CN111961669A - 用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法 - Google Patents

用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法 Download PDF

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普内特·P·塞思
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苏珊·M·弗赖尔
马克·J·格雷厄姆
罗桑尼·M·克鲁克
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Abstract

本文提供用于降低动物中ANGPTL3 mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。本文还提供用于降低动物中的脂质和/或葡萄糖的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物和组合物对于在有需要的个体中治疗、预防、延缓或改善任何一种或多种心血管疾病和/或代谢疾病、或其症状是有用的。

Description

用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法
本申请是申请号为201580020855.3、申请日为2015年5月1日、发明名称为“用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为 PCT/US2015/028837的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2014 年5月1日、申请号为61/987,467，和申请日为2014年9月11日、申请号为62/049,230的美国申请的优先权。
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表提供为在2015 年4月28日创建的名称为BIOL0254WOSEQ_ST25.txt的文件，所述文件的大小为0.98MB。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本文提供用于降低动物中血管生成素样蛋白3(ANGPTL3) mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。此外，本文提供具有用于降低动物中ANGPTL3相关的疾病或病状的ANGPTL3抑制剂的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物和组合物例如对于在动物中治疗、预防、延缓或改善任何一种或多种心血管疾病或代谢综合征或其症状是有用的。
背景
糖尿病和肥胖(有时通称为“糖胖症”)是相互联系的，因为已知的是肥胖加重糖尿病的病理学并且超过60％的糖尿病患者是肥胖的。大多数人类肥胖与胰岛素抵抗和瘦素抵抗相关。事实上，已提出肥胖可能比糖尿病自身对胰岛素作用具有甚至更大的影响(Sindelka等， Physiol Res.,2002,51,85-91)。另外，已知市场上用于治疗糖尿病的若干化合物可诱导体重增加，这是治疗这种疾病的一个非常不希望的副作用。
心血管疾病也与肥胖和糖尿病相互联系。心血管疾病涵盖各种各样的病因，并且具有同样各种各样的病原体和相互联系的参与者。许多病原体导致症状诸如胆固醇(包括非高密度脂蛋白胆固醇(非 -HDL-C))的血浆水平升高，以及其他脂质相关的病症。此类脂质相关的病症，通常被称为血脂异常，包括高脂血症、高胆固醇血症和高甘油三酯血症，以及其他适应症。升高的非HDL胆固醇与动脉粥样硬化及其后遗症相关，所述后遗症包括心血管疾病诸如动脉硬化、冠状动脉疾病、心肌梗塞、缺血性中风和其他形式的心脏疾病。这些在工业化国家被列为最普遍的疾病类型。事实上，在美国估计有1200万人患有冠心病，并且约3600万人因为胆固醇水平升高需要治疗。
流行病学和实验证据已经表明，高水平的循环甘油三酯(TG)可以导致心血管疾病和许多代谢病症(Valdivielso等，2009,Atherosclerosis Zhang等，2008,Circ Res.1；102(2):250-6)。源自外源或内源性的TG 被并入并且分泌在来自肠道的乳糜微粒或来自肝脏的极低密度脂蛋白(VLDL)中。一旦处于循环中，TG就被脂蛋白脂肪酶(LpL)水解，并且然后所得到的游离脂肪酸可以被局部组织吸收并用作能量来源。由于LpL对血浆TG和代谢通常具有深远的影响，发现和开发能够影响LpL活性的化合物引起了极大的兴趣。
代谢综合征是增加人们患上心血管疾病和糖尿病的风险的医学病症的组合。包括高血压、高甘油三脂、增加的HDL和肥胖的症状在一些个体中往往一起出现。它影响群生方式的很多人。在一些研究中，在USA的流行率计算为高达人口的25％。代谢综合征已知由其他各种名称，诸如(代谢)综合征X、胰岛素抵抗综合征、Reaven氏综合征或CHAOS。随着心血管病症和代谢病症的高流行率，仍然需要改进的方法来治疗这些病状。
血管生成素是分泌的生长因子家族。血管生成素与它们各自的内皮特异性受体一起在血管生成中起重要作用。一个家庭成员，血管生成素样蛋白3(也称为血管生成素样蛋白3、ANGPT5、ANGPTL3或血管生成素5)，主要在肝脏中表达并且被认为在调节脂质代谢中发挥作用(Kaplan等，J.Lipid Res.,2003,44,136-143)。研究基因组中与 HDL、LDL和甘油三酯的血浆浓度相关的常见变体的全基因组关联扫描(GWAS)发现了甘油三酯与ANGPTL3附近的单核苷酸多态性(S NP)之间的关联(Willer等，Nature Genetics,2008,40(2):161-169)。具有纯合的ANGPTL3功能缺失突变的个体呈现出所有致动脉粥样化的血浆脂质和脂蛋白的低水平，诸如总胆固醇(TC)和TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B(apoB)、非-HDL-C以及HDL-C(R omeo等2009,J Clin Invest,119(1):70-79；Musunuru等2010,N Engl J Med,363:2220-2227；Martin-Campos等2012,Clin Chim Act a,413:552-555；Minicocci等2012,J Clin Endocrinol Metab,97:e1 266-1275；Noto等2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol,32:805-809； Pisciotta等2012,CirculationCardiovasc Genet,5:42-50)。这种临床表型也被称为家族性复合高脂血症(FHBL2)。尽管VLDL分泌减少，患有FHBL2的受试者肝脏的脂肪含量也不增加。他们也似乎具有较低的血浆葡萄糖和胰岛素水平，并且重要的是，这些受试者似乎都没有糖尿病和心血管疾病。至今，没有报道不良的临床表型(Minicocci 等2013,J of Lipid Research,54:3481-3490)。在动物模型中已经显示ANGPTL3的降低引起TG、胆固醇和LDL水平的减少(美国序列号13/520,997；PCT公开号WO 2011/085271)。ANGPTL3缺陷小鼠具有非常低的血浆甘油三酯(TG)和胆固醇水平，而ANGPTL3过表达产生了相反的效果(Koishi等2002；Koster 2005；Fujimoto2006)。因此，ANGPTL3在脂质代谢方面的潜在作用，使其成为治疗性干预的有吸引力的目标。
至今，通过直接靶向ANGPTL3水平治疗心血管代谢疾病的治疗策略仍然有限。先前已经建议或开发ANGPTL3多肽片段(美国序列号12/128,545)、抗ANGPTL3抗体(美国序列号12/001,012)和 ANGPTL3核酸抑制剂，包括反义寡核苷酸(美国序列号13/520,997， PCT公开号WO 2011/085271；以引用方式整体并入本文)，但并没有直接靶向ANGPTL3的化合物被批准用于治疗心血管代谢疾病。因此，对于高效的和高耐受的抑制ANGPTL3的化合物存在未满足的需求。本文公开的发明涉及新型的、高效的ANGPTL3表达抑制剂的发现和它们在治疗中的使用。
发明内容
本文提供用于调节ANGPTL3 mRNA和蛋白质表达的组合物和方法。在某些实施方案中，组合物是ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂降低ANGPTL3 mRNA和蛋白质的表达。
在某些实施方案中，组合物是ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂为核酸。在某些实施方案中，核酸为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，反义化合物为附接有缀合物基团的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是具有缀合物基团的修饰寡核苷酸，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:77的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是具有缀合物基团的修饰寡核苷酸，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基1140-1159的等长部分互补的至少 8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是具有缀合物基团的修饰寡核苷酸，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:2的核碱基9715-9734的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:2至少80％互补。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是具有缀合物基团的修饰寡核苷酸，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸包括：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段；并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是具有缀合物基团的修饰寡核苷酸，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成，并且具有由SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基组成的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸由以下组成：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段； (b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段；并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本公开提供缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触的方法。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触并且降低细胞中核酸转录物的量或活性的方法。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)先前已有描述。参见例如，Park 等，PNAS第102卷，第47期，第17125-17129页(2005)。所述受体在肝脏细胞尤其是肝细胞上表达。此外，已显示，包含三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)配体的聚簇的化合物能够结合ASGP-R，从而导致化合物被摄取到细胞中。参见例如，Khorev等，Bioorganic and Medicinal Chemistry，16,9，第5216-5231页(May 2008)。因此，包含所述GalNAc聚簇的缀合物已用来促进将某些化合物摄取到肝脏细胞 (确切地是肝细胞)中。例如，已显示，某些含有GalNAc的缀合物在体内增加双链siRNA化合物在肝脏细胞中的活性。在所述情况下，含有GalNAc的缀合物通常连接至siRNA双链体的有义链。因为在反义链最终与靶核酸杂交之前丢弃有义链，所以存在很少关于缀合物将干扰活性的问题。通常，缀合物连接至siRNA的有义链的3’末端。参见例如，美国专利8,106,022。本文描述的某些缀合物基团比先前描述的缀合物基团更有活性和/或更易于合成。
在本发明的某些实施方案中，缀合物连接至单链反义化合物，包括但不限于基于RNA酶H的反义化合物和改变前体mRNA靶核酸的剪接的反义化合物。在所述实施方案中，缀合物应该保持连接至反义化合物足以提供益处(摄取到细胞中的改进)的时间，但是随后应裂解或以其他方式不干扰对于活性所必需的后续步骤，如与靶核酸杂交以及与RNA酶H或与和剪接或剪接调节相关的酶相互作用。这种性质平衡在单链反义化合物的环境中比在其中缀合物可简单连接至有义链的siRNA化合物中更为重要。本文公开了与缺乏缀合物的相同反义化合物相比在体内在肝脏细胞中具有改进效力的缀合的单链反义化合物。已知这些化合物所需的性质平衡如改进的效力是令人惊奇的。
在某些实施方案中，本文的缀合物基团包含可裂解部分。如所指出的，不希望受机制的束缚，合乎逻辑的是，缀合物应在化合物上保持足以提供摄取增强的时间，但其后，希望缀合物的一些部分或理想的是缀合物的全部均裂解，从而释放呈其最具活性形式的母体化合物 (例如，反义化合物)。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷。所述实施方案通过经由一个或多个可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)通过核苷使缀合物的其余部分(聚簇)连接至反义寡核苷酸来利用细胞中的内源性核酸酶。在某些实施方案中，聚簇通过磷酸二酯键联与可裂解核苷结合。在某些实施方案中，可裂解核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸(反义化合物)。在某些实施方案中，缀合物基团可包含两个或三个可裂解核苷。在所述实施方案中，所述可裂解核苷通过可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)彼此连接，连接至反义化合物和/或连接至聚簇。本文的某些缀合物不包含可裂解核苷而是包含可裂解键。显示了通过至少一个在细胞中易受裂解的键(可裂解键)来提供缀合物自寡核苷酸的充分裂解。
在某些实施方案中，缀合反义化合物为前药。向动物施用所述前药并且其最终代谢为更具活性的形式。例如，使缀合反义化合物裂解以去除缀合物的全部或部分，从而产生缺乏缀合物的全部或一些的反义化合物的活性(或更具活性)形式。
在某些实施方案中，缀合物连接在寡核苷酸的5’末端。某些所述 5’-缀合物比具有连接在3’末端的类似缀合物基团的对应物更有效地裂解。在某些实施方案中，改进的活性可与改进的裂解相关。在某些实施方案中，在5’末端包含缀合物的寡核苷酸比在3’末端包含缀合物的寡核苷酸具有更大的效能(参见，例如，实施例56、81、83和84)。此外，5’-连接允许更简单的寡核苷酸合成。通常，在固体载体上在3’至5’方向上合成寡核苷酸。为了制得3’-缀合寡核苷酸，通常将预先缀合的3’核苷连接至固体载体，然后按常规构造寡核苷酸。然而，将所述缀合核苷连接至固体载体增加了合成的复杂性。此外，使用所述方法，缀合物则存在于寡核苷酸的整个合成中并且在后续步骤期间可能发生降解或可能限制可使用的反应和试剂的种类。使用本文针对 5’-缀合寡核苷酸所述的结构和技术，可使用标准自动化技术合成寡核苷酸并且与最后(最5’)的核苷一起或在寡核苷酸从固体载体上裂解之后引入缀合物。
鉴于现有技术和本公开，普通技术人员可简单制得本文的任何缀合物和缀合寡核苷酸。此外，本文公开的某些所述缀合物和缀合寡核苷酸的合成更简单和/或需要更少步骤，并且因此比先前公开的缀合物的合成更低廉，从而在制造上提供优点。例如，某些缀合物基团的合成由较少合成步骤组成，从而导致相对先前所述的缀合物基团产率增加。缀合物基团如实施例46中的GalNAc3-10和实施例48中的 GalNAc3-7比先前描述的缀合物简单得更多，所述先前描述的缀合物如需要装配更多化学中间体的U.S.8,106,022或U.S.7,262,177中所述的那些。因此，本文描述的这些和其他缀合物在与任何寡核苷酸一起使用方面优于先前描述的化合物，所述寡核苷酸包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
类似地，本文公开了仅具有一个或两个GalNAc配体的缀合物基团。如所示出的，所述缀合物基团改进了反义化合物的活性。所述化合物比包含三个GalNAc配体的缀合物更易于制备。包含一个或两个 GalNAc配体的缀合物基团可连接至任何反义化合物，包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
在某些实施方案中，本文的缀合物大致上不改变耐受性的某些量度。例如，本文显示缀合反义化合物不比未缀合的母体化合物更具有免疫原性。因为效力得到改进，所以其中耐受性保持相同(或甚至与效力增益相比耐受性实际上仅略微变差)的实施方案对于治疗具有改进的性质。
在某些实施方案中，缀合允许人们以在不存在缀合的情况下具有较不吸引人的结果的方式改变反义化合物。例如，在某些实施方案中，用磷酸二酯键联替代完全的硫代磷酸酯反义化合物的一个或多个硫代磷酸酯键联造成耐受性的一些量度的改进。例如，在某些情况下，具有一个或多个磷酸二酯的所述反义化合物比其中每个键联为硫代磷酸酯的相同化合物具有更小的免疫原性。然而，在某些情况下，如实施例26中所示，用磷酸二酯键联同样替代一个或多个硫代磷酸酯键联还造成细胞摄取减少和/或效力损失。在某些实施方案中，本文描述的缀合反义化合物耐受所述键联变化，其中当与缀合的完全硫代磷酸酯对应物相比时摄取和效力损失很少或没有损失。事实上，在某些实施方案中，例如在实施例44、57、59和86中，包含缀合物和至少一个磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸实际上表现出增加的体内效力，即使是相对于也包含相同缀合物的完全硫代磷酸酯对应物来说。此外，因为缀合导致摄取/效力的实质增加，所以为实现改进的耐受性，所述实质增益的些微损失是可接受的。因此，在某些实施方案中，缀合反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联。
在某些实施方案中，本文的反义化合物的缀合造成肝细胞中递送、摄取和活性的增加。因此，向肝脏组织递送更多的化合物。然而，在某些实施方案中，仅递送增加不能解释活性的整体增加。在某些所述实施方案中，更多化合物进入肝细胞。在某些实施方案中，即使是肝细胞摄取增加也不能解释活性的整体增加。在所述实施方案中，缀合化合物的生产性(productive)摄取增加。例如，如实施例102中所示，相对于非实质细胞，含有GalNAc的缀合物的某些实施方案增加了反义寡核苷酸在肝细胞中的富集。此富集对靶向在肝细胞中表达的基因的寡核苷酸是有益的。
在某些实施方案中，本文的缀合反义化合物造成肾暴露减少。例如，如实施例20中所示，包含含有GalNAc的缀合物的某些实施方案的反义寡核苷酸在肾中的浓度低于缺乏含有GalNAc的缀合物的反义寡核苷酸的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此对于非肾靶标，肾积累是不希望的。
在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380000101
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在上图和在本文的类似图中，支链基团“D”支化多次，所述次数是适应由“q”指示的(E-F)基团数目所必需的。因此，在q＝1时，式为：
A-B-C-D-E-F
在q＝2时，式为：
Figure BDA0002559814380000102
在q＝3时，式为：
Figure BDA0002559814380000111
在q＝4时，式为：
Figure BDA0002559814380000112
在q＝5时，式为：
Figure BDA0002559814380000113
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380000121
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380000122
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380000131
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380000141
在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有5’-X的修饰寡核苷酸 ISIS 563580，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。在某些实施方案中，反义化合物由具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 563580组成，其中 X为包含GalNAc的缀合物基团。
Figure BDA0002559814380000151
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703801。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703801组成。
Figure BDA0002559814380000161
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703802。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703802组成。
Figure BDA0002559814380000171
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有SEQ ID NO:77的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。在某些实施方案中，反义化合物由具有SEQ ID NO:77的核碱基序列的修饰寡核苷酸组成，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。
Figure BDA0002559814380000181
其中，R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)且R2为H；或者R1和R2一起形成桥，其中R1为-O-且R2为-CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且 R1和R2直接连接使得所得的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
并且对于相同环(每个环为独立地)上的R3和R4的每一对：R3选自H和-OCH2CH2OCH3且R4为H，或者R3和R4一起形成桥，其中 R3为–O-，并且R4为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R3和R4直接连接使得所得的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
并且R5选自H和–CH3；
并且Z选自S-和O-。
某些实施方案提供组合物，其包含本文所述的缀合反义化合物或其盐，和药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，ANGPTL3表达的调节发生在细胞或组织中。在某些实施方案中，调节发生在动物的细胞或组织中。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，调节是ANGPTL3 mRNA水平的降低。在某些实施方案中，调节是ANGPTL3蛋白水平的降低。在某些实施方案中，ANGPTL3 mRNA和蛋白质都被降低。所述降低可以时间相关性或剂量相关性方式进行。
某些实施方案提供用于治疗的组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善ANGPTL3相关疾病、病症和病状的组合物和方法。在某些实施方案中，所述疾病、病症和病状是心血管和/或代谢性疾病、病症和病状。在某些实施方案中，用于治疗的组合物和方法包括向有此需要的个体施用ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂为核酸。在某些实施方案中，核酸为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，反义化合物为附接有缀合物基团的修饰寡核苷酸。
发明详述
要理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)关于本文所论述的文献部分明确地以引用方式特此并入以及以引用方式特此整体并入。
定义
除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学所用的命名及本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的工序及技术为本领域中熟知且常用的。标准技术可以用于化学合成和化学分析。某些此类技术和工序可见于“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Sangvi和Cook编，美国化学学会，Washington D.C.,1994；“Remington's Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co.,Easton,Pa.，第21版，2005；和“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”， Stanley T.Crooke编，CRC Press,BocaRaton,Florida；和Sambrook等, “Molecular Cloning,A laboratory Manual,”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，所述文献出于任何目的而以引用方式并入本文。在允许的情况下，贯穿本公开中所提及的所有专利、申请、已公布的申请及出版物、可经由数据库(诸如美国国家生物技术信息中心 (National Center for BiotechnologyInformation，NCBI))获得的 GENBANK登录号及相关序列信息及其他数据关于本文所论述的文献部分其他以引用方式并入本文以及以引用方式整体并入本文。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
如本文所使用，“核苷”意指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)和修饰核苷。核苷可连接至磷酸酯部分。
如本文所使用，“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。
如本文所使用，“呋喃糖基”意指包含5元环的结构，所述5元环包含四个碳原子和一个氧原子。
如本文所使用，“天然存在的糖部分”意指如在天然存在的RNA 中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。
如本文所使用，“糖部分”意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。
如本文所使用，“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
如本文所使用，“取代的糖部分”意指并非天然存在的糖部分的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’- 位上包含取代基的呋喃糖基。某些取代的糖部分为双环糖部分。
如本文所使用，“2’-取代的糖部分”意指在2’-位上包含除H或OH 之外的取代基的呋喃糖基。除非另外指出，否则2’-取代的糖部分不是双环糖部分(即，2’-取代的糖部分的2’-取代基不与呋喃糖基环的另一个原子形成桥联。
如本文所使用，“MOE”意指-OCH2CH2OCH3。
如本文所使用，“2’-F核苷”是指包含在2’位上包含氟的糖的核苷。除非另外指出，否则2’-F核苷中的氟在核糖位上(替代天然核糖的OH)。
如本文所使用，术语“糖替代物”意指如下结构：所述结构不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的糖部分，使得所得到的核苷亚基能够连接在一起和/或与其他核苷连接以形成能够与互补的低聚化合物杂交的低聚化合物。所述结构包括如下环：所述环包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环系统)。糖替代物包括但不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。
如本文所使用，“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环结构的桥联。在某些实施方案中， 4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些所述实施方案中，桥联连接了呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。
如本文所使用，“核苷酸”意指还包含磷酸酯连接基团的核苷。如本文所使用，“连接核苷”可或可不通过磷酸酯键联连接并且因此包括但不限于“连接的核苷酸”。如本文所使用，“连接核苷”为以连续顺序连接的核苷(即，在那些连接的核苷之间不存在另外的核苷)。
如本文所使用，“核碱基”意指可连接至糖部分以形成能够掺入到寡核苷酸中的核苷的原子基团，并且其中原子基团能够与另一个寡核苷酸或核酸的互补的天然存在的核碱基键合。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
如本文所使用，术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。
如本文所使用，“修饰核碱基”意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。
如本文所使用，“修饰核苷”意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个化学修饰的核苷。修饰核苷包含修饰的糖部分和/ 或修饰的核碱基。
如本文所使用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。
如本文所使用，“受限的乙基核苷”或“cEt”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
如本文所使用，“锁核酸核苷”或“LNA”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥联。
如本文所使用，“2’-取代的核苷”意指在2’-位上包含除H或OH 之外的取代基的核苷。除非另外指出，否则2’-取代的核苷不是双环核苷。
如本文所使用，“脱氧核苷”意指包含2'-H呋喃糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中发现。在某些实施方案中，2’- 脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
如本文所使用，“寡核苷酸”意指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA) 和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。
如本文所使用，“寡核苷”意指其中没有核苷间键联含有磷原子的寡核苷酸。如本文所使用，寡核苷酸包含寡核苷。
如本文所使用，“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰核苷和/ 或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。
如本文所使用，“键联”或“连接基团”意指将两个或更多个其他原子基团连接在一起的原子基团。
如本文所使用，“核苷间键联”意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。
如本文所使用，“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
如本文所使用，“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的核苷间键联之外的任何核苷间键联。
如本文所使用，“末端核苷间键联”意指寡核苷酸或其限定区的最后两个核苷之间的键联。
如本文所使用，“磷连接基团”意指包含磷原子的连接基团。磷连接基团包括但不限于具有下式的基团：
Figure BDA0002559814380000241
其中：
Ra和Rd各自独立地为O、S、CH2、NH或NJ1，其中J1为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
Rb为O或S；
Rc为OH、SH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基或取代的氨基；并且
J1为Rb为O或S。
磷连接基团包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯。
如本文所使用，“核苷间磷连接基团”意指直接连接两个核苷的磷连接基团。
如本文所使用，“非核苷间磷连接基团”意指不直接连接两个核苷的磷连接基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
如本文所使用，“中性连接基团”意指不带电荷的连接基团。中性连接基团包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、 MMI(-CH2-N(CH3)-O-)、酰胺-3(-CH2-C(＝O)-N(H)-)、酰胺-4 (-CH2-N(H)-C(＝O)-)、甲缩醛(-O-CH2-O-)以及硫代甲缩醛(-S-CH2-O-)。另外的中性连接基团包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)的非离子键联、羧酸盐酯、羧酰胺、硫醚、磺酸酯以及磺酰胺(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编，ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页))。另外的中性连接基团包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
如本文所使用，“核苷间中性连接基团”意指直接连接两个核苷的中性连接基团。
如本文所使用，“非核苷间中性连接基团”意指不直接连接两个核苷的中性连接基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
如本文所使用，“低聚化合物”意指包含两个或更多个子结构的聚合结构。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个缀合物基团和/或端基。在某些实施方案中，低聚化合物由寡核苷酸组成。低聚化合物还包括天然存在的核酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个连接的单体亚单元的骨架，其中每个连接的单体亚单元直接或间接地连接至杂环碱基部分。在某些实施方案中，低聚化合物还可包括不连接至杂环碱基部分从而提供无碱基位点的单体亚单元。在某些实施方案中，连结单体亚单元、糖部分或糖替代物与杂环碱基部分的键联可独立地修饰。在某些实施方案中，可或可不包括杂环碱基的键联-糖单元可被模拟物诸如肽核酸中的单体取代。
如本文所使用，“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。
如本文所使用，“缀合物”或“缀合物基团”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
如本文所使用，在缀合物基团背景下的“缀合物接头”或“接头”意指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分并且其(1)将寡核苷酸共价连接至缀合物基团的另一个部分或(2)共价连接缀合物基团的两个或更多个部分。
缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如反义寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的3’末端核苷的3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的5’末端核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，用于形成至低聚化合物的连接的键为可裂解键。在某些所述实施方案中，所述可裂解键构成可裂解部分的全部或部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分(例如，可裂解键或可裂解核苷)和碳水化合物聚簇部分，如GalNAc聚簇部分。此碳水化合物聚簇部分包含：靶向部分和任选地缀合物接头。在某些实施方案中，通过配体的数目和身份来鉴定碳水化合物聚簇部分。例如，在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含3个GalNAc基团并且命名为“GalNAc3”。在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含4 个GalNAc基团并且命名为“GalNAc4”。本文描述了具体的碳水化合物聚簇部分(具有具体系链、支链基团和缀合物接头基团)并且由后面跟着下标“a”的罗马数字命名。因此“GalNac3-1a”是指具有3个GalNac 基团和明确鉴定的系链、支链基团和连接基团的缀合物基团的具体碳水化合物聚簇部分。所述碳水化合物聚簇片段通过可裂解部分(如可裂解键或可裂解核苷)连接至低聚化合物。
如本文所使用，“可裂解部分”意指能够在生理条件下分裂的键或基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内部裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。
如本文所使用，“可裂解键”意指能够被分裂的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。
如本文所使用，“碳水化合物聚簇”意指具有连接至支架或接头基团的一个或多个碳水化合物残基的化合物。(参见针对碳水化合物聚簇的实例，例如Maier等,“Synthesisof Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent CarbohydrateCluster for Cellular Targeting”，Bioconjugate Chemistry,2003,(14):18-29，所述文献以引用方式全部并入本文，或Rensen等“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins tothe Hepatic Asiaglycoprotein Receptor”，J.Med.Chem. 2004,(47):5798-5808)。
如本文所使用，“修饰的碳水化合物”意指相对于天然存在的碳水化合物具有一个或多个化学修饰的任何碳水化合物。
如本文所使用，“碳水化合物衍生物”意指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。
如本文所使用，“碳水化合物”意指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。
如本文所使用，“保护基”意指本领域技术人员已知的任何化合物或保护基。保护基的非限制性实例可见于"Protective Groups in Organic Chemistry",T.W.Greene、P.G.M.Wuts,ISBN 0-471-62301-6,John Wiley &Sons,Inc,New York，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，“单链的”意指不与其补体杂交并且缺乏足够自身互补性以形成稳定自身双链体的低聚化合物。
如本文所使用，“双链的”意指彼此杂交的低聚化合物对或形成发夹结构的单个自身互补的低聚化合物。在某些实施方案中，双链低聚化合物包含第一和第二低聚化合物。
如本文所使用，“反义化合物”意指包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的化合物，所述寡核苷酸的至少一部分与其能够杂交的靶核酸互补，从而导致至少一种反义活性。
如本文所使用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测和/或可测量的变化。在某些实施方案中，反义活性包括靶核酸转录物(例如mRNA)的量或活性的调节。在某些实施方案中，反义活性包括前体mRNA的剪接的调节。
如本文所使用，“基于RNA酶H的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于反义化合物与靶核酸的杂交和随后的RNA酶H对靶核酸的裂解。
如本文所使用，“基于RISC的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于RNA诱导的沉默复合物 (RISC)。
如本文所使用，“检测”或“测量”意指执行用于检测或测量的测试或测定。所述检测和/或测量可能得到零值。因此，如果用于检测或测量的测试得到没有活性(活性为零)的结果，那么也仍然是已经进行了检测或测量活性的步骤。
如本文所使用，“可检测和/或可测量的活性”意指不为零的在统计学上显著的活性。
如本文所使用，“基本上未变化”意指具体地相对于变化更多的另一个参数，具体参数几乎没有或没有变化。在某些实施方案中，当参数变化小于5％时，所述参数基本上未变化。在某些实施方案中，如果参数变化小于两倍而另一个参数变化至少十倍，则所述参数基本上未变化。例如，在某些实施方案中，反义活性为靶核酸的量的变化。在某些所述实施方案中，如果非靶核酸的量比靶核酸的量变化的小得多，那么所述非靶核酸的量基本上未变化，但变化不必需为零。
如本文所使用，“表达”意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽) 以及翻译。
如本文所使用，“靶核酸”意指反义化合物意图与其杂交以产生希望的反义活性的核酸分子。反义寡核苷酸与其靶核酸具有足够的互补性以允许在生理条件下杂交。
如本文所使用，在提到核碱基时的“核碱基互补性”或“互补性”意指能够与另一个核碱基碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U) 互补。在某些实施方案中，互补核碱基意指反义化合物中能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。包含某些修饰的核碱基可维持与对应核碱基配对的能力，并且因此仍能够具有核碱基互补性。
如本文所使用，关于核碱基的“非互补性”意指彼此不形成氢键的核碱基对。
如本文所使用，关于低聚化合物(例如，连接核苷、寡核苷酸或核酸)的“互补性”意指所述低聚化合物或其区与另一个低聚化合物或其区通过核碱基互补性杂交的能力。互补的低聚化合物不需要在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，容忍一些错配。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区在70％的核碱基上互补(70％互补)。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区80％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区90％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区95％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区100％互补。
如本文所使用，“错配”意指当第一和第二低聚化合物对准时，不能够与第二低聚化合物的对应位置上的核碱基配对的第一低聚化合物的核碱基。第一和第二低聚化合物中的任一或两者可为寡核苷酸。
如本文所使用，“杂交”意指互补低聚化合物(例如，反义化合物及其靶核酸)的配对。虽然不限于具体机制，但配对的最常见机制涉及互补核碱基之间的氢键合，所述氢键合可为沃森-克里克 (Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键合。
如本文所使用，“特异性杂交”意指低聚化合物与一个核酸位点杂交比它与另一个核酸位点杂交具有更大亲和力的能力。
如本文所使用，关于寡核苷酸或其部分的“完全互补”意指寡核苷酸或其部分的每个核碱基均能够与互补核酸或其邻接部分的核碱基配对。因此，完全互补区在任一链中均不包含错配或未杂交的核碱基。
如本文所使用，“互补百分比”意指与靶核酸的等长部分互补的低聚化合物的核碱基的百分数。通过将与靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的低聚化合物的核碱基数除以低聚化合物的总长度来计算互补百分比。
如本文所使用，“同一性百分比”意指与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同类型(不依赖于化学修饰)的第一核酸中的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。
如本文所使用，“调节”意指当与调节前的分子、功能或活性的量或质量相比时分子、功能或活性的量或质量的变化。例如，调节包括基因表达的变化，即增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为另一个实例，表达的调节可包括前体mRNA加工的剪接位点选择的变化，从而导致与不存在调节情况下的量相比的具体剪接变体的绝对或相对量的变化。
如本文所使用，“化学基序”意指寡核苷酸或其区中的化学修饰的模式(pattern)。可通过寡核苷酸的某些核苷和/或某些连接基团上的修饰来定义基序。
如本文所使用，“核苷基序”意指寡核苷酸或其区中的核苷修饰的模式。这样的寡核苷酸的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。
如本文所使用，“糖基序”意指寡核苷酸或其区中的糖修饰的模式。
如本文所使用，“键联基序”意指寡核苷酸或其区中的键联修饰的模式。这样的寡核苷酸的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。
如本文所使用，“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。
如本文所使用，“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。
如本文所使用，关于核苷或一种“类型”的核苷的“修饰类型”意指核苷的化学修饰并且包括修饰和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，否则“具有第一类型的修饰的核苷”可为未修饰的核苷。
如本文所使用，“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA 为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰的。
如本文所使用，“相同类型的修饰”是指彼此相同的修饰，包括不存在修饰。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同类型的修饰”，即使DNA核苷为未修饰的。具有相同类型修饰的所述核苷可包含不同的核碱基。
如本文所使用，“单独区”意指寡核苷酸的部分，其中任何相邻部分的化学修饰或化学修饰的基序包括至少一个差异以允许单独的区彼此区分。
如本文所使用，“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合用于向动物施用的任何物质。在某些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂为无菌盐水。在某些实施方案中，所述无菌盐水为药用级盐水。
如本文所使用，术语“代谢病症”意指主要特征在于代谢失调–与食物分解产生能量相关的一系列复杂化学反应的疾病或病状。
如本文所使用，术语“心血管疾病”或“心血管病症”意指主要特征在于心脏或血管功能受损的疾病或病状。心血管疾病或病症的实例包括但不限于动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管疾病 (中风)、冠心病、高血压、血脂异常、高脂血症和高胆固醇血症。
如本文所使用，术语“单环系统或多环系统”意指包括选自单一或多环基团环系统的所有环系统，其中环稠合或连接并且意图包括单独地选自以下的单环系统和混合环系统：脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族和杂芳基烷基。所述单环结构和多环结构可含有环，所述环各自具有相同水平的饱和或各自独立地具有不同程度的饱和，包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和。每个环可包含选自C、N、O和S的环原子以产生杂环以及仅包含C环原子的环，所述环可存在于混合基序中，例如像苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子并且稠环具有两个氮原子。单环系统或多环系统可进一步被取代基取代，例如像具有两个连接至环中的一个的＝O基团的邻苯二甲酰亚胺。单环系统或多环系统可使用各种策略连接至母体分子，如直接通过环原子、通过多个环原子稠合、通过取代基或通过双官能连接部分。
如本文所使用，“前药”意指化合物的无活性或具有较小活性的形式，当向受试者施用时，所述前药被代谢形成活性或更具活性的化合物(例如，药物)。
如本文所使用，“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指替代指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷的2’-位上的除H 或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实施方案中，本公开的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取代基还可进一步被其他取代基取代并且可直接连接或通过连接基团如烷基或烃基连接至母体化合物。
同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O) O-Raa)、脂族基团、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-N(Rbb)(Rcc))、亚氨基(＝ NRbb)、酰胺基(-C(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、氨甲酰基(carbamido)((-OC(O)N(Rbb)(Rcc)或- N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、硫脲基(-N(Rbb)C(S) N(Rbb)(Rcc))、胍基(-N(Rbb)C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc))、脒基(-C(＝NRbb)N(Rb b)(Rcc)或-N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、巯基(-SRbb)、亚硫酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)以及氨磺酰基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)S(O)2Rbb)。其中每个Raa、Rbb和Rcc独立地为H、任选连接的化学官能团或另外的具有优选列表的取代基，所述列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。本文描述的化合物内的所选取代基以一定递归度存在。
如本文所使用，如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，其中1至约6个碳原子更优选。
如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1,3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环系统。环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C1-C12烷基。基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可位于任何位置并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分上被另外的取代基取代。
如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C1-C12烷基的芳香族基团。所得到的芳烷基(或芳基烷基)的烷基部分与母体分子形成共价键。实例包括但不限于苯甲基、苯乙基等。如本文所使用的芳烷基可任选地包括连接至烷基、芳基或形成基团的这两个基团的另外的取代基。
如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环系统基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环系统在一个或多个环中具有约5 至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“卤基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴和碘的原子。
如本文所使用，“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环系统或稠环系统的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环系统，所述稠环系统包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的系统。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“缀合物化合物”意指适合用作缀合物基团的任何原子、原子基团或连接的原子基团。在某些实施方案中，缀合物化合物可具有或赋予一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
如本文所使用，除非另外指出或修改，术语“双链的”是指彼此杂交的两个单独的低聚化合物。所述双链化合物可在一个或两个链的一个或两个末端上具有一个或多个或非杂交的核苷(突出端)和/或一个或多个内部非杂交核苷(错配)，前提是存在足够互补性，以维持在生理学相关条件下的杂交。
如本文所使用，“2’-O-甲氧基乙基”(也称为2’-MOE和 2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖基(furosyl)环的2'位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
如本文所使用，“2’-O-甲氧基乙基核苷酸”意指包含2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分的核苷酸。
“3’靶位点”或“3’终止位点”是指与特定反义化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
如本文所使用，“5’靶位点”或“5起始位点”是指与特定反义化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
如本文所使用，“5-甲基胞嘧啶”意指用连接至5’位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
如本文所使用，“约”意指在值的±10％以内。例如，如果陈述“标志物可增加约50％”，则意味着标志物可增加45％-55％
如本文所使用，“活性药剂”意指当施用给个体时药物组合物中提供治疗益处的一种或多种物质。例如，在某些实施方案中，靶向 ANGPTL3的反义寡核苷酸为活性药剂。
如本文所使用，“活性靶区”或“靶区”意指一种或多种活性反义化合物所靶向的区。
如本文所使用，“活性反义化合物”意指降低靶核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。
如本文所使用，“脂肪细胞新生(adipogenesis)”意指由前成脂肪细胞发育成脂肪细胞。“脂肪生成(Lipogenesis)”意指脂肪的产生或形成：脂肪变性或脂肪浸润。
如本文所使用，“肥胖症”或“肥胖”是指肥胖的状态或相对于瘦体重而言过度高量的体脂肪或脂肪组织。体脂肪的量包括对全身脂肪分布和脂肪组织沉积物大小和质量的考虑。体脂肪分布可通过皮褶测量、腰臀比或诸如超声波、计算机断层扫描或磁共振成像的技术来评估。根据疾病预防控制中心(Center for Disease Control and Prevention) 的规定，体重指数(BMI)为30或以上的个体被视为肥胖。如本文所使用，术语“肥胖”包括因为体内脂肪组织过量累积所导致的超出身体需要的体脂肪增加的情况。术语“肥胖”包括但不限于下列病状：成年型肥胖；食饵性肥胖；内源性或代谢性肥胖；内分泌肥胖；家族性肥胖；胰岛功能亢进性肥胖；增生性-肥大性肥胖；性腺功能减退性肥胖；甲状腺功能减退性肥胖；终身性肥胖；病态肥胖和外源性肥胖。
如本文所使用，“伴随施用”是指在相同时间以任何方式对两种药剂同时施用，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。伴随施用不需要在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同施用途经对两种药剂进行施用。两种药剂的作用不需要在相同时间显现。所述作用仅需要重叠一段时间但不需要同延。
如本文所使用，“施用”意指将药剂提供给动物，并且包括但不限于通过医学专业人员施用或自我施用。
如本文所使用，“药剂”意指在施用给动物时可提供治疗益处的活性物质。“第一药剂”意指本发明的治疗性化合物。例如，第一药剂可以是靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸。“第二药剂”意指本发明的第二治疗化合物(例如，靶向ANGPTL3的第二反义寡核苷酸)和/或非ANGPTL3治疗化合物。
如本文所使用，“改善”是指相关疾病、病症或病状的至少一种指标、体征或症状的减轻。指标的严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观度量来确定。
如本文所使用，“ANGPTL3”意指ANGPTL3的任何核酸或蛋白质。
如本文所使用，“ANGPTL3表达”意指从编码ANGPTL3的基因转录的mRNA的水平或从mRNA翻译的蛋白质的水平。ANGPTL3 表达可通过本领域已知的方法如RNA印迹或蛋白质印迹进行测定。
如本文所使用，“ANGPTL3核酸”意指编码ANGPTL3的任何核酸。例如，在某些实施方案中，ANGPTL3核酸包括编码ANGPTL3 的DNA序列、从编码ANGPTL3的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列，和编码ANGPTL3的mRNA序列。“ANGPTL3 mRNA”意指编码ANGPTL3蛋白质的mRNA。
如本文所使用，“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。
如本文所使用，“含apoB的脂蛋白”意指具有载脂蛋白B作为其蛋白组分的任何脂蛋白，并且被理解为包括LDL、VLDL、IDL和脂蛋白并且通常可以是降脂质剂和降脂质疗法的目标。“含ApoB-100 的LDL”意指含有ApoB-100同工型的LDL。
如本文所使用，“动脉粥样硬化”意指影响大动脉和中等动脉的动脉的硬化并且以存在脂肪沉积物为特征。脂肪沉积物被称为“动脉粥样化”或“斑”，其主要由胆固醇和其他脂肪、钙和疤痕组织组成，并且损伤动脉的内衬。
如本文所使用，“心血管代谢疾病”或“心血管代谢病症”是关于心血管系统和代谢系统两者的疾病或病症。心血管代谢疾病或病症的实例包括但不限于糖尿病和血脂异常。
如本文所使用，“共同施用”意指对个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可以在单一药物组合物中，或可在分开的药物组合物中。两种或更多种药剂中的每一种可通过相同或不同的施用途经进行施用。共同施用包括平行或相继施用。
如本文所使用，“胆固醇”是在所有动物组织的细胞膜中发现的固醇分子。胆固醇必须通过包括极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的脂蛋白在动物的血浆中运输。“血浆胆固醇”是指存在于血浆或血清中的所有脂蛋白 (VDL、IDL、LDL、HDL)酯化和/或非酯化胆固醇的总和。
如本文所使用，“胆固醇吸收抑制剂”意指抑制从饮食获得的外源性胆固醇的吸收的药剂。
如本文所使用，“冠心病(CHD)”意指向心脏供应血液和氧气的小血管的变窄，这通常是动脉粥样硬化的结果。
如本文所使用，“糖尿病(diabetes mellitus)”或“糖尿病(diabetes)”是以由胰岛素水平不足或胰岛素敏感性降低所致的代谢障碍或异常高血糖(高血糖症)为特征的综合征。特征症状为由高血糖水平引起的过量尿产生(多尿)、试图补偿增加排尿的过度口渴和增加的液体摄取 (烦渴)、由对眼睛光学系统的高血糖作用引起的视力模糊、原因不明的体重减轻、和嗜眠。
如本文所使用，“糖尿病性血脂异常”或“伴血脂异常的2型糖尿病”意指以2型糖尿病、HDL-C降低、甘油三酯升高以及小而密LDL 颗粒的升高为特征的病状。
如本文所使用，“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。例如，注射型组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
如本文所使用，“血脂异常”是指脂质和/或脂蛋白代谢的障碍，包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏。血脂异常可表现为诸如胆固醇和甘油三酯的脂质以及诸如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的脂蛋白的升高。
如本文所使用，“剂量单位”意指所提供的药剂的形式，例如丸剂、片剂或本领域中已知的其他剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位为含有冻干反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位为含有重构反义寡核苷酸的小瓶。
如本文所使用，“剂量”意指在单次施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可在一个、两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂中施用。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，可使用两次或更多次注射来实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被陈述为每小时、每天、每周或每月药剂的量。剂量可表示为mg/kg或g/kg。
如本文所使用，“有效量”或“治疗有效量”意指足以在需要活性药剂的个体中实现所需生理学结果的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其他相关因素。
如本文所使用，“葡萄糖”是指被细胞用作能量源和代谢介体的单糖。“血浆葡萄糖”是指血浆中存在的葡萄糖。
如本文所使用，“高密度脂蛋白-C(HDL-C)”意指与高密度脂蛋白颗粒结合的胆固醇。血清(或血浆)中HDL-C的浓度通常以mg/dL或 nmol/L计量。“血清HDL-C”和“血浆HDL-C”分别意指血清和血浆中的HDL-C。
如本文所使用，“HMG-CoA还原酶抑制剂”意指通过抑制酶HMG-CoA还原酶起作用的药剂，例如阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀。
如本文所使用，“高胆固醇血症”意指按照National Cholesterol EducationalProgram(NCEP)对于检测、评价或治疗成人高胆固醇的专家小组报告的指南(参见Arch.Int.Med.(1988)148,36-39)，以升高的胆固醇或循环(血浆)胆固醇、LDL-胆固醇和VLDL-胆固醇为特征的病状。
如本文所使用，“高脂血症(Hyperlipidemia)”或“高脂血症 (hyperlipemia)”是以血清脂质或循环(血浆)脂质升高为特征的病状。此病状表现为异常高浓度的脂肪。循环血液中的脂质级分为胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和甘油三酯。
如本文所使用，“高甘油三酯血症”意指以甘油三酯水平升高为特征的病状。
如本文所使用，“鉴定”或“选择具有代谢或心血管疾病的受试者”意指鉴定或选择已诊断出代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的受试者；或，鉴定或选择具有代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的任何症状的受试者，所述症状包括但不限于高胆固醇血症、高血糖、高脂血症、高甘油三酯血症、高血压、增加的胰岛素抵抗、胰岛素敏感性降低、超过正常体重，和/或超过正常体脂肪含量或它们的任何组合。所述鉴定可通过任何方法来实现，所述方法包括但不限于标准临床试验或评价，如测量血清或循环(血浆)胆固醇，测量血清或循环(血浆) 血液葡萄糖，测量血清或循环(血浆)甘油三酯，测量血压，测量体脂肪含量，测量体重等。
如本文所使用，“鉴定”或“选择糖尿病受试者”意指鉴定或选择已被鉴定为糖尿病的受试者，或鉴定或选择具有糖尿病(1型或2型)的任何症状的受试者，所述症状诸如但不限于具有至少110mg/dL的空腹血糖、糖尿、多尿、多饮、增加的胰岛素抵抗和/或胰岛素敏感性降低。
如本文所使用，“鉴定”或“选择肥胖受试者”意指鉴定或选择已被诊断为肥胖的受试者，或鉴定或选择具有超过30的BMI和/或腰围在男性中大于102cm或在女性中大于88cm的受试者。
如本文所使用，“鉴定”或“选择具有血脂异常的受试者”意指鉴定或选择已被诊断出脂质和/或脂蛋白代谢障碍(包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏)的受试者。血脂异常可表现为诸如胆固醇和甘油三酯的脂质以及诸如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的脂蛋白的升高。
如本文所使用，“鉴定”或“选择具有增加的肥胖症的受试者”意指鉴定或选择具有增加的量的体脂肪(或肥胖症)的受试者，所述体脂肪包括对全身脂肪分布和脂肪组织沉积物大小和质量中的一者或两者的考虑。体脂肪分布可通过皮褶测量、腰臀比或诸如超声波、计算机断层扫描或磁共振成像的技术来评估。根据疾病预防控制中心(Center forDisease Control and Prevention)的规定，体重指数(BMI)为30或以上的个体被视为肥胖。
如本文所使用，“改进的心血管后果”意指不利的心血管事件的发生率或其风险降低。不利心血管事件的实例包括但不限于死亡、再梗死、中风、心源性休克、肺水肿、心脏停搏和心房性心律失常。
如本文所使用，“紧邻”意指在紧邻的要素之间没有插入要素。
如本文所使用，“个体”或“受试者”或“动物”意指对于治疗或疗法所选择的人或非人动物。
如本文所使用，“胰岛素抵抗”被定义为其中正常胰岛素量不足以产生来自细胞(例如脂肪、肌肉和/或肝细胞)的正常胰岛素应答的病状。脂肪细胞中的胰岛素抵抗导致储存的甘油三酯水解，这升高血浆中的游离脂肪酸。肌肉中的胰岛素抵抗降低葡萄糖摄取，而肝脏中的胰岛素抵抗减少葡萄糖储存，两种作用都会升高血液葡萄糖。由胰岛素抵抗引起的胰岛素和葡萄糖的高血浆水平往往导致代谢综合征和2 型糖尿病。
如本文所使用，“胰岛素敏感性”是个体对葡萄糖加工的有效程度的量度。具有高胰岛素敏感性的个体有效地加工葡萄糖，而具有低胰岛素敏感性的个体不会有效地加工葡萄糖。
如本文所使用，术语“静脉施用”意指施用到静脉中。
如本文所使用，“降低脂质”意指受试者中一种或多种脂质的减少。降低脂质可随时间在一个或多个剂量下发生。
如本文所使用，“降脂质剂”是指提供给受试者以在受试者中实现降低脂质的药剂，例如，ANGPTL3特异性调节剂。例如，在某些实施方案中，提供给受试者降脂质剂以降低受试者中的apoB、apoC-III、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非-HDL-C、甘油三酯、小而密LDL颗粒和Lp(a)中的一种或多种。
如本文所使用，“降脂质疗法”意指提供给受试者以降低受试者中的一种或多种脂质的治疗方案。在某些实施方案中，提供降脂质疗法以降低受试者中的apoB、apoC-III、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、 IDL-C、非-HDL-C、甘油三酯、小而密LDL颗粒和Lp(a)中的一种或多种。
如本文所使用，“脂蛋白”诸如VLDL、LDL和HDL是指血清、血浆和淋巴中发现的一组蛋白质并且对于脂质运输是重要的。每种脂蛋白的化学组成有所不同，其中HDL具有更高的蛋白质对脂质比例，而VLDL具有更低的蛋白质对脂质比例。
如本文所使用，“低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)”意指在低密度脂蛋白颗粒中携带的胆固醇。血清(或血浆)中LDL-C的浓度通常以 mg/dL或nmol/L计量。“血清LDL-C”和“血浆LDL-C”分别意指血清和血浆中的LDL-C。
如本文所使用，“主要风险因素”是指促成特定疾病或病状的高风险的因素。在某些实施方案中，冠心病的主要风险因素包括但不限于吸烟、高血压、低HDL-C、冠心病家族史、年龄和本文公开的其他因素。
如本文所使用，“代谢病症”或“代谢疾病”是指以代谢功能的改变或紊乱为特征的病状。“代谢的”和“代谢”是本领域中熟知的术语并且通常包括发生在活有机体内的整个范围的生物化学过程。代谢病症包括但不限于高血糖症、前驱糖尿病、糖尿病(I型和2型)、肥胖症、胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病引起的血脂异常。
如本文所使用，“代谢综合征”意指以代谢来源的脂质和非脂质心血管风险因素的聚类为特征的病状。在某些实施方案中，通过以下因素中任何3个的存在来鉴定代谢综合征：男性中腰围大于102cm或女性中腰围大于88cm；至少150mg/dL的血清甘油三酯；男性中HDL-C小于40mg/dL或女性中小于50mg/dL；至少130/85mmHg 的血压；以及至少110mg/dL的空腹血糖。这些决定因素可在临床实践中容易地测量(JAMA,2001,285:2486-2497)。
如本文所使用，“混合型血脂异常”意指以升高的胆固醇和升高的甘油三酯为特征的病状。
如本文所使用，“MTP抑制剂”意指抑制酶微粒体甘油三酯转移蛋白的药剂。
如本文所使用，“非酒精性脂肪肝疾病”或“NAFLD”意指以不是由过量酒精饮用(例如，超过20g/天的酒精消耗)引起的肝脏脂肪炎症为特征的病状。在某些实施方案中，NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关。NAFLD涵盖从简单的肝细胞甘油三酯累积(肝脏脂肪变性) 到伴炎症的肝脏脂肪变性(脂肪性肝炎)、纤维化和肝硬化的疾病谱。
如本文所用，“非酒精性脂肪肝炎(NASH)”从NAFLD的进展超出甘油三酯的沉积而发生。能够诱导坏死、炎症和纤维化的“二次打击”是NASH发展所需要的。二次打击的候选物可分组成广泛种类：引起氧化应激增加的因素和提升促炎细胞因子表达的因素。已提出，在动物和人类的肝细胞中增加的肝脏甘油三酯导致氧化应激增加，表明肝甘油三酯积累、氧化应激和肝脏脂肪变性到NASH的进展之间潜在的因果关系(Browning和Horton,J ClinInvest,2004,114,147-152)。高甘油三酯血症和高脂肪酸血症可以引起外周组织中的甘油三酯积累(Shimamura等,Biochem Biophys Res Commun,2004,322, 1080-1085)。
如本文所使用，“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。核酸还可包含单一分子中的这些要素的组合。
如本文所使用，“肠胃外施用”意指不通过消化道的施用。肠胃外施用包括局部施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。施用可以是连续的或长期的或短期的或间歇的。
如本文所使用，“药剂”意指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸为药剂。
如本文所使用，“药物组合物”意指适用于对个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种活性剂和无菌水溶液。
如本文所使用，“药学上可接受的载体”意指不会干扰寡核苷酸的结构或功能的介质或稀释剂。这些载体中的某些使药物组合物能够被配制为例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、混悬液和锭剂以便由受试者口服摄入。某些所述载体使得药物组合物能够配制成用于注射或输注。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。
如本文所使用，“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体寡核苷酸的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。
如本文所述，“部分”意指核酸中限定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
如本文所使用，“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作或发展达数分钟到无限期的时间段。预防还意指降低发展疾病、疾病或病状的风险。
如本文所使用，“副作用”意指可归因于治疗的非所需作用的生理应答。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病和不适。例如，血清中升高的转氨酶水平可指示肝中毒或肝功能异常。例如，升高的胆红素可指示肝中毒或肝功能异常。
如本文所使用，“抑制素”意指抑制HMG-CoA还原酶的活性的药剂。
如本文所使用，“皮下施用”意指刚好在皮肤下方的施用。
如本文所使用，“靶向”或“靶向的”意指设计和选择将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的过程。
如本文所使用，“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录物”均是指能够由反义化合物靶向的核酸。
如本文所使用，“靶区”被定义为具有至少一个可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的部分。
如本文所使用，“靶区段”意指一种或多种反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”或“5’起始位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”或“3’终止位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
如本文所使用，“治疗有效量”意指对个体提供治疗益处的药剂的量。
如本文所使用，“治疗性生活方式变化”意指旨在降低脂肪/脂肪组织质量和/或胆固醇的饮食和生活方式变化。此类变化会降低发展心脏病的风险，并且可包括关于每日总卡路里、总脂肪、饱和脂肪、多不饱和脂肪、单不饱和脂肪、碳水化合物、蛋白质、胆固醇、不溶纤维的饮食摄取的推荐，以及身体活动的推荐。
如本文所使用，“甘油三酯”意指由与三个脂肪酸分子结合的甘油组成的脂质或中性脂肪。
如本文所使用，“2型糖尿病(Type 2diabetes)”(也称为“2型糖尿病(type2diabetes mellitus)”、“糖尿病2型(diabetes mellitus,type 2)”，且先前称作“糖尿病2型(diabetes mellitus type 2)”、“非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)”、“肥胖相关糖尿病”或“成人发作型糖尿病”)是一种代谢病症，其主要以胰岛素抵抗、相对胰岛素缺乏和高血糖为特征。
如本文所使用，“治疗”是指施用药物组合物以达到疾病、病症或病状的改变或改善。
某些实施方案
在某些实施方案中，ANGPTL3具有如GenBank登录号 NM_014495.2中所列的序列(以SEQ ID NO:1形式并入本文)。在某些实施方案中，ANGPTL3具有如GenBank登录号No.NT_032977.9 的核苷酸33032001至33046000中所列的序列(以SEQ ID NO:2形式并入本文)。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个核苷组成并且具有包含与SEQ ID NO:1-2的等长部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，化合物包含本领域中已知的靶向ANGPTL3 的siRNA或反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。适用于缀合的靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸的实例包括但不限于公开于US 8,653,047(WO 2011/085271)中的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于US 8,653,047中的SEQ ID NO:34-111中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于 US 8,653,047中的SEQ ID NO:34-111中的任一个的核碱基序列的siRNA的有义链或反义链和本文所述的缀合物基团。以上提及的所有 SEQ ID NO的核碱基序列以引用的方式并入本文。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中修饰寡核苷酸由靶向ANGPTL3的长度为 12至30个连接核苷组成。ANGPTL3靶标可以具有选自SEQ ID NO: 1-2中的任一个的序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸为与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少 12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159互补的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少 80％互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸为与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少 12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926互补的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少 80％互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基147至162的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸为与SEQ ID NO:1的核碱基147至162的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或16个连续核碱基。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基147至162互补的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12至30个、15至30个、 18至24个、19至22个、13至25个、14至25个、15至25个或16 至24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由8个、9 个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18 个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27 个、28个、29个或30个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸为16个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸为20个连接核苷的长度。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含这样的核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO:1或2的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14 个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或 20个连续核碱基的部分。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16 个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基的核碱基序列，所述连续核碱基来源的核碱基序列选自SEQ ID NO:15-27、 30-73、75-85、87-232、238、240-243、245-247、249-262、264-397、 399-469、471-541、543-600、604-760、762-819、821-966、968-971、 973-975、977-990、992-1110、1112-1186、1188-1216、1218-1226、 1228-1279、1281-1293、1295-1304、1306-1943、1945-1951、1953-1977、1979-1981、1983-2044、2046-2097、2099-2181、2183-2232、2234-2238、 2240-2258、2260-2265、2267-2971、2973-2976、2978-4162、4164-4329、4331-4389、4391-4394、4396-4877中的任一个。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:77的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS563580和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 563580和缀合物基团组成。
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有5’-X的修饰寡核苷酸 ISIS 563580，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。在某些实施方案中，反义化合物由具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 563580组成，其中 X为包含GalNAc的缀合物基团。
Figure BDA0002559814380000531
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703801。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703801组成。
Figure BDA0002559814380000541
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703802。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 703802组成。
Figure BDA0002559814380000551
在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有SEQ ID NO:77的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。在某些实施方案中，反义化合物由具有SEQ ID NO:77的核碱基序列的修饰寡核苷酸组成，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。
Figure BDA0002559814380000561
其中，R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)且R2为H；或者R1和R2一起形成桥，其中R1为-O-且R2为-CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且 R1和R2直接连接使得所得的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
并且对于相同环(每个环为独立地)上的R3和R4的每一对：R3选自H和-OCH2CH2OCH3且R4为H，或者R3和R4一起形成桥，其中 R3为–O-，并且R4为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R3和R4直接连接使得所得的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
并且R5选自H和–CH3；
并且Z选自S-和O-。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:20的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS544199和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 544199和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:35的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS560400和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 560400和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:90的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS567233和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 567233和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:93的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS567320和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 567320和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:94的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS567321和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 567321和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:110的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS 559277 和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 559277和缀合物基团组成。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:114的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物包含ISIS 561011 和缀合物基团。在某些实施方案中，化合物由ISIS 561011和缀合物基团组成。
在某些实施方案中，如在修饰寡核苷酸的整体范围内所测量，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1-2中任一个至少70％、 75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。
在某些实施方案中，本文公开的化合物为单链的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的化合物为单链的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键联为修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9 或至少10个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖为双环糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟 -HNA或4’-(CH2)n-O-2’桥联，其中n为1或2。
在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸具有：a)由连接脱氧核苷组成的缺口区段；b)由连接核苷组成的5'翼区段；及c)由连接核苷组成的3'翼区段。缺口区段定位在5'翼区段与3'翼区段之间并且每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括：由连接脱氧核苷组成的缺口区段；由连接核苷组成的5’翼区段；由连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段定位在5'翼区段与3'翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰糖。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰寡核苷酸，其由20个连接核苷组成且具有包含与SEQ ID NO:1-2的等长部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；由五个连接核苷组成的 5’翼区段；和由五个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段定位在 5'翼区段与3'翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2'-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；由五个连接核苷组成的5’翼区段；由五个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰寡核苷酸，其由20个连接核苷组成且具有包含选自SEQ ID NO:77的核碱基序列的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段缺口区段；由五个连接核苷组成的5’翼区段；和由五个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段位于5'翼区段与3'翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含 2'-O-甲氧基乙基糖；其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由具有SEQ ID NO:77的核碱基序列的20个连接核苷组成并且包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；由五个连接核苷组成的5’翼区段；由五个连接核苷组成的 3’翼区段；其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰寡核苷酸，其由20个连接核苷组成且具有包含选自SEQ ID NO:20的核碱基序列的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段缺口区段；由五个连接核苷组成的5’翼区段；和由五个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段位于5'翼区段与3'翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含 2'-O-甲氧基乙基糖；其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由具有SEQ ID NO:20的核碱基序列的20个连接核苷组成并且包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；由五个连接核苷组成的5’翼区段；由五个连接核苷组成的 3’翼区段；其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰寡核苷酸，其由16个连接核苷组成且具有包含SEQ ID NO:110的核碱基序列的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段缺口区段；由三个连接核苷组成的5’翼区段；和由三个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段定位在5'翼区段与3'翼区段之间，其中每个翼区段包含至少一个2'-O- 甲氧基乙基糖和至少一个cEt糖；其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由具有SEQ ID NO:110的核碱基序列的16个连接核苷组成并且包含：由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；由三个连接核苷组成的5’翼区段；由三个连接核苷组成的3’翼区段；其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段包含至少一个2'-O-甲氧基乙基糖和至少一个cEt糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为 5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的5’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的3’端连接至修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，缀合物基团包含恰好一个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含一个或多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含恰好两个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含两个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含三个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含恰好三个配体。在某些实施方案中，每个配体选自：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、 L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6- 二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基 -D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、 2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4- 硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D- 葡糖-庚吡喃糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4- 硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在某些实施方案中，每个配体为 N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000631
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000632
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000641
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000642
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000643
在某些实施方案中，缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
在某些实施方案中，缀合物基团包含选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000651
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure BDA0002559814380000652
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure BDA0002559814380000661
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure BDA0002559814380000662
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
在某些实施方案中，缀合物基团共价连接至修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000663
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000671
其中：
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；
每个n独立地为0或1；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000681
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000682
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000691
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000692
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000701
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002559814380000702
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000711
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000721
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000722
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000731
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000732
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000733
在某些实施方案中，缀合物接头包含吡咯烷。在某些实施方案中，缀合物接头不包含吡咯烷。
在某些实施方案中，缀合物接头包含PEG。
在某些实施方案中，缀合物接头包含酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含至少两个酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头不包含酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含聚酰胺。
在某些实施方案中，缀合物接头包含胺。
在某些实施方案中，缀合物接头包含一个或多个二硫键。
在某些实施方案中，缀合物接头包含蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分包含脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分选自：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3- 二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分选自：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000741
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000751
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000761
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000762
其中n为1至20。
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000771
在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000772
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000773
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构之一：
Figure BDA0002559814380000774
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构之一：
Figure BDA0002559814380000781
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000782
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000783
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000784
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000791
在某些实施方案中，支链基团包含醚。
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000792
每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000801
在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000802
在某些实施方案中，支链基团包含：
Figure BDA0002559814380000803
其中每个j为1至3的整数；并且
其中每个n为1至20的整数。
在某些实施方案中，支链基团包含：
Figure BDA0002559814380000811
在某些实施方案中，每个系链选自以下：
Figure BDA0002559814380000812
其中L选自磷连接基团和中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，每个系链选自以下：
Figure BDA0002559814380000821
其中Z2为H或CH3；并且
每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。
在某些实施方案中，每个系链选自以下：
Figure BDA0002559814380000822
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
在某些实施方案中，至少一个系链包含乙二醇。
在某些实施方案中，至少一个系链包含酰胺。在某些实施方案中，至少一个系链包含聚酰胺。
在某些实施方案中，至少一个系链包含胺。
在某些实施方案中，至少两个系链彼此不同。在某些实施方案中，所有系链彼此相同。
在某些实施方案中，每个系链选自以下：
Figure BDA0002559814380000831
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
在某些实施方案中，每个系链选自以下：
Figure BDA0002559814380000832
在某些实施方案中，每个系链具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000833
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，每个系链具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000834
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000841
其中每个n独立地为0、1、2、3、 4、5、6或7。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380000842
在某些实施方案中，配体为半乳糖。
在某些实施方案中，配体为甘露糖-6-磷酸。
在某些实施方案中，每个配体选自：
Figure BDA0002559814380000843
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
在某些实施方案中，每个配体选自：
Figure BDA0002559814380000851
在某些实施方案中，每个配体具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000852
在某些实施方案中，每个配体具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000853
在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：
Figure BDA0002559814380000861
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000862
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000871
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000872
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000881
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000882
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000883
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000891
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000892
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000893
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000901
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000902
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000911
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000912
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000913
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000921
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000922
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000923
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000931
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000932
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000941
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000942
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000943
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000951
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000952
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：
Figure BDA0002559814380000953
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000961
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000962
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000963
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000964
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000971
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380000972
在某些实施方案中，缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。
在某些实施方案中，缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。
在某些实施方案中，缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中缀合物基团包含处于缀合物基团与寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，缀合物基团包含酰胺可裂解部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含酯可裂解部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000981
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000982
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380000991
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001001
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001011
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001012
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001021
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001022
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001031
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001032
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001041
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001042
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001051
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001052
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001061
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380001062
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380001071
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含：
Figure BDA0002559814380001072
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些实施方案中，Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，Bx为腺嘌呤。在某些实施方案中，Bx为胸腺嘧啶。在某些实施方案中，Q13为 O(CH2)2-OCH3。在某些实施方案中，Q13为H。
本发明的某些实施方案提供包含本文公开的组合物或化合物的前药。某些实施方案提供使用本文描述的缀合反义化合物和组合物抑制ANGPTL3的表达的方法。在某些实施方案中，缀合反义化合物或组合物抑制ANGPTL3至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少50％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少55％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少60％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少65％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少 ANGPTL3至少70％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少75％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少80％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少85％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少ANGPTL3至少90％。在优选的实施方案中，包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的反义化合物减少 ANGPTL3至少95％。
在某些实施方案中，当例如，如在实施例2-3和7-10中所述的 Hep3B细胞系中测试人类细胞时，本文公开的缀合反义化合物或组合物具有小于20μM、小于10μM、小于8μM、小于5μM、小于2μM、小于1μM或小于0.8μM的IC50。
在某些实施方案中，当通过如实施例13中所述的参数测量时，本文公开的缀合反义化合物或组合物由于具有小于40cP、小于35 cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP或小于15cP的粘度而有效。
在某些实施方案中，本文公开的缀合反义化合物或组合物具有高度可耐受性，如通过实施例中描述的体内耐受性测量所表明。在某些实施方案中，本文公开的缀合反义化合物具有高度可耐受性，如通过具有不超过盐水处理的动物4倍、3倍、2倍或1.5倍的ALT和/或 AST值的增加所表明。
本文公开的某些实施方案提供本文公开的缀合反义化合物的盐。在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含具有缀合物基团的修饰寡核苷酸的盐。
在某些实施方案中，本文公开的缀合反义化合物或组合物还包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，动物为人。
本文公开的某些实施方案提供方法，其包括向动物施用本文公开的缀合反义化合物或组合物。在某些实施方案中，施用缀合反义化合物或组合物是治疗性的。在某些实施方案中，施用所述缀合反义化合物或组合物治疗、预防或减慢与ANGPTL3有关的疾病的进展。在某些实施方案中，所述疾病与升高的ANGPTL3有关。在某些实施方案中，施用所述缀合反义化合物或组合物预防、治疗、改善心血管和/ 或代谢疾病或减慢其进展。
本文公开的某些实施方案提供用于治疗人类心血管和/或代谢疾病的方法，其包括鉴定患有心血管和/或代谢疾病的人并且给所述人施用治疗有效量的任何本文所公开的缀合反义化合物或组合物中的任一种，以便治疗所述人的心血管和/或代谢疾病。
某些实施方案提供用于治疗中的本文所述的缀合反义化合物和组合物。在某些实施方案中，所述治疗用在治疗、预防与ANGPTL3 有关的疾病或减慢其进展。在某些实施方案中，所述治疗用在治疗、预防与升高的ANGPTL3有关的疾病或减慢其进展。
在某些实施方案中，所述疾病是心血管和/或代谢疾病、病症或病状。在某些实施方案中，代谢和/或心血管疾病包括但不限于，肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血脂异常、脂肪代谢障碍、冠心病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、高脂肪酸血症或代谢综合征，或其组合。血脂异常可以是高血脂症。高血脂症可以是混合型高脂血症(CHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、或者高胆固醇血症和高甘油三酯血症两者。混合型高脂血症可以是家族性的或非家族性的。高胆固醇血症可以是家族性纯合的高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合的高胆固醇血症(HeFH)。高甘油三酯血症可以是家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)或高脂蛋白血症IV型。 NAFLD可以是肝脏脂肪变性或脂肪性肝炎。糖尿病可以是2型糖尿病或者伴血脂异常的2型糖尿病。胰岛素抵抗可以是伴血脂异常的胰岛素抵抗。
在某些实施方案中，本文公开的缀合反义化合物或组合物被指定为第一药剂，并且本文公开的方法或用途还包括施用第二药剂。在某些实施方案中，共同施用第一药剂与第二药剂。在某些实施方案中，依序或同时地共同施用第一药剂与第二药剂。
在某些实施方案中，第二药剂为降血糖剂。降血糖剂可以包括但不限于治疗性生活方式改变、PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、 GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促分泌剂、SGLT2 抑制剂、人胰淀素类似物、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。降血糖剂可以包括但不限于二甲双胍、磺酰脲类、罗格列酮、氯茴苯酸类、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。磺酰脲可为醋磺己脲(acetohexamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、甲苯磺丁脲 (tolbutamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)或格列齐特(gliclazide)。氯茴苯酸类可为那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈(repaglinide)。噻唑烷二酮可以为吡格列酮(pioglitazone)或罗格列酮。α-葡萄糖苷酶可以是阿卡波糖(acarbose)或米格列醇(miglitol)。
在某些实施方案中，第二药剂为降脂质疗法。在某些实施方案中，降脂质疗法可以包括但不限于治疗性生活方式改变、HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、MTP抑制剂(例如，靶向MTP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、ApoB抑制剂(例如，靶向ApoB 的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、ApoC3抑制剂(例如，靶向 ApoC3的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、PCSK9抑制剂(例如，靶向PCSK9的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、CETP抑制剂(例如，靶向CETP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、贝特类、有利的油(例如，磷虾或鱼油(例如VascepaR)、亚麻籽油或其他富含ω-3 脂肪酸(诸如α-亚麻酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸 (EPA))的油)或其任意组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可以是阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或辛伐他汀。胆固醇吸收抑制剂可以是依折麦布(ezetimibe)。贝特类可以是非诺贝特 (fenofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、氯贝特 (clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)和类似物。
在某些实施方案中，施用包含以胃肠外方式施用。在某些实施方案中，施用包含皮下施用。
在某些实施方案中，施用本文公开的缀合反义化合物导致脂质水平降低，包括甘油三酯水平、胆固醇水平、胰岛素抵抗、血糖水平或其组合。所述水平中的一个或多个可以独立地降低至少5％、至少 10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。施用缀合反义化合物可以导致改进的胰岛素敏感性或肝脏胰岛素敏感性。施用本文公开的缀合反义化合物可以导致动脉粥样硬化斑块、肥胖、葡萄糖、脂质、葡萄糖抗性、胆固醇的降低、或胰岛素敏感性的改善或其组合。
某些实施方案提供本文所述的缀合反义化合物用于制备用于治疗、改善、延迟或预防与ANGPTL3有关的疾病中的一种或多种的药物的用途。某些实施方案提供本文所述的缀合反义化合物用于制备用于治疗、改善、延迟或预防代谢疾病或心血管疾病中的一种或多种的药物的用途。
某些实施方案提供用于治疗、预防或改善本文所述的代谢疾病或心血管疾病中的一种或多种的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)本文所述的缀合反义化合物；及任选地b)本文所述的另外的药剂或疗法。所述试剂盒还可以包括使用所述试剂盒来治疗、预防或改善代谢疾病或心血管疾病中的一种或多种的说明书或标签。
反义化合物
低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸及siRNA。低聚化合物可为靶核酸的“反义序列”，意味着其能够与靶核酸经由氢键合进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些这类实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物的长度为 10至30个核苷酸。换句话说，反义化合物为10至30个连接的核碱基。在其他实施方案中，反义化合物包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸由8至80个、10至80个、12至50个、12至30个、15至 30个、18至24个、19至22个或20个连接核碱基组成。在某些这类实施方案中，反义化合物包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸由长度为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16 个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25 个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34 个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43 个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52 个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61 个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70 个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79 个或80个或处于由上述任何两个值所界定的范围内的连接核碱基组成。
在某些实施方案中，反义化合物包括缩短或截短的修饰寡核苷酸。缩短或截短的修饰寡核苷酸可有单个核苷自5'端缺失(5'截短)，或者自3'端缺失(3'截短)。缩短或截短的寡核苷酸可有两个或更多个核苷自5'端缺失，或者可有两个或更多个核苷自3'端缺失。或者，缺失的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端有一个或多个核苷缺失和3'端有一个或多个核苷缺失的反义化合物中。
当单一额外核苷存在于延长的寡核苷酸中时，所述额外核苷可以位于寡核苷酸的5'端、3'端或中心部分。当存在两个或更多个额外核苷时，所添加的核苷可彼此邻近，例如在寡核苷酸的5'端(5'添加)、 3'端(3'添加)或中心部分上添加有两个核苷的寡核苷酸中。或者，所添加的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端上添加有一个或多个核苷、在3'端上添加有一个或多个核苷、和/或在中心部分上添加有一个或多个核苷的寡核苷酸中。
有可能增加或减少反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。长度为25 个核碱基且在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够导引靶mRNA进行特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。同样，靶特异性裂解可使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。
Gautschi等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,March 2001)表明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外及体内减少bcl-2及bcl-xL两者的表达的能力。此外，这个寡核苷酸展现有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个和42个核碱基的反义寡核苷酸在家兔网状红血球测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14 个核碱基的反义寡核苷酸各自能够单独抑制转译，但程度相较于具有 28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。
某些反义化合物基序和机制
在某些实施方案中，反义化合物具有排列成一定型态或基序的化学上修饰的亚单元，以赋予反义化合物以诸如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可赋予另一个所需的性质，例如用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。
反义活性可以从涉及反义化合物(例如，寡核苷酸)与靶核酸的杂交的任何机制获得，其中杂交最终产生生物作用。在某些实施方案中，调节靶核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，减少靶核酸的量和/ 或活性。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交最终导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交未导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸杂交的出现(占位)导致反义活性的调节。在某些实施方案中，具有特定化学基序或化学修饰的模式的反义化合物特别适合采用一种或多种机制。在某些实施方案中，反义化合物通过一种以上的机制和/或通过从未被阐述的机制起作用。因此，本文所述的反义化合物不限于特定机制。
反义机制包括但不限于RNA酶H介导的反义；RNAi机制，其利用RISC途径并且包括但不限于siRNA、ssRNA和微RNA机制；以及占位型机制。某些反义化合物可通过一种以上的此机制和/或通过另外的机制起作用。
RNA酶H介导的反义
在某些实施方案中，反义活性通过RNA酶H导致靶RNA的至少部分地裂解。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，包含DNA或DNA状核苷的至少一部分的反义化合物可激活RNA酶H，导致靶核酸的裂解。在某些实施方案中，利用RNA酶H的反义化合物包含一种或多种修饰核苷。在某些实施方案中，此类反义化合物包含至少一个1-8修饰核苷的嵌段。在某些实施方案中，修饰核苷不支持RNA酶H活性。在某些实施方案中，此类反义化合物为如本文所述的缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA样核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷和DNA样核苷。
具有缺口聚物基序的某些反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持核糖核酸酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的每个区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的每个区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D- 核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(此2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE和2’-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(此双环糖修饰的核苷可包括具有限制性乙基的核苷)。在某些实施方案中，翼中的核苷可包括若干修饰的糖部分，包括例如2'-MOE及双环糖部分，如限制性乙基或LNA。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的及未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包括2'-MOE核苷、双环糖部分(如限制性乙基核苷或LNA核苷)及2'-脱氧核苷的各种组合。
每个相异区可包含均一糖部分、变化或交替的糖部分。翼-缺口- 翼基序常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'翼的长度，“Y”表示缺口的长度，且“Z”表示3'翼的长度。“X”及“Z”可包含均一、变化或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”及“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2'-脱氧核苷。本文所用的描述为“X-Y-Z”的缺口聚物具有一定构型以使缺口紧邻5'翼及3'翼中的每一个而定位。因此，在5'翼与缺口之间，或缺口与3'翼之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同；在其他实施方案中，它们不同。在某些实施方案中，“Y”为8至15个核苷。X、Y或Z可为1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或超过30个核苷中的任一个。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物具有其中缺口由6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、 15个或16个连接核苷组成的缺口聚物基序。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有式A所述的糖基序，如下：(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
其中：
每个A独立地为2'-取代的核苷；
每个B独立地为双环核苷；
每个J独立地为2'-取代的核苷或2'-脱氧核苷；
每个D为2'-脱氧核苷；
m为0-4；n为0-2；p为0-2；r为0-2；t为0-2；v为0-2；w为 0-4；x为0-2；y为0-2；z为0-4；g为6-14；
其限制条件为：
m、n及r中的至少一个不为0；
w和y中的至少一个不为0；
m、n、p、r及t的总和为2至5；并且
v、w、x、y及z的总和为2至5。
RNAi化合物
在某些实施方案中，反义化合物干扰RNA化合物(RNAi)，所述 RNA化合物包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此化合物至少部分地通过RISC途径起作用以降解和/或螯合靶核酸(因此包括微RNA/微RNA模拟化合物)。在某些实施方案中，反义化合物包含使其特别适合于此机制的修饰。
1.ssRNA化合物
在某些实施方案中，包括特别适合用作单链RNAi化合物(ssRNA) 的那些的反义化合物包含修饰的5’末端。在某些实施方案中，5’末端包含修饰的磷酸酯部分。在某些实施方案中，此修饰的磷酸酯是稳定的(例如，与未修饰的5’磷酸酯相比，对降解/裂解有抗性)。在某些实施方案中，此5’末端核苷使5’磷酸酯部分保持稳定。某些修饰的5’末端核苷可见于例如WO/2011/139702中的领域。
在某些实施方案中，ssRNA化合物的5’核苷具有式IIc：
Figure BDA0002559814380001181
其中：
T1为任选地保护磷部分；
T2为连接式IIc的化合物与低聚化合物的核苷间连接基团；
A具有下式的一种：
Figure BDA0002559814380001182
Q1和Q2各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、 C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(R3)(R4)；
Q3为O、S、N(R5)或C(R6)(R7)；
R3、R4、R5、R6和R7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
M3为O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、 C(R15)＝C(R17)、OC(R15)(R16)或OC(R15)(Bx2)；
R14为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的 C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的 C2-C6炔基；
R15、R16、R17和R18各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
Bx1为杂环碱基部分；
或者如果存在Bx2，则Bx2为杂环碱基部分并且Bx1为H、卤素、 C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、 C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
J4、J5、J6和J7各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
或者J4与J5或J7中的一者形成桥，其中所述桥包括选自O、S、 NR19、C(R20)(R21)、C(R20)＝C(R21)、C[＝C(R20)(R21)]以及C(＝O)的1至 3个连接双基基团并且J5、J6以及J7的另外两个各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
R19、R20和R21各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
G为H、OH、卤素或O-[C(R8)(R9)]n-[(C＝O)m-X1]j-Z；
R8和R9各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
X1为O、S或N(E1)；
Z为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(E2)(E3)；
E1、E2和E3各自独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
n为1至约6；
m为0或1；
j为0或1；
每个取代的基团包含独立地选自卤素、OJ1、N(J1)(J2)、＝NJ1、SJ1、 N3、CN、OC(＝X2)J1、OC(＝X2)N(J1)(J2)和C(＝X2)N(J1)(J2)的一个或多个任选地保护的取代基；
X2为O、S或NJ3；
J1、J2和J3各自独立地为H或C1-C6烷基；
当j为1时，那么Z不为卤素或N(E2)(E3)；并且
其中所述低聚化合物包含8至40个单体亚单元并且与靶核酸的至少一部分是可杂交的。
在某些实施方案中，M3为O、CH＝CH、OCH2或OC(H)(Bx2)。在某些实施方案中，M3为O。
在某些实施方案中，J4、J5、J6和J7各自为H。在某些实施方案中，J4与J5或J7中的一者形成桥。
在某些实施方案中，A具有下式的一种：
Figure BDA0002559814380001211
其中：
Q1和Q2各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基。在某些实施方案中，Q1和Q2各自为H。在某些实施方案中，Q1和Q2各自独立地为H或卤素。在某些实施方案中，Q1和Q2为H并且Q1和Q2的另一者为F、CH3或OCH3。
在某些实施方案中，T1具有下式：
Figure BDA0002559814380001212
其中：
Ra和Rc各自独立地为保护羟基、保护巯基、C1-C6烷基、取代的 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、保护氨基或取代的氨基；并且
Rb是O或S。在某些实施方案中，Rb为O并且Ra和Rc各自独立地为OCH3、OCH2CH3或CH(CH3)2。
在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、 OCH2CH3、O(CH2)2F、OCH2CHF2、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(C H2)2-OCH3、O(CH2)2-SCH3、O(CH2)2-OCF3、O(CH2)3-N(R10)(R11)、O(C H2)2-ON(R10)(R11)、O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R10) (R11)、OCH2C(＝O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11)或O(CH2)2-N(R12)-C(＝NR 13)[N(R10)(R11)]，其中R10、R11、R12和R13各自独立地为H或C1-C6烷基。在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCF3、OCH2CH3、O CH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、 OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N (H)-C(＝NH)NH2。在某些实施方案中，G为F、OCH3或O(CH2)2-OC H3。在某些实施方案中，G为O(CH2)2-OCH3。
在某些实施方案中，5’末端核苷具有式IIe：
Figure BDA0002559814380001221
在某些实施方案中，反义化合物(包括特别适合于ssRNA的那些) 包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本文讨论的任何糖修饰和/或其他已知的糖修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有均匀糖修饰的区或者由具有均匀糖修饰的区组成。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均包含相同的RNA样糖修饰。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-F核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-OMe核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-MOE 核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为cEt核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为LNA核苷。在某些实施方案中，统一区构成了寡核苷酸的全部或基本上全部。在某些实施方案中，所述区构成了全部寡核苷酸，除1-4个末端核苷之外。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含重复糖修饰的一个或多个区，其中所述核苷在具有第一类型的糖修饰的核苷与具有第二类型的糖修饰的核苷之间交替。在某些实施方案中，两种类型的核苷均为RNA 样核苷。在一些实施方案中，交替核苷选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、 LNA和cEt。在某些实施方案中，交替修饰为2’-F和2’-OMe。此类区可以是连续的或可以夹杂不同修饰的核苷或缀合核苷。
在某些实施方案中，交替修饰的交替区各自由单个核苷组成(即模式为(AB)xAy，其中A为具有第一类型的糖修饰的核苷并且B为具有第二类型的糖修饰的核苷；x为1-20并且y为0或1)。在某些实施方案中，交替基序中的一个或多个交替区包括不只一种类型的单个核苷。例如，寡核苷酸可包括以下核苷基序中的任一个的一个或多个区：
AABBAA、
ABBABB、
AABAAB、
ABBABAABB、
ABABAA、
AABABAB、
ABABAA、
ABBAABBABABAA、
BABBAABBABABAA、或
ABABBAABBABABAA；
其中，A为第一类型的核苷并且B为第二类型的核苷。在某些实施方案中，A和B各自选自2’-F、2’-OMe、BNA以及MOE。
在某些实施方案中，具有此交替基序的寡核苷酸还包含修饰的5’末端核苷，诸如式IIc或IIe的那些。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具2-2-3基序的区。此类区包含以下基序：
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
其中：A为第一类型的修饰核苷；
B和C为具有与A不同修饰的核苷，然而，B和C两者彼此可具有相同或不同的修饰；
x和y为1至15。
在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷。在某些实施方案中， B和C两者均为2’-F修饰核苷。在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷并且B和C两者均为2’-F修饰核苷。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序： 5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷；
A为第一类型的修饰核苷；
B为第二类型的修饰核苷；
D为包含与其邻近的核苷不同的修饰的修饰核苷。因此，如果y 为0，那么D与B必须是不同修饰的并且如果y为1，那么D与A 必须是不同修饰的。在某些实施方案中，D不同于A和B两者。
X为5-15；
Y为0或1；
Z为0-4。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序：5’-(Q)-(A)x-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷；
A为第一类型的修饰核苷；
D为包含不同于A的修饰的修饰核苷。
X为11-30；
Z为0-4。
在某些实施方案中，以上基序中的A、B、C以及D选自：2’-OMe、 2’-F、2’-MOE、LNA和cEt。在某些实施方案中，D表示末端核苷。在某些实施方案中，此类末端核苷不被设计来与靶核酸杂交(尽管一个或多个可能偶然杂交)。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为腺嘌呤，与靶核酸的相应位置处的核碱基的同一性无关。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为胸腺嘧啶。
在某些实施方案中，包括特别适合用作ssRNA的那些的反义化合物包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
具有本文所述的各种糖基序中的任一个的寡核苷酸可以具有任何键联基序。例如，包括但不限于以上所述的那些的寡核苷酸可以具有选自非限制性下表的键联基序：
5’最末端键联 中心区 3’区
PS 交替PO/PS 6PS
PS 交替PO/PS 7PS
PS 交替PO/PS 8PS
2.siRNA化合物
在某些实施方案中，反义化合物为双链RNAi化合物(siRNA)。在此类实施方案中，一条或两条链可以包含针对ssRNA的以上所述的任何修饰基序。在某些实施方案中，ssRNA化合物可以是未修饰的 RNA。在某些实施方案中，siRNA化合物可以包含未修饰的RNA核苷，但是是修饰的核苷间键联。
若干实施方案涉及双链组合物，其中每条链包含由一个或多个修饰或未修饰的核苷的位置限定的基序。在某些实施方案中，提供包含完全或至少部分杂交以形成双链体的第一和第二低聚化合物并且还包含与核酸靶互补并且杂交的区的组合物。此组合物包含第一低聚化合物(其为与核酸靶具有完全或部分互补性的反义链)和第二低聚化合物(其为与第一低聚化合物的一个或多个区具有互补性并且形成至少一个双链体区的有义链)是合适的。
若干实施方案的所述组合物通过与核酸靶杂交调节基因表达，从而导致正常功能的损失。在一些实施方案中，靶核酸为ANGPTL3。在某些实施方案中，通过激活用本文公开的组合物形成的RISC复合物促进靶向ANGPTL3的降解。
若干实施方案涉及双链组合物，其中所述链中的一条用于例如影响相反的链优选装载入(或裂解)RISC复合物中。所述组合物用于靶向所选择的核酸分子并且调节一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，本发明的组合物与靶RNA的一部分杂交，导致靶RNA的正常功能的损失。
若干实施方案涉及双链组合物，其中两条链均包括半修饰基序、完全修饰的基序、定位修饰的基序或交替基序。本发明的组合物的每条链可被修饰以在例如siRNA途径中充当特定的角色。使用每条链中的不同基序或每条链中具有不同化学修饰的相同基序使得靶向 RISC复合物的反义链，同时抑制有义链的并入。在该模型中，每条链可以独立地被修饰以使得增强其特定的作用。反义链可以在5'末端进行修饰以增强在RISC的一个区的作用，而3'末端可以进行不同修饰以增强在RISC的不同区域的作用。
双链寡核苷酸分子可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸分子可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链并且另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；诸如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；反义链包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列(例如，双链寡核苷酸分子的约15至约25个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补)。或者，双链寡核苷酸由单一寡核苷酸组装，其中siRNA的自身互补的有义和反义区借助于基于核酸或不基于核酸的连接基连接。
双链寡核苷酸可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸可以是具有两个或更多个环结构以及茎的环形单链多核苷酸，所述主干包含自身互补的有义和反义区，其中反义区包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列，并且其中环形多核苷酸可以在体内或体外处理产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。
在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含分开的有义和反义序列或区，其中有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接基共价连接，或者可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德华相互作用、疏水性相互作用和/或堆积相互作用非共价连接。在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链寡核苷酸以引起靶基因表达抑制的方式来与靶基因的核苷酸序列相互作用。
如本文所用，双链寡核苷酸无需限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸分子缺乏含有2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不要求分子内存在核糖核苷酸来支持RNAi的这类双链寡核苷酸可以具有连接的一个或多个连接基或其他连接或缔合的基团、部分或含有一个或多个具有2'-OH基团的核苷酸的链。任选地，双链寡核苷酸可以在约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置上包括核糖核苷酸。如本文所用，术语siRNA意思等同于用来描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。此外，如本文所用，术语RNAi意思等同于用来描述序列特异性RNA干扰，诸如转录后基因沉默、转录抑制或表观遗传的其他术语。例如，双链寡核苷酸可以以转录后水平和转录前水平二者用于表观遗传学沉默基因。在非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子表观遗传学调节基因表达可以由染色质结构的siRNA介导的修饰或甲基化模式以改变基因表达导致(参见例如，Verdel等,2004,Science,303,672-676；Pal-Bhadra等,2004,Science,303,669-672；Allshire,2002, Science,297,1818-1819；Volpe等,2002,Science,297,1833-1837； Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218以及Hall等,2002,Science, 297,2232-2237)。
可以设想本文提供的若干实施方案的化合物和组合物可以通过 dsRNA介导的基因沉默或RNAi机制靶向ANGPTL3，包括例如“发夹”或茎-环双链RNA效应分子，其中具有自身互补序列的单个RNA 链能够形成双链构型或包含两个单独的RNA链的双链体dsRNA效应分子。在各种实施方案中，dsRNA完全由核糖核苷酸组成或由核糖核苷酸和脱氧核苷酸的混合物(诸如例如通过2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377 所公开的RNA/DNA杂合体)组成。dsRNA或dsRNA效应分子可以是具有自身互补性的区的单个分子使得分子的一个区段中的核苷酸与分子的另一个区段中的核苷酸进行碱基配对。在各种实施方案中，由单个分子组成的dsRNA完全由核糖核苷酸组成或包括与脱氧核糖核苷酸的区互补的核糖核苷酸的区。或者，dsRNA可以包括具有彼此互补的区的两个不同的链。
在各种实施方案中，两条链完全由核糖核苷酸组成，一条链完全由核糖核苷酸组成并且一条链完全由脱氧核糖核苷酸组成，或者一条或两条链含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在某些实施方案中，互补的区彼此或与靶核酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、 98％或100％互补性。在某些实施方案中，以双链构型存在的dsRNA 的区包括至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 50、75、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸或者包括所有的cDNA中或由dsRNA表示的其他靶核酸序列中的核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA不含有任何单链区诸如单链区末端或者 dsRNA为发夹。在其他实施方案中，dsRNA具有一个或多个单链区或突出端。在某些实施方案中，RNA/DNA杂合体包括为反义链或区的DNA链或区(例如，与靶核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)以及为有义链或区的RNA链或区(例如，与靶核酸具有至少 70、80、90、95、98或100％互补性)，并且反之亦然。
在各种实施方案中，RNA/DNA杂合体是使用酶法或化学合成方法诸如本文所述的那些或在2000年4月19日提交的WO 00/63364 或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377所述的那些在体外制成的。在其他实施方案中，体外所合成的DNA链在其转化进入细胞之前、之后或同时与体内或体外所制成的RNA链复合。在其他实施方案中，dsRNA为含有有义和反义区的单环核酸，或者dsRNA包括环状核酸和第二个环状核酸或线性核酸(参见，例如2000年4月19 日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377)。示例性环状核酸包括套索结构，其中核苷酸的游离5' 磷酰基以环回方式连接到另一个核苷酸的2'羟基。
在其他实施方案中，dsRNA包括其中糖的2'位含有卤素(诸如氟基)或者含有烷氧基(诸如甲氧基)的一个或多个修饰的核苷酸，其相比于其中相应的2'位含有氢或羟基的相应的dsRNA增加了体外或体内 dsRNA的半衰期。在其他实施方案中，dsRNA包括相邻核苷酸之间的一个或多个键而非自然存在的磷酸二酯键联。此类键联的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯以及二硫代磷酸酯键联。dsRNAs还可以是如美国专利号6,673,661中所教导的化学修饰地核酸分子。在其他实施方案中，dsRNA含有一个或两个加帽链，如例如由2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号 60/130,377所公开的。
在其他实施方案中，dsRNA可以是任何WO 00/63364中所公开的至少部分dsRNA分子，以及任何美国临时申请60/399,998以及美国临时申请60/419,532和PCT/US2003/033466中所述的dsRNA分子，所述申请的教义以引用的方式并入本文。任何dsRNA可使用本文所述的方法或标准方法诸如WO 00/63364中所述的那些在体外或体内进行表达。
占位
在某些实施方案中，预期反义化合物或靶核酸不通过RNA酶H 导致裂解或者通过RISC途径导致裂解或螯合。在某些此类实施方案中，反义活性可以由占位产生，其中杂交反义化合物的存在破坏了靶核酸的活性。在某些此类实施方案中，反义化合物可以是统一修饰的或者可以包含修饰的混合和/或包含修饰的和未修饰的核苷酸。
靶核酸、靶区及核苷酸序列
编码ANGPTL3的核苷酸序列包括不限于以下：GenBanK登录号NM_014495.2(以SEQID NO:1形式并入本文)或GenBanK登录号 NT_032977.9的核苷酸33032001至33046000(以SEQ ID NO:2形式并入本文)中所列的人类序列。应了解，本文中所含的实施例中的每个SEQ ID NO中所列的序列与糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。因而，由SEQ IDNO定义的反义化合物可独立地包含对糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)所述的反义化合物指示核碱基序列与基序的组合。
在某些实施方案中，靶区为靶核酸的结构明确的区。例如，靶区可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合区、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其他所定义的核酸区。关于 ANGPTL3的结构明确的区可通过登录号从序列数据库如NCBI获得并且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区可涵盖从靶区内一个靶区段的5’靶位点到所述靶区内另一靶区段的3’靶位点的序列。
在一些实施方案中，“靶区段”是核酸内的靶区的较小子部分。例如，靶区段可为一个或多个反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”或“5’起始位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”或“3’终止位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的靶区段。在某些实施方案中，所需作用为mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所需作用为由靶核酸编码的蛋白质水平的降低或与靶核酸有关的表型改变。
靶区可含有一个或多个靶区段。靶区内的多个靶区段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上一定数目的核苷酸，所述数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上的至多或至多约5 个核苷酸。在某些实施方案中，靶区段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5'靶位点或3'靶位点中的任一个的起始核酸的范围所界定的靶区。
适合的靶区段可见于5'UTR、编码区、3'UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合区内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也为适合的靶区段。适合的靶区段可尤其排除某一结构明确的区，如起始密码子或终止密码子。
确定适合的靶区段可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列相比较。举例来说，可使用BLAST算法来鉴别不同核酸当中具相似性的区。这个比较可防止选择可能以非特异性方式与除所选靶核酸以外的序列(即非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性靶区内的活性(例如，如由靶核酸水平的降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，ANGPTL3 mRNA水平的降低指示对ANGPTL3蛋白质表达的抑制。ANGPTL3蛋白质水平的降低也指示对靶mRNA表达的抑制。此外，表型变化诸如胆固醇、 LDL、甘油三酯或葡萄糖水平的降低可以指示ANGPTL3 mRNA和/ 或蛋白质表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与ANGPTL3核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键合)。
杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法法在本领域中为熟知的(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第 3版,2001)。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与 ANGPTL3核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如ANGPTL3核酸) 的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
反义化合物可在ANGPTL3核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与 ANGPTL3核酸、靶区、靶区段或其指定部分具有或具有至少70％、 75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与SEQ ID NOs:1-2的一个或多个序列具有或具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％互补性。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。
举例来说，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与靶区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实施例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因而，长度为18个核碱基并具有4(四)个非互补核碱基且所述非互补核碱基由与靶核酸完全互补的两个区侧接的反义化合物与靶核酸将具有77.8％的总体互补性且因而处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具(basic local alignment search tool))和PowerBLAST程序来测定(Altschul等，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997, 7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用 Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与 ANGPTL3核酸或其靶区或靶区段或靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基皆能够与靶核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可对于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。举例来说，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在靶序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与靶序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与靶序列可以完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5'端或3'端处。或者，一个或多个非互补核碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，长度为或为多达10个、12个、13个、14 个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如ANGPTL3核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，长度为或为多达10个、12个、13个、14 个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23 个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如ANGPTL3核酸)或其指定部分包含至多6 个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
本文提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指靶核酸的区或区段内确定数目的连续 (即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少 10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中具有至少8 个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、 18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围) 核碱基的部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分的序列具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一碱基的化合物。非同一碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸靶的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质 (例如像细胞吸收增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键及不含磷键的方法为熟知的。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，核苷间键联以有缺口的基序布置。在所述实施方案中，两个翼区的每一个中的核苷间键联不同于缺口区中的核苷间键联。在某些实施方案中，翼中的核苷间键联为磷酸二酯并且缺口中的核苷间键联为硫代磷酸酯。核苷基序被独立地选择，使得具有有缺口的核苷间键联基序的所述寡核苷酸可以具有或可不具有有缺口的核苷基序并且如果它具有有缺口的核苷基序，那么翼和缺口长度可以相同或可不同。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个甲基膦酸酯键联。在某些实施方案中，具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸包含包括除一个或两个甲基膦酸酯键联之外所有的硫代磷酸酯键联的键联基序。在某些实施方案中，一个甲基膦酸酯键联位于具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联的数量以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联的数量和位置与磷酸二酯核苷间键联的数量和位置以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量。在某些实施方案中，在可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时还能保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，在减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，在增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。
修饰的糖部分
本发明的反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、 R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基)置换；及其组合。化学上修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其他所公开的 5',2'-双取代的核苷，参见08年8月21日公开的PCT国际申请WO 2008/101157)或核糖基环氧原子被S置换且2'位上被进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请US2005-0130923)；或者 BNA的5'-取代(参见07年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'- 甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和 2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、 O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)以及 O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中Rl、Rm以及Rn各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个BNA 核苷，其中桥包含下式的一种：4'-(CH2)-O-2'(LNA)、4'-(CH2)-S-2'、 4'-(CH2)2-O-2'(ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(以及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)、 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(以及其类似物，参见2009年1月8日公布的以 WO 2009/006478公布的PCT/US2008/068922)、4'-CH2-N(OCH3)-2'(以及其类似物，参见2008年12月11日公布的以WO/2008/150729公布的PCT/US2008/064591)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的已公布的美国专利申请US2004-0171570)、4'-CH2-N(R)-O-2'(其中R为H、C1-C12烷基、或保护基)(参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Zhou等，J.Org.Chem., 2009,74,118-134)和4'-CH2-C(＝CH2)-2'(以及其类似物，参见2008年 12月8日公布的以WO2008/154401公布的PCT/US2008/066154)。
另外的双环核苷被报道在已公开的文献中(参见，例如：Srivastava 等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等,Chem.Biol.,2001,8,1-7； Orum等,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等,Tetrahedron,1998,54, 3607-3630；Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222； Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美国专利号：7,741,457； 7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461； 6,525,191；6,268,490；美国专利申请号：US2008-0039618； US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申请序列号： 61/097,787；61/026,995；和国际申请：WO 2009/006478；WO 2008/154401；WO 2008/150729；WO 2009/100320；WO 2011/017521；WO 2009/067647；WO 2010/036698；WO 2007/134181；WO 2005/021570；WO 2004/106356；WO99/14226。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO 99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。
本文所用的“4'-2'双环核苷”或“4'至2'双环核苷”是指包含含连接 2'碳原子与4'碳原子的桥的呋喃糖环的双环核苷。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'位与2'位之间具有至少一个桥的化合物，所述桥包括但不限于包含1个或1至4个独立地选自以下的连接基团的桥： -[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、 -O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、 3或4；Ra和Rb各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、 CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酸基(S(＝O)-J1)；并且
J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、 -[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、 4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4'-(CH2)-O-2'桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中 (Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括具有4'至2'桥联的那些，其中此类桥联包括但不限于α-L-4'-(CH2)-O-2'、β-D-4'-CH2-O-2'、 4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、4'-CH2-N(R)-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'和4'-(CH2)3-2'，其中 R为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001431
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、 -CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001432
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基。
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、 OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基且X为O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001441
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001442
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
qa、qb、qc以及qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的 C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001451
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、 NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、 N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe连同qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；
已描述了具有4'-CH2-O-2'桥联的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5- 甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶双环核苷的合成和制备连同其低聚化以及核酸识别性质(Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。双环核苷的合成也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
也已制备具有4'至2'桥连基团诸如4'-CH2-O-2'和4'-CH2-S-2'的各种双环核苷的类似物(Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8, 2219-2222)。包含双环核苷的作为核酸聚合酶底物的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的制备也已有所描述(Wengel等,WO 99/14226)。此外，2'- 氨基-BNA(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(Singh等,J.Org.Chem.,1998,63, 10035-10039)。另外，2'-氨基-BNA及2'-甲基氨基-BNA已被制备且它们与互补的RNA及DNA链的双螺旋体的热稳定性先前已有所报导。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0002559814380001461
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qi、qj、qk和ql各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、 NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、 N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷已有所描述(Frier等，Nucleic Acids Research,1997,25(22), 4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚化和生物化学研究也已有所描述 (Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲氧基 (4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’) BNA(也称为受限的乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA； (H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环 (4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA和(K)乙烯基BNA，如下文所描绘。
Figure BDA0002559814380001481
其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
本文所用的术语“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的六元四氢吡喃“糖”的核苷并且也可以称为糖替代物。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示的四氢呋喃环系统的氟HNA(F-HNA)的核苷。
Figure BDA0002559814380001482
在某些实施方案中，选择具有下式的糖替代物：
Figure BDA0002559814380001483
其中：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的 C2-C6炔基；并且
R1及R2中的一个为氢且另一个选自卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，且每个J1、J2及J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为氟并且R2为H；R1为甲氧基并且R2为H，以及R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报告(参见例如：Braasch等,Biochemistry,2002,41, 4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及 5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下式的糖替代物：
Figure BDA0002559814380001501
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代 (参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的 PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚化和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等,J. Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO 2010/036696，Robeyns等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984； Horváth等,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等,J. Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等,Nucleosides, Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等, Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等,Tetrahedron,2004, 60(9),2111-2123；Gu等,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang 等,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等,J.Org.Chem.,2001,66, 8478-82；Wang等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001, 20(4-7),785-788；Wang等,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO 06/047842以及已公布的PCT申请WO 01/049687；每项申请的内容以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。
Figure BDA0002559814380001511
其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8和q9各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其他糖取代基团。
许多其他单环、双环和三环的环系统为本领域中已知的并且适合作为可用来修饰用于并入本文所提供的低聚化合物中的核苷的糖替代物(参见，例如，综述文章：Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem., 2002,10,841-854)。可对所述环系统进行各种其他的取代以进一步增强活性。
本文所用的“2'-修饰的糖”意指在2'位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代及未取代的烷氧基、取代及未取代的硫烷基、取代及未取代的氨基烷基、取代及未取代的烷基、取代及未取代的烯丙基以及取代及未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、 O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'取代基还可选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、 SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、 NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进药物动力学性质的基团、或改进反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2'-MOE 侧链(Baker等,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。所述2'-MOE 取代已被描述为相较于未修饰的核苷及其他修饰的核苷(如2'-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)具有改善的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还被示为在体内使用中具有良好特征的基因表达的反义抑制剂(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24, 630-637；和Altmann等.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“2'-修饰的核苷”或“2'-取代的核苷”是指包含在2'位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2'碳与另一个碳的双环核苷，以及具有如以下的非桥连2'取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、 2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2'位上包含氟基的糖的核苷。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”、“2’-O-甲基”或“2’-甲氧基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.4,981,957、 5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、 5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、 5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,670,633、5,700,920、5,792,847以及6,600,032以及2005年6月2日提交的且2005年12 月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219，并且每篇所述专利以引用的方式整体并入本文。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸靶杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2'-MOE。在某些实施方案中，2'-MOE修饰的核苷酸排列于缺口聚物基序中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷布置在整个缺口聚物基序的翼中。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代与天然存在的或合成的未修饰核碱基在结构上不同，但在功能上是可以互换的。天然和修饰的核碱基能够参与氢键合。这样的核碱基修饰可赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，诸如，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对于增加反义化合物的靶核酸结合亲和力是特别有用的。例如，5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编, Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)。
额外修饰核碱基包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3) 尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8- 氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其是5-溴基、5-三氟甲基和其他5-位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
杂环碱基部分还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。尤其可用于提高反义化合物的结合亲和性的核碱基包括5-取代的嘧啶、 6-氮嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5- 丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的缩短或缺口加宽的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
用于配制药物组合物的组合物及方法
反义寡核苷酸可与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物及用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。
靶向ANGPTL3核酸的反义化合物可通过将反义化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)。PBS是适用于以肠胃外方式递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用包含靶向ANGPTL3核酸的反义化合物及药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为PBS。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖在动物(包括人)施用时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在反义化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义化合物的额外核苷。
缀合的反义化合物
反义化合物可共价连接至一个或多个增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的部分或缀合物。典型缀合物基团包括胆固醇部分及脂质部分。额外的缀合物基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及染料。
反义化合物还可被修饰以具有一个或多个稳定化基团，所述一个或多个稳定化基团一般连接至反义化合物的一端或两端以增强如核酸酶稳定性的性质。在稳定化基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免遭核酸外切酶降解，且可有助于递送和 /或定位于细胞内。帽可存在于5'端(5'帽)或3'端(3'帽)上，或可存在于这两端上。帽结构在本领域中为熟知的且包括例如反向脱氧无碱基帽。其他可用于对反义化合物的一端或两端进行封端以赋予核酸酶稳定性的3'及5'稳定化基团包括2003年1月16日公布的WO 03/004602 中所公开的那些基团。
在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380001561
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380001571
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380001572
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
Figure BDA0002559814380001581
本公开提供以下非限制性编号的实施方案：
Figure BDA0002559814380001582
其中：
T2为核苷、核苷酸、单体亚单位或低聚化合物。
在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。
i.某些可裂解部分
在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸。在某些所述实施方案中，可裂解部分直接连接至细胞靶向部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷或核苷类似物。在某些实施方案中，核苷或核苷类似物包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分为包含选自以下的任何保护的杂环碱基的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N- 苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧核苷，所述2'-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'- 脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯键联连接至接头。
在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的3'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的5'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的2'位。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。
在某些实施方案中，在将复合物施用至动物之后，仅在被靶细胞内化之后，可裂解部分才被裂解。在细胞内部，可裂解部分裂解，从而释放活性反义寡核苷酸。虽然不希望受理论的束缚，但是据信可裂解部分在细胞内被一种或多种核酸酶裂解。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶裂解可裂解部分与接头之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001601
其中Bx、Bx1、Bx2以及Bx3各自独立地为杂环碱基部分。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001611
i.某些接头
在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些所述实施方案中，接头共价结合至可裂解部分。在某些所述实施方案中，接头共价结合至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，接头共价结合至细胞靶向部分。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接并且还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体(tethered ligand)的位置。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体的位置并且不连接至支链基团。在某些实施方案中，接头还包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括接头。
在某些实施方案中，接头包括至少线性基团，所述线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-) 和羟氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，线性基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷连接基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，线性基团包括至少一个中性连接基团。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和可裂解部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分、固体载体和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括共价连接至支架基团的线性基团。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支架包括至少一个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支架包括至少两个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分和接头。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头、蛋白质结合部分和固体载体。在某些实施方案中，支架基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为脂质，例如像包括但不限于：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001631
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001641
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001651
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001661
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001671
Figure BDA0002559814380001681
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001682
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001691
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001701
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001702
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001703
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001704
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001705
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001706
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001711
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
ii.某些细胞靶向部分
在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。某些所述细胞靶向部分使反义化合物的细胞摄取增加。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链和一个或多个配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链、一个或多个配体以及一个或多个可裂解键。
1.某些支链基团
在某些实施方案中，缀合物基团包含靶向部分，所述靶向部分包含支链基团和至少两个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团连接缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团连接可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团连接反义寡核苷酸。在某些实施方案中，支链基团共价连接至接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支链基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支链基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001721
其中每个n独立地为1至20；
j为1至3；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001731
其中每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001732
Figure BDA0002559814380001741
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001742
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001743
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001751
其中A1为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001752
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001753
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001754
2.某些系链
在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至支链基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至连接基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
在某些实施方案中，系链包括一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。
在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团包含约13个原子的链长。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001771
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001772
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001773
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001781
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001782
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001783
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001784
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
在某些实施方案中，系链包含磷连接基团。在某些实施方案中，系链不包含任何酰胺键。在某些实施方案中，系链包含磷连接基团并且不包含任何酰胺键。
3.某些配体
在某些实施方案中，本公开提供了配体，其中每个配体共价连接至系链。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲和力的配体。在某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲和力的配体。在某些实施方案中，每个配体为碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含2至6个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配体。
在某些实施方案中，配体为碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、修饰的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，配体为氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液酸、α-D- 半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖 (GalNAc)、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3- 二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基 -D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O- 三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及 3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。
在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2- 脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，“N-乙酰基半乳糖胺”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，其包括β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖可以互换使用。因此，在其中描绘一种形式的结构中，这些结构也意图包括另一种形式。例如，在针对α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖示出结构时，该结构也意图包括另一种形式。在某些实施方案中，在某些优选的实施方案中，β形式2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖为优选的实施方案。
Figure BDA0002559814380001801
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
Figure BDA0002559814380001802
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
Figure BDA0002559814380001811
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001812
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001813
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001821
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001822
iii.某些缀合物
在某些实施方案中，缀合物基团包含以上结构特征。在某些所述实施方案中，缀合物基团包含以下结构：
Figure BDA0002559814380001823
其中每个n独立地为1至20。
在某些所述实施方案中，缀合物基团包含以下结构：
Figure BDA0002559814380001831
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001832
其中每个n独立地为1至20；
Z为H或连接的固体载体；
Q为反义化合物；
X为O或S；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001841
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001842
在某些所述实施方案中，缀合物基团包含以下结构：
Figure BDA0002559814380001843
在某些所述实施方案中，缀合物基团包含以下结构：
Figure BDA0002559814380001851
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001852
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001853
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001861
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001862
在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。
b.某些缀合反义化合物
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001871
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001872
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
在某些所述实施方案中，支链基团包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001881
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001891
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001892
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001901
其中
A为反义寡核苷酸；
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001902
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001911
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0002559814380001912
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
Figure BDA0002559814380001921
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、 US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、 WO 2013/033230和WO 2012/037254，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性出版物包括但不限于 BIESSEN等,"The CholesterolDerivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the HepaticAsialoglycoprotein Receptor:a Potent Cholesterol Lowering Agent"J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852、BIESSEN等,"Synthesis of Cluster Galactosides with HighAffinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1995) 38:1538-1546、LEE等,"New and more efficient multivalent glyco-ligands forasialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic&MedicinalChemistry(2011)19:2494-2500、RENSEN等, "Determination of the Upper Size Limitfor Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor onHepatocytes in Vitro and in Vivo"J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584、RENSEN等, "Design and Synthesis ofNovel N-Acetylgalactosamine-TerminatedGlycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic AsialoglycoproteinReceptor"J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808、 SLIEDREGT等,"Design and Synthesis ofNovel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomesto the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1999)42:609-618以及Valentijn等,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides withhigh affinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron,1997, 53(2),759-770，所述专利中的每一项均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，缀合反义化合物包含基于RNA酶H的寡核苷酸(如缺口聚物)或剪接调节寡核苷酸(如完全修饰的寡核苷酸)和包含至少一个、两个或三个GalNAc基团的任何缀合物基团。在某些实施方案中，缀合反义化合物包含见于任何以下参考文献中的任何缀合物基团：Lee,Carbohydr Res,1978,67,509-514；Connolly等，J Biol Chem,1982,257,939-945；Pavia等，Int J Pep Protein Res,1 983,22,539-548；Lee等，Biochem,1984,23,4255-4261；Lee等， Glycoconjugate J,1987,4,317-328；Toyokuni等，Tetrahedron Lett,1990,31,2673-2676；Biessen等，J Med Chem,1995,38,1538-154 6；Valentijn等，Tetrahedron,1997,53,759-770；Kim等，Tetrahedr on Lett,1997,38,3487-3490；Lee等，Bioconjug Chem,1997,8,7 62-765；Kato等，Glycobiol,2001,11,821-829；Rensen等，JBiol Chem,2001,276,37577-37584；Lee等，Methods Enzymol,2003,3 62,38-43；Westerlind等，Glycoconj J,2004,21,227-241；Lee等， Bioorg Med Chem Lett,2006,16(19),5132-5135；Maierhofer等，B ioorg Med Chem,2007,15,7661-7676；Khorev等，Bioorg Med Ch em,2008,16,5216-5231；Lee等，Bioorg Med Chem,2011,19,24 94-2500；Kornilova等，Analyt Biochem,2012,425,43-46；Pujol等， Angew Chemie Int Ed Engl,2012,51,7445-7448；Biessen等，J M ed Chem,1995,38,1846-1852；Sliedregt等，J MedChem,1999,4 2,609-618；Rensen等，J Med Chem,2004,47,5798-5808；Rense n等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26,169-175；van Rosse nberg等，Gene Ther,2004,11,457-464；Sato等，J Am Chem Soc, 2004,126,14013-14022；Lee等，J Org Chem,2012,77,7564-75 71；Biessen等，FASEB J,2000,14,1784-1792；Rajur等，Bioconj ugChem,1997,8,935-940；Duff等，Methods Enzymol,2000,313, 297-321；Maier等，Bioconjug Chem,2003,14,18-29；Jayaprakas h等，Org Lett,2010,12,5410-5413；Manoharan,Antisense Nuclei c Acid Drug Dev,2002,12,103-128；Merwin等，BioconjugChem, 1994,5,612-620；Tomiya等，Bioorg Med Chem,2013,21,5275- 5281；国际申请WO1998/013381；WO2011/038356；WO1997/04609 8；WO2008/098788；WO2004/101619；WO2012/037254；WO2011/1 20053；WO2011/100131；WO2011/163121；WO2012/177947；WO2013/033230；WO2013/075035；WO2012/083185；WO2012/083046；W O2009/082607；WO2009/134487；WO2010/144740；WO2010/148013； WO1997/020563；WO2010/088537；WO2002/043771；WO2010/1297 09；WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；WO2012/089602；WO2013/166121；WO2 013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177； 5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744； 8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548； 8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；已公布的美国专利申请公布US2011/0097264；US2011/0097265；US 2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；US2008/028104 4；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2 012/0136042；US2012/0165393；US2008/0281041；US2009/0203135； US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；US2012/0128 760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US201 3/0121954；US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；U S2003/0077829；US2008/0108801以及US2009/0203132；所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入。
细胞培养及反义化合物处理
可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对ANGPTL3核酸的水平、活性或表达的作用。用于所述分析的细胞类型可获自商业供货商(例如American Type CultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc., Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD) 且根据供货商的说明书使用商购的试剂(例如Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)培养细胞。例示性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞、Huh7(肝细胞癌)细胞、原代肝细胞、A549 细胞、GM04281成纤维细胞和LLC-MK2细胞。
体外测试反义寡核苷酸
本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
通常，可当细胞在培养中达到约60-80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。
一种常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂
Figure BDA0002559814380001963
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与
Figure BDA0002559814380001961
在
Figure BDA0002559814380001962
1(Invitrogen,Carlsbad, CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的
Figure BDA0002559814380001967
浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括 LIPOFECTAMINE
Figure BDA0002559814380001966
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE
Figure BDA0002559814380001964
在
Figure BDA0002559814380001965
1血清减少型培养基 (Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的
Figure BDA0002559814380001968
浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括
Figure BDA0002559814380001969
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与
Figure BDA00025598143800019611
在
Figure BDA00025598143800019610
1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至 12ug/mL范围内的
Figure BDA00025598143800019612
浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括 OligofectamineTM(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与OligofectamineTM在Opti-MEMTM-1血清减少型培养基 (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中混合以达成寡核苷酸的所需浓度，其中OligofectamineTM与寡核苷酸的比率为每100nM约 0.2至0.8μL。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括 FuGENE 6(RocheDiagnostics Corp.,Indianapolis,IN)。将反义低聚化合物与FuGENE 6在1mL无血清的RPMI中混合以达成寡核苷酸的所需浓度，其中FuGENE 6与低聚化合物的比率是每100nM为1至 4μL的FuGENE 6。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔(Sambrook和Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版, 2001)。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。通常可在反义寡核苷酸处理后16至24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说， 当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。
所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的。当用 LIPOFECTAMINE
Figure BDA0002559814380001971
Lipofectin或Cytofectin转染时，通常使用浓度在1 nM至300 nM范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625 nM至20,000 nM范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的(Sambrook和Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版, 2001)。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用
Figure BDA0002559814380001972
试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)，根据制造商推荐的方案来制备。
分析对靶水平或表达的抑制
对ANGPTL3核酸的水平或表达的抑制可以本领域中已知的多种方式来测定(Sambrook和Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版, 2001)。举例来说，靶核酸水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR 可以使用可从PE-Applied Biosystems(FosterCity, CA)商购，并根据制造商说明书来使用的市售ABI
Figure BDA0002559814380001981
7600、7700或7900序列检测系统来方便地完成。
对靶RNA水平的定量实时PCR分析
可通过定量实时PCR，使用ABI
Figure BDA0002559814380001982
7600、7700或7900 序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商说明书来对靶RNA水平进行定量。定量实时PCR的方法在本领域中为熟知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)，其接着用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中依序进行RT及实时PCR反应。RT及实时PCR试剂可获自 Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT和实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量可使用表达恒定的基因(如亲环素A(cyclophilin A)或GADPH)的表达水平或通过使用
Figure BDA0002559814380001983
(LifeTechnologiesTM,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来标准化。亲环素A或GADPH表达可通过实时PCR，通过与靶同时操作、复合操作或分开操作来定量。总RNA可以使用
Figure BDA0002559814380001987
RNA定量试剂来定量。通过
Figure BDA0002559814380001985
定量RNA的方法教导于 Jones,L.J.等(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中。使用
Figure BDA0002559814380001984
4000仪器(PEApplied Biosystems)来测量
Figure BDA0002559814380001986
荧光。
用于设计实时PCR探针及引物的方法在本领域中为熟知的，且可包括使用软件，如PRIMER
Figure BDA0002559814380001988
软件(Applied Biosystems, Foster City,CA)。实时PCR使用的探针及引物被设计成与ANGPTL3 特异性序列杂交，并且公开在下面实施例中。靶特异性PCR探针可以具有共价连接到5'端的FAM和共价连接到3'端的TAMRA或MGB，其中FAM是荧光染料并且TAMRA或MGB是淬灭剂染料。
分析蛋白质水平
对ANGPTL3核酸的反义抑制可通过测量ANGPTL3蛋白质水平来评估。ANGPTL3的蛋白质水平可以本领域中熟知的多种方式来评价或定量，如免疫沉淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如卡斯蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法 (FACS)(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版,2001)。针对靶的抗体可被鉴别且获自多种来源，如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可经由本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。
体内测试反义化合物
在动物体内测试反义化合物(例如反义寡核苷酸)以评估它们抑制 ANGPTL3表达及引起表型改变的能力。可在正常动物或实验疾病模型中进行测试。为了向动物施用，在药学上可接受的稀释剂(如磷酸盐缓冲的生理盐水)中配制反义寡核苷酸。施用包括肠胃外施用途径。在用反义寡核苷酸处理一段时间后，自肝脏组织分离RNA且测量ANGPTL3核酸表达的改变。还测量ANGPTL3蛋白质水平的改变。
某些适应症
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的方法，其包括施用本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体具有代谢疾病和/或心血管疾病。在某些实施方案中，个体具有混合型高脂血症(例如家族性的或非家族性的)、高胆固醇血症(例如家族性纯合的高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合的高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、脂肪代谢障碍、高甘油三酯血症(例如杂合的LPL缺乏、纯合的LPL缺乏)、冠状动脉疾病(CAD)、家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、高脂蛋白血症IV型)、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病、伴血脂异常的2型糖尿病)、胰岛素抵抗(例如伴血脂异常的胰岛素抵抗)、血管壁增厚、高血压(例如肺动脉高血压)、硬化症(例如，动脉粥样硬化、系统性硬化症、进行性皮肤硬化症和增殖性闭塞性血管病变诸如指溃疡和肺血管受累)或其组合。
在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物在动物中调节脂质和/或能量代谢。在某些实施方案中，本文所述的靶向 ANGPTL3的化合物调节高胆固醇血症、血脂异常、脂肪代谢障碍、高甘油三酯血症、代谢综合征、NAFLD、NASH和/或糖尿病的生理标志物或表型。例如，向动物施用所述化合物可以调节VLDL、非酯化脂肪酸(NEFA)、LDL、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、胰岛素或 ANGPTL3水平中的一个或多个。在某些实施方案中，生理标志物或表型的调节可与化合物对ANGPTL3的抑制相关。
在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物降低和 /或防止下列中的一种或多种：肝TG积累(即肝脏脂肪变性)、血管壁增厚(例如动脉内膜中层增厚)、混合型高脂血症(例如家族性或非家族性)、高胆固醇血症(例如例如家族性纯合的高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合的高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、脂肪代谢障碍、高甘油三酯血症(例如杂合的LPL缺乏、纯合的LPL缺乏、家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、高脂蛋白血症IV型)、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病、伴血脂异常的2型糖尿病)、胰岛素抵抗(例如伴血脂异常的胰岛素抵抗)、高血压和硬化症或其任意组合。在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物改善胰岛素敏感性。
在某些实施方案中，施用靶向ANGPTL3核酸的反义化合物导致 ANGPTL3的表达减少约至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％，或由这些值中的任何两个所界定的范围。
在某些实施方案中，包含靶向ANGPTL3的反义化合物的药物组合物被用于制备用于治疗患有或容易患有代谢疾病或心血管疾病的患者的药物。在某些实施方案中，包含靶向ANGPTL3的反义化合物的药物组合物被用于制备用于治疗患有或容易患有下列中的一种或多种疾病的患者的药物：混合型高脂血症(例如家族性或非家族性)、高胆固醇血症(例如家族性纯合的高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合的高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、脂肪代谢障碍、高甘油三酯血症(例如家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、高脂蛋白血症IV型)、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎 (NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病、伴血脂异常的2型糖尿病)、胰岛素抵抗(例如伴血脂异常的胰岛素抵抗)、血管壁增厚、高血压和硬化症或其组合。
施用
在某些实施方案中，本文所述的化合物或组合物以肠胃外方式施用。
在某些实施方案中，肠胃外施用是通过输注施用。输注可以是慢性的或连续的或短期的或间歇的。在某些实施方案中，通过泵递送输注的药物试剂。
在某些实施方案中，肠胃外施用是通过注射施用。可以通过注射器或泵递送注射液。在某些实施方案中，所述注射为弹丸注射(bolus injection)。在某些实施方案中，注射液直接施用到组织或器官。在某些实施方案中，所述注射为皮下注射。
某些组合疗法
在某些实施方案中，包含本文所公开的修饰寡核苷酸的第一药剂与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施方案中，这样的第二药剂可被设计成用于治疗与本文所述第一药剂相同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，这样的第二药剂可被设计成用于治疗与本文所述第一药剂不同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，第二药剂可被设计成用于治疗本文所述的一种或多种药物组合物的不期望的副作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以治疗第一药剂的不期望的作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生组合效果。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生协同效果。
在某些实施方案中，第一药剂与一种或多种第二药剂同时施用。在某些实施方案中，第一药剂与一种或多种第二药剂不同时施用。在某些实施方案中，第一药剂与一种或多种第二药剂一起制备成单个药物制剂。在某些实施方案中，第一药剂与一种或多种第二药剂分开制备。
在某些实施方案中，第二药剂包括但不限于降血糖剂或降脂质剂。降血糖剂可以包括但不限于治疗性生活方式改变、PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促分泌剂、SGLT2抑制剂、人胰淀素类似物、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。降血糖剂可以包括但不限于二甲双胍、磺酰脲类、罗格列酮、氯茴苯酸类、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。磺酰脲可为醋磺己脲(acetohexamide)、氯磺丙脲 (chlorpropamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)或格列齐特(gliclazide)。氯茴苯酸类可为那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈 (repaglinide)。噻唑烷二酮可以为吡格列酮(pioglitazone)或罗格列酮。α-葡萄糖苷酶可以是阿卡波糖(acarbose)或米格列醇(miglitol)。在某些实施方案中，降脂质疗法可以包括但不限于治疗性生活方式改变、 HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、MTP抑制剂(例如，靶向MTP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、贝特类、PCSK9 抑制剂(例如，靶向PCSK9的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、 CETP抑制剂(例如，靶向CETP的小分子例如托塞曲匹(Torcetrapib) 和安塞曲匹(anacetrapib)、多肽、抗体或反义化合物)、apoC-III抑制剂(例如，靶向apoC-III的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、apoB 抑制剂(例如，靶向aPOB的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、富含ω-3脂肪酸的有利的油、ω-3脂肪酸或其任意组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可以是阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和类似物。胆固醇吸收抑制剂可以是依折麦布。贝特类可以是非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、吉非贝齐和类似物。富含ω-3脂肪酸的有利的油可以是磷虾油、鱼油(例如 VascepaR)、亚麻籽油和类似物。ω-3脂肪酸可以是ALA、DHA、EPA 和类似物。
某些化合物
靶向人类ANGPTL3的反义寡核苷酸描述在早期的出版物中(参见2011年7月14日公布的PCT专利公布号WO 2011/085271，以引用的方式整体并入本文)。本文所述的包括十大体外最有效的反义化合物的若干寡核苷酸(233676、233690、233710、233717、233721,233722、337459、337460、337474、337477、337478、337479、337481、 337484、337487、337488、337490、337491、337492、337497、337498、 337503、337505、337506、337508、337513、337514、337516、337520、 337521、337525、337526和337528)在整个选择对下文和美国序列号 61/920,652中描述的反义化合物的体外筛选中被用作基准。发现在 WO 2011/085271中描述的最有效的化合物之中，ISIS 233722的抑制 ANGPTL3的能力是高度可变的。因此，虽然最初233722被包括在一些体外研究中，但是没有被选作进一步研究的基准。在先前体外鉴别的有效基准化合物之中，五种(233710、233717、337477、337478、 337479和337487)被选择用于在huANGPTL3转基因小鼠中进行如下文所述的体内测试，以评估在降低人mRNA转录物和蛋白表达方面最有效者(实施例126)。具有最高的降低ANGPTL3水平的最初体内效力的反义寡核苷酸(233710)被用作下文描述的新反义化合物的体内评估的基准。
在某些实施方案中，本文描述的反义化合物从相对于在WO 2011/085271和美国序列号61/920,652中描述的反义化合物的一种或多种改进的性质中受益。这些改进的性质在本文的实施例中得到了证明，并且为了便于参考，在下面提供了实施例的非详尽总结。
在本文所述的第一筛选中，在Hep3B细胞中测试了约3000种新设计的靶向人ANGPTL3的5-10-5MOE缺口聚物的反义化合物在体外对人ANGPTL3 mRNA的作用(实施例116)。新反义化合物的mRNA 抑制水平通过使用一些先前设计的反义化合物(233717、337484、 337487、337492和337516)作为基准在选择研究中进行评估。从所述第一筛选中的约3000种新设计的反义化合物之中，选择大约85种反义化合物用于体外的剂量依赖性抑制研究，以确定它们的半数最大抑制浓度(IC50)(实施例117-118)。从测试半数最大抑制浓度(IC50)的约85 种新反义化合物之中，选择约38种展示有效的剂量依赖性ANGPTL3 降低的反义化合物，以反义化合物233710作为基准在小鼠中测试体内效力和耐受性(ALT和AST)(实施例126-127)。
在本文所述的第二筛选中，在Hep3B细胞中测试了约2000种新设计的靶向人ANGPTL3的具有MOE缺口聚物基序或混合基序(脱氧的5-10-5MOE和cET缺口聚物)的反义化合物在体外对人ANGPTL3 mRNA的作用(实施例119-121)。新反义化合物的抑制水平通过使用一些先前设计的反义化合物(233717、337487、337513、337514和 337516)作为基准在选择研究中进行评估。从所述第二筛选中的约 2000种新设计的反义化合物之中，选择大约147种反义化合物用于体外的剂量依赖性抑制研究，以确定它们的半数最大抑制浓度(IC50)(实施例122-125)。从测试半数最大抑制浓度(IC50)的约147种新反义化合物之中，选择约73种展示有效的剂量依赖性ANGPTL3降低的反义化合物，以反义化合物233710作为基准在小鼠中测试体内效力和耐受性(例如，ALT和AST)(实施例126-127)。
从第一和第二筛选中在小鼠中测试效力和耐受性的约111种反义化合物之中，选择24种，通过评估肝代谢标记(诸如丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白和胆红素)以及肾脏代谢标记 (BUN和肌酸酐)和器官重量在小鼠中测试更广泛的耐受性(实施例 127)。
与鼠体内研究平行，选择了17种反义化合物进行粘度测试(实施例128)。一般而言，粘度不佳的反义化合物不进行进一步的研究。
基于小鼠耐受性研究的结果，选择20种反义化合物在大鼠中测试体内耐受性(实施例129)。在大鼠中，测量肝脏代谢标记物如ALT、 AST、白蛋白和胆红素，体重和器官重量，以及肾脏代谢标记物如 BUN、肌酸酐和总蛋白/肌酸酐比，以确定化合物在体内的耐受性。
还评估了在大鼠中测试的20种反义化合物对于恒河猴 ANGPTL3基因序列的交叉反应性(实施例130)。尽管本研究中的反义化合物是在食蟹猴中测试，但食蟹猴ANGPTL3序列无法用于与全长化合物的序列比较，因此，将反义化合物的序列与密切相关的恒河猴的序列进行比较。发现8种反义化合物的序列与恒河猴ANGPTL3基因序列有0-2个错配，并且在食蟹猴中进一步研究(实施例130)。在猴中测试了8种反义化合物(ISIS 563580、ISIS560400、ISIS 567320、 ISIS 567321、ISIS 544199、ISIS 567233、ISIS 561011和ISIS559277) 对于ANGPTL3 mRNA和蛋白质表达的抑制以及耐受性。在耐受性研究中，测试体重、肝脏代谢标记(ALT、AST和胆红素)、肾脏代谢标记(BUN和肌酸酐)、血液学参数(血细胞计数、血红蛋白和红细胞压积)和促炎性标志物(CRP和C3)。此外，测量全长寡核苷酸存在于肝脏和肾脏中的浓度，并且计算全长寡核苷酸在肝脏/肾脏中的比值。
在食蟹猴中被评估为有效的和耐受的反义化合物ISIS 563580的序列进一步用GalNAc缀合物和/或主链上的化学变化进行修饰，如实施例113-115和131所示，并且评价增加的效力。
因此，本文提供了具有任何一种或多种改进的特性的反义化合物，例如，相对于WO2011/085271和美国序列号61/920,652中描述的反义化合物改进的特性。在某些实施方案中，本文提供了包含如本文所述的靶向SEQ ID NOs:1-2中任一个的核碱基区或可与其特异性杂交的修饰寡核苷酸的反义化合物。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于它们抑制 ANGPTL3表达的效力而有效。在某些实施方案中，化合物或组合物抑制ANGPTL3至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物在人类细胞 (例如Hep3B细胞系)中测试时，由于体外IC50小于20μM、小于10 μM、小于8μM、小于5μM、小于2μM、小于1μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM或小于0.5μM而有效(如实施例117-118和122-125中所述)。在某些实施方案中，IC50<1.0μM 的优选反义化合物包括SEQ ID NO：15、20、24、34、35、36、37、 42、43、44、47、50、51、57、58、60、77、79、82、87、88、90、 91、93、94、100、101、104、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、 154、155、156、157、158、169、170、177、188、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、 224、225、226、227、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，IC50<0.9μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO：15、20、35、36、42、43、44、50、57、60、77、79、87、88、90、91、93、94、 101、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、 134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、177、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、 231和232。在某些实施方案中，IC50<0.8μM的优选反义化合物包括 SEQ ID NO：15、20、35、36、42、43、44、50、57、60、77、79、 87、88、90、91、93、94、101、104、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、 154、155、156、157、158、177、209、210、211、212、213、214、 215、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、229、 230、231和232。在某些实施方案中，IC50<0.7μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO：15、20、36、42、43、57、60、114、117、127、 131、177、209、210、211、212、213、214、215、217、218、219、 220、221、222、223、224、225、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，IC50<0.6μM的优选反义化合物包括SEQ IDNO：15、 20、36、42、43、57、60、114、117、127、131、177、209、210、 211、212、213、215、217、218、219、220、221、222、224、225、 228、229、230、231和232。在某些实施方案中，IC50<0.5μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO：43、114、117、127、131、177、209、 210、211、212、215、217、218、219、220、221、222、229、230 和232。
在某些实施方案中，在通过测定测量时(如实施例128中所述)，如本文所述的某些反义化合物由于小于40cP、小于35cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP、小于15cP或小于10cP的粘度而有效。具有大于40cP的粘度的寡核苷酸小于最佳的粘度。在某些实施方案中，粘度<20cP的优选反义化合物包括SEQ ID NO：16、18、20、34、 35、36、38、49、77、90、93和94。在某些实施方案中，粘度<15cP 的优选反义化合物包括SEQ ID NO：16、18、20、34、35、38、49、90、93和94。在某些实施方案中，粘度<10cP的优选反义化合物包括SEQ ID NO：18、34、35、49、90、93和94。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物具有高度可耐受性，如通过实施例中描述的体内耐受性测量所表明。在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物具有高度可耐受性，如通过具有不超过盐水处理的动物3倍、2倍或1.5倍的ALT和/或AST值的增加所表明。
在某些实施方案中，如本文所述的某些反义化合物由于具有大于 50％的抑制效力、小于1μM的体外IC50、小于20cP的粘度和不超过3倍的ALT和/或AST的增加中的一个或多个而有效。
在某些实施方案中，优选ISIS 563580(SEQ ID NO:77)。此化合物被发现是ANGPTL3转基因小鼠中的有效的抑制剂和最耐受的反义化合物。它在体外具有可接受的约16.83cP的粘度和<0.8μM的IC50值。在小鼠中它的ALT和/或AST水平的增加不超过盐水处理的动物 3倍。另外，在猴中，它是抑制ANGPTL3最耐受的和有效的化合物之一，并且具有全长寡核苷酸浓度的最佳比率。
在某些实施方案中，优选ISIS 544199(SEQ ID NO:20)。此化合物被发现是有效的和耐受的反义化合物。它在体外具有可接受的1.7 cP的粘度和<0.5μM的IC50值。在小鼠中它的ALT和/或AST水平的增加不超过盐水处理的动物3倍。另外，在猴中，它是抑制ANGPTL3 最有效的化合物之一，并且具有全长寡核苷酸浓度的良好比率。
在某些实施方案中，优选ISIS 559277(SEQ ID NO:110)。此化合物被发现是有效的和耐受的反义化合物。它在体外具有<0.8μM的 IC50值。在小鼠中它的ALT和/或AST水平的增加不超过盐水处理的动物3倍。另外，在猴中，它是抑制ANGPTL3最有效的化合物之一，并且具有全长寡核苷酸浓度的良好比率。
在某些实施方案中，优选GalNAc缀合的反义化合物ISIS 658501 (SEQ ID NO:4912)。此反义化合物被发现比其母体化合物ISIS 563580 (SEQ ID NO:77)更有效，如抑制水平所示。
在某些实施方案中，优选GalNAc缀合的反义化合物ISIS 703801 (SEQ ID NO:77)。此反义化合物被发现比其母体化合物ISIS 563580 (SEQ ID NO:77)更有效若干倍。ISIS 703801的ID50值为1，而ISIS 563580的ID50值为6。
在某些实施方案中，优选GalNAc缀合的反义化合物ISIS 703802 (SEQ ID NO:77)。此反义化合物被发现比其母体化合物ISIS 563580 (SEQ ID NO:77)更有效若干倍。ISIS 703802的ID50值为0.3，而ISIS 563580的ID50值为6。
实施例
以下实施例说明了本公开的某些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供具体实施方案时，发明人已预期了那些具体实施方案的一般应用。例如，具有具体基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理支持。并且，例如，在特别高亲和力的修饰出现在具体位置上时，相同位置上的其他高亲和力修饰也认为是合适的，除非另外指出。
实施例1：用于制备亚磷酰胺化合物1、1a和2的一般方法
Figure BDA0002559814380002091
根据如本文说明书所述的本领域已知的程序制备化合物1、1a和 2(参见Seth等,Bioorg.Med.Chem.,2011,21(4),1122-1125,J. Org.Chem.,2010,75(5),1569-1581,Nucleic Acids Symposium Series, 2008,52(1),553-554)；并且还参见已公布的PCT国际申请(WO 2011/115818、WO 2010/077578、WO2010/036698、WO2009/143369、 WO 2009/006478以及WO 2007/090071)和美国专利7,569,686)。
实施例2：制备化合物7
Figure BDA0002559814380002101
化合物3(2-乙酰氨基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D吡喃半乳糖或半乳糖胺五乙酸酯)为商业上可获得的。根据公布的工序制备化合物5(Weber等，J.Med.Chem.,1991,34,2692)。
实施例3：制备化合物11
Figure BDA0002559814380002102
化合物8和9为商业上可获得的。
实施例4：制备化合物18
Figure BDA0002559814380002111
根据实施例3中说明的工序制备化合物11。化合物14为商业上可获得的。使用由Rensen等，J.Med.Chem.,2004,47,5798-5808所报道的类似工序制备化合物17。
实施例5：制备化合物23
Figure BDA0002559814380002112
化合物19和21为商业上可获得的。
实施例6：制备化合物24
Figure BDA0002559814380002121
根据实施例4和5中说明的工序制备化合物18和23。
实施例7：制备化合物25
Figure BDA0002559814380002131
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例8：制备化合物26
Figure BDA0002559814380002132
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例9：在3’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物29的一般制备
Figure BDA0002559814380002141
Figure BDA0002559814380002151
其中受保护的GalNAc3-1具有以下结构：
Figure BDA0002559814380002152
缀合物基团GalNAc3-1的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-1a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-1a具有式：
Figure BDA0002559814380002161
根据实施例7中说明的工序制备固体载体结合的受保护的 GalNAc3-1，即化合物25。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在3’末端包含GalNAc3-1的低聚化合物29(参见Dupouy等, Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例10：在5’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物34的一般制备
Figure BDA0002559814380002171
UnylinkerTM 30为商业上可获得的。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在5’末端包含GalNAc3-1聚簇的低聚化合物34(参见Dupouy等,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例 1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例11：制备化合物39
Figure BDA0002559814380002181
根据实施例2、4和5中说明的工序制备化合物4、13和23。使用公布于Rouchaud等,Eur.J.Org.Chem.,2011,12,2346-2353中的类似工序制备化合物35。
实施例12：制备化合物40
Figure BDA0002559814380002191
根据实施例11中说明的工序制备化合物38。
实施例13：制备化合物44
Figure BDA0002559814380002192
Figure BDA0002559814380002201
根据实施例5和11中说明的工序制备化合物23和36。使用公布于WO 2009082607中的类似工序制备化合物41。
实施例14：制备化合物45
Figure BDA0002559814380002211
根据实施例13中说明的工序制备化合物43。
实施例15：制备化合物47
Figure BDA0002559814380002212
化合物46为商业上可获得的。
实施例16：制备化合物53
Figure BDA0002559814380002221
化合物48和49为商业上可获得的。根据实施例4和15中说明的工序制备化合物17和47。
实施例17：制备化合物54
Figure BDA0002559814380002231
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例18：制备化合物55
Figure BDA0002559814380002241
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例19：用于通过固相技术制备在3’位包含GalNAc3-1的缀合ASO的一般方法(ISIS 647535、647536以及651900的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成仪(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscience
Figure BDA0002559814380002242
oligopilot合成仪(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的负载GalNAc3-1的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等， 2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体上的负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺缩合。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1 M溶液硫化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用三乙胺和乙腈的1:1(v/v)混合物将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。
然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，0-40％的B持续60min，流速14mL min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用 Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征 ASO。
使用本领域中熟知的标准寡核苷酸合成工序合成不包含缀合物的反义寡核苷酸。
使用这些方法，制备了靶向ApoC III的三种单独的反义化合物。如以下表17中所概述，靶向ApoC III的三种反义化合物中的每一种均具有相同的核碱基序列；ISIS 304801为具有所有硫代磷酸酯键联的5-10-5MOE缺口聚物；ISIS 647535与ISIS 304801相同，除了ISIS 647535具有缀合在其3’末端的GalNAc3-1；并且ISIS 647536与ISIS 647535相同，除了所述化合物的某些核苷间键联为磷酸二酯键联。如表17中进一步概述，合成了靶向SRB-1的两种单独的反义化合物。 ISIS 440762为具有所有硫代磷酸酯核苷间键联的2-10-2cEt缺口聚物；ISIS 651900与ISIS 440762相同，除了ISIS 651900在其3’-末端包括GalNAc3-1。
表17
靶向ApoC III和SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380002261
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示 -O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”指示具有先前在实施例9中示出的结构的缀合物基团。应注意，GalNAc3-1包含将ASO连接至缀合物的剩余部分的可裂解腺苷，所述可裂解腺苷命名为“GalNAc3-1a”。这种命名法用于上表以显示整个核碱基序列，包括作为缀合物的一部分的腺苷。因此，在上表中，序列还可列为以“GalNAc3-1”结尾，其中省略“Ado”。在全部这些实施例中使用了这种惯例：使用下标“a”来指示缺乏可裂解核苷或可裂解部分的缀合物基团的部分。缺乏可裂解部分的缀合物基团的此部分在本文中是指“聚簇”或“缀合物聚簇”或“GalNAc3聚簇”。在某些情况下，通过单独提供其聚簇和其可裂解部分来方便地描述缀合物基团。
实施例20：huApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的剂量依赖性反义抑制
在剂量依赖性研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人 ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且以上描述的ISIS 304801 和ISIS 647535进行单独测试和评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
每周一次在0.08、0.25、0.75、2.25或6.75μmol/kg下用ISIS 304801 或647535或使用PBS作为对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。每个处理组由4只动物组成。在施用最后剂量之后的四十八小时，从每只小鼠中抽血并且将小鼠处死并收集组织。
ApoC III mRNA分析
使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380002271
RNA定量试剂(Molecular Probes, Inc.Eugene,OR)根据标准方案来测定小鼠肝脏中的ApoC III mRNA 水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的ApoC III mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的ApoC III mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。每个ASO的半数最大有效剂量(ED50)也呈现于以下表18 中。
如所说明的，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III RNA减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表18
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
Figure BDA0002559814380002281
ApoC III蛋白分析(浊度测定)
使用在2013年3月29日印刷之前在线公布的Graham等， Circulation Research所报道的工序确定血浆ApoC III蛋白分析。
在不稀释的情况下，使用Olympus临床分析仪和可商购获得的浊度ApoC III测定法(Kamiya,Cat#KAI-006,Kamiya Biomedical,Seattle, WA)对从小鼠分离的约100μl血浆进行分析。如供应商所述执行测定方案。
如以下表19中所示，相对于PBS对照，这两种反义化合物使 ApoC III蛋白减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801) 更有效。
表19
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
Figure BDA0002559814380002291
通过Bligh和Dyer(Bligh,E.G.和Dyer,W.J.Can.J. Biochem.Physiol.37:911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol, 37,911-917,1959)的方法提取血浆甘油三酯和胆固醇并且通过使用 Beckmann Coulter临床分析器和商业上可获得的试剂来测量。
相对于PBS注射的小鼠测量甘油三酯水平并且表示为“％PBS”。结果呈现于表20中。如所说明的，这两种反义化合物使甘油三酯水平降低。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表20
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
Figure BDA0002559814380002292
Figure BDA0002559814380002301
通过HPLC分析血浆样品来测定总胆固醇和不同级分的胆固醇 (HDL和LDL)的量。结果呈现于表21和22中。如所说明的，这两种反义化合物使总胆固醇水平降低；均使LDL降低；并且均使HDL升高。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。HDL水平增加和LDL水平降低为反义抑制ApoC III的心血管有益作用。
表21
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
Figure BDA0002559814380002302
表22
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
Figure BDA0002559814380002303
Figure BDA0002559814380002311
药物代谢动力学分析(PK)
还评价了ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏和肾样品。在MSD1上利用IP-HPLC-MS分析样品。测量全长ISIS 304801和 647535的组织水平(μg/g)并且结果提供于表23中。如所说明的，对于两种反义化合物，总全长反义化合物的肝脏浓度类似。因此，即使GalNAc3-1-缀合的反义化合物在肝脏中更具活性(如通过以上RNA和蛋白质数据所展示)，但它在肝脏中不以大致上更高的浓度存在。事实上，所计算的EC50(提供于表23中)证实了所观察到的缀合化合物的效力增加不能完全归因于积累增加。此结果表明缀合物不仅仅通过肝脏积累的机制，还可能通过改进细胞对反义化合物的产生性摄取来改进效力。
结果还显示GalNAc3-1缀合反义化合物在肾中的浓度低于缺乏 GalNAc缀合物的反义化合物的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此，对于非肾靶标，肾积累为不希望的。这些数据表明GalNAc3-1缀合使肾积累减少。
表23
转基因小鼠中ASO处理的PK分析
Figure BDA0002559814380002321
还鉴定了ISIS 647535的代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。以下示出所观察到的代谢物的裂解位点和结构。使用标准工序计算全长ASO的相对％并且结果呈现于表23a中。ISIS 647535 的主要代谢物为缺乏整个缀合物的全长ASO(即ISIS304801)，其由在以下示出的裂解位点A处裂解产生。此外，还观察到由其他裂解位点产生的另外代谢物。这些结果表明在GalNAc3-1糖与ASO之间引入其他可裂解键如酯、肽、二硫化物、氨基磷酸酯或酰基腙也可以是有用的，所述可裂解键可被细胞内部的酶裂解或所述可裂解键可在细胞液的还原性环境中裂解或所述可裂解键对内体和溶酶体内部的酸性pH不稳定。
表23a
所观察到的ISIS 647535的全长代谢物
Figure BDA0002559814380002322
Figure BDA0002559814380002331
Figure BDA0002559814380002332
Figure BDA0002559814380002341
实施例21：单一施用研究中人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的反义抑制
在单一施用研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人 ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且描述于表17中的ISIS 304801、647535和647536进行进一步评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
在以下示出的剂量下，用ISIS 304801、647535或647536(以上所述)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠一次。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III mRNA和蛋白质水平；血浆甘油三酯；以及胆固醇，包括如上所述(实施例20)评估的 HDL和LDL级分。来自那些分析的数据呈现于以下表24-28中。使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。ALT和AST 水平显示反义化合物在所有施用的剂量下为耐受良好的。
这些结果显示了与缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)相比，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 647535和647536)的效力的改进。此外，包含GalNAc3-1缀合物和一些磷酸二酯键联的ISIS 647536与ISIS 647535一样有效，所述ISIS 647535包含相同的缀合物并且ASO内的所有核苷间键联为硫代磷酸酯。
表24
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
Figure BDA0002559814380002351
Figure BDA0002559814380002361
表25
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
Figure BDA0002559814380002362
表26
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
Figure BDA0002559814380002363
Figure BDA0002559814380002371
表27
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
Figure BDA0002559814380002372
表28
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
Figure BDA0002559814380002373
Figure BDA0002559814380002381
这些结果证实GalNAc3-1缀合物改进了反义化合物的效力。结果还显示了其中反义寡核苷酸具有混合的键联的GalNAc3-1缀合反义化合物(具有六个磷酸二酯键联的ISIS647536)和相同反义化合物的全部硫代磷酸酯型式(ISIS 647535)的相等效力。
硫代磷酸酯键联为反义化合物提供若干性质。例如，它们抗核酸酶消化并且它们结合导致化合物在肝脏中积累而不是在肾/尿液中积累的蛋白质。这些为希望的性质，特别是当治疗肝脏中的适应症时。然而，硫代磷酸酯键联还与炎症性应答相关。因此，减少化合物中硫代磷酸酯键联的数目预期会减小炎症的风险，但是也降低化合物在肝脏中的浓度，增加在肾和尿液中的浓度，减小在核酸酶存在下的稳定性并且降低总体效力。本结果显示其中某些硫代磷酸酯键联已被磷酸二酯键联替代的GalNAc3-1缀合反义化合物与具有全部硫代磷酸酯键联的对应物在对抗肝脏中的靶标方面一样有效。所述化合物预期为促炎性较少的(参见实施例24，其描述了显示PS的减少导致炎症性作用减小的实验)。
实施例22：靶向SRB-1的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体内的作用
在剂量依赖性研究中，针对其抑制Balb/c小鼠中的SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1并且描述于表17中的ISIS 440762和651900 进行评价。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor, ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380002392
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。
如表29中所说明的，这两种反义化合物使SRB-1 mRNA水平降低。此外，包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 651900)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 440762)更有效。这些结果展示使用与不同靶标互补并且具有不同化学修饰核苷的反义寡核苷酸观察到GalNAc3-1缀合物的效力益处，在这种情况下，修饰核苷包含受限的乙基糖部分(双环糖部分)。
表29
ASO处理对Balb/c小鼠中SRB-1 mRNA水平的影响
Figure BDA0002559814380002391
Figure BDA0002559814380002401
实施例23：人外周血单核细胞(hPBMC)测定方案
使用BD Vautainer CPT管法进行hPBMC测定。从在美国健康工作诊所(Faraday&ElCamino Real,Carlsbad)具有知情同意书的志愿供体中获得全血样品并且收集在4-15个BDVacutainer CPT 8ml管中 (VWR Cat.#BD362753)。使用PBMC测定数据表记录每个供体的CPT 管中的大约起始总全血体积。
通过将管轻轻倒置8-10次在离心之前立即重新混合血液样品。将CPT管在具有制动的1500-1800RCF(2700RPM Beckman Allegra 6R)下、在水平(摆动)转子中在室温(18-25℃)下离心30min。从血沉棕黄层界面(在Ficoll与聚合物凝胶层之间)取回细胞；转移至无菌50 ml圆锥管并且汇集至5个CPT管/50ml圆锥管/供体。然后用PBS(无 Ca++、Mg++；GIBCO)洗涤细胞两次。将管加满至50ml并且通过倒置若干次来混合。然后将样品在室温下在330xg下(在Beckman Allegra 6R中的1215RPM)离心15分钟并且在不干扰沉淀物的情况下尽可能多的抽吸上清液。通过轻轻旋转管使细胞沉淀物脱落并且将细胞重新悬浮在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素(大约1ml/10ml起始全血体积)中。将60μl样品用移液管移入到具有600μl VersaLyse试剂(Beckman Coulter Cat#A09777)的样品小瓶(Beckman Coulter)中并且轻轻涡旋10-15秒。将样品在室温下孵育10min并且在计数之前再次混合。使用PBMC细胞类型(1:11的稀释因子与其他参数一起存储) 在Vicell XR细胞活力分析器(BeckmanCoulter)上计数细胞悬浮液。记录活细胞/ml和活力。在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中将细胞悬浮液稀释至1x107活PBMC/ml。
将细胞以5x105涂布在50μl/孔的96孔组织培养平板(Falcon Microtest)中。根据实验模板(总共100μl/孔)添加50μl/孔的稀释在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中的2x浓度寡核苷酸/对照。将平板放置在振荡器上并且允许混合约1min。在37℃、5％CO2下孵育24 小时之后，将平板在400x g下离心10分钟，之后去除上清液用于 MSD细胞因子测定(即人IL-6、IL-10、IL-8和MCP-1)。
实施例24：在hPBMC测定中评价GalNAc3-1缀合ASO的促炎性作用
使用实施例23中描述的方案，在hPBMC测定中评价列于表30 中的反义寡核苷酸(ASO)的促炎性作用。ISIS 353512为已知为测定中的IL-6释放的高响应者的内标物。从新鲜志愿供体中分离hPBMC并且用0μM、0.0128μM、0.064μM、0.32μM、1.6μM、8μM、40μM 和200μM浓度下的ASO处理。在24小时处理之后，测量细胞因子水平。
IL-6的水平用作原始读出。使用标准工序计算EC50和Emax。结果表达为来自两个供体的Emax/EC50的平均比率并且表示为“Emax/EC50”。较低的比率表明促炎性反应相对减小并且较高的比率表明促炎性反应相对增加。
对于测试化合物，促炎性最小的化合物为PS/PO连接的ASO (ISIS 616468)。GalNAc3-1缀合ASO(ISIS 647535)比其未缀合的对应物ISIS 304801的促炎性稍小。这些结果表明掺入一些PO键联使促炎性反应减小并且添加GalNAc3-1缀合物并不使化合物更具有促炎性并且可能减小促炎性反应。因此，人们将预期包含混合的PS/PO键联和GalNAc3-1缀合物的反义化合物将相对于具有或不具有 GalNAc3-1缀合物的全部PS连接的反义化合物产生较低的促炎性反应。这些结果表明GalNAc3-1缀合反义化合物(尤其是具有减小的PS含量的那些)为促炎性较小的。
总之，这些结果表明GalNAc3-1缀合化合物(尤其是具有减小的 PS含量的缀合化合物)可在比缺乏GalNAc3-1缀合物的对应全部PS 反义化合物更高的剂量下施用。因为不预期这些化合物的半衰期是大致上不同的，所以所述较高施用将导致较不频繁的给药。事实上，所述施用可为甚至更不频繁的，因为GalNAc3-1缀合化合物为更有效的 (参见实施例20-22)并且一旦化合物的浓度下降到低于所需要的水平，重新给药是必要的，其中所述需要的水平基于效力。
表30
修饰ASO
Figure BDA0002559814380002421
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示 -O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“Ado’-GalNAc3-1a”指示所指的具有连接至反义寡核苷酸的3’-末端的在实施例9中示出的结构GalNAc3-1的缀合物。
表31
靶向ApoC III的ASO在hPBMC测定中的促炎性作用
Figure BDA0002559814380002431
实施例25：靶向人ApoC III的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体外的作用
在体外测试以上所述的ISIS 304801和647535。用0.03μM、0.08 μM、0.24μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM和20μM浓度的修饰寡核苷酸处理密度为25,000个细胞/孔的来自转基因小鼠的原代肝细胞。在大约16小时的处理期后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过RIBOGREEN所测量，根据总 RNA含量调节hApoC III mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表32中。如所说明的，与对照ISIS 304801相比，在用ISIS 647535处理的细胞中观察到可比的效力。
表32
靶向原代肝细胞中的人ApoC III的修饰ASO
Figure BDA0002559814380002432
Figure BDA0002559814380002441
在本实验中，在体外没有观察到在体内所观察到的GalNAc3-1 缀合的极大效力益处。随后体外的在原代肝细胞中的自由摄取实验确实显示了包含各种GalNAc缀合物的寡核苷酸相对于缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸的效力增加(参见实施例60、82和92)。
实施例26：PO/PS键联对ApoC III ASO活性的影响
每周一次以25mg/kg的ISIS 304801或ISIS 616468(上述两者) 或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
如上所述收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III蛋白水平 (实施例20)。来自那些分析的数据呈现于以下表33中。
这些结果表明相对于全部PS(ISIS 304801)，在翼中具有PO/PS 的反义化合物(ISIS 616468)效力减小。
表33
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III蛋白水平的影响
Figure BDA0002559814380002442
Figure BDA0002559814380002451
实施例27：化合物56
Figure BDA0002559814380002452
化合物56可从Glen Research商业上获得或可根据由Shchepinov 等，NucleicAcids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的已公布工序制备。
实施例28：制备化合物60
Figure BDA0002559814380002453
根据实施例2中说明的工序制备化合物4。化合物57为商业上可获得的。通过结构分析来证实化合物60。
化合物57意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他单保护的取代或未取代的烷基二醇包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备具有预先确定的组成的亚磷酰胺。
实施例29：制备化合物63
Figure BDA0002559814380002454
使用类似于由Tober等,Eur.J.Org.Chem.,2013,3,566-577；和 Jiang等,Tetrahedron,2007,63(19),3982-3988所报道的那些的工序制备化合物61和62。
或者，使用类似于由Kim等，Synlett,2003,12,1838-1840；和 Kim等，已公布的PCT国际申请WO 2004063208的科学和专利文献中所报道的那些的工序制备化合物63。实施例30：制备化合物63b
Figure BDA0002559814380002461
使用类似于由Hanessian等，Canadian Journal of Chemistry,1996, 74(9),1731-1737所报道的那些的工序制备化合物63a。
实施例31：制备化合物63d
Figure BDA0002559814380002462
使用类似于由Chen等，Chinese Chemical Letters,1998,9(5), 451-453所报道的那些的工序制备化合物63c。
实施例32：制备化合物67
Figure BDA0002559814380002463
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。使用类似于由Or等，已公布的PCT国际申请WO 2009/003009所报道的那些的工序制备化合物65。用于化合物65的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例33：制备化合物70
Figure BDA0002559814380002471
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。化合物68为商业上可获得的。用于化合物68的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例34：制备化合物75a
Figure BDA0002559814380002472
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22), 4447-4454所报道的公布的工序制备化合物75。
实施例35：制备化合物79
Figure BDA0002559814380002481
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22), 4447-4454所报道的公布的工序制备化合物76。
实施例36：制备化合物79a
Figure BDA0002559814380002482
根据实施例35中说明的工序制备化合物77。
实施例37：用于通过固体载体制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的缀合低聚化合物82的一般方法(方法I)
Figure BDA0002559814380002491
其中GalNAc3-2具有式：
Figure BDA0002559814380002501
缀合物基团GalNAc3-2的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-2a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-2a具有式：
Figure BDA0002559814380002502
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45, 3623-3627)。分别根据实施例27和28中说明的工序制备亚磷酰胺化合物56和60。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯连接的缀合物基团的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例38：用于制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2 缀合物的低聚化合物82的替代方法(方法II)
Figure BDA0002559814380002511
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45, 3623-3627)。根据实施例35中说明的工序制备GalNAc3-2聚簇亚磷酰胺，即化合物79。此替代方法允许在合成的最后一步将磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物一步装至低聚化合物。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例39：用于通过固体载体制备在5’末端包含GalNAc3-3缀合物的低聚化合物83h(针对5'末端连接修饰的GalNAc3-1)的一般方法
Figure BDA0002559814380002521
Figure BDA0002559814380002531
根据实施例4中说明的工序制备化合物18。化合物83a和83b 为商业上可获得的。使用标准寡核苷酸合成工序制备包含磷酸二酯连接的己胺的低聚化合物83e。用氨水处理受保护的低聚化合物提供 5'-GalNAc3-3缀合的低聚化合物(83h)。
其中GalNAc3-3具有结构：
Figure BDA0002559814380002532
缀合物基团GalNAc3-3的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-3a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-3a具有式：
Figure BDA0002559814380002541
实施例40：用于通过固体载体制备在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-4缀合物的低聚化合物89的一般方法
Figure BDA0002559814380002551
Figure BDA0002559814380002561
其中GalNAc3-4具有结构：
Figure BDA0002559814380002562
其中CM为可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为：
Figure BDA0002559814380002563
缀合物基团GalNAc3-4的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-4a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-4a具有式：
Figure BDA0002559814380002571
受保护的Unylinker官能团化的固体载体化合物30为商业上可获得的。使用类似于文献中所报道的那些的工序制备化合物84(参见 Shchepinov等，Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4447-4454； Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1999,27,3035-3041；以及 Hornet等，Nucleic Acids Research,1997,25,4842-4849)。
根据实施例28和36中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物60和79a。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的在3’末端具有磷酸二酯连接的缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例41：用于通过固相技术制备在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37，Bx为腺嘌呤)缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661134的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。使用亚磷酰胺化合物56和60来合成5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成仪(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscience
Figure BDA0002559814380002581
oligopilot合成仪(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体上的初始负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺偶联。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3 分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用20％甲苯中的二乙胺(v/v)将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的 ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。
然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，0-40％的B持续60min，流速14mL min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用 Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征 ASO。
表34
靶向SRB-1的在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的 ASO
Figure BDA0002559814380002591
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示 -O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-2a”的结构在实施例37中示出。
实施例42：用于通过固相技术制备在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661166的制备)
使用如实施例39和41中所说明的类似工序进行ISIS 661166的合成。
ISIS 661166为5-10-5MOE缺口聚物，其中5’位包含GalNAc3-3 缀合物。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS 分析来表征ASO。
表34a
靶向Malat-1的通过己基氨基磷酸二酯键联在5’位上包含GalNAc3-3 缀合物的ASO
Figure BDA0002559814380002592
Figure BDA0002559814380002601
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联 (PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“5’-GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。
实施例43：靶向SRB-1的5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2 (参见实施例37和41，Bx为腺嘌呤)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中，测试在5’末端包含磷酸二酯连接的 GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134(参见实施例41)对小鼠中SRB-1的反义抑制。未缀合的ISIS 440762和651900(3’末端处的GalNAc3-1 缀合物，参见实施例9)包括在研究中用于比较并且先前描述于表17 中。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900、661134或用PBS 处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72 小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380002602
RNA定量试剂 (Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA 的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
如表35中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2 缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661134)或包含连接在3’末端的 GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 651900)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。此外，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134与在3’末端包含 GalNAc3-1缀合物的ISIS 651900相比效力相等。
表35
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1或GalNAc3-2的ASO
Figure BDA0002559814380002611
先前在实施例9和37中描述了3’GalNAc3-1和5’GalNAc3-2的结构。
药物代谢动力学分析(PK)
如实施例20中所说明，以相同方式检验和评价来自高剂量组(7 mg/kg)的ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏样品。鉴定了 661134(5’GalNAc3-2)和ISIS 651900(3’GalNAc3-1)的全长代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。结果显示针对在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO(ISIS 661134)所检测到的主要代谢物为ISIS 440762(数据未示出)。在可检测水平下没有观察到另外的代谢物。不像其对应物，针对在3’末端具有GalNAc3-1缀合物的ASO(ISIS 651900)观察到类似于先前在表23a中报道的那些的另外的代谢物。这些结果表明具有磷酸二酯连接的GalNAc3-1或 GalNAc3-2缀合物可在不损害其效力的情况下改进ASO的PK特征。
实施例44：PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1 缀合物(参见实施例9)的ASO的反义抑制的影响
在单一施用研究中，针对其抑制小鼠中SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861和 655862进行测试。在研究中包括母体未缀合化合物ISIS 353382用于比较。
ASO为5-10-5MOE缺口聚物，其中缺口区包含十个2’-脱氧核糖核苷并且每个翼区包含五个2’-MOE修饰核苷。使用如先前在实施例19中所说明的类似方法制备ASO并且在以下表36中描述。
表36
靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的修饰ASO
Figure BDA0002559814380002621
Figure BDA0002559814380002631
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联 (PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”的结构在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 353382、655861、655862或用PBS 处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380002632
RNA 定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏 SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总 RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为 PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下报告。
如表37中所说明，与PBS处理的对照相比，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS655861和655862)与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此外，相对于全部PS(ISIS 655861)，具有混合的PS/PO键联的ISIS 655862显示出效力的改进。
表37
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO 的反义抑制的影响
Figure BDA0002559814380002641
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了器官重量。结果展示相比于PBS对照，在用ASO处理的小鼠中没有观察到转氨酶水平(表38)或器官重量(数据未示出)上升。此外，与全部PS(ISIS 655861)相比，具有混合的PS/PO键联的ASO(ISIS 655862)显示出类似的转氨酶水平。
表38
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO 的转氨酶水平的影响
Figure BDA0002559814380002651
实施例45：PFP酯化合物110a的制备
Figure BDA0002559814380002661
Figure BDA0002559814380002671
单独用化合物103a或103b(38毫摩尔)和TMSOTf(0.5当量)以及二氯甲烷(200mL)中的分子筛处理化合物4(9.5g，28.8毫摩尔)，并且在室温下搅拌16小时。这时使有机层过滤通过硅藻土，然后用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷) 纯化所得到的油状物，得到>80％产率的化合物104a和104b。LCMS 和质子NMR与结构一致。
将化合物104a和104b处理至与对于化合物100a-d(实施例47) 相同的条件，得到>90％产率的化合物105a和105b。LCMS和质子 NMR与结构一致。
在与对于化合物901a-d相同的条件下单独用化合物90处理化合物105a和105b，得到化合物106a(80％)和106b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物106a和106b处理至与对于化合物96a-d(实施例47)相同的条件，得到107a(60％)和107b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物107a和107b处理至与对于化合物97a-d(实施例47)相同的条件，得到40％-60％产率的化合物108a和108b。LCMS和质子 NMR与结构一致。
将化合物108a(60％)和108b(40％)处理至与对于化合物100a-d (实施例47)相同的条件，得到>80％产率的化合物109a和109b。LCMS 和质子NMR与结构一致。
将化合物109a处理至与对于化合物101a-d(实施例47)相同的条件，得到30％-60％产率的化合物110a。LCMS和质子NMR与结构一致。或者，可以类似方式用化合物109b起始制备化合物110b。
实施例46：用于与PFP酯(寡核苷酸111)缀合的一般工序；ISIS 666881(GalNAc3-10)的制备
使用标准固相寡核苷酸工序合成并纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸。将5’-己基氨基修饰的寡核苷酸溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量的溶解于DMSO(50μL)中的所选的 PFP酯化GalNAc3聚簇。如果在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，那么添加DMSO直到所有PFP酯溶解。在室温下混合约16h之后反应完全。用水将所得到的溶液稀释至12mL，然后在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。然后将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，并且在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干以提供 GalNAc3缀合的寡核苷酸。
Figure BDA0002559814380002691
将寡核苷酸111与GalNAc3-10缀合。缀合物基团GalNAc3-10的 GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-10a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-，如用以下GalNAc3-10合成的寡核苷酸 (ISIS666881)中所示。GalNAc3-10(GalNAc3-10a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002692
根据此一般工序制备ISIS 666881。使用标准固相寡核苷酸工序合成并且纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸ISIS 660254。将ISIS 660254(40mg，5.2μmol)溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量溶解于DMSO(50μL)中的PFP酯(化合物110a)。在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，则需要另外的DMSO(600μL)来完全溶解PFP酯。在室温下混合16h之后反应完全。用水将溶液稀释至12mL总体积，并且在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在 3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，同时在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合的寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干，得到90重量％产率的ISIS 666881(42mg， 4.7μmol)。
GalNAc3-10缀合的寡核苷酸
Figure BDA0002559814380002701
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
实施例47：包含GalNAc3-8的寡核苷酸102的制备
Figure BDA0002559814380002711
Figure BDA0002559814380002721
Figure BDA0002559814380002731
将三元酸90(4g，14.43mmol)溶解于DMF(120mL)和N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(8.9mL，52毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。连同N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)一起添加Boc-二胺91a 或91b(68.87mmol)，并且使反应物在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/ 二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物92a和 92b。LCMS和质子NMR与结构一致。
在室温下用20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸将化合物92a或 92b(6.7毫摩尔)处理16小时。蒸发所得到的溶液，然后溶解于甲醇中，并且用DOWEX-OH树脂处理30分钟。过滤所得到的溶液并且在减压下缩减至油状物，得到85％-90％产率的化合物93a和93b。
将化合物7或64(9.6毫摩尔)在DMF(20mL)中用HBTU(3.7g， 9.6毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(5mL)处理15分钟。向其中添加化合物93a或93b(3毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到20％-40％产率的化合物 96a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
在乙醇(75mL)中通过雷尼镍单独地将化合物96a-d(0.75毫摩尔) 氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除乙醇，得到80％-90％产率的化合物97a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物23(0.32g，0.53毫摩尔)在DMF(30mL)中用HBTU(0.2 g，0.53毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.14毫摩尔)处理15 分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.38毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到 30％-40％产率的化合物98a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物99(0.17g，0.76毫摩尔)在DMF(50mL)中用HBTU (0.29g，0.76毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0毫摩尔)处理 15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.51毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到40％-60％产率的化合物100a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地在甲醇/乙酸乙酯(1:1，50mL)中通过10％Pd(OH)2/C将化合物100a-d(0.16毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除有机物，得到80％-90％产率的化合物 101a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地将化合物101a-d(0.15毫摩尔)溶解于DMF(15mL)和吡啶 (0.016mL，0.2毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯 (0.034mL，0.2毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->5％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物 102a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
Figure BDA0002559814380002751
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-8缀合物基团的低聚化合物102。缀合物基团GalNAc3-8的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-8a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在优选的实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-8(GalNAc3-8a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002761
实施例48：包含GalNAc3-7的寡核苷酸119的制备
Figure BDA0002559814380002762
Figure BDA0002559814380002771
根据文献中描述的工序合成化合物112(J.Med.Chem.2004,47, 5798-5808)。
将化合物112(5g，8.6mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(22mL/22 mL)中。添加碳上氢氧化钯(0.5g)。将此反应混合物在室温下在氢气气氛下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用1:1甲醇 /乙酸乙酯洗涤所述垫。合并滤液和洗涤物并且浓缩至干燥，得到化合物105a(定量的)。通过LCMS证实结构。
将化合物113(1.25g，2.7mmol)、HBTU(3.2g，8.4mmol)和DIEA (2.8mL，16.2mmol)溶解于无水DMF(17mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物105a(3.77g，8.4mmol)在无水DMF (20mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂以得到油。将残余物溶解于CH2Cl2(100mL)中并且用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用10％至20％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物114(1.45g，30％)。通过LCMS 和1H NMR分析来证实结构。
将化合物114(1.43g，0.8mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(4mL/4 mL)中。添加钯碳(湿润，0.14g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物115(定量的)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物83a(0.17g，0.75mmol)、HBTU(0.31g，0.83mmol) 和DIEA(0.26mL，1.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物115(1.22g，0.75mmol) 在无水DMF中的溶液，并且将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CH2Cl2中。将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥并且过滤。将有机层浓缩至干燥，并且通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用3％至15％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物116(0.84g，61％)。通过 LC MS和1HNMR分析来证实结构。
Figure BDA0002559814380002791
将化合物116(0.74g，0.4mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(5mL/5 mL)中。添加钯碳(湿润，0.074g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/ 乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物117(0.73g，98％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物117(0.63g，0.36mmol)溶解于无水DMF(3mL)中。向此溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(70μL，0.4mmol)和三氟乙酸五氟苯基酯(72μL，0.42mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h并且倾入到饱和NaHCO3水溶液中。将混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥。将二氯甲烷溶液浓缩至干燥并且用硅胶柱色谱法纯化并且用5％至10％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物118(0.51g，79％)。通过LCMS以及1H与1H和19FNMR证实结构。
Figure BDA0002559814380002801
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-7缀合物基团的低聚化合物119。缀合物基团GalNAc3-7的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-7a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-7(GalNAc3-7a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002802
实施例49：包含GalNAc3-5的寡核苷酸132的制备
Figure BDA0002559814380002811
将化合物120(14.01g，40mmol)和HBTU(14.06g，37mmol)溶解于无水DMF(80mL)中。添加三乙胺(11.2mL，80.35mmol)并且搅拌5min。在冰浴中冷却反应混合物并且添加化合物121(10g，mmol) 在无水DMF(20mL)中的溶液。添加另外的三乙胺(4.5mL，32.28 mmol)并且将反应混合物在氩气气氛下搅拌18h。通过TLC(乙酸乙酯:己烷；1:1；Rf＝0.47)监测反应。在减压下移除溶剂。将残余物吸收于EtOAc(300mL)中并且用1M NaHSO4(3x150mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x150mL)和盐水(2x100mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层。通过过滤去除干燥剂并且通过旋转蒸发浓缩有机层。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物并且通过使用35％–50％的己烷中的EtOAc 洗脱，得到化合物122(15.50g，78.13％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。质量m/z 589.3[M+H]+。
将LiOH(92.15mmol)在水(20mL)和THF(10mL)中的溶液添加至溶解于甲醇(15mL)中的化合物122(7.75g，13.16mmol)的冷却溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45min并且通过TLC(EtOAc:己烷；1:1)监测。在减压下将反应混合物浓缩至一半体积。在冰浴中冷却剩余的溶液并且通过添加浓HCl来中和。将反应混合物稀释，用 EtOAc(120mL)萃取并且用盐水洗涤(100mL)。当静置过夜时形成乳液并且澄清。将有机层分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发，得到化合物123(8.42g)。残余的盐可能为质量过量的原因。LCMS与结构一致。产物无需任何进一步纯化即使用。计算的分子量：574.36；实测的分子量：575.3[M+H]+。
Figure BDA0002559814380002821
根据文献中描述的工序合成化合物126(J.Am.Chem.Soc.2011, 133,958-963)。
Figure BDA0002559814380002822
Figure BDA0002559814380002831
将化合物123(7.419g，12.91mmol)、HOBt(3.49g，25.82mmol) 和化合物126(6.33g，16.14mmol)溶解于DMF(40mL)中，并且在冰浴中冷却所得到的反应混合物。在氩气气氛下，向其中添加N,N-二异丙基乙胺(4.42mL，25.82mmol)、PyBop(8.7g，16.7mmol)，接着添加Bop偶联试剂(1.17g，2.66mmol)。去除冰浴并且使溶液升温至室温。在1h后反应完成，如通过TLC(DCM:MeOH:AA；89:10:1)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于EtOAc(200mL) 中并且用1M NaHSO4(3x100 mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x100 mL) 和盐水(2x100 mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法用50％己烷/EtOAC至100％EtOAc梯度纯化残余物，得到呈白色泡沫的化合物127(9.4g)。LCMS和1HNMR与结构一致。质量m/z 778.4[M+H]+。
将三氟乙酸(12mL)添加至化合物127(1.57g，2.02mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌1h。将反应混合物与甲苯(30mL)在减压条件下共蒸发至干燥。使所获得的残余物与乙腈(30 mL)和甲苯(40mL)共蒸发两次，得到呈三氟乙酸盐的化合物128(1.67 g)并且无需进一步纯化即用于下一步。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z 478.2[M+H]+。
将化合物7(0.43g，0.963mmol)、HATU(0.35g，0.91mmol)和 HOAt(0.035g，0.26mmol)合并在一起并且在圆底烧瓶中在减压下通过P2O5干燥4h，然后溶解于无水DMF(1mL)中并且搅拌5min。添加该化合物128(0.20g，0.26mmol)在无水DMF(0.2mL)和N,N-二异丙基乙胺(0.2mL)中的溶液。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物。在30min之后反应完全，如通过LCMS和TLC(7％MeOH/DCM)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM(30mL) 中并且用1M NaHSO4(3x20 mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x20 mL)和盐水(3x20 mL)洗涤。将有机相分离、用Na2SO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法使用5％-15％的二氯甲烷中的MeOH来纯化残余物，得到化合物129(96.6mg)。LC MS和1H NMR与结构一致。质量m/z 883.4[M+2H]+。
在20mL闪烁瓶中将化合物129(0.09g，0.051mmol)溶解于甲醇 (5mL)中。向其中添加少量的10％Pd/C(0.015mg)并且用H2气体冲洗反应容器。将此反应混合物在室温下在H2气氛下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇洗涤硅藻土垫。将滤液洗涤物汇集在一起并且在减压下浓缩，得到化合物130(0.08g)。LCMS 和1H NMR与结构一致。产物未进行进一步纯化即使用。质量m/z 838.3[M+2H]+。
向10mL刻度的圆底烧瓶中添加化合物130(75.8mg，0.046 mmol)、0.37M吡啶/DMF(200μL)和搅拌棒。在搅拌的情况下向此溶液中逐滴添加0.7M三氟乙酸五氟苯基酯/DMF(100μL)。在1h后反应完成，如通过LC MS所测定的。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CHCl3(大约10mL)中。将有机层用NaHSO4(1M，10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)各分配三次。将有机相分离并且通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩，得到化合物131(77.7mg)。LCMS与结构一致。无需进一步纯化即使用。质量m/z 921.3[M+ 2H]+。
Figure BDA0002559814380002851
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-5缀合物基团的低聚化合物132。缀合物基团GalNAc3-5的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-5a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-5(GalNAc3-5a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002861
实施例50：包含GalNAc4-11的寡核苷酸144的制备
Figure BDA0002559814380002871
Figure BDA0002559814380002881
化合物134的合成。向Merrifield烧瓶中添加用乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈洗涤的氨甲基VIMAD树脂(2.5g，450μmol/g)。树脂在乙腈(4mL)中溶胀。通过添加20(1.0mmol，0.747g)、TBTU(1.0 mmol,0.321g)、乙腈(5mL)和DIEA(3.0mmol，0.5mL)将化合物133 在100mL圆底烧瓶中预先活化。使此溶液搅拌5min，然后在振荡的情况下添加至Merrifield烧瓶。使悬浮液震荡3h。排出反应混合物并且用乙腈、DMF和DCM洗涤树脂。通过测量DCM中的DMT阳离子在500nm(消光系数＝76000)处的吸光度来定量新树脂负载量并且测定为238μmol/g。通过悬浮于乙酸酐溶液中持续十分钟，进行三次，来将树脂加帽。
使用反复基于Fmoc(iterative Fmoc-based)的固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物141。拆下少量的固体载体并且将其悬浮于氨水(28-30wt％)中6h。通过LC-MS分析裂解的化合物并且所观察到的质量与结构一致。质量m/z 1063.8[M+2H]+。
使用固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物142。
Figure BDA0002559814380002891
在DNA合成器上使用标准固相合成来合成固体载体结合的化合物143。
将固体载体结合的化合物143悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热16h。将溶液冷却并且过滤固体载体。浓缩滤液，将残余物溶解于水中并且通过HPLC在强阴离子交换柱上纯化。将含有全长化合物144的级分汇集在一起并且脱盐。通过LC-MS分析所得到的GalNAc4-11缀合的低聚化合物并且所观察到的质量与结构一致。
缀合物基团GalNAc4-11(GalNAc4-11a)的GalNAc4聚簇部分可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc4-11(GalNAc4-11a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002901
实施例51：包含GalNAc3-6的寡核苷酸155的制备
Figure BDA0002559814380002902
如文献中所描述来合成化合物146(Analytical Biochemistry 1995, 229,54-60)。
Figure BDA0002559814380002911
将化合物4(15g，45.55mmol)和化合物35b(14.3克，57mmol) 溶解于CH2Cl2(200ml)中。添加活化的分子筛(
Figure BDA0002559814380002912
2g，粉末状)，并且使反应物在氮气气氛下搅拌30分钟。添加TMS-OTf(4.1ml，22.77 mmol)并且使反应物在室温下搅拌过夜。当完成时，通过倾入到饱和NaHCO3水溶液(500ml)和碎冰(大约150g)的溶液中来猝灭反应。将有机层分离、用盐水洗涤、通过MgSO4干燥、过滤并且在减压下浓缩至橙色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化粗材料并且用2％-10％的 CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物112(16.53g，63％)。LCMS和1H NMR与预期的化合物一致。
将化合物112(4.27g，7.35mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(40ml) 中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加 Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯，400mg)，并且使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的CH2Cl2中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液，并且在高真空下简单干燥以得到化合物105a(3.28g)。LCMS和1H NMR 与希望的产物一致。
将化合物147(2.31g，11mmol)溶解于无水DMF(100mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA，3.9mL，22mmol)，接着添加HBTU(4 g，10.5mmol)。使反应混合物在氮气下搅拌大约15分钟。向其中添加化合物105a(3.3g，7.4mmol)在干燥DMF中的溶液并且在氮气气氛下搅拌2h。将反应物用EtOAc稀释并且用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相分离、干燥(MgSO4)、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法2％-5％的CH2Cl2中的MeOH来纯化粗材料，得到化合物148(3.44g，73％)。LCMS和1H NMR与预期的产物一致。
将化合物148(3.3g，5.2mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(75ml) 中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加 Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(350mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30 分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物149(2.6g)。LCMS与希望的产物一致。将残余物溶解于干燥DMF(10ml)中，其立即用于下一步。
Figure BDA0002559814380002921
将化合物146(0.68g，1.73mmol)溶解于干燥DMF(20ml)中。向其中添加DIEA(450μL，2.6mmol，1.5当量)和HBTU(1.96g，0.5.2 mmol)。使反应混合物在氮气下在室温下搅拌15分钟。添加化合物 149(2.6g)在无水DMF(10mL)中的溶液。通过添加DIEA(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。使反应在室温下在氮气下搅拌2h。在完成时，将反应物用EtOAc(100mL)稀释，并且用饱和 NaHCO3水溶液洗涤、接着用盐水洗涤。将有机相分离、用MgSO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物150(0.62g，20％)。LCMS 和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物150(0.62g)溶解于1:1MeOH/EtOAc(5L)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(60mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时 (TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物151(0.57g)。LCMS与希望的产物一致。将产物溶解于4mL干燥DMF中并且立即用于下一步。
Figure BDA0002559814380002941
将化合物83a(0.11g，0.33mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(75μL，1mmol)和PFP-TFA(90μL，0.76 mmol)。当接触时反应混合物变为洋红色，并且在接下来的30分钟里逐渐变为橙色。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时(形成 PFP酯)，添加化合物151(0.57g，0.33mmol)在DMF中的溶液。通过添加N,N-二异丙基乙胺(如果必要的话)将反应物的pH调节至 pH＝9-10。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机相分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过硅胶柱色谱法(2％-10％的CH2Cl2中的MeOH)纯化残余物，得到化合物152(0.35g，55％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物152(0.35g，0.182mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(10 mL)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(35mg)。使氢气鼓泡穿过溶液 30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物153(0.33 g，定量的)。LCMS与希望的产物一致。
在氮气下搅拌的情况下，将化合物153(0.33g，0.18mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(65μL，0.37 mmol)和PFP-TFA(35μL，0.28mmol)。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当接触时反应混合物变为洋红色，并且逐渐变为橙色。通过添加更多的N,-二异丙基乙胺将反应混合物的pH维持在pH＝ 9-10。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机层分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的 CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物154(0.29g，79％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
Figure BDA0002559814380002951
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-6缀合物基团的低聚化合物155。缀合物基团GalNAc3-6的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-6a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-6(GalNAc3-6a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002961
实施例52：包含GalNAc3-9的寡核苷酸160的制备
Figure BDA0002559814380002962
根据文献中描述的工序合成化合物156(J.Med.Chem.2004,47, 5798-5808)。
将化合物156(18.60g，29.28mmol)溶解于甲醇(200mL)中。添加钯碳(6.15g，10wt％，负载量(干基)，基质碳粉，湿润)。将此反应混合物在室温下在氢气气氛下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇彻底洗涤硅藻土垫。洗涤合并的滤液并且浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用5％-10％的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物157(14.26g，89％)。质量m/z 544.1[M-H]-。
将化合物157(5g，9.17mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。添加HBTU(3.65g，9.61mmol)和N,N-二异丙基乙胺(13.73mL，78.81 mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟。向其中添加化合物47 (2.96g，7.04mmol)的溶液。将反应在室温下搅拌8h。将反应混合物倾入到饱和NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取混合物，并且将有机层用盐水洗涤并干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用50％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物 158(8.25g，73.3％)。通过MS和1H NMR分析来证实结构。
在减压下通过P2O5干燥化合物158(7.2g，7.61mmol)。将干燥的化合物溶解于无水DMF(50mL)中。向其中添加1H-四唑(0.43g， 6.09mmol)和N-甲基咪唑(0.3mL，3.81mmol)以及2-氰乙基 -N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯(3.65mL，11.50mmol)。将反应混合物在氩气气氛下搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释。用饱和NaHCO3和盐水洗涤反应混合物。将有机相分离、干燥 (Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用50％-90％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物159(7.82g，80.5％)。通过LCMS和31P NMR分析来证实结构。
Figure BDA0002559814380002981
使用标准寡核苷酸合成工序制备包含GalNAc3-9缀合物基团的低聚化合物160。将化合物159的三个单元偶联至固体载体，接着偶联核苷酸亚磷酰胺。用氨水处理受保护的低聚化合物得到化合物160。缀合物基团GalNAc3-9的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-9a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-9(GalNAc3-9a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380002982
实施例53：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
Figure BDA0002559814380002991
使内酯161与二氨基丙烷(3-5当量)或单-Boc保护的二氨基丙烷 (1当量)反应，以提供醇162a或162b。当未受保护的丙二胺用于上述反应时，通过在高真空下蒸发来去除过量的二胺并且使用CbzCl保护 162a中的游离氨基，以在通过柱色谱法纯化之后提供呈白色固体的 162b。在TMSOTf的存在下，使醇162b与化合物4进一步反应，以提供163a，所述163a通过使用催化氢化去除Cbz基团而转化为163b。通过使三元酸113(参见实施例48)与DMF(0.1M至0.5M)中的 PFPTFA(3.5当量)和吡啶(3.5当量)反应来制备五氟苯基(PFP)酯164。使三酯164与胺163b(3-4当量)和DIPEA(3-4当量)直接反应，以提供化合物18。以上方法极大地促进中间体的纯化并且使副产物的形成最小化，所述副产物使用实施例4中描述的工序形成。
实施例54：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
Figure BDA0002559814380003001
使用实施例53中概述的工序由酸113制备三PFP酯164并且使其与单-Boc保护的二胺反应，以提供基本上定量产率的165。用盐酸或三氟乙酸去除Boc基团以提供三胺，所述三胺在合适的碱如DIPEA 的存在下与PFP活化的酸166反应，以提供化合物18。
通过用DMF中的PFPTFA(1-1.2当量)和吡啶(1-1.2当量)处理来由对应的酸制备PFP保护的Gal-NAc酸166。继而通过使用乙腈和水中的TEMPO(0.2当量)和BAIB的氧化来由对应的醇制备前体酸。使用先前在实施例47中描述的条件，通过与1,6-己二醇(或1,5-戊二醇或对于其他n值的其他二元醇)(2-4当量)和TMSOTf反应来由糖中间体4制备前体醇。
实施例55：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、3、8以及9)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种 GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表39
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003011
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。“GalNAc3-9”的结构先前在实施例52中示出。“GalNAc3-3”的结构先前在实施例39中示出。“GalNAc3-8”的结构先前在实施例47中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664078、661161、 665001或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后 72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003022
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表40中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1mRNA水平。事实上，在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1 和GalNAc3-9缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 655861和ISIS 664078)和包含连接在5’末端的GalNAc3-3和GalNAc3-8缀合物的反义寡核苷酸 (ISIS 661161和ISIS 665001)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 353382) 相比显示出效力的大致改进。此外，在3'末端包含GalNAc3-9缀合物的ISIS 664078与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861相比基本上效力相等。分别包含GalNAc3-3或GalNAc3-9的5'缀合的反义寡核苷酸ISIS 661161和ISIS 665001与3'缀合的反义寡核苷酸(ISIS655861和ISIS 664078)相比具有增加的效力。
表40
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1、3、8或9的ASO
Figure BDA0002559814380003021
Figure BDA0002559814380003031
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表41
Figure BDA0002559814380003032
Figure BDA0002559814380003041
实施例56：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、2、3、5、6、7以及10)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种 GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处，具有连接在3’末端处的GalNAc3缀合物基团的ISIS 655861除外。
表42
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003042
Figure BDA0002559814380003051
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。“GalNAc3-2a”的结构先前在实施例37中示出。“GalNAc3-3a”的结构先前在实施例39中示出。“GalNAc3-5a”的结构先前在实施例49中示出。“GalNAc3-6a”的结构先前在实施例51中示出。“GalNAc3-7a”的结构先前在实施例48中示出。“GalNAc3-10a”的结构先前在实施例46中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003062
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
如表43中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1mRNA水平。事实上，缀合反义寡核苷酸与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。5'缀合的反义寡核苷酸与3'缀合的反义寡核苷酸相比显示出效力稍微增加。
表43
Figure BDA0002559814380003061
Figure BDA0002559814380003071
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表44中示出。
表44
Figure BDA0002559814380003072
Figure BDA0002559814380003081
实施例57：靶向ApoC III的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸的体内作用持续时间研究
用以下指示的剂量注射小鼠一次并且经过42天的过程监测 ApoC-III和血浆甘油三酯(血浆TG)水平。在每个组中使用3只表达人APOC-III的转基因小鼠进行研究。
表45
靶向ApoC III的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003082
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。
表46
ApoC III mRNA(第1天时的％盐水)和血浆TG水平(第1天时的％盐水)
Figure BDA0002559814380003091
如上表中可看出，与未缀合寡核苷酸相比，作用持续时间随着 3'-缀合物基团的添加而增加。与缀合的全部PS寡核苷酸647535相比，对于缀合的混合PO/PS寡核苷酸647536存在作用持续时间的进一步增加。
实施例58：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸(比较 GalNAc3-1和GalNAc4-11)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 440762作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。“GalNAc3-11a”的结构先前在实施例50中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 440762、651900、663748或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003102
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表47中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1 mRNA水平。在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和 GalNAc4-11缀合物的反义寡核苷酸(ISIS651900和ISIS 663748)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。两种缀合寡核苷酸GalNAc3-1和GalNAc4-11效力相等。
表47
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003101
Figure BDA0002559814380003111
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表48中示出。
表48
Figure BDA0002559814380003112
实施例59：靶向FXI的GalNAc3-1缀合的ASO的体内作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的FXI的反义抑制。包括ISIS404071作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
表49
靶向FXI的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003121
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 404071、656172、656173或用PBS 处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，一周两次，持续3周。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003122
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏FXI mRNA水平。还使用ELISA测量了血浆FXI蛋白水平。在归一化为PBS处理的对照之前，确定相对于总RNA的FXI mRNA水平(使用
Figure BDA0002559814380003132
)。以下结果以每个处理组的FXImRNA水平的平均百分比呈现。将数据归一化为PBS处理的对照并且表示为“％ PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
表50
因子XI mRNA(％盐水)
Figure BDA0002559814380003131
如表50中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 FXI mRNA水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
如表50a中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 FXI蛋白水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
表50a
因子XI蛋白(％盐水)
Figure BDA0002559814380003141
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、总白蛋白、CRE和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表51
Figure BDA0002559814380003142
实施例60：靶向SRB-1的缀合ASO的体外作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对原代小鼠肝细胞中的SRB-1的反义抑制。包括ISIS 353382作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表52
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003151
Figure BDA0002559814380003161
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。“GalNAc3-3a”的结构先前在实施例39中示出。“GalNAc3-8a”的结构先前在实施例47中示出。“GalNAc3-9a”的结构先前在实施例52中示出。“GalNAc3-6a”的结构先前在实施例51中示出。“GalNAc3-2a”的结构先前在实施例37中示出。“GalNAc3-10a”的结构先前在实施例46中示出。“GalNAc3-5a”的结构先前在实施例49中示出。“GalNAc3-7a”的结构先前在实施例48中示出。
处理
在体外在小鼠原代肝细胞中测试以上列出的寡核苷酸，所述小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度涂布并且用0.03、0.08、0.24、 0.74、2.22、6.67或20nM修饰寡核苷酸处理。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过
Figure BDA0002559814380003172
所测量，根据总RNA含量调节SRB-1 mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表53中。结果显示，在其中没有使用试剂或电穿孔技术来人工促进寡核苷酸进入到细胞中的自由摄取条件下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc 缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 353382)在肝细胞中显著更有效。
表53
Figure BDA0002559814380003171
a多次运行的平均值。
实施例61：包含GalNAc3-12的低聚化合物175的制备
Figure BDA0002559814380003181
Figure BDA0002559814380003191
Figure BDA0002559814380003201
化合物169为商业上可获得的。通过向化合物171添加苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯来制备化合物172。通过向DMF中的5-(苯甲氧基)-5- 氧戊酸添加PFP-TFA和DIEA来制备苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯。使用实施例46中说明的一般工序由化合物174制备包含GalNAc3-12缀合物基团的低聚化合物175。缀合物基团GalNAc3-12的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-12a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。 GalNAc3-12(GalNAc3-12a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003202
实施例62：包含GalNAc3-13的低聚化合物180的制备
Figure BDA0002559814380003211
Figure BDA0002559814380003221
使用实施例2中示出的一般工序制备化合物176。使用实施例49 中说明的一般工序由化合物177制备包含GalNAc3-13缀合物基团的低聚化合物180。缀合物基团GalNAc3-13的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-13a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003231
实施例63：包含GalNAc3-14的低聚化合物188的制备
Figure BDA0002559814380003241
化合物181和185为商业上可获得的。使用实施例46中说明的一般工序由化合物187制备包含GalNAc3-14缀合物基团的低聚化合物188。缀合物基团GalNAc3-14的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-14a) 可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003251
实施例64：包含GalNAc3-15的低聚化合物197的制备
Figure BDA0002559814380003252
Figure BDA0002559814380003261
化合物189为商业上可获得的。使用实施例31中示出的一般工序制备化合物195。使用标准寡核苷酸合成工序由化合物194和195 制备包含GalNAc3-15缀合物基团的低聚化合物197。缀合物基团 GalNAc3-15的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-15a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为 -P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-15(GalNAc3-15a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003262
实施例65：靶向SRB-1的包含5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较 GalNAc3-3、12、13、14以及15)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。将 GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表54
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003271
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-3a”的结构先前在实施例39中示出。“GalNAc3-12a”的结构先前在实施例61中示出。“GalNAc3-13a”的结构先前在实施例62 中示出。“GalNAc3-14a”的结构先前在实施例63中示出。“GalNAc3-15a”的结构先前在实施例64中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、661161、671144、670061、 671261、671262或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次或两次。给药两次的小鼠在第一次剂量之后三天接受第二次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003282
RNA 定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏 SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的 SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表55中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1 mRNA水平。在接受单一剂量的动物与接受两次剂量的动物之间没有观察到靶敲除的显著差异(参见ISIS 353382剂量30mg/kg和2 x15mg/kg；以及ISIS 661161剂量5mg/kg和2x2.5mg/kg)。包含磷酸二酯连接的GalNAc3-3、12、13、14以及15缀合物的反义寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 335382)相比显示出效力的大致改进。
表55
SRB-1 mRNA(％盐水)
Figure BDA0002559814380003281
Figure BDA0002559814380003291
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表56
Figure BDA0002559814380003292
Figure BDA0002559814380003301
实施例66：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3聚簇的靶向 SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的核苷(可裂解部分(CM))连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表57
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003302
Figure BDA0002559814380003311
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-3a”的结构先前在实施例39中示出。“GalNAc3-13a”的结构先前在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 661161、670699、670700、670701、671165或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后 72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003312
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表58中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1 mRNA水平。包含各种可裂解部分的反义寡核苷酸均显示出类似的效力。
表58
SRB-1 mRNA(％盐水)
Figure BDA0002559814380003321
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表59
Figure BDA0002559814380003322
Figure BDA0002559814380003331
实施例67：包含GalNAc3-16的低聚化合物199的制备
Figure BDA0002559814380003341
使用实施例7和9中说明的一般工序制备包含GalNAc3-16缀合物基团的低聚化合物199。缀合物基团GalNAc3-16的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-16a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-16(GalNAc3-16a-CM-)的结构在以下示出：
Figure BDA0002559814380003351
实施例68：包含GalNAc3-17的低聚化合物200的制备
Figure BDA0002559814380003352
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-17缀合物基团的低聚化合物200。缀合物基团GalNAc3-17的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-17a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-17 (GalNAc3-17a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003353
实施例69：包含GalNAc3-18的低聚化合物201的制备
Figure BDA0002559814380003361
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-18缀合物基团的低聚化合物201。缀合物基团GalNAc3-18的GalNAc3聚簇部分 (GalNAc3-18a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-18 (GalNAc3-18a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003362
实施例70：包含GalNAc3-19的低聚化合物204的制备
Figure BDA0002559814380003371
使用实施例52中说明的一般工序由化合物64制备包含 GalNAc3-19缀合物基团的低聚化合物204。缀合物基团GalNAc3-19 的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-19a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为 -P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-19(GalNAc3-19a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003381
实施例71：包含GalNAc3-20的低聚化合物210的制备
Figure BDA0002559814380003391
通过将PFP-TFA和DIEA添加至乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基) 己酸来制备化合物205，所述乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸通过将三氟甲磺酸酐添加至6-氨基己酸来制备。将反应混合物加热至 80℃，然后降低至室温。使用实施例52中说明的一般工序由化合物 208制备包含GalNAc3-20缀合物基团的低聚化合物210。缀合物基团 GalNAc3-20的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-20a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为 -P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-20(GalNAc3-20a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003401
实施例72：包含GalNAc3-21的低聚化合物215的制备
Figure BDA0002559814380003411
化合物211为商业上可获得的。使用实施例52中说明的一般工序由化合物213制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物215。缀合物基团GalNAc3-21的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-21a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-21(GalNAc3-21a-CM-) 的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003421
实施例73：包含GalNAc3-22的低聚化合物221的制备
Figure BDA0002559814380003431
使用二异丙基铵四唑由化合物219制备化合物220。使用实施例 52中说明的一般工序从化合物220制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物221。缀合物基团GalNAc3-22的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-22a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003441
实施例74：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3聚簇的靶向 SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表60
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003442
Figure BDA0002559814380003451
在所有表格中，大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5- 甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
“GalNAc3-3a”的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-17a的结构先前在实施例68中示出，并且GalNAc3-18a的结构在实施例69中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表60中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003452
RNA定量试剂(Molecular Probes, Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表61中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1 mRNA水平。包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸显示出类似的效力并且比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表61
SRB-1 mRNA(％盐水)
Figure BDA0002559814380003461
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表62中示出。
表62
Figure BDA0002559814380003462
Figure BDA0002559814380003471
实施例75：包含5’-缀合物基团的寡核苷酸的药物代谢动力学分析
使用根据实施例65、66和74中描述的处理工序所获得的肝脏样品来评价以上表54、57和60中的ASO的PK。使用标准方案切碎并提取肝脏样品并且与内标物一起通过IP-HPLC-MS进行分析。通过对适当的UV峰进行积分，测量组合组织水平(μg/g)并且使用适当的提取离子色谱图(EIC)测量全长ASO缺失缀合物(“亲本”，在该情况下的 Isis No为353382)的组织水平。
表63
肝脏中的PK分析
Figure BDA0002559814380003472
Figure BDA0002559814380003481
以上表63中的结果显示，在寡核苷酸施用之后72小时，尤其当考虑到具有与不具有GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸之间的给药差异时，包含GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏组织水平比不包含 GalNAc3缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 353382)更高。此外，至72 小时，40％-98％的包含GalNAc3缀合物基团的每个寡核苷酸代谢为母体化合物，表明GalNAc3缀合物基团从寡核苷酸上裂解。
实施例76：包含GalNAc3-23的低聚化合物230的制备
Figure BDA0002559814380003491
Figure BDA0002559814380003501
化合物222为商业上可获得的。将44.48ml(0.33mol)的化合物 222用吡啶(500mL)中的甲苯磺酰氯(25.39g，0.13mol)处理16小时。然后将反应物蒸发至油状物，溶解于EtOAc中并且用水、饱和 NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将乙酸乙酯浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用EtOAc/己烷(1:1)洗脱，接着用10％的 CH2Cl2中的甲醇洗脱，得到呈无色油状物的化合物223。LCMS和 NMR与结构一致。在室温下将10g(32.86mmol)的1-甲苯磺酰基三甘醇(化合物223)用DMSO(100mL)中的叠氮化钠(10.68g，164.28 mmol)处理17小时。然后将反应混合物倾倒在水上，并且用EtOAc 萃取。将有机层用水洗涤三次并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥，得到5.3g的化合物224(92％)。LCMS和NMR与结构一致。在惰性气氛下用4A分子筛(5g)和二氯甲烷(100mL)中的TMSOTf (1.65ml，9.11mmol)处理1-叠氮基三甘醇(化合物224，5.53g，23.69 mmol)和化合物4(6g，18.22mmol)。在14小时之后，过滤反应物以去除分子筛，并且将有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至4％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物225。LCMS和NMR 与结构一致。通过Pearlman氏催化剂在EtOAc/甲醇(4:1，250mL)中氢化化合物225(11.9g，23.59mmol)。在8小时之后，通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到化合物226。LCMS和NMR与结构一致。
为了生成化合物227，用五氟三氟乙酸酯(9.05ml，52.65mmol) 逐滴处理硝基甲烷三丙酸(4.17g，15.04mmol)和Hunig氏碱(10.3ml， 60.17mmol)在DMF(100mL)中的溶液。在30分钟之后，将反应物倾倒在冰水上并且用EtOAc萃取。将有机层用水、盐水洗涤并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且然后从庚烷中重结晶，得到呈白色固体的化合物227。LCMS和NMR与结构一致。将化合物227 (1.5g，1.93mmol)和化合物226(3.7g，7.74mmol)在室温下在乙腈(15 mL)中搅拌2小时。然后将反应物蒸发至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至10％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物228。LCMS 和NMR与结构一致。在氢气气氛中，用乙醇(100mL)中的雷尼镍(约 2g湿润)处理化合物228(1.7g，1.02mmol)。在12小时之后，通过过滤去除催化剂并且将有机层蒸发至固体，所述固体直接用于下一步。LCMS和NMR与结构一致。用DMF(5mL)中的苯甲基戊二酸 (0.18g，0.8mmol)、HBTU(0.3g，0.8mmol)和DIEA(273.7μl，1.6 mmol)处理此固体(0.87g，0.53mmol)。在16小时之后，在减压下在 65℃下去除DMF至油状物，并且将油状物溶解于二氯甲烷。将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。在有机层蒸发之后，通过柱色谱法纯化化合物并且用2％至20％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到偶联的产物。LCMS和NMR与结构一致。将苯甲酯在氢气气氛下用Pearlman氏催化剂去保护，持续1小时。然后通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到酸。LCMS和NMR 与结构一致。将酸(486mg，0.27mmol)溶解于干燥DMF(3mL)中。添加吡啶(53.61μl，0.66mmol)并且用氩气吹扫反应物。将五氟三氟乙酸酯(46.39μl，0.4mmol)缓慢添加至反应混合物中。反应物的颜色从浅黄色变为酒红色，并且放出轻烟，所述轻烟用氩气流吹走。使反应物在室温下搅拌一小时(通过LCMS证实反应完全)。在减压(旋转蒸发仪)下在70℃下去除溶剂。将残余物用DCM稀释并且用1N NaHSO4、盐水洗涤，再次用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机物通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩至干燥，得到225mg的呈易碎黄色泡沫的化合物229。LCMS和NMR与结构一致。
使用实施例46中说明的一般工序由化合物229制备包含 GalNAc3-23缀合物基团的低聚化合物230。GalNAc3-23缀合物基团的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-23a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc3-23(GalNAc3-23a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380003521
实施例77：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。
表64
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003522
Figure BDA0002559814380003531
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例 71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表64中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003532
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表65中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 SRB-1 mRNA水平。
表65
SRB-1mRNA(％盐水)
Figure BDA0002559814380003541
使用标准方案，还测量了血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和 BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表66中示出。
表66
Figure BDA0002559814380003551
实施例78：通过包含GalNAc3缀合物的靶向血管紧张素原的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对血压正常的斯普拉道来大鼠中的血管紧张素原(AGT)的反义抑制。
表67
靶向AGT的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003561
“GalNAc3-1a”的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表67中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性斯普拉道来大鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将大鼠处死。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003562
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc. Eugene,OR)根据标准方案测量AGT肝脏mRNA水平。用1:20,000 稀释的血浆使用总血管紧张素原ELISA(目录号JP27412,IBL International,Toronto,ON)来测量AGT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的肝脏中AGT mRNA水平或血浆中 AGT蛋白水平的平均百分比呈现。
如表68中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表68
AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380003571
使用标准方案，在处死时还测量了血浆中的肝脏转氨酶水平(即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST))和体重。结果在以下表69中示出。
表69
肝脏转氨酶水平和大鼠体重
Figure BDA0002559814380003572
实施例79：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表70中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表70
靶向APOC-III的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003581
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例 46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
用列于表70中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的六至八周龄转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后72小时、1周、2周、 3周、4周、5周和6周时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现，表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出比不具有缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 304801)更长的作用持续时间，即使母体剂量为包含 GalNAc缀合物基团的寡核苷酸剂量的三倍也是如此。
表71
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
Figure BDA0002559814380003591
Figure BDA0002559814380003601
实施例80：通过包含GalNAc3缀合物的靶向α-抗胰蛋白酶(A1AT) 的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表72中的寡核苷酸对小鼠中的A1AT的剂量依赖性抑制。
表72
靶向A1AT的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003611
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例 46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003612
RNA 定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定A1AT 肝脏mRNA水平。使用小鼠α1-抗胰蛋白酶ELISA(目录号41-A1AMS-E01,Alpco,Salem,NH)测定A1AT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平的平均百分比呈现。
如表73中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 A1AT肝脏mRNA和A1AT血浆蛋白水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比母体(ISIS 476366)显著更有效。
表73
A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380003621
使用标准方案在处死时测量血浆中的肝脏转氨酶和BUN水平。还测量了体重和器官重量。结果在以下表74中示出。体重以相对于基线的％示出。器官重量以相对于PBS对照组的体重的％示出。
表74
Figure BDA0002559814380003631
实施例81：包含GalNAc3聚簇的靶向A1AT的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表72中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性 C57BL/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定基线并且在剂量之后5天、12天、19天和25天时抽血。通过 ELISA测量血浆A1AT蛋白水平(参见实施例80)。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆A1AT蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸更有效并且比缺乏GalNAc 缀合物的母体(ISIS 476366)具有更长的作用持续时间。此外，包含 5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 678381、678382、678383和678384) 通常比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656326)甚至更有效并且作用持续时间甚至更长。
表75
小鼠中的血浆A1AT蛋白水平
Figure BDA0002559814380003641
Figure BDA0002559814380003651
实施例82：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体外反义抑制
在处理之前2小时，以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝脏肝细胞接种于96孔平板中。以2、10、50或250nM在Williams E培养基中添加列于表76中的寡核苷酸，并且将细胞在37℃下在5％CO2中孵育过夜。在寡核苷酸添加之后16小时使细胞裂解，并且使用RNease3000BioRobot(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003653
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定 SRB-1mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示，包含各种不同GalNAc缀合物基团和各种不同可裂解部分的寡核苷酸在体外自由摄取实验中比缺乏GalNAc缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS353382和666841)显著更有效。
表76
SRB-1表达的体外抑制
Figure BDA0002559814380003652
Figure BDA0002559814380003661
Figure BDA0002559814380003671
Figure BDA0002559814380003681
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-5a在实施例49中示出，GalNAc3-6a在实施例51 中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-8a在实施例47中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-12a在实施例61中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，GalNAc3-14a在实施例63中示出，GalNAc3-15a在实施例64中示出，GalNAc3-17a在实施例68中示出，GalNAc3-18a在实施例69中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
实施例83：通过包含GalNAc3聚簇的靶向因子XI的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表77中的寡核苷酸对小鼠中的因子XI 的剂量依赖性抑制。
表77
靶向因子XI的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003691
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例 46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用以下列出的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将小鼠处死。根据标准方案使用实时PCR测量因子XI肝脏mRNA水平并且归一化为亲环蛋白。还测量了肝脏转氨酶、BUN和胆红素。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的平均百分比呈现。
如表78中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子XI肝脏mRNA。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效。此外，包含5’-GalNAc 缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效。
表78
因子XI肝脏mRNA、肝脏转氨酶、BUN和胆红素水平
Figure BDA0002559814380003701
Figure BDA0002559814380003711
实施例84：包含GalNAc3缀合物的靶向因子XI的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表77中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表77中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天通过尾部放血抽血以确定基线并且在剂量之后3天、10天和17天时抽血。使用来自 R&D Systems,Minneapolis,MN的因子XI捕获和生物素化的检测抗体(分别为目录号AF2460和BAF2460)和OptEIA Reagent Set B(目录号550534,BDBiosciences,San Jose,CA)通过ELISA测量血浆因子XI 蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆因子 XI蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效且作用持续时间更长。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、 678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸 (ISIS 656173)更有效并且作用持续时间甚至更长。
表79
小鼠中的血浆因子XI蛋白水平
Figure BDA0002559814380003712
Figure BDA0002559814380003721
实施例85：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表76中的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表76中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003722
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的肝脏SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
如表80和81中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。
表80
肝脏中的SRB-1 mRNA
Figure BDA0002559814380003731
表81
肝脏中的SRB-1 mRNA
Figure BDA0002559814380003732
Figure BDA0002559814380003741
还使用标准方案测量了肝脏转氨酶水平、总胆红素、BUN和体重。每个处理组的平均值在以下表82中示出。
表82
Figure BDA0002559814380003742
Figure BDA0002559814380003751
实施例86：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表83中的寡核苷酸对表达人 TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于下表中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射八周龄TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。在整个实验的各个时间点进行尾部放血，测量血浆TTR蛋白、ALT和AST水平并且报道于表85-87中。在将动物处死之后，测量血浆ALT、AST和人TTR水平以及体重、器官重量和肝脏人TTR mRNA水平。使用临床分析器(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003752
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTR mRNA水平。呈现于表 84-87中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。体重为每个单独处理组的直到处死时从基线的重量变化的平均百分比。将示出的器官重量归一化为动物的体重，然后相对于 PBS组的平均归一化器官重量呈现每个处理组的平均归一化器官重量。
在表84-87中，“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表84和85中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏 GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效。此外，包含GalNAc缀合物和混合的PS/PO核苷间键联的寡核苷酸甚至比包含GalNAc缀合物和全部PS键联的寡核苷酸更有效。
表83
靶向人TTR的寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003761
表85的图例可见于实施例74。“GalNAc3-1”的结构在实施例9 中示出。“GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。“GalNAc3-10a”的结构在实施例46中示出。“GalNAc3-13a”的结构在实施例62中示出。“GalNAc3-19a”的结构在实施例70中示出。
表84
人TTR的体内反义抑制
Figure BDA0002559814380003771
表85
人TTR的体内反义抑制
Figure BDA0002559814380003772
Figure BDA0002559814380003781
表86
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
Figure BDA0002559814380003782
Figure BDA0002559814380003791
表87
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
Figure BDA0002559814380003792
Figure BDA0002559814380003801
实施例87：单一剂量的包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试ISIS号420915和660261(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。在单一剂量研究中还测试ISIS号420915、 682883和682885(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。
处理
用100mg/kg ISIS No.420915或13.5mg/kg ISIS No.660261各自皮下注射表达人TTR的八周龄雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4 只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第 3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表88
血浆TTR蛋白水平
Figure BDA0002559814380003811
处理
用100mg/kg ISIS No.420915、10.0mg/kg ISIS No.682883或10.0 mg/kg 682885各自皮下注射表达人TTR的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表89
血浆TTR蛋白水平
Figure BDA0002559814380003812
Figure BDA0002559814380003821
表88和89中的结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 420915)更有效并且作用持续时间更长。
实施例88：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SMN的寡核苷酸进行的体内剪接调节
测试列于表90中的寡核苷酸对小鼠中的人存活运动神经元 (SMN)的剪接调节。
表90
靶向SMN的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003822
Figure BDA0002559814380003831
“GalNAc3-7a”的结构先前在实施例48中示出。“X”指示通过Gene Tools(Philomath,OR)产生的5’伯胺，并且GalNAc3-7b指示缺乏如下所示的接头的–NH-C6-O部分的GalNAc3-7a的结构：
Figure BDA0002559814380003832
ISIS号703421和703422为吗啉代寡核苷酸，其中两个寡核苷酸中的每个核苷酸为吗啉代核苷酸。
处理
用列于表91中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人SMN的六周龄转基因小鼠一次。每个处理组由2只雄性和2只雌性组成。在剂量之后3天将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定具有和不具有外显子7的肝脏人SMN mRNA水平。使用Ribogreen试剂测量总RNA。将SMN mRNA水平归一化为总mRNA，并且进一步归一化为盐水处理组的平均值。包括外显子7的SMN mRNA与缺失外显子7的SMN mRNA的所得平均比率在表91中示出。结果显示，调节剪接并包含GalNAc缀合物的完全修饰的寡核苷酸比缺乏GalNAc 缀合物的母体寡核苷酸在改变肝脏中的剪接上显著更有效。此外，对于多种修饰化学包括2’-MOE和吗啉代修饰的寡核苷酸，将维持这个趋势。
表91
靶向人SMN的寡核苷酸的体内作用
Figure BDA0002559814380003841
实施例89：通过包含GalNAc3缀合物的靶向载脂蛋白A(Apo(a)) 的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表92中的寡核苷酸对转基因小鼠中的 Apo(a)的剂量依赖性抑制。
表92
靶向Apo(a)的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003842
Figure BDA0002559814380003851
“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共六次剂量)下，每周一次用列于表92中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射八周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由3-4只动物组成。在第一次剂量前一天进行尾部放血并且每周在每次剂量之后进行尾部放血以测定血浆Apo(a)蛋白水平。在最后施用之后两天将小鼠处死。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003853
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc. Eugene,OR)根据标准方案测定Apo(a)肝脏mRNA水平。使用ELISA 测定Apo(a)血浆蛋白水平，并且测定肝脏转氨酶水平。表93中的 mRNA和血浆蛋白结果以相对于PBS处理组的处理组平均百分比呈现。将血浆蛋白水平进一步归一化为PBS组的基线(BL)值。平均绝对转氨酶水平和体重(相对于基线平均值的％)报道于表94中。
如表93中所说明，用寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低Apo(a) 肝脏mRNA和血浆蛋白水平。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效并且作用持续时间更长。如表94中所说明，转氨酶水平和体重不受寡核苷酸的影响，表明寡核苷酸为耐受良好的。
表93
Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380003852
Figure BDA0002559814380003861
表94
Figure BDA0002559814380003862
实施例90：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表95中的寡核苷酸对表达人 TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于表96中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在第一次剂量之前，进行尾部放血以测定基线(BL)处的血浆TTR蛋白水平。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用临床分析器(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003863
RNA定量试剂(Molecular Probes, Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTRmRNA水平。呈现于表96中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表96 中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效，并且包含磷酸二酯或脱氧腺苷可裂解部分的寡核苷酸与缺乏缀合物的母体相比显示出效力的显著改进(参见ISIS号 682883和666943相对于420915并且参见实施例86和87)。
表95
靶向人TTR的寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003871
Figure BDA0002559814380003881
表95的图例可见于实施例74。“GalNAc3-3a”的结构在实施例39 中示出。“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。“GalNAc3-10a”的结构在实施例46中示出。“GalNAc3-13a”的结构在实施例62中示出。
表96
人TTR的体内反义抑制
Figure BDA0002559814380003882
实施例91：通过包含GalNAc3缀合物的靶向因子VII的寡核苷酸在非人灵长类动物中进行的体内反义抑制
在非终止的剂量递增研究(non-terminal,dose escalation study)中测试列于以下表97中的寡核苷酸对猴子中的因子VII的反义抑制。
处理
用递增剂量的列于表97中的寡核苷酸或用PBS在第0天、第15 天和第29天时各自皮下注射非首次用于实验的猴子。每个处理组由 4只雄性和1只雌性组成。在第一次剂量之前并且在此后的各个时间点进行抽血以测定血浆因子VII蛋白水平。通过ELISA测量因子VII 蛋白水平。呈现于表98中的结果为相对于基线(BL)处的PBS组的平均值(刚好在第一次剂量之前取得的测量结果)的每个处理组的平均值。如表98中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子VII表达水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸与缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸相比在猴子中显著更有效。
表97
靶向因子VII的寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003891
表97的图例可见于实施例74。“GalNAc3-10a”的结构在实施例46 中示出。
表98
因子VII血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380003892
Figure BDA0002559814380003901
实施例92：通过包含GalNAc3缀合物的靶向Apo-CIII的反义寡核苷酸在原代肝细胞中进行的反义抑制
以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝细胞接种于96孔平板中，并且以0.46nM、1.37nM、4.12nM或12.35nM、37.04nM、111.11nM或 333.33nM或1.00μM添加靶向小鼠ApoC-III的列于表99中的寡核苷酸。在用寡核苷酸孵育24小时之后，使细胞裂解并且使用RNeasy(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380003903
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.)根据标准方案测定ApoC-III mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示无论可裂解部分是否为磷酸二酯或磷酸二酯连接的脱氧腺苷，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸均比缺乏缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表99
小鼠原代肝细胞中小鼠APOC-III表达的抑制
Figure BDA0002559814380003902
Figure BDA0002559814380003911
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例 39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例 46中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，并且GalNAc3-19a在实施例70中示出。
实施例93：通过包含混合翼和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1 的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表100中的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。
表100
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003912
Figure BDA0002559814380003921
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
处理
在以下示出的剂量下用列于表100中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。如表101中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物并具有为全部cEt或混合糖修饰的翼的缺口聚物寡核苷酸比缺乏缀合物并包含全部cEt修饰的翼的母体寡核苷酸显著更有效。
还测量了体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN，并且每个处理组的平均值在表101中示出。体重以相对于刚好在寡核苷酸剂量之前测量的基线体重的体重平均百分比(％BL)示出。
表101
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
Figure BDA0002559814380003931
实施例94：通过包含2’-糖修饰和5’-GalNAc3缀合物的靶向 SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表102中的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。
表102
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003941
下标“m”指示2’-O-甲基修饰的核苷。对于完整的表格图例参见实施例74。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a 的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表103中示出并且显示包含GalNAc缀合物的2’-MOE和2’-OMe修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物的相应母体寡核苷酸显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表103
SRB-1 mRNA
Figure BDA0002559814380003942
Figure BDA0002559814380003951
实施例95：通过包含双环核苷和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表104中的寡核苷酸对小鼠中的 SRB-1的反义抑制。
表104
靶向SRB-1的修饰ASO
Figure BDA0002559814380003952
Figure BDA0002559814380003961
下标“g”指示氟-HNA核苷，下标“l”指示包含2’-O-CH2-4’桥联的锁核苷。对于其他其他缩写参见实施例74表格图例。GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表105中示出并且显示包含GalNAc缀合物和各种双环核苷修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含双环核苷修饰的母体寡核苷酸显著更有效。此外，包含GalNAc缀合物和氟-HNA修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含氟 -HNA修饰的母体显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN 测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表105
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
Figure BDA0002559814380003962
Figure BDA0002559814380003971
实施例96：包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸的血浆蛋白结合
在超滤测定中测试靶向ApoC-III的列于表70中的寡核苷酸和靶向Apo(a)的列于表106中的寡核苷酸以便评估血浆蛋白结合。
表106
靶向Apo(a)的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003972
对于表格图例参见实施例74。GalNAc3-7a的结构先前在实施例 48中示出。
将Ultrafree-MC超滤单元(30,000NMWL，低结合再生的纤维素膜，Millipore,Bedford,MA)用300μL的0.5％Tween 80预调节并且在2000g下离心10分钟，然后用300μL的对照寡核苷酸在H2O中的 300μg/mL溶液预调节并且在2000g下离心16分钟。为了评估待用于研究中的来自表70和106的每个测试寡核苷酸对过滤器的非特异性结合，将300μL的pH7.4的寡核苷酸在H2O中的250ng/mL溶液放置于预调节的过滤器中并且在2000g下离心16分钟。通过ELISA 测定分析未过滤和过滤的样品以测定寡核苷酸浓度。对于每个样品，使用三次重复以获得平均浓度。相对于未过滤样品的过滤样品的平均浓度用来确定在不存在血浆的情况下通过过滤器回收的寡核苷酸的百分比(％回收)。
收集于K3-EDTA中的来自正常的无药物人志愿者、食蟹猴和 CD-1小鼠的冷冻全血浆样品购自Bioreclamation LLC(Westbury, NY)。在两种浓度(5μg/mL和150μg/mL)下将测试寡核苷酸添加至1.2 mL血浆等分试样中。将每个掺加的血浆样品的等分试样(300μL)放置于预调节的过滤器单元中并且在37℃下孵育30分钟，接着立即在 2000g下离心16分钟。通过ELISA分析过滤和未过滤的掺加的血浆样品的等分试样，以测定每个样品中的寡核苷酸浓度。每个浓度使用三次重复，以确定每个样品中结合和未结合的寡核苷酸的平均百分数。使用相对于未过滤样品的浓度的过滤样品的平均浓度来确定血浆中未结合至血浆蛋白的寡核苷酸的百分比(％未结合)。通过将每个寡核苷酸的％未结合除以％回收来校正非特异性结合的最终未结合寡核苷酸值。通过从100中扣除最终％未结合值来确定最终％结合寡核苷酸值。对于在每种血浆中测试的两种浓度的寡核苷酸(5μg/mL和150 μg/mL)，结果在表107中示出。结果显示GalNAc缀合物基团对血浆蛋白结合不具有显著影响。此外，具有全部PS核苷间键联的寡核苷酸和具有混合PO/PS键联的寡核苷酸均结合血浆蛋白，并且具有全部 PS键联的那些寡核苷酸比具有混合PO/PS键联的那些寡核苷酸结合血浆蛋白的程度略微更大。
表107
结合至血浆蛋白的修饰寡核苷酸的百分比
Figure BDA0002559814380003991
实施例97：包含GalNAc3缀合物基团的靶向TTR的修饰寡核苷酸
将包含GalNAc缀合物的示于表108中的寡核苷酸设计成靶向 TTR。
表108
靶向TTR的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380003992
Figure BDA0002559814380004001
表108的图例可见于实施例74。“GalNAc3-1”的结构先前在实施例9中示出。“GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。“GalNAc3-10a”的结构在实施例46中示出。“GalNAc3-13a”的结构在实施例62中示出。“GalNAc3-19a”的结构在实施例70中示出。
实施例98：在hPMBC测定中评价包含GalNAc缀合物的寡核苷酸的促炎性作用
在如实施例23和24中所描述的hPMBC测定中测试列于表109 中的寡核苷酸的促炎性作用。(对于寡核苷酸的描述参见表30、83、 95和108。)ISIS 353512为用作阳性对照的高响应者，并且其他寡核苷酸描述于表83、95和108中。使用来自一位志愿者供体的血液获得示于表109中的结果。结果显示，与具有全部PS键联的相同寡核苷酸相比，包含混合PO/PS核苷间键联的寡核苷酸产生显著较低的促炎性反应。此外，GalNAc缀合物基团在此测定中不具有显著作用。
表109
Figure BDA0002559814380004002
Figure BDA0002559814380004011
实施例99：包含GalNAc缀合物的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力
在竞争性受体结合测定中测试列于表110中的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力(对于寡核苷酸的描述，参见表76)。将竞争配体α1-酸糖蛋白(AGP)在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中用1U 神经氨酸酶-琼脂糖在37℃下孵育16小时，并且通过唾液酸测定或尺寸排阻色谱法(SEC)来证实>90％的去唾液酸化。根据Atsma等的工序使用一氯化碘来碘化AGP(参见J Lipid Res.1991Jan；32(1):173-81)。在此方法中，将去唾液酸化的α1-酸糖蛋白(de-AGP)添加至0.25M NaOH中的10mM氯化碘、Na125I和1M甘氨酸中。在室温下孵育 10分钟之后，通过利用3KDMWCO自旋柱将混合物浓缩两次来从游离的125I中分离出125I-标记的de-AGP。在配备有Agilent SEC-3柱 (7.8x300 mm)和β-RAM计数器的HPLC系统上测试蛋白质的标记效率和纯度。如下进行利用125I-标记的de-AGP和含有ASO的各种 GalNAc-聚簇的竞争实验。将人HepG2细胞(106个细胞/毫升)涂布在 6孔平板上处于2ml适当的生长培养基中。使用了用10％胎牛血清 (FBS)、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES补充的MEM培养基。将细胞分别在5％和10％CO2下在37℃下孵育16-20小时。在实验之前用不具有FBS的培养基洗涤细胞。将细胞在37℃下用1ml含有适当生长培养基的竞争混合物孵育30min，所述培养基具有2％FBS、10-8 M 125I-标记的de-AGP和浓度在10-11至10-5M范围内的含有GalNAc- 聚簇的ASO。在10-2M GalNAc糖存在下测定非特异性结合。将细胞用不具有FBS的培养基洗涤两次，以去除未结合的125I-标记的 de-AGP和竞争者GalNAc ASO。使用含有1％β-巯基乙醇的Qiagen 的RLT缓冲液使细胞裂解。在简短的10min冻/融循环之后将裂解液转移至圆底测定管中并且在γ-计数器上测定。在将125I蛋白计数除以最低GalNAc-ASO浓度计数的值之前扣除非特异性结合。使用非线性回归算法根据单一位点竞争结合方程式拟合抑制曲线以计算结合亲和力(KD’s)。
从在五个不同日子进行的实验中获得表110中的结果。用上标“a”标志的寡核苷酸的结果为在两个不同日子进行的实验的平均值。结果显示，在5’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以比在3’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸大1.5倍至16倍的亲和力结合人 HepG2细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
表110
去唾液酸糖蛋白受体结合测定结果
Figure BDA0002559814380004021
实施例100：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中测试列于以下表111a中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表111a
靶向APO(a)的修饰ASO
Figure BDA0002559814380004031
“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。
处理
每周一次用列于表111b中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雌性转基因小鼠，总共6次剂量。每个处理组由 3只动物组成。在给药前一天抽血以测定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后72小时、1周和2周时抽血。在第一次剂量之后3周、4周、5周和6周时将发生另外的抽血。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表111b中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸在Apo(a)表达中表现出蛋白质减少。对于包含全部PS核苷间键联的寡核苷酸和包含混合PO 和PS键联的寡核苷酸观察到这种有效作用。
表111b
Apo(a)血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380004032
Figure BDA0002559814380004041
实施例101：通过包含经由稳定部分连接的GalNAc聚簇的寡核苷酸进行的反义抑制
测试列于表112中的寡核苷酸对小鼠APOC-III表达的体内抑制。用列于表112中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射C57Bl/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。用ISIS440670处理的每只小鼠接受2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg的剂量。用ISIS 680772 或696847处理的每只小鼠接受0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20 mg/kg。ISIS 696847的GalNAc缀合物基团经由稳定部分连接，所述稳定部分为硫代磷酸酯键联而不是能够易于裂解的含磷酸二酯的键联。在剂量之后72小时将动物处死。使用实时PCR测量肝脏APOC-III mRNA水平。根据标准方案将APOC-III mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的APOC-III mRNA水平的平均百分比呈现于表112中。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸比缺乏缀合物基团的寡核苷酸显著更有效。此外，包含经由可裂解部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 680772)甚至比包含经由稳定部分连接至寡核苷酸的 GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 696847)更有效。
表112
靶向小鼠APOC-III的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380004042
Figure BDA0002559814380004051
“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。
实施例102：包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸在肝脏中的分布
评价了不包含GalNAc缀合物的ISIS 353382(参见表36)和包含 GalNAc缀合物的ISIS 655861(参见表36)的肝脏分布。以列于表113 中的剂量用ISIS 353382或655861皮下注射雄性balb/c小鼠一次。每个处理组由3只动物组成，除了ISIS 655861的18mg/kg组，所述组由2只动物组成。在剂量之后48小时将动物处死以确定寡核苷酸的肝脏分布。为了测量每个细胞的反义寡核苷酸分子的数量，将钌(II) 三-联吡啶标签(MSD TAG，Meso ScaleDiscovery)缀合至用来检测反义寡核苷酸的寡核苷酸探针。呈现于表113中的结果为以百万个寡核苷酸分子/细胞单位计的每个处理组的寡核苷酸的平均浓度。结果显示，在等效剂量下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc 缀合物的寡核苷酸以更高的浓度存在于总肝脏和肝细胞中。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更低的浓度存在于非实质肝脏细胞中。虽然ISIS 655861在肝细胞和非实质肝脏细胞中的浓度为每个细胞类似的，但是肝脏大约为80体积％肝细胞。因此，存在于肝脏中的大多数ISIS 655861寡核苷酸见于肝细胞中，而存在于肝脏中的大多数ISIS 353382寡核苷酸见于非实质肝脏细胞中。
表113
Figure BDA0002559814380004061
实施例103：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表114中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表114
靶向APOC-III的修饰ASO
Figure BDA0002559814380004062
Figure BDA0002559814380004071
GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出，并且GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
处理
用列于表114中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人 APOC-III的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后3天、7天、14天、21天、 28天、35天和42天时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。表115中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现。实施例79的表71中的结果与以下表115中的结果的比较显示，包含磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键联的混合物的寡核苷酸表现出比仅包含硫代磷酸酯核苷间键联的相当(equivalent)寡核苷酸增加的作用持续时间。
表115
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
Figure BDA0002559814380004072
Figure BDA0002559814380004081
实施例104：包含5’-GalNAc2缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004091
化合物120为商业上可获得的，并且化合物126的合成描述于实施例49中。将化合物120(1g，2.89mmol)、HBTU(0.39g，2.89mmol) 以及HOBt(1.64g，4.33mmol)溶解于DMF(10mL中，并且添加N,N- 二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)。在约5min之后，将氨基己酸苄基酯(1.36g，3.46mmol)添加至反应物中。在3h之后，将反应混合物倾入100mL的1M NaHSO4中并且用2x50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并且用3x40mL饱和NaHCO3和2x盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM:EA:Hex，1:1:1)纯化产物，得到化合物231。LCMS和NMR与结构一致。将化合物231(1.34 g，2.438mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中并且添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物在减压下浓缩并且与甲苯共蒸发(3x10mL)。在减压下干燥残余物，得到呈三氟乙酸盐的化合物 232。化合物166的合成描述于实施例54中。将化合物166(3.39g， 5.40mmol)溶解于DMF(3mL)中。将化合物232(1.3g，2.25mmol) 的溶液溶解于DMF(3mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.55mL)。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后倾入水(80mL)并且用EtOAc (2x100 mL)萃取水层。将有机相分离并且用饱和NaHCO3水溶液(3x 80mL)、1M NaHSO4(3x80mL)和盐水(2x80mL)洗涤，然后干燥 (Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到化合物233。LCMS和NMR与结构一致。将化合物233(0.59g，0.48mmol) 溶解于甲醇(2.2mL)和乙酸乙酯(2.2mL)中。添加钯/碳(10重量％ Pd/C，湿，0.07g)并且将反应混合物在氢气气氛下搅拌3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且浓缩以得到羧酸。将羧酸(1.32g，1.15 mmol，不含聚簇的酸)溶解于DMF(3.2mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(0.3mL，1.73mmol)和PFPTFA(0.30mL，1.73mmol)。在室温下搅拌30min之后，将反应混合物倾入水(40mL)中并且用 EtOAc(2x50mL)萃取。如上所述完成标准的后处理，得到化合物 234。LCMS和NMR与结构一致。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸235。缀合物基团GalNAc2-24的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-24a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc2-24(GalNAc2-24a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004101
实施例105：包含GalNAc1-25缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004102
化合物166的合成描述于实施例54中。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸236。
或者，使用以下示出的方案合成寡核苷酸236，并且使用实施例 10中描述的工序使用化合物238来形成寡核苷酸236。
Figure BDA0002559814380004111
缀合物基团GalNAc1-25的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-25a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。 GalNAc1-25(GalNAc1-25a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004112
实施例106：通过包含5’-GalNAc2或5’-GalNAc3缀合物的靶向 SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表116和117中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
处理
用2mg/kg、7mg/kg或20mg/kg的ISIS No.440762，或用0.2 mg/kg、0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg的ISIS No.686221、686222或708561，或用盐水皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏 SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平，并且ED50结果呈现于表116和117中。尽管先前的研究示出三价的GalNAc缀合的寡核苷酸比二价的GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效，所述二价的GalNAc缀合的寡核苷酸继而比一价的 GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效(参见例如Khorev等,Bioorg.&Med.Chem.,第16卷,5216-5231(2008))，用包含一价、二价以及三价的GalNAc聚簇的反义寡核苷酸处理以如表116和117中所示的相似效力降低SRB-1 mRNA水平。
表116
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380004121
对于表格图例，参见实施例93。GalNAc3-13a的结构在实施例62 中示出，并且GalNAc2-24a的结构在实施例104中示出。
表117
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002559814380004122
Figure BDA0002559814380004131
对于表格图例，参见实施例93。“GalNAc1-25a”的结构在实施例 105中示出。
使用实施例75中描述的工序，还评价了表116和117中的寡核苷酸在肝脏中的浓度。如通过UV以μg寡核苷酸/克肝脏组织的单位所测量，示于以下表117a和117b中的结果为每个处理组的平均总反义寡核苷酸组织水平。结果显示，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以显著高于相同剂量的缺乏GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的水平在肝脏中积累。此外，在其相应缀合物基团中包含一个、两个或三个 GalNAc配体的反义寡核苷酸均以类似水平在肝脏中积累。由以上引用的Khorev等参考文献来看此结果为令人惊奇的并且与示于以上表 116和117中的活性数据一致。
表117a
包含GalNAc2或GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
Figure BDA0002559814380004132
表117b
包含GalNAc1缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
Figure BDA0002559814380004141
实施例107：包含GalNAc1-26或GalNAc1-27缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004142
通过使用DMF中的HBTU和DIEA将化合物47(参见实施例15) 偶联至酸64(参见实施例32)来合成寡核苷酸239。将所得到的含酰胺化合物亚磷酸酯化，然后使用实施例10中描述的工序添加至寡核苷酸的5’-末端。缀合物基团GalNAc1-26的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-26a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-26(GalNAc1-26a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004143
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用实施例7中描述的工序将由化合物47和64反应所形成的酰胺添加至固体载体上。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸240。
Figure BDA0002559814380004151
缀合物基团GalNAc1-27的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-27a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-27(GalNAc1-27a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004152
实施例108：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中在小鼠中测试列于以下表118中的寡核苷酸。
表118
靶向APO(a)的修饰ASO
Figure BDA0002559814380004153
Figure BDA0002559814380004161
“GalNAc3-7a”的结构在实施例48中示出。
处理
用列于表119中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后1周时抽血。另外的抽血将每周发生，持续大约8周。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表119中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明反义寡核苷酸减少了Apo(a)蛋白表达。此外，包含 GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡核苷酸更有效的Apo(a)表达减少。
表119
Apo(a)血浆蛋白水平
Figure BDA0002559814380004162
Figure BDA0002559814380004171
实施例109：包含GalNAc1-28或GalNAc1-29缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004172
使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成亚磷酰胺中间体，接着使用实施例10中描述的工序合成寡核苷酸来合成寡核苷酸 241。缀合物基团GalNAc1-28的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-28a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-28(GalNAc1-28a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004173
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成羟基中间体，然后使用实施例7中描述的工序将所述羟基中间体添加至固体载体。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸242。
Figure BDA0002559814380004174
缀合物基团GalNAc1-29的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-29a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。 GalNAc1-29(GalNAc1-29a-CM-)的结构如下所示：
Figure BDA0002559814380004181
实施例110：包含GalNAc1-30缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004182
如上所示，合成包含GalNAc1-30缀合物基团的寡核苷酸246，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc1-30的GalNAc1聚簇部分 (GalNAc1-30a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，Y为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，Y为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。“GalNAc1-30a”的结构示出如下：
Figure BDA0002559814380004191
实施例111：包含GalNAc2-31或GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成
Figure BDA0002559814380004192
如上所示，合成包含GalNAc2-31缀合物基团的寡核苷酸250，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-31的GalNAc2聚簇部分 (GalNAc2-31a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。“GalNAc2-31a”的结构示出如下：
Figure BDA0002559814380004201
以下示出包含GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成。
Figure BDA0002559814380004202
如上所示，合成包含GalNAc2-32缀合物基团的寡核苷酸252，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-32的GalNAc2聚簇部分 (GalNAc2-32a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。“GalNAc2-32a”的结构示出如下：
Figure BDA0002559814380004211
实施例112：包含GalNAc1缀合物的修饰寡核苷酸
用GalNAc1缀合物基团合成靶向SRB-1的表120中的寡核苷酸，以便进一步测试包含含有一个GalNAc配体的缀合物基团的寡核苷酸的效力。
表120
Figure BDA0002559814380004212
Figure BDA0002559814380004221
实施例113：包含GalNAc缀合物基团的靶向血管生成素样蛋白 3的反义寡核苷酸
将表121中的寡核苷酸设计成靶向人血管生成素样蛋白 3(ANGPTL3)。
表121
Figure BDA0002559814380004231
实施例114：靶向人ANGPTL3的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在以下示出的剂量(总共两次剂量)下，每周一次用列于表122中 (和描述于表121中)的寡核苷酸或用PBS各自腹膜内注射六周龄雄性转基因C57Bl/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后两天将小鼠处死。使用实时PCR和
Figure BDA0002559814380004232
RNA定量试剂 (Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测量ANGPTL3肝脏 mRNA水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的肝脏中 ANGPTL3 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表122中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低 ANGPTL3肝脏mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表122
ANGPTL3肝脏mRNA水平
Figure BDA0002559814380004241
还使用标准方案在处死时测量肝脏丙氨酸转氨酶(ALT)水平。结果显示无一处理组具有升高的ALT水平，这表明寡核苷酸的耐受性良好。
实施例115：靶向小鼠ANGPTL3的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中在小鼠中测试列于以下表123中的寡核苷酸。
表123
靶向小鼠ANGPTL3的修饰ASO
Figure BDA0002559814380004242
Figure BDA0002559814380004251
“GalNAc3-7a”的结构先前在实施例48中示出。
对低密度脂蛋白受体敲除(LDLR-/-)小鼠饲喂西方膳食1周，之后每周一次以如下所示的剂量用表123列出的寡核苷酸或用PBS腹膜内注射。每个处理组由5只动物组成。在施用第一剂量之前(以确定血浆中甘油三酯的基线水平)和第一次剂量之后2周时抽血。表124中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的甘油三酯水平的平均百分比呈现，所述结果表明反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低甘油三酯。此外，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡核苷酸更有效的甘油三酯的减少。
表124
血浆甘油三酯(TG)水平
Figure BDA0002559814380004252
实施例116：在Hep3B细胞中由MOE缺口聚物对人血管生成素样蛋白3的反义抑制
设计靶向血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)核酸的反义寡核苷酸且测试其在体外对ANGPTL3 mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人类引物探针集RTS3492_MGB(正向序列CCGTGGAAGACC AATATAAACAATT，在本文中指定为SEQ ID NO:4；AGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCT；反向序列，在本文中指定为SEQ ID NO:5；探针序列AACCAACAGCATAGTCAAATA，在本文中指定为 SEQ ID NO:6)测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380004261
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S) 键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号 NM_014495.2)的人ANGPTL3 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO: 2(从核苷酸33032001至33046000截短的GENBANK登录号 NT_032977.9)的人ANGPTL3基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表125
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004271
Figure BDA0002559814380004281
Figure BDA0002559814380004291
Figure BDA0002559814380004301
表126
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004311
Figure BDA0002559814380004321
Figure BDA0002559814380004331
Figure BDA0002559814380004341
Figure BDA0002559814380004351
表127
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004352
Figure BDA0002559814380004361
Figure BDA0002559814380004371
Figure BDA0002559814380004381
Figure BDA0002559814380004391
表128
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004392
Figure BDA0002559814380004401
Figure BDA0002559814380004411
Figure BDA0002559814380004421
Figure BDA0002559814380004431
表129
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004432
Figure BDA0002559814380004441
Figure BDA0002559814380004451
Figure BDA0002559814380004461
Figure BDA0002559814380004471
表130
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004472
Figure BDA0002559814380004481
Figure BDA0002559814380004491
Figure BDA0002559814380004501
Figure BDA0002559814380004511
Figure BDA0002559814380004521
表131
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004522
Figure BDA0002559814380004531
Figure BDA0002559814380004541
Figure BDA0002559814380004551
Figure BDA0002559814380004561
Figure BDA0002559814380004571
Figure BDA0002559814380004581
Figure BDA0002559814380004591
Figure BDA0002559814380004601
Figure BDA0002559814380004611
Figure BDA0002559814380004621
Figure BDA0002559814380004631
表132
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004641
Figure BDA0002559814380004651
Figure BDA0002559814380004661
Figure BDA0002559814380004671
Figure BDA0002559814380004681
Figure BDA0002559814380004691
Figure BDA0002559814380004701
Figure BDA0002559814380004711
Figure BDA0002559814380004721
Figure BDA0002559814380004731
Figure BDA0002559814380004741
Figure BDA0002559814380004751
Figure BDA0002559814380004761
Figure BDA0002559814380004771
Figure BDA0002559814380004781
Figure BDA0002559814380004791
Figure BDA0002559814380004801
Figure BDA0002559814380004811
Figure BDA0002559814380004821
表133
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380004822
Figure BDA0002559814380004831
Figure BDA0002559814380004841
Figure BDA0002559814380004851
Figure BDA0002559814380004861
Figure BDA0002559814380004871
Figure BDA0002559814380004881
Figure BDA0002559814380004891
Figure BDA0002559814380004901
Figure BDA0002559814380004911
Figure BDA0002559814380004921
Figure BDA0002559814380004931
Figure BDA0002559814380004941
Figure BDA0002559814380004951
Figure BDA0002559814380004961
Figure BDA0002559814380004971
Figure BDA0002559814380004981
Figure BDA0002559814380004991
Figure BDA0002559814380005001
Figure BDA0002559814380005011
表134
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005012
Figure BDA0002559814380005021
Figure BDA0002559814380005031
Figure BDA0002559814380005041
Figure BDA0002559814380005051
Figure BDA0002559814380005061
Figure BDA0002559814380005071
Figure BDA0002559814380005081
Figure BDA0002559814380005091
Figure BDA0002559814380005101
Figure BDA0002559814380005111
Figure BDA0002559814380005121
Figure BDA0002559814380005131
Figure BDA0002559814380005141
Figure BDA0002559814380005151
Figure BDA0002559814380005161
Figure BDA0002559814380005171
Figure BDA0002559814380005181
Figure BDA0002559814380005191
Figure BDA0002559814380005201
表135
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005202
Figure BDA0002559814380005211
Figure BDA0002559814380005221
Figure BDA0002559814380005231
Figure BDA0002559814380005241
Figure BDA0002559814380005251
Figure BDA0002559814380005261
Figure BDA0002559814380005271
Figure BDA0002559814380005281
Figure BDA0002559814380005291
Figure BDA0002559814380005301
Figure BDA0002559814380005311
表136
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005321
Figure BDA0002559814380005331
Figure BDA0002559814380005341
Figure BDA0002559814380005351
Figure BDA0002559814380005361
Figure BDA0002559814380005371
Figure BDA0002559814380005381
Figure BDA0002559814380005391
Figure BDA0002559814380005401
Figure BDA0002559814380005411
Figure BDA0002559814380005421
Figure BDA0002559814380005431
表137
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005432
Figure BDA0002559814380005441
Figure BDA0002559814380005451
Figure BDA0002559814380005461
Figure BDA0002559814380005471
Figure BDA0002559814380005481
Figure BDA0002559814380005491
Figure BDA0002559814380005501
Figure BDA0002559814380005511
Figure BDA0002559814380005521
Figure BDA0002559814380005531
Figure BDA0002559814380005541
Figure BDA0002559814380005551
Figure BDA0002559814380005561
Figure BDA0002559814380005571
Figure BDA0002559814380005581
Figure BDA0002559814380005591
Figure BDA0002559814380005601
Figure BDA0002559814380005611
Figure BDA0002559814380005621
表138
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005622
Figure BDA0002559814380005631
Figure BDA0002559814380005641
Figure BDA0002559814380005651
实施例117：在Hep3B细胞中由MOE缺口聚物对人ANGPTL3 的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的5-10-5MOE缺口聚物且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.75μM、1.50μM、3.00μM、6.00μM以及12.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集 RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380005652
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表139
Figure BDA0002559814380005661
实施例118：在Hep3B细胞中由MOE缺口聚物对人ANGPTL3 的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的5-10-5MOE缺口聚物且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.813μM、1.625μM、3.25μM、6.50μM以及13.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA 且通过定量实时PCR测量ANGPTL3mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380005662
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表140
Figure BDA0002559814380005671
表141
Figure BDA0002559814380005672
Figure BDA0002559814380005681
表142
Figure BDA0002559814380005682
表143
Figure BDA0002559814380005683
Figure BDA0002559814380005691
表144
Figure BDA0002559814380005692
表145
Figure BDA0002559814380005693
Figure BDA0002559814380005701
表146
Figure BDA0002559814380005702
表147
Figure BDA0002559814380005703
Figure BDA0002559814380005711
实施例119：在Hep3B细胞中由脱氧、MOE及(S)-cEt缺口聚物对人ANGPTL3的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的额外的反义寡核苷酸且测试其在体外对ANGPTL3 mRNA的作用。使用电穿孔以4,500nM的反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在约24 小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量 ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量 mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380005712
所测量的总RNA含量调整 ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的 ANGPTL3的抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计作为脱氧、MOE以及 (S)-cEt寡核苷酸。脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧糖残基。每个反义寡核苷酸的糖修饰被描述为“eek-d10-kke”，其中“k”表示(S)-cEt糖修饰；“d”表示脱氧核糖；数字表示脱氧核糖糖类残基的数量；并且“e”表示MOE糖修饰。每个寡核苷酸整个的核苷间键联为硫代磷酸酯 (P＝S)键联。整个各寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中寡核苷酸所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中寡核苷酸所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个寡核苷酸靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK 登录号NM_014495.2)的人ANGPTL3 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(从核苷酸33032001至33046000截短的GENBANK登录号 NT_032977.9)的人ANGPTL3基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表148
由靶向SEQ ID NO:1和2的脱氧、MOE及cEt寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005721
Figure BDA0002559814380005731
Figure BDA0002559814380005741
Figure BDA0002559814380005751
Figure BDA0002559814380005761
Figure BDA0002559814380005771
表149
由靶向SEQ ID NO:1和2的脱氧、MOE及(S)-cEt缺口聚物对 ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005781
Figure BDA0002559814380005791
Figure BDA0002559814380005801
Figure BDA0002559814380005811
实施例120：在Hep3B细胞中由脱氧、MOE及(S)-cEt缺口聚物对人ANGPTL3的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的额外的反义寡核苷酸且测试其在体外对ANGPTL3 mRNA的作用。5-10-5MOE缺口聚物ISIS337487和ISIS233717，也被包括在测定中作为基准寡核苷酸。使用电穿孔以 4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的 Hep3B细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集 RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380005821
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计作为脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸或5-10-5MOE缺口聚物。脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧糖残基。每个反义寡核苷酸的糖修饰被描述为“eek-d10-kke”，其中“k”表示(S)-cEt糖修饰；“d”表示脱氧核糖；数字表示脱氧核糖糖类残基的数量；并且“e”表示MOE修饰。5-10-5MOE 缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。每个寡核苷酸整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。整个各寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中寡核苷酸所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中寡核苷酸所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个寡核苷酸靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_014495.2)的人 ANGPTL3 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(从核苷酸 33032001至33046000截短的GENBANK登录号NT_032977.9)的人ANGPTL3基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表150
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380005831
Figure BDA0002559814380005841
Figure BDA0002559814380005851
Figure BDA0002559814380005861
Figure BDA0002559814380005871
Figure BDA0002559814380005881
Figure BDA0002559814380005891
Figure BDA0002559814380005901
Figure BDA0002559814380005911
Figure BDA0002559814380005921
Figure BDA0002559814380005931
Figure BDA0002559814380005941
Figure BDA0002559814380005951
Figure BDA0002559814380005961
Figure BDA0002559814380005971
Figure BDA0002559814380005981
Figure BDA0002559814380005991
Figure BDA0002559814380006001
表151
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380006002
Figure BDA0002559814380006011
Figure BDA0002559814380006021
Figure BDA0002559814380006031
Figure BDA0002559814380006041
Figure BDA0002559814380006051
Figure BDA0002559814380006061
Figure BDA0002559814380006071
Figure BDA0002559814380006081
Figure BDA0002559814380006091
Figure BDA0002559814380006101
Figure BDA0002559814380006111
表152
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380006112
Figure BDA0002559814380006121
Figure BDA0002559814380006131
Figure BDA0002559814380006141
Figure BDA0002559814380006151
Figure BDA0002559814380006161
Figure BDA0002559814380006171
Figure BDA0002559814380006181
Figure BDA0002559814380006191
Figure BDA0002559814380006201
Figure BDA0002559814380006211
Figure BDA0002559814380006221
表153
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380006222
Figure BDA0002559814380006231
Figure BDA0002559814380006241
Figure BDA0002559814380006251
Figure BDA0002559814380006261
Figure BDA0002559814380006271
Figure BDA0002559814380006281
Figure BDA0002559814380006291
Figure BDA0002559814380006301
Figure BDA0002559814380006311
Figure BDA0002559814380006321
Figure BDA0002559814380006331
Figure BDA0002559814380006341
Figure BDA0002559814380006351
Figure BDA0002559814380006361
Figure BDA0002559814380006371
Figure BDA0002559814380006381
Figure BDA0002559814380006391
Figure BDA0002559814380006401
Figure BDA0002559814380006411
表154
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380006412
Figure BDA0002559814380006421
Figure BDA0002559814380006431
Figure BDA0002559814380006441
Figure BDA0002559814380006451
Figure BDA0002559814380006461
Figure BDA0002559814380006471
Figure BDA0002559814380006481
Figure BDA0002559814380006491
Figure BDA0002559814380006501
Figure BDA0002559814380006511
Figure BDA0002559814380006521
Figure BDA0002559814380006531
Figure BDA0002559814380006541
实施例121：在Hep3B细胞中由MOE缺口聚物对人ANGPTL3 的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的额外的反义寡核苷酸且测试其在体外对ANGPTL3 mRNA的作用。使用电穿孔以4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380006552
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA 水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE或 3-10-4MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。3-10-4MOE缺口聚物的长度为17 个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和 3’方向上分别侧接包含三和四个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最 3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_014495.2)的人ANGPTL3 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(从核苷酸33032001至33046000截短的GENBANK登录号NT_032977.9)的人ANGPTL3基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表155
由靶向SEQ ID NO:1和2的MOE缺口聚物对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0002559814380006551
Figure BDA0002559814380006561
Figure BDA0002559814380006571
Figure BDA0002559814380006581
Figure BDA0002559814380006591
实施例122：在Hep3B细胞中对人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的脱氧、MOE及cEt寡核苷酸且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。在研究中还包括5-10-5MOE缺口聚物，ISIS233717和ISIS 337847。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下单独表格中。
将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.813μM、1.625μM、3.25μM、6.500μM以及13.00μM 浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380006592
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表156
Figure BDA0002559814380006601
表157
Figure BDA0002559814380006602
表158
Figure BDA0002559814380006603
Figure BDA0002559814380006611
表159
Figure BDA0002559814380006612
实施例123：在Hep3B细胞中对人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的脱氧、MOE及cEt寡核苷酸且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。在研究中还包括5-10-5MOE缺口聚物ISIS337847。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下单独表格中。
将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.160μM、0.481μM、1.444μM、4.333μM以及13.00μM 浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380006622
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
表160
Figure BDA0002559814380006621
表161
Figure BDA0002559814380006631
表162
Figure BDA0002559814380006632
实施例124：在Hep3B细胞中由MOE缺口聚物对人ANGPTL3 的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上实施例且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的MOE缺口聚物且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。将细胞以 20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.160 μM、0.481μM、1.444μM、4.333μM以及13.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集 RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380006642
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表163
Figure BDA0002559814380006641
实施例125：在Hep3B细胞中由脱氧、MOE及cEt寡核苷酸对人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对ANGPTL3 mRNA展现显著的体外抑制的脱氧、MOE及cEt寡核苷酸且在Hep3B细胞中以各种剂量测试。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.111μM、0.333μM、1.00μM、3.00μM以及9.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离 RNA且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3492_MGB测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002559814380006653
所测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的ANGPTL3的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
表164
Figure BDA0002559814380006651
表165
Figure BDA0002559814380006652
Figure BDA0002559814380006661
表166
Figure BDA0002559814380006662
表167
Figure BDA0002559814380006663
Figure BDA0002559814380006671
实施例126：在huANGPTL3转基因小鼠中对人ANGPTL3的反义抑制
进一步评估上述研究中所述的反义寡核苷酸在具有人ANGPTL3 转基因的C57Bl/6小鼠(Tg小鼠)中降低人ANGPTL3 mRNA转录的能力。
研究1
将雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物腹膜内注射，剂量为50mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2 周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用RTS3492_MGB 测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。还使用人引物探针集RTS1984(正向序列CTTCAATGAAACGTGGGAGAACT，在本文中指定为SEQ ID NO:7；反向序列TCTCTAGGCCCAACCAAAATTC，在本文中指定为SEQ IDNO:8；探针序列 AAATATGGTTTTGGGAGGCTTGAT，在本文中指定为SEQ ID NO:9) 来测量mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006683
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA显著减少。
表168
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006681
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白质水平降低。
表169
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006682
Figure BDA0002559814380006691
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第10天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表170
转基因小鼠中第10天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006692
研究2
将雄性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物腹膜内注射，剂量为50mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2 周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用RTS1984测量 ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS 对照的用
Figure BDA0002559814380006702
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA 显著减少。
表171
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006701
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白质水平降低。
表172
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006711
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第8天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表173
转基因小鼠中第8天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006712
Figure BDA0002559814380006721
研究3
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物腹膜内注射，剂量为2.5mg/kg、 12.5mg/kg或25mg/kg，每周一次持续3周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用hANGPTL3_LT S01022(正向序列AAATTTTAGCCAATGGCCTCC，在本文中指定为 SEQ ID NO:10；反向序列TGTCATTAATTTGGCCCTTCG，在本文中指定为SEQ ID NO:11；探针序列TCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCC，在本文中指定为SEQ ID NO:12)测量ANGPTL 3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006722
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用IS IS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA显著减少。每个缺口聚物的ED50也呈现于下表中。‘n.d.’表示不能检测到E D50。
表174
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006731
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白质水平降低。‘n.d.’表示不能检测到ED50。
表175
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006741
Figure BDA0002559814380006751
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第17天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表176
转基因小鼠中第17天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006752
Figure BDA0002559814380006761
研究4
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物腹膜内注射，剂量为25mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2 周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006762
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS 对照相比，ANGPTL3mRNA显著减少。
表177
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006771
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第10天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表178
转基因小鼠中第10天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006772
Figure BDA0002559814380006781
研究5
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物或脱氧、MOE和cEt缺口聚物腹膜内注射，剂量为25mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受 PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用RTS1984测量 ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS 对照的用
Figure BDA0002559814380006792
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA 显著减少。
表179
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006791
Figure BDA0002559814380006801
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第9天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表180
转基因小鼠中第9天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006802
Figure BDA0002559814380006811
研究6
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射，剂量为25 mg/kg，每周一次持续2周。还包括5-10-5MOE缺口聚物ISIS 233710 作为基准。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS 注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006812
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用若干ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3mRNA显著减少。
表181
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006821
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，用若干ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3 蛋白质水平降低。
表182
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006822
Figure BDA0002559814380006831
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第10天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表183
转基因小鼠中第10天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006832
Figure BDA0002559814380006841
研究7
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射，剂量为25 mg/kg，每周一次持续2周。还包括5-10-5MOE缺口聚物ISIS 233710 作为基准。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS 注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006842
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS 对照相比，ANGPTL3mRNA显著减少。
表184
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006851
Figure BDA0002559814380006861
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，用一些ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3 蛋白质水平降低。在这种情况下，“0”值意味着用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可能已经记录了增加的表达水平。
表185
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006862
Figure BDA0002559814380006871
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第9天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表186
转基因小鼠中第9天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006872
Figure BDA0002559814380006881
研究8
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射，剂量为25 mg/kg，每周一次持续2周。还包括5-10-5MOE缺口聚物ISIS 233710 作为基准。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS 注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006882
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS 对照相比，ANGPTL3mRNA显著减少。
表187
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006891
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，用ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白质水平降低。
表188
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006892
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第8天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表189
转基因小鼠中第8天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006901
研究9
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射，剂量为25 mg/kg，每周一次持续2周。还包括5-10-5MOE缺口聚物ISIS 233710 作为基准。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS 注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006912
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用一些ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3mRNA显著减少。在这种情况下，“0”值意味着用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可能已经记录了增加的表达水平。
表190
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006911
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。所述结果表示，用一些ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3 蛋白质水平降低。在这种情况下，“0”值意味着用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可能已经记录了增加的表达水平。
表191
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006921
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第9天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表192
转基因小鼠中第9天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006931
研究10
将雄性和雌性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
小鼠组接受5-10-5MOE缺口聚物或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射，剂量为5mg/kg、12.5mg/kg或25mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏提取RNA以用于使用 hANGPTL3_LTS01022，也可以使用RTS3492_MGB测量ANGPTL3 的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380006942
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用一些ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA 减少。
表193
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380006941
Figure BDA0002559814380006951
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第8天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表194
转基因小鼠中第8天的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380006952
Figure BDA0002559814380006961
实施例127：CD1小鼠中靶向人ANGPTL3的反义寡核苷酸的耐受性
Figure BDA0002559814380006963
小鼠(Charles River,MA)是经常被用于安全性和功效测试的多用途小鼠模型。将小鼠用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的改变。
研究1
向雄性CD1小鼠(每处理组一只动物)腹膜内注射单一剂量200 mg/kg的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。向一只雄性CD1小鼠皮下注射单一剂量的PBS。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第4天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表195
在第4天时CD1小鼠血浆中的血浆转氨酶水平
Figure BDA0002559814380006962
Figure BDA0002559814380006971
体重
在单一剂量的ISIS寡核苷酸一天后，测量体重并呈现于下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表196
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的体重(g)
Figure BDA0002559814380006972
Figure BDA0002559814380006981
研究2
向雄性CD1小鼠(每处理组一只动物)腹膜内注射单一剂量200 mg/kg的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。向一只雄性CD1小鼠皮下注射单一剂量的PBS。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸在第5天的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶(ALT和AST)的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表197
在第5天时CD1小鼠血浆中的血浆转氨酶水平
Figure BDA0002559814380006982
Figure BDA0002559814380006991
体重
在单一剂量的ISIS寡核苷酸5天后，测量体重并呈现于下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表198
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的体重(g)
Figure BDA0002559814380006992
Figure BDA0002559814380007001
研究3
向雄性CD1小鼠(每处理组4只动物)腹膜内注射100mg/kg的 5-10-5MOE缺口聚物，每周一次持续6周。向一组的4只雄性CD1 小鼠腹膜内注射PBS，每周一次持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸的影响，在第45天时，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量各种肝和肾功能标记物的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表199
在第45天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0002559814380007002
体重
在第43天测量体重并呈现在下表中。在研究结束时第45天测量肾脏、肝脏和脾脏的重量。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表200
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的重量(g)
Figure BDA0002559814380007011
研究4
向雄性CD1小鼠(每处理组4只动物)腹膜内注射50mg/kg或100 mg/kg的5-10-5MOE缺口聚物或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸，每周一次持续6周。向一组的4只雄性CD1小鼠腹膜内注射PBS，每周一次持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸的影响，在第46天时，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量各种肝和肾功能标记物的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表201
在第45天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0002559814380007021
体重
在第44天测量体重并呈现在下表中。在研究结束时第46天测量肾脏、肝脏和脾脏的重量。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表202
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的重量(g)
Figure BDA0002559814380007022
研究5
向雄性CD1小鼠(每处理组4只动物)腹膜内注射50mg/kg的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸，每周一次持续6周。向一组的4只雄性 CD1小鼠腹膜内注射PBS，每周一次持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS寡核苷酸的影响，在第43天时，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量各种肝和肾功能标记物的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表203
在第43天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0002559814380007031
体重
在第41天测量体重并呈现在下表中。在研究结束时第43天测量肾脏、肝脏和脾脏的重量。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表204
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的重量(g)
Figure BDA0002559814380007041
实施例128：靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸的粘度测量
测量来自上述研究的选定反义寡核苷酸的粘度，目的是筛选出具有大于40厘泊(cP)的粘度的反义寡核苷酸。具有大于40cP的粘度的寡核苷酸小于最佳的粘度。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称量到玻璃小瓶中，添加120μL的水，并通过在50℃下加热小瓶将反义寡核苷酸溶解于溶液中。将预加热的样品的一部分(75μL)移液至微量粘度计(Cambridge)。微量粘度计的温度设定为25℃并且测量样品的粘度。预加热的样品的另一部分(20μL)移液到10mL的水中，以在85℃下在260nM下UV读取 (Cary UV instrument)。结果呈现于下表中，其中每种反义寡核苷酸的浓度为350mg/ml，并且表明大部分的反义寡核苷酸溶液在上述标准下其粘度是最佳的。
表205
靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸的粘度
Figure BDA0002559814380007042
Figure BDA0002559814380007051
实施例129：Sprague-Dawley大鼠中靶向人ANGPTL3的反义寡核苷酸的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评价的多用途模型。将大鼠用选自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的改变。
研究1
将Sprague-Dawley雄性大鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只 Sprague-Dawley大鼠皮下注射PBS或100mg/kg的5-10-5MOE缺口聚物，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。在第45天测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。也使用同一临床化学分析仪测量胆红素的血浆水平且结果也呈现于下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的 ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表206
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
Figure BDA0002559814380007061
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS 寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。测量总尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且评价总尿蛋白与肌酸酐的比值。结果在下表中呈现。
表207
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007062
Figure BDA0002559814380007071
表208
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿液标志物
Figure BDA0002559814380007072
器官重量
在第42天测量体重并呈现在下表中。在研究结束后第45天时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表209
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0002559814380007073
Figure BDA0002559814380007081
研究2
将Sprague-Dawley雄性大鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只 Sprague-Dawley大鼠皮下注射PBS或50mg/kg或100mg/kg的5-10-5 MOE缺口聚物或脱氧、MOE以及cEt寡核苷酸，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。在第44天测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。也使用同一临床化学分析仪测量胆红素的血浆水平且结果也呈现于下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的 ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表210
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
Figure BDA0002559814380007082
Figure BDA0002559814380007091
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，在第44天使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮 (BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。测量总尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且评价总尿蛋白与肌酸酐的比值。结果在下表中呈现。
表211
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007092
表212
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿液标志物
Figure BDA0002559814380007093
Figure BDA0002559814380007101
器官重量
在第42天测量体重并呈现在下表中。在研究结束后第44天时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表213
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0002559814380007102
研究3
将Sprague-Dawley雄性大鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只 Sprague-Dawley大鼠皮下注射PBS或50mg/kg的脱氧、MOE以及 (S)-cEt寡核苷酸，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。在第44天测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。也使用同一临床化学分析仪测量胆红素的血浆水平且结果也呈现于下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的 ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表214
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
Figure BDA0002559814380007111
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，在第44天使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮 (BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。测量总尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且评价总尿蛋白与肌酸酐的比值。结果在下表中呈现。
表215
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007121
表216
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿液标志物
Figure BDA0002559814380007122
器官重量
在第42天测量体重并呈现在下表中。在研究结束后第44天时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表217
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0002559814380007131
实施例130：食蟹猴中靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸的作用
将食蟹猴用选自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理。评估反义寡核苷酸功效和耐受性以及它们在肝和肾中的药代动力学特征。
在进行此研究时，食蟹猴基因组序列在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中是不可用的；因此，不能确认与食蟹猴基因序列的交叉反应性。取而代之，将食蟹猴中所用的 ISIS反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列针对同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列完全交叉反应。所测试的人反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸3049001 至3062000截短的GENBANK登录号No.NW_001108682.1，在本文中命名为SEQ ID NO:3)交叉反应。人寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越高，人寡核苷酸与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。相对于SEQ IDNO:3的每一寡核苷酸的起始和终止位点在下表中呈现。“起始位点”表示恒河猴基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。‘错配’表示与恒河猴基因组序列错配的人寡核苷酸中的核碱基的数量。
表218
与恒河猴ANGPTL3基因组序列(SEQ ID NO:3)互补的反义寡核苷酸
Figure BDA0002559814380007132
Figure BDA0002559814380007141
处理
在研究之前，将猴子保持隔离至少30天的时间，在此期间，每天观察动物的一般健康状况。猴子是2-4岁并且重量在2至4kg之间。以顺时针旋转向9组5只随意分配的雄食蟹猴的背部上的四个位点处 (即左、顶部、右以及底部)各皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS，每剂量一个位点。第一周的每两天(第1、3、5以及7天)给予猴子负荷剂量的PBS或40mg/kg的ISIS，并且随后一周一次给药PBS或40mg/kg 的ISIS寡核苷酸，持续12周(第14、21、28、35、42、49、56、63、 70、77以及84天)。
在研究期期间，每天两次观察猴子的生病或不适的迹象。在与实验负责人协商后，由兽医用得到批准的止痛剂或缓解疼痛的试剂处理经历因治疗、损伤或生病所引起的超过瞬时或轻微的疼痛或不适的任何动物。鉴定出任何处于不良健康状况或处于可能的濒死状况的动物以供进一步监测以及可能的安乐死。例如，发现ISIS 567321治疗组的一只动物在第45天是濒死的，因而被终止。在第86天(最后给药后约48小时)，在氯胺酮/塞拉嗪诱导的麻醉和施用戊巴比妥钠后通过放血法对动物进行预先安排的安乐死。实施例中所述的实验方案得到了Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。
肝靶减少
RNA分析
在第86天，自肝脏提取RNA以用于测量ANGPTL3的mRNA 表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380007152
归一化的mRNA的变化百分比。如下表中所示，用ISIS 反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，ANGPTL3 mRNA显著减少。ANGPTL3 mRNA水平分析表明，都与恒河猴序列完全交叉反应的ISIS 544199和ISIS 559277显著降低表达水平。靶向有错配的猴序列的其他ISIS寡核苷酸也可以降低ANGPTL3 mRNA的水平。
表219
相对于PBS对照的食蟹猴肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380007151
蛋白质分析
在第85天时，自所有可用的动物中收集大约1mL血液并且放入含有EDTA的钾盐的管中。将血液样品放入冰中，并且离心(4℃下 3000rpm持续10min)以获得血浆。
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。血浆ANGPTL3的分析揭示ISIS 563580、544199和ISIS 559277以持续方式降低蛋白质水平。其他ISIS寡核苷酸也可以降低 ANGPTL3水平。
表220
食蟹猴中的血浆蛋白水平(ng/mL)
Figure BDA0002559814380007161
耐受性研究
体重测量
为了评估ISIS寡核苷酸对动物总体健康的影响，测量体重并且结果呈现于下表中。所述结果表示用反义寡核苷酸处理对体重的作用在反义寡核苷酸的预期范围内。具体地说，用ISIS 563580处理就猴子的体重而言耐受良好。
表221
食蟹猴中的最终体重(g)
Figure BDA0002559814380007162
Figure BDA0002559814380007171
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的效果，从所有研究组中收集血液样本。给药后48小时，自颅骨、隐静脉或股静脉收集血液样本。在采血之前，猴子禁食过夜。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后离心(以大约3,000rpm保持10分钟)以得到血清。各种肝功能标记物的水平使用Toshiba200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量。测量ALT和AST的血浆水平并且结果呈现于下表中，以IU/L表示。胆红素，一种肝功能标记物，类似地加以测量并且结果呈现于下表中，以mg/dL表示。所述结果表示大部分反义寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝功能没有作用。具体地说，用ISIS 563580处理就猴子的肝功能而言耐受良好。
表222
食蟹猴血浆中的ALT水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380007172
Figure BDA0002559814380007181
表223
食蟹猴血浆中的AST水平(IU/L)
Figure BDA0002559814380007182
表224
食蟹猴血浆中的胆红素水平(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007183
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的效果，从所有研究组中收集血液样本。给药后48小时，自颅骨、隐静脉或股静脉收集血液样本。在采血之前，猴子禁食过夜。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后离心(以大约3,000rpm保持10分钟)以得到血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量BUN和肌酸酐的水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。
血浆化学数据表示大部分ISIS寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肾功能没有任何作用。具体地说，用ISIS 563580处理就猴子的肾功能而言耐受良好。
表225
食蟹猴中的血浆BUN水平(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007191
表226
食蟹猴中的血浆肌酸酐水平(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007192
Figure BDA0002559814380007201
血液学
为了评价食蟹猴中的ISIS寡核苷酸对血液学参数的任何效果，从每个可用的研究动物收集大约0.5mL的血液的血液样品置于含有 K2-EDTA的试管中。使用ADVIA120血细胞分析仪(Bayer,USA)分析样品的红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、个别白细胞计数(诸如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的计数)以及对血小板计数，血红蛋白含量以及红细胞压积。数据呈现于下表中。
所述数据示出寡核苷酸不会引起超出在该剂量下的寡核苷酸的预期范围之外的血液学参数的任何改变。具体地说，用ISIS 563580 处理就猴子的血液学参数而言耐受良好。
表227
食蟹猴的血球计数
Figure BDA0002559814380007202
Figure BDA0002559814380007211
表228
食蟹猴中的血液学参数
Figure BDA0002559814380007212
对促炎症性分子的作用
为了评价ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何消炎作用，在给药前 84天取血样以供分析C-反应性蛋白和C3水平。从每只动物收集约 1.5mL的血液并放入不加抗凝剂的试管中以分离血清。将试管在室温下保持最少90分钟，然后在室温下以3,000rpm离心10分钟以得到血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量用作炎症标记物的C-反应蛋白(CRP)和补体C3。结果表明，用ISIS 563580处理在猴子中耐受。
表229
食蟹猴血浆中的C-反应蛋白水平(mg/L)
Figure BDA0002559814380007221
表230
食蟹猴血浆中的C3水平(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007222
寡核苷酸浓度的测量
测量全长寡核苷酸浓度。所使用的方法是先前公开的方法(Leeds 等，1996；Geary等，1999)的改进版本，其由苯酚-氯仿(液-液)萃取、然后是固相萃取组成。在萃取之前添加内标物(ISIS 355868，27 聚体2’-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本文指定为SEQ ID NO:13)。使用校准曲线计算组织样品的浓度，检测下限(LLOQ)为约1.14μg/g。结果呈现在下表中，表达为μg/g肝或肾组织。计算全长寡核苷酸浓度在肾脏和肝脏中的比值。与其他评估的化合物相比，发现ISIS563580处理后的全长寡核苷酸浓度在肾脏和肝脏中的比值最佳。
表231
全长寡核苷酸浓度
Figure BDA0002559814380007231
实施例131：使用包含GalNAc缀合物基团的ISIS寡核苷酸和不包含GalNAc缀合物基团的ISIS寡核苷酸的huANGPTL3转基因小鼠中人ANGPTL3的反义抑制的对比
评价包含GalNAc3-7a的反义寡核苷酸相比于未缀合的对应物在 Tg小鼠中降低人ANGPTL3 mRNA转录的能力。靶向SEQ ID NO:1 的缺口聚物描述在下表和表121中。主链化学列的符号如下：‘s’表示硫代酯，并且‘o’表示磷酸酯。
表232
ISIS寡核苷酸
Figure BDA0002559814380007232
Figure BDA0002559814380007241
将雌性和雄性Tg小鼠保持在12小时光/暗周期中。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中制备反义寡核苷酸(ASO)并且通过0.2微米过滤器过滤进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
4只小鼠组接受ISIS 563580皮下注射，剂量为5mg/kg、10mg/kg、 15mg/kg或30mg/kg，每周一次持续2周。各组4只小鼠接受ISIS 703801或ISIS 703802腹膜内注射，剂量为0.3mg/kg、1mg/kg、3 mg/kg或10mg/kg，每周一次持续2周。一组小鼠接受PBS皮下注射，每周一次持续2周。PBS注射组充当与相应寡核苷酸处理组做比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，自肝脏组织提取RNA以用于使用人引物探针集hANGPTL3_LTS01022测量ANGPTL3的mRNA表达的实时PCR 分析。结果呈现为相对于PBS对照的用
Figure BDA0002559814380007242
归一化的 mRNA的变化百分比。0值仅指示反义寡核苷酸在可测量水平不抑制表达。
结果证明，从抑制百分比和ID50值明显看出，缀合化合物比未缀合的对应物在降低ANGPTL3上更有效。具有混合主链化学的缀合寡核苷酸(703802)比具有全部硫代磷酸酯键主链化学的缀合寡核苷酸 (703801)在抑制表达上更有效。
表233
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002559814380007251
蛋白质分析
使用商业上可获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，R&D Systems，Minneapolis，MN)用1:20,000稀释的转基因血浆样品，使用制造商描述的方案对人ANGPTL3蛋白水平进行定量。结果在下表中呈现。0值仅指示反义寡核苷酸在可测量水平不抑制表达。
结果证明，从抑制百分比明显看出，缀合化合物比未缀合的对应物在降低ANGPTL3上更有效。具有混合主链化学的缀合寡核苷酸 (703802)比具有全部硫代磷酸酯键主链化学的缀合寡核苷酸(703801) 在抑制表达上更有效。
表234
转基因小鼠中血浆蛋白水平的抑制百分比
Figure BDA0002559814380007252
Figure BDA0002559814380007261
实施例132：CD1小鼠中靶向人ANGPTL3的GalNAc缀合的反义寡核苷酸的耐受性
用下表描述的ISIS 703802的各种剂量皮下注射雄性CD1小鼠 (每处理组4只动物)，持续6周(在第1、3、5、8、14、21、28、35 和42天)。向一组的4只雄性CD1小鼠皮下注射PBS持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为评价ISIS 703802的影响，在第44天时，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量各种肝和肾功能标记物的血浆水平。结果在下表中呈现。显示即使在高剂量时，ISIS 703802也是耐受化合物。
表235
在第44天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0002559814380007262
Figure BDA0002559814380007271
体重
在研究结束时第44天测量身体、肾脏、肝脏和脾脏的重量。即使施用高剂量时，ISIS 703802也不能显著改变身体和器官重量。
表236
反义寡核苷酸处理后CD1小鼠的重量(g)
Figure BDA0002559814380007272
实施例133：Sprague-Dawley大鼠中靶向人ANGPTL3的 GalNAc缀合的反义寡核苷酸的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评价的多用途模型。将 Sprague-Dawley雄性大鼠维持在12小时光/暗周期中并且随意喂食 Purina正常大鼠食物饲料5001。用下表描述的ISIS 703802的各种剂量皮下注射每组的4只Sprague-Dawley大鼠，持续6周(在第1、3、 5、8、14、21、28、35和42天)。向一组的4只大鼠皮下注射PBS 持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝和肾功能
为评价ISIS 703802对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。在第 44天测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。
为评价ISIS 703802对肾功能的影响，使用同一临床化学分析仪测量白蛋白、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐和胆红素的血浆水平，并且结果呈现于下表中，以g/dL或mg/dL表示。
为了进步一步评价ISIS 703802对肾功能的影响，测量尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且评价总尿蛋白与肌酸酐的比值。结果在下表中呈现。
显示即使在高剂量时，ISIS 703802也是耐受化合物。
表237
在第44天Sprague-Dawley大鼠血浆中的肝和肾功能标记物
Figure BDA0002559814380007281
表238
在第44天Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿液标志物(mg/dL)
Figure BDA0002559814380007282
Figure BDA0002559814380007291
器官重量
在研究结束后第44天时测量身体、肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。即使施用高剂量时，ISIS 703802也不能显著改变肾和肝的重量。
表239
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0002559814380007292

Claims (187)

1.一种包含修饰的寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ IDNO:1至少80％互补。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有与SEQ ID NO:1的等长部分互补的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的部分的核碱基序列。
3.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包含含有与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的一部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
4.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
5.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:77、20、35、90、93或94的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。
6.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:110或114的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或16个连续核碱基的核碱基序列。
7.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸为单链的或双链的。
8.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键联。
11.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。
12.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。
13.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。
14.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。
15.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。
16.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。
17.如权利要求10至16中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
18.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
19.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。
20.如权利要求19所述的化合物，其中至少一个修饰的糖为双环糖。
21.如权利要求19所述的化合物，其中至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH2)n-O-2’桥联，其中n为1或2。
22.如任一前述权利要求所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
24.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含：
由连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接核苷组成的5’翼区段；
由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
25.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由15至30、18至24、19至22、13至25、14至25、15至25、16或20个连接核苷组成。
26.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有包含与SEQ ID NO:77的等长部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由五个连接核苷组成的5’翼区段；
由五个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
27.一种由ISIS 563580和缀合物基团、ISIS 544199和缀合物基团、ISIS 560400和缀合物基团、ISIS 567233和缀合物基团、ISIS 567320和缀合物基团、ISIS 567321和缀合物基团、ISIS 559277和缀合物基团、ISIS 561011和缀合物基团组成的化合物。
28.如权利要求1至27中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
29.如权利要求1至27中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
30.如权利要求1-29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。
31.如权利要求1-29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。
32.如权利要求1-29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。
33.如权利要求1-29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。
34.如权利要求30-33中任一项所述的化合物，其中每个配体选自：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-葡糖-庚吡喃糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。
35.如权利要求34所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。
36.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000061
37.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000062
38.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000063
39.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000071
40.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000072
41.如权利要求29至35中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
42.如权利要求1至41中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000081
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
43.如权利要求1至41中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure RE-FDA0002717616990000082
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
44.如权利要求43所述的化合物，其中缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure RE-FDA0002717616990000091
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
45.如权利要求29至35中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
Figure RE-FDA0002717616990000092
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
46.如权利要求1至45中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。
47.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000093
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
48.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000101
其中：
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；
每个n独立地为0或1；并且
q为1与5之间的整数。
49.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000111
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
50.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000112
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
51.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000121
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
52.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000122
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
53.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000131
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
54.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000132
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
55.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000141
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
56.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000151
57.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000152
58.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000161
59.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000162
60.如权利要求47至54中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000163
61.如权利要求47至60中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。
62.如权利要求47至60中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。
63.如权利要求47至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。
64.如权利要求47至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。
65.如权利要求47至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。
66.如权利要求47至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。
67.如权利要求47至66中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。
68.如权利要求47至67中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。
69.如权利要求47至68中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。
70.如权利要求47至69中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。
71.如权利要求70所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。
72.如权利要求70所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。
73.如权利要求70所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
74.如权利要求47至73中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000181
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
75.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000191
其中每个n独立地为1至20。
76.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000201
77.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000202
其中n为1至20。
78.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000211
79.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000212
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
80.如权利要求47至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000213
81.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
Figure RE-FDA0002717616990000214
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
82.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
Figure RE-FDA0002717616990000221
其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
83.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000222
84.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000223
85.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000231
86.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000232
87.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。
88.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000233
每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
89.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000241
90.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000242
91.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000243
Figure RE-FDA0002717616990000251
其中每个j为1至3的整数；并且
其中每个n为1至20的整数。
92.如权利要求47至80中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000252
93.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000253
其中L选自磷连接基团和中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
94.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000261
其中Z2为H或CH3；并且
每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。
95.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000262
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
96.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。
97.如权利要求47至92或94中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。
98.如权利要求47至92或94中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。
99.如权利要求47至92或94中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。
100.如权利要求47至92或94中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。
101.如权利要求47至92或94中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。
102.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000271
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
103.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000281
104.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000282
其中每个n独立地为1至20。
105.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000283
106.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000284
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
107.如权利要求47至92中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：
Figure RE-FDA0002717616990000291
108.如权利要求104至107中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。
109.如权利要求104至107中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。
110.如权利要求104至107中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000292
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
111.如权利要求104至107中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
Figure RE-FDA0002717616990000293
112.如权利要求104至107中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000301
113.如权利要求104至107中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000302
114.如权利要求1至29或56至80中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。
115.如权利要求114所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：
Figure RE-FDA0002717616990000303
其中每个n独立地为1至20。
116.如权利要求115中任一项所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000311
117.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000312
其中每个n独立地为1至20。
118.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000321
119.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000322
120.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000331
121.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000332
122.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000333
123.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000341
124.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000342
125.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000351
126.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000352
127.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000361
128.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000362
129.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000363
130.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000371
131.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000372
132.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000373
133.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000381
134.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000382
135.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000391
136.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000392
137.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000401
138.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000402
139.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000403
140.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
Figure RE-FDA0002717616990000404
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
141.如权利要求115所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000411
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
142.如权利要求115所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000412
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
143.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000413
144.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000421
145.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000422
146.如权利要求116所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000423
147.如权利要求1至146中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。
148.如权利要求1至146中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。
149.如权利要求1至146中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。
150.如权利要求1至147中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。
151.如权利要求1至147中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。
152.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000431
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
153.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000441
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
154.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000451
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
155.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000461
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
156.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000471
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
157.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000472
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
158.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000481
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
159.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000482
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
160.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000491
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
161.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000492
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
162.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000501
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
163.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000502
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
164.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000511
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
165.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000521
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
166.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure RE-FDA0002717616990000522
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
167.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000531
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
168.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000532
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
169.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
Figure RE-FDA0002717616990000541
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
170.如权利要求152至169中任一项所述的化合物，其中Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
171.如权利要求152至169中任一项所述的化合物，其中Bx为腺嘌呤。
172.如权利要求152至169中任一项所述的化合物，其中Bx为胸腺嘧啶。
173.如权利要求152至169中任一项所述的化合物，其中Q13为O(CH2)2-OCH3。
174.如权利要求152至169中任一项所述的化合物，其中Q13为H。
175.一种组合物，其包含根据权利要求1-174中任一项所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。
176.一种前药，其包含如权利要求1至175中任一项所述的化合物。
177.一种方法，其包括向动物施用如权利要求1-176中任一项所述的化合物、组合物或前药。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述动物为人。
179.如权利要求177所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善心血管和/或代谢疾病或减慢其进展。
180.如权利要求177所述的方法，其包括共同施用所述化合物或组合物与第二药剂。
181.如权利要求181所述的方法，其中所述化合物或组合物与所述第二药剂是伴随施用的。
182.如权利要求177所述的方法，其中所述施用是肠胃外的。
183.如权利要求177所述的方法，其中所述施用是皮下的。
184.一种用于治疗人类心血管和/或代谢疾病的方法，其包括鉴定患有心血管和/或代谢疾病的人并且给所述人施用治疗有效量的如权利要求1-176中任一项所述的化合物或组合物，以便治疗所述人的心血管和/或代谢疾病。
185.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物的组合物，其用于治疗。
186.如权利要求184所述的组合物，其用于治疗、预防与升高的ANGPTL3相关的疾病或减缓其进展。
187.如权利要求184所述的组合物，其中所述疾病为心血管和/或代谢疾病、病症或病状。
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