ES2947520T3 - Proceso para la preparación de agentes de ARN conjugados con carbohidratos - Google Patents

Proceso para la preparación de agentes de ARN conjugados con carbohidratos Download PDF

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Pachamuthu Kandasamy
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Abstract

Esta divulgación se refiere a un proceso mejorado para la preparación de conjugados de carbohidratos. La divulgación también se refiere a agentes de ARNi conjugados con carbohidratos que comprenden estos conjugados de carbohidratos, que tienen una pureza mejorada y son ventajosos para la administración in vivo de los agentes de ARNi. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para la preparación de agentes de ARN conjugados con carbohidratos
La presente invención se refiere a procesos mejorados para la preparación de conjugados de carbohidratos.
El suministro eficiente a las células in vivo requiere una orientación específica y una protección sustancial del entorno extracelular, particularmente de las proteínas séricas. Un método para lograr la orientación específica es conjugar una fracción de orientación a un agente de ARNi. La fracción de orientación ayuda a dirigir el agente de ARNi al sitio diana requerido. Una forma en la que la fracción de orientación puede mejorar el suministro es mediante la actividad endocítica mediada por el receptor. Este mecanismo de captación implica el movimiento del agente de ARNi unido a los receptores de membrana hacia el interior de un área que está envuelta por la membrana a través de la invaginación de la estructura de la membrana o mediante la fusión del sistema de suministro con la membrana celular. Este proceso se inicia mediante la activación de un receptor de superficie celular o de membrana después de la unión de un ligando específico al receptor. Se conocen y se han estudiado muchos sistemas endocíticos mediados por receptores, incluidos los que reconocen azúcares tales como galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, péptidos y proteínas tales como la transferrina, la asialoglicoproteína, la vitamina BI2, la insulina y el factor de crecimiento epidérmico (EGF). El receptor de Asialoglicoproteína (ASGP-R) es un receptor de alta capacidad, que es muy abundante en los hepatocitos. El ASGP-R muestra una afinidad 50 veces mayor para N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) que D-Gal.
Recientemente, ciertos conjugados de carbohidratos demostraron ser un suministro alternativamente valioso a los liposomas para el suministro de ARNip.
En este contexto, el documento WO 2009/073809 A2 describe los conjugados de carbohidratos como agentes de suministro para oligonucleótidos tales como agentes de ARNi. Además, Huang y otros (Huang, X. y otros; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19; 2009; pp. 4130-4133) describe la síntesis y la evaluación biológica de una serie de fluoroquinolonas C7 no básicas sustituidas como agentes antibacterianos.
La presente invención se refiere a los siguientes elementos:
1. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000002_0001
en donde
A es un enlazador de alquileno C6-C14;
cada R es, independientemente, un grupo protector de ácido; y
Rx es un grupo protector de ácido;
dicho proceso comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IX):
Figure imgf000002_0002
con un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000002_0003
para producir un compuesto de fórmula (VIII), en donde Hal es halógeno.
2. El proceso del elemento 1, en donde R es t-butilo, Hal es C1 y A es un enlazador alquileno C10.
3. El proceso del elemento 1 o el elemento 2, en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de N,N-diisopropiletilamina.
4. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000003_0001
en donde Z es un grupo protector de ácido, n es 0-20, y cada ocurrencia de r y s es independientemente 1 -7; dicho proceso comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XII):
Figure imgf000003_0002
en donde P es un grupo protector de amina que puede eliminarse con un ácido sulfónico.
5. El proceso del elemento 4, en donde el ácido sulfónico es ácido p-toluenosulfónico o ácido metanosulfónico. 6. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000003_0003
en donde
X es un grupo protector de hidroxilo;
Y es un grupo protector de amina;
Prt es un grupo protector de hidroxilo;
n es 0-15;
q, ry s son cada uno, independientemente, 1-7; y
o es un soporte sólido;
dicho proceso comprende
(1) tratar un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
con un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000004_0002
en presencia de una base para proporcionar un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000004_0003
en donde Z es un grupo protector de ácido;
(2) desproteger Z en el compuesto de fórmula (IV), seguido de acoplamiento con una prolina hidroxilada de fórmula (V):
Figure imgf000004_0004
(3) acoplar el producto de la etapa (2) con anhídrido succínico; y
(4) acoplar el producto de la etapa (3) a un soporte sólido para proporcionar un compuesto de fórmula (I).
7. El proceso del elemento 6,
en donde X es Bz o Ac; y/o
en donde Y es Ac; y/o
en donde n es 7; y q, r, y s son cada uno 1; y/o
en donde Prt es un grupo protector de 4,4'-Dimetoxitritilo.
En la presente descripción se describe un proceso mejorado para la preparación de conjugados de carbohidratos y agentes de ARNi conjugados con carbohidratos. El proceso descrito en la presente descripción proporciona un producto conjugado de carbohidratos que contiene menos impurezas (por ejemplo, menos contaminantes metálicos). El presente proceso también elimina la necesidad de reacciones de hidrogenación costosas mediante el uso de catalizadores tales como Pd sobre carbono, y reduce el número de etapas de purificación para obtener un producto farmacéuticamente aceptable.
Los procesos, intermediarios y productos descritos en la presente descripción son útiles para preparar agentes de ARNi conjugados con carbohidratos, tales como los que tienen la fórmula:
Figure imgf000005_0001
en donde
cada ocurrencia de X es un grupo protector de hidroxi o hidrógeno;
cada ocurrencia de Y es un grupo protector de amina (por ejemplo, acetil);
n es 0-20 (por ejemplo, 0-15 o 4-15, preferentemente 7);
cada ocurrencia de q, r y s es independientemente 1-7;
L es un grupo de enlace; y
R1 es un agente de ARNi. En una modalidad, todas las ocurrencias de X son las mismas, todas las ocurrencias de Y son las mismas, todas las ocurrencias de q son las mismas, todas las ocurrencias de r son las mismas, y todas las ocurrencias de s son las mismas. En una modalidad, cada ocurrencia de X es hidrógeno. En otra modalidad, cada ocurrencia de Y es acetilo. En una modalidad, cada ocurrencia de X es hidrógeno y cada ocurrencia de Y es acetilo.
En una modalidad preferida, n es 6, q es 1, r es 1, y s es 1. En otra modalidad preferida, n es 7, q es 1, r es 1, y s es 1. El agente de ARNi conjugado con carbohidratos está preferentemente sustancialmente libre de metal (tal como un ion metálico).
Una modalidad descrita en la presente descripción, pero que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, es un compuesto de fórmula (A) donde el compuesto es
libre o sustancialmente libre de uno o más de
(i) impurezas metálicas (tales como paladio, platino y rutenio),
(ii) cada uno de los dos productos secundarios de urea siguientes
Figure imgf000005_0003
(iii) Cada uno de los compuestos de sacáridos siguientes
Figure imgf000005_0002
En una modalidad preferida, que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, el compuesto de fórmula (A) contiene no más de aproximadamente 0,5 %, o con mayor preferencia no más de aproximadamente 0,2 %, de cualquier producto secundario de urea individual o compuesto de sacárido descrito anteriormente. Por ejemplo, el compuesto puede contener no más de aproximadamente 0,1 o aproximadamente 0,05 % de cualquier producto secundario de urea individual o compuesto de sacárido descrito anteriormente. El compuesto de fórmula (A) también contiene preferentemente no más de aproximadamente 1000 ppm (por ejemplo, no más de aproximadamente 400, aproximadamente 300, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 10, aproximadamente 5, o 1 aproximadamente ppm) de cualquier metal individual (tal como paladio, platino o rutenio). En una modalidad, el compuesto de fórmula (A) contiene no más de aproximadamente 1000 ppm (por ejemplo, no más de aproximadamente 400, aproximadamente 300, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 10, aproximadamente 5, o 1 aproximadamente ppm) de (i) rutenio, (ii) paladio, (iii) platino o (iv) cualquiera de sus combinaciones.
Una modalidad descrita en la presente descripción pero que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, se refiere a un proceso para convertir un compuesto de fórmula (VI) en un compuesto de fórmula (VII):
Figure imgf000006_0001
El proceso puede comprender:
(i) hacer reaccionar al compuesto de fórmula (VI) con una base tal como una base de alcóxido metálico (por ejemplo, NaOMe);
(ii) reducir el producto de la etapa (i) (por ejemplo, con NaBH4); y
(iii) hacer reaccionar al producto de la etapa (ii) con un ácido (por ejemplo, HCl).
Este proceso puede realizarse en un solo frasco y con alto rendimiento (por ejemplo, >80 %).
Por ejemplo, en una modalidad, el compuesto de fórmula (VI) reacciona con un metal alcóxido (tal como el metóxido de sodio). La etapa (ii) puede incluir la reacción con un agente reductor, tal como un borohidruro, por ejemplo, borohidruro de sodio. En una modalidad, la etapa (ii) implica más de 1 equivalente, tal como 2-5 equivalentes (por ejemplo, 3 equivalentes), del agente reductor. En una modalidad adicional, el ácido usado en la etapa (iii) es un ácido mineral, por ejemplo, ácido clorhídrico. En una modalidad preferida, las etapas (i), (ii) y (iii) se realizan al mismo tiempo, es decir, el proceso es un proceso de una etapa. Los inventores descubrieron sorprendentemente que este proceso de preparación del compuesto (VII) elimina una etapa de hidrogenación y el uso de reactivos costosos (por ejemplo, cloroformiato de bencilo y Pd sobre carbono). El producto resultante es cristalino y contiene cantidades más bajas de impurezas de metales pesados (tales como paladio y rutenio) que pueden traspasarse durante la síntesis para contaminar el compuesto de fórmula (A) o (I). (El compuesto de la fórmula (I) se muestra más abajo.)
El compuesto de fórmula (VII) puede convertirse en un compuesto de fórmula (A) o (I).
Una modalidad de la presente invención reivindicada se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000006_0002
en donde
A es un enlazador de alquileno C6-C14 (por ejemplo, un enlazador de alquileno C8-C12 tal como -(CH2)10-); cada R es, independientemente, un grupo protector de ácido (por ejemplo, alquilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, t-butilo) o arilo sustituido o no sustituido); y
Rx es un grupo protector de ácido, tal como alquilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, metilo) o
arilo sustituido o no sustituido. Preferentemente, Rx es diferente de todos los grupos R.
El proceso incluye hacer reaccionar a un compuesto de la fórmula (IX):
Figure imgf000007_0001
con un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000007_0002
para producir un compuesto de fórmula (VIII), en donde Hal es halógeno (por ejemplo, Cl).
En una modalidad, cada R es t-butilo. En otra modalidad, Hal es Cl. En una modalidad adicional, A es un enlazador alquileno C10. En una modalidad preferida, cada R es t-butilo, Hal es Cl y A es un enlazador alquileno C10.
En una modalidad, el proceso para preparar un compuesto de fórmula (VIII) implica hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IX) con el compuesto de fórmula (X) en presencia de DIEA (N,N-diisopropiletilamina). Los solicitantes encontraron sorprendentemente que el uso del haluro de ácido de fórmula (X) permite que la reacción se lleve a cabo en presencia de DIEA (opuesto a dimetilaminopropil carbodiimida (EDC), un reactivo usado típicamente para promover tales reacciones de acoplamiento) lo que proporciona sorprendentemente un producto que tiene una mayor pureza. El producto puede, por ejemplo, contener cantidades menores de productos secundarios de urea sustituida (o estar libre de o sustancialmente libre de productos secundarios de urea) y contener menos solvente residual (por ejemplo, alcohol tal como t-butanol). Los productos secundarios de urea sustituidos que se pueden formar se muestran más abajo.
Figure imgf000007_0003
En otra modalidad, el compuesto de fórmula (VIII) se convierte en un compuesto de fórmula (A) o (I).
Sin embargo, otra modalidad se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula:
Figure imgf000007_0004
en donde Z es un grupo protector de ácido y n, r y s son como se definió anteriormente. El compuesto (II) puede formarse con un contraión (tal como CF3SO3-) presente. El proceso implica hacer reaccionar a un compuesto de la fórmula (XII):
Figure imgf000008_0001
en donde P es un grupo protector de amina (por ejemplo, Boc), que puede eliminarse con un ácido sulfónico (por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico o ácido metanosulfónico). Por ejemplo, en una modalidad, el compuesto de fórmula (XII) reacciona con ácido p-toluenosulfónico en un solvente alcohólico (por ejemplo, metanol) a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 60 °C (por ejemplo, a aproximadamente 50 °C). La solubilidad parcial de la triamina en solventes halogenados tales como diclorometano puede conducir a una desprotección incompleta del compuesto de fórmula (XII). Los inventores encontraron sorprendentemente que el usar un ácido sulfónico (en un solvente alcohólico tal como metanol) proporciona una mayor desprotección (es decir, reduce la posibilidad de desprotección incompleta) del compuesto de fórmula (XII), probablemente debido a la mejor solubilidad de la triamina en el alcohol.
En otra modalidad, el compuesto de fórmula (II) se convierte en un compuesto de fórmula (A) o (I). El proceso para preparar un compuesto de fórmula (I) es parte de la invención reivindicada.
Sin embargo, otra modalidad, que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula (XIII):
Figure imgf000008_0002
en donde
X, Y, n, q, r y s son como se definió anteriormente con respecto a la fórmula (A); y
Prt es un grupo protector de hidroxilo.
El proceso comprende reaccionar a un compuesto de fórmula (XIV)
Figure imgf000009_0001
con dihidrofurano-2,5-diona en presencia de una amina (preferentemente una amina terciaria tal como trietilamina). Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la reacción de succinilación puede realizarse en ausencia de catalizadores costosos que son usados típicamente en esta reacción tal como DMAP (dimetilaminopiridina) o DMAP inmovilizado (tal como PS-DMAP, un equivalente de DMAP ligado a poliestireno), de esta manera se reducen significativamente los costos. Adicionalmente, se reduce el número de impurezas potenciales en el producto (debido a la oligomerización, las reacciones) y se elimina la posibilidad de contaminación por metales pesados (como Pd o Ru cuando son usados como catalizadores). En una modalidad, la reacción se lleva a cabo en un solvente clorado (por ejemplo, diclorometano o dicloroetano).
En otra modalidad, el compuesto de fórmula (XIII) se convierte en un compuesto de fórmula (A) o (I).
Cualquiera de los intermedios y productos descritos en la presente descripción puede convertirse en un agente de ARNi conjugado con carbohidratos de fórmula (A), que contiene un resto de GalNAc3.
Sin embargo, otra modalidad, que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, es un método para preparar un agente de ARNi conjugado con carbohidratos de fórmula (A) mediante (I) la obtención de cualquiera de los intermediarios o productos descritos en la presente descripción (por ejemplo, un compuesto de fórmula (I)), y (ii) convertirlo en el agente de ARNi conjugado con carbohidratos de fórmula (A). Por ejemplo, el método puede incluir (i) desproteger el grupo hidroxilo protegido por Prt en el compuesto de fórmula (I), (ii) convertir el grupo hidroxilo a -L-R1 (como se define en la fórmula (A) anterior), y (iii) retirar el soporte sólido y el enlazador de ácido succínico (que se encuentra entre el soporte sólido y el grupo hidroxilo de un resto de prolinol) para obtener el compuesto de fórmula (A).
En una modalidad, los intermediarios y productos descritos en la presente descripción (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (A) o (I)) están sustancialmente libres de metal (tal como un ion metálico, por ejemplo, paladio, platino o rutenio). Sustancialmente libre de metal, como se usa en la presente descripción, incluye que contiene menos de o igual a aproximadamente 1000 partes por millón (ppm) de metal, tal como menos de o igual a aproximadamente 800 ppm, menos de o igual a aproximadamente 500 ppm, menos de o igual a aproximadamente 400 ppm, menos de o igual a aproximadamente 300 ppm, menos de o igual a aproximadamente 200 ppm, menos de o igual a aproximadamente 100 ppm, menos de o igual a aproximadamente 50 ppm, menos de o igual a aproximadamente 10 ppm o menos de o igual a aproximadamente 1 ppm de metal.
En una modalidad, descrita pero que no constituye en sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, es un compuesto de fórmula (A) o (I) sustancialmente libre de metal (tal como un ion metálico), por ejemplo, que contiene menos de o igual a aproximadamente 1000 partes por millón (ppm) de metal, tal como menos de o igual a aproximadamente 800 ppm, menos de o igual a aproximadamente 500 ppm, menos de o igual a aproximadamente 400 ppm, menos de o igual a aproximadamente 300 ppm, menos de o igual a aproximadamente 200 ppm, menos de o igual a aproximadamente 100 ppm, menos de o igual a aproximadamente 50 ppm, menos de o igual a aproximadamente 10 ppm o menos de o igual a aproximadamente 1 ppm de metal.
En otra modalidad, los intermediarios y productos descritos en la presente descripción (por ejemplo, un compuesto de fórmula (A) o (I)) están sustancialmente libres de un contraión (por ejemplo, OSO3'). Sustancialmente libre de un contraión, como se usa en la presente descripción, incluye contener menos de o igual a aproximadamente 1000 partes por millón (ppm) de un contraión, tal como menos de o igual a aproximadamente 800 ppm, menos de o igual a aproximadamente 500 ppm, menos de o igual a aproximadamente 400 ppm, menos de o igual a aproximadamente 300 ppm, menos de o igual a aproximadamente 200 ppm, menos de o igual a aproximadamente 100 ppm, menos de o igual a aproximadamente 50 ppm, menos de o igual a aproximadamente 10 ppm o menos de o igual a aproximadamente 10 ppm de un contraión.
Sin embargo, otra modalidad es un compuesto de fórmula (A) o (I) que está sustancialmente libre de un contraión, por ejemplo, que contiene menos de o igual a aproximadamente 1000 partes por millón (ppm) de un contraión, tal como menos de o igual a aproximadamente 800 ppm, menos de o igual a aproximadamente 500 ppm, menos de o igual a aproximadamente 400 ppm, menos de o igual a aproximadamente 300 ppm, menos de o igual a aproximadamente 200 ppm, menos de o igual a aproximadamente 100 ppm, menos de o igual a aproximadamente 50 ppm, menos de o igual a aproximadamente 10 ppm o menor que o igual a aproximadamente 1 ppm de un contraión.
Sin embargo, otra modalidad es un compuesto de fórmula (A) o (I) que contiene menos de aproximadamente 10 % en peso, tal como menos de aproximadamente 7,5 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 4 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 2 %, menos de aproximadamente 1 %, menos de aproximadamente 0,5 % o menos de aproximadamente 0,1 % en peso de cada uno de los siguientes productos secundarios de urea
Figure imgf000010_0001
Sin embargo, otra modalidad es un compuesto de fórmula (A) o (I) que contiene menos de aproximadamente 10 % (en base al 100 % del peso total del compuesto), tal como menos de aproximadamente 7,5 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 4 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 2 %, menos de aproximadamente 1 %, menos de aproximadamente 0,5 %, o menos de aproximadamente 0,1 % de uno o más de los siguientes compuestos.
Figure imgf000010_0002
En una modalidad, el compuesto de fórmula (A) o (I) no contiene más de aproximadamente 0,5 %, 0,4 % o 0,3 % de uno o más de los compuestos anteriores. En otra modalidad, el compuesto de fórmula (A) o (I) no contiene más de aproximadamente 0,2 % de uno o más de los compuestos anteriores. En aún otra modalidad, el compuesto de fórmula (A) o (I) no contiene más de aproximadamente 0,1 % de uno o más de los compuestos anteriores. En aún otra modalidad, el compuesto de fórmula (A) o (I) no contiene más de aproximadamente 0,05 % de uno o más de los compuestos anteriores.
Sin embargo, otra parte de la modalidad de la invención que se reivindica se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000011_0001
en donde
X, Y, n, q, r y s se definen como anteriormente;
y Prt es un grupo protector de hidroxilo; y
^ es un soporte sólido.
Prt es preferentemente diferente de todos los grupos que protegen a X hidroxilo.
En una modalidad, todas las ocurrencias de X son las mismas, todas las ocurrencias de Y son las mismas, todas las ocurrencias de q son las mismas, todas las ocurrencias de r son las mismas, y todas las ocurrencias de s son las mismas. El proceso comprende una o más de las siguientes etapas:
(1) tratar un compuesto de fórmula II:
Figure imgf000011_0002
con un compuesto de fórmula III:
Figure imgf000011_0003
en presencia de una base para proporcionar un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000012_0001
en donde Z es un grupo protector de ácido;
(2) desproteger Z en el compuesto de fórmula (IV), seguido de acoplamiento con una hidroxiprolina (V):
Figure imgf000012_0002
y
(3) acoplar el producto de la etapa (2) con anhídrido succínico; y
(4) acoplar el producto de la etapa (3) a un soporte sólido para proporcionar un compuesto de fórmula (I). En el caso de que el proceso no incluya la etapa (4), el intermediario que se forma se convierte subsecuentemente en un compuesto de fórmula (I) o (A). El compuesto de fórmula (I) es útil para preparar agentes de ARNi conjugados con carbohidratos, tales como los de fórmula (A).
En una modalidad, el proceso incluye (i) la etapa (2) (pero no necesariamente con las etapas (1), (3) y (4)), y (ii) convertir el prolinol intermediario que se forma en la etapa (2) a un compuesto de fórmula (A) o (I).
En una modalidad, el proceso se lleva a cabo en 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, o 15 etapas o menos de la sal de clorhidrato de galactosamina.
En una modalidad, el proceso se lleva a cabo en 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, o 15 etapas o menos a partir de tris(hidroximetil) aminometano.
En una modalidad, la etapa (1) se lleva a cabo mediante el uso de un reactivo de acoplamiento de péptidos en presencia de una base. Opcionalmente, el intercambio del(de los) grupo(s) protector(es) del resto de galactosamina (por ejemplo, X e Y) se lleva a cabo desprotegiendo un primer grupo protector, y luego se reintroduce un nuevo grupo protector. Por ejemplo, un grupo protector benzoilo se reemplaza con un grupo protector acetilo.
En otra modalidad, la etapa (2) se lleva a cabo desprotegiendo primero Z, seguido del acoplamiento al ácido correspondiente con hidroxiprolina (V),
Figure imgf000012_0003
con un reactivo de acoplamiento de péptido en presencia de una base.
En un ejemplo, Z es un grupo protector de ácido tal como alquilo, alquilo sustituido, arilo, o arilo sustituido. Los grupos Z ilustrativos de acuerdo con la definición anterior incluyen, pero no se limitan a: metilo, etílico, sec-butilo, terc-butilo, clorometilo, bromometilo, 2-yodoetilo, 2-fluoropropilo, fenilo, 2-bromofenilo, 4-clorofenilo, 4-metoxifenilo, p-tolilo, otolilo, 4-benciloxifenilo, 3-carbamilfenilo, 4-cloro-3-cianofenilo, 4-metoxi-2-tolilo, 4-trifluorometilfenilo, bencilo, 4 metoxibencilo, 4-yodobencilo, 3-metanosulfonamidobencilo, 3-nitrobencilo, 3-cloro-4-benciloxibencilo, 2-etilbencilo, fenoximetilo, 4-bromofenoximetilo, 2-metoxifenoximetilo, 4-toliloximetilo, 4-clorofenoximetilo, 4-carbamilfeniloximetilo, 3-cloro-4-etoxifenoximetiloIo y grupos similares. R1 también puede ser 2-furilmetilo, 2-tienilmetilo, 3-tienilmetilo, ciclohexadienilmetilo, carbometoxi, 4-nitrobenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo y benzhidroxiloxicarbonilo.
En una modalidad, X es bencilo (Bz) o acetilo (Ac).
En una modalidad, Y es Ac.
En una modalidad, n es 6 y q, r y s son 1.
En otra modalidad, n es 7 y q, r y s son 1.
En una modalidad, los procesos descritos en la presente descripción se llevan a cabo en condiciones libres de metal. En una modalidad, el rendimiento total del proceso para preparar el compuesto de fórmula (I) a partir del compuesto de fórmula (II) es al menos de aproximadamente 15 %, tal como al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, o al menos aproximadamente 50 % que se calcula mediante el uso de tris(hidroximetil)aminometano o sal de clorhidrato de galactosamina como material de partida. Otra modalidad, que no constituye por sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, es un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000013_0001
en donde
Figure imgf000013_0002
son como se definió anteriormente, preparados por cualquiera de los procesos descrito en la presente descripción, o un proceso que incluye una o más etapas descritas en los procesos descritos en la presente descripción.
Sin embargo, otra modalidad, que no constituye por sí misma la temática de la reivindicación de la presente invención, es un compuesto de fórmula (A):
Figure imgf000014_0001
en donde L, R1, X, Y, n, q, r y s son como se definió anteriormente con respecto a la fórmula (A), preparada por cualquiera de los procesos descritos en la presente descripción, o un proceso que incluye una o más etapas descritas en los procesos descritos en la presente descripción.
En una modalidad, el compuesto de fórmula (I) se prepara a partir de Tris, GalNAc y trans-4-OH-Pro-OH con un soporte sólido, y en ausencia de cualquier reactivo metálico.
En una modalidad, cualquiera de los procesos descritos en la presente descripción es usado para la síntesis a gran escala del compuesto de fórmula (I), tal como en una escala superior a 1 kilogramo.
En una modalidad, cualquiera de los procesos descritos en la presente descripción se llevan a cabo en un solvente inerte, tal como, por ejemplo, dimetilforamida, dimetilsulfóxido, diclorometano, metanol, piridina, acetonitrilo, hexano, éter de petróleo, benceno, tolueno, xileno; éteres (tales como éter dietílico, éter diisopropílico, tetrahidrofurano, dioxano, éter dimetílico de etilenglicol), y sus mezclas.
En otros aspectos, se describe en la presente descripción un aumento del rendimiento del producto para la producción a escala intermedia y grande de un compuesto de Fórmula (A) o (I). El compuesto de Fórmula (I) es un intermediario particularmente útil en la síntesis de agentes de ARNi conjugados con carbohidratos (tal como fórmula (A)).
Definiciones
El término “grupo de enlace” se refiere a cualquier grupo adecuado para el acoplamiento del agente de ARNi al resto de GalNAc. Se proporcionan ejemplos de grupos de enlace en la Publicación Internacional Núm. WO 2009/082607 y en la publicación de patente de Estados Unidos Núm. 2012/0136042.
El término “agente de ARNi” se refiere a un agente de ARN (o agente que puede escindirse en un agente de ARN) que puede regular descendentemente la expresión de un gen diana (por ejemplo, un ARNip), preferentemente un ARN diana endógeno o patógeno. Sin querer estar limitado por la teoría, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de una serie de mecanismos, que incluyen la escisión postranscripcional de un ARNm diana (que se denomina en la técnica como ARNi), o mecanismos pretranscripcionales o pretraduccionales. Un agente de a Rní puede incluir una sola hebra o puede incluir más de una hebra, por ejemplo, puede ser un agente de ARNi de doble hebra. Si el agente ARNi es una sola hebra, puede incluir una modificación 5' que incluye uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato. En una modalidad preferida, el agente de ARNi está bicatenario.
El agente de ARNi típicamente incluye una región de suficiente homología con el gen diana, y tiene suficiente longitud en términos de nucleótidos, de manera que el agente de ARNi, o un fragmento de este, puede mediar en la regulación descendente del gen diana. El agente de ARNi es o incluye una región que es al menos parcialmente, y en algunas modalidades completamente, complementaria al ARN diana. No es necesario que haya una complementariedad perfecta entre el agente ARNi y la diana, pero la correspondencia es preferentemente suficiente para permitir que el agente ARNi, o un producto escisión del mismo, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, por ejemplo, mediante la escisión de ARNi del ARN diana, por ejemplo, ARNm.
Los nucleótidos en el agente de ARNi pueden modificarse (por ejemplo, uno o más nucleótidos pueden incluir un grupo 2'-F o 2'-OC.H3), o ser sustitutos de nucleótidos. Las regiones monocatenarias de un agente a Rní pueden modificarse o incluir sustitutos nucleosídicos, por ejemplo, la región o regiones no apareadas de una estructura de horquilla, por ejemplo, una región que une dos regiones complementarias, puede tener modificaciones o sustitutos nucleosídicos. La modificación para estabilizar uno o más 3'- o 5'-terminales de un agente de ARNi, por ejemplo, contra exonucleasas. Las modificaciones pueden incluir enlaces amino C3 (o C6, C7, C12), enlaces tiol, enlaces carboxilo, separadores no nucleotídicos (C3, C6, C9, C12, abásicos, trietilenglicol, hexaetilenglicol), reactivos especiales de biotina o fluoresceína que vienen como fosforamiditas, y que tienen otro grupo hidroxilo protegido con DMT, lo que permite acoplamientos múltiples durante la síntesis del a Rn . Las modificaciones también pueden incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en el grupo 2' OH de la azúcar ribosa, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos, por ejemplo, desoxitimidina, en lugar de ribonucleótidos, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosfotioato. En algunas modalidades, las diferentes hebras incluirán diferentes modificaciones.
En algunas modalidades, se prefiere que las hebras se elijan de manera que el agente ARNi Incluya una única hebra o región no apareada en uno o ambos extremos de la molécula. Un agente de ARNi bicatenario tiene preferentemente sus hebras emparejadas con un saliente, por ejemplo, uno o dos salientes 5' o 3' (preferentemente al menos un saliente 3' de 2-3 nucleótidos). Los agentes ARNi preferidos tendrán salientes monocatenarios, preferentemente 3' salientes, de 1 o preferentemente 2 o 3 nucleótidos de longitud en cada extremo. Los salientes pueden ser el resultado de que una hebra es más larga que la otra, o el resultado de que dos hebras de la misma longitud estén escalonadas.
Las longitudes preferidas para las regiones dúplex entre las hebras del agente de ARNi están entre 6 y 30 nucleótidos de longitud. Las regiones dúplex preferidas están entre 15 y 30, con la máxima preferencia 18, 19, 20, 21, 22 y 23 nucleótidos de longitud. Otras regiones dúplex preferidas están entre 6 y 20 nucleótidos, con la máxima preferencia 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 nucleótidos de longitud.
El término "soporte sólido", como se usa en la presente descripción, denota en particular cualquier partícula, microesfera o superficie sobre la cual puede ocurrir la síntesis de un oligonucleótido. Los soportes sólidos que pueden usarse en las diferentes modalidades de los procesos descritos en la presente descripción pueden seleccionarse, por ejemplo, de soportes inorgánicos y soportes orgánicos. Los soportes inorgánicos se seleccionan preferentemente de gel de sílice y vidrio de poro controlado (CPG). Los soportes orgánicos se seleccionan preferentemente entre poliestireno altamente reticulado, Tentagel (copolímeros injertados que consisten en una matriz de poliestireno poco reticulado en la que se injerta polietilenglicol (PEG o POE)), polivinilacetato (PVA), Poros - un copolímero de poliestireno/divinilbenceno, aminopolietilenglicol y celulosa. Los soportes sólidos preferidos susceptibles en la presente descripción incluyen aquellos que son hidrófobos. Las modalidades preferidas utilizan soportes sólidos a base de poliestireno. Muchos otros soportes sólidos están disponibles comercialmente y pueden utilizarse en la presente descripción.
El término "grupo protector de hidroxilo", como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto químico lábil que protege a un grupo hidroxilo contra reacciones no deseadas durante procedimiento(s) sintéticos. Después del(de los) procedimiento(s) sintético(s), el grupo protector de hidroxi puede eliminarse selectivamente. Los grupos protectores de hidroxilo como se conoce en la técnica se describen generalmente en T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3ra edición, John Wiley & Sons, Nueva York (1999). Los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo incluyen benciloxicarbonilo, 4-nitrobenciloxicarbonilo, 4-bromobenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, metoxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, difenilmetoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo, 2-furfuriloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, acetilo, formilo, cloroacetilo, trifluoroacetilo, metoxiacetilo, fenoxiacetilo, benzoilo, metilo, t-butilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 1,1 -dimetil-2-propenilo, 3-metil-3-butenilo, alilo, bencilo, para-metoxibencildifenilmetilo, trifenilmetilo (tritilo), tetrahidrofurilo, metoximetilo, metiltiometilo, benciloximetilo, 2,2,2-tricloroetoximetilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, metanosulfonilo, paratoluenosulfonilo, trimetilsililo, trietilsililo y triisopropilsililo. Los grupos protectores de hidroxilo preferidos son acetilo (Ac o — C(O)CHs), benzoilo (Bz o — C(O)C6Ha) y trimetilsililo (TMS o --Si(CH3)a).
El término "grupo protector de amina," como se usa en la presente descripción, se refiere a un resto químico lábil que protege a un grupo amino contra reacciones no deseadas durante procedimientos sintéticos. Después del(de los) procedimiento(s) sintético(s), el grupo protector de amina como se describió en la presente descripción puede eliminarse selectivamente. Los grupos protectores amino como se conoce en la técnica se describen generalmente en T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3ra edición, John Wiley & Sons, Nueva York (1999). Los ejemplos de grupos protectores de amino incluyen t-butoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo y benciloxicarbonilo.
El término "grupo protector de ácido carboxílico" se refiere a los grupos protectores del ácido carboxílico que se emplean para bloquear o proteger la funcionalidad del ácido carboxílico mientras se llevan a cabo reacciones que involucran otros sitios funcionales del compuesto. Tales grupos protectores de carboxilos pueden observarse por su facilidad de escisión por métodos hidrolíticos o hidrogenolíticos al ácido carboxílico correspondiente. Los ejemplos de grupos que protegen los ésteres de ácido carboxílico incluyen metilo, terc-butilo, bencilo, 4-metoxibencilo, alcanoiloximetilo C2-C6 , 2-yodoetilo, 4-nitrobencilo, difenilmetilo (benzhidrilo), fenacilo, 4-halofenacilo, dimetilalilo, 2,2,2-tricloroetilo, tri(alquilo C1 -C3)sililo, succinimidometilo y restos que forma ésteres similares. Además de la protección de los ésteres de los grupos carboxilos, tales grupos también pueden protegerse como anhídrido mixto, tal como el que se forma con cloruro de acetil, cloruro de propionilo, cloruro de isobutirilo y otros cloruros ácidos en presencia de una base amina terciaria. Otros grupos protectores de carboxi conocidos, tales como los que se describen por E. Haslam in Protective Groups in Organic Chemistry, supra, Capítulo 5, son adecuados. Se prefieren los grupos protectores que forman ésteres.
En las definiciones anteriores, los grupos protectores de hidroxi y carboxi no se definen exhaustivamente. La función de tales grupos es proteger los grupos funcionales reactivos durante las etapas preparativas y luego eliminarlos en algún momento posterior sin alterar el resto de la molécula. Muchos grupos protectores se conocen en la técnica, y usar otros grupos protectores que no se mencionan específicamente en la presente descripción es igualmente aplicable.
Los reactivos de acoplamiento de péptidos adecuados incluyen DCC (diciclohexilcarbodiimida), DIC (diisopropilcarbodiimida), di-p-toluoilcarbodiimida, BDP (1-benzotriazol dietilfosfato-1 -ciclohexil-3-(2-morfoliniletil)carbodiimida), EDC (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil-3-etil-carbodiimida)), fluoruro cianúrico, cloruro cianúrico, TFFH (hexafluorofosfato de tetrametil fluoroformamidinio), DPPA (difenilfosforazidato), BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino) fosfonio ), HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio), TBTU (tetrafuoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio), TSTU (tetrafuoroborato de O—(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio), HATU (hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1-H-1,2,3-triazolo[4,5,6]-piridin-1-ilmetileno]-N-metilmetanaminio N-óxido), BOP-Cl (cloruro de (bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico), PyBOP ((tetrafluorofosfato de 1 -H-1,2,3-benzotriazol-1 -iloxi)-tris(pirrolidino)fosfonio), BrOP (hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)fosfonio), DEPBT (3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona) PyBrOP hexafluorofosfato de (bromotris(pirrolidino)fosfonio). EDC, BOAT, BOP-Cl y PyBrOP son los reactivos de acoplamiento de péptidos preferidos. La cantidad de reactivo de acoplamiento de péptidos está en el intervalo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 equivalentes. Los reactivos opcionales que pueden usarse en la reacción de formación de enlaces amida incluyen DMAP (4-dimetilaminopiridina) o reactivos de éster activo, tales como HOBT (1-hidroxibenzotriazol), HOAT (hidroxiazabenzotriazol), HOSu (hidroxisuccinimida), HONB (endo-N-hidroxi-5-norbomeno-2,3-dicarboxamida), en cantidades de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 equivalentes.
El término “halo” se refiere a cualquier radical de flúor, cloro, bromo o yodo.
El término “alquilo” se refiere a cadenas de hidrocarburos no aromáticos saturadas e insaturadas que pueden ser una cadena recta o una cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono (estos incluyen, sin limitación, propilo, alilo, o propargilo), que pueden interrumpirse opcionalmente con N, O, o S. Por ejemplo, C 1-C10 indica que el grupo puede tener de 1 a 10 (inclusive) átomos de carbono. El término “alquileno” se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-).
El término “alcoxi” se refiere a un radical -O-alquilo.
El término “alquilenodioxo” se refiere a una especie divalente de la estructura -O-R-O-, en la que R representa un alquileno.
El término “aminoalquilo” se refiere a un alquilo sustituido con un grupo amino.
El término “mercapto” se refiere a un radical -SH.
El término “tioalcoxi” se refiere a un radical -S-alquilo.
El término “arilo” se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 6 carbonos o bicíclicos de 10 carbonos en donde los átomos 0, 1, 2, 3 o 4 de cada anillo pueden sustituirse por un sustituyente. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo y naftilo.
Los términos “arilalquilo” y “aralquilo” se refieren a un alquilo sustituido con un arilo.
El término “arilalcoxi” se refiere a un alcoxi sustituido con un arilo.
El término “cicloalquilo” como se emplea en la presente descripción incluye grupos de hidrocarburos cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen de 3 a 12 carbonos, por ejemplo, de 3 a 8 carbonos, y, por ejemplo, de 3 a 6 carbonos, en donde adicionalmente el grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
El término “heteroarilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclicos de 5-8 miembros, bicíclicos de 8­ 12 miembros, o tricíclicos de 11-14 miembros que tienen de 1-3 heteroátomos si son monocíclicos, de 1-6 heteroátomos si son bicíclicos o de 1-9 heteroátomos si son tricíclicos, donde los heteroátomos se seleccionan de O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6, o 1-9 heteroátomos de N, O, o S si son monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), y 0, 1,2, 3. o 4 átomos de cada anillo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo y tiazolilo.
Los términos “heteroarilalquMo” y “heteroaralquilo” se refieren a un alquilo sustituido con un heteroarilo.
El término “heteroarilalcoxi” se refiere a un alcoxi sustituido con un heteroarilo.
El término “heterociclilo” se refiere a un sistema de anillos tricíclicos no aromáticos monocíclicos de 5-8 miembros, bicíclicos de 8-12 miembros o tricíclicos de 11-14 miembros que tienen de 1-3 heteroátomos si son monocíclicos, de 1-6 heteroátomos si son bicíclicos, o de 1-9 heteroátomos si son tricíclicos, donde los heteroátomos se seleccionan de O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, O S si son monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), y 0, 1,2 o 3 átomos de cada anillo pueden sustituirse por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen trizolilo, tetrazolilo, piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo y tetrahidrofuranilo. El término “oxo” se refiere a un átomo de oxígeno, que forma un carbonilo cuando se une al carbono, un N-óxido cuando se une al nitrógeno, y un sulfóxido o sulfona cuando está unido al azufre.
El término “acilo” se refiere a un sustituyente alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, arilcarbonilo, heterociclilcarbonilo, o heteroarilcarbonilo, cualquiera de los cuales puede sustituirse además por uno o más sustituyentes.
El término "sustituido" se refiere a la sustitución de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada por el radical de un sustituyente especificado que incluye, pero no se limita a: halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heterociclilo, tiol, alquiltio, ariltio, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilalquilo, arilsulfonilalquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, haloalquilo, amino, trifluorometilo, ciano, nitro, alquilamino, arilamino, alquilaminoalquilo, arilaminoalquilo, aminoalquilamino, hidroxi, alcoxialquilo, carboxilalquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilalquilo, acilo, aralcoxicarbonilo, ácido carboxílico, ácido sulfónico, sulfonilo, ácido fosfónico, arilo, heteroarilo, heterocíclico y alifático. Se entiende que el sustituyente puede estar aún más sustituido.
Esquemas de reacción
Como se muestra en cualquiera de los Esquemas 1-8 más abajo, Ac y Bz pueden reemplazarse por cualquier grupo protector de hidroxi, como se describió en la presente descripción. Boc puede reemplazarse por cualquier grupo protector de amina, como se describió en la presente descripción.
Conversión del Compuesto 1 en el Compuesto 7A
El Compuesto 1 puede convertirse en el compuesto 7A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 1 más abajo.
Esquema 1
Figure imgf000017_0001
El Compuesto 1 se convierte en un compuesto protegido por nitrógeno, tal como el compuesto 2A, por ejemplo, a través de la reacción con Boc2O y trietilamina. El compuesto éster metílico 2A subsecuentemente se reduce al alcohol correspondiente, por ejemplo, con borohidruro de litio como agente reductor en un solvente polar tal como THF. La reacción de 3A con ácido clorhídrico proporciona la sal clorhídrica 4A. El rendimiento general para estas tres etapas de conversión de 1 a 4A es -62 %.
El átomo de nitrógeno del compuesto de prolinol 4A se protege, por ejemplo con un grupo -COCF3 como en 5A, como a través de la reacción con CF3CO2Et en acetonitrilo en presencia de una amina tal como trietilamina. El grupo hidroximetilo del compuesto 5A se convierte en -CH2-ODMTr de 6A, por ejemplo, a través de la reacción con DMTrCl (cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo) en presencia de DMAP y piridina. El átomo de nitrógeno del compuesto 6A se desprotege, por ejemplo, mediante la reacción de 6A con una base (por ejemplo, hidróxido de potasio) en un alcohol (por ejemplo, metanol), para proporcionar el compuesto 7A.
Las ventajas del proceso descrito en el Esquema 1 incluyen (i) no implica reacciones de hidrogenación, por lo que se elimina de esta manera la necesidad de usar un reactivo costoso tal como Pd sobre carbono, (ii) el compuesto 4A es cristalino, lo que hace que sea más fácil de manipular y purificar, y (iii) no se introducen contaminantes de metales pesados (como Pd) en el sistema.
Conversión alternativa del Compuesto 1 en el Compuesto 4A
Alternativamente, el compuesto 1 puede convertirse en el compuesto 4A en un proceso de una etapa al reaccionar el compuesto 1 con un alcóxido, tal como el metóxido de sodio, añadir un agente reductor (por ejemplo, borohidruro de sodio) y luego añadir ácido clorhídrico. El rendimiento general de este proceso de una sola etapa es del 84 %.
Conversión del Compuesto 8 en el Compuesto 13A
El Compuesto 8 puede convertirse en el Compuesto 13A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 2 más abajo.
Esquema 2
Figure imgf000018_0001
Los grupos hidroxilo en las posiciones 1, 3, 4 y 6 del compuesto de azúcar 8 se protegen, por ejemplo con los grupos acetilo (Ac), y el grupo amino en la posición 2 se sustituye, por ejemplo, con un grupo acetilo, para producir el compuesto 9. Por ejemplo, el compuesto 8 puede reaccionar con AC2O y DMAP en presencia de trietilamina para proporcionar el compuesto 9. El grupo hidroxilo en la posición 1 se activa, por ejemplo, mediante la conversión del compuesto 9 en el compuesto 10 mediante la reacción con TMSOTf en dicloroetano. La reacción del compuesto 10 con el compuesto 11A (que puede formarse a partir de valerolactona y metanol) proporciona el compuesto 12A. Los grupos hidroxilo en las posiciones 3, 4 y 6 se desprotegen, por ejemplo, mediante la reacción con trietilamina en metanol, para producir el compuesto 12B. Los grupos de alcohol pueden volver a protegerse, por ejemplo, con grupos bencilo mediante la reacción con BZ2O en presencia de DMAP y piridina para proporcionar el compuesto 12C. A continuación, el grupo éster metílico del compuesto 12C se hidroliza para producir el compuesto 13A, por ejemplo, mediante la reacción con yoduro de litio y piridina, seguido de la adición de trietilamina, cloruro de sodio y agua.
Las ventajas del proceso descrito en el Esquema 2 incluyen (i) que no está involucrada la etapa de oxidación de metales pesados (tal como rutenio), y (ii) que los compuestos 12B y 12C son cristalinos, lo que los hace más fáciles de manipular y purificar.
Conversión del Compuesto 16 en el Compuesto 19A
El Compuesto 16 puede convertirse en el Compuesto 19A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 3 más abajo.
Esquema 3
Figure imgf000019_0001
El compuesto 16 se convierte en el compuesto 17A por ejemplo mediante la reacción con acrilato de 1 -butilo e hidróxido de sodio. La reacción del compuesto 17A con el compuesto 15A en presencia de un reactivo de acoplamiento de péptidos (tal como EDC), HCl, DIEA y t-butanol proporciona el compuesto 18A, que se convierte en el ácido tris 19A, por ejemplo, mediante la reacción con ácido metanoico.
Las ventajas del proceso descrito en el Esquema 3 incluyen (i) se elimina el uso de cloroformiato de bencilo, (ii) no se requieren reacciones de hidrogenación (de esta manera se evita la posible introducción de metales pesados tal como Pd), y (iii) el compuesto 19A es cristalino. Además, el uso del compuesto 15A, que está disponible comercialmente, reduce el número de etapas sintéticas, ya que no se requieren etapas sintéticas adicionales para preparar un análogo protegido con monoéster, tal como el ácido 12-(benciloxi)-12-oxododecanoico, que puede prepararse a partir del ácido 1,12-dodecanoico.
Conversión del Compuesto 19A en el Compuesto 25A
El Compuesto 16 puede convertirse en el Compuesto 19A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 4 más abajo.
Esquema 4
Figure imgf000020_0001
La reacción del compuesto 19A con el compuesto 21 en presencia de un reactivo de acoplamiento de péptidos (tal como EDC), HCl, DIEA y t-butanol proporciona el compuesto 24A. Los grupos terminales amino del compuesto 24A están desprotegidos, por ejemplo, mediante la reacción con TFA (ácido trifluoroacético) para proporcionar el compuesto 25A.
Alternativamente, el compuesto 24A puede desprotegerse mediante la reacción con un ácido sulfónico (por ejemplo, ácido p-tolueno sulfónico o ácido metano sulfónico) en un solvente alcohólico. El uso de un ácido sulfónico (en un solvente alcohólico tal como metanol) proporciona una mayor desprotección (es decir, reduce la posibilidad de una desprotección incompleta) del compuesto 24A, probablemente debido a la solubilidad mejorada de la triamina en el alcohol.
Conversión del Compuesto 25A en el Compuesto 26A
El Compuesto 25A puede convertirse en el Compuesto 26A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 5 más abajo.
Esquema 5
Figure imgf000021_0001
La reacción del compuesto 25A con un reactivo de acoplamiento de péptidos (tal como EDC), DIEA en dimetilformamida y t-butanol proporciona el compuesto 26A. Usar EDC como agente de acoplamiento proporciona un mayor rendimiento del compuesto 26A.
Conversión del Compuesto 26A en el Compuesto 27A
El Compuesto 26A puede convertirse en el Compuesto 27A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 6 más abajo.
Esquema 6
Figure imgf000021_0002
El extremo del ácido carboxílico del compuesto 26A se desprotege para proporcionar el compuesto 27A. El compuesto 26A puede convertirse en el compuesto 27A mediante la reacción con (i) un alcóxido (por ejemplo, metóxido de sodio) en un alcohol (por ejemplo, metanol), (ii) un hidróxido (por ejemplo, hidróxido de sodio) y (iii) Ac2O en piridina. No se requiere una etapa de hidrogenación en esta conversión de 26A a 27A.
Conversión del Compuesto 27A en el Compuesto 29A
El Compuesto 27A puede convertirse en el Compuesto 29A a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 7 más abajo.
Esquema 7
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La reacción del compuesto 27A con el compuesto 7A (que puede prepararse como se describió anteriormente) en presencia de un reactivo de acoplamiento de péptidos (tal como HBTU), DIEA y t-butanol proporciona el compuesto 29A. Las ventajas del proceso descrito en el Esquema 7 incluyen (i) no se requiere el uso de una sal de fluoruro (es decir, ion fluoruro), por lo que se elimina de esta manera la formación de impurezas (tales como los compuestos 29-1 y 29-2 que se muestran más abajo) debido a las posibles reacciones secundarias que pueden ocurrir debido a la presencia del ion de fluoruro básico, y (ii) se elimina el uso costoso de piridina y el ácido fluorhídrico.
Figure imgf000022_0002
Conversión del Compuesto 29A en el Compuesto 31
El Compuesto 29A puede convertirse en el Compuesto 31 a través de la secuencia de reacciones que se muestra en el Esquema 8 más abajo.
Esquema 8
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
La reacción del compuesto 29A con anhídrido succínico en presencia de una base (por ejemplo, trietilamina) proporciona el compuesto 30, que puede cargarse en un soporte sólido para proporcionar el compuesto 31.
Las ventajas del proceso que se muestra en el Esquema 8 incluyen: (i) se elimina el uso de catalizadores costosos usados típicamente en esta reacción, tal como DMAp (dimetilamino piridina) o un DMAP inmovilizado (tal como PS-DMAP, un equivalente de DMAP ligado a poliestireno), (ii) se reduce el número de impurezas potenciales en el producto (debido a reacciones de oligomerización), y (III) se elimina la posibilidad de contaminación por metales pesados (como Pd o Ru cuando se utilizan como catalizadores).
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como una limitación adicional.
Ejemplos
Procedimiento experimental: Proceso de GalNAc
Ejemplo 1 - Síntesis del compuesto 2
Figure imgf000024_0001
A una solución agitada de éster dimetílico 1 (200 g, 774,65 mmol) en dietiléter y acetonitrilo se añadió KOH (891,4 mmol) disuelto en MeOH gota a gota entre 0-5 °C durante 1 hora y la mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 48 horas adicionales. Se filtró el sólido blanco mediante el uso de un embudo sinterizado luego se lavó con dietiléter (100 ml) y se secó por succión durante 3 horas. El sólido blanco obtenido anteriormente se disolvió en agua (500 ml) luego se acidificó con HCl 1 mol/l (1 N) a pH ~3-4 y el sólido blanco se recogió mediante alteración seguido de lavado con agua (50 ml x 2). Este material se secó al aire durante un día y a continuación se secó en presencia de P2O5 , obteniéndose el producto 2 (166 g, 88 %) en forma de polvo blanco.
Ejemplo 2 - Síntesis del compuesto 5
Figure imgf000024_0002
Reactivos y condiciones: (i)[1]. BOc2O, Et3N, DCM, (i)[2], LiBH4, THF e (i)[3], HCl en éter. (ii)[1] Trifluoroacetato de etilo, Et3N; (ii)[2] DMTr-Cl/Py o DMTr-CI, DMAP/Py y (ii)[3] KOH ac.
Síntesis del compuesto 4
Etapa (i)[1]: A una suspensión de éster metílico de transhidroxiprolina-HCL 3 (100 g, 552,3 mmol) y Boc2O (132,5 g, 607,57 mmol) en DCM (3 l) se añadió gota a gota Et3N a ~0-5 °C durante 1 hora y se llevó lentamente a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió agua (50 ml) y se concentró el solvente orgánico, a continuación de la concentración del solvente se obtuvo el material crudo (~115 g) que fue usado para la siguiente etapa sin purificación.
1H RMN (CDC13): 1,42, 1,46 (s, 9H), 1,75-1,77 (m, 2H), 2,07-2,11 (m, 1H), 2,26-2,34 (m, 1H), 3,44-3,67 (m, 3H), 3,74 (s, 3H), 4,4 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,48-4,51 (m, 1H).
Etapa (i)[2]: A una solución agitada de éster metílico de prolinol protegido por NBoc (115 g, 469 mmol) en THF a ~0 °C se añadió LiBH4 en porciones a lo largo de una hora y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió 50 ml de solución de NaOH 1 mol/l (1 N) y se concentró el solvente seguido de extracción con DCM (2 x 500 ml), lavado con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La concentración del solvente dio diol crudo (92 g) como aceite incoloro (92 g). 1H RMN (CDC13 ): 1,48 (s, 9H), 1,74 (br s, 1H), 2,02-2,08 (m, 1H), 2,63 (br s, 2H), 3,42-3,75 (m, 4H), 4,11-4,17 (m, 1H), 4,38-4,39 (m, 1H).
Etapa (i)[3]: A una solución agitada de NBoc diol (57 g, 262,52 mmol) en éter (150 ml) se añadió HCl en éter (50 ml) y se agitó durante toda la noche. El sólido blanco se filtró y se lavó con éter (50 ml). El filtrado se mantuvo a ~0 °C durante 6 h y el sólido se filtró y se lavó con éter (25 ml). Ambos lotes se combinaron y se secaron en presencia de P2O5 a presión reducida a un peso constante 4 (31 g). 1H RMN (D2O): 1,94-2,01 (m, 1H), 2,14-2,19 (m, 1H), 3,30-3,48 (m, 2H), 3,71-3,76 (m, 1H), 3,93-4,08 (m, 2H), 4,67-4,75 (m, 1H).
Síntesis del compuesto 5
Etapa (ii)[1]: La reacción se realizó en un reactor de vidrio de 5 bocas de 15 l provisto de un agitador superior sobre un baño de hielo. A una solución agitada de 4 (450 g, 2,94 moles) en acetonitrilo (8 l) se añadieron Et3N (1 l, 7,2 moles) y trifluoroacetato de etilo (1000 g, 7,04 moles), y se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. El sólido blanco (EtaN.HCl) se filtró sobre el embudo sinterizado y se lavó con acetato de etilo (4 l). La solución orgánica se concentró seguido de una evaporación con tolueno (2 l x 2) y se secó a presión reducida durante toda la noche en un evaporador giratorio de 22 l para obtener un producto crudo como una masa gomosa (~600 g).
Etapa (ii)[2]: El compuesto crudo que se obtuvo anteriormente (2,94 moles) se disolvió en 2 l de piridina anhid. y se transfirió al matraz de cuatro bocas de 15 l. Se añadieran otros 6 l de piridina anhid. Esta solución se enfrió a ~5 °C mediante el uso de un baño de hielo, seguido de la adición de DMTr-Cl (1000 g, 2,95) en porciones bajo atmósfera de nitrógeno durante 20 min. y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadieron 12 l de agua mientras se agitaba y se dejó reposar durante 6 h. El compuesto se depositó en la parte inferior del matraz como una masa gomosa marrón. La capa de agua-piridina se decantó mediante el uso de una bomba de transferencia y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 5 l). Combinado el extracto de acetato de etilo con, el material viscoso que permaneció en el reactor, después de decantar la capa de agua. La concentración del solvente dio el producto correspondiente como aceite viscoso que fue usado para la siguiente etapa sin purificación.
Etapa (ii)[3]: A una solución agitada del compuesto trifluoroacetilo (2,94 moles) en MeOH (5 l) se añadió KOH (330 g, 5,88 moles) disuelto en agua (2 l) gota a gota durante 30 min. y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se concentró a un volumen de 3 l, a continuación se añadieron 15 l de agua y se dejó reposar durante toda la noche. El producto se depositó en la parte inferior como aceite viscoso marrón rojizo. Se decantó el agua mediante el uso de la bomba de transferencia y a continuación se añadieron 6 l de DCM para disolver, se lavó con 5 l de agua y se separó el solvente orgánico. La concentración del solvente seguida de purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (sílice de 4 Kg, eluyente: hexano/acetato de etilo y acetato de etilo/MeOH) dio el compuesto 5 (1000 g, 81 %) como sólido blanco amarillento espumoso. 1H RMN (c Dc 13): 1,35-1,42 (m, 1H), 1,65-1,70 (m, 1H), 2,33 (br s, 1H), 2,59-2,62 (m, 1H), 2,72-2,75 (m, 1H), 2,82-2,91 (m, 2H), 3,36-3,41 (m,1H), 3,71 (s, 6H), 4,1 (br s, 1H), 4,525 (d, J = 4,0 Hz, 1H).
Ejemplo 3: Síntesis del compuesto 31
Figure imgf000026_0001
Reactivos y condiciones: (i)[1]. EDC.HCl, DIEA, HOBt / DCM-DMF o HBTU, DIEN DCM- DMF o HBTU, DIEA, HOBt/ DCM-DMF o EDC.HCl, DiEa , A-hidroxisuccinimida o EDC.HCl, DIEA, pentafluorofenol o DCC, DMAP / DCM-DMF o cualquier otro activador de ácido carboxílico para amidación/esterificación y ácido monometil dodecanodoico (i)[2] HCOOH o HCl en éter/dioxano/dioxano-DMF o TFA, (ii)[l]. etapa (i)[l] más Mono Boc 1,3-propanodiamina y (ii)[2] LíOh o NaOH o KOH en ac. THF; (iii)[ 1] etapa (i)[l] más el compuesto 5 y (iii)[2], etapa (i)[2]; (iv) (i)[l] más el compuesto 9; (v) DMTr-Cl/Py o DMTr-Cl, DMAP/py.
Síntesis del compuesto 7
Etapa (i)[1]: El compuesto comercialmente disponible 6 (1081 g, 2,139 mol), el éster metílico de monn de ácido dodecanoico (653 g, 2,673 moles) y el HOBt (433,5 g, 3,209 mol) se disolvieron en una mezcla de DCM (6 l) y DMF (1 l) en un matraz RB de 12 l y 3 bocas equipado con agitador superior bajo argón. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada y se mantuvo la temperatura a ~10 °C. Se añadió EDAC.HCl (531 g, 2,673 mol) lentamente en porciones seguido de DIEA(1,12 l, 6,42 mol) durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación bajo argón durante dos días. Se comprobó por TLC después de dos días mediante el uso de la tinción KMnO4 y se transfirió a un matraz rotavapor y se eliminaron los volátiles a presión reducida. Después de retirar la mayor parte del diclorometano, el matraz se transfirió a una campana y añadieron 15 l de agua con agitación y se mantuvo la mezcla para que se depositara durante toda la noche. La capa superior se decantó y la capa viscosa de la parte inferior se disolvió en 4 l de EtOAc y se lavó con agua (2x4 l), ácido cítrico acuoso al 10 % (2x3,5 l), solución ac. de NaHCO32X4 l seguido de salmuera saturada (2,5 l). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se eliminaron los solventes. El producto crudo se secó bajo alto vacío durante toda la noche y se usó para la siguiente reacción sin ninguna otra purificación (1641 g, cuantitativo). CL- EM, Cal, para C38H69NO12 PM: 731,48; encontrado 732,3 (M+H). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 56,85 (s, 1H), 3,53 (dd, J = 12,9, 6,9 Hz, 16H), 3,30 (s, 1H), 2,49 (dd, J = 3,5, 1,7 Hz, 2H), 2,37 (t, J = 6,1 Hz, 7H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,02 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,56 - 1,44 (m, 3H), 1,44 -1,34 (m, 32H), 1,21 (s, 13H).
Etapa (i)[2]: El compuesto anterior de la etapa (i)[1] (1560 g, 2,134 moles) se introdujo en un matraz RB de 3 cuellos de 22 l equipado con un agitador superior bajo argón. Se añadió ácido fórmico (10 kg) al ácido y se agitó la mezcla durante 24 horas. La TLC mostró que quedaba una pequeña cantidad de material de partida. Se añadió más ácido fórmico (4 l) y continuó la agitación durante otras 24 horas. La TLC y los espectros de masas mostraron la terminación de la reacción y la mezcla se transfirió al evaporador giratorio de 20 l y se eliminaron los volátiles a presión reducida. Después de la eliminación del ácido fórmico, el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno (4,5 l X2). Al residuo anterior se añadieron 8 l de EtOAc/hexano al 50 % con rotación lenta, precipitó un sólido blanco de la solución y la mezcla se agitó durante 2 h. La mezcla se filtró y se lavó con 4 l de EtOAc/hexano al 50 % seguido de 4 l de éter anhidro. El compuesto 7 se secó al aire a 45 °C hasta que alcanzó un peso constante (Rendimiento 1096 g, 91 %). CL- EM calculado para C26H45NO12 PM: 563,29; Encontrado 564,3(M+H). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 8 12,08 (bs, 3H), 6,89 (s, 1H), 3,65 - 3,43 (m, 7H), 2,41 (dt, J = 12,7, 6,3 Hz, 3H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 2,02 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,44 (ddd, J = 19,5, 13,3, 6,7 Hz, 2H), 1,21 (s, 5H).
Síntesis del compuesto 8
Etapa (ii)[1]: A una solución agitada de 7 (89,5 g, 158,7), NBoc diaminopropano (103,6 g, 595 mmol), EDC (113,7 g, 595 mmol), HOBt (96,4 g, 630 mmol) en DCM/DMF (1,5 l/0,5 l) se añadió DIEA (207,4 ml, 1190 mmol) gota a gota durante 10 min. y se agitó a temperatura ambiente durante 14 h. Se añadieron 100 ml de agua y se evaporó DCM a presión reducida. Se añadió 1 l de agua, a continuación se decantó cuidadosamente la capa de agua y este procedimiento se repitió dos veces. El aceite viscoso que se obtuvo se disolvió en DCM (500 ml), a continuación se lavó con agua (500 ml), ácido cítrico al 10 % (500 ml), NaHCO3 sat. (250 ml), salmuera (200 ml) y se secó sobre Na2SO4. La concentración del solvente dio el producto correspondiente (157 g) como un aceite viscoso incoloro. LCMS: Calculado: 1031,67 (M+), Encontrado: 1066,4 (M++ C1)
Etapa (ii)[2]: A una solución agitada de éster metílico (135 g, 131 mmol) en 1,5 l de THF se añadió ac. LiOH (13 g en 0,5 l de agua, 309,5 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 14 h. El solvente se evaporó a ~1 l, a continuación se añadieron 2 l de agua. Esta solución acuosa se lavó con acetato de etilo (1 l x 2), a continuación se ajustó el pH a 2-3 con ácido cítrico al 20 %, se extrajo con DCM (1 l x 2), se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y la concentración del solvente dio 8 (107 g) como aceite viscoso incoloro. LCMS para el compuesto 8: Calculado: 1017,66 (M+), Encontrado: 1016,6 (M+-l)
Síntesis del compuesto 9
Etapa (iii)[1]: A una solución agitada de ácido 8 (28 g, 27,514 mmol) trans hidroxilprolinol 4 (6,3 g, 41,27 mmol) y HOBt (16,84 g, 110,06 mmol) en DCM/DMF (250 ml/250 ml) se añadió DIEA gota a gota (17,75 g, 137,57 mmol) a temperatura ambiente durante 5 min. y se agitó durante 30 min. A la solución anterior se añadió HBTU (13,05, 34,39 mmol) en porciones durante 10 min. y se agitó durante 3 h. Se añadieron 100 ml de agua, seguidos de evaporación de DCM y luego se añadieron 500 ml de agua y se dejaron en reposo durante 1 h. Se decantó la solución turbia y el sólido pegajoso se rodeó con agua (100 ml x 3). El material gomoso se disolvió al 20 % de MeOH en DCM (500 ml) y se concentró seguido de una evaporación conjunta con tolueno (100 ml x 2) para obtener el producto correspondiente (31 g) como sólido espumoso amarillento. LCMS: Calculado: 1116,73 (M+), Encontrado: 1117,7 (M++l), 1139,6 (M++Na).
Etapa (iii)[2]: A una solución agitada del compuesto anterior (29 g, 25,9 mmol) en 150 ml de MeOH se añadió HCl 2 mol/l (2 M) en éter dietílico gota a gota durante 10 min. y se agitó durante 3 h. Se añadieron 300 ml de éter dietílico anhidro y se dejó reposar durante 30 min. El solvente orgánico se decantó, se lavó con éter dietílico (200 ml x 2). Se secó el material gomoso a presión reducida para obtener el polvo blanco 9 (23,2 g). LCMS para el compuesto 9: Calculado: 816,57 (M+), Encontrado: 817,4 (M++l), 839,3 (M++Na)
Métodos alternativos para la etapa (iii)[2]:
(A) El compuesto NBoc anterior (0,475 g, 0,425 mmol) se disolvió en 10 ml. de HCOOH al 95 % y se agitó durante 3 h. El solvente orgánico se concentró para proporcionar el producto correspondiente en rendimiento cuantitativo. LCMS para el compuesto 9: Calculado: 816,57 (M+), Encontrado: 817,4 (M++l), 839,3 (M++Na)
(B) El compuesto NBoc anterior (0,475 g, 0,425 mmol) se disolvió en 10 ml de TFA al 20 % en DCM y se agitó durante 3 h. El solvente orgánico se concentró para proporcionar el producto correspondiente en rendimiento cuantitativo. LCMS para el compuesto 9: Calculado: 816,57 (M+), Encontrado: 817,4 (M++l), 839,3 (M++Na)
Síntesis del compuesto 31
Etapa (iv): A una solución agitada de 25 (10 g, 15,79), EDC (3,79 g, 19,84 mmol), N-hidroxisuccinimida (2,27 g, 19,73 mmol) en DCM (200 ml) se añadió DIEA (5,09 g, 39,46 mmol) gota a gota durante 5 min y se agitó a temperatura ambiente durante 14 h. Se añadieron 50 ml de agua, a continuación se extrajo con DCM (2 x 100 ml), se lavó con agua, ácido cítrico al 10 % (100 ml), NaHCO3 sat. (250 ml), salmuera (200 ml) y se secó sobre Na2SO4. La concentración del solvente dio el producto correspondiente (12 g) como sólido amarillento y fue usado para la siguiente etapa sin purificación.
A una solución agitada de la amina 9 (22 g, 23,8 mmol) en DMF (500 ml) se añadieron Et3N gota a gota y azúcar NHS (55,6 g, 76,16 mmol, obtenido de la etapa anterior) de una sola vez y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche (12 h). Se añadió 1 l de agua a la mezcla de reacción y se dejó reposar 1 h. La solución de agua turbia/DMF se decantó, se rodeó con agua (100 ml x 2). El material gomoso se disolvió en DCM (-500 ml), se secó sobre Na2SO4. La concentración del solvente dio el material crudo, que se purificó por cromatografía en columna (0-20 % de MeOH en DCM) para obtener el producto correspondiente (27,5 g, 48 %). MALDI: Calculado: 2662,20 (M+), Encontrado: 2686,08 (M++Na), 2702,74 (M++K).
Etapa (v): A una solución agitada de alcohol (420 mg, 0,158 mmol) en piridina seca (10 ml) se añadieron DMTrCl (64 mg, 0,19 mmol) y DMAP (10 mg, 0,08 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadieron otros 107 mg (0,32 mmol) de DMTrCl y se agitó durante 6 h. La reacción se apagó con agua (10 ml) seguido de concentración a un volumen de 10 ml. Se decantó la capa de agua y el material gomoso se rodeó con 10 ml de agua dos veces. Este material se disolvió en DCM (10 ml), se secó sobre Na2SO4 y la concentración del solvente dio el material crudo que se purificó por cromatografía en columna para obtener 11 (250 mg, rendimiento 74 %). MALDI para el compuesto 11: Calculado: 2964,33 (M+), Encontrado: 2988,85 (M++Na), 3002,77 (M++K).
Ejemplo 4 - Síntesis del ácido monocarboxílico 30
Figure imgf000028_0001
Reactivos y condiciones: (i)[1]. AC2O, DMAP, ET3N/ Py y (i)[2]. TMSOTf/ 1,2-dicloroetano; (ii) MeOH, ET3N; (iii)[1]. TMSOTf/ 1,2-dicloroetano y (iii)[2]. Et3N /MeOH; (iv)[1] BZ2O, DMAP/Py y (iv)[2]. Lil/Py, reflujo para R = Bz; (v)[1], Ac. NaOH y (v)[2]. Ac2O, DMAP/Py para R = Ac; (vii)[1 ]. EDC.HCl, DIEA, HOBt / DCM-DMF o HBTU, DIEN DCM-DMF o HBTU, DIEA, HOBt/ DCM-DMF o EDC.HCl, DIEA, N-hidroxisuccinimida o EDC.HCl, DIEA, pentafluorofenol o DCC, DMAP / DCM-DMF o cualquier otro activador del ácido carboxílico para amidación/esterificación y Mono Boc 1,3-propanodiamina (vii)[2]. TFA, anisol, ta; o HCl/MeOH/Doxano o ácido p-Toluenosulfónico/MeOH a 60-70 °C (viii)[1 ], etapa (vii)[1], [2]. NaOMe/MeOH, (viii)[3], Acuoso, NaOH y (viii)[4]. Ac2O/Py.
Síntesis del compuesto 21
Etapa (i)[1]: Se añadió piridina anhidra (7,2 l) a una suspensión agitada y enfriada (sobre un baño de hielo) de galactosamina.HCl 20 (1,63 kg, 7,55 mol) en anhídrido acético (5,3 l) en un reactor de 40 l bajo atmósfera de Ar. Se añadieron consecutivamente DMAP (79 g) y trietilamina (1,05 l, 7,55 mol), y la mezcla se agitó sobre el baño de hielo durante toda la noche, tiempo durante el cual se produjo la disolución 20 seguido de la cristalización del azúcar peracetilado y el clorhidrato de trietilamina junto con un efecto exotérmico de hasta 30 °C durante las primeras 2 horas. La mezcla se filtró a través de un filtro de vidrio sinterizado, y el residuo se lavó con tolueno (~4 l x 2) seguido de agua (~3 l x 2). El residuo cristalino se secó durante toda la noche en el filtro de vidrio, se transfirió a placas de secado y se secó al aire a 70 °C en una placa caliente durante dos días para proporcionar 2,53 kg (86 %) de compuesto peracetilado puro.
Etapa (i)[2]: La reacción se realizó en un reactor de 20 l bajo atmósfera Ar. Se añadió TMSOTf (1,40 l, 7,74 mol) lentamente (10 min) a una suspensión agitada del intermediario de azúcar peracetilado (2,52 kg, 6,49 mol) en DCE anhid. (4,0 l) bajo atmósfera de Ar. La mezcla se agitó a ta durante la noche y se transfirió por línea de transferencia a una mezcla vigorosamente agitada de NaHCO3 (1,64 kg, 19,4 mol), hielo (5,5 l) y agua (5,5 l) en un reactor abierto de 40 l. La agitación continuó durante 40 minutos, la capa orgánica se separó, la capa de agua se lavó con DCM (x2) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhid.. La mezcla se filtró, el solvente se evaporó, el residuo oleoso se secó en el evaporador giratorio (15 mbar a 30 °C), se redisolvió en DCE anhid. (4,0 l), y el solvente se evaporó nuevamente, y se secó en el evaporador giratorio (3 mbar a 30 °C de temperatura del baño) para proporcionar 2,14 kg de 21 crudo. El compuesto crudo en el evaporador giratorio se redisolvió en DCE anhid. (4,0 l) y la solución resultante fue usada en la siguiente etapa.
Síntesis del hidroxiácido 23
La reacción se realizó en un matraz de evaporación giratorio de 20 l bajo un flujo lento de argón. Una solución de valerolactona 22 (98 % de pureza (TCI), 1,0 kg, 10 mol) y trietilamina (140 ml, 1 mol) en metanol seco (4 l) se agitó a ta durante 1 h, tiempo durante el cual se observó un ligero efecto exotérmico (hasta 28 °C). La mezcla se concentró en vacío (baño de calentamiento a 25 °C), se diluyó con tolueno seco (4 l) y se evaporó a presión reducida, y el residuo se secó en un evaporador giratorio a 4 mbar/25 °C seguido de agitación a alto vacío (53,33-79,99 Pa (0,4-0,6 torr), ta) durante toda la noche para proporcionar 23 como un líquido incoloro, 1,39 kg (100 %), que contiene <1 % de tolueno.
Síntesis del compuesto 24
Etapa (iii)[1]: La reacción se llevó a cabo en un reactor de 20 l provisto con una camisa de refrigeración bajo atmósfera de Ar. Se añadió TMSOTf (250 ml, 1,38 mol) a una solución agitada y enfriada (12 °C) de 21 crudo (2,14 kg, <6,49 mol) e hidroxiéster 23 (0,94 l, 7,14 mol) en DCE anhid. (6,5 l). Se observó un efecto exotérmico inmediato (hasta 23 °C), el enfriador se apagó y la mezcla se agitó a ta durante 3 h y se transfirió a un matraz abierto de 22 l con una mezcla vigorosamente agitada de NaHCO3 (168 g, 2,0 mol), agua (3 l) y algo de hielo. La fase orgánica se separó y se secó sobre Na2SO4 anhid., el solvente se evaporó, y el residuo oleoso se secó en un evaporador giratorio a 12 mbar/30 °C para proporcionar 3,09 kg de producto crudo que fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa (iii)[2]: La reacción se realizó en un reactor de filtración de 20 l provisto de una camisa de calentamiento/enfriamiento. El producto bruto que se obtuvo de la etapa anterior (3,09 kg, <6,49 mol) se disolvió en metanol anhidro (10 l) bajo atmósfera de Ar, y se añadió trietilamina (0,90 l, 6,49 mol). La mezcla se calentó a 50 °C durante 2 días, se añadió tolueno (4 l) y la solución se dejó enfriar a ta durante toda la noche tiempo durante el cual ocurrió la cristalización a granel. La suspensión se enfrió a 0 °C, se agitó durante toda la noche, se filtró, y el sólido se lavó con metanol al 10 % en tolueno (8,8 l) y se secó en aire a 65 °C sobre una placa caliente para proporcionar 0,97 kg de 24. El filtrado se concentró al vacío hasta la cristalización a granel, y se añadió alcohol etílico seco (4,0 l). La suspensión se trituró en el evaporador giratorio a ta durante toda la noche, se filtró, y el sólido se lavó con una mezcla de tolueno-etanol (1:1, ~2 l) para proporcionar 191 g adicionales de 24 tras secarse al aire a 65 °C sobre una placa caliente. Rendimiento total: 1,16 kg, 54 % basado en 9, -95 % de pureza.
Síntesis del compuesto 25 (R = Bz)
Etapa (iv)[1 ]: El compuesto 24 (1,06 kg, 3,15 mol, ~95 % de pureza) y DMAP (384 g, 3,15 mol) se disolvieron en piridina anhidra (9,0 l) bajo atmósfera de Ar. Se añadió anhídrido benzoico (2,49 kg, 11,02 mol), la mezcla se agitó durante la noche, se añadió agua (200 ml) y la agitación continuó durante 0,5 horas adicionales. La piridina se evaporó y el residuo se secó en un evaporador giratorio a 10 mbar sobre 35 °C de temperatura de baño (se produjo cristalización). El residuo se dividió entre agua (2 l) y EtOAc (4 l) en un matraz de evaporador giratorio hasta la disolución completa de sólidos, se transfirió a un recipiente de extracción y se diluyó con EtOAc adicional (8 l) y agua (5 l). La capa orgánica se separó y se lavó consecutivamente con agua (10 l), NaHCO3 sat. (5 l x 2) y otra vez con agua (5 l x 2). La capa orgánica se separó, el solvente se evaporó al vacío hasta masa viscosa, el residuo oleoso se redisolvió en etanol (3,8 l), el solvente se evaporó nuevamente, y el residuo se secó en un evaporador giratorio a 20 mbar/35 °C. El residuo se redisolvió en etanol (10,6 l) a 35 °C y se transfirió a un reactor de filtración de 20 l provisto de una camisa de calentamiento/enfriamiento. Se añadió agua (6,0 l) por porciones, se dejó enfriar la mezcla hasta 22 °C y se añadieron semillas del producto. La cristalización masiva se produjo después de agitar durante toda la noche; la mezcla se enfrió a 0 °C, se agitó durante 5 horas adicionales y se filtró. El precipitado se presecó pasando aire durante toda la noche, se transfirió a placas de secado y se secó al aire a 65 °C sobre placas calefactoras durante 2 días (hasta masa constante) para proporcionar 1,70 kg (84 %) del producto benzoilado (-97 % de pureza).
Etapa (iv)[2]: Una mezcla de producto perbonzoilado obtenido (608 g, 0,938 mol), Lil anhid. ("ultra seco" - Alfa-Aesar, 503 g, 3,75 mol), y piridina anhid. (1,6 l) se calentó bajo atmósfera de Ar, reflujo suave, durante 24 h, se enfrió a ta, y se diluyó con agua (0,5 l). La piridina se evaporó, el residuo oleoso se secó en un evaporador giratorio a 4 mbar/30 °C, y se dividió entre H3PO4 al 20 % frío (5 l) y la mezcla de acetato de etilo - hexano (2:1, 5 l), la fase orgánica se separó, se lavó con 5 % de ac. NaCl (2 l), bisulfito de sodio ac. al 3 % (2 l) y se secó sobre Na2SO4 anhid.. La solución (volumen total de 6 l) se decantó del agente desecante y se filtró a través de un tapón de 900 g de gel de sílice cargado en húmedo en una mezcla de acetato de etilo - hexano (2:1) sobre un embudo filtrante de vidrio sinterizado. La torta de gel de sílice se lavó con la mezcla de AcOEt-hexano 2:1, hasta que no se observó ninguna cantidad sustancial de ácido en el filtrado por TLC (18 l). Los filtrados combinados se evaporaron, el producto espumoso se disolvió en ACN (1,6 l) y el ACN se evaporó. El último procedimiento se repitió, y el producto se secó a 53,33 Pa (0,4 torr) durante 1 día para proporcionar 25 (584,3 g, 98 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 6 1,54 (S, 4H), 1,71(S, 3H), 2,22(t, 2H), 3,54(m, 1H), 3,81 (m, IH), 4,39(m, 2H), 4,48(m, 2H), 4,74(d, IH), 5,37(dd, 1H), 5,76(d, IH), 7,40(t, 2H), 7,50(t, 2H),
7,58(m, 3H), 7,65 (t, IH), 7,73(m, 3H), 7,92(t, 4H), 8,1 l(d, 2H), 12,1 l(s, 1H). 13C 1H RMN (100 MHz, DMSO-de): 6 ■ 21,0, 22,6, 28,3, 33,2, 49,7, 62,0, 67,9, 68,4, 70,0, 71,8, 100,8, 128,5, 128,6, 128,9, 129,0, 129,1, 133,4, 133,6, 164,8, 165,1, 169,3, 174,3. CL-EM: 634 (M+1)+.
Síntesis del compuesto 25 (R=Ac)
Etapa (v)[1]: El compuesto 24 (12,70 g, 38 mmol) se disolvió en una solución de NaOH (1,88 g, 47 mmol) en metanol (50 ml) y agua (5 ml), la mezcla se agitó durante toda la noche, se neutralizó con ácido acético (0,51 ml, 9 mmol), se diluyó con etanol anhidro (200 ml) y se evaporó hasta secarse. Después de secar durante toda la noche a 53,33 Pa (0,4 torr), se obtuvieron 15,38 g de espuma blanca que se trituraron con 150 ml de piridina anhidra seguido de anhídrido acético (30 ml, 152 mmol). La mezcla se agitó a 30 °C durante toda la noche, se enfrió a 0 °C y se añadió agua (14 ml). Se retiró el baño de enfriamiento, la mezcla se agitó a ta durante 1 h, la mayoría de los solventes se eliminaron al vacío, el residuo se dividió entre salmuera saturada (150 ml) y acetato de etilo (100 ml), la capa orgánica se separó, se lavó con una mezcla de ácido fosfórico al 20 % y salmuera al 20 % (1:1, 250 ml), salmuera saturada 3 veces, se secó sobre sulfato de sodio anhid. y se evaporó al vacío. El residuo se evaporó conjuntamente con «-butanol (x3) seguido de ACN (x3) para proporcionar 14,46 g (83 %) de 25. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,54 (S, 4H), 1,71 (S, 3H), 2,22(t, 2H), 3,54(m, 1H), 3,81 (m, IH), 4,39(m, 2H), 4,48(m, 2H), 4,74(d, IH), 5,37(dd, IH), 5,76(d, 1H), 7,40(t, 2H), 7,50(t, 2H), 7,58(m, 3H), 7,65 (t, 1H), 7,73(m, 3H), 7,92(t, 4H), 8,1 l(d, 2H), 12,1 l(s, 1H). 13C 1H RMN (100 MHz, DMSO-d6): 21,0, 22,6, 28,3, 33,2, 49,7, 62,0, 67,9, 68,4, 70,0, 71,8, 100,8, 128,5, 128,6, 128,9, 129,0, 129,1, 133,4, 133,6, 164,8, 165,1, 169,3, 174,3. CL-EM: 634 (M+1)+.
Síntesis del compuesto 29
Etapa (vii)[1 ]: El compuesto 7 (1090 g, 1,936 mol) y HOBt (1170 g, 8,667 mol) se tomaron en un matraz de 22 l equipado con un agitador superior bajo argón. Se añadieron 4 l de DCM y 2 l de DMF con agitación y la mezcla se enfrió en una mezcla de hielo-agua a ~10 °C. Se añadió con agitación una solución de mono boc propilamina 21(1265 g, 7,260 mol) en 2 l de DCM a la solución anterior. Lentamente, todos los reactivos entraron en la solución. Una suspensión de EDAC. HCl (1439 g, 7,260 mol) en 4 l de DCM se añadió lentamente a la mezcla de reacción mientras se mantenía la temperatura alrededor de 10 °C. Se añadió DIEA (2,40 l, 13,55 mol) lentamente durante un período de 1,5 horas. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante toda la noche bajo argón. Se comprobó la TLC y la mezcla de reacción se transfirió a un embudo evaporador giratorio y se eliminaron los volátiles a presión reducida. El matraz se transfirió a la campana y añadieron 10 l de agua al residuo con agitación y dejó que la mezcla sedimentara durante toda la noche. Se separaron dos capas durante toda la noche y se decantó la capa superior. La capa de la parte inferior se disolvió en 8 l de EtOAc y se transfirió a un embudo separador y se lavó con agua (2X4 l), ac. Solución de NaHCO3 (2,5 l) y 10 % ac. Ácido cítrico (2X3,5 l) y agua (1X4 l) y salmuera saturada (2,5 l). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se eliminaron los solventes a presión reducida. El residuo se evaporó conjuntamente con tolueno y diclorometano y se secó bajo alto vacío (Rendimiento 2026 g, cuantitativo). CL- EM calculado para C50H93N7O15 PM: 1031,67; Encontrado 1032,6(M+H). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 57,79 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 6,94 (s, 1H), 6,72 (t, 3 = 5,3 Hz, 1H), 3,61 - 3,45 (m, 5H), 3,01 (dd, J = 12,8, 6,6 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 12,7, 6,5 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 2,03 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,55 - 1,38 (m, 3H), 1,36 (d, J = 10,7 Hz, 8H), 1,21 (s, 3H).
Etapa (vii)[2]: El compuesto de la etapa (vii)[1] (52 g, 50,40 mmol) se disolvió en 100 ml de DCM con 20 ml de anisol. A la mezcla anterior se añadió TFA (200 ml) y se agitó la mezcla durante toda la noche. Se eliminaron los solventes y el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno (2X100 ml) para obtener un líquido gomoso. Este residuo se disolvió en MeOH (30 ml) y se precipitó con éter anhidro. La mezcla se mantuvo en la cámara fría durante toda la noche para depositarse y decantarse. El compuesto se secó a alto vacío para obtener un sólido esponjoso blanco 29 como su sal TFA (rendimiento 52,10 g, 96 %). CL- EM calculado para C35H69N7O9 PM: 731,52; Encontrado 732,50(M+H). 1H RMN. (400 MHz, DMSO) 88,04 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,82 (s, 3H), 3,65 - 3,42 (m, 5H), 3,18 - 3,02 (m, 2H), 2,84 - 2,69 (m, 2H), 2,28 (dt, J = 12,2, 6,9 Hz, 2H), 2,03 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,78 - 1,57 (m, 2H), 1,56 - 1,35 (m, 1H), 1,21 (s, 3H).
Síntesis del compuesto 30 (R= Ac)
Etapa (viii)[1 ] para Acetato: A una solución de ácido GalNAc 25-Ac (50,65 g, 113,27 mmol), HBTU (52 g, 136 mmol) y HOBt (19 g, 135 mmol) en DCM (500 ml) se añadió DIEA (52 ml, 10 eq.) y se agitó la mezcla durante 10 minutos a 15 °C. A esta mezcla se añadió una solución de amina 29 (32 g, 29,80 mmol) en DMF (100 ml) y se agitó mezcla durante 4 horas. Se comprobó la TLC y se eliminaron los solventes. Al residuo se añadió agua y se extrajo con EtOAc. Se lavó la capa orgánica con agua (2X200 ml), ac. Solución de bicarbonato (1X200 ml) y salmuera (200 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se eliminaron los solventes. El producto crudo se purificó por una columna de gel de sílice corta mediante el uso de la mezcla de EtOAc/MeOH como eluyente para obtener el compuesto 26a como un sólido blanquecino (rendimiento, 42,3 g, 70 %). MALDI- EM calculado para C92H150N10O39 PM: 2019,01; encontrado 2042.10 (M+Na).
Etapa (viii)[1 ] para Benzoato:
Método A: A una solución de ácido GalNAc 25-Bz (35,86 g, 56,63 mmol), HBTU (28 g, 73,61 mmol) y HOBt (11,48 g, 84,90 mmol) en DCM (200 ml) se añadió DIEA (26 ml, 10 eq.) y se agitó la mezcla durante 10 minutos a 15 °C. A esta mezcla se añadió una solución de amina 29(15,70 g, 14,90 mmol) en DMF (50 ml) y se agitó la mezcla durante 4 horas. Se comprobó la TLC y se eliminaron los solventes. Al residuo se añadió agua y se extrajo con EtOAc. Se lavó la capa orgánica con agua (2X100 ml), ac. Solución de bicarbonato (1X100 ml) y salmuera (150 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se eliminaron los solventes. El producto crudo se purificó por una columna de gel de sílice corta mediante el uso de la mezcla de EtOAc/MeOH como eluyente para obtener el compuesto 26b como un sólido blanquecino (rendimiento, 25,20 g, 67 %). MALDI- EM calculado para C137H168N10O39 PM: 2577,15; encontrado 3000.10 (M+Na). 1H RMN (400 MHz, DMSO) 68,04 - 7,80 (m, 1H), 7,79 - 7,33 (m, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 5,36 (dd, J = 11,1, 3,3 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,55 - 4,19 (m, 1H), 4,01 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 3,86 -3,73 (m, 1H), 3,64 - 3,45 (m, 1H), 3,31 (s, 1H), 3,02 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 2,36 - 2,15 (m, 1H), 2,13 - 1,99 (m, 1H), 1,69 (s, 1H), 1,61 - 1,35 (m, 1H), 1,31 - 1,02 (m, 1H).
Método B: A una solución de ácido GalNAc 25-Bz (30,78, 48,62 mmol), EDAC.HCl (10,70 g, 54 mmol) y HOBt (9,11 g, 67,5 mmol) en DCM/DMF (2:1) (200 ml) se añadió DIEA (24 ml, 10 eq.) y se agitó la mezcla durante 15 minutos a 15 °C. A esta mezcla se añadió una solución de amina 29 A (14,50 g, 13,50 mmol) en DMF (100 ml) se agitó la mezcla durante toda la noche, se comprobó la TLC y se eliminaron los solventes. Al residuo se le añadió agua y el compuesto precipitó. El residuo precipitado se disolvió en el EtOAc y lavó la capa orgánica con agua (2X200 ml). Ac. Solución de bicarbonato (1X200 ml), ácido fosfórico al 5 % (1X200 ml) y salmuera (150 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se eliminaron los solventes. El producto crudo se purificó por una columna de gel de sílice corta mediante el uso de la mezcla de EtOAc/MeOH como eluyente para obtener el compuesto 26b como un sólido blanquecino (rendimiento, 30,10 g, 87 %). MALDI- EM calculado para C137H168N10O39 PM: 2577,15; encontrado 3000,10 (M+Na).
Etapa (viii)[2-4]: Ácido triantenario GalNAc 30 del éster 26a
Figure imgf000032_0001
A una solución de éster triantenario 26a (10,2 g, 5 mmol) en metanol anhidro (20 ml) a 0 °C se añadió una solución al 25 % en peso de NaOMe (5,7 ml, 25 mmol) bajo atmósfera de Ar. La mezcla se agitó durante 5 minutos y se evaporó al vacío hasta que el residuo oleoso viscoso se volvió a disolver en 15 ml de metanol y 2 ml de agua. La mezcla se agitó a ta durante toda la noche, se neutralizó con clorhidrato de trietilamina (3,44 g, 25 mmol) y se diluyó con piridina anhidra (60 ml). Los solventes se evaporaron hasta que el residuo oleoso viscoso se redisolvió en DMF anhid. (30 ml) bajo atmósfera de Ar y la solución se transfirió a través de la cánula a una mezcla vigorosamente agitada de piridina (32 ml) y anhídrido acético (18,9 ml, 200 mmol). La mezcla se agitó a ta durante toda la noche, se enfrió a 0 °C y se añadió agua (11 ml). La mezcla se agitó a ta durante 0,5 h, y se evaporó a 45 °C hasta un residuo oleoso viscoso. El residuo se evaporó conjuntamente con agua (10 ml x 2) seguido de n-butanol (100 ml x 2) para proporcionar 15,0 g de residuo. Este último se disolvió en acetato de etilo - isopropanol (5:1, 150 ml), y se cargó en una columna de filtración con gel de sílice (45 g) desactivada con TEA al 2 % en acetato de etilo. La columna de filtración se eluyó con 150 ml cada uno: acetato de etilo - isopropanol (5:1, x2), acetato de etilo - metanol (5:1, x2), (2:1, x2) y (1:1, x2). Se recogieron las fracciones que contenían producto, se evaporaron al vacío, el residuo se redisolvió en a Cn (30 ml), se filtró a través de celite y se evaporó. El producto se secó a 53,33 Pa (0,4 torr) durante toda la noche, y se obtuvieron 9,45 g (94 %) de 30-Ac. 1H RMN (400MHz, DMSO-D6): 81,21-1,15(m, 12H), 1,49-1,46(m, 22H), 1,76 (s, 9H), 1,88(s, 9H), 1,98(s, 12H), 2,01(m, 9H), 2,09(s, 9H), 2,21(t, 2H), 2,27(t, 6H), 2,9 (m, 1H), 3,02 (m, 14H), 3,52 (m, 12H), 3,70 (m, 10H), 3,88 (q, 3H), 4,0 (s, 9H), 4,1 (m, 1H), 4,48 (d, 3H), 4,7-4,S (m, 1H), 4,98 (d, 3H), 5,21 (d, 3H), 6,84 (m, 4H), 7,02 (s, 1H), 7,17 (m, 5H), 7,28 (m, 4H), 7,79 (m, 3H), 7,88 (m, 6H). MALDI-EM: 2429 (M+Na)+.
Etapa (viii)[2-4]: Ácido triantenario GalNAc 30 del éster 26b
Figure imgf000033_0001
A una solución de éster triantenario 26b (13,5 g, 5,2 mmol) en metanol anhidro (60 ml) a 0 °C se añadió una solución al 25 % en peso de NaOMe (1,2 ml, 5,2 mmol) bajo atmósfera de Ar. Se retiró el baño de enfriamiento, la mezcla se agitó a ta durante 1 h, se neutralizó con clorhidrato de trietilamina (0,85 g, 6,2 mmol), se evaporó en vacío y el residuo se dividió entre 1 % ac. NaCl (70 ml) y etilacetato (40 ml). La capa acuosa se separó, se lavó con 40 ml de acetato de etilo y se aspiró en el evaporador giratorio hasta que quedaron ~60 ml de la solución. Se añadió NaOH (0,64 g, 16 mmol), la mezcla se agitó durante toda la noche a ta, se neutralizó con clorhidrato de trietilamina (2,48 g, 18 mmol), se diluyó con 60 ml de piridina, y los solventes se evaporaron al vacío hasta obtener un residuo oleoso viscoso que se evaporó conjuntamente con 60 ml adicionales de piridina y se disolvió nuevamente en 60 ml de piridina. El precipitado se filtró, se lavó con piridina, y los filtrados combinados se evaporaron al vacío y se secaron a 4 mbar/30 °C durante 3 h para proporcionar 11,06 g de residuo. Este último se disolvió en piridina anhid. (40 ml) bajo atmósfera Ar y la solución se transfirió a través de una cánula a una mezcla vigorosamente agitada de piridina (50 ml) y anhídrido acético (25 ml, 260 mmol). La mezcla se agitó a ta durante toda la noche, se enfrió a 0 °C y se añadió agua (30 ml). La mezcla se agitó a ta durante 0,5 h, y se evaporó a 45 °C hasta un residuo oleoso viscoso que se secó a 4 mbar/45 °C durante 1,5 h. El residuo se disolvió en una mezcla agitada de acetato de etilo (50 ml), isopropanol (15 ml) y cloruro de sodio al 25 % (50 ml), se añadió trietilamina gota a gota hasta pH constante = 7 (8 ml), y los líquidos se decantaron del NaCl sólido a un embudo de decantación. La capa orgánica se separó, se lavó con NaCl al 25 % (50 ml) NaCl sat. (30 ml), secado sobre sulfato de sodio anhid., los solventes se evaporaron, el residuo se evaporó conjuntamente con Ac N (x2) y se secó a 53,33 Pa (0,4 torr) durante la noche para proporcionar 9,95 g (96 %) de 30.
Ejemplo 5 - Síntesis del monómero GalNAc 32 con soporte sólido
Figure imgf000034_0001
Reactivos y condiciones: (i) EDC.HCl, DIEA, HOBt / DCM-DMF o HBTU, DIEN DCM-DMF o HBTU, DIEA, HOBt/ DCM-DMF o EDC.HCl, D iEa , N-hidroxisuccinimida o EDC.HCl, DIEA, pentafluorofenol o DCC, DMAP / DCM-DMF o cualquier otro activador de ácido carboxílico para amidación/esterificación; (ii)(l). Anhídrido succínico, DMAP o anhídrido succínico e DMAP inmovilizados en cualquier soporte sólido o anhídrido succínico, piridina o anhídrido succínico y DIEA o anhídrido succínico y ET3N y (ii) (2) etapa (i) y soportes sólidos funcionalizados con hidroxi o amino (por ejemplo, vidrio de poro de control o cualquier soporte polimérico)
Derivado triantenario 31 (Ac):
Etapa (i): A una mezcla agitada de ácido triantenario 30 (5,00 g, 2,5 mmol), derivado de hidroxiprolinol 5 (1,17 g, 2,8 mmol), HBTU (1,14 g, 3,0 mmol), HOBt (1,01 g, 7,5 mmol) en DCM anhid. (50 ml), se añadió DIEA (1,3 ml, 7,5 mmol). La mezcla se agitó durante toda la noche, se apagó con agua (60 ml), la capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de sodio anhid. y se evaporó para proporcionar 9,21 g de residuo. Este último se disolvió en una mezcla de acetato de etilo (80 ml) y DCM (30 ml), y se cargó en una columna de filtración con silicagel (20 g) desactivada con TEA al 2 % en acetato de etilo. La columna de filtración se eluyó con 90 ml de cada uno: acetato de etilo - TEA (2 %) (x6), acetato de etilo - metanol (10:1, xl) y (3:1, x3). Se recogieron las fracciones que contenían producto, se evaporaron al vacío y el residuo se evaporó conjuntamente con ACN (x2). El producto se secó a 53,33 Pa (0,4 torr) durante toda la noche, y se obtuvo 4,77 g (80 %) de 31(Ac). 1H RMN (400MHz, DMSO-D6): 81,21-1,15(m, 12H), 1,49-1,46(m, 22H), 1,76 (s, 9H), 1,88(s, 9H), 1,98(s, 12H), 2,01(m, 9H), 2,09(s, 9H), 2,21(t, 2H), 2,27(t, 6H), 2,9 (m, 1H), 3,02 (m, 14H), 3,52 (m, 12H), 3,70 (m, 10H), 3,88 (q, 3H), 4,0 (s, 9H), 4,1 (m, 1H), 4,48 (d, 3H), 4,7-4,5 (m, 1H), 4,98 (d, 3H), 5,21 (d, 3H), 6,84 (m, 4H), 7,02 (s, 1H), 7,17 (m, 5H), 7,28 (m, 4H), 7,79 (m, 3H), 7,88 (m, 6H). MALDI-EM: 2429 (M+Na)+.
Etapa (ii)[1]-Ac
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Se preparó una solución del compuesto de la etapa (i) en DCM se preparó en un matraz RB de 2 l en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió trietilamina durante 10 minutos. A continuación, se añadió anhídrido succínico seguido de PS-DMAP a temperatura ambiente. Se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente (TLC y HPLC). La masa de reacción se filtró a través de un lecho de celite y se lavó con DCM (500 ml). Luego, la capa orgánica se diluyó con DCM (1 l) y se lavó con agua (3x4500 ml). Se añadió carbón vegetal (7,5 g) a la capa orgánica y se agitó durante 15 minutos. A continuación, se filtró a través de lecho de celite y se lavó con DCM (500 ml). El filtrado se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó a presión reducida a 30 °C para obtener el compuesto como sólido blanquecino 140 g (86 %). 1H RMN (400 Mhz , d Ms O-D6): 8 1,21 (m, 12H), 1,47-1,51 (m, 22H), 1,78 (s, 9H), 1,89 (s, 9H), 1,99 (s, 9H), 2,05 (m, 8H), 2,10 (s, 9H), 2,29 (m, 3H) 2,36 (m, 6H), 2,39 (q, 2H), 2,42 (q, 2H), 3,04 (m, 14H), 3,42 (q, 4H), 3,53 (m, 12H), 3,7 (m, 10H), 3,87-3,90 (q, 3H), 4,03 (s, 9H), 4,2 (m, 1H), 4,49-4,52 (d, 3H), 4,97-4,99 (d, 3H), 5,22 (s, 3H), 5,35 (s, IH), 6,87 (m, 4H), 7,02 (s, IH), 7,17 (m, 5H), 7,28 (m, 4H), 7,79 (m, 3H), 7,88 (m, 6H). 13C RMN (100 MHz, DMSO-D6): 6 10,51, 2042, 21,84, 22,71, 24,48, 25,34, 28,54, 28,88, 28,99, 29,29, 29,72, 30,30, 33,10, 34,07, 35,04, 36,02, 36,26, 36,34, 45,37, 49,38, 52,34, 54,98,. 59,48, 61,41, 63,24, 66,69, 67,31, 68,27, 68,64, 69,83, 70,50, 72,58, 85,29, 100,98, 113,11, 126,61, 127,58, 127,80, 129,61, 135,74, 158,03, 169,50, 169,66,169,95,170,02, 170,24,172,09, 172,51, 172,63,174,35. MALDI-EM: 2529 (M+Na).
Etapa (ii)[1]-Bz:
Figure imgf000035_0002
El compuesto de la etapa (i)-Bz se disolvió en DCM y trietilamina. A esta solución se añadieron anhídrido succínico y PS-DMAP y se agitó la solución durante 48 horas. La mezcla se filtró y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y los solventes se eliminaron a presión reducida para obtener el compuesto como un sólido blanquecino (89,23 g, 95 %). MALDI-EM calculado 3064,33; encontrado 3087,30 (M+Na).
Etapa (ii)[2]: Proceso general para la síntesis de soportes sólidos de GalNAc 32(Ac o Bz)- CPG, poliestireno-amino, soportes basados en poliestireno-amino).
Ejemplo de soporte a base de poliestireno amino: El succinato de la etapa (ii)[i] (32,50 g, 12,46 mmol) se tomó en acetonitrilo (1000 ml) al que se añadieron HBTU (11,80 g, 31,16 mmol) y DiEA (10 ml, 4 eq.) y se mezcló la mezcla de reacción durante 5 minutos. Se añadió soporte de poliestireno terminado en amino (160 g) y se agitó la mezcla durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró y se lavó sucesivamente con DCM, MeOH/DCM al 10 %, DCM y éter dietílico. Se secó al vacío y se comprobó la carga. El soporte sólido seco se tapó mediante el uso de Ac2O/Py al 25 % durante 3 horas, se lavó y se secó para obtener el soporte sólido requerido (186 g, carga de 67 jmol/g).
Condiciones de reacción para la carga de succinato de GalNAc etapa(ii)[1] en diferentes soportes sólidos
Etapa (ii)[2]:
Figure imgf000035_0001
Se probaron tres condiciones diferentes para fabricar el soporte sólido de poliestireno los resultados se muestran más abajo.
Carga de succinato de GalNAc etapa(i)[1] en soporte de poliestireno con terminación hidroxilo
Siguiendo los mismos protocolos descritos anteriormente se cargaron diferentes soportes poliméricos con terminación hidroxilo y los resultados se indican más abajo.
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Carga de succinato de GalNAc etapa (i) [1] en soporte de poliestireno con terminación hidroxilo
Siguiendo los mismos protocolos descritos anteriormente se cargaron diferentes soportes poliméricos con terminación hidroxilo y los resultados se indican más abajo.
Figure imgf000036_0003
Ejemplo 6 - Síntesis de DMTr-Prolinol 7A
Figure imgf000036_0001
Etapa 1. Clorhidrato de trans-4-Hidroxiprolmol 4A:
Figure imgf000037_0001
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Procedimiento 1:
La reacción se llevó a cabo en un matraz de 5 l provisto de una entrada de gas, un termómetro, un condensador de reflujo y una salida de gas colocada sobre un condensador de reflujo y conectada a un burbujeador. Se añadió una solución al 25 % en peso de NaOMe en MeOH (166 ml, 0,725 mol) a una solución enfriada (0 °C) y agitada de 1 (131,6 g, 0,725 mol) en MeOH anhid. (1,3 l) bajo atmósfera de Ar seguido de la adición por porciones de NaBH4 (90,8 g, 2,39 mol) durante ~1,5 h. Se observó un efecto exotérmico significativo durante la adición de la primera 1/3-porción de borohidruro y se ajustó la velocidad de adición para mantener la temperatura de reacción más abajo de 20-25 °C. El baño refrigerante de agua helada se sustituyó por un baño refrigerante de agua del grifo y la mezcla se agitó durante toda la noche mientras se mantenía la temperatura entre 20-25 °C hasta que cesó la evolución del hidrógeno (monitorización con burbujeador de gas). La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C; se añadió una solución 4 mol/l (4 M) de HCl en dioxano (3,2 mol, 800 ml) (exotermia hasta 30 °C), se eliminó el baño de enfriamiento y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de vidrio de porosidad fina y el filtrado se evaporó a presión reducida (80 mbar, 30 °C) hasta que se produjo la cristalización a granel (~ 2 l del solvente eliminado). Se añadió MeCN seco (1,5 l), la mezcla se trituró en un evaporador giratorio (20 °C, 2 h) se filtró, el residuo cristalino se lavó una vez con MeCN, y se secó durante toda la noche en un flujo lento de nitrógeno para proporcionar 93,0 g (84 %) de 4A puro. Una porción adicional de 11,0 g (9 %) de 4A precipitó lentamente a partir del licor madre que se contaminó con NH4CI y otras impurezas menores. 1H r Mn (D2O): 1,94-2,01 (m, 1H), 2,14-2,19 (m, 1H), 3,30-3,48 (m, 2H), 3,71-3,76 (m, 1H), 3,93-4,08 (m, 2H), 4,67-4,75 (m, 1H).
Procedimiento 2:
Para optimizar el procedimiento anterior mayor escala mayor, la conversión de 1 a 4A se llevó a cabo en una escala de 3 moles. El procedimiento se indica más abajo.
Figure imgf000037_0002
Se añadió clorhidrato de éster metílico de trans-4-hidroxiprolina (1,544,86 g, 3 mol) a un reactor de vidrio encamisado de 20 l provisto con termómetro, condensador de reflujo y embudo de adición de sólidos; el sólido se disolvió en metanol anhidro (5 l) bajo atmósfera de Ar y la solución se enfrió a 0 °C. Se añadió una solución de NaOMe en MeOH (25 % en peso, 686 ml, 3 mol) a la solución fría bajo agitación constante y flujo constante de Ar; a continuación se añadió NaBH4 (300 g, 2,64 mol) por porciones a través del embudo de adición de sólidos durante ~1,5 h. La velocidad de adición se ajustó para mantener la temperatura de reacción más abajo de 20-25 °C. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche mientras se mantenía la temperatura entre 25-30 °C hasta que cesó la evolución del hidrógeno (monitorización con burbujeador de gas). La mezcla se enfrió nuevamente a 5 °C; se añadió lentamente una solución de HCl 4 mol/l (4 M) en dioxano (12 mol, 3 l) bajo agitación; se filtró a través de un filtro de vidrio de porosidad fina y el filtrado se evaporó a presión reducida (8 l del solvente eliminado, se observó la cristalización inicial del producto).
Se añadió MeCN anhidro (4 l) a la suspensión y la mezcla se agitó a ta; se filtró y el producto cristalino se lavó una vez con MeCN (1 l), y se secó durante toda la noche en un horno de vacío a 40 °C para proporcionar 423,0 g (92 %) de 4A. Sin embargo, el análisis por RMN del producto indicó la presencia de éster no reactivos 1 (<5 %). El producto sólido se disolvió en metanol caliente (800 ml) y se filtró bajo calor para eliminar los sólidos no disueltos (presumiblemente NaCl). El filtrado claro se diluyó con 4 l de EtOAc y la solución se enfrió sobre un baño de hielo. La filtración del producto cristalizado seguido de secado proporcionó el producto puro 4A (1er cultivo 270 g 2do cultivo 61 g = total 331 g, 72 %) como sólido cristalino blanco. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): 89,48 (s, 1H), 8,75 (d, J= 187,3 Hz, 1H), 5,34 (dd, J= 16,9, 11,7 Hz, 2H), 4,37 (s, 1H), 3,83 - 3,59 (m, 2H), 3,61 - 3,42 (m, 1H), 3,15 (t, J = 26,0 Hz, 1H), 3,01 (t, J= 21,2 Hz, 1H), 1,98 - 1,61 (m, 2H). 13C1H RMN (126 MHz, DMSO DMSO-d6): 594,27, 68,77, 59,89, 59,86, 59,68, 52,42, 52,35, 35,39.
Ejemplo 7 -Síntesis del compuesto 5A
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La reacción se realizó en un reactor de vidrio de 5 bocas de 15 l provisto de un agitador superior sobre un baño de hielo. A una solución agitada de 4A (450 g, 2,94 mol) en acetonitrilo (8 l) se añadió Et3N (1 l, 7,2 mol) y trifluoroacetato de etilo (1000 g, 7,04 mol), y se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. El sólido blanco (EtsN.HCl) se filtró sobre el embudo sinterizado y se lavó con EtOAc (4 l). La solución orgánica se concentró seguido de una evaporación conjunta con tolueno (2 x 2 l) y se secó a presión reducida durante la noche en un evaporador giratorio de 22 l para obtener 5A crudo como una masa gomosa (~600 g). El Compuesto 5A así obtenido podría ser usado en la siguiente etapa sin una purificación adicional.
Ejemplo 8 -Síntesis del compuesto 7 A
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La reacción se realizó en un reactor de vidrio de 5 cuellos de 15 l bajo nitrógeno provisto de un agitador superior sobre un baño de hielo. El compuesto crudo 5A (2,94 mol) se disolvió en 2 l de piridina anhid. y se transfirió al matraz de 15 l. Se añadieron otros 6 l de piridina anhidra. Esta solución se enfrió sobre un baño de hielo a ~5 °C seguido de la adición de DMTr-Cl (1000 g, 2,95 mol) en porciones bajo atmósfera de nitrógeno durante 20 minutos y la mezcla de reacción se agitó a ta durante toda la noche. La terminación de la reacción se confirmó mediante TLC. Se añadió agua (12 l) mientras se agitaba y se dejó reposar durante 6 h. El compuesto se depositó en la parte inferior del matraz como una masa gomosa marrón. La capa de agua-piridina se decantó mediante el uso de una bomba de transferencia y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (EtOAc, 2 x 5 l). Se combinó el extracto de EtOAc con el material viscoso permaneció en el reactor, después de decantar la capa de agua. La concentración del solvente dio el compuesto 6A como aceite viscoso que fue usado la siguiente etapa sin purificación.
La reacción (desprotección de TFA) se realizó en un reactor de vidrio de 5 cuellos de 15 l provisto de un agitador superior. A una solución agitada de 6A (2,94 mol) en MeOH (5 l) se añadió KOH (330 g, 5,88 mol) en 2 l de agua gota a gota durante 30 min y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró a un volumen de 3 l a presión reducida; se añadieron 15 l de agua al concentrado y se dejó reposar durante toda la noche. El producto se depositó en la parte inferior como aceite viscoso marrón rojizo. Se decantó la capa de agua mediante el uso de una bomba de transferencia y se añadieron 6 l de diclorometano (DCM) para disolver el producto sedimentado, se lavó con 5 l de agua y se separó el solvente orgánico. La concentración del solvente seguido de ja cromatografía de la columna de gel de sílice (4 kg de sílice, eluyente: hexano/acetato de etilo y acetato de etilo/MeOH, véase la Tabla más abajo para más detalles) dio el compuesto 7A (1000 g, 81 % del compuesto 4A) como sólido de color blanco amarillento espumoso. 1H RMN (CDC1a): 1,35-1,42 (m, 1H), 1,65-1,70 (m, 1H), 2,33 (br s, 1H), 2,59-2,62 (m, 1H), 2,72-2,75 (m, 1H), 2,82-2,91 (m, 2H), 3,36-3,41 (m,lH), 3,71 (s, 6H), 4,1 (br s, 1H), 4,525 (d, J = 4,0 Hz, 1H).
Ejemplo 9 - Síntesis del ácido BzGalNAc C5 13B
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Se añadió piridina anhidra (7,2 l) a una suspensión agitada y enfriada (baño de hielo) de clorhidrato de D-(+)-galactosamina 8 (1,63 kg, 7,55 mol) en anhídrido acético (5,3 l) en un reactor de 40 l bajo atmósfera de Ar. Se añadieron consecutivamente DMAP (79 g) y trietilamina (1,05 l, 7,55 mol) y la mezcla se agitó durante la noche en el baño de hielo, tiempo durante la cual se produjo una disolución de 8 seguido de cristalización de 9 y clorhidrato de trietilamina junto con un efecto exotérmico de hasta 30 °C durante las primeras 2 horas. La mezcla se filtró a través de un filtro de vidrio sinterizado, y el residuo se lavó con tolueno (~4 l x 2) seguido de agua (~3 l x 2). El residuo cristalino se secó durante toda la noche en el filtro de vidrio, se transfirió a placas de secado y se secó en aire (placa caliente a 70 °C) durante dos días para proporcionar 2,53 kg ( 86 %) de 9 puro. 1H RMN (400 MHz, DMSO) 8 7,88 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,63 (d, J = 8 , 8 Hz, 1H), 5,26 (d, 7= 3,1 Hz, 1H), 5,05 (dd, 7= 11,3, 3,3 Hz, 1H), 4,34 - 3,82 (m, 4H), 2,11 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,77 (s, 3H).
5-hidroxipentanoato de metilo 11A
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La reacción se realizó en un matraz de evaporación giratorio de 20 l bajo un flujo lento de argón. Una solución de valerolactona (98 % de pureza, adquirida de TCI, 1,0 kg, 10 mol) y trietilamina (140 ml, 1 mol) en metanol seco (4 l) se agitó a ta durante 1 h, tiempo durante el cual se observó un ligero efecto exotérmico (hasta 28 °C). La mezcla se concentró en vacío (baño de calentamiento a 25 °C), se diluyó con tolueno seco (4 l) y se evaporó a presión reducida, y el residuo se secó en un evaporador giratorio a 4 mbar/25 °C seguido de agitación bajo alto vacío 53,33-79,99 Pa (0,4-0,6 torr), ta durante toda la noche para proporcionar 11A como un líquido incoloro, 1,39 kg (100 %), que contiene <1 % de tolueno. 1H RMN (400 MHz, CD3CN) 8 3,61 (s, 3H), 3,49 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,55 (bs, 1H), 2,31 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 1,62 (dt, J= 14,9, 7,1 Hz, 2H), 1,55 - 1,42 (m,2H).
Intermediario de oxazolidina 10 (crudo)
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La reacción se realizó en un reactor de 20 l bajo atmósfera Ar. Se añadió TMSOTf (1,40 l, 7,74 mol) lentamente (10 min) a una suspensión agitada de 9 (2,52 kg, 6,49 mol) en 1,2-dicloroetano anhid. (DCE, 4,0 l) bajo atmósfera de Ar. La mezcla se agitó a ta durante toda la noche y se transfirió a través de una línea de transferencia a una mezcla vigorosamente agitada de NaHCO3 (1,64 kg, 19,4 mol), hielo (5,5 l) y agua (5,5 l) en un reactor abierto de 40 l. La agitación continuó durante 40 minutos, la capa orgánica se separó, la capa de agua se lavó con diclorometano (DCM 0,5 l x2) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhid.. La mezcla se filtró, el solvente se evaporó, el residuo oleoso se secó en el evaporador giratorio (15 mbar a 30 °C), se volvió a disolver en DCE anhid. (4,0 l), y el solvente se evaporó nuevamente y el residuo se secó en el evaporador giratorio (3 mbar, 30 °C) para proporcionar 2,14 kg de 10 crudo que se volvió a disolver en DCE anhid. (4,0 l) y la solución así obtenida fue usada en la siguiente etapa.
Glicósido GalNAc peracetilado 12A (crudo)
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La reacción se realizó en un reactor de 20 l provisto con una camisa de enfriamiento bajo el atmósfera de Ar. Se añadió TMSOTf (250 ml, 1,38 mol) a una solución agitada y enfriada (12 °C) de 10 crudo (2,14 kg, <6,49 mol) y el 5-hidroxipentanoato de metilo (11A, 0,94 l, 7,14 mol) en DCE anhid. (6,5 l). Se observó un efecto exotérmico inmediato (hasta 23 °C), el enfriador se apagó y la mezcla se agitó a ta durante 3 h y se transfirió a un matraz abierto de 22 l con una mezcla vigorosamente agitada de NaHCO3 (168 g, 2,0 mol), agua (3 l) y algo de hielo. La fase orgánica se separó y se secó sobre Na2SO4 anhid.; el solvente se evaporó, y el residuo oleoso se secó en el evaporador giratorio a 12 mbar/30 °C para proporcionar 3,09 kg de 12A crudo que fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDC3): 85,73 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 5,26 (dd, J = 11,2, 3,3 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,34 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,21 - 4,04 (m, 3H), 3,93 (tdd, J = 17,7, 11,1, 7,0 Hz, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,70 -3,62 (m, 4H), 3,57 - 3,41 (m, 2H), 2,55 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 2,32 (dt, J = 23,8, 11,7 Hz, 3H), 2,18 - 2,11 (m, 4H), 2,11 -1,78 (m, 14H), 1,78 - 1,44 (m, 5H).
Éster metílico desprotegido de GalNAc 12B
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La reacción se realizó en un reactor de filtración de 20 l provisto de una camisa de calentamiento/enfriamiento. El 12A crudo (3,09 kg, < 6,49 mol) se disolvió en metanol anhidro (10 l) bajo atmósfera de Ar, se añadió trietilamina (0,90 l, 6,49 mol) a la solución y se calentó a 50 °C durante 2 días bajo agitación. La mezcla de reacción se diluyó con tolueno (4 l) y se dejó que la solución se enfriara durante toda la noche tiempo durante cual ocurrió la cristalización a granel. La suspensión se enfrió a 0 °C, se agitó durante toda la noche, se filtró, y el sólido se lavó con metanol al 10 % en tolueno (8,8 l) y se secó en aire (65 °C en la placa caliente) para proporcionar 0,97 kg de 12B. El filtrado se concentró a presión reducida hasta que se inició la precipitación a granel. Se añadió etanol seco (4,0 l) al concentrado y la suspensión resultante se trituró en el evaporador giratorio a ta durante toda la noche, se filtró, y el sólido se lavó con una mezcla de tolueno-etanol (1:1, ~2 l) para proporcionar 191 g adicionales de 12B después de secar en aire (65 °C en la placa caliente). Rendimiento total: 1,16 kg, 54 % basado en 9, -95 % de pureza. RMN (400 MHz, DMSO-d6): 8 7,58 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 4,60 - 4,47 (m, 2H), 4,44 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,77 - 3,60 (m, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,54 - 3,21 (m, 6H), 2,28 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,78 (d, J= 6,6 Hz, 3H), 1,59 - 1,36 (m, 4H).
Glicósido de GalNAc perbenzoilado 12C
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El glicósido 12B (1,06 kg, 3,15 mol, -95 % de pureza) y DMAP (384 g, 3,15 mol) se disolvieron en piridina anhid. (9,0 l) bajo atmósfera de Ar. Se añadió anhídrido benzoico (2,49 kg, 11,02 mol) y la mezcla se agitó durante la noche; se añadió agua (200 ml) a la mezcla de reacción y la agitación continuó durante 0,5 horas adicionales. La piridina se eliminó de la mezcla de reacción a presión reducida y el residuo se secó en el evaporador giratorio a 10 mbar/35 °C. El residuo se dividió entre agua (2 l) y EtOAc (4 l) en el matraz del evaporador giratorio de 20 l hasta la disolución completa de los sólidos, se transfirió a un recipiente de extracción y se diluyó con EtOAc (8 l) y agua (5 l) adicionales. La capa orgánica se separó y se lavó consecutivamente con agua (10 l), NaHCO3 sat. (2x5 l), y de nuevo agua (2x5 l). La capa orgánica se separó y el solvente se evaporó a presión reducida hasta obtener una masa viscosa. El residuo oleoso se volvió a disolver en etanol (3,8 l) y se evaporó nuevamente a presión reducida. El residuo así obtenido se secó en el evaporador giratorio a 20 mbar/35 °C durante 2 h. El residuo se volvió a disolver en etanol (10,6 l) a 35 °C y se transfirió a un reactor de filtración de 20 l provisto de una camisa de calentamiento/enfriamiento. Se añadió agua (6,0 l) por porciones a 35 °C, se dejó enfriar la mezcla hasta 22 °C y se añadieron semillas de 12C a la solución. La cristalización masiva se produjo después de agitar durante toda la noche; la mezcla se enfrió a 0 °C, se agitó durante 5 horas adicionales y se filtró. El precipitado se secó previamente pasando aire durante toda la noche, se transfirió a placas de secado y se secó en aire (65 °C en la placa caliente durante 2 días) hasta una masa constante para proporcionar 1,70 kg (84 %) de 12C (-97 % de pureza, que contiene -3 % del metilglucósido correspondiente). RMN (400 MHz, DMSO-ds): 68,05 - 7,84 (m, 1H), 7,76 - 7,30 (m, 2H), 5,75 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 5,35 (dd, J = 11,1, 3,3 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,54-4,41 (m, 1H), 4,41-4,18 (m, 1H), 3,79 (dd, J = 10,0, 4,7 Hz, 1H), 3,56 (s, 1H), 3,55 - 3,47 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 1,69 (s, 1H), 1,55 (dd, J= 11,8, 9,1 Hz, 1H).
BzGalNAc Cs sal de sodio del ácido 13B
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Lil anhid. ("ultraseco" - Alfa-Aesar, 1,41 kg, 10,52 mol) se añadió en porciones durante ~30 min a una solución agitada de éster metílico 12C (1,70 kg, 2,63 mol), en piridina anhid. (4,5 l) bajo atmósfera de Ar en un matraz de 4 bocas de 12 l equipado con entrada de gas, termómetro, condensador de reflujo y manto calefactor. Se observó un efecto exotérmico hasta 70 °C durante la adición. A continuación, la mezcla se calentó bajo reflujo suave (125 °C en el matraz) durante 25 h, se enfrió a ta y se diluyó con agua (1,5 l). La piridina se evaporó; el residuo oleoso se secó en el evaporador giratorio a 11 mbar/35 °C, se diluyó nuevamente con agua (2 l), se evaporó y se secó a 10 mbar/35 °C durante 3 h. El residuo (4,86 kg) se dividió entre H3PO4 al 20 % refrigerado (6 l), agua (2 l) y la mezcla de EtOAc -hexano (2:1, 8 l). La fase orgánica se separó, y la fase de agua se lavó nuevamente con mezcla de EtOAc - hexano (2:1, 3 x 3 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con 5 % ac. NaCl (6 l) y se secó sobre Na2SO4 anhid.. La solución (volumen total ~20 l) se decantó del agente desecante y se filtró a través de un tapón de 2,5 kg de gel de sílice (cargado en húmedo en mezcla de EtOAc - hexano (2:1) en un embudo de filtrante de vidrio sinterizado de 6 l). La torta de gel de sílice se lavó con la mezcla de EtOAc-hexano 2:1, hasta que no se observó ninguna cantidad sustancial del ácido en el filtrado mediante TLC (45 l). Los filtrados combinados se evaporaron y se secaron a 20 mbar/35 °C para proporcionar ácido crudo como espuma suave (1,78 kg) que se disolvió en EtOAc (4 l) y hexanos (2 l). Se añadió trietilamina (384 ml, 2,76 mol) seguido de solución de NaCl al 5 % (2,3 l). La capa acuosa de la parte inferior que contiene sal de trietilamonio del ácido 13B se separó, y se desechó la capa orgánica después del lavar con NaCl al 5 % (0,5 l x 2). El producto se extrajo de la capa acuosa combinada en una mezcla de EtOAc e isopropanol (5:1,6 l); la capa orgánica se lavó con NaCl al 5 % (4 l x 3), NaCl saturado (1 l x 2) y se secó sobre Na2SO4 anhid.. Los solventes se evaporaron a presión reducida; el residuo se secó brevemente en el evaporador giratorio a 20 mbar/35 °C, y se disolvió en acetonitrilo (ACN, 6 l). La solución se filtró del precipitado inorgánico a través de un filtro de vidrio sinterizado, se evaporó, se secó brevemente en el evaporador giratorio a 20 mbar/30 °C, se redisolvió en ACN (6 I), se evaporó nuevamente y se secó a alto vacío para proporcionar 1,58 kg (93 %) de sal de sodio pura 13B.
1H RMN (400 MHz, DMSO-de): a 8,50 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,90 (dd, J = 10,9, 4,0 Hz, 4H), 7,82-7,28 (m, 11H), 5,75 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 5,46 - 5,26 (m, 1H), 4,75 (dd, J = 32,1, 8,6 Hz, 1H), 4,53 - 4,20 (m, 4H), 3,74 (dt, J = 11,1, 5,7 Hz, 1H), 3,54 (dt, J = 10,6, 5,5 Hz, 1H), 2,01 - 1,82 (m, 2H), 1,71 (s, 3H), 1,65 - 1,33 (m, 4H).
Ejemplo 9 - Síntesis de Tris(terc-butil)-Tris amina 17A
(3,3'-(2-amino-2-((3-terc-butoxi-3-oxopropoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi)dipropanoato de terc-butilo)
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Se añadieron TRIS (500 g) y DMSO (830 ml) bajo argón en un matraz de 12 l de cuatro bocas equipado con un agitador superior sobre un baño de agua helada. La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 15 °C y agitó la mezcla durante aproximadamente 10 min para disolver completamente el TRIS (o hasta que la mezcla de reacción se convirtió en una solución homogénea). Se añadió NaOH 5 mol/l (5 M) (83 ml) en el momento y se agitó la mezcla durante 5 min. Se añadió acrilato de terc-butilo (2300 ml) a la mezcla anterior lentamente bajo agitación constante durante un período de 1 h y se mantuvo la temperatura de reacción a aproximadamente ~15 °C durante la adición. Se calentó lentamente la mezcla a temperatura ambiente y continuó la agitación durante 24 horas bajo argón. La TLC (eluyente: tinción al 2 % de MeOH/EtOAc- KMnO4 básico) y el análisis de masas de la mezcla de reacción después de 24 h mostraron la presencia de un gran exceso del producto de di-adicción (di-aducto) (adición incompleta de Michael). Para conducir la reacción a la terminación se añadieron 83 ml adicionales de NaOH 5 mol/l (5 M) a la mezcla de reacción seguido de 1550 ml de acrilato de terc-butilo. La agitación continuó durante otras 24 horas. La mezcla de reacción se transfirió a un evaporador giratorio y se lavó el matraz con 2 l de EtOAc. Se eliminó el acrilato de tercbutilo sin reaccionar y el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno (2x2 l). El residuo que se obtuvo se disolvió en EtOAc (4 l) y se lavó con el mismo volumen de agua, las capas no se separaron bien, al añadir 2 l de salmuera saturada a la mezcla se separaron la fase orgánica y acuosa. El proceso de lavado se repitió una vez más. La primera capa acuosa se lavó con 2 l de acetato de etilo y la capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio. Los solventes se eliminaron al vacío y el residuo (2,023 kg, peso bruto) se purificó por filtración en columna de gel de sílice seguido de una segunda cromatografía de columna como se describió más abajo.
Cromatografía en columna de filtración: Se empaquetó una suspensión de 3 kg de gel de sílice en hexano y se cargó el compuesto crudo, se eluyó sucesivamente con hexano (4 l), EtOAc/hexano 1:3 (4 l) y EtOAc/hexano 1:1 (8 l) y 2,5 % MeOH en EtOAc (12 l). El producto de di-adición (diaducto) se eliminó por completo. Se agruparon todas las fracciones que contenían el compuesto deseado 17A (triaducto), se evaporaron (1530 g-peso bruto) y se dividieron en dos mitades para la purificación cromatográfica en segunda columna.
Purificación final de 17A: El residuo de la columna de filtración se dividió en dos mitades para la segunda purificación.
Condiciones de la columna:~765 g del crudo de la columna de filtración se disolvió en la cantidad mínima de EtOAc/hexano y se cargó en 3 kg de gel de sílice (3 kg) empacado en hexano. Se eluyó sucesivamente con hexano (4 l), EtOAc/hexano 1:3 (4 l), EtOAc/hexano 3:7 (4 l), EtOAc/hexano 3:1 (4 l); y MeOH 2,5 % en EtOAc (12 l).
La cromatografía en columna se repitió en las mismas condiciones para aislar el compuesto 17A de la segunda porción. Las fracciones puras agrupadas se evaporaron a presión reducida para obtener el compuesto 17A puro como aceite viscoso (1087 g, 56 %). RMN (400 MHz, DMSO-d6): 83,54 (t, J = 6,0 Hz, 6H), 3,16 (s, 6H), 2,38 (t, J = 6,0 Hz, 6H), 1,39 (s, 27H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6): 8 171,06, 80,30, 73,13, 67,46, 56,42, 40,21, 40,21, 39,89 39,58, 36,50, 28,40.
Ejemplo 10 - Síntesis del éster metílico de Tris(terc-Butilo) C12 18A
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El compuesto 17A (1081 g, 2,139 mol), el éster monometilo 15A (653 g, 2,673 mol) y HOBt (433,5 g, 3,209 mol) se disolvieron en una mezcla de DCM (6 l) y DMF (1 l) en un matraz RB de cuatro bocas de 12 l equipado con un agitador superior bajo argón. Se añadió EDAC.HCl (531 g, 2,673 mol) en porciones a la mezcla de reacción bajo agitación constante. Se agitó la mezcla de reacción durante 15 min (o hasta que la mezcla de reacción se convirtió en una solución homogénea) y se enfrió sobre un baño de agua helada a aproximadamente ~10 °C. Se añadió DIEA (1,12 l, 6,42 mol) durante un período de 30 min mientras se mantiene la temperatura alrededor de ~10 °C. Se calentó lentamente la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agitó bajo argón durante dos días. Se comprobó la TLC (eluyente: 35 % EtOAc/Hexanos, tinción básica KMnO4) y se transfirieron las soluciones a un evaporador giratorio de 20 l; se eliminaron los solventes y los volátiles a presión reducida. Después de retirar la mayor parte del diclorometano, el matraz se transfirió a una campana y provisto con un agitador superior. Se añadió agua (15 l) con agitación y se separó un líquido gomoso. La mezcla anterior se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente. La capa superior se decantó y la capa viscosa de la parte inferior se disolvió en 8 l de EtOAc y se lavó sucesivamente con agua (2x4 l), ácido cítrico acuoso al 10 % (2 x 3,5 l), solución ac. de NaHCO3 (2 x 2,5 l), seguido de un lavado con salmuera saturada (2,5 l). La capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno anhidro (2 l). El residuo se secó a alto vacío durante toda la noche para obtener el compuesto 18A como un aceite viscoso incoloro (1641 g, 77 g más que el rendimiento cuantitativo - había una pequeña cantidad de HOBt y tolueno) que fue usado para la siguiente reacción sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de): “ 6,85 (s, 1H), 3,53 (dd, J = 12,9, 6,9 Hz, 16H), 3,30 (s, 1H), 2,49 (dd, J = 3,5, 1,7 Hz, 2H), 2,37 (t, J = 6,1 Hz, 7H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,02 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,56 - 1,44 (m, 3H), 1,44 - 1,34 (m, 32H), 1,21 (s, 13H). EM calculada para C38H69NO12: 731,48; encontrada 732,3 (M+H).
Ejemplo 11 - Síntesis del éster metílico del ácido tricarboxílico C1219A
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El compuesto 18A (1560 g, 2,134 mol) se cargó en un matraz RB de cuatro bocas de 22 l equipado con un agitador superior bajo argón. Se añadió ácido fórmico (10 Kg-8,2 l) al matraz de reacción y todos los reactivos entraron en solución dentro de 20 minutos y se agitó durante 24 horas bajo argón. La TLC (eluyente: 35 % de EtOAc/Hexanos tinción KMnO4 básica) mostró una reacción incompleta y presencia de 18A sin reaccionar. Se añadieron 4,1 l adicionales de ácido fórmico y continuó la agitación durante otras 24 horas. La TLC y los espectros de masas mostraron la terminación de la reacción y la mezcla se transfirió a un evaporador giratorio de 20 l y los volátiles se eliminaron a presión reducida. Tras eliminar el ácido fórmico, el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno (2x 4,5 l). La mezcla de EtOAc y hexano (1:1, 8 l) se cargó en el matraz giratorio en el evaporador giratorio a baja velocidad, el sólido blanco precipitó de la solución y la mezcla se hizo girar lentamente durante otras 2 h en el evaporador giratorio (hasta que se separó el sólido que fluyó libremente). El sólido se filtró y se lavó con EtOAc/hexano (1:1, 4 l) seguido de éter anhidro (4 l). El sólido se transfirió a una bandeja y se secó al aire a 45 °C hasta que alcanzó un peso constante para obtener el compuesto 19A como un polvo blanco (rendimiento de 1096 g, 91 %).
La recristalización de 19A a partir de acetato de etilo proporciona un producto sin trazas de éster terc-butílico parcialmente desprotegido. Se disolvió 19A (5,0 g) en acetato de etilo a reflujo (25 ml) y la solución clara caliente se decantó del matraz que contiene sólidos residuales. El matraz se enjuagó con una pequeña cantidad de acetato de etilo, y la solución decantada combinada se dejó enfriar hasta ta durante toda la noche. El precipitado se filtró y se secó al aire para proporcionar 4,75 g (95 %) de 19A. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 8 12,08 (bs, 3H), 6,89 (s, 1H), 3,65 - 3,43 (m, 7H), 2,41 (dt, J = 12,7, 6,3 Hz, 3H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 2,02 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,44 (ddd, J = 19,5, 13,3, 6,7 Hz, 2H), 1,21 (s, 5H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-ds): 5173,41, 172,70, 172,56, 68,21,66,75, 59,57, 51,18, 40,13, 39,92, 39,71, 39,51, 39,30, 39,09, 38,88, 35,94, 34,67, 33,33, 28,99, 28,94, 28,89, 28,75, 28,57, 28,55, 25,35, 24,51. EM calculada para C26H45NO12: 563,29; encontrada 564,3 (M+H).
Ejemplo 12 - Síntesis del éster metílico de Tris(BocAmina) 24A
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El ácido tricarboxílico 19A (1090 g, 1,936 mol) y HOBt (1170 g, 8,667 mol) se añadieron a un matraz de cuatro bocas de 22 l equipado con un agitador superior bajo argón. Se añadieron 4 l de DCM y 2 l de DMF a la mezcla con agitación constante. La mezcla de reacción se enfrió sobre un baño de agua helada a ~10 °C. Se añadió una solución de mono-Boc propanodiamina 21(1265 g, 7,260 mol) en 2 l de DCM a la solución bajo agitación. La reacción se volvió homogénea en 15 min. La suspensión de EDAC.HCl (1440 g, 7,260 mol) en 4 l de DCM se añadió lentamente a la mezcla de reacción seguido de la adición lenta de DIEA (2,40, 13,55 mol) durante un período de 1,5 h al matraz bajo argón mientras se mantenía la temperatura ~10 °C. El color de la solución se convirtió en amarillo pardusco claro; la mezcla se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche bajo atmósfera de argón. Se comprobó la TLC (eluyente: MeOH/DCM al 10 %, tinción KMnC4 básica) y la mezcla de reacción se transfirió a un evaporador giratorio de 20 l; se eliminaron el DCM y los volátiles a presión reducida. El matraz se trasladó a una campana y provisto con un agitador superior. Se añadieron 10 l de agua al residuo con agitación para formar una solución lechosa. La mezcla se dejó reposar durante toda la noche. Se separaron dos capas durante la noche y se decantó la capa superior mediante el uso de una bomba de transferencia. La capa de la parte inferior se disolvió en 8 l de EtOAc y se transfirió a un embudo separador. La capa de EtOAc se lavó sucesivamente con agua (2 x 4 l de agua 2 l de salmuera), ac. solución de NaHCO3 (2,5 l 1 l de salmuera), solución ac. de ácido cítrico al 10 % (2 x 3,5 l 1 l de salmuera), agua (lx4 l 2 l de salmuera) y salmuera saturada (2,5 l). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y el solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se evaporó conjuntamente sucesivamente con tolueno (2,50 l) y diclorometano (6 l). El residuo se secó a alto vacío durante toda la noche para obtener el compuesto 24A como un líquido gomoso amarillo pálido (2026 g, 30 g más de rendimiento cuantitativo, contaminado con pequeña cantidad de HOBt y agua). RMN (400 MHz, DMSO-d6): § 7,79 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 6,94 (s, 1H), 6,72 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 3,61 - 3,45 (m, 5H), 3,01 (dd, J = 12,8, 6,6 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 12,7, 6,5 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 2,03 (t, J = 7,3 Hz, IH), 1,55 - 1,38 (m, 3H), 1,36 (d, J = 10,7 Hz, 8H), 1,21 (s, 3H). EM calculada para C50H93N7O15: 1031,67; encontrada 1032,6 (M+H).
Ejemplo 13 - Síntesis de la sal de ácido trifluoroacético triamino 25A
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El compuesto 24A (1990 g, líquido gomoso) de la etapa anterior se disolvió en 4 l DCM en el matraz del evaporador giratorio. Se determinó el peso de la mezcla y se transfirió la cantidad necesaria de solución a otro matraz de evaporador giratorio de 20 l para esta reacción. El DCM se eliminó a presión reducida y el residuo se secó bajo a vacío durante toda la noche. Después del secarse durante toda la noche, el residuo 24A (750 g, 727 mmol) se disolvió en DCM anhidro (2 l) y se transfirió a un matraz de cuatro bocas de 12 l equipado con un agitador superior bajo argón. El matraz del evaporador giratorio se lavó con 500 ml de DCM y se transfirió esa solución también al matraz de reacción. Se añadió anisol (250 ml) a la mezcla de reacción seguido de ácido trifluoroacético (3,5 l) con agitación. Durante la adición de ácido trifluoroacético se produjo una fuerte efervescencia debido a la liberación de gas butileno, un subproducto de la reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La terminación de la reacción se monitoreó mediante análisis de la EM. La mezcla se transfirió a un matraz de evaporador giratorio de 20 l y los volátiles se sometieron a presión reducida. El residuo se evaporó conjuntamente con tolueno anhidro (2 x 2 l) para obtener un líquido gomoso marrón pálido. El matraz se transfirió a una campana y se conectó a un agitador superior. El residuo se disolvió en MeOH anhidro (1 l); se añadió éter anhidro (8 l) a la solución bajo agitación constante. Durante la adición de éter, la solución se volvió lechosa y se separó una masa gomosa en la parte inferior del matraz. El matraz se mantuvo en la cámara frigorífica (~4 °C) durante toda la noche para que sedimentara todo el producto en la pared y la parte inferior del matraz. La capa superior se decantó y el matraz que contenía el residuo se transfirió al evaporador giratorio; se evaporó el solvente residual a presión reducida y secó el residuo a alto vacío durante toda la noche para obtener el compuesto 25A como un sólido esponjoso blanco, que tras la eliminación del vacío se convirtió en un líquido incoloro gomoso (789 g, 9 g más que el rendimiento cuantitativo). RMN (400 MHz, DMSO-ds): 88,06 (t, J= 5,6 Hz, 1H), 7,85 (s, 3H), 6,99 (s, 1H), 3,66 - 3,42 (m, 4H), 3,21 - 3,00 (m, 2H), 2,89 - 2,68 (m, 2H), 2,28 (dt, J= 12,4, 6,9 Hz, 2H), 2,04 (t, / = 7,3 Hz, 1H), 1,76 - 1,59 (m, 2H), 1,56 - 1,35 (m, 1H), 1,21 (s, 3H). EM calculada para C35H69N7O9 : 731,52; encontrada 732,50 (M+H).
Ejemplo 14 - Síntesis de éster tris(BzGalNAc )-metilo 26B
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La sal de ácido trifluoroacético triamino 25A (776 g, 0,7228 moles) se disolvió en 2 l de DMF anhidro en un matraz de evaporador giratorio de 20 l. Los compuestos 13B (1570 g, 2,476 moles) y HOBt (490 g, 3,630 moles) se cargaron en un matraz de 22 l de cuatro bocas con un agitador superior bajo argón. A la mezcla anterior se añadieron 4 l de DCM y 2 l de DMF y se agitó hasta que la mayor parte del sólido pasó a solución (30 min, persiste una ligera turbidez). El matraz se enfrió sobre una mezcla de hielo y agua a aproximadamente 10 °C. Se añadió una disolución de EDAC.HCl (576 g, 2,904 moles) en 2 l de DMF seguido de DIEA (1260 ml) mediante el uso de un embudo de adición durante un período de 15-20 minutos mientras se mantuvo la temperatura a ~10 °C. A la mezcla anterior, se añadió lentamente la solución de 25A en DMF y se enjuagó el matraz con 1 l de DMF y se transfirió esta solución también a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y continuó en agitación durante toda la noche. El color de la solución cambió de amarillo pálido a marrón pálido durante la noche. La TLC se comprobó y la mezcla de reacción se transfirió a un evaporador giratorio de 20 l para eliminar la mayoría de los volátiles. La mezcla de reacción se dividió en aproximadamente dos mitades y se añadieron 12 l de agua fría con hielo con agitación vigorosa a cada una de esas porciones. El sólido precipitó durante la adición de agua y la solución se mantuvo en la cámara fría durante toda la noche. Dos capas separadas con solución de color amarillo pálido en la parte superior y precipitado de color marrón claro en la parte inferior. La capa superior se decantó mediante el uso de una bomba de transferencia y el residuo se disolvió en EtOAc (9 l). Esta solución se lavó sucesivamente con una mezcla de NaCl al 5 % (5 l) y H3PO4 al 20 % (1 l), NaCl al 5 % (2x6 l) y NaCl sat. (3,5 l). La capa orgánica se separó, se diluyó con EtOAc a 20 l y se secó sobre sulfato de sodio anhid. Esta solución se cargó directamente en una columna de filtración de 7,5 kg de gel de sílice (EMD, grado 62, malla 60-200) precargada en húmedo con EtOAc en un embudo de 20 l. La columna se eluyó con 40 l de EtOAc (los primeros 12 l eran solvente puro y se reutilizaron), seguido de 20 l de EtOAcmetanol 20:1 y 6 0 l de EtOAc-metanol 3:1. Se recogieron fracciones de EtOAc-metanol (3:1) que contenían el producto, se evaporaron y el residuo se secó a 2 mbar/35 °C durante la noche para proporcionar 1,51 kg (82 %) de 26B como espuma blanquecina. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6 ): 8 8,00 (d, J = 9,3 Hz, 3H), 7,96 - 7,80 (m, 15H), 7,80 -7,43 (m, 30H), 7,37 (t, J= 7,8 Hz, 6 H), 6,98 (s, IH), 5,76 (d, J= 3,2 Hz, 3H), 5,37 (dd, J= 11,1, 3,2 Hz, 3H), 4,74 (d, J= 8,5 Hz, 3H), 4,55 - 4,40 (m, 6 H), 4,40 - 4,20 (m, 6 H), 4,01 (q, /= 7,1 Hz, 3H), 3,89 - 3,73 (m, 3H), 3,66 - 3,42 (m, 18H), 3,34 (s, 2H), 3,03 (s, 12H), 2,35 - 2,17 (m, 8H), 2,13-2,00 (m, 8H), 1,70 (s, 9H), 1,61 - 1,33 (m, 21H), 1,16 (dd, J = 12,4, 5,2 Hz, 15H).
Ejemplo 15 - Síntesis de Tris(AcGalNAc)-Ácido 27A
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Etapa 1
A una solución de Tri-GalNAc (Bz)-Éster metílico 26B (1,51 kg, 0,585 mol) en metanol anhid. (6,5 l) se añadió una solución al 25 % en peso de NaOMe en metanol (135 ml, 0,585 mol) bajo atmósfera de Ar. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se neutralizó con clorhidrato de trietilamina (96,3 g, 0,70 mol), se evaporó a presión reducida, y el residuo se dividió entre 1 % ac. NaCl (7,0 l) y EtOAc (3,0 l) en un embudo separador para extraer el benzoato de metilo (producto secundario) en la capa orgánica (el producto desbenzoilado 26B-1 es muy soluble en agua). La capa de EtOAc se separó y la capa acuosa se lavó con 3,0 l adicionales de acetato de etilo. Se añadió piridina (2,0 l) al extracto acuoso y la mezcla se evaporó en el evaporador giratorio a 40 mbar/35 °C hasta que se eliminaron todos las trazas de acetato de etilo (~2 h).
Etapa 2
El matraz del evaporador giratorio que contenía el extracto de agua de la etapa anterior se equipó con un agitador superior, se añadió NaOH (70,0 g, 1,75 mol) y la mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, se neutralizó con clorhidrato de trietilamina (241 g, 1,75 mol), se diluyó con 6,0 l de piridina y los solventes se evaporaron a 13 mbar/35 °C en el evaporador giratorio de 20 l hasta obtener un residuo oleoso viscoso. El residuo se volvió a disolver en piridina (6,0 l), se filtró el cloruro de sodio precipitado, se lavó con piridina (3x500 ml), y los filtrados combinados se evaporaron a 20 mbar/45 °C hasta obtener un residuo oleoso viscoso.
Etapa 3
El residuo de la etapa 2 se volvió a disolver en piridina anhid. (6,0 l) bajo atmósfera de Ar y la solución se añadió lentamente a una mezcla vigorosamente agitada de piridina anhid. (5,6 l) y anhídrido acético (2,8 l) durante aproximadamente 1,5 h. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche, se enfrió en un baño de agua helada a -4 °C y se añadieron 1,5 l de agua helada. Se observó un efecto exotérmico de hasta 40 °C; la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente (~0,5 h) y se transfirió a un evaporador giratorio para eliminar los volátiles. El residuo oleoso se secó al vacío a 2 mbar/45 °C hasta un peso constante (-1,82 kg). El residuo se disolvió en una mezcla agitada de acetato de etilo (5,0 l) e isopropanol (1,0 l), y se añadió cloruro de sodio ac. al 25 % (6,0 l). El pH de la fase ac. se ajustó a 7 mediante la adición lenta de trietilamina (1,025 l). La neutralización se acompañó de la precipitación de cloruro de sodio sólido y la separación de una capa intermedia, que se llevó de nuevo a la fase orgánica mediante la adición de 0,5 l de isopropanol. Los líquidos se decantaron del NaCl sólido a un embudo separador mediante el uso de una bomba de transferencia. La capa orgánica se separó, se lavó con NaCl al 25 % (6,0 l x 2), NaCl sat. (3,0 l), se secó sobre sulfato de sodio anhid., se evaporaron los solventes, el residuo espumoso se evaporó conjuntamente con acetonitrilo anhidro (6,0 l x 2) y se secó a 2 mbar/40 °C durante 24 h para proporcionar 1,11 kg (95 %) de 27A. RMN (400 MHz, DMSO-d6): 58,00 (d, J = 9,3 Hz, 3H), 7,96 - 7,80 (m, 15H), 7,80 - 7,43 (m, 30H), 7,37 (t, J = 7,8 Hz, 6H), 6,98 (s, 1H), 5,76 (d, J = 3,2 Hz, 3H), 5,37 (dd, J = 11,1, 3,2 Hz, 3H), 4,74 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 4,55 - 4,40 (m, 6H), 4,40 - 4,20 (m, 6H), 4,01 (q, J = 7,1 Hz, 3H), 3,89 - 3,73 (m, 3H), 3,66 - 3,42 (m, 18H), 3,34 (s, 2H), 3,03 (s, 12H), 2,35-2,17 (m, 8H), 2,13-2,00 (m, 8H), 1,70 (s, 9H), 1,61 - 1,33 (m, 21H), 1,16 (dd, J = 12,4, 5,2 Hz, 15H).
Ejemplo 16 - Síntesis de Hip-Tris(AcGalNAc) 29A
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A una solución agitada de ácido GalNAc triantenario 27A (1,107 kg, 0,552 mol) en DCM anhid. (10,0 l) en un matraz de cuatro bocas de 22 l se añadieron el derivado de hidroxiprolinol 7A (256 g, 0,61 mol), HOBt monohidratado (168 g, 1,1 mol) y HBTU (250 g, 0,66 mol) bajo atmósfera de argón. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min, se añadió DIEA (286 ml, 1,65 mol) y la agitación continuó durante 3 horas adicionales. Se comprobó la TLC y la mezcla se apagó con NaHCO3 acuoso al 4 % (6,0 l), la capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida hasta que quedó un residuo viscoso gomoso. Este último se dividió entre una mezcla de acetato de etilo-isopropanol (5:1) (9,6 l) y 1 % ac. NaCl (8,0 l), la capa orgánica se separó, se lavó con solución sat. de NaCl (3,5 l), diluida hasta un volumen total de 13 l con mezcla de acetato de etilo-isopropanol (5:1) y se secó sobre Na2SO4 anhid.. La solución seca se cargó directamente en una columna de filtración de gel de sílice (7,2 kg, EMD malla 60-200) que se desactivó y se precargó en húmedo con TEA al 2 % en acetato de etilo. La columna se eluyó con acetato de etilo-isopropanol (5:1, 30 l) seguido de acetato de etilo-metanol (2:1, 46 l). La pequeña fracción contaminada (6 l) precedió a las principales fracciones puras, que se recogieron por separado. Las fracciones puras se evaporaron al vacío, y el residuo espumoso se volvió a disolver y se evaporó conjuntamente con acetonitrilo anhidro (6 l x 2). El residuo se secó durante toda la noche a 2 mbar/30 °C para proporcionar 1,145 kg de 29A (87 %). La fracción contaminada se evaporó y se purificó de manera analógica en una pequeña columna de filtración de gel de sílice (325 g) para proporcionar 46 g adicionales del material. Rendimiento total de 29A: 1,19 kg, 90 %. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 87,82 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,73 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,24 (m, 1H), 7,24 - 7,11 (m, 2H), 6,97 (s, 1H), 6,93 - 6,80 (m, 1H), 5,20 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 5,01 - 4,85 (m, 1H), 4,48 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,42 - 4,23 (m, 1H), 4,13 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4,06 - 3,96 (m, 3H), 3,86 (dd, J = 19,9, 8,9 Hz, 1H), 3,77 - 3,64 (m, 3H), 3,62 - 3,46 (m, 5H), 3,46 - 3,28 (m, 2H), 3,15 (dd, J = 8,7, 5,0 Hz, 1H), 3,11 - 2,92 (m, 6H), 2,34 - 2,15 (m, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,08 - 2,00 (m, 5H), 1,98 (s, 3H), 1,91 - 1,85 (m, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,48 (dd, J =17,3, 11,4, 6,3 Hz, 7H), 1,30-1,11 (m, 6H).
Ejemplo 17 - Síntesis de Hip-Tris(AcGalNAc) Succinato 30
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Se añadieron sucesivamente anhídrido succínico (94,8 g, 0,948 mol) y PS-DMAP (carga: 1,57 mmol/g, 604 g, 0,948 mol) a una solución de 29A (1,14 kg, 0,474 mol) y trietilamina (198 ml, 1,42 mol) en DCM anhid. (6,0 l) en un matraz de cuatro bocas de 12 l equipado con un agitador superior debajo atmósfera de argón. Después de agitar durante 24 h, se añadió anhídrido succínico adicional (24 g, 0,24 mol). La mezcla se agitó durante 24 h adicionales, se filtró a través de Celite cargado en húmedo en DCM (0,5 kg), y los sólidos se lavaron a fondo con DCM (8 l en total). El filtrado combinado (~14 l) se evaporó a presión reducida a un volumen de ~6 l. La mezcla se transfirió a un embudo separador y se añadió trietilamina (200 ml). La solución combinada se lavó con 5 % ac. NaCl (6 l x 2), la capa orgánica se separó y se secó sobre Na2SO4 anhid.. El solvente se evaporó en un evaporador giratorio de 20 la presión reducida hasta obtener un residuo espumoso suave que se volvió a disolver en 6 l de DCM anhid. que contiene 100 ml de trietilamina, el solvente se evaporó nuevamente, y el residuo espumoso que se obtuvo se secó a 1 mbar/20 °C durante 2 días para proporcionar 1,19 kg (96 % con base en sal de trietilamina) de 30 como espuma vítrea. La RMN indicó la presencia de 4,3 % de masa de solventes residuales (DCM y trazas de trietilamina). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): S 7,93 -7,72 (m, 1H), 7,28 (dd, J = 13,3, 6,1 Hz, 1H), 7,24 - 7,12 (m, 1H), 6,99 (s, 1H), 6,94 - 6,80 (m, 1H), 5,33 (s, 1H), 5,20 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 4,96 (dd, J = 11,2, 3,3 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 4,10 - 3,95 (m, 1H), 3,86 (dd, J = 19,8, 8,9 Hz, 1H), 3,79 - 3,62 (m, 1H), 3,61 - 3,45 (m, 1H), 3,45 - 3,32 (m, 1H), 3,26 - 3,15 (m, 1H), 3,13 - 2,94 (m, 1H), 2,41 - 2,13 (m, 1H), 2,09 (s, 1H), 2,03 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 1,98 (s, 1H), 1,88 (s, 1H), 1,76 (s, 1H), 1,57 - 1,35 (m, 2H), 1,31-1,06 (m, 2H), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, 1H).
Ejemplo 18 - Método alternativo de fabricación del compuesto 18A - Sustitución del acoplamiento EDC/HOBt con cloruro ácido
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Se añadió cloruro de tionilo (bajo en hierro, 99 %, 19,7 ml, 0,27 mol) a una suspensión del ácido dodecanodioico -éster monometilo 15A (55,6 g, 0,228 mol) en tolueno anhid. (200 ml) y la mezcla se agitó a 60 °C hasta que se completó la evolución del gas (burbujeador, 3 h). La mezcla se enfrió hasta ta; el solvente y los volátiles se evaporaron a presión reducida, y el matraz de evaporación se rellenó con argón. El residuo (cloruro ácido 15B) se diluyó con DCM anhid. (200 ml) y se transfirió lentamente a través de una cánula durante 40 min en una solución enfriada (0 °C) y agitada de 17A (104,5 g, 0,207 mol) y DIEA (47 ml, 0,27 mol) en DCM anhid. (500 ml). La agitación continuó a 0 °C durante 30 minutos adicionales y la mezcla se apagó mediante la adición de NaHCO3 sat. (400 ml). La fase orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en una mezcla 1:1 de acetato de etilo y hexano (600 ml) y se lavó consecutivamente con 600 ml de cada uno: 2 % ac. NaHCO3, agua, 5 % ac. HCl, agua (x2) (Nota 2), NaCl sat. y se secó sobre Na2SO4 anhid. Los solventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se secó con agitación a 53,33 Pa (0,4 torr) durante toda la noche para proporcionar 143,5 g (95 %) de 18a .
Ejemplo 19 - Síntesis de la sal de ácido tósico triamínico 25B
1) desprotección con ácido p-toluenosulfónico (PTSA o ácido tósico) del éster metílico de Tris(BocAmina) 24A a la correspondiente sal de ácido tósico 25B
Figure imgf000054_0001
Una solución de amina protegida con Boc 24A (9,36 g, 9,1 mmol) y monohidrato de ácido p-toluenosulfónico (ácido tósico, 6,23 g, 32,8 mmol) en metanol seco (90 ml) se calentó en un matraz protegido contra la humedad a 50 °C durante toda la noche. La terminación de la reacción se controló mediante análisis de EM. La mezcla se enfrió hasta ta, el exceso de ácido tósico se neutralizó mediante la adición de DIE A (0,96 ml, 5,5 mmol), y la mezcla se diluyó con tolueno (180 ml). Los solventes se evaporaron y el residuo sólido espumoso que se obtuvo se secó en un evaporador giratorio a 8 mbar/30 °C durante 2 h para proporcionar 13,95 g de 25B que contenía ~5,5 mmol (1,66 g) de sal p-TSA-DIEA y trazas de tolueno residual.
2) Armazón triantenaria 26A a partir de sal de ácido tósico triamino 25B
A una solución enfriada (10 °C) y agitada de ácido BzGalNAc C5 - sal sódica 13A (21,5 g, 32,8 mmol) y monohidrato de HOBt (5,51 g, 36 mmol) en DMF anhid. se añadió clorhidrato de EDC (100 ml) (7,1 g, 36 mmol) seguido de DIEA (10,0 ml, 73 mmol), y la mezcla se agitó a 10 °C hasta la disolución completa del clorhidrato de EDC (~ 15 min). Simultáneamente, el sólido de la etapa anterior que contenía 25B (13,95 g, 9,1 mmol) se disolvió en DMF anhid. (70 ml) y la solución se transfirió a través de una cánula a la mezcla anterior. La mezcla se dejó calentar hasta ta durante toda la noche, se enfrió a 0 °C y se diluyó con agua (600 ml). Tras sedimentar los componentes orgánicos a 0 °C durante toda la noche, la capa de agua se decantó del residuo orgánico viscoso, este último se tomó en EtOAc (200 ml), se lavó sucesivamente con una mezcla de NaCl al 5 % (200 ml), ácido fosfórico al 20 % (20 ml), salmuera al 5 % (x2) y salmuera saturada; se diluyó la capa orgánica con EtOAc hasta un volumen total de 300 ml y se secó sobre Na2SO4 anhid.. Esta solución se cargó directamente en una columna de filtración corta de 100 g de gel de sílice precargada en húmedo en EtOAc. La columna se eluyó con EtOAc (300 ml x 2) seguido de EtOAc-metanol 3;1 (300 ml x 3), las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon, evaporaron y se secaron a 53,33 Pa (0,4 torr) durante la noche para proporcionar 20,14 g (86 %) de 26A. El perfil de HPLC (87 %) fue comparable al lote de referencia (88 %).
Ejemplo 20- Síntesis de Hip-Tris(AcGalNAc ) Succinato 30 - Succinilación en ausencia de DMAP o DMAP inmovilizado (PS-DMAP)
Figure imgf000055_0001
Se añadió anhídrido succínico (1,18 g, 11,8 mmol) a una solución de 29A (11,4 g, 4,7 mmol) y trietilamina (1,95 ml, 14 mmol) en DCM anhid. (60 ml) bajo atmósfera de Ar. La mezcla se agitó a ta durante 2 días, después de lo cual la TLC indicó una conversión completa. La mezcla se lavó dos veces con 5 % ac. NaCl (x 2), la capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhid. y el solvente se evaporó a presión reducida. El residuo se secó a 0,4 mbar/20 °C para proporcionar 11,8 g (96 % con base en sal de trietilamina) de 30. La dietilamina también puede ser usada en lugar de la trietilamina, lo que resulta en un producto menos coloreado.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000056_0001
en donde
A es un enlazador de alquileno C6-C14;
cada R es, independientemente, un grupo protector de ácido; y
Rx es un grupo protector de ácido;
dicho proceso comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IX):
Figure imgf000056_0002
con un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000056_0003
para producir un compuesto de fórmula (VIII), en donde Hal es halógeno.
2. El proceso de la reivindicación 1, en donde R es t-butilo, Hal es Cl y A es un enlazador alquileno C10.
3. El proceso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la reacción se realiza en presencia de N,N-diisopropiletilamina.
4. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000056_0004
en donde Z es un grupo protector de ácido, n es 0-20, y cada ocurrencia de r y s es independientemente 1-7; dicho proceso comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XII):
Figure imgf000057_0001
en donde P es un grupo protector de amina que puede eliminarse con un ácido sulfónico.
5. El proceso de la reivindicación 4, en donde el ácido sulfónico es ácido p-toluenosulfónico o ácido metanosulfónico.
6. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000057_0002
en donde
X es un grupo protector de hidroxilo;
Y es un grupo protector de amina;
Prt es un grupo protector de hidroxilo;
n es 0-15;
q, ry s son cada uno, independientemente, 1-7; y
Q
es un soporte sólido;
dicho proceso comprende
(1) tratar un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000057_0003
con un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000058_0001
en presencia de una base para proporcionar un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000058_0002
en donde Z es un grupo protector de acido;
(2) desproteger Z en el compuesto de fórmula (IV), seguido de acoplamiento con una prolina hidroxilada de fórmula (V):
Figure imgf000058_0003
(3) acoplar el producto de la etapa (2) con anhídrido succínico; y
(4) acoplar el producto de la etapa (3) a un soporte sólido para proporcionar un compuesto de fórmula (I).
7. El proceso de la reivindicación 6,
en donde X es Bz o Ac; y/o
en donde Y es Ac; y/o
en donde n es 7; y q, r, y s son cada uno 1; y/o
en donde Prt es un grupo protector de 4,4'-Dimetoxitritilo.
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