JP7296916B2 - オリゴヌクレオチド-リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法 - Google Patents
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Description
オリゴヌクレオチドが、siRNA、マイクロRNA、アンチmiR、アンタゴmir、マイクロRNA模倣体、デコイ、免疫刺激、G-四量体、スプライシング変化、ssRNA、アンチセンス、アプタマー、ステムループRNAもしくはDNAまたは任意の二本鎖RNAもしくはDNAの2つの鎖のうちの1つまたは二本鎖のより短い方のRNAもしくはDNA(例えば、siRNA)などのオリゴヌクレオチドであり;
生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
リンカーが、リガンドとオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり、ここで、リンカーが、表1または1A中の連結基から選択されてもよく;および
リガンドが、糖に由来し、ここで、(i)リガンドが、リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ(ii)コンジュゲートが、1~12個のリガンド(好ましくは、1~5個または1~3個のリガンド)を含有し、(iii)リガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか(その場合、k=1)、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサ(リガンド骨格とも呼ばれる)であり、
R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、かつkが、1~6(好ましくは、1~5または1~3)であり、各R3が、R2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい);および
(c)表4または4A中のリガンド
から選択されてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のリガンド(例えば、糖質)コンジュゲートに関する。
以下のリンカーが、保護基DMTrとともに示される。コンジュゲートされるとき、DMTr基が除去され、隣接する酸素原子は、オリゴヌクレオチドへの(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基への)リンカーの結合部位である。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
表1A中で以下に示されるリンカーは、それに1つ以上のオリゴヌクレオチドが結合された状態で示される。リンカーが、オリゴヌクレオチドを含まない化学的部分であることが、当業者に理解されるであろう。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
リガンドはまた、以下の2つの一般式
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
Q1が、H、C1~C4アルキル、
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である。
Aが、リンカーへの結合点であり、リンカーに結合された結合または化学結合基(例えば、アミド、カルバメート、尿素、-C-N-(例えば、-CH2-NH-または-C(Ra)(Rb)-N(Rc)-、ここで、Ra、Rb、およびRcが、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択される)、C=NH、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはヒドラジン)を表すことができ;
Yが、任意の官能基(例えば、二価基として使用されるとき、それは、-CONH-、-NHCO-、またはSであり得、または、例えば、一価基として使用されるとき、それは、-OH、-SH、またはハロゲンであり得る)、-CH2-、保護基、または化学的に不活性なキャップであり;
Qが、OH、または本明細書に記載される糖のC6位に対する任意の修飾であり;および
nが、1~6である。
さらに別の実施形態において、上記のリガンドまたは標的化モノマー(表2、2A、3、3A、4、および4A中などの)のいずれかの糖部分は、以下の式III
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;および
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない)
の糖部分で置換され得る。
R52が、1~12個の原子の長さの二価化学基であり;
リンカーが、上に定義されるとおりであり;
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり;および
Xが、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない。
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり;
オリゴヌクレオチド-1およびオリゴヌクレオチド-2が、上記のオリゴヌクレオチドと同じ定義を有し;
生物学的に活性な物質-1および生物学的に活性な物質-2が、上記の生物学的に活性な物質と同じ定義を有し;および
各リガンドが、同じであってもまたは異なっていてもよく、各オリゴヌクレオチドが、同じであってもまたは異なっていてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートに関する。
各オリゴヌクレオチド(または生物学的に活性な物質)およびリガンドが、独立して、本明細書に定義されるとおりであり;
各リンカーが、独立して、本明細書に記載されるいずれかのもの(例えば、表1または1A中)であり得、または式
tが、1~6の範囲(例えば、1、2、3、4、5、または6)である)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートである。
式VI中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が、核酸塩基(例えば、ウラシル、シトシン、アデノシン、またはグアニン)であり、かつ任意選択的に、核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子(例えば、アミノ基)に結合され;および
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。リガンドR8は、例えば、-R2-R3または表2、2A、4、および4A中のリガンドであり得る。
式VII中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスフェートを介して3’末端および/またはホスホロチオエートを介して5’末端でリンカーに結合されてもよく、または逆もまた同様である。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約100ヌクレオチド未満(例えば、約50ヌクレオチド未満の長さを有する化学的に修飾されたまたは非修飾の核酸分子(RNAまたはDNA)を指す。核酸は、例えば、(i)一本鎖DNAまたはRNA、(ii)ヘアピンループを有する二本鎖DNAまたはRNAを含む二本鎖DNAまたはRNA、または(iii)DNA/RNAハイブリッドであり得る。二本鎖RNAの非限定的な例としては、siRNA(低分子干渉RNA)が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約5~約50ヌクレオチド(約10~約50ヌクレオチドなど)の範囲の長さを有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約15~約30ヌクレオチドなどの約6~約30ヌクレオチドの範囲の長さを有する。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約18~約23ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
オリゴヌクレオチド
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物のゲノム中のDNAから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小さいRNA分子の高度に保存された種類である。プロセシングされるmiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の主要調節因子として認識されている一本鎖約17~25ヌクレオチド(nt)RNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’-不飽和領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。RISCは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
一実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択される配列に相補的なDNAまたはRNA、例えば標的遺伝子mRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なmRNAに結合することによって遺伝子発現を阻害するものと考えられる。標的mRNAへの結合は、それに結合することによって相補的なmRNA鎖の翻訳を防ぐことによって、または標的mRNAの分解をもたらすことによって、遺伝子発現の阻害をもたらし得る。アンチセンスDNAは、特定の、相補的(コードまたは非コード)RNAを標的にするのに使用され得る。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNase Hによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、より好ましくは、約15~約30個のヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないことがあり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合、または標的配列との1つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合が想定される。
アンタゴmirは、RNAse保護ならびに向上した組織および細胞取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有するRNA様のオリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖、ホスホロチオエート骨格および、例えば、3’末端におけるコレステロール部分の完全な2’-O-メチル化によって、通常のRNAと異なる。アンタゴmirは、アンタゴmirおよび内因性miRNAを含む二本鎖を形成し、それによって、miRNAに誘発される遺伝子サイレンシングを防ぐことによって、内因性miRNAを効率的にサイレンシングするのに使用され得る。アンタゴmirを介したmiRNAサイレンシングの例は、全体が参照により本明細書に明示的に援用されるKrutzfeldt et al,Nature,2005,438:685-689に記載されるmiR-122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成され得る。米国特許出願公開第2007/0123482号明細書および同第2007/0213292号明細書(それぞれが参照により本明細書に援用される)を参照されたい。
アプタマーは、高い親和性および特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である(それぞれ、全体が参照により援用される、Tuerk and Gold,Science 249:505(1990);Ellington and Szostak,Nature 346:818(1990))。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの様々な実体に結合するDNAまたはRNAアプタマーの産生が成功している。それぞれ、全体が参照により援用される、Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10-16(1997)、Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324-9(1999)、およびHermann and Patel,Science 287:820-5(2000)を参照されたい。アプタマーは、RNAまたはDNAベースであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的の結合が遺伝子の活性に影響を与えるmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAが、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性を調節するのに直接関与する。一般に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合するための反復するインビトロでの選択または同等に、SELEX(試験管内進化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))によって操作される(engineered)。アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製されてもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、「アプタマー」という用語は、具体的に、2つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから導かれるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
別の実施形態によれば、核酸-脂質粒子は、リボザイムと結合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するRNA分子錯体である(Kim and Cech,Proc Natl Acad Sci USA.1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons,Cell.1987 Apr 24;49(2):211-20)。例えば、多数のリボザイムは、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断する高度な特異性で、リン酸エステル転移反応を加速する(Cech et al.,Cell.1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof,J Mol Biol.1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub,Nature.1992 May 14;357(6374):173-6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が塩基対形成相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因するとされている。
哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されるとき、免疫応答を誘発することが可能な免疫刺激オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖または二本鎖)を含む、脂質粒子と結合される核酸は、免疫刺激性であり得る。ISSは、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定のパリンドローム(全体が参照により援用されるYamamoto S.,et al.(1992)J.Immunol.148:4072-4076を参照)、またはCpGモチーフ、ならびに他の公知のISSの特徴(多重Gドメインなど、全体が参照により援用される国際公開第96/11266号を参照)を含む。
リンカーは、オリゴヌクレオチドをリガンドに結合するための任意の好適な基であり得る。リンカーの他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
オリゴヌクレオチドは、両者を結合するための任意の好適な基を介してリンカーに結合され得る。基は、切断可能であるかまたは切断不可能であり得る。リンカーおよび好適な結合基の例が、本明細書に記載される。結合基の他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。好適な結合基としては、例えば、NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHまたは以下に限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの、原子の鎖が挙げられ、そのそれぞれが、置換または非置換であってもよく、1つ以上のメチレンが、O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環式によって介在または終端され得、ここで、R8が、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
切断可能な基の1つの種類は、還元または酸化により切断される酸化還元で切断可能な基である。還元で切断可能な基の例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。候補の切断可能な基が、好適な「還元で切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞内、例えば、標的細胞内で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いた他の還元剤を用いたインキュベーションによって評価され得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価され得る。好ましい実施形態において、候補の化合物は、血液中で10%以下切断される。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で分解される。候補の化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択され、細胞外媒体を模倣するように選択される条件と比較される条件下で標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され得る。
ホスフェート系の切断可能な基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の連結基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、および-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
酸で切断可能な基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれを下回る)のpHを有する酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低いpHの細胞小器官が、酸で切断可能な連結基のための切断環境を提供することができる。酸で切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、または-OC(O)で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素(アルコキシ基)がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはt-ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
エステル系の切断可能な基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルで切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-、または-OC(O)-で表される。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
ペプチド系の切断可能な基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-で表され、式中、RAおよびRBが、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。本明細書において使用される際、「糖質」は、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成されるそれ自体糖質である化合物;または酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、それぞれが少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖(単糖、二糖、三糖および約4~9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびにでんぷん、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、C5以上(好ましくは、C5~C8)糖が挙げられ;二糖および三糖としては、2つまたは3つの単糖単位(好ましくは、C5~C8)を有する糖が挙げられる。
リガンドは、本明細書に記載される任意のリガンドであり得る。
他の好適なリガンドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
本明細書に記載されるコンジュゲートは、被験体に投与するために製剤化され得る。説明しやすくするために、この項における製剤、組成物および方法は、主に、非修飾iRNA剤のコンジュゲートに関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法が、他のオリゴヌクレオチド、例えば、修飾されたiRNA剤のコンジュゲートで実施することができ、このような実施が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
メタノール(60mL)中の市販の(R)-メチル2-((S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)-2-ヒドロキシアセテート200(1.9g)の撹拌溶液に、固体水素化ホウ素ナトリウム(0.4g)を、0~5℃で加え、添加後、反応混合物を室温に温め、20分間撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈し、ジクロロメタンで抽出する。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物(1.6g)を単離し、それをさらに精製せずに次の工程にそのまま使用する。
ジクロロメタン(60mL)中のアルコール201(1.6g)の溶液に、トリエチルアミン(1.5mL)を加え、混合物を撹拌しながら冷却する。この撹拌溶液に、ジクロロメタン(30mL)中のメタンスルホニルクロリド(1.3g)を滴下して加え、混合物を室温で2時間撹拌し、その後、反応混合物を、飽和NaHCO3溶液(100mL)、続いて塩水(100mL)で洗浄し、有機層を、無水Na2SO4上で乾燥させた後、濃縮する。このように得られた粗生成物を、シリカゲルを用いて精製すると、純粋な生成物が得られた。
一般的な手順において、核酸塩基(2当量)を、110℃で無水DMF(100mL)に溶解させ、この撹拌溶液に、固体CsCO3(2g)およびヨウ化ナトリウム(2g)を加え、混合物を激しく撹拌する。この撹拌溶液に、無水DMF(10mL)中のメシレート202(1当量)の溶液を滴下して加える。反応混合物を、110℃でさらに30分間撹拌した後、減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解させ、有機層を、飽和NaHCO3(100mL)、塩水(100mL)で洗浄し、乾燥させる(無水Na2SO4)。有機層の濃縮により、粗生成物が得られ、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物203a~dを単離する。
アルコール203a~dを、トリエチルアミンの存在下で、炭酸ジスクシンイミジル(DSC)で最初に処理して、スクシンイミジルエステルを得て、それを、ピリジンの存在下で、モノフタルイミド保護されたヘキサンジアミンで処理したところ、カラム精製の後、アミン置換された生成物204a~dが得られる。
204a~d中のアセトニド保護を、報告される条件下で、酢酸で処理することによって除去したところ、205a~dが得られ、それを次の工程にそのまま使用する。
ピリジン中のDMTrClによるジオール205a~dの処理により、モノDMT保護されたアルコール206a~dが得られるであろう。
フタルイミド保護されたアミン206a~dを、室温で一晩、メタノール(20倍)中のメチルアミンの溶液で処理する。反応混合物の濃縮、続いてカラム精製により、脱保護アミン207a~dが得られる。
EDCおよびヒューニッヒ塩基を用いた、アミン207a~dによる一本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、リガンドがコンジュゲートされたモノマー208a~dが生じ得る。
同様の結合手順を用いて、アミン207a~dによる、三本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、三本鎖GalNAcがコンジュゲートされたモノマー209a~dが生じ得る。
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いた、アルコール208a~dおよび209a~dのリン酸化により、対応するアミダイト210a~dおよび211a~dが、フラッシュカラム精製後に得られた。
市販の(R)-グリシドールを、文献に報告されるようにODMTr保護されたエポキシド220に転化した。30分間にわたるマイクロ波照射下での、110℃での1,6-ジメチルアミノヘキサン221(6mmol、2当量)によるエポキシド220(1.12g、3mmol)の処理により、エポキシド開環生成物222が90%の収率で得られた。
カルボン酸223とのアミン222の結合により、結合された生成物224が良好な収率で得られた。
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いたアルコール224のリン酸化により、フラッシュカラム精製の後、対応するアミダイト225が得られた。
ASGPRリガンドを調製するのに有用な中間体が、以下のスキーム4~8に示されるように合成され得る。
前述されるコンジュゲート構成単位21(スキーム8を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
前述されるコンジュゲート構成単位32(スキーム10を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
前述されるコンジュゲート構成単位41(スキーム12を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。
前述されるコンジュゲート構成単位104および105(スキーム16を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
パラジウムの結合の化学的作用を用いて、GalNAcリガンドおよびカチオン性分子が、2’位に様々な置換基を有するピリミジンヌクレオシドのC-5位に導入され得る。以下のスキーム(スキーム19~スキーム27)に示されるように、ヌクレオシド構成単位がそれに応じて合成され得る。スキーム28および29において、GalNAcリガンドを含有する設計されたプリンヌクレオシド類似体が示される。スキーム30において、GalNAcリガンドが、C-1’位に導入される。クリックの化学的作用を用いて、スキーム31および32に示されるように、GalNAcが、脱塩基部位に導入され得る。スキーム33は、プリン環上のC-2位にGalNAcリガンドを導入するための交換可能なヌクレオシド手法を示す。
ピリジン(70mL)中の102(R=F;11.2g、30.1mmol;Antiviral Chemistry&Chemotherapy,2010,21,15-31)の溶液に、DMTrCl(11.2g、32.1mmol)を加えた。反応混合物を室温で14時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中5%のMeOH、Rf=0.23)によって精製したところ、化合物103(17.8g、26.4mmol、88%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.81(s,1H)、8.07(s,1H)、7.46-7.14(m,10H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.83(d,J=20.5Hz、1H)、5.60(d,J=7.0Hz、1H)、5.16(dd,J=53.4、4.8Hz、1H)、4.43-4.20(m,1H)、4.08-3.90(m,1H)、3.74(s,7H)、3.23(d,J=2.7Hz、2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.68、158.09、158.07、149.89、145.13、144.72、136.12、135.46、135.37、129.71、127.93、127.67、126.70、123.90、85.61、81.30、69.75、62.47、55.06、55.03。
CH3CN(75mL)中の化合物103(R=F;6.40g、9.49mmol)の溶液に、PdCl2(PhCN)2(73mg、0.190mmol)、Et3N(2.65mL、19.0mmol)およびCF3CH2OH(6.91mL、94.9mmol)を加えた。混合物を、COガス雰囲気下で、60℃で撹拌した。蒸発後、残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%のMeOH)によって精製したところ、104(4.30g、6.37mmol、67%、Rf=CH2Cl2中5%のMeOHによって展開される0.32)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.78(s,1H)、8.52(s,1H)、7.41(d,J=7.4Hz、2H)、7.34-7.16(m,8H)、6.93-6.80(m,4H)、5.90(d,J=20.1Hz、1H)、5.63(d,J=7.1Hz、1H)、5.26(d,J=4.4Hz、1H)、5.12(d,J=4.5Hz、1H)、4.50-4.17(m,3H)、4.07(dd,J=7.3、5.0Hz、1H)、3.73(d,J=1.2Hz、7H)、3.31-3.17(m,2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.70、158.96、158.08、158.06、149.18、148.89、144.76、135.47、135.33、129.70、129.66、127.80、127.61、126.66、124.62、121.86、102.57、94.10、92.27、90.68、90.32、85.56、81.36、68.11、67.95、62.36、59.26、58.91、54.98.19F NMR(376MHz、DMSO-d6):δ-74.94、-74.96、-74.99、-201.81、-201.86、-201.87、-201.93、-201.95、-202.01、-202.07.C33H30F4N2NaO9についての分子量(M+Na)+計算値697.1785、実測値697.2。
化合物104(R=F;4.15g、6.15mmol)を、室温で一晩、3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン(25mL)で処理した。反応混合物を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させたところ、粗材料105が得られた。C36H42FN4O8についての分子量(M+H)+計算値677.2987、実測値677.1。
GalNAcおよびその誘導体を、ヌクレオシド中のリボース環にコンジュゲートするための合成手法が以下に示される。スズ-修飾ヌクレオシドが、臭化アルキルと結合されて、2’-および3’-結合生成物が生成され得る。得られた第一級アミンまたは活性化エステルならびに末端アルケンのそれぞれが、適切な反応条件を用いて、GalNAcリガンドと結合され得る。これらの構成単位は、標準的なホスホロアミダイトの化学的作用を用いて、オリゴヌクレオチド中に組み込まれる。GalNAcリガンドはまた、合成後手法によって、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。
化合物1(15.6g、40.1mmol)を、DCE中のTMSOTf(7.98mL、44.1mmol)で処理したところ、化合物2が得られた。C14H20NO8についての分子量(M+H)+計算値330.12、実測値330.0。
C2-誘導体化されたガラクトサミン類似体が、以下のスキーム52および53に示されるように調製され得る。
プソイドウリジンリガンドが、スキーム55および56に示されるように調製され得る。
N-グリコシド結合を含有するASGPRリガンドが、スキーム57~63に示されるように調製され得る。
以下のASGPRリガンドが、スキーム64~73に示されるように調製され得る。
リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカーが、以下のスキーム74~76によって調製され得る。
RNA合成および二本鎖アニーリング
全てのオリゴヌクレオチドを、AKTAoligopilot合成装置またはABI 394合成装置で合成した。特に規定されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体(dT-CPG、500Å、Prime Synthesis)および標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies)を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。2’-Fホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトを、(Promega)から購入した。10%のTHF/ANC(v/v)中0.2Mの濃度で使用したグアノシンを除いて、全てのホスホロアミダイトを、アセトニトリル(CH3CN)中0.2Mの濃度で使用した。16分間の結合/再利用時間を使用した。活性剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals)であり、PO-酸化については、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化については、2,6-ルチジン/ACN(1:1v/v)中のPADS(2%)を使用した。
合成の完了の後、担体を、100mlのガラス瓶(VWR)に移した。55℃で6.5時間にわたって、80mLの、エタノールアンモニアの混合物[アンモニア:エタノール(3:1)]を用いて、塩基およびリン酸基を同時に脱保護しながら、オリゴヌクレオチドを、担体から切断した。瓶を、氷上で短時間冷却し、次に、エタノールアンモニア混合物をろ過して、新たな250mlの瓶に入れた。CPGを、2×40mLの分量のエタノール/水(1:1v/v)で洗浄した。次に、混合物の体積を、ロータリーエバポレータ(roto-vap)によって約30mlまで減少させた。次に、混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバック(speed vac)で、減圧下で乾燥させた。
乾燥した残渣を、26mlのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA.3HF)またはピリジン-HFおよびDMSO(3:4:6)に再懸濁させ、60℃で90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次に、反応を、50mlの20mMの酢酸ナトリウムでクエンチし、pHを6.5に調整し、精製するまで冷凍庫で貯蔵した。
精製の前に、オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートされるリガンドの性質によって決まる。
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、逆相分取HPLCによって精製した。コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドを、社内で充填したTSKゲルカラムで、アニオン交換HPLCによって精製した。緩衝液は、10%のCH3CN中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)および10%のCH3CN、1MのNaBr中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液B)であった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを、水で150μlに希釈し、次に、CGEおよびLC/MS分析用の特殊なバイアル中にピペットで取った。化合物を、最後に、LC-ESMSおよびCGEによって分析した。
RNAi剤の調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、95℃で5分間にわたって1×PBS中で加熱し、ゆっくりと室温に冷ました。二本鎖の完全性を、HPLC分析によって確認した。以下の表1は、合成されたRNAi剤を示している。
所望のアミノリンカーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例30(スキーム79)に記載される固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件に適合する対応するアミノリンカーモノマーを用いて合成した。脱保護の後、アミノが結合されたオリゴヌクレオチドを、スキーム79の下の表に示されるリガンドのNHSエステルと反応させた後、アンモニアによる処理およびHPLC精製を行った。各精製されたリガンドがコンジュゲートされた一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補的な鎖の等モル混合物でアニールしたところ、表5に示されるsiRNAが得られた。スキーム79および表5に示される(1+1+1)設計が、アミノリンカーホスホロアミダイトをアミノリンカー固体担体に連続して結合し(2つの合成サイクル)、その後、実施例29に記載されるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを連続して結合することによって得られた。
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトHep3B細胞またはラットH.II.4.E細胞(ATCC,Manassas,VA)を、10%のFBS、ストレプトマイシン、およびグルタミン(ATCC)が補充されたRPMI(ATCC)中、5%のCO2の雰囲気下、37℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから解放した。ウェル当たり14.8μlのOpti-MEMおよび0.2μlのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)を、96ウェルプレート内のウェル当たり5μlのsiRNA二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次に、約2×104個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない80μlの完全増殖培地を、siRNA混合物に加えた。RNA精製の前に、細胞を24時間または120時間インキュベートした。10nMおよび0.1nMの最終二本鎖濃度で単回投与実験を行い、10nMの最終二本鎖濃度の最大用量で、8、4倍連続希釈を用いて用量応答実験を行った。
細胞を採取し、150μlの溶解/結合緩衝液中に溶解させ、次に、Eppendorf Thermomixerを用いて850rpmで5分間混合した(混合速度は、プロセス全体を通して同一であった)。10マイクロリットルの磁気ビーズおよび80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、1分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、5分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を加え、70℃で5分間混合した。ビーズを磁石上に5分間捕捉した。40μlの上清を除去し、別の96ウェルプレートに加えた。
反応当たり、1μlの10倍緩衝液、0.4μlの25倍dNTP、1μlのランダムプライマー、0.5μlの逆転写酵素、0.5μlのRNase阻害剤および1.6μlのH2Oのマスターミックスを、5μlの総RNAに加えた。以下の工程によって、Bio-Rad C-1000またはS-1000サーモサイクラー(Hercules,CA)を用いて、cDNAを生成した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間、4℃で保持。
2μlのcDNAを、384ウェルプレート(Roche cat#04887301001)中で、ウェル当たり、0.5μlのGAPDH TaqMan Probe(Applied Biosystems Cat#4326317E(ヒト)Cat#4308313(げっ歯類))、0.5μlのTTR TaqMan probe(Applied Biosystems cat#HS00174914_m1(ヒト)cat#Rn00562124_m1(ラット))および5μlのLightcycler 480プローブマスターミックス(Roche Cat#04887301001)を含むマスターミックスに加えた。Roche LC 480リアルタイムPCR機械(Roche)中でリアルタイムPCRを行った。特に断りのない限り、各二本鎖を少なくとも2つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを2回アッセイした。
以下の実験は、TTRを標的にするRNAi剤のサイレンシング活性に対する、GalNAc3リガンドとともに三重項反復モチーフの導入を含む化学修飾の有益な効果を実証した。
各修飾siRNAのIC50を、Lipofectamine RNAiMAXを用いて標準的な逆トランスフェクションによって、Hep3B細胞中で決定した。簡潔に述べると、5μLのOpti-MEMを、ウェル当たり10μLのOpti-MEMおよび0.5μLのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)とともに、96ウェルプレート内のウェル当たり5μLのsiRNA二本鎖に加えることにより逆トランスフェクションを行い、室温で15~20分間インキュベートした。インキュベーションの後、次に、12,000~15,000個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない100μLの完全増殖培地を、各ウェルに加えた。細胞を、溶解ならびにbDNA(Quantigene)によるTTRおよびGAPDH mRNAの分析の前に、5%のCO2の雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。10nM~0.6pMの範囲の7つの異なるsiRNA濃度を、IC50の決定のために評価し、siRNAトランスフェクト細胞のTTR/GAPDHを、10nMのLuc siRNAでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
初代カニクイザルまたはマウス肝細胞における自由取り込みサイレンシングを、4時間または24時間にわたるTTR siRNAを用いたインキュベーションの後に評価した。サイレンシングを、最初の曝露から24時間の時点で測定した。
RNAi剤の有効性を評価するために、これらの薬剤をマウスに投与した。RNAi剤またはPBS対照を、5mg/kgまたは1mg/kgの単回の皮下投与でマウスに投与した。約48時間後、マウスを200μlのケタミンで麻酔をかけ、次に、右尾動脈を切断することによって放血させた。全血を単離し、血漿を単離し、アッセイまで-80℃で貯蔵した。肝組織を採取し、急速冷凍し、プロセシングまで-80℃で貯蔵した。
マウスにおけるAT3のインビボでの遺伝子サイレンシングを、インビボでのTTR遺伝子サイレンシングについて実施例33に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって、AT3 siRNA-リガンドコンジュゲートの単回皮下投与によって決定した。インビトロでの遺伝子サイレンシングを、実施例31および32に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって評価した。
オリゴヌクレオチドコンジュゲーションに有用なモノ-GalNAc NHSエステルが、以下のスキーム81~86に示されるように調製され得る。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、示される位置でsiRNAのセンス鎖に結合した。
以下の表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。以下のリガンドを、示されるように各siRNAのセンス鎖に結合した。
表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。リガンドを、表に示される位置でセンス鎖に結合した。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート43527におけるものと同じであった。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート57727におけるものと同じであった。L224、L223、L221、L96およびL227の構造が以下に示される。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.29(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.80(m,4H)、7.78-7.76(m,1H)、7.73-7.70(m,0H)、5.81(d,J=5.3Hz、1H)、5.72(d,J=5.6Hz、1H)、5.25(d,J=6.2Hz、1H、D2O交換可能)、5.12(t,J=5.0Hz、1H、D2O交換可能)、5.00(d,J=5.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.14(q,J=5.6Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90-3.79(m,2H)、3.74(t,J=4.6Hz、0H)、3.67-3.58(m,1H)、3.58-3.49(m,4H)、3.46-3.37(m,1H)、1.75(d,J=3.7Hz、3H)、1.62-1.42(m,4H)、1.37-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ168.00、167.97、163.78、163.73、150.79、150.57、136.23、136.07、134.44、134.40、131.60、131.56、123.02、109.38、109.26、87.73、85.89、85.07、82.71、80.82、77.49、72.43、69.69、69.51、68.38、60.86、60.62、29.23、28.96、27.93、26.15、26.07、25.16、24.96、12.26.C24H29N3O8についてのMS計算値487.1955、実測値m/z 488.0(M+1)+、510.2(M+23)Na+、486.2(M-1)-、522.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.26。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.77(m,4H)、7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.4Hz、2H)、7.33-7.19(m,7H)、6.89(d,J=8.0Hz、4H)、5.82(d,J=4.8Hz、1H)、5.10(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.18(q,J=5.5Hz、1H)、3.96(q,J=4.8、4.4Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.62-3.46(m,4H)、3.27-3.14(m,2H)、1.59-1.45(m,4H)、1.38(s,3H)、1.34-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.91、163.61、158.19、158.16、150.41、144.66、135.45、135.31、135.11、134.33、131.58、129.74、127.93、127.65、126.84、122.97、113.27、109.60、86.46、85.91、83.09、80.53、69.63、68.76、63.19、55.06、37.31、28.89、27.91、26.07、24.95、11.66.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.3(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.35。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H、D2O交換可能)、7.87-7.79(m,4H)、7.49(s,1H)、7.36(d,J=7.4Hz、2H)、7.29(t,J=7.6Hz、2H)、7.26-7.19(m,5H)、6.94-6.81(m,4H)、5.71(d,J=4.6Hz、1H)、5.36(d,J=6.0Hz、1H、D2O交換可能)、4.27(q,J=5.2Hz、1H)、3.99-3.95(m,1H)、3.90(t,J=5.3Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.63-3.47(m,3H)、3.36(t,J=6.8Hz、1H)、3.26-3.15(m,2H)、1.59-1.39(m,7H)、1.28-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.93、163.69、158.17、158.15、150.57、144.63、135.72、135.30、135.17、134.35、131.58、129.71、127.91、127.63、126.82、122.97、113.24、109.37、88.69、85.91、80.60、77.27、72.18、69.67、55.03、39.50、37.33、29.09、27.88、26.08、25.08、11.74.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.0(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.18。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.5Hz、2H)、7.30(t,J=7.5Hz、2H)、7.24(d,J=8.9Hz、5H)、6.89(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(s,1H)、4.19(t,J=5.0Hz、1H)、3.97(t,J=4.9Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.27-3.15(m,3H)、1.48(d,J=6.4Hz、2H)、1.38(s,3H)、1.34-1.18(m,6H)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H、D2O交換可能)、7.97(d,J=9.3Hz、1H、D2O交換可能)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.73-7.45(m,11H)、7.41-7.19(m,11H)、6.88(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=4.7Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.12(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.8、7.6Hz、2H)、4.39-4.15(m,3H)、3.96(t,J=4.7Hz、2H)、3.79(dd,J=9.4、3.8Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.28-3.16(m,2H)、2.99(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.43(m,6H)、1.36(d,J=17.6Hz、5H)、1.24(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.40、165.20、165.16、164.86、163.62、158.18、158.15、150.41、144.64、135.47、135.31、135.10、133.77、133.49、129.73、129.20、129.16、129.03、129.00、128.97、128.70、128.59、127.91、127.64、126.82、113.26、109.59、100.89、86.47、85.91、83.09、80.60、71.85、69.97、69.74、68.77、67.92、63.19、62.03、55.04、49.74、38.34、35.03、29.17、29.04、28.59、26.25、25.12、22.69、21.85、11.66.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1298.3(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.36。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.44(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.74-7.45(m,11H)、7.40-7.27(m,6H)、7.23(d,J=8.7Hz、5H)、6.89(d,J=8.1Hz、4H)、5.84(d,J=6.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.5Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.22(m,1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.40(m,2H)、4.38-4.22(m,3H)、4.13(q,J=3.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.7Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.54-3.28(m,5H)、3.25-3.19(m,1H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.57-2.51(m,2H)、2.44(t,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.57-1.27(m,11H)、1.18(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.40、171.76、171.63、169.39、165.20、165.15、164.86、163.50、158.22、150.50、144.48、135.45、135.12、134.95、133.76、133.48、129.70、129.17、129.03、129.00、128.97、128.70、128.58、127.95、127.61、113.30、110.16、100.91、86.13、80.75、78.22、71.89、70.67、70.23、69.97、68.73、67.91、62.04、55.04、52.01、49.73、38.33、34.98、29.13、28.92、28.55、26.19、25.08、22.68、21.82、11.69、10.48.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-、1409.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.39(s,1H)、7.98(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.2Hz、4H)、7.72-7.45(m,11H)、7.38(t,J=6.8Hz、4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(t,J=5.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.35(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.31(m,4H)、4.15-4.04(m,2H)、3.71(s,8H)、3.58-3.45(m,5H)、3.28-3.20(m,2H)、3.03-2.93(m,2H)、2.76(t,J=5.8Hz、1H)、2.57(q,J=5.3Hz、1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.42-1.29(m,5H)、1.27-1.15(m,5H)、1.14-1.03(m,10H)、0.94(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.60、169.26、165.07、165.03、164.73、163.48、158.10、158.08、158.07、150.24、150.22、144.39、144.34、134.99、134.97、134.87、134.80、133.63、133.37、133.34、129.65、129.62、129.60、129.07、129.05、129.03、128.90、128.88、128.87、128.83、128.56、128.45、127.75、127.56、127.50、126.74、118.72、118.57、113.10、113.08、109.63、109.54、100.76、85.92、85.90、71.72、69.84、68.61、67.78、61.89、54.91、49.60、45.53、42.53、42.42、42.31、38.23、38.21、34.88、29.05、29.02、28.96、28.45、26.17、25.08、25.04、24.18、24.13、24.09、24.03、22.55、21.71、19.71、19.66、19.62、11.51、11.49.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.01、153.65。
C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1509.4(M+35)Cl-。Rf=100%のEtOAc中の0.39。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。
粗製の4B*のNMR:
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.50(s,1H)、7.43-7.16(m,9H)、6.88(d,J=8.7Hz、4H)、5.73(d,J=4.6Hz、1H)、4.29(t,J=4.8Hz、1H)、4.02-3.89(m,3H)、3.46-3.15(m,5H)、2.24-2.16(m,1H)、2.05(s,1H)、1.58-1.10(m,13H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ163.73、158.04、158.02、150.58、144.49、135.54、135.18、135.06、129.56、127.78、127.50、126.69、113.11、109.23、88.49、85.78、80.47、77.20、72.02、69.62、62.85、54.91、54.90、41.44、33.12、29.17、26.11、25.31、11.62。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、8.00-7.89(m,5H)、7.73-7.45(m,11H)、7.40-7.35(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(d,J=8.8Hz、4H)、5.74(d,J=10.1Hz、2H)、5.42-5.33(m,2H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.41(m,2H)、4.38-4.23(m,3H)、3.99(d,J=4.7Hz、1H)、3.91(t,J=5.1Hz、1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.41-3.36(m,1H)、3.27-3.17(m,2H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.4Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.28(m,11H)、1.28-1.15(m,4H).13C NMR(75MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.85、163.64、162.25、158.14、150.55、144.57、135.68、135.30、135.16、133.73、133.45、129.66、129.18、129.14、129.00、128.93、128.66、128.55、127.88、127.61、126.80、113.22、109.36、100.88、88.57、85.90、80.63、77.35、72.16、71.83、69.97、69.73、68.73、67.91、62.97、62.02、55.01、54.84、49.75、38.34、35.73、35.02、30.73、29.23、29.11、28.57、26.25、25.21、22.66、21.84、11.68.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1297.4(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.24)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.73-7.51(m,9H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.40-7.19(m,12H)、6.87(d,J=8.7Hz、4H)、5.85(d,J=3.9Hz、1H)、5.74(d,J=3.2Hz、1H)、5.47-5.42(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=9.1、7.7Hz、2H)、4.38-4.20(m,4H)、4.01-3.94(m,2H)、3.80-3.76(m,2H)、3.71(s,6H)、3.40-3.16(m,10H)、3.07-2.94(m,3H)、2.56(q,J=6.2、5.7Hz、2H)、2.43(d,J=4.1Hz、3H)、2.07-2.01(m,2H)、1.69(s,3H)、1.48(d,J=15.0Hz、7H)、1.40-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.63、173.45、172.79、171.92、171.52、169.54、168.92、165.29、165.24、164.94、163.78、158.23、150.33、144.57、136.18、135.27、135.18、133.84、133.57、129.77、129.24、129.09、129.06、129.04、128.77、128.65、127.96、127.70、126.90、113.29、109.73、100.97、85.97、80.75、75.82、73.31、71.96、70.48、62.59、62.40、55.10、55.07、52.06、51.40、51.36、45.45、38.42、35.04、33.35、29.20、29.09、28.95、28.77、22.70、21.90、11.81、10.08、7.26、7.17.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.18)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、8.00-7.88(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.34(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.91-6.85(m,4H)、5.88(dd,J=9.3、5.1Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.62-4.50(m,1H)、4.45(q,J=8.2、7.2Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.07-3.95(m,3H)、3.72(s,13H)、3.44-3.39(m,1H)、3.31-3.22(m,2H)、2.98(s,2H)、2.71-2.66(m,1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.47(d,J=28.1Hz、8H)、1.40-1.18(m,8H)、1.13-1.00(m,11H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、171.70、170.37、170.29、169.37、165.18、165.14、164.85、163.58、163.50、158.20、158.18、158.16、158.14、154.86、150.48、150.43、144.53、144.52、144.50、135.18、135.14、135.05、134.98、133.74、133.48、133.44、129.69、129.66、129.63、129.18、129.16、129.13、129.01、128.99、128.98、128.93、128.67、128.64、128.56、128.54、128.52、127.91、127.88、127.57、118.81、118.70、113.25、113.21、109.72、109.68、100.87、86.16、86.15、86.02、71.83、71.81、69.95、69.92、68.72、68.71、67.89、63.45、59.71、55.00、54.98、49.72、42.79、42.69、42.64、38.35、38.33、35.00、30.12、30.03、29.26、29.25、29.14、29.11、29.09、28.56、28.54、26.29、25.27、25.25、24.34、24.29、24.24、24.22、24.08、24.02、22.66、22.65、21.84、21.83、21.36、20.72、20.67、20.66、19.80、19.78、19.74、19.73、19.67、19.62、18.82、18.56、16.57、14.04、13.65、13.50、11.69、11.56、11.56、11.55、11.53.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ155.08、154.60。C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1474.3(M-1)-、1509.4(M+35)Cl- Rf=100%のEtOAc中の0.43)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.36(s,1H)、8.12(s,1H)、7.95-7.68(m,4H)、7.32(s,2H、D2O交換可能)、5.96(d,J=6.2Hz、1H)、5.42(t,J=7.1、4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.15(d,J=5.1Hz、1H、D2O交換可能)、4.44(t,J=6.3、4.7Hz、1H)、4.27(q,J=4.9、2.8Hz、1H)、3.96(q,J=3.4Hz、1H)、3.66(dt,J=12.2、4.2Hz、1H)、3.60-3.42(m,4H)、3.30(dd,J=9.5、6.4Hz、1H)、1.41(dt,J=33.8、6.9Hz、4H)、1.25-1.04(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.89、150.68、148.24、148.19、134.35、131.54、128.38、127.61、125.44、122.96、118.74、86.39、86.03、81.49、69.66、68.64、28.85、27.81、25.93、24.84.C24H28N6O6についてのLRMS計算値496.2070、実測値m/z 497.2(M+1)+、519.2(M+23)Na+、531.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.28。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.88-7.77(m,4H)、7.42-7.33(m,2H)、7.33-7.16(m,9H)、6.88-6.78(m,4H)、6.01(d,J=4.8Hz、1H)、5.17(d,J=5.9Hz、1H)、4.56(t,J=5.0Hz、1H)、4.38(q,J=5.2Hz、1H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.37(m,4H)、3.34(s,2H)、3.23(d,J=4.6Hz、2H)、1.60-1.37(m,4H)、1.31-1.11(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、158.02、156.08、152.63、149.21、144.85、139.58、135.55、135.45、134.31、131.57、129.70、127.75、127.68、126.62、122.95、119.20、113.10、85.97、85.49、83.48、80.10、69.76、69.12、63.53、28.92、27.85、25.99、24.91.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+、833.1(M+35)Cl- Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、8.02-7.85(m,5H)、7.76-7.45(m,10H)、7.44-7.17(m,13H)、6.83(dd,J=8.8、5.1Hz、4H)、6.01(d,J=4.9Hz、1H)、5.78-5.74(m,1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.18(d,J=5.8Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57(t,J=4.9Hz、1H)、4.46(q,J=8.6、7.4Hz、2H)、4.41-4.23(m,3H)、4.07(q,J=4.5Hz、1H)、3.85-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.55(ddd,J=24.2、9.5、5.1Hz、2H)、3.46-3.38(m,1H)、3.23(d,J=4.4Hz、2H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.58-1.36(m,6H)、1.33-1.12(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.69、169.38、165.20、165.15、164.85、158.00、156.07、152.62、149.19、144.82、139.58、135.53、135.42、133.77、133.51、133.47、129.68、129.19、129.16、129.02、129.00、128.97、128.69、128.59、127.73、127.65、126.61、119.18、113.08、100.88、85.94、85.47、83.49、80.08、71.84、69.96、69.80、69.10、68.75、67.91、63.53、62.02、54.98、54.89、49.73、35.01、29.11、29.03、28.58、26.17、25.05、22.69、21.83.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322、実測値m/z 691.3(M+23)Na+、703.2(M+35)Cl-(4A*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.3(M+23)Na+、1282.3(M-1)-、1318.3(M+35)Cl-(4A).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.00(4A*).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.24(4A)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(s,1H)、8.35(d,J=5.2Hz、2H)、7.98-7.88(m,5H)、7.59(ddt、J=60.0、30.9、7.5Hz、11H)、7.37(dd,J=16.2、8.2Hz、4H)、7.21(q,J=7.3Hz、8H)、6.81(dd,J=8.8、7.2Hz、4H)、6.05(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.18(d,J=5.9Hz、1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.58(t,J=5.0Hz、1H)、4.44(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.22(m,3H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.78(dd,J=9.9、4.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.53(dtd、J=19.4、9.5、5.1Hz、2H)、3.40(dt,J=9.4、6.4Hz、1H)、3.22(d,J=4.5Hz、2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.93(q,J=6.5Hz、2H)、2.02(s,2H)、1.68(s,3H)、1.53-1.36(m,7H)、1.30-1.08(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.38、165.19、165.15、164.85、159.23、158.01、157.98、157.91、151.93、151.19、144.80、141.39、135.49、135.44、133.76、133.49、133.46、129.68、129.63、129.18、129.17、129.15、129.02、129.00、128.99、128.96、128.68、128.58、127.73、127.65、126.61、125.76、118.03、100.88、85.97、85.47、83.59、80.01、71.84、69.96、69.79、69.11、68.74、67.90、63.54、62.51、62.02、54.97、54.95、54.88、51.97、49.72、45.62、35.00、34.52、29.07、29.00、28.57、26.14、25.03、22.68、21.83、7.15.C74H82N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1339.4(M)、1361.4(M+23)Na+、1338.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.42(s,1H)、8.30(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.2Hz、4H)、7.75-7.65(m,4H)、7.65-7.53(m,4H)、7.47(t,J=7.6Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.3Hz、4H)、7.21(td、J=12.2、10.6、5.5Hz、7H)、6.82(t,J=8.3Hz、4H)、6.04(d,J=6.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.1Hz、1H)、5.45-5.41(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.08-5.02(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.39(m,3H)、4.38-4.19(m,5H)、3.78(d,J=9.4Hz、2H)、3.70(s,6H)、3.50(d,J=9.3Hz、2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.59(q,J=6.8、6.3Hz、2H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.34-1.16(m,6H)、1.08-0.97(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.35、171.73、171.48、169.39、165.20、165.14、164.85、159.33、158.06、158.03、157.96、151.94、151.22、144.68、141.81、135.31、133.75、133.48、133.45、129.69、129.61、129.17、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.75、127.61、126.66、125.86、113.11、100.88、85.82、85.69、81.39、77.45、71.89、71.01、70.19、69.96、68.70、67.89、63.28、62.04、54.98、54.96、52.01、49.71、34.95、34.54、29.00、28.92、28.85、28.81、28.53、26.05、24.95、22.67、21.80、7.18.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009、実測値m/z 1439.4(M)、1463.4(M+23)Na+、1437.4(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.23。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=1.9Hz、1H)、8.41(s,1H)、8.32(d,J=9.1Hz、1H)、8.01(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.4Hz、4H)、7.75-7.52(m,8H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.36(dt,J=12.4、7.4Hz、4H)、7.21(t,J=8.6Hz、7H)、6.81(q,J=7.7、7.1Hz、4H)、6.06(dd,J=8.8、5.3Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.84(q,J=4.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.63(dd,J=10.1、5.1Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.38-4.15(m,3H)、3.80(dd,J=17.4、8.2Hz、3H)、3.70(d,J=2.9Hz、7H)、3.67-3.19(m,14H)、3.17(s,3H)、3.11(s,3H)、2.77(t,J=6.0Hz、1H)、2.60(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.90(s,1H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.43-1.34(m,2H)、1.23(dt,J=14.6、6.6Hz、3H)、1.01(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ172.00、171.70、169.39、165.20、165.16、164.87、159.29、158.05、158.03、157.93、151.89、151.83、151.13、151.05、144.73、144.69、141.97、141.72、135.42、135.34、133.75、133.49、133.45、129.70、129.66、129.62、129.20、129.16、129.02、128.95、128.80、128.68、128.57、127.69、127.62、126.63、125.93、125.85、118.86、118.67、113.05、100.89、86.40、86.13、85.62、85.59、82.88、82.65、78.92、78.75、71.84、71.01、70.54、70.37、70.06、69.98、69.88、68.73、67.91、63.00、62.83、62.03、58.83、58.65、58.22、58.03、54.96、54.86、49.74、46.12、45.65、42.74、42.62、42.58、42.46、40.62、38.30、34.99、34.52、29.06、28.97、28.57、26.18、25.09、25.06、24.37、24.29、24.23、24.16、22.67、21.83、21.05、19.89、19.82、19.78、19.71、19.07、10.57.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.09、153.88.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M)、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.35。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.82(d,J=7.5Hz、4H)、7.34-7.15(m,11H)、6.80(d,J=6.8Hz、4H)、5.89(d,J=4.1Hz、1H)、5.46(d,J=5.8Hz、1H)、4.84(d,J=4.6Hz、1H)、4.14(t,J=4.7Hz、1H)、4.09-4.03(m,1H)、3.69(s,6H)、3.61-3.51(m,3H)、3.15(dd,J=10.1、4.3Hz、1H)、1.58-1.45(m,4H)、1.25(d,J=8.0Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.92、158.01、156.06、152.59、149.25、144.78、139.57、135.47、134.33、131.58、129.63、127.73、127.62、126.61、122.95、119.16、113.08、88.22、85.48、80.83、77.64、71.70、69.58、63.09、54.96、52.00、37.32、29.05、27.88、26.07、25.06、7.15.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.27(s,1H)、8.10(s,1H)、8.03-7.88(m,5H)、7.75-7.44(m,10H)、7.42-7.16(m,13H)、6.82(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.90(d,J=4.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.47(d,J=6.0Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.87(q,J=5.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.50-4.41(m,2H)、4.39-4.22(m,2H)、4.15(t,J=5.0Hz、1H)、4.07(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.51(d,J=9.7Hz、1H)、3.45-3.38(m,1H)、3.27(dd,J=10.4、3.6Hz、1H)、3.17(dd,J=10.4、4.7Hz、1H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.40-1.18(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.41、165.21、165.16、164.87、158.01、156.05、152.58、152.57、149.25、144.76、139.58、139.56、135.48、135.46、133.78、133.52、133.48、129.62、129.19、129.17、129.04、129.00、128.99、128.97、128.70、128.60、127.75、127.62、126.63、119.15、113.09、100.90、88.16、85.49、80.86、77.70、71.85、71.71、69.96、69.66、68.77、67.91、63.11、62.02、54.97、49.73、35.03、29.24、29.17、28.59、26.30、25.25、22.70、21.87.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322実測値m/z 691.2(M+1)+、703.2(M+35)Cl-(4B*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.2(M+23)Na+、1282.2(M-1)-、1318.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.37(d,J=5.5Hz、2H)、8.03-7.87(m,5H)、7.73-7.45(m,10H)、7.40-7.29(m,4H)、7.21(dd,J=15.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.8、4.4Hz、4H)、5.95(d,J=4.5Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.50(d,J=5.9Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.90(q,J=5.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.1、7.2Hz、2H)、4.39-4.23(m,2H)、4.15(t,J=4.9Hz、1H)、4.08(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.70(s,6H)、3.65-3.56(m,1H)、3.54-3.47(m,1H)、3.17(s,4H)、3.11(s,3H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.57-1.43(m,6H)、1.40-1.19(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.77、169.42、165.21、165.17、164.88、159.21、158.02、158.00、157.92、151.90、151.27、144.74、141.47、135.51、135.46、133.78、133.52、133.48、129.63、129.58、129.19、129.17、129.04、129.00、128.97、128.70、128.60、127.75、127.63、126.65、125.76、113.09、100.90、88.23、85.49、80.95、77.75、71.86、71.65、69.98、69.69、68.77、67.92、63.15、62.04、54.97、49.75、45.68、40.64、35.04、34.54、29.23、29.16、28.60、26.30、25.24、22.70、21.88、11.35.C74H282N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1341.3(M+1)+、1361.3(M+23)Na+、1337.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.90(s,1H)、8.42(d,J=9.1Hz、2H)、8.06(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.77-7.45(m,10H)、7.37(t,J=7.7Hz、2H)、7.30-7.10(m,9H)、6.85-6.73(m,4H)、6.19(d,J=3.0Hz、1H)、6.12-6.04(m,1H)、5.75(d,J=2.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.70-4.63(m,1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.40-4.23(m,3H)、4.10-4.03(m,1H)、3.83-3.76(m,2H)、3.69(s,6H)、3.54-3.48(m,2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,4H)、2.98(q,J=6.4、5.5Hz、3H)、2.80(q,J=7.2Hz、4H)、2.57(d,J=3.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41(s,2H)、1.33(s,2H)、1.26-1.14(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ174.17、172.71、172.37、170.34、166.14、166.09、165.80、160.24、158.93、158.91、158.88、152.99、151.83、145.56、142.79、136.40、136.26、134.71、134.45、134.41、130.51、130.46、130.10、129.97、129.95、129.93、129.90、129.64、129.53、128.65、128.52、127.56、126.65、113.99、101.84、87.28、86.31、81.71、76.73、73.86、72.82、71.23、70.90、69.68、68.84、63.47、62.97、55.89、52.92、50.66、46.35、35.93、35.49、30.06、29.74、29.67、29.50、27.18、26.12、23.62、22.78、10.55、8.11.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.38。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=5.5Hz、1H)、8.41-8.30(m,2H)、7.98-7.89(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.29(m,4H)、7.29-7.14(m,8H)、6.84-6.78(m,4H)、6.09(dd,J=28.1、4.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.14(m,1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=7.3、6.8Hz、2H)、4.37-4.22(m,3H)、4.14-4.09(m,1H)、3.81-3.72(m,2H)、3.70(s,6H)、3.56-3.35(m,6H)、3.18(s,3H)、3.12-3.10(m,3H)、3.03-2.96(m,3H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,6H)、1.38-1.19(m,7H)、1.04(q,J=7.0Hz、9H)、0.75(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.71、169.36、165.17、165.13、164.84、159.18、158.01、157.86、151.80、151.13、144.68、144.64、141.62、135.41、135.38、133.73、133.45、133.42、129.57、129.14、129.00、128.92、128.65、128.55、127.72、127.58、126.63、125.82、125.78、118.75、118.56、113.06、100.88、87.48、87.12、85.55、85.47、81.28、80.95、77.36、77.02、73.45、73.34、72.81、72.67、71.83、69.96、69.74、68.73、67.90、62.74、62.57、62.01、58.73、58.59、58.15、58.00、54.94、54.85、49.74、42.75、42.66、42.50、42.40、35.02、34.52、29.24、29.14、28.57、26.31、25.28、24.26、24.20、24.14、23.78、23.73、22.66、21.85、19.77、19.72、19.55、19.49.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ154.92、154.69.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M+1)+、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.25。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.31(s,2H)、7.93(d,J=8.1Hz、1H)、7.88-7.81(m,7H)、5.82(d,J=5.0Hz、1H)、5.73(d,J=5.3Hz、1H)、5.63(dd,J=8.1、1.9Hz、2H)、5.30(d,J=6.1Hz、1H)、5.12(t,J=4.9Hz、2H)、5.03(d,J=5.9Hz、1H)、4.15(q,J=5.4Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90(d,J=3.9Hz、1H)、3.85(t,J=4.8Hz、2H)、3.75(t,J=4.6Hz、1H)、3.68-3.49(m,9H)、3.43(dd,J=17.9、9.5Hz、2H)、1.65-1.43(m,7H)、1.39-1.21(m,7H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ170.71、170.69、165.87、165.82、153.48、153.27、143.32、143.14、137.12、134.36、125.75、104.53、104.44、90.81、88.93、87.82、85.53、83.85、80.17、75.40、72.43、72.33、71.09、63.50、63.22、57.68、48.54、40.13、40.09、31.95、31.72、30.68、28.89、28.81、27.90、27.71.C23H27N3O8についてのLRMS計算値473.1798、実測値m/z 474.1(M+1)+、472.0(M-1)-、508.0(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,4H)、7.71(d,J=8.1Hz、1H)、7.40-7.28(m,4H)、7.24(dd,J=8.8、2.1Hz、5H)、6.89(d,J=8.6Hz、4H)、5.77(d,J=3.6Hz、1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、5.09(d,J=6.7Hz、1H)、4.15(q,J=6.1Hz、1H)、3.97-3.92(m,1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.73(s,6H)、3.61-3.49(m,4H)、3.30-3.17(m,2H)、1.60-1.46(m,4H)、1.34-1.22(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.87、162.92、158.10、158.09、150.22、144.60、140.15、135.31、135.04、134.28、131.55、129.73、127.85、127.66、126.75、122.92、113.22、113.20、101.43、101.40、87.11、87.09、85.84、82.56、80.79、69.71、68.43、62.58、55.02、55.00、28.88、27.86、26.01、24.92.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.1(M+35)Cl-(3A).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v(3A)中の0.28
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H)、7.88-7.71(m,5H)、7.38-7.18(m,9H)、6.87(dd,J=8.8、1.5Hz、4H)、5.68(d,J=3.5Hz、1H)、5.40(d,J=5.7Hz、1H)、5.29(d,J=8.1Hz、1H)、4.22(q,J=5.1Hz、1H)、3.97(d,J=6.5Hz、1H)、3.92-3.86(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54(q,J=8.2、7.2Hz、3H)、3.34(t,J=6.7Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、1.58-1.40(m,4H)、1.28-1.19(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、163.02、158.11、150.41、144.59、140.45、135.26、135.09、134.33、131.57、129.72、127.87、127.65、126.78、122.95、113.21、101.34、89.41、85.92、80.35、76.70、72.01、69.56、63.47、62.35、55.01、37.32、30.15、29.03、27.87、26.07、25.07、18.59.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.0(M+35)Cl-(3B).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.16(3B)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,5H)、7.39-7.27(m,4H)、7.27-7.18(m,5H)、6.93-6.83(m,4H)、5.74(s,1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、4.28-4.21(m,1H)、3.89(t,J=6.2Hz、2H)、3.72(d,J=0.9Hz、6H)、3.62-3.49(m,3H)、3.46-3.35(m,2H)、3.17(dd,J=10.9、3.8Hz、1H)、1.60-1.42(m,4H)、1.26(dd,J=15.9、8.0Hz、4H)、0.71(s,9H)、-0.06(d,J=28.2Hz、6H).13C NMR(125MHz、dmso)δ173.26、168.44、163.58、155.55、149.75、145.74、140.49、140.30、139.68、136.94、135.19、135.15、133.22、133.12、132.24、128.32、118.58、118.56、91.39、87.57、85.97、75.01、74.88、60.43、60.42、42.70、34.50、33.29、31.46、30.82、30.54、22.96、0.58、0.00.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、925.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.72。
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 963.0(M+23)Na+、940.2(M-1)-、975.1(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.50。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.91(d,J=7.4Hz、1H)、7.87-7.74(m,4H)、7.40-7.15(m,11H)、6.92-6.83(m,4H)、5.80(d,J=1.6Hz、1H)、5.50(d,J=7.4Hz、1H)、4.24(dd,J=7.6、5.1Hz、1H)、3.91(d,J=7.4Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、3.45-3.40(m,2H)、3.12(dd,J=10.9、3.4Hz、1H)、1.62-1.41(m,4H)、1.36-1.20(m,5H)、0.69(s,9H)、-0.05(s,3H)、-0.13(s,3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.90、165.53、158.21、154.70、144.37、140.64、135.15、135.06、134.32、131.57、129.78、129.74、127.84、127.78、126.88、122.96、113.21、113.18、85.93、81.59、81.38、69.55、55.07、55.06、37.37、29.23、27.95、26.16、25.43、25.27、17.59、-4.80、-5.38.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 889.0(M+1)+、911.0(M+23)Na+、888.1(M-1)-、923.1(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.34。
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.11。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.16(m,22H)、6.95-6.81(m,4H)、5.82(s,1H)、5.74(d,J=2.6Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=8.6、7.5Hz、2H)、4.39-4.21(m,3H)、3.92(d,J=7.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.8Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.46(dd,J=30.5、9.4Hz、3H)、3.17-2.93(m,4H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.40-1.20(m,6H)、0.71(s,9H)、-0.07(d,J=37.7Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.53、169.19、165.27、165.02、164.97、164.68、158.01、154.45、144.18、140.48、134.95、134.86、133.58、133.31、133.28、129.58、129.55、129.03、129.00、128.98、128.85、128.83、128.78、128.51、128.40、127.65、127.59、126.68、113.02、112.99、100.71、93.65、93.62、88.11、88.09、85.74、81.43、81.23、71.68、69.80、69.46、69.12、68.55、67.75、61.86、61.35、54.87、54.86、49.57、45.40、34.83、29.16、28.99、28.39、26.13、25.27、25.22、22.52、22.51、21.67、17.43、8.36、-4.95、-5.55.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1372.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,5H)、7.78(d,J=7.5Hz、1H)、7.74-7.54(m,8H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.43-7.36(m,4H)、7.32(t,J=7.6Hz、2H)、7.26(dd,J=8.9、2.3Hz、5H)、7.17(d,J=20.1Hz、2H)、6.90(d,J=8.7Hz、4H)、5.81(d,J=2.4Hz、1H)、5.75(d,J=4.1Hz、1H)、5.49(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.00(d,J=7.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.22(m,2H)、4.16(q,J=7.1Hz、1H)、3.99-3.91(m,1H)、3.74(s,8H)、3.68-3.47(m,3H)、3.26(d,J=2.8Hz、2H)、3.01(q,J=6.6Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.32(dt,J=42.4、8.9Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.41、165.19、165.15、164.85、158.09、154.72、144.62、140.55、135.39、135.16、133.76、133.48、129.70、129.18、129.15、129.02、129.00、128.98、128.96、128.69、128.58、127.86、127.68、126.77、113.20、100.87、93.72、87.86、85.78、81.73、81.63、71.85、69.96、69.73、68.73、68.25、67.90、62.25、62.02、55.01、54.88、49.73、45.59、35.01、29.13、28.56、26.25、25.17、22.68、21.84、8.54.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1258.2(M-1)-、1294.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.60(s,1H)、8.06-7.88(m,6H)、7.75-7.45(m,10H)、7.42-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.8Hz、4H)、5.84(d,J=2.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.61(d,J=7.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.06(d,J=6.9Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.9、7.6Hz、2H)、4.40-4.13(m,3H)、4.03-3.96(m,1H)、3.74(s,8H)、3.69-3.56(m,2H)、3.51(d,J=9.8Hz、1H)、3.29-3.24(m,1H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=9.8Hz、5H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.50(d,J=5.5Hz、6H)、1.39-1.22(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.76、171.07、169.40、165.22、165.17、164.87、158.13、157.87、154.87、144.65、141.75、135.43、135.10、133.77、133.50、133.48、129.80、129.76、129.21、129.17、129.04、129.02、128.97、128.70、128.59、127.89、127.71、126.79、113.26、113.24、101.40、100.90、88.33、85.85、81.97、81.72、71.88、70.00、69.82、68.75、68.31、67.94、62.24、62.05、55.05、52.03、49.76、45.47、35.03、34.78、29.14、29.11、28.59、26.25、25.18、22.70、21.86、8.54、7.18.C73H82N5O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1315.2(M+1)+、1337.1(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.63(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(q,J=6.3、5.7Hz、5H)、7.75-7.47(m,10H)、7.41-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.9Hz、4H)、5.90(d,J=4.2Hz、1H)、5.74(s,1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.17(t,J=5.6Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.5、7.9Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.16(q,J=5.2Hz、2H)、3.80(d,J=9.7Hz、1H)、3.74(s,6H)、3.52(dd,J=9.6、6.1Hz、2H)、3.42-3.28(m,4H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=16.5Hz、5H)、2.61-2.52(m,2H)、2.06(s,2H)、1.71(s,3H)、1.57-1.15(m,14H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.27、171.74、171.56、171.23、169.39、165.20、165.16、164.87、158.14、158.05、154.88、144.54、141.83、135.19、135.00、133.77、133.49、129.70、129.20、129.17、129.03、129.01、128.97、128.70、128.59、127.93、127.60、126.81、113.29、101.96、100.91、88.17、86.07、80.16、79.25、71.88、70.28、70.13、69.98、68.73、67.92、62.25、62.04、55.03、54.90、51.99、49.74、45.46、34.99、34.82、29.12、28.95、28.84、28.71、28.57、26.19、25.13、22.69、21.84、10.00、7.17.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1416.2(M+1)+、1437.1(M+23)Na+、1413.3(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.48。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07-7.87(m,6H)、7.76-7.19(m,21H)、6.97-6.82(m,4H)、5.88(dd,J=8.4、2.6Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.59(dd,J=10.9、7.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.23(m,5H)、4.17-4.07(m,1H)、3.98-3.92(m,1H)、3.83-3.77(m,1H)、3.73(d,J=2.5Hz、6H)、3.71-3.45(m,7H)、3.35(d,J=22.0Hz、6H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=5.1Hz、5H)、2.74(t,J=5.9Hz、1H)、2.64-2.57(m,1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.42-1.19(m,7H)、1.17-1.03(m,10H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.69、171.08、169.35、165.17、165.13、164.84、158.14、157.85、154.83、154.81、144.53、144.45、141.75、141.54、135.15、134.91、134.87、133.71、133.44、133.41、129.81、129.75、129.17、129.13、129.00、128.91、128.64、128.53、127.81、127.70、126.80、118.75、118.61、113.16、101.60、101.51、100.87、88.81、88.32、85.99、81.35、80.96、80.49、71.83、69.97、69.80、69.48、69.38、68.71、67.90、62.01、61.87、61.28、58.40、58.25、58.17、58.01、54.99、49.73、45.61、42.61、42.56、42.51、42.45、34.99、34.73、29.20、29.14、29.10、28.56、26.28、25.27、25.23、24.30、24.24、24.17、22.66、21.83、19.80、19.75.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ153.88、153.40.C82H99N8O18PについてのLRMS計算値1514.6815、実測値m/z 1537.2(M+23)Na+、1551.2(M+35)Cl.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、7.87-7.77(m,5H)、7.37-7.19(m,9H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.66(d,J=3.7Hz、1H)、5.28(d,J=8.1Hz、1H)、4.36(t,J=4.1Hz、1H)、3.99(t,J=2.9Hz、1H)、3.88-3.82(m,1H)、3.71(s,6H)、3.57-3.42(m,3H)、3.34(d,J=10.7Hz、2H)、3.25(dd,J=11.0、3.5Hz、1H)、1.57-1.37(m,4H)、1.29-1.19(m,4H)、0.81(s,9H)、0.03(d,J=4.4Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.85、162.93、158.14、150.33、144.47、139.87、135.04、134.89、134.30、131.53、129.73、127.85、127.61、126.81、122.91、113.20、101.32、88.72、86.03、80.60、76.69、73.71、69.85、62.08、59.70、54.99、37.28、29.07、27.83、26.04、25.41、25.09、17.63、-5.07、-5.26.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.0(M+23)Na+、888.2(M-1)-、924.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.71。
5B*)
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 964.3(M+23)Na+、941.3(M-1)-、976.3(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.51
5B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.89-7.75(m,5H)、7.38-7.21(m,9H)、7.09(s,2H)、6.88(d,J=7.9Hz、4H)、5.71(d,J=14.2Hz、1H)、5.50(d,J=7.2Hz、1H)、4.24(s,1H)、3.99(d,J=6.1Hz、1H)、3.88-3.83(m,1H)、3.72(s,6H)、3.52(t,J=6.8Hz、2H)、3.41(dd,J=26.0、9.6Hz、2H)、3.21(d,J=11.1Hz、2H)、1.46(d,J=55.9Hz、4H)、1.20(s,4H)、0.82(s,9H)、0.05(d,J=18.7Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.87、165.54、158.14、154.95、144.49、140.38、135.13、135.06、134.33、131.56、129.71、127.86、127.65、126.82、122.94、113.19、93.63、89.79、85.93、79.86、76.34、74.03、69.80、61.80、55.01、54.90、37.30、29.10、27.84、26.07、25.53、25.10、17.71、-4.77、-5.39.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 911.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、923.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
6B*)
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、781.2(M+23)Na+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
次に、中間体6B*を、6A*と同じようにGalNAc(OBz)-C5-NHSエステルに結合したところ、4.64gの6B(3.38mmol、87%)が得られた。
6B)
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.99-7.86(m,6H)、7.73-7.53(m,9H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.6Hz、2H)、7.24(dd,J=8.8、2.8Hz、6H)、6.89(d,J=8.3Hz、4H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.70(d,J=2.5Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.24(m,3H)、4.01(d,J=6.6Hz、1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.79(d,J=10.0Hz、1H)、3.73(s,6H)、3.55-3.42(m,2H)、3.38(d,J=9.5Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、2.98(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.51(s,4H)、1.44-1.28(m,4H)、1.23-1.14(m,4H)、0.83(s,9H)、0.10-0.02(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ172.22、169.88、166.00、165.71、165.67、165.38、158.68、155.43、145.00、140.94、135.71、135.60、134.27、134.01、133.97、130.23、129.73、129.68、129.55、129.47、129.20、129.09、128.39、128.19、127.36、113.73、101.42、94.19、90.20、86.48、80.46、76.98、74.58、72.37、70.51、70.44、69.26、68.45、67.51、62.56、62.43、55.55、55.54、50.28、38.87、35.54、29.83、29.66、29.11、26.84、26.05、25.82、25.63、23.21、22.39、18.24、-4.26、-4.83.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1373.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.48。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.00(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.4Hz、4H)、7.82(d,J=7.4Hz、1H)、7.70(t,J=6.3Hz、4H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.56(q,J=8.2Hz、3H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.7Hz、2H)、7.24(d,J=7.4Hz、6H)、7.10(s,1H)、6.88(d,J=8.0Hz、4H)、5.76-5.73(m,2H)、5.52(d,J=7.4Hz、1H)、5.39-5.31(m,2H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=9.3、7.9Hz、2H)、4.38-4.31(m,1H)、4.32-4.22(m,1H)、4.12(q,J=5.0Hz、1H)、4.01-3.97(m,1H)、3.93-3.89(m,1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.73(s,6H)、3.56-3.48(m,2H)、3.30(d,J=9.4Hz、2H)、3.19(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.6Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.54-1.39(m,6H)、1.37-1.29(m,2H)、1.21(d,J=7.1Hz、4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.34、165.53、165.17、165.12、164.83、158.08、155.00、144.52、140.72、135.34、135.18、133.72、133.46、133.43、129.64、129.61、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.54、127.82、127.64、126.74、113.17、100.87、93.63、90.33、85.81、79.75、76.44、72.33、71.83、69.95、69.49、68.71、67.89、62.07、62.01、54.98、49.71、38.33、34.98、29.20、29.11、28.55、26.26、25.19、22.66、21.82.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1259.2(M-1)-、1294.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.24。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.62(s,1H)、8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.21(m,11H)、6.93-6.85(m,4H)、5.75(d,J=4.6Hz、3H)、5.62(d,J=7.2Hz、1H)、5.43(d,J=5.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.37-4.24(m,2H)、4.20-4.15(m,1H)、4.07-4.02(m,1H)、3.97-3.93(m,1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.73(s,6H)、3.58-3.48(m,2H)、3.31(s,2H)、3.26(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、3.15(s,3H)、3.05-2.95(m,5H)、2.09-2.00(m,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.40(m,6H)、1.38-1.29(m,2H)、1.22(s,4H).13C NMR(126MHz、DMSO-d6)δ171.68、171.04、169.35、165.17、165.12、164.83、158.09、157.81、154.99、144.53、141.90、135.33、135.06、133.72、133.46、133.43、129.71、129.66、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.55、127.83、127.63、126.76、113.19、101.28、100.87、90.81、85.86、79.97、76.32、72.35、71.82、69.95、69.49、68.72、67.90、62.00、54.99、54.85、49.72、45.67、35.00、34.72、29.20、29.11、28.57、26.25、25.20、22.66、21.83.C73H82N6O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1316.4(M+1)+、1337.2(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07(d,J=9.2Hz、1H)、7.99-7.84(m,5H)、7.79-7.44(m,10H)、7.41-7.20(m,11H)、6.88(d,J=8.5Hz、4H)、5.86(d,J=2.0Hz、1H)、5.75(d,J=3.4Hz、1H)、5.70(d,J=7.2Hz、1H)、5.43-5.33(m,2H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.37-4.21(m,3H)、4.02-3.96(m,1H)、3.72(s,7H)、3.59-3.45(m,2H)、3.43-3.20(m,6H)、3.15(s,3H)、3.04-2.93(m,5H)、2.46-2.38(m,2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、171.72、171.32、171.10、169.35、165.17、165.13、164.83、158.10、157.92、154.67、144.47、142.44、135.23、135.05、133.72、133.43、129.69、129.18、129.13、129.00、128.92、128.65、128.54、127.83、127.65、126.76、113.18、101.67、100.89、88.99、85.87、80.36、75.39、73.66、71.87、70.48、69.95、68.69、67.90、62.53、62.02、61.80、54.98、54.86、51.98、51.26、49.72、40.84、38.32、34.95、34.77、29.10、29.06、28.97、28.88、28.67、28.53、26.21、25.16、22.65、21.80、10.64、7.14.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1438.9(M+23)Na+、1413.2(M-1)-。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.05(d,J=9.9Hz、1H、D2O交換可能)、11.65(d,J=8.8Hz、1H、D2O交換可能)、8.26(d,J=9.5Hz、1H)、7.82(p,J=4.3Hz、4H)、5.87(d,J=6.5Hz、1H)、5.78(d,J=6.0Hz、0H、D2O交換可能)、5.39(d,J=6.2Hz、0H、D2O交換可能)、5.12(d,J=4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.04(t,J=5.4Hz、1H、D2O交換可能)、4.56-4.51(m,0H)、4.33-4.27(m,1H)、4.24(q,J=4.5Hz、1H)、3.94-3.87(m,1H)、3.64-3.42(m,6H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.23-1.12(m,4H)、1.09(dd,J=6.6、4.9Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.03、167.91、167.89、167.81、154.72、148.83、148.19、137.43、137.41、134.30、131.55、131.52、122.92、122.86、119.99、86.24、84.46、84.44、81.41、69.59、68.89、68.88、61.25、37.16、34.70、28.87、27.84、27.78、25.90、24.79、18.82、18.79、18.75.C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 583.2(M+1)+、581.1(M-1)-、617.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.06(s,1H)、11.59(s,1H)、8.12(s,1H)、7.81(p,J=4.4Hz、4H)、7.33(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.16(m,7H)、6.82(dd,J=8.7、7.1Hz、4H)、5.92(d,J=5.5Hz、1H)、5.14(d,J=5.6Hz、1H)、4.39(t,J=5.2Hz、1H)、4.27(q,J=4.8Hz、1H)、4.03(q,J=3.9Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.57(dd,J=11.2、4.7Hz、1H)、3.51-3.38(m,3H)、3.27(dd,J=10.4、6.1Hz、1H)、3.15(dd,J=10.3、3.0Hz、1H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.47(dt,J=21.2、6.6Hz、4H)、1.28-1.15(m,4H)、1.10(dd,J=6.6、5.1Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.04、167.83、158.02、158.00、154.74、148.76、148.16、144.74、137.44、135.44、135.35、134.30、131.52、129.68、129.65、127.72、127.65、126.62、122.92、120.29、113.06、85.52、85.02、84.06、80.59、69.78、69.12、63.93、63.45、37.19、34.72、28.89、27.79、25.94、24.83、18.80、18.78.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.2(M+1)+、907.0(M+23)Na+、883.2(M-1)-、919.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.52
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.08(s,1H、D2O交換可能)、11.67(s,1H、D2O交換可能)、8.14(s,1H)、7.86-7.76(m,4H)、7.37-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.0Hz、4H)、5.81(d,J=4.7Hz、1H)、5.51(d,J=5.7Hz、1H、D2O交換可能)、4.67(d,J=4.7Hz、1H)、4.05-3.91(m,2H)、3.70(s,6H)、3.55(dt,J=14.2、8.2Hz、3H)、3.39(d,J=9.4Hz、1H)、3.26-3.14(m,2H)、2.76(p,J=6.8Hz、1H)、1.50(dt,J=35.7、6.6Hz、4H)、1.32-1.19(m,4H)、1.11(d,J=6.8Hz、6H).13C NMR(126MHz、D2O)δ180.10、167.90、158.02、154.81、148.81、148.16、144.70、137.29、135.39、135.36、134.33、131.55、129.64、129.61、127.74、127.61、126.64、122.94、120.28、113.07、87.17、85.57、81.14、77.71、72.22、69.63、63.31、59.72、54.94、37.30、34.73、29.08、27.86、26.05、25.03、18.87、18.78、14.05.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.1(M+1)+、883.0(M-1)-、919.0(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.32。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、683.1(M-1)-、719.1(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.73(s,1H)、9.90(s,1H)、8.02(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.0Hz、4H)、7.79(s,1H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.4Hz、4H)、7.30-7.16(m,7H)、6.84(dd,J=8.9、2.7Hz、4H)、6.53(s,2H)、5.81(d,J=5.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.13(d,J=5.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.39-4.19(m,4H)、3.99(q,J=4.2Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.61-3.46(m,2H)、3.46-3.37(m,1H)、3.24-3.12(m,2H)、2.97(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.37(m,6H)、1.36-1.25(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.84、158.02、156.66、153.81、151.30、144.77、135.47、135.37、134.89、133.75、133.47、129.67、129.18、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.77、127.65、126.64、116.64、113.12、100.88、85.53、84.44、83.53、80.61、71.86、69.96、69.78、69.08、68.73、67.90、63.84、62.02、54.98、49.72、45.42、38.30、34.99、29.12、29.06、28.56、26.17、25.06、22.68、21.82、8.47.C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1301.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1336.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、9.94(s,1H)、8.48(s,1H)、8.03(d,J=9.3Hz、1H)、7.97-7.87(m,5H)、7.75-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=14.6、7.4Hz、4H)、7.29-7.16(m,7H)、6.83(dd,J=8.7、4.6Hz、4H)、5.93(d,J=4.9Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.21(d,J=5.7Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.23(m,4H)、4.02(q,J=4.7Hz、1H)、3.78(d,J=9.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.52(ddt、J=40.7、16.1、7.9Hz、4H)、3.25(dd,J=10.3、5.9Hz、1H)、3.15(d,J=7.7Hz、1H)、3.07(s,3H)、3.01-2.92(m,5H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.38(m,6H)、1.35-1.24(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.20、165.15、164.85、158.03、158.01、157.79、157.58、157.28、149.86、144.76、136.33、135.47、135.38、133.75、133.48、133.45、129.66、129.62、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.67、128.56、127.76、127.63、126.64、119.78、113.11、100.88、85.50、85.06、83.46、80.78、71.87、69.97、69.83、69.04、68.72、67.91、63.80、62.03、54.98、49.73、45.45、45.43、34.99、34.63、29.10、29.06、28.55、26.16、25.07、22.67、21.82、8.48.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1356.1(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1353.3(M-1)-、1389.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.43(s,1H)、8.62(s,1H)、8.08-7.98(m,2H)、7.92(t,J=8.0Hz、4H)、7.71(dd,J=12.7、7.3Hz、4H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=7.7、7.1Hz、3H)、7.50(d,J=7.7Hz、2H)、7.39(t,J=7.8Hz、2H)、7.30-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.9Hz、4H)、5.94(d,J=4.4Hz、1H)、5.76(s,1H)、5.63(t,J=5.5Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.90(t,J=4.9Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.39-4.24(m,2H)、4.15(q,J=4.9Hz、1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.72(s,6H)、3.53-3.43(m,2H)、3.37(q,J=7.2Hz、3H)、3.27(dd,J=10.5、5.2Hz、1H)、3.22-3.15(m,1H)、3.03(s,3H)、3.01-2.94(m,5H)、2.79(q,J=7.0Hz、2H)、2.59(q,J=6.4、5.9Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.46(m,4H)、1.38(s,2H)、1.33-1.26(m,2H)、1.15(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.21、171.83、171.69、169.34、165.16、165.11、164.81、158.00、157.99、157.96、157.55、157.24、149.59、144.58、137.75、135.32、135.29、133.71、133.43、129.52、129.41、129.16、129.13、129.11、128.98、128.91、128.64、128.53、127.71、127.49、126.58、120.16、113.06、100.86、86.36、85.38、80.12、78.06、71.84、70.27、69.94、68.68、67.89、62.00、54.94、54.93、54.84、51.98、49.70、45.44、34.94、34.60、29.05、28.97、28.68、28.63、28.52、26.09、25.03、22.64、21.78、9.74、7.13.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.2(M+1)+、1478.1(M+23)Na+、1453.2(M-1)-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.40(s,1H)、8.42(s,1H)、8.05-7.85(m,6H)、7.74-7.44(m,10H)、7.43-7.15(m,11H)、6.81(q,J=8.8Hz、4H)、5.95(t,J=3.7Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57-4.40(m,4H)、4.30(dq、J=29.0、9.1Hz、2H)、4.21-4.06(m,1H)、3.82-3.68(m,8H)、3.64-3.43(m,7H)、3.30-3.19(m,4H)、3.04(d,J=2.6Hz、3H)、3.00(s,3H)、2.97-2.86(m,5H)、2.74(t,J=5.6Hz、1H)、2.54(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.36(m,6H)、1.34-1.04(m,19H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.85、169.52、165.35、165.30、165.01、158.23、158.19、157.72、157.41、157.39、149.96、149.93、144.86、144.83、136.91、136.66、135.50、135.49、135.44、135.40、133.91、133.64、133.61、129.84、129.80、129.77、129.71、129.34、129.32、129.30、129.17、129.15、129.11、128.84、128.73、127.91、127.89、127.79、127.71、126.83、126.80、120.20、119.00、118.79、113.25、101.04、85.79、85.75、85.26、82.88、82.63、80.07、79.65、72.01、70.12、68.88、68.07、63.50、63.37、62.18、58.78、58.65、58.21、58.06、55.15、55.14、55.12、49.88、45.74、35.15、34.77、29.30、29.27、29.24、28.72、26.39、25.30、25.28、24.47、24.44、24.42、24.38、24.34、24.28、22.83、21.98、21.21、19.96、19.91、19.88、19.83、18.96、9.56.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.02、153.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1578.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1590.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、707.2(M+23)Na+、683.3(M-1)-、719.3(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1300.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1334.2(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.29。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ10.91(s,1H)、10.65(s,1H)、8.13(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(t,J=6.5Hz、4H)、7.82(d,J=7.5Hz、2H)、7.76-7.67(m,3H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.0Hz、3H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.31(m,4H)、7.27(t,J=7.6Hz、2H)、7.21(d,J=8.5Hz、5H)、6.89-6.81(m,4H)、6.75(s,2H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.71(d,J=4.7Hz、1H)、5.50(d,J=6.0Hz、1H)、5.36(s,6H)、4.78(d,J=8.5Hz、1H)、4.60(q,J=4.9Hz、1H)、4.45(q,J=10.0、8.2Hz、2H)、4.38-4.24(m,2H)、4.03-3.95(m,2H)、3.79(d,J=9.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.18(ddd,J=44.2、10.5、3.7Hz、2H)、3.01-2.95(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.41(m,6H)、1.35(q,J=6.6、6.1Hz、2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.35、165.18、165.12、164.83、158.00、156.60、153.94、151.24、144.70、135.43、134.92、133.74、133.45、129.61、129.17、129.15、129.13、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.75、127.63、126.63、116.62、113.10、100.88、86.80、85.54、80.71、77.77、72.13、71.91、69.96、69.62、68.69、67.88、63.34、62.61、62.04、54.97、54.90、49.69、34.95、29.24、29.12、28.52、26.27、25.21、22.67、21.81、8.43。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、10.46(s,1H)、8.51(s,1H)、8.08(d,J=9.3Hz、1H)、7.99-7.87(m,5H)、7.77(t,J=5.5Hz、1H)、7.73-7.52(m,7H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(t,J=7.8Hz、2H)、7.31(d,J=7.3Hz、2H)、7.21(dd,J=19.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.52(d,J=5.8Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.81-4.67(m,2H)、4.44(q,J=8.7、7.5Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.10(t,J=5.3Hz、1H)、3.99(q,J=4.8Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.50(d,J=9.7Hz、1H)、3.24-3.12(m,2H)、3.03(d,J=7.3Hz、10H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.29(m,8H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.36、165.19、165.13、164.84、158.00、157.99、157.80、157.57、157.22、149.83、144.70、136.79、135.46、135.43、133.74、133.47、133.45、129.58、129.55、129.17、129.15、129.14、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.73、127.60、126.63、119.77、113.08、100.89、87.65、85.46、80.73、77.67、72.05、71.90、69.96、69.75、68.71、67.90、63.22、62.04、54.99、54.97、49.71、34.98、34.63、29.22、29.13、28.54、26.26、25.20、22.67、21.83、8.38.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1355.3(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1389.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.47(s,1H)、8.51(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.99(s,1H)、7.92(t,J=7.1Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.74-7.67(m,3H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.2Hz、3H)、7.49(t,J=7.8Hz、2H)、7.38(t,J=7.8Hz、2H)、7.29(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.14(m,7H)、6.81(d,J=7.9Hz、4H)、6.03(d,J=2.7Hz、1H)、6.00-5.97(m,1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.55-4.49(m,1H)、4.45(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.04-3.99(m,1H)、3.83-3.76(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54-3.41(m,2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.14(dd,J=10.7、4.1Hz、1H)、3.05(s,3H)、3.04-2.97(m,6H)、2.62-2.56(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.45(m,4H)、1.34(dd,J=19.5、13.0Hz、4H)、1.17(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、172.01、171.73、171.46、169.36、168.68、165.18、165.13、164.84、158.00、157.90、157.54、157.36、149.37、144.55、137.17、135.38、135.31、133.74、133.48、133.45、129.54、129.51、129.18、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.68、128.56、127.73、127.57、126.63、119.94、113.06、100.90、86.10、85.41、80.53、75.77、72.98、71.88、70.43、69.96、68.70、67.90、62.55、62.02、54.96、51.99、49.71、45.43、34.97、34.62、33.24、29.14、29.10、28.94、28.84、28.54、26.20、25.18、22.66、22.59、21.82、21.13、14.72、10.03、7.16.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.3(M+1)+、1453.2(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.43。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.41(s,1H)、8.47(d,J=11.9Hz、1H)、8.06-7.86(m,6H)、7.77-7.43(m,10H)、7.42-7.12(m,11H)、6.81(dd,J=5.9、2.7Hz、4H)、5.98(dd,J=21.6、3.6Hz、1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.07-4.92(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.53-4.20(m,5H)、4.07-3.98(m,1H)、3.86-3.45(m,14H)、3.41-3.13(m,8H)、3.02(dd,J=10.2、3.3Hz、8H)、2.74(dd,J=12.3、6.3Hz、1H)、2.57(t,J=5.9Hz、1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.48(d,J=27.8Hz、6H)、1.39-1.30(m,2H)、1.26-1.04(m,15H)、0.89(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.89、169.54、165.36、165.31、165.03、158.21、158.19、157.82、157.75、157.71、157.40、149.88、149.85、144.82、137.15、137.02、135.57、135.52、135.50、133.92、133.65、133.61、129.74、129.35、129.33、129.32、129.19、129.17、129.16、129.11、128.84、128.73、127.92、127.76、126.83、120.14、120.01、118.98、118.80、113.25、101.07、85.74、85.64、72.02、70.13、68.92、68.08、62.19、55.13、55.11、49.90、46.32、45.78、42.96、42.86、35.19、34.78、29.47、29.41、29.33、29.31、28.75、26.48、25.44、24.48、24.43、24.39、24.37、24.34、24.05、23.99、22.84、22.04.31P NMR(162MHz、DMSO)δ151.33、150.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1577.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1591.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.95(s,1H)、7.89-7.77(m,4H)、6.78(s,2H、D2O交換可能)、5.81(d,J=6.7Hz、1H)、5.74(s,2H、D2O交換可能)、5.51-5.43(m,1H、D2O交換可能)、5.08(d,J=4.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.37(dd,J=6.6、5.0Hz、1H)、4.27-4.21(m,1H)、3.92(q,J=3.3Hz、1H)、3.67-3.59(m,1H)、3.52(q,J=7.9、7.0Hz、4H)、3.34-3.30(m,1H)、1.45(dt,J=38.0、6.6Hz、4H)、1.24-1.12(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、160.03、156.21、151.36、136.06、134.31、131.55、122.95、113.48、86.18、85.11、80.52、69.50、69.12、61.68、54.88、28.94、27.84、26.00、24.86.C24H29N7O6についてのLRMS計算値511.5304、実測値m/z 512.2(M+1)+、534.2(M+23)Na+、546.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.50。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.83(dtd、J=8.7、6.2、3.4Hz、4H)、7.73(s,1H)、6.76(s,2H)、5.73(d,J=10.5Hz、3H)、4.52(dd,J=8.6、4.9Hz、1H)、4.18(d,J=4.8Hz、1H)、4.03(dd,J=12.9、2.1Hz、1H)、3.96-3.85(m,2H)、3.78-3.70(m,1H)、3.66-3.58(m,1H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、1.53(dp、J=20.7、6.8Hz、4H)、1.30(ddt、J=44.2、14.5、7.2Hz、4H)、1.07-0.95(m,28H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.89、160.32、156.12、150.97、134.39、134.33、131.55、122.95、113.27、86.56、80.81、80.63、70.46、69.75、60.23、29.19、27.95、26.09、25.25、17.30、17.18、17.13、17.08、16.96、16.85、16.81、16.74、12.75、12.37、12.23、12.07.C36H55N7O7Si2についてのLRMS計算値754.0356、実測値m/z 754.3(M+1)+、776.3(M+23)Na+、753.3(M-1)-、788.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.31。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ9.73(s,1H)、8.02(s,1H)、7.83(d,J=3.7Hz、4H)、7.19(s,2H)、5.83(s,1H)、4.65(dd,J=8.3、5.2Hz、1H)、4.32(d,J=4.5Hz、1H)、4.15-4.07(m,1H)、3.97-3.85(m,2H)、3.81-3.72(m,1H)、3.68-3.59(m,1H)、3.53(t,J=6.9Hz、2H)、2.91-2.80(m,1H)、1.62-1.45(m,4H)、1.41-1.21(m,4H)、1.20-1.07(m,3H)、1.06-0.83(m,31H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6)δ174.75、167.82、156.01、152.89、149.44、137.57、134.27、131.52、122.89、116.27、87.34、81.19、80.98、70.49、70.30、60.83、37.31、34.01、29.19、27.92、26.08、25.16、19.24、19.19、17.28、17.13、16.97、16.91、16.88、16.82、12.53、12.35、12.12、12.04.C40H61N7O8Si2についてのLRMS計算値823.4120、実測値m/z 824.2(M+1)+、846.2(M+23)Na+、822.2(M-1)-、858.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.54。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.61(s,1H、D2O交換可能)、7.95(s,1H)、7.88-7.78(m,4H)、6.44(s,2H、D2O交換可能)、5.76(d,J=6.1Hz、1H)、5.06(s,2H、D2O交換可能)、4.28-4.17(m,2H)、3.63-3.46(m,5H)、3.38-3.28(m,3H)、1.46(dt,J=37.2、6.7Hz、4H)、1.19(d,J=5.6Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.88、156.61、153.74、151.18、135.36、134.32、131.55、122.95、116.57、85.85、84.42、81.07、69.56、68.88、61.30、37.26、28.95、27.83、25.99、24.86.C24H28N6O7についてのLRMS計算値512.2019、実測値m/z 513.1(M+1)+、511.0(M-1)-、547.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.19。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.04(s,1H)、11.64(s,1H)、8.27(s,1H)、7.82(p,J=4.4Hz、4H)、5.88(d,J=6.6Hz、1H)、5.13(d,J=4.7Hz、1H)、5.05(t,J=5.4Hz、1H)、4.28(ddd,J=23.5、6.8、4.7Hz、2H)、3.92(q,J=4.0Hz、1H)、3.63-3.50(m,3H)、3.46(t,J=7.2Hz、2H)、3.35(d,J=6.5Hz、1H)、2.74(p,J=6.9Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.25-1.13(m,4H)、1.09(dd,J=6.7、4.8Hz、6H).C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 582.2(M+1)+、581.1(M-1)-、616.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
[実施態様1]
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり;および
前記リガンドが糖に由来し、(i)前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ(ii)前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、
少なくとも1個のリンカーが、表1(ここで、DMTr基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である)または表1Aに記載のものから選択される、および/または
少なくとも1個のリガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
R3が、表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつnが、1~5(好ましくは、1~3)であり、各R3は、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
kが、1~6である)、
(c)以下の構造の1つを有するリガンド、
矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し(すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される);
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
Q1が、H、C1~C4アルキル、
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である)
および
(d)表4または4A中のリガンド
から選択される。
前記オリゴヌクレオチドが、(i)前記オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの1つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、実施形態1に記載のコンジュゲート。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子に結合し;および
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたウラシルであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたシトシンであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、実施形態3~6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、実施形態1の表1または表1Aに記載のものから選択され;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し;および
各リガンドが、1~6個の標的化モノマーを含む。
前記リガンドが肝臓を標的にする、実施形態8に記載のコンジュゲート。
前記リガンドがASGPRを標的にする、実施形態8または9に記載のコンジュゲート。
各リガンドが糖含有基を含む、実施形態8~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、実施形態1の表2、2A、4、または4Aに記載のものから選択される。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、式-R2-(R3)kのものであり、式中、R2がスペーサであり、R3が、実施形態1の表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびkが1~6であり、各R3は、R2中の窒素原子に結合し、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
Claims (2)
- オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、該オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖siRNA化合物であり、その二本鎖部分は19~23ヌクレオチド対の長さの範囲であり、センス鎖のオリゴヌクレオチドの3’末端から7番目、8番目および9番目の位置のヌクレオシドがそれぞれ、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされており、該コンジュゲートされたヌクレオシドは次式を有し、
5’および3’末端はそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合しており、
R6は核酸塩基であり、
-R7-(R8)nは、
- 2’-Fまたは2’-OCH3基を有する1つ以上のヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
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