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌, 레진, 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트,　폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜,　폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 또는 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 지지체는 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
여기서, 링커는 리포터와 지지체를 연결하는 부분으로서, 리포터와 지지체를 연결할 수 있는 임의의 물질은 모두 본원에서 의도한 링커로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 링커는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C30 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로아릴, 아마이드(-CONH-), 에스터(-COO-), 케톤(-CO-), 뉴클레오사이드 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 링커를 매개로 한 상기 지지체와 상기 소광자의 연결 구조의 예시는 아래와 같다.
[연결 구조 1]
[연결 구조 2]
[연결 구조 3]
[연결 구조 4]
[연결 구조 5]
[연결 구조 6]
[연결 구조 7]
[연결 구조 8]
[연결 구조 9]
[연결 구조 10]
[연결 구조 11]
[연결 구조 12]
[연결 구조 13]
이러한 링커는 리포터와 지지체를 연결할 뿐 리포터 또는 형광단의 다른 반응 또는 형광 및 소광 작용에 영향을 미치지 않는다.
핵산 검출 방법
본 발명의 일 실시예에 따르면, 표적 핵산에 리포터로 표지된 프로브 또는 리포터와 소광자로 이중 표지된 프로브를 반응시켜 표지하는 방법이 구현될 수 있다. 또한, 표적 생체 분자의 종류에 따라 리포터에 적절한 반응성기를 도입함으로써 표적-특이적 상호작용을 이용한 생체 분자의 표지 방법이 구현될 수도 있다. 아울러, 리포터로 표지한 생체 분자를 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응시켜 표지하는 한편, 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬으로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화하여, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
단일사슬로 변성시킨 표적 핵산을 기판 위에 고정하고, 올리고뉴클레오티드와 혼성화한다. 여기서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 본원에 정의된 화합물이 표지되고, 3' 말단에는 소광자가 표지된다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
혼성화는 실온~70℃, 그리고 2~48시간의 범위에서 하는 것이 바람직하다. 혼성화에 의해 프로브 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산이 선택적으로 프로브 핵산과 결합한다. 그 후, 기판을 세정하고 실온에서 건조한다.
이 때, 올리고뉴클레오티드는 프로브에 의해 표적 핵산에 혼성화되지만 5' 말단의 화합물은 3' 말단의 소광자에 의해 소광된 상태로 존재한다.
이어서, 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오티드는 중합 효소에 의해 신장되는데, 올리고뉴클레오티드는 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 표적 핵산으로부터 분리 및 분해되며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 화합물과 3' 말단의 소광자는 서로 분리되며, 이에 따라 형광단은 형광을 발할 수 있게 된다.
이 때, 발생하는 형광 강도를 측정하여 표적 핵산의 증폭량을 측정할 수 있게 된다.
PCR법
PCR법은 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 리포터로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 리포터를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다.
또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 리포터를 결합하여, 리포터가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다.
이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다.
통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확률로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 리포터로 표지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 리포터를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다.
또한, 터미네이터 대신에 미리 리포터로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH (in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 리포터로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다.
이를 위해, 형광염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다.
예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 리포터를 특이결합을 사용한 타겟의 표지 방법에도 사용할 수 있다.
즉, 타겟을 포함하는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 표지에 있어, 피검체에 특이적으로 결합하는 결합 물질 또는 수식 물질에 특이적으로 결합하는 결합물질 중 하나를, 리포터로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합에는, 항원-항체, 합텐-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag 항원, Tag 항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체를 사용할 수 있다.
구체적으로는 기판, 용액, 비즈 또는 항체에 존재하는 항원에 대하여 리포터로 표지한 항체 등의 결합 물질을 반응시켜, 항체의 항원 특이적 상호작용을 통해 특정 항원을 표지할 수 있다.
항원으로는 단백질, 다당류, 핵산, 펩티드 등이 가능하며, 항원 이외에 FITC나 디니트로페닐기 등의 저분자량 분자과 같은 합텐도 사용 가능하다. 이 때, 항원(또는 합텐)과 항체의 조합으로는 GFP와 항 GFP항체, FITC와 항FITC 항체 등이 있다.
표지된 항원들은 면역염색, ELISA, Western blotting 또는 Flow cytometry 등과 같은 각종 측정 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다.
뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 리포터를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다.
RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 리포터로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 리포터는 조직 또는 세포 내의 표적 핵산 또는 표적 단백질을 표지할 수 있는 반응성기를 포함함으로써 표적 핵산의 전사 수준 또는 표적 단백질의 발현 수준을 확인하기 위한 염료로서 사용될 수 있다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다. 또한, 본원의 청구항 및 상세한 설명에 정의된 리포터 중 하기의 제조예를 통해 합성 방법이 개시되지 않은 화합물은 하기의 제조예를 참고하여 합성될 수 있을 것이다.
제조예 1. 화합물 1의 합성
중간체(intermediate) 2의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 1 (미국등록특허공보 7442814호를 참조하여 합성함) (500 g, 3.42 mol), 피리딘(360 mL, 4.45 mol), 다이클로로메탄(5000 mL)를 넣고 -78℃에서 교반하였다. 무수 트리플루오로메탄설포닉산(631 mL, 3.76 mol)을 적가 후 상온에서 1시간 교반하여 생성된 고체는 여과하여 제거하였다. 여액에 10% 탄산수소나트륨 수용액(4000 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한뒤 여과하여 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(930 g, 97%).
중간체(intermediate) 3의 합성
1 L 1구 반응기에 중간체 2 (342 g, 1.23 mol), 2,3,3-트리메린인돌레닌(140 g, 0.88 mol), 다이클로로메탄(700 mL)를 넣고 환류하에 24시간 교반한 후 냉각하여 농축하였다.
중간체(intermediate) 4의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 3 (4 g, 9 mmol), 트리에틸오르소포메이트(4.7 mL, 27 mmol), 피리딘(20 mL)를 넣고 환류하에 3시간 교반한 후 냉각하여 농축하였다.
화합물 1의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 4 (5 g, 2.949 mmol), 50% 황산 수용액(10 mL), 클로로포름(50 mL)을 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(30 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하고 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하였다. 여액은 농축하고 컬럼정제하였다(20 mg).
수득한 화합물 1의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (m, 2H), 7.44-7.33 (m, 7H), 4.62 (s, 2H), 4.13-3.90 (m, 4H), 1.68 (s, 12H), 1.44 (s, 6H), 0.98 (s, 6H)
제조예 2. 화합물 2, 화합물 14 내지 화합물 17의 합성
중간체(intermediate) 7의 합성
3 L 1구 반응기에 중간체 6 (Nucleic Acid Research (2012), 40(14), e108를 참조하여 합성) (98 g, 0.158 mmol), 화합물 1의 중간체 3 (76.2 g, 0.174 mmol), 무수아세트산(160 mL), 피리딘(1000 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반한 후 농축하고 컬럼정제하였다(80 g).
화합물 2의 합성
2 L 1구 반응기에 중간체 7 (80 g, 0.098 mol), 50% 황산 수용액(160 mL), 클로로포름(800 mL)을 넣고 상온에서 24시간 교반한 후 반응기에 물(500 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(26 g).
화합물 14의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 2 (26.8 g, 0.038 mol), 2N 수산화나트륨수용액 70 mL), 태트라하이드로퓨란(130 mL), 메탄올(130 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반한 후 농축하고 반응기에 다이클로로메탄 (400 mL), 4 M 염산(100 mL)넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하였다.
화합물 15의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 14 (26.8 g, 0.038 mol), N,N'-다이사이클로헥실카보디이미드(10.6 g, 0.051 mol), N-하이드록시석신이미드(5.9 g, 0.051 mol), 다이클로로메탄(300 mL)를 넣고 상온에서 2시간 교반한 후 생성된 고체는 여과하여 제거하였다. 여액에 소금물(200 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하였다.
화합물 16의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 15 (48.5 g, 0.063 mol), 6-아미노헥산올(22 g, 0.188 mol), 다이클로로메탄 (500 mL)를 넣고 상온에서 1시간 교반한다. 물 (200 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리한다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한뒤 여과한다. 여액은 농축하고 컬럼정제하였다(43 g).
화합물 17의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 16 (20.5 g, 0.028 mol), 2-시아노에틸 N,N'-다이이소프로필클로로포스포아미다이트(8.6 g, 0.036 mol), 트리에틸아민(8 mL, 0.051 mol), 다이클로로메탄(410 mL)를 넣고 상온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 10% 탄산나트륨수용액(500 mL)를 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하여 컬럼정제하였다(21 g).
수득한 화합물 17의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (m, 1H), 7.41-7.14 (m, 8H), 4.87 (m, 1H), 4.63-4.58 (m, 1H), 4.25-4.18 (m, 4H), 3.84-3.45 (m, 16H), 2.62-2.58 (m. 3H), 2.26-1.96 (m, 5H), 1.78-1.70 (m, 9H), 1.49-1.39 (m, 5H), 1.23-1.00 (m, 15H), 0.93 (s, 3H), 0.69 (m, 1H)
제조예 3. 화합물 3의 합성
중간체(intermediate) 9의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 8 (국제공개특허공보 2004-039894호를 참조하여 합성함) (2.78 g, 9.88 mmol), 무수아세트산(1.1 mL), 트리에틸아민(2.8 mL), 다이클로로메탄(30 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반한 후 반응액에 물을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(2.3 g).
중간체(intermediate) 10의 합성
중간체 9를 사용하여 Nucleic Acid Research (2012), 40(14), e108을 참조로 중간체 10을 합성하였다.
중간체(intermediate) 11의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 10 (6 g, 9.17 mmol), 화합물 1에서의 중간체 3 (4 g, 9.17 mmol), 무수아세트산(9 mL), 피리딘(60 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반한 후 농축하고 컬럼정제하였다(4.5 g).
화합물 3의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 11 (4.5 g, 5.30 mmol), 50% 황산수용액(10 mL), 클로로포름(50 mL)을 넣고 상온에서 24시간 교반한 후 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(1.2 g).
수득한 화합물 3의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.29-8.25 (m, 1H), 8.10-8.07 (m, 1H), 7.98-7.95 (m, 2H), 7.61 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 7.52-7.44 (m, 2H), 7.42-7.33 (m, 2H), 7.26 (m, 1H), 7.10 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 5.11-4.98 (m, 1H), 4.83-4.62 (m, 1H), 4.48-4.36 (m, 2H), 3.96-3.60 (m, 2H), 3.45-3.37 (m, 2H), 2.81-2.76 (m, 2H), 2.41-2.28 (m, 2H), 2.05-2.03 (m, 3H), 1.85-1.81 (m, 3H), 1.74 (m, 3H), 1.40-0.94 (m, 11H), 0.57-0.51 (m, 1H)
제조예 4. 화합물 4의 합성
중간체(intermediate) 13의 합성
250 mL 1구 반응기에 화합물 3에서의 중간체 10 (6 g, 9.17 mmol), 중간체 12 (1,1,2-트리메틸-1H-벤조[e]인돌을 사용하여 화합물 1에서의 중간체 3의 제조방법을 참조하여 합성함) (4.47 g, 9.17 mmol), 무수아세트산(9 mL), 피리딘(60 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반한 후 농축하고 컬럼정제하였다(4.8 g).
화합물 4의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 13 (4.8 g, 5.35 mmol), 50% 황산 수용액(10 mL), 클로로포름(50 mL)을 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(0.9 g).
수득한 화합물 4의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44-8.40 (m, 1H), 8.15-8.12 (m, 2H), 8.00-7.97(m, 4H), 7.65 (m, 2H), 7.54-7.39 (m, 4H), 5.15-5.02 (m, 1H), 4.93-4.71 (m, 1H), 4.46-4.37 (m, 2H), 4.16-3.79 (m, 2H), 3.44-3.42 (m, 2H), 2.91-2.75 (m, 2H), 2.42 (m, 2H), 2.19-2.06 (m, 9H), 1.46-1.29 (m, 5H), 1.27-1.118 (m, 2H), 0.99 (m, 4H), 0.64-0.55 (m, 1H)
제조예 5. 화합물 5, 화합물 18 및 화합물 19의 합성
중간체(intermediate) 16의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 15 (3-buten-1-ol을 사용하여 Journal of the American Chemical Society (2004), 126(19), 6064-6071를 참조하여 합성함)(465 g, 2.27 mol)과 화합물 2에서의 중간체 5 (503.5 g, 1.75 mol), 다이클로로메탄 5 L를 넣고 상온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 냉각 및 농축한 후 컬럼정제하였다(922 g, 107%).
중간체(intermediate) 17의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 16 (922 g, 1.87 mol)과 말론알데하이드 디아닐라이드 하이드로클로라이드(630.9 g, 2.43 mol), 무수아세트산 6 L를 넣고 환류 하에 1시간 교반하였다. 반응액을 냉각 및 농축한 후 컬럼정제하였다(1132 g, 91%).
중간체(intermediate) 18의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 14 (화합물 1에서의 중간체 2 및 3 제조방법을 참조로 합성)(341 g, 0.779 mol)와 중간체 17 (516.6 g, 0.779 mol), 트리에틸아민(434.6 mL, 3.11 mol), 다이클로로메탄 5L를 넣고 환류하에 2시간 교반하였다. 반응액을 냉각 및 농축한 후 컬럼정제하였다(541 g, 85%).
중간체(intermediate) 19의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 18 (541 g, 0.663 mol)과 아크롤레인 다이메틸아세탈 (678 g, 6.63 mol), 2세대 그럽스 촉매(253.6 g, 0.298 mmol), 다이클로로메탄 5 L를 넣고 환류하에 24시간 교반하였다. 반응액을 냉각 및 농축 후 메탄올에 녹여 엠버라이트 IRA-410 클로라이드 폼 레진에 통과시킨 후 다이클로로메탄과 물로 추출하였다. 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(330 g, 64%).
중간체(intermediate) 20의 합성
10 L 4구 반응기에 중간체 19 (330 g, 0.436 mol)과 다이클로로메탄 4 L를 넣는다. -78℃로 냉각 후 삼브롬화붕소(414.5 mL, 4.36 mol)을 천천히 첨가하였다. 같은 온도에서 3시간 교반 후 포화 탄산수소나트륨 수용액 4 L를 천천히 가하고 유기층을 추출 후 농축시키고 다시 메탄올에 녹였다. 0.3 M 염산 수용액을 첨가하고 60℃에서 2시간 교반한 후 다이클로로메탄을 첨가하여 유기층을 추출하였다. 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하고 여액을 농축하였다(271 g, 93%).
화합물 5의 합성
5 L 4구 반응기에 중간체 20 (103.1 g, 0.154 mol)을 메탄올 1 L에 녹여 넣은 후 1 M 수산화나트륨 수용액 800 ml를 첨가하고 상온에서 16시간 교반한 후 2 M 염산 수용액을 첨가하였다. 다이클로로메탄을 첨가하여 유기층을 분리한 다음 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하였다. 여액을 농축 후 컬럼정제하였다(23.2 g, 23%).
화합물 18의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 5 (23.2 g, 0.036 mol), HATU (16.6 g, 0.043 mol)을 디메틸포름아마이드 230 ml에 녹여 넣은 후 N,N-디이소프로필에틸아민(12.6 mL, 0.072 mol)을 첨가하였다. 상온에서 10분간 교반하고 6-아미노헥산올(21.2 g, 0.181 mol)를 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 다이클로로메탄과 물을 이용하여 추출하였다. 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하고 여액을 농축 후 컬럼정제하였다(22.8 g, 73%).
화합물 19의 합성
1 L 1구 반응기에 화합물 18 (22.4 g 0.026 mol)을 다이클로로메탄 200 ml에 녹여 넣은 후 트리에틸아민(11 mL, 0.08 mol)을 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N'-다이이소프로필클로로포스포아미다이트(8.8 g, 0.037 mol)을 첨가 후 상온에서 30분간 교반하였다. 다이클로로메탄으로 묽힌 후 10% 탄산나트륨 수용액을 넣고 유기층을 분리하였다. 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하고 여액을 농축 후 컬럼정제하였다(17.4 g, 63%).
수득한 화합물 19의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (s, 1H), 7.54 (s, 1H) ,7.38-7.33 (m, 4H), 7.23-7.19 (m, 2H), 7.10 (d, 1H), 7.02-6.99 (m, 1H), 4.56-4.48 (m, 1H), 4.36-4.32 (m, 1H), 4.24-4.16 (m, 1H), 3.80-3.38 (m, 12H), 3.01 (s, 1H), 2.89 (s, 1H), 2.82-2.75 (m, 1H), 2.63 (t, 2H), 2.51-2.16 (m, 8H), 1.98-1.83 (m, 2H), 1.77-1.71 (m, 16H), 1.55-1.42 (m, 3H), 1.16-1.12 (m, 15H), 0.91 (s, 1H), 0.56 (s, 1H)
제조예 6. 화합물 6, 화합물 20 및 화합물 21의 합성
중간체(intermediate) 53의 합성
화합물 2에서의 중간체 5를 합성하는 방법에서 에틸 6-브로모헥사노에이트 대신 에틸 6-브로모뷰티레이트 (35 g, 0.179 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 54의 합성
화합물 5의 중간체 16을 합성하는 방법에서 중간체 5 대신 중간체 53 (29 g, 0.112 mol)을 사용하여 합성하였다
.
중간체(intermediate) 55의 합성
화합물 5의 중간체 17을 합성하는 방법에서 중간체 16 대신 중간체 54 (20 g, 0.043 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 22의 합성
화합물 5에서의 중간체 18을 합성하는 방법에서 중간체 14 대신 중간체 21(화합물 1에서의 중간체 3의 제조에서 2,3,3-트리메틸인돌레닌 대신 1,1,2-트리메틸-1H-벤조[e]인돌을 사용하여 합성함) (9.3 g, 0.019 mol), 중간체 17 대신 중간체 55 (12 g, 0.019 mol)을 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 23의 합성
화합물 5에서의 중간체 19를 합성하는 방법에서 중간체 18 대신 중간체 22 (9.5 g, 0.011 mol)를 사용하여 합성하였다.
화합물 6의 합성
화합물 5에서의 중간체 20을 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 중간체 23 (7.6 g, 9.21 mmol)을 사용하여 합성하였다.
화합물 20의 합성
화합물 5에서의 중간체 20을 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 화합물 6 (2.6g, 3.62 mmol)을 사용하여 합성하였다.
화합물 21의 합성
250 ml 1구 반응기에 화합물 6 (1.8 g, 2.61 mmol), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(0.8 g, 2.61 mmol)를 디메틸포름아마이드 50 ml에 녹여 넣고 반응액에 트리에틸아민(0.8 mL, 7.83 mmol)을 첨가한 후 상온에서 2시간 교반하였다. 용매를 농축한 후 다이클로로메탄으로 추출하고 1 M 염산 수용액으로 씻어주었다. 유기층에 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반 후 여과하고 여액을 농축 후 컬럼정제하였다(1.6 g, 79 %).
수득한 화합물 21의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.19 (d, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.92 (d, 2H), 7.70 (d, 1H), 7.61 (t, 1H), 7.46 (t, 1H), 7.37-7.31 (m, 3H), 7.24 (d, 1H), 7.09-7.06 (m, 1H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.4 (d, 1H), 4.22-4.16 (m, 1H), 3.84-3.74 (m, 2H), 2.80-2.78 (m, 5H), 2.52-2.38 (m, 4H), 2.17 (s, 1H), 2.08-2.03 (m, 4H), 1.78-1.74 (t, 3H), 1.62 (s, 6H), 1.60-1.48 (m, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.33-1.25 (m, 1H), 0.91-0.90 (m, 1H), 0.64-0.60 (m, 1H)
제조예 7. 화합물 7의 합성
중간체(intermediate) 25의 합성
2 L 1구 반응기에 중간체 24 (32.4 g, 0.083 mol), 3-메틸-2-부타논(22.5 g, 0.25 mol)을 에탄올 300 ml에 녹여 넣고 상온에서 교반하였다. 반응액에 염산 80 ml을 첨가 후 환류하에 24시간 교반하고 반응액을 냉각 및 농축 후 아세토나이트릴을 넣어 녹인 뒤 농축하였다. 에틸아세테이트 300 ml를 넣은 뒤 생성된 고체를 여과하고 여과된 고체에 에틸아세테이트 500 ml와 포화 탄산수소나트륨 수용액 500 ml를 넣고 교반하였다. 유기층을 얻은 뒤 무수황산마그네슘을 넣고 5분간 교반 후 여과 및 농축하였다(11.4 g, 50%).
중간체(intermediate) 26의 합성
화합물 1에서의 중간체 3을 합성하는 방법에서 2,3,3-트리메틸인돌레닌 대신 중간체 25 (12.1 g, 0.054 mol)을 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 27의 합성
화합물 5에서의 중간체 18을 합성하는 방법에서 중간체 14 대신 중간체 26 (6.1 g, 0.011 mol)을 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 28의 합성
화합물 5에서의 중간체 19를 합성하는 방법에서 중간체 18 대신 중간체 27 (7.8 g, 8.38 mmol)을 사용하여 합성하였다.
화합물 7의 합성
화합물 5에서의 중간체 20를 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 중간체 28 (5.8 g, 6.50 mmol)을 사용하여 합성하였다(2 g, 39%).
수득한 화합물 7의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d, 1H), 7.67-7.65 (m, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.39-7.29 (m, 4H), 7.26 (d, 1H), 7.15-7.11 (m 1H), 7.09 (d, 1H), 4.60-4.40 (m, 3H), 4.24-3.92 (m, 5H), 3.80-3.76 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 2.96-2.75 (m, 1H), 2.68-2.39 (m, 1H), 2.31-2.22 (m, 1H), 2.16-2.13 (m, 3H), 2.04 (s, 1H), 1.93-1.91 (m, 2H), 1.88-1.86 (m, 3H), 1.82-1.80 (m, 2H), 1.75-1.67 (m, 1H), 1.60 (s, 5H), 1.52-1.50 (m, 8H), 1.46-1.42 (m, 2H), 1.36 (s, 2H), 1.27 (t, 2H), 1.22-1.17 (m, 3H), 0.92-0.88 (m, 1H), 0.59-0.45 (m, 1H)
제조예 8. 화합물 8의 합성
중간체(intermediate) 29의 합성
2-메틸벤조티아졸을 사용하여 중간체 29를 합성하였다(한국공개특허공보 제10-2019-0059842호를 참조하여 합성함).
중간체(intermediate) 32의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 30 (Nucleic Acid Research (2012), 40(14), e108을 참조하여 합성) (2.25 g, 5 mmol), 중간체 31 (2-메틸벤조티아졸을 사용하여 화합물 1의 중간체 3의 합성을 참조함) (2 g, 5 mmol), 무수아세트산(5 mL), 피리딘(20 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반하고 냉각 후 농축하였다.
화합물 8의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 32 (11.8 g, 0.02 mol), 50% 황산 수용액(24 mL), 클로로포름(120 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하여 컬럼정제하였다(45 mg)
수득한 화합물 8의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01-7.99 (m, 2H), 7.68-7.63 (m, 3H), 7.556-7.55 (m,2H), 7.42-7.40 (m, 2H), 4.76-4.69 (m, 1H), 4.65-4.58 (m, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.35 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.13-4.07 (m, 1H), 3.87 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 2.61-2.52 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.31 (s, 3H), 0.89 (s, 3H)
제조예 9. 화합물 9의 합성
100 mL 1구 반응기에 중간체 33 (화합물 8의 중간체 31의 합성 참조) (6.7 g, 9 mmol), 50% 황산 수용액(14 mL), 클로로포름(70 mL)을 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하여 컬럼정제하였다(13 mg).
수득한 화합물 9의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.69 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.54-7.49 (m, 3H), 7.40-7.38 (m, 4H), 4.55 (s, 2H), 4.00-3.91 (m, 4H), 1.42 (s, 6H), 0.98 (s, 6H)
제조예 10. 화합물 10의 합성
중간체(intermediate) 35의 합성
중간체 34를 사용하여 중간체 35를 합성하였다(한국공개특허공보 제10-2019-0059842호를 참조하여 합성함)
중간체(intermediate) 37의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 36 (Nucleic Acid Research (2012), 40(14), e108을 참조하여 합성) (5.17 g, 5 mmol), 중간체 31 (4 g, 5 mmol), 무수아세트산(5mL), 피리딘(50 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반하고 냉각 후 농축하였다.
화합물 10의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 37 (7 g, 0.01 mol), 50% 황산 수용액(15 mL), 클로로포름(200 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(50 mg).
수득한 화합물 10의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.6-7.38 (m, 3H), 4.87-4.6.1 (m, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.89-4.82 (m, 1H), 4.19-4.15 (m, 3H), 3.97-3.82 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.76-2.70 (m, 1H), 2.13-2.20 (m, 1H), 1.40 (s, 3H), 0.96 (s, 3H)
제조예 11. 화합물 11의 합성
100 mL 1구 반응기에 중간체 38 (화합물 2의 중간체 7의 합성을 참조함) (9 g, 11 mmol), 50% 황산 수용액(10 mL), 클로로포름(100 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하여 컬럼정제하였다(130 mg).
수득한 화합물 11의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79-7.74(m, 2H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.46-7.42 (m, 2H), 7.30-7.19 (m, 2H), 7.04 (m, 1H, J = 7.6 Hz), 4.73-4.69 (m, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.17-4.12 (m, 3H), 4.02 (q, 2H, J = 6.8 Hz), 3.90-3.82 (m, 1H), 2.67-2.63 (m, 1H), 2.14-1.98 (m, 3H), 1.67 (s, 3H), 1.48-1.42 (m, 5H), 1.25-1.14 (m, 5H), 0.98 (s, 1H), 0.95-0.88 (m, 1H), 0.70-0.59 (m, 1H)
제조예 12. 화합물 12의 합성
중간체(intermediate) 39의 합성
2-메틸벤조옥사졸을 사용하여 중간체 39를 합성하였다(한국공개특허공보 제10-2019-0059842호를 참조하여 합성함).
중간체(intermediate) 43의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 40 (Nucleic Acid Research (2012), 40(14), e108을 참조하여 합성함) (3.28 g, 7 mmol), 중간체 42 (중간체 41을 사용하여 중간체 3의 합성을 참조함) (4.0 g, 7 mmol), 무수아세트산(9 mL), 피리딘(30 mL)를 넣고 50℃에서 24시간 교반하고 냉각 후 농축하였다.
화합물 12의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 43 (5.6 g, 0.02 mol), 50% 황산 수용액(10 mL), 클로로포름(10 mL)를 넣고 상온에서 24시간 교반하였다. 반응기에 물(100 mL)을 넣고 강교반한 뒤 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨을 넣고 5분간 교반한 뒤 여과하고 여액을 농축하고 컬럼정제하였다(400 mg).
수득한 화합물 12의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.48-7.20 (m, 5H), 6.99 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 4.93-4.89 (m, 1H), 4.565 (m, 1H), 4.43-4.40 (m, 2H), 4.05-3.98 (m, 2H), 3.66-3.55 (m, 2H), 2.76 (m, 1H), 2.20-2.12 (m, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35 (s, 3H), 1.27-1.15 (m, 5H), 0.95-0.90 (m, 3H), 0.89-0.61 (m, 2H)
제조예 13. 화합물 13의 합성
중간체(intermediate) 44의 합성
중간체 3을 합성하는 방법에서 2,3,3-트리메틸인돌레닌 대신 2-메틸벤조티아졸 (25 g, 0.167 mol)을 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 45의 합성
중간체 18을 합성하는 방법에서 중간체 14 대신 중간체 44 (14.3 g, 0.035 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 46의 합성
중간체 19를 합성하는 방법에서 중간체 18 대신 중간체 45 (4.3 g, 5.34 mmol)를 사용하여 합성하였다.
화합물 13의 합성
중간체 20을 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 중간체 46 (1.7 g, 2.16 mmol)를 사용하여 합성하였다(0.16 g, 11%).
수득한 화합물 13의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12-8.07 (dd, 1H), 7.77-7.75 (m, 1H), 7.53 (d, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.43-7.39 (m, 2H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.16-7.13 (m, 1H), 6.97-6.93 (m, 1H), 4.67-4.52 (m, 2H), 4.16-4.02 (m, 4H), 3.74-3.70 (m, 1H), 3.60 (d, 1H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.71 (d, 2H), 1.65 (s, 8H), 1.22-1.97 (m, 4H), 0.94 (b, 1H), 0.60 (b, 1H)
제조예 14. 화합물 50의 합성
중간체(intermediate) 47의 합성
중간체 3을 합성하는 방법에서 2,3,3-트리메틸인돌레닌 대신 2-메틸나프토[2,1-d]티아졸(2-Methylnaphtho[2,1-d]thiazole) (33.3 g, 0.167 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 48의 합성
중간체 18을 합성하는 방법에서 중간체 14 대신 중간체 47 (16 g, 0.035 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 49의 합성
중간체 19를 합성하는 방법에서 중간체 18 대신 중간체 48 (4.6 g, 5.34 mmol)를 사용하여 합성하였다.
화합물 50의 합성
중간체 20을 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 중간체 49 (1.8 g, 2.16 mmol)를 사용하여 합성하였다(0.21 g, 13%).
수득한 화합물 50의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.09-8.01 (dd, 1H), 7.80-7.78 (m, 1H), 7.59 (d, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.48-7.42 (m, 2H), 7.36-7.33 (m, 1H), 7.18-7.15 (m, 1H), 6.99-6.95 (m, 1H), 4.70-4.55 (m, 2H), 4.19-4.05 (m, 4H), 3.78-3.73 (m, 1H), 3.63 (d, 1H), 2.19-2.13 (m, 2H), 1.75 (d, 2H), 1.68 (s, 8H), 1.24-1.19 (m, 4H), 0.96 (b, 1H), 0.70 (b, 1H)
제조예 15. 화합물 51의 합성
중간체(intermediate) 50의 합성
중간체 3을 합성하는 방법에서 2,3,3-트리메틸인돌레닌 대신 2-메틸나프토[2,1-d]옥사졸(2-Methylnaphtho[2,1-d]oxazole) (30.6 g, 0.167 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 51의 합성
중간체 18을 합성하는 방법에서 중간체 14 대신 중간체 50 (15.5 g, 0.035 mol)를 사용하여 합성하였다.
중간체(intermediate) 52의 합성
중간체 19를 합성하는 방법에서 중간체 18 대신 중간체 51 (4.5 g, 5.36 mmol)를 사용하여 합성하였다.
화합물 51의 합성
중간체 20을 합성하는 방법에서 중간체 19 대신 중간체 52 (1.7 g, 2.13 mmol)를 사용하여 합성하였다(0.16 g, 11%).
수득한 화합물 51의 1H-NMR은 다음과 같다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 (d, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.02-7.99 (dd, 1H), 7.71-7.68 (m, 1H), 7.48(d, 2H), 7.41(s, 1H), 7.36-7.31 (m, 2H), 7.27-7.30 (m, 1H), 7.12-7.09 (m, 1H), 6.89-6.85 (m, 1H), 4.60-4.64 (m, 2H), 4.05-4.01 (m, 4H), 3.67-3.62 (m, 1H), 3.52 (d, 1H), 2.09-2.03 (m, 2H), 1.66 (d, 2H), 1.58 (s, 8H), 1.14-1.08 (m, 4H), 0.92 (b, 1H), 0.68 (b, 1H)
전술한 제조예에 따라 합성된 화합물 1 내지 화합물 13, 화합물 50 및 화합물 51에 대하여 DMSO 용매 하에서 측정된 광물리학적 특성(photophysical property)은 하기의 표 1과 같다.
구분 UV (nm) PL(nm) Absorption coefficient
(ε)		 Quantum Yield
(Φ)
화합물 1 566 582 116,000 0.96
화합물 2 566 581 106,000 -
화합물 3 586 602 109,000 0.81
화합물 4 604 620 109,000 0.79
화합물 5 674 691 148,000 -
화합물 6 692 711 141,000 0.54
화합물 7 696 720 145,000 0.41
화합물 8 582 595 156,000 0.84
화합물 9 582 596 117,000 0.87
화합물 10 584 596 70,000 0.84
화합물 11 570 587 87,000 0.85
화합물 12 530 550 94,000 0.88
화합물 13 682 703 112,000 -
화합물 50 700 723 108,000 -
화합물 51 660 686 110,000 -
제조예 16. 이중 표지 프로브(올리고뉴클레오티드)의 합성
Universal UnyLinker Support (Chemgene, 500Å)를 사용하여 BQCV (black queen cell virus)에 대한 forward primer로서 5'-GCG GGA GAT GAT ATG GAC TT-3' 및 reverse primer로서 5'-CCG TCT GAG ATG CAT GAA TAC-3'를 각각 1μmol scale로 합성하였다.
우선, 소광자-CPG를 사용하여 단일 표지 프로브로서 5'-CCA TCT TTA TCG GTA CGC CGC CC-소광자-3'를 합성한 다음(한국공개특허공보 제10-2020-0067733호를 참조하여 합성함), MerMadeTM 48X DNA Synthesizer를 사용하여 5'-CCA TCT TTA TCG GTA CGC CGC CC-소광자-3'의 5' 말단에 리포터로서 화합물 2, 화합물 5, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 51, Cy3TM 및 Cy5TM를 각각 표지하고, 3' 말단에 소광자를 표지한 이중 표지 프로브를 합성하였다.
또한, 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 50과의 비교 실험을 위해 비교예 3에는 5' 말단에 Cy5.5TM를 표지하고, 3' 말단에 발광 스펙트럼 영역을 포함하는 상용화된 소광자로서, Black Hole Quencher® 3 (BHQ3, LGC Biosearch Technologies)를 표지하여 동일한 프로브 서열을 포함하는 이중 표지 프로브를 합성하였다.
합성된 이중 표지 프로브의 형태는 하기의 표 2에 나타내었다.
구분 이중 표지 프로브
실시예 1 5'-화합물 2-프로브-소광자-3'
실시예 2 5'-화합물 5-프로브-소광자-3'
실시예 3 5'-화합물 6-프로브-BHQ3-3'
실시예 4 5'-화합물 7-프로브-BHQ3-3'
실시예 5 5'-화합물 11-프로브-소광자-3'
실시예 6 5'-화합물 12-프로브-소광자-3'
실시예 7 5'-화합물 13-프로브-소광자-3'
실시예 8 5'-화합물 50-프로브-BHQ3-3'
실시예 9 5'-화합물 51-프로브-소광자-3'
비교예 1 5'-Cy3-프로브-소광자-3'
비교예 2 5'-Cy5-프로브-소광자-3'
비교예 3 5'-Cy5.5-프로브-BHQ3-3'
상기 제조예 16에서 사용된 소광자-CPG의 구조는 다음과 같다.
상기 제조예 16에서 리포터로서 사용된 화합물 2, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 50, 화합물 51, Cy3TM, Cy5TM 및 Cy5.5TM의 흡수/발광 파장 영역은 하기의 표 3에 나타내었으며, 소광자 및 BHQ3의 흡수 파장 영역은 하기의 표 4에 나타내었다.
리포터 Excitationmax (nm) Emissionmax (nm)
화합물 2 566 581
화합물 5 674 691
화합물 6 692 711
화합물 7 696 720
화합물 11 570 587
화합물 12 530 550
화합물 13 682 703
화합물 50 700 723
화합물 51 660 686
Cy3 550 565
Cy5 648 670
Cy5.5 689 713
구분 λMax(nm) ε (mol-1·cm-1)
소광자 580-710 140,000
BHQ3 620-730 42,000
실험예 . 이중 표지 프로브를 사용한 Real-Time PCR 실험
제조예 16에 따라 합성된 각각의 이중 표지 프로브를 사용하여 하기의 표 5에 기재된 조성으로 BQCV (black queen cell virus) plasmid DNA에 대한 Real-Time PCR을 2회 반복 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). 상기 Real-Time PCR 결과는 도 1 내지 도 6에 나타내었다.
구분 함량(μl)
(Bioline)SensiFASTTM Probe No-ROX Mix (2X) 10
BQCV plasmid DNA (5000 copies/μl) 1
BQCV F/R primer mix (10 pmole/μl) 1
BQCV Dual-labeled probe (5 pmole/μl) 3
DEPC Water 5
도 1 내지 도 6에 나타낸 상기 Real-Time PCR 결과를 참조하면, 화합물 2, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 50 및 화합물 51을 이중 표지 프로브로서 사용한 경우, 상용화된 형광 물질인 Cy3TM, Cy5TM 및 Cy5.5TM 대비 상대적으로 낮은 Ct 값을 나타내고, 최종적으로 증폭되는 RFU 값이 높게 형성된 것을 확인할 수 있다.
이는 분자 진단 측면을 고려할 때, 핵산 표지용 리포터로서 본원에 정의된 화합물의 검출 한계(LoD, Limit of Detection)가 기존 상용화된 다른 형광 물질 대비 낮기 때문에 본원에 정의된 화합물을 리포터로서 사용할 경우, 샘플 내 타겟 DNA 또는 RNA가 상대적으로 낮은 농도로 존재하더라도 상용화된 다른 형광 물질 대비 검출 용이성이 높을 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 Real-Time PCR로부터 측정된 직선성(linearity) 결과를 나타낸 하기의 표 6을 참조하면, 화합물 2, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 50 및 화합물 51을 이중 표지 프로브로서 사용한 경우, 상용화된 형광 물질인 Cy3TM, Cy5TM 및 Cy5.5TM 대비 우수한 직선성(linearity)을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
구분 DNA
(copies/rxn)		 Copy number
(Log)		 Ct RFU
실시예 1 3,000,000 6.48 22.31 20348.30
300,000 5.48 25.62 20553.16
30,000 4.48 29.12 19401.68
3,000 3.48 32.28 18304.96
실시예 2 3,000,000 6.48 22.30 7379.42
300,000 5.48 25.75 7763.84
30,000 4.48 29.09 7406.86
3,000 3.48 32.09 6698.01
실시예 3 3,000,000 6.48 21.59 10651.44
300,000 5.48 24.95 11065.51
30,000 4.48 28.22 10612.25
3,000 3.48 31.61 9832.63
실시예 4 3,000,000 6.48 21.98 8392.59
300,000 5.48 25.22 8547.10
30,000 4.48 28.60 8536.10
3,000 3.48 31.96 7618.57
실시예 5 3,000,000 6.48 22.13 22887.64
300,000 5.48 25.65 20903.66
30,000 4.48 28.89 20368.47
3,000 3.48 32.30 19820.60
실시예 6 3,000,000 6.48 22.44 19200.76
300,000 5.48 25.81 19462.41
30,000 4.48 29.11 19246.49
3,000 3.48 32.34 17240.04
실시예 7 3,000,000 6.48 22.61 6338.07
300,000 5.48 26.12 6359.52
30,000 4.48 29.33 6341.19
3,000 3.48 32.33 6293.22
실시예 8 3,000,000 6.48 21.56 10664.79
300,000 5.48 25.07 9996.94
30,000 4.48 28.55 8857.95
3,000 3.48 31.94 8526.70
실시예 9 3,000,000 6.48 22.06 8353.37
300,000 5.48 25.61 8278.98
30,000 4.48 28.76 8461.61
3,000 3.48 32.10 7801.32
비교예 1 3,000,000 6.48 22.61 17814.16
300,000 5.48 26.06 16944.36
30,000 4.48 29.29 16986.76
3,000 3.48 32.96 15081.32
비교예 2 3,000,000 6.48 23.28 4477.92
300,000 5.48 26.98 4057.75
30,000 4.48 30.30 4051.88
3,000 3.48 33.03 4203.40
비교예 3 3,000,000 6.48 22.36 6352.35
300,000 5.48 25.87 5970.11
30,000 4.48 29.23 6092.57
3,000 3.48 32.55 5501.55
상기 결과를 종합적으로 검토할 때, 본원에 정의된 화합물은 핵산 표지용 리포터로서 기존 핵산 표지 및 검출 분야(예를 들어, PCR 실험 등)에 적용하거나, 기존 상용화된 형광 물질을 충분히 대체할 수 있을 것이다.
이상, 본 발명의 몇몇 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (24)

  1. 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물.
    [화학식 1]

    여기서,
    Ar1 및 Ar2은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C6-C20의 아릴 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 헤테로아릴이며,
    Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
    Q는 O, S 또는 NRd이며,
    X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
    Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R3은 각각 독립적으로,
    (1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
    (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기이거나,
    (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
    (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이며,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 2]

    여기서,
    X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 3]

    여기서,
    X1 내지 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 4]

    여기서,
    X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  5. 제1항에 있어서,
    Ra 내지 Rf, R1 내지 R3, Ar1의 임의의 탄소에 결합된 작용기 및 Ar2의 임의의 탄소에 결합된 작용기 중 적어도 하나는,
    (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기;
    (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
    (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기인,
    화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf로부터 선택되는 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 아이오도(-I)인,
    화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 5로 표시되는 화합물.
    [화학식 5]

    여기서,
    Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, NRc, O 또는 S이며,
    Q는 O, S 또는 NRd이며,
    X1 내지 X6은 각각 독립적으로 CReRf이며,
    Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R11은 각각 독립적으로,
    (1) 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C20 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로사이클로알킬, 하이드록시, 옥사이도(-O-), 치환 또는 비치환된 C1-C40 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아릴, 치환 또는 비치환된 C2-C50 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C5-C50 아르알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 C5-C40 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C3-C40 사이클로알킬티오, 치환 또는 비치환된 C2-C40 헤테로아릴티오, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 아실옥시, 치환 또는 비치환된 포스피노, 카복실레이트(-CO2 -), 트리플루오로메틸설포닐(-SO2CF3), 치환 또는 비치환된 암모늄, 나이트로, 설폰산(-SO3H), 설폰산염, 치환된 설포닐, 치환된 설폰산에스터, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 치환된 티오케톤, 트리할로메틸(-CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3), 할로포르밀(-COCl, -COBr, -COI), 포르밀(-CHO), 아실, 카르복실, 치환된 에스터, 치환 또는 비치환된 아미노카르보닐, 나이트로, 나이트로소(-N=O), 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I), 치환 또는 비치환된 게르마늄, 치환 또는 비치환된 붕소, 치환 또는 비치환된 알루미늄, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 포스핀, 치환 또는 비치환된 인산(phosphoric acid), 인산염(phosphate), 아인산(phosphonic acid), 아인산염(phosphonate), 나이트릴, 히드라진, 아세탈, 케탈 및 폴리알킬렌옥사이드로부터 선택되는 작용기이거나,
    (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기;
    (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
    (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기이며,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 6으로 표시되는 화합물.
    [화학식 6]

    여기서,
    X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 7로 표시되는 화합물.
    [화학식 7]

    여기서,
    X1 내지 X5 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 하기의 화학식 8로 표시되는 화합물.
    [화학식 8]

    여기서,
    X1 내지 X6 중 적어도 하나의 Re 및 Rf는 수소 및 중수소가 아니다.
  11. 제7항에 있어서,
    Ra 내지 Rf 및 R1 내지 R11 중 적어도 하나는,
    (2) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 상기 작용기로 치환된 임의의 작용기;
    (3) 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 치환된 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 치환 또는 비치환된 아미노, 알켄, 알카인, 할로겐, 하이드라자이드, 아지도, 이미도, 케텐, 이소시아네이트, 에폭사이드, 말레이미드, 1,2,4,5-테트라진 유도체, 사이클로알카인 유도체, 사이클로알켄, 트리포스페이트 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이거나, 상기 반응성기로 치환된 임의의 작용기이거나, 또는
    (4) 알코올 유래 보호기, 아민 유래 보호기, 카보닐 유래 보호기, 카복실산 유래 보호기, 포스페이트 유래 보호기 및 알카인 유래 보호기로부터 선택되는 보호기이거나, 상기 보호기로 치환된 임의의 작용기인,
    화합물.
  12. 제7항에 있어서,
    R4 내지 R11 중 서로 인접한 두 작용기가 서로 결합하여 고리를 형성한 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제1항에 있어서,
    Q는 O이고, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 CRaRb, O 또는 S로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제1항의 화합물은 핵산 표지용 리포터인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 핵산 표지용 리포터로서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물; 및
    소광자;
    를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 화합물과 상기 소광자 사이에 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder)가 개재된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제15항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 단일 표지된 프로브 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 소광자로 이중 표지된 프로브;
    지지체; 및
    상기 프로브와 상기 지지체를 연결하는 링커;
    를 포함하는,
    핵산 검출용 지지체.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 지지체는 유리, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌 또는 레진인,
    핵산 검출용 지지체.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 링커는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C30 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C3-C30 헤테로아릴, 아마이드(-CONH-), 에스터(-COO-), 케톤(-CO-), 뉴클레오사이드 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는,
    핵산 검출용 지지체.
  21. (a) 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약 및 제14항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계;
    (b) 상기 반응 혼합물 중 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 반응 혼합물의 형광 강도를 측정하는 단계;
    를 포함하는,
    핵산 검출 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 단계 (b)는,
    (b-1) 상기 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오티드가 중합 효소에 의해 신장되는 단계;
    (b-2) 상기 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 표적 핵산으로부터 상기 올리고뉴클레오티드의 리포터와 소광자가 분리되는 단계; 및
    (b-3) 상기 리포터로부터 떨어진 상기 리포터가 형광을 발하는 단계;
    를 포함하는,
    핵산 검출 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 측정된 형광 강도로부터 표적 핵산의 증폭량을 측정하는 단계 (d)를 더 포함하는,
    핵산 검출 방법.
  24. 제1항의 화합물은 단백질 표지용 염료인 것을 특징으로 하는 화합물.
KR1020230015331A 2022-02-10 2023-02-06 신규한 화합물 및 이의 용도 KR20230120998A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220017565 2022-02-10
KR1020220017565 2022-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230120998A true KR20230120998A (ko) 2023-08-17

Family

ID=87564710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230015331A KR20230120998A (ko) 2022-02-10 2023-02-06 신규한 화합물 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230120998A (ko)
WO (1) WO2023153739A1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7427301B2 (en) * 2004-09-13 2008-09-23 L'ORéAL S.A. Composition comprising at least one substituted carbocyanin derivative, process for treating keratin fibers using it, device therefor and use thereof
WO2019040825A1 (en) * 2017-08-24 2019-02-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services CONFORMATIONAL RESTRICTION OF CYANINE FLUOROPHORES IN A FAR RED RANGE AND CLOSE INFRARED

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023153739A1 (ko) 2023-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9228225B2 (en) Xanthene dyes
US7705150B2 (en) Cyanine dyes
US9777320B2 (en) Molecular adaptors for dye conjugates
US20200256798A1 (en) Heteroarylcyanine dyes
KR102237237B1 (ko) 소광자 및 이의 용도
KR20240031282A (ko) 시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
US9315864B2 (en) Heteroarylcyanine dyes with sulfonic acid substituents
KR102645305B1 (ko) 시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
EP1740100B1 (en) Xanthene dyes
JP2023503074A (ja) 消光子およびこの用途
KR20230120998A (ko) 신규한 화합물 및 이의 용도
JP6814139B2 (ja) クマリン系化合物及び関連する方法
EP2150858A1 (en) Novel hydrazone-based and oxime-based fluorescent and chromophoric/pro-fluorescent and pro-chromophoric reagents and linkers
JP2020089361A (ja) クエンチャー及びその用途
KR20220089636A (ko) 리포터 및 이의 용도
KR20220127142A (ko) 리포터 및 이의 용도
KR102260233B1 (ko) 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
US20240132940A1 (en) Reporter and uses thereof
US20230332210A1 (en) Reporter and use thereof
KR102262100B1 (ko) 소광자 및 이의 용도
KR102246542B1 (ko) 소광자 및 이의 용도
KR20220081920A (ko) 소광자 및 이의 용도
KR20210064798A (ko) 소광자 및 이의 용도
KR20210063014A (ko) 소광자 및 이의 용도
JP2002281978A (ja) Ｄｎａプローブアレイを用いた標的ｄｎａのノンラベル検出法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application