KR20220011656A - 핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도 - Google Patents

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Abstract

프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 형 9(PCSK9) 유전자 발현을 억제하는 siRN, siRNA를 함유하는 약제학적 조성물, 및 접합체가 개시되어 있다. siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다. siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 함유한다. 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 I은 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 지닌, 서열 번호: 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이를 갖는다. 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 지닌, 서열 번호: 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이를 갖는다. siRNA, 이의 약제학적 조성물 및 접합체는 고콜레스테롤혈증을 효과적으로 치료 및/또는 방지할 수 있다.

Description

핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도
본 개시내용은 프로단백질 컨버타제 서브틸리신(proprotein convertase subtilisin)/켁신(kexin) 형 9(PCSK9) 유전자, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체(conjugate)의 발현을 억제할 수 있는 핵산에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이러한 핵산, 약제학적 조성물및 siRNA 접합체의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
이상지질혈증(dyslipidemia), 특히 지속적으로 높은 수준의 저-밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-c)은 죽상경화증(atherosclerosis)의 발생 및 발달을 유도하고 촉진하는 중요한 위험 인자이며, 허혈성 심혈관(ischemic cardiovascular) 및 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease)과 밀접하게 관련되어, 사람 건강에 심각한 위협이 되고 있다. 이상지질혈증을 치료하기 위해 현재 이용가능한 의약은 주로 스타틴, 콜레스테롤 흡수 억제제, 레진(resin), 프로부콜, 피브레이트, 니아신, 및 이의 유도체를 포함한다. 혈장 콜레스테롤 수준을 저핫키기 위한 지질-저하 의약의 적용은 심혈관 및 뇌혈관 질환의 위험을 감소시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 목적한 지질 수준을 달성하는데 실패한 환자의 고려할만한 비율이 여전히 존재한다.
연구는 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 형 9(PCSK9) 유전자가 지질 대사, 특히 콜레스테롤 대사에서 중요한 역활을 함을 나타낸다. PCSK9 유전자의 발현을 억제함으로써, 혈장 콜레스테롤 수준은 효과적으로 감소시킬 수 있다. RNA 간섭(RNA interference)(RNAi)의 메카니즘을 기반으로, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)(siRNA)는 서열-특이적인 방식으로 목적한 표적 유전자의 발현을 억제 또는 차단함으로써, 질환을 치료하는 목적을 달성할 수 있다. mRNA 수준에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 것은 의심의 여지없이 가장 이상적인 치료 수단이 될 것이다.
PCSK9 유전자의 발현을 억제하고 고콜레스테롤혈증을 치료하는 siRNA 의약을 개발하기 위한 주요 실마리는 적합한 siRNA 및 이의 변형 및 효과적인 전달 시스템을 찾는 것이다.
발명의 요약
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체가 PCSK9 유전자의 발현을 구체적으로 억제할 수 있고, 간에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제함으로써, 고콜레스테롤혈증의 치료 또는 방지를 달성할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 보다 높은 활성을 지닌 siRNA 및 약제학적 조성물을 추가로 발명하였다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 화학식 (308)로 나타낸 구조를 갖는 siRNA 접합체를 제공한다:
Figure pct00001
상기식에서,
n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
m1, m2, 또는 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고:
Figure pct00002
여기서,
E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
Nu는 siRNA이고;
siRNA는 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하고; siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성(reverse complementary)이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 다음의 그룹 i) 내지 vi) 중 하나로부터 선택된 서열이다:
i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00003
여기서, Z1은 C이고 Z2는 G이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00004
여기서, Z5는 A이고 Z6은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00005
여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 포함하고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00006
여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00007
여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다; 및
vi) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00008
여기서, Z21은 A이고 Z22는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 치환되고; 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
각각의 L1은 독립적으로 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고; 여기서 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
Figure pct00009
는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타내고;
M1은 표적화 그룹(targeting group)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 PCSK9 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하고, 여기서 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 및 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 나머지 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 상술한 그룹 i) 내지 vi) 중 하나로부터 선택된 서열이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA를 포함하는 siRNA 접합체 및 siRNA에 공유결합으로 연결된 접합 그룹을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태의 치료 및/또는 방지용 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태를 치료 및/또는 방지하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시킴을 포함하여, 간세포내에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
유리한 효과
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 및 siRNA 접합체는 본 개시내용의 PCSK9 mRNA에 대해 양호한 안정성, 보다 높은 억제 활성, 및 보다 낮은 오프-표적 효과(off-target effect) 및 독성을 나타낼 수 있고/있거나 PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증을 유의적으로 치료 및/또는 방지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 시험관내(in vitro) 세포 실험에서 표적 mRNA에 대해 탁월한 억제 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 간세포내에서 표적 mRNA에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내(in vivo)에서 보다 높은 안정성 및/또는 보다 높은 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내에서 표적 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내에서 PCSK9 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내에서 간 내 PCSK9 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내에서 동물 모델내 간에서 PCSK9 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 생체내에서 사람 대상체내 간에서 PCSK9 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 명백한 오프-표적 효과를 나타내지 않는다. 오프-표적 효과는 예를 들면, 비-표적 유전자의 정상적인 발현의 억제일 수 있다. 오프-표적 유전자의 발현의 결합/억제가 표적 유전자 상에서의 효과와 비교하여 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만인 경우, 오프-표적 효과는 유의적이지 않은 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 psiCHECK 시스템 내에서, 표적 서열에 대해 0.0194 nM 내지 0.0561 nM 범위의 IC50 값을 갖는 보다 높은 억제 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)내로 9 mg/kg의 단일 피하 주사 후, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 투여 7일 전과 비교하여 투여 후 15일째에 NHP의 간 조직 내에서 PCSK9 mRNA에 대해 56 내지 81% 이하의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 발현에 대해 보다 유의적인 억제를 나타내고, 투여 후 14일째에 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 발현에 대해 90% 이상까지의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 혈청 속에서 LDL-c 및 CHO 수준을 유의적으로 억제할 수 있고, 특히 투여 후 14일 내지 29일의 기간 동안 LDL-c에 대해 30% 이하, 또는 심지어 64% 이하의 억제를 나타내고; 이는 또한 CHO에 대해 보다 높은 억제율, 심지어 35% 이상 까지의 억제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 9 mg/kg의 단일 투여 후, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 11주 동안 LDL-c에 대해 50% 초과의 억제율을 유지할 수 있고, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 랫트 또는 마우스에서 맹백한 독성을 나타내지 않는다. 결론적으로, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 신속한 온세트(rapid onset) 및 긴 작용 기간을 가지며, 표적 mRNA의 발현을 유의적으로 억제할 수 있고, 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 함량을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 혈청 속에서 LDL-c 및 CHO에서 강력한 억제 효과를 가지고, 양호한 생물학적 안전성을 갖는다.
따라서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체는 PCSK9 유전자의 발현을 억제할 수 있고, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태를 효과적으로 치료 및/또는 방지할 수 있으므로, 촉망되는 적용 가능성을 나타낸다.
본 개시내용의 추가의 특징 및 장점은 다음의 "발명의 상세한 설명"에서 상세하게 나타낼 것이다.
도 1a 내지 1f는 상이한 siRNA(siRNA 1 내지 6)으로 형질감염 후 psiCHECK 시스템 내에서 리포터 유전자 Renilla의 상대적인 잔류 활성에 따라 핏팅된 용량-효과 곡선을 나타낸다.
도 2는 9 mg/kg의 접합체 1, 4 또는 7의 단일 피하 주사를 시노몰구스 원숭이에게 제공한 후 상이한 시점에서 혈청 속의 표준화된 PCSK9 단백질 수준을 나타낸다.
도 3은 9 mg/kg의 접합체 4 또는 7의 단일 피하 주사를 시노몰구스 원숭이에게 제공한 후 상이한 시점에서 혈청 속의 표준화된 LDL-c 수준을 나타낸다.
도 4는 9 mg/kg의 접합체 4 또는 7의 단일 피하 주사를 시노몰구스 원숭이에게 제공한 후 상이한 시점에서 혈청 속의 표준화된 CHO 수준을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
다음은 본 개시내용의 구체적인 구현예의 상세한 설명이다. 본원에 기술된 구체적인 구현예는 본 개시내용을 나타내고 설명하기 위해서만 사용되며 본 개시내용을 제한하는 것이 아님이 이해될 수 있다.
본 개시내용에서, PCSK9 mRNA는 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NM_174936.3로 나타낸 서열의 mRNA이다. 또한, 달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에서 사용된 용어 "표적 유전자"는 상기 PCSK9 mRNA를 전사할 수 있는 유전자를 지칭하고; 용어 "표적 mRNA"는 상기 PCSK9 mRNA를 지칭한다.
정의
본 개시내용의 맥락에서, 달리 정의하지 않는 한, C, G, U, A 및 T는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고, VP는 VP의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐 포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; Ps는 Ps의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; P는 문자 P의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환하여 형성시킨 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오타이드 유사체"는 핵산 내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만, 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들면, 이소뉴클레오타이드, 브릿지된(bridged) 뉴클레오타이드(브릿지된 핵산, BNA) 또는 아사이클릭 뉴클레오타이드와는 구조적으로 상이한 그룹을 지칭한다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환하여 형성시킨 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "상보성" 및 "역 상보성"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 당해 분야에 잘 공지된 의미를 가질 수 있는데, 즉, 하나의 가닥 각각에서 염기는 이중 가닥 핵산 분자내 다른 가닥의 것과 상보저긍로 쌍을 이룬다. DNA에서, 퓨린 염기 아데노신(A)은 피리미딘 염기 티민(T)(또는 RNA내 우라실(U))과 쌍을 이루고; 퓨린 염기 구아닌(G)은 피리미딘 염기 사이토신(C)과 항상 쌍을 이룬다. 각각의 염기 쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 하나의 가닥에서 아데노신이 다른 가닥내 티민(또는 우라실)과 항상 쌍을 이루고, 구아닌이 사이토신과 항상 쌍을 이루는 경우, 2개의 가닥은 서로 상보성인 것으로 고려되고; 가닥의 서열은 이의 상보성 쇄의 서열로부터 유추될 수 있다. 상응하게, "염기쌍오류(mispairing)"는 상응하는 위치에서 염기가 이중 가닥 핵산내 상보성 쌍의 방식으로 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 나타내지 않는 한, "염기적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이상의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미한다. "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미한다. "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 뉴클레오타이드 서열이 다른 뉴클레오타이드 서열로부터 "뉴클레오타이드 차이"를 가지는 경우, 이들 사이의 동일한 위치에서 뉴클레오타이드의 염기는 변화된다. 예를 들면, 후자의 서열내 뉴클레오타이드 염기가 A이고 전자의 서열 내 동일한 위치에서 뉴클레오타이드 염기가 U, C, G, 또는 T인 경우, 2개의 뉴클레오타이드 서열은 당해 위치에서 뉴클레오타이드 차이를 갖는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 위치에서 뉴클레오타이드가 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체로 대체되는 경우, 이러한 위치내에 뉴클레오타이드 차이가 존재하는 것으로 또한 고려된다.
본 개시내용의 맥락에서, 특히 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체의 제조방법의 설명에서, 달리 명시하지 않는 한, "뉴클레오시드 단량체"는 제조된 siRNA 또는 siRNA 접합체내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라서, 포스포르아미디트 고체상 합성에 사용된 변형되지 않거나 변형된 뉴클레오시드 포스포르아미디트 단량체(변형되지 않거나 변형된 RNA 포스포르아미디트; 때때로 RNA 포스포르아미디트는 뉴클레오시드 포스포르아미디트로서 지칭된다)를 지칭한다. 포스포르아미디트 고체 상 합성은 당해 분야의 기술자에 의해 RNA 합성용으로 잘 공지된 방법이다. 본 개시내용에 사용된 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업적으로 이용가능하다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, "접합"은 특이적인 기능을 가진 하나 이상의 화학적 모이어티(moiety) 각각이 공유결합성 연결을 통해 서로 연결되어 있음을 의미한다. 상응하게, "접합체"는 개개의 화학적 모이어티의 공유결합성 연결에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 또한, "siRNA 접합체"는 특이적인 기능을 지닌 하나 이상의 화학적 모이어티 각각을 siRNA에 공유결합으로 부착시켜 형성된 화합물을 나타낸다. 다음의 내용에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 "접합체"로서 때때로 약칭된다. 본 개시내용의 내용에 따라서, siRNA 접합체는 많은 siRNA 접합체, 또는 화학식으로 나타낸 siRNA 접합체의 일반적인 용어로서 이해될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, "접합 분자"는 반응을 통해 siRNA에 접합됨으로써, 최종적으로 본 개시내용의 siRNA 접합체를 형성할 수 있는 구체적인 화합물로서 해석될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기술된 현상 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 이러한 설명은 이러한 현상 또는 상황이 발생하는 예 및 이것이 발생하지 않는 예를 포함한다. 예를 들면, "임의 치환된 알킬"은 하기 정의된 바와 같은 "알킬" 및 "치환된 알킬"을 의미한다. 당해 분야의 기술자는 하나 이상의 치환체를 함유하는 임의의 그룹과 관련하여, 이러한 그룹이 입체적으로, 실질적으로, 합성적으로 실행불가능하고/하거나 고유하게 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하기 위해 의도되지 않음을 이해할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "알킬"은 나타낸 수의 탄소 원자, 일반적으로 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들면 1 내지 10개의 탄소 원자, 예를 들면, 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 측쇄 알킬을 지칭한다. 예를 들면, C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 및 측쇄 알킬 둘 다를 포함한다. 구체적인 수의 탄소 원자를 갖는 알킬 잔기가 지칭되는 경우, 이러한 수의 탄소 원자를 갖는 모든 측쇄 및 직쇄 형태가 포함되는 것으로 의도되는데; 즉, 예를 들면, "부틸"은 n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 및 t-부틸을 포함하고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함함을 의미한다. 알킬렌은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는 알킬의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알케닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 그룹은 이중 결합(들)의 시스 또는 트랜스 구조일 수 있다. 대표적인 알케닐 그룹은 에테닐; 프로페닐, 예를 들면, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일; 부테닐, 예를 들면, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알키닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자, 및 다른 구현예에서 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알케닐렌은 알케닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는, 알케닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알키닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 2개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 대표적인 알키닐 그룹은 에티닐; 프로피닐, 예를 들면, 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일; 부티닐, 예를 들면, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알키닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알키닐렌은 알키닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는, 알키닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알콕시"는 산소 브릿지를 통해 부착된 나타낸 수의 탄소 원자의 알킬 그룹, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 2급-부톡시, 3급-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시, 3-메틸펜틸옥시 등을 지칭한다. 알콕시 그룹은 일반적으로 산소 브릿지를 통해 부착된 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "아릴"은 환 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족의 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템으로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 방향족의 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템은 단지 하나의 수소 원자 및 6 내지 18개의 탄소 원자를 함유하고, 여기서 환 시스템 내 적어도 하나의 환은 완전히 불포화되는데, 즉, 이는 후켈 이론(Huckel theory)에 따라 사이클릭의, 탈국재화된(delocalized)(4n+2)π-전자 시스템을 함유한다. 아릴 그룹은 예를 들면, 페닐, 플루오레닐, 및 나프틸고 같은 그룹을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴렌은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 부착 그룹을 갖는 아릴의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로 치환체" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도를 지칭하고 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬을 지칭하고 여기서 명시된 수의 탄소 원자는 하나 이상(최대 허용가능한 수까지)의 할로겐 원자로 치환된다. 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 또는 펜타-플루오로에틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로사이클릴"은 2 내지 12개의 탄소 원자 및 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 안정한 3 내지 18원의 비-방향족 환 라디칼을 지칭한다. 명세서에 달리 기술하지 않는 한, 헤테로사이클릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 테트라사이클릭 환 시스템이고, 이는 융합된 또는 브릿지된 환 시스템(들)을 포함할 수 있다. 헤테로사이클릴 내 헤테로원자(들)은 임의로 산화될 수 있다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우, 임의로 사급화된다. 헤테로사이클릴은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로사이클릴은 임의의 환 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다 이러한 헤테로사이클릴의 예는 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아니, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥사피페라지닐, 2-옥사피페리디닐, 2-옥사피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로아릴"은 2 내지 17개의 탄소 원자 및, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 18원의 방향족 환 라디칼로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 헤테로아릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 환 시스템일 수 있고, 여기서 환 시스템 내 적어도 하나의 환은 충분히 불포화되는데, 즉, 이는 후켈 이론에 따라 사이클릭의, 탈국재화된(4n+2)π-전자 시스템을 함유한다. 헤테로아릴은 융합되거나 브릿지된 환 시스템(들)을 포함한다. 헤테로아릴 내 헤테로원자(들)은 임의 산화된다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우 임의로 사급화된다. 헤테로아릴은 임의의 환 원자를 통해 분자의 나머지에 부착된다. 헤테로아릴의 예는 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조디옥사졸릴, 벤조푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]뮈나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10 헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로헵타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10- 헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디노닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타 [4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]프리디닐 및 티오페닐/티에닐을 포함한, 이에 한정되지 않는다.
다양한 하이드록실 보호 그룹이 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 일반적ㄱ으로, 보호 그룹은 화학적 작용 그룹을 특수한 반응 조건 하에서 불활성이 되도록 하며, 분자의 나머지에 실질적으로 손상을 입히지 않고 분자내 이러한 작용 그룹으로 확장 및 이로부터 제거할 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호 그룹은 문헌: Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, 및 또한 문헌: Greene and Wuts, Protective 그룹s in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991에 기술되어 있고, 이는 각각 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 보호 그룹은 염기성 조건 하에서 안정하지만 산성 조건하에서 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-예외적인 예는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐트산텐-9-일(Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일(Mox)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-예외적인 예는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸, 및 TMTr (4,4',4''-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체(subject)"는 임의의 동물, 예컨대, 포유동물 또는 유대목 동물(marsupial)을 포함한다. 본 개시내용의 대상체는 사람, 비-사람 영장류(예컨대, 레서스(rhesus) 또는 다른 유형의 마카퀴), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 랫트, 및 임의의 종류의 가금류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 치료학적 이점을 포함하나 이에 한정되지 않는 유리하거나 목적한 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. "치료학적 이점"은 치료되는 근본적인 장애의 근절 또는 개선을 의미한다. 또한, 치료학적 이점은 근본적인 장애와 관련된 하나 이상의 생리학적 증상을 근절 또는 개선함으로써, 대상체가 여전히 근본적인 장애로 고통받을 수 있지만, 대상체에서 개선을 관찰함에 의해 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은, "방지"는 예방학적 이점을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 유리하거나 목적한 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. "예방학적 이점"을 수득하기 위하여, siRNA 접합체 또는 약제학적 조성물은 특수한 질환으로 진전될 위험이 있는 대상체, 또는 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게, 심지어 이러한 질환이 이루어지지 않았다고 해도, 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 PCSK9 유전자의 발현을 억제할 수 있는 6개의 siRNA를 제공한다.
본 개시내용의 siRNA는 기본 구조 단위로서 뉴클레오타이드 그룹을 포함한다. 뉴클레오타이드 그룹이 포스페이트 그룹, 리보스 그룹 및 염기를 포함하고 있는 것은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 그룹의 상세한 설명은 본원에서 빠져 있다.
본 개시내용의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 길이가 19 내지 23개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 26개 뉴클레오타이드이다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 길이 비는 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
제1의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제1 siRNA일 수 있다.
제1 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제1 siRNA내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가진다:
Figure pct00010

여기서, Z1은 C이고 Z2는 G이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드이다;
본 개시내용의 맥락에서, "상응하는 위치"는 뉴클레오타이드 서열의 동일한 말단으로부터 계수하는 경우, 뉴클레오타이드 서열내 동일한 위치를 지칭한다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열 I의 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드는 서열 번호: 1의 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z4에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z4는 A, U 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z4 위치에서의 차이이고, 여기서 Z4는 A, U 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z3은 Z4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 3으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 4로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드이다:
Figure pct00011

여기서, Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드이고, Z3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z3은 C이고, Z4는 G이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 동일한 길이를 갖고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나, 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 1에 나타낸 뉴크렐오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CCC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GGG이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 ACCC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GGGU이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GG이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제2의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제2의 siRNA일 수 있다.
제2의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제2의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00012

여기서, Z5는 A이고 Z6는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II은 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z8은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치에서의 차이이고, 여기서 Z8은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z7은 Z8에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 63으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 64로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
Figure pct00013

여기서, Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z7은 A이고, Z8은 U이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 61에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5'에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 A이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GGU이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 ACC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GGGU이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 ACCC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GU이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 AC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제3의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제3의 siRNA일 수 있다.
제3의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제3의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00014

여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 가지고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 가지고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II과 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치를 포함하고, 여기서 Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치에서의 차이이고, 여기서 Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z11은 Z12에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 123으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 124로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
Figure pct00015

여기서, Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z11은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z11은 A이고, Z12는 U이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 121에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UAG이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CUA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AUAG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CUAU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드이 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되면, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제4의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제4의 siRNA일 수 있다.
제4의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제4의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이를 가지고 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00016

여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가진다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z16 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z16은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z16 위치에서의 차이이고, 여기서 Z16은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z15는 Z16에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 183으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 184로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
Figure pct00017

여기서, Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z15는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z15는 U이고, Z16은 A이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 181에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GAC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GUC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGAC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GUCU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제4의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제5의 siRNA일 수 있다.
제5의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제5의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 214로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이를 가지고 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00018

여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가진다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z20 위치에서의 차이이고, 여기서 Z20은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z20 위치에서의 차이이고, 여기서 Z20은 U, C 또는 G로부터 선택되다. 일부 구현예에서, Z19는 Z20에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 더 높은 억제능을 가지고 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 서로 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 243으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 244로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
Figure pct00019

여기서, Z20는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z19는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z19는 U이고, Z20은 A이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 241에 나타뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CUG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CAG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCUG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CAGA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제6의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제6의 siRNA일 수 있다.
제6의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제6의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이를 가지고 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00020

여기서, Z21은 A이고 Z22는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z24 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z24는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z24 위치에서의 차이이고, 여기서 Z24는 A, C 또는 G로부터 선택되다. 일부 구현예에서, Z23은 Z24에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 303으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 304로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00021

여기서, Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z23은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z23은 A이고, Z24는 U이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV은 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 제2의 뉴클레오타이드 서열은 표적 mRNA의 서열 번호: 301에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AUG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CAU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UAUG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CAUA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
siRNA의 오버행 말단(Overhang terminal) 및 변형
뉴클레오타이드 서열 V, 핵산 서열, 또는 뉴클레오타이드 변형 및 siRNA의 변형된 서열에 관한 다음의 설명은 제1의 siRNA 내지 제6의 siRNA 중 어느 하나에 적용가능하다. 즉, 달리 기술하지 않는 한, siRNA의 다음의 설명은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6의 siRNA의 설명으로 고려될 수 있다. 예를 들면, 특수한 siRNA를 구체적으로 나타낸 경우, "siRNA는 뉴클레오타이드 서열 V를 포함한다"는 "제1의 siRNA, 제2의 siRNA, 제3의 siRNA, 제4의 siRNA, 제5의 siRNA 및 제6의 siRNA가 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다"를 의미한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다. 뉴클레오타이드 서열 V는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행 말단을 형성한다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 V 내 각각의 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 합성을 촉진시키고 합성 비용을 절약하기 위하여, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 연속적인 티민 데옥시리보뉴클레오타이드(dTdT) 또는 2개의 연속적인 우라실 리보뉴클레오타이드(UU)이고; siRNA의 안티센스 가닥와 표적 mRNA 사이의 친화성을 향상시키기 위하여, 뉴클레오타이드 서열 V는 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21 또는 21/23이다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA는 보다 우수한 mRNA 사일런싱 활성(silencing activity)을 나타낸다.
표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드는 표적 mRNA의 제3의 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 제3의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 II와 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성인 뉴클레오타이드 서열의 분절을 지칭하거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 뉴클레오타이드 서열 IV로 이루어진 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 제1의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 5로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열 번호: 6으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00022

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 7로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열 번호: 8로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00023

여기서, Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제2의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 65로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열 번호: 66으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00024

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 67로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 68로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00025

여기서, Z8는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제3의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 125로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 126으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00026

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 127로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 128로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00027

여기서, Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제4의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 185로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 186으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00028

대안적으로, siRNA의 센스 가닥운 서열 번호: 187로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 188로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00029

여기서, Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z15는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제5의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 245로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 246으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00030

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 247로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열를 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 248로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00031

Figure pct00032

여기서, Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z19는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제6의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 305로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 306으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00033

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 307로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 308로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00034

여기서, Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z23은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1f에 나타낸 siPCSKa1, siPCSKa2, siPCSKb1, siPCSKb2, siPCSKc1, siPCSKc2, siPCSKd1, siPCSKd2, siPCSKe1, siPCSKe2, siPCSKf1 또는 siPCSKf2이다.
상술한 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA에서, 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내 뉴클레오타이드는 변형되지 않는 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내에서, 뉴클레오타이드 중 일부 또는 모두는 변형된 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드 그룹에서 이러한 변형은 본 개시내용의 siRNA의 PCSK9 우전자의 발현을 억제하기 위한 기능의 유의적인 감소 또는 상실을 초래하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 다른 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 염기를 지닌 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA 접합체의 유전자 발현을 억제하기 위한 기능의 유의적인 손상 또는 상실을 초래할 수 있다. 예를 들면, 문헌: Watts, J.K., G. F. Deleavey and M. J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p.842-55에 기술된 변형된 뉴클레오타이드가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 및/또는 적어도 하나의 포스페이트 그룹은 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이다. 다시 말해서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격내 포스페이트 및/또는 리보스 그룹 중 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹 및/또는 변형된 그룹을 지닌 리보스 그룹이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA가 동물 실험에서 혈장 안정성과 유전자 사일런싱 효능 사이에서 높은 균형을 달성함을 발견하였다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 적어도 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 뉴클레오타이드 서열 I은 5개 이하의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 II는 7개 이하의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드는 센스 가닥내 서열 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드를 지칭하고, 이는 다음의 화학식 (7)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체로부터 독립적으로 선택된다.
리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (8)로 나타낸 바와 같은 2'-메톡시(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들면 화학식 (9)로 나타낸 바와 같은, 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-아미노 (2'-NH2) 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (10)으로 나타낸 바와 같다. 일부 구현예에서, 2'-데옥시 뉴클레오타이드(DNA)는 화학식 (11)로 나타낸 바와 같다.
Figure pct00035

뉴클레오타이드 유사체는 핵산 내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만, 아데노신 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드와는 구조적으로 상이한 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, 브릿지된 뉴클레오타이드 또는 아사이클릭 뉴클레오타이드일 수 있다.
BNA 뉴클레오타이드(브릿지된 핵산, BNA)는 구속되거나 접근불가능한 뉴클레오타이드이다. BNA는 "고정된" C3'-엔도 당 푸커링(puckering)을 지닌 5-, 6-원 또는 7-원의 환 브릿지된 구조를 함유할 수 있다. 브릿지는 전형적으로 리보스의 2'- 및 4'-위치에 혼입되어 2',4'-BNA 뉴클레오타이드를 생성한다. 일부 구현예에서, BNA는 LNA, ENA, cET BNA 등일 수 있고 이는 각각 화학식 (12), (13) 및 (14)으로 나타낸다.
Figure pct00036

아크릴성 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 부류를 지칭하고 여기서 당 환은 개방되어 있다. 일부 구현예에서, 아크릴성 뉴클레오타이드는 언록된(unlocked) 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이고, 이는 각각 화학식 (15) 및 (16)로 나타낸다.
Figure pct00037

상기 화학식(15) 및 (16)에서, R은 H, OH 또는 알콕시(O-알킬)로부터 선택된다.
이소뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드내 리보스 환 상의 염기의 위치를 변경시켜 형성한 화합물이다. 일부 구현예에서, 이소뉴클레오타이드는 각각 화학식 (17) 또는 (18)로 나타낸 바와 같이, 리보스 환 상의 1'-위치로부터 2'-위치 또는 3'-위치로 염기를 수송하여 형성시킨 화합물이다.
Figure pct00038

상기 화학식(17) 및 (18)의 화합물에서, "염기"는 A, U, G, C, 또는 T와 같은 염기를 나타내고; R은 H, OH, F, 또는 상기 비-플루오로 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다. 본 개시내용의 맥락에서, 메톡시 변형된 뉴클레오타이드는 리보스 그룹의 2'-하이드록시 그룹을 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 뉴클레오타이드", 및 "2'-플루오로리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지며 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 화합물을 지칭하고, 이는 화학식 (7)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "2'-메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 뉴클레오타이드는 메톡시로 치환된다" 및 "2'-메톡시리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지고, 뉴클레오타이드내 리보스 그룹의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 화합물을 지칭하고, 이는 화학식 (8)로 나타낸 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이다: 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II에서 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이다: 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고;
대안적으로, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
대안적으로, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1f에 나타낸 siPCSKa1-M1, siPCSKa1-M2, siPCSKa1-M3, siPCSKa2-M1, siPCSKa2-M2, siPCSKa2-M3, siPCSKb1-M1, siPCSKb1-M2, siPCSKb1-M3, siPCSKb2-M1, siPCSKb2-M2, siPCSKb2-M3, siPCSKc1-M1, siPCSKc1-M2, siPCSKc1-M3, siPCSKc2-M1, siPCSKc2-M2, siPCSKc2-M3, siPCSKd1-M1, siPCSKd1-M2, siPCSKd1-M3, siPCSKd2-M1, siPCSKd2-M2, siPCSKd2-M3, siPCSKe1-M1, siPCSKe1-M2, siPCSKe1-M3, siPCSKe2-M1, siPCSKe2-M2, siPCSKe2-M3, siPCSKf1-M1, siPCSKf1-M2, siPCSKf1-M3, siPCSKf2-M1, siPCSKf2-M2 또는 siPCSKf2-M3 중 어느 하나이다.
상기 변형을 지닌 siRNA는 보다 낮은 비용을 가질 뿐 아니라, 혈액 속의 리보뉴클레아제는 핵산을 용이하게 분해할 수 없어서, 핵산의 안정성을 증가시키고 핼산이 뉴클레아제 가수분해에 대해 보다 강력한 내성을 가지도록 한다. 한편, 상기 변형을 지닌 siRNA는 또한 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격 내 포스페이트 그룹의 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 포스페이트 그룹 내 포스포디에스테르 결합 내 적어도 하나의 산소를 황 원자로 치환시켜 형성한 포스포로티오에이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹이다:
Figure pct00039

이러한 변형은 siRNA의 이중 가닥 구조를 안정화시킴으로써 염기 쌍화(base pairing)의 높은 특이성 및 높은 친화성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치한다: 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외하고는 상기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외하고는 상기 위치 모두에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음 위치 중 적어도 하나에 위치한다:
센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1f에 나타낸 siPCSKa1-M1S, siPCSKa1-M2S, siPCSKa1-M3S, siPCSKa2-M1S, siPCSKa2-M2S, siPCSKa2-M3S, siPCSKb1-M1S, siPCSKb1-M2S, siPCSKb1-M3S, siPCSKb2-M1S, siPCSKb2-M2S, siPCSKb2-M3S, siPCSKc1-M1S, siPCSKc1-M2S, siPCSKc1-M3S, siPCSKc2-M1S, siPCSKc2-M2S, siPCSKc2-M3S, siPCSKd1-M1S, siPCSKd1-M2S, siPCSKd1-M3S, siPCSKd2-M1S, siPCSKd2-M2S, siPCSKd2-M3S, siPCSKe1-M1S, siPCSKe1-M2S, siPCSKe1-M3S, siPCSKe2-M1S, siPCSKe2-M2S, siPCSKe2-M3S, siPCSKf1-M1S, siPCSKf1-M2S, siPCSKf1-M3S, siPCSKf2-M1S, siPCSKf2-M2S 또는 siPCSKf2-M3S 중 임의의 하나이다.
일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥내 5'-말단에서 뉴클레오타이드는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이다.
대표적인 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 다음 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00040

다른 예로, 문헌: Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48은 다음의 4개의 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드를 개시하고 있다:
Figure pct00041

여기서 R은 H, OH, 메톡시, 및 F로부터 선택되고;
"염기"는 A, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 5'-포스페이트를 지닌 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (3)으로 나타낸 비닐포스포네이트 (5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형을 지닌 뉴클레오타이드, 또는 화학식 (5)로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1f에 나타낸 siPCSKa1-M1P1, siPCSKa1-M2P1, siPCSKa1-M3P1, siPCSKa2-M1P1, siPCSKa2-M2P1, siPCSKa2-M3P1, siPCSKb1-M1P1, siPCSKb1-M2P1, siPCSKb1-M3P1, siPCSKb2-M1P1, siPCSKb2-M2P1, siPCSKb2-M3P1, siPCSKc1-M1P1, siPCSKc1-M2P1, siPCSKc1-M3P1, siPCSKc2-M1P1, siPCSKc2-M2P1, siPCSKc2-M3P1, siPCSKd1-M1P1, siPCSKd1-M2P1, siPCSKd1-M3P1, siPCSKd2-M1P1, siPCSKd2-M2P1, siPCSKd2-M3P1, siPCSKe1-M1P1, siPCSKe1-M2P1, siPCSKe1-M3P1, siPCSKe2-M1P1, siPCSKe2-M2P1, siPCSKe2-M3P1, siPCSKf1-M1P1, siPCSKf1-M2P1, siPCSKf1-M3P1, siPCSKf2-M1P1, siPCSKf2-M2P1, siPCSKf2-M3P1, siPCSKa1-M1SP1, siPCSKa1-M2SP1, siPCSKa1-M3SP1, siPCSKa2-M1SP1, siPCSKa2-M2SP1, siPCSKa2-M3SP1, siPCSKb1-M1SP1, siPCSKb1-M2SP1, siPCSKb1-M3SP1, siPCSKb2-M1SP1, siPCSKb2-M2SP1, siPCSKb2-M3SP1, siPCSKc1-M1SP1, siPCSKc1-M2SP1, siPCSKc1-M3SP1, siPCSKc2-M1SP1, siPCSKc2-M2SP1, siPCSKc2-M3SP1, siPCSKd1-M1SP1, siPCSKd1-M2SP1, siPCSKd1-M3SP1, siPCSKd2-M1SP1, siPCSKd2-M2SP1, siPCSKd2-M3SP1, siPCSKe1-M1SP1, siPCSKe1-M2SP1, siPCSKe1-M3SP1, siPCSKe2-M1SP1, siPCSKe2-M2SP1, siPCSKe2-M3SP1, siPCSKf1-M1SP1, siPCSKf1-M2SP1, siPCSKf1-M3SP1, siPCSKf2-M1SP1, siPCSKf2-M2SP1 및 siPCSKf2-M3SP1 중 어느 하나이다.
제7의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제7의 siRNA일 수 있다.
제7의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제7의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 399로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 400으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
Figure pct00042

여기서, Z25는 U이고 Z26은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z25에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z27을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z26에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z28을 포함하고, 여기서 Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 399로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 400으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 400으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z28에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z28은 G, U 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z28에서의 차이이고, 여기서 Z28은 G, U 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z27은 Z28에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 399로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 뉴클레오타이드 서열 i의 5' 말단으로부터 계수하여 9번째 뉴클레오타이드 Z의 차이를 포함하고, 여기서 Z는 dT이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I와 서열 번호: 399로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z27 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z27은 A, G 또는 C로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 399로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 2개의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 완전히 역 상보성이고, 여기서 2개의 뉴클레오타이드 차이는 Z 및 Z27 위치에서의 차이이고 Z는 dT이고 Z27은 A, G 또는 C로부터 선택된다.
상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I는 서열 번호: 401로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 402로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 402이고:
Figure pct00043

여기서 dT는 티민 데옥시뉴클레오타이드이고, Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z27은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z28은 Z27에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z27은 U이고, Z28은 A이다.
일부 구현예에서, 제7의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 403으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 404로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00044

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 405로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 406으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고:
Figure pct00045

일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1g에 나타낸 siPCSKg3 또는 siPCSKg4이다.
일부 구현예에서, Z 및/또는 Z27 위치에서 뉴클레오타이드 차이를 지닌 상술한 siRNA에서 뉴클레오타이드 중 적어도 일부는 변형된 뉴클레오타이드이고, 이러한 변형된 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 이러한 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내 2, 6, 14, 및 16번 위치에서뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1g에 나타낸 siPCSKg3-M4, siPCSKg4-M5, siPCSKg3-M4S, siPCSKg4-M5S, siPCSKg3-M4P1, siPCSKg4-M5P1, siPCSKg3-M4SP1 또는 siPCSKg4-M5SP1 중 임의의 하나이다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도, 본 개시내용의 siRNA가 유의적으로 향상된 혈장 및 라이소솜 안정성을 가지는 한편, 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제 활성을 나타냄을 발견하였다.
본 개시내용의 siRNA는 당해 분야에서 siRNA를 제조하는 통상의 방법, 예컨대, 고체 상 합성 방법 및 액체 상 합성 방법으로 수득할 수 있다. 시판되는 통상의 장치가 고체 상 합성에 이미 이용가능하다. 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 상응하는 변형을 지닌 뉴클레오타이드 단량체를 사용하여 본 개시내용의 siRNA 내로 도입할 수 있다. 상응하는 변형을 가진 뉴클레오타이드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 siRNA 내로 도입하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 활성 성분으로서 상기 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 siRNA 투여 분야에서 통상의 담체, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 자기 나노입자(예를 들면, Fe3O4 및 Fe2O3-기반 나노입자), 탄소 나노튜브, 메소포러스(mesoporous) 규소, 인산칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리(L-라이신)(PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 폴리(D&L-락트산/글리콜산) 공중합체(PLGA), 폴리(2-아미노에틸 에틸렌 포스페이트)(PPEEA), 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA), 및 이의 유도체일 수 있다.
약제학적 조성물에서, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체의 함량은 구체적으로 요구되지 않으며, 개개 구성성분의 통상의 함량일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량 비는 1:(1-500)이고, 일부 구현예에서, 중량비는 1:(1-50)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있고, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 약제학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충제, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
pH 완충제는 pH가 7.5 내지 8.5인 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드 완충제 용액, 및/또는 pH가 5.5 내지 8.5인 포스페이트 완충제, 예를 들면, pH가 5.5 내지 8.5인 포스페이트 완충제이다.
보호제는 이노시톨, 소르비톨, 슈크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 및 글루코스 중 적어도 하나일 수 있다. 보호제의 함량은 약제학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 wt% 내지 30 wt%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약제학적 조성물의 삼투압이 200 내지 700 밀리오스몰(milliosmol)/kg이 되도록 한다. 목적한 삼투압에 따라서, 당해 분야의 기술자는 삼투압 조절제의 함량을 용이하게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제형, 예를 들면, 주사 액제; 도는 주사용 동결건조된 분말일 수 있고; 이는 액체 부형제와 혼합되어 투여시 액체 제형을 형성할 것이다. 액체 제형은 파하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고 또한 폐에 스프레이로 투여될 수 있거나, 다른 기관(예를 들면, 간)에 스프레이로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주사로 투여된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포좀 제형의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀 제형에 사용된 약제학적으로 허용되는 담체는 아민-함유 형질감염 화합물(이후 또한 유기 아민으로 지칭됨), 헬퍼(helper) 지질 및/또는 페길화된(PEGylated) 지질을 포함할 수 있다. 여기서, 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질은 각각 아민-함유 형질감염 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 유도체, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제CN103380113A호에 기술된 바와 같은 헬퍼 지질 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같은 화학식 (201)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00046

여기서,
각각의 X101 또는 X102는 서로 독립적으로 O, S, N-A 및 C-A로부터 선택되고, 여기서 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이고;
각각의 Y101 또는 Z101는 서로 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2로부터 선택되고;
각각의 R101, R102, R103, R104, R105, R106 또는 R107은 서로 독립적으로 수소; 사이클릭 또는 아사이클릭(acyclic)의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 지방족 그룹; 사이클릭 또는 아사이클릭의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로지방족 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아실 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아릴 그룹; 및 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로아릴 그룹으로부터 선택되고;
x는 1 내지 10의 정수이고;
n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이고, p는 0 또는 1이고, 여기서 m=p=0이면, R102는 수소이고;
n 및 m 중 적어도 하나가 2이면, 화학식 (201) 내 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)으로 나타낸 구조를 형성하고:
Figure pct00047

여기서 g, e 또는 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *N는 화학식 (201)에 나타낸 질소 원자를 나타낸다.
일부 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 일부 구현예에서, 화학식 (201) 내 R101 및 R102는 서로 독립적으로 임의의 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 알킬 또는 알케닐이고, 알킬 또는 알케닐은 3 내지 20개의 탄소 원자(예를 들면, 8 내지 18개의 탄소 원자) 및 0 내지 4개의 이중 결합(예를 들면, 0 내지 2개의 이중 결합)을 갖는다.
일부 구현예에서, n 및 m이 서로 독립적으로 1 또는 3인 경우, R103은 임의의 다음 화학식(204) 내지 (213)이고:
Figure pct00048

Figure pct00049
및
Figure pct00050

여기서, 화학식(204) 내지 (213)에서, g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, 각각의 "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *는 화학식 (201)내 질소 원자에 대한 R103의 잠재적인 부착점을 나타내고, 여기서 임의의 * 위치내 각각의 H는 대체되어 화학식 (201)내 질소 원자에 대한 부착을 형성할 수 있다.
화학식 (201)로 나타낸 화합물은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 화학식 (214)로 나타낸 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 나타낸 유기 아민이고:
Figure pct00051

헬퍼 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이다.
페길화된 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 속의 유기 아민, 헬퍼 지질, 및 페길화된 지질 중 몰 비는 (19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)이고, 예를 들면, 몰 비는 (50-70):(20-40):(3-20)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질감염 시약에 의해 형성된 약제학적 조성물 입자는 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 약 40 nm 내지 약 135 nm이고, 보다 전형적으로, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm이고; 예를 들면, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 nm이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질감염 시약에 의해 형성된 약제학적 조성물에서 siRNA 대 총 지질, 예컨대, 유기 아민, 헬퍼 지질 및/또는 페길화된 지질의 중량 비(중량/중량 비)는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:3 내지 약 1:20, 약 1:4 내지 약 1:18, 약 1:5 내지 약 1:17, 약 1:5 내지 약 1:15, 약 1:5 내지 약 1:12, 약 1:6 내지 약 1:12, 또는 약 1:6 내지 약 1:10의 범위이다. 예를 들면, 본 개시내용의 siRNA 대 총 지질의 중량 비는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 또는 1:18이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 별개인 각각의 구성성분과 함께 시판될 수 있고, 액체 제형의 형태로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 약제학적으로 허용되는 담체에 의해 형성된 약제학적 조성물은 기존의 siRNA를 본 개시내용의 siRNA로 대체하는 것을 제외하고는, 다양한 공지된 공정으로 제조할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음의 공정에 따라 제조할 수 있다:
유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질을 알코올 속에 상술한 바와 같은 몰 비로 현탁시키고 균질하게 혼합하여 액체 용액을 수득하고; 알코올은 수득되는 액체 용액이 2 내지 25 mg/mL(예컨대, 8 내지 18 mg/mL)의 통 질량 농도에서 존재하도록 하는 양으로 사용된다. 알코올은 약제학적으로 허용되는 알코올, 예를 들면, 약 실온에서 액체 형태인 알코올, 예를 들면, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알코올, 글리세롤, PEG 200, PEG 300, 및 PEG 400 중 하나 이상, 예를 들면, 에탄올이다.
본 개시내용의 siRNA는 완충된 염 용액 속에 용해되어 siRNA의 수용액을 형성한다. 완충된 염 용액은 0.05 내지 0.5 M, 예를 들면, 0.1 내지 0.2 M의 농도를 갖는다. 완충된 염 용액의 pH는 4.0 내지 5.5, 예를 들면, 5.0 내지 5.2로 조절된다. 완충된 염 용액은 siRNA가 0.6 mg/ml 미만, 예를 들면, 0.2 내지 0.4 mg/mL의 농도로 존재하도록 하는 양이다. 완충된 염은 가용성 아세테이트 및 가용성 시트레이트, 예를 들면, 아세트산나트륨 및/또는 아세트산칼륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
siRNA의 액체 용액 및 수용액은 혼합된다. 혼합에 의해 수득된 생성물은 40 내지 60℃의 농도에서 적어도 2분(예컨대, 5 내지 30분) 동안 항온처리하여 항온처리된 액체 제형을 생산한다. 액체 용액 대 siRNA의 수용액의 용적 비는 1:(2-5)이다.
항온처리된 액체 제형은 농축 또는 희석시키고, 정제하여 불순물을 제거하고 멸균여과하여 본 개시내용의 약제학적 조성물을 수득하고, 이는 다음의 물리화학적 매개변수를 갖는다: 6.5 내지 8의 pH, 80% 이상의 캡슐화 퍼센트(encapsulation percentage), 40 내지 200 nm의 입자 크기, 0.30 미만의 다분산성 지수(polydispersity index), 및 250 내지 400 mOsm/kg의 삼투압. 예를 들면, 물리화학적 매개변수는 다음과 같을 수 있다: 7.2 내지 7.6의 pH, 90% 이상의 캡슐화 퍼센트, 60 내지 100 nm의 입자 크기, 0.20 미만의 다분산성 지수, 및 300 내지 400 mOsm/kg의 삼투압.
여기서, 농축 또는 희석 단계는 불순물의 제거 전, 후 또는 동시에 수행할 수 있다. 불순물을 제거하는 방법은 임의의 다양한 기존의 방법, 예를 들면, 100 kDa이 중공 섬유(hollow fiber) 컬럼 및 접선 유동 시스템을 사용한 한외여과(ultrafiltration) 교환 용액으로서 pH 7.4에서의 PBS를 사용한 한외여과일 수 있다. 멸균 방법은 임의의 다양한 기존의 방법, 예를 들면, 0.22 μm 여과기 상에서의 여과 멸균일 수 있다.
siRNA 접합체
본 개시내용은 상기 siRNA 및 siRNA에 접합하여 연결된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체를 제공한다.
일반적으로, 접합 그룹은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및 임의의 링커를 포함한다. 더욱이, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 순차적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적화 그룹의 수는 1 내지 6이다. 일부 구현예에서, 표적 그룹의 수는 2 내지 4이다. siRNA 분자는 비-공유결합적으로 또는 공유결합적으로 접합 그룹에 접합될 수 있는데, 예를 들면 siRNA 분자는 접합 그룹에 공유결합적으로 접합될 수 있다. siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단, 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단일 수 있고, siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 존재한다.
일부 구현예에서, 접합 그룹은 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹, 2'-하이드록시 또는 염기에 연결될 수 있다. 접합 그룹은 뉴클레오타이드가 2'05'-포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 경우 3'-하이드록시 그룹에 연결될 수 있다. 접합 그룹이 siRNA의 말단에 연결된 경우, 접합 그룹은 전형적으로 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹에 연결되고; 접합 그룹이 siRNA의 내부 서열에 연결된 경우, 접합 그룹은 리보스 환 또는 염기에 전형적으로 연결된다. 다양한 연결 방식에 대해 다음에 대한 참고가 이루어질 수 있다: Muthiah Manoharan et.al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalatosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10(5): 1181-7.
일부 구현예에서, siRNA 및 접합 그룹은 산에 불안정하거나 환원성 화학 결합에 의해 연결될 수 있고 이러한 화학 결합은 세포 엔도소옴의 산성 환경 하에서 분해됨으로써 siRNA를 유리 상태로 만들 수 있다. 비-분해가능한 접합 방식을 위해, 접합 그룹을 siRNA의 센스 가닥에 연결시킴으로써, siRNA의 활성에서 접합 효과를 최소화할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 siRNA 투여 분야에서 통상의 리간드, 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO2009082607A2호에 기술된 다양한 리간드일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 다음의 표적화 분자 또는 이의 유도체에 의해 형성된 리간드로부터 선택된 하나 이상일 수 있다: 친지성 분자, 예를 들면, 콜레스테롤, 담즙 산, 비타민(예를 들면, 비타민 E), 상이한 쇄 길이를 지닌 지질 분자; 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜; 폴리펩타이드, 예를 들면, 세포-침투 펩타이드; 아프타머(aptamer); 항체; 양자 점(quantum dot); 사카라이드, 예를 들면, 락토드, 폴리락토스, 만노스, 갈락토스, N-아세틸갈락토스아민(GalNAc); 폴레이트; 또는 간 실질 세포 내에서 발현된 수용체 리간드, 예를 들면, 아시알로당단백질, 아시알로-당 잔기, 지단백질(예를 들면, 고 밀도 지단백질, 저 밀도 지단백질 등), 글루카곤, 신경전달물질(neurotransmitter)(예를 들면, 아드레날린), 성장 인자, 트랜스페린 등.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 포유동물 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사람 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드이다. 이러한 리간드의 유형은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고 전형적으로 쇼적 세포의 표면에서 특이적인 수용체에 결합하는 기능을 제공함으로써, 표적 세포내로 리간드에 연결된 siRNA의 전달을 매개한다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 독립적으로 아시알로당단백질, 예를 들면, 아시알로오로소무코이드(ASOR) 또는 아시알로페투인(ASF)이다. 일부 구현예에서, 리간드는 사카라이드 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 폴리사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 또는 사카라이드 유도체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 트리사카라이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 폴리사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 모노사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 폴리사카라이드 유도체, 및 모노사카라이드 유도체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드 또는 적어도 하나의 리간드는 글루코스 및 이의 유도체, 만노스 및 이의 유도체, 갈락토스 및 이의 유도체, 크실로스 및 이의 유도체, 리보스 및 이의 유도체, 푸코스 및 이의 유도체, 락토스 및 이의 유도체, 말토스 및 이의 유도체, 아라비노스 및 이의 유도체, 프럭토스 및 이의 유도체, 및 시알산으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-크실로푸라노스, L-크실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코스아민, 시알산, 갈락토스아민, N-아세틸갈락토스아민, N-트리플루오로아세틸갈락토스아민, N-프로피오닐갈락토스아민, N-n-부티릴갈락토스아민, N-이소부티릴갈락토스아민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오ㅛ-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로부터 독립적으로 선택된다. 리간드의 다른 선택사항은 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제CN105378082A호의 개시내용에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체 내 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민일 수 있고, 여기서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자는 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가일 수 있다. 본원에 기술된 용어 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가는 각각 siRNA 접합체내 siRNA 분자 대 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자의 몰 비가 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4임을 의미하고, 여기서 siRNA 접합체는 siRNA 분자 및 표적화 그룹으로서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자를 함유하는 접합 그룹으로부터 형성된다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 N-아세틸갈락토스아민이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드가 N-아세틸갈락토스아민을 포함하는 접합 그룹에 접합된 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자는 3가 또는 4가이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA가 N-아세틸갈락토스아민을 함유하는 접합 그룹에 접합된 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자는 3가이다.
표적화 그룹은 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 연결될 수 있고, 적절한 링커는 표적화 그룹의 특수한 유형에 따라 당해 분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 링커 및 표적화 그룹 및 siRNA와의 링커 방식의 유형은, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO2015006740A2호의 개시내용에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토스아민인 경우, 적합한 링커는 화학식 (301)로 나타낸 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00052

여기서,
k는 1 내지 3의 정수이고;
LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 가진 아미드 결합-포함 쇄 모이어티이고, 각각의 LA의 2개의 말단은 표적화 그룹 및 LC 모이어티에 에테르 결합을 통해 각각 연결되고:
Figure pct00053

LB는 화학식 (303)로 나타낸 구조를 갖는 N-아실피롤리딘-포함 쇄 모이어티이고, 여기서 쇄 모이어티는 하나의 말단에서 카보닐 그룹을 갖고 아미드 결합을 통해 LC 모이어티에 연결되고, 다른 말단에서 옥시 그룹을 갖고 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결되고:
Figure pct00054

LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 2가 내지 3가 연결 그룹이고, LC는 에테르 결합을 통해 산소 원자를 경유하여 LA 모이어티에 연결되고, 아미드 결합을 통해 질소 원자를 경유하여 LB 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에서, n=3이고 LC가 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 3가 연결 그룹인 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자를 siRNA 분자와 링커로서 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 통해 연결시켜 형성된 siRNA 접합체는 화학식 (304)로 나타낸 구조를 가지고:
Figure pct00055
화학식 (304),
여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
유사하게, siRNA와 접합 그룹 사이이 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단, 또는 5'-말단에 존재하거나, siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단은 3개의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 분자에 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 경유하여 공유결합으로 접합시켜 siRNA 분자 대 GalNAc 분자의 몰 비가 1:3인 siRNA 접합체(이후 또한 (GalNAc)3-siRNA로 지칭됨)를 수득하고, 이러한 접합체는 화학식 (305)로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00056

화학식 (305),
여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토스아민인 경우, 적합한 링커는 화학식 (306)으로 나타낸 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00057

여기서,
l은 0 내지 3의 정수이고;
*는 표적화 그룹에 에테르 결합을 경유하여 연결된 부위를 나타내고;
#는 siRNA에 포스포에스테르 결합을 경유하여 연결된 부위를 나타낸다.
일부 구체적인 구현예에서, l=2인 경우, siRNA 접합체는 화학식 (307)로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00058

화학식 (307),
여기서, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
상기 접합체는 선행 분야에 상세히 기술된 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들면, 제WO2015006740 A2호는 다양한 접합체의 제조 방법을 상세히 기술한다. 본 개시내용의 siRNA 접합체는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 제WO2014025805A1호는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술한다. 문헌: Rajeev et al., ChemBioChem 2015, 16, 903-908은 화학식 (307)로 나타낸 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술한다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (308)로 나타낸 구조를 갖고:
Figure pct00059

여기서,
n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
각각의 m1, m2, 또는 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R3는 화학식 (A59)로 나타낸 구조를 갖는 그룹이고:
Figure pct00060

여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고; Nu는 본 개시내용의 siRNA이고;
R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
각각의 L1은 독립적으로 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 L1은 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 갖는다.
일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 및 이의 임의의 조합의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서 A1 내지 A26의 구조 및 정의는 다음과 같고:
Figure pct00061

여기서 각각의 j1은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고; 각각의 j2는 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
각각의 R'는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
각각의 Ra는 독립적으로 화학식 (A27) 내지 (A45) 또는 이의 임의의 조합의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
Figure pct00062

Figure pct00063

각각의 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
Figure pct00064
는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타낸다.
당해 분야의 기술자는, L1이 편의상 직쇄 알킬로 정의되어 있지만, 이는 직쇄 그룹이 아닐 수 있거나 상이하게, 예를 들면, 상기 대체 및/또는 치환에 의해 생산된 아민 또는 알케닐로 명명될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, L1의 길이는 2개의 부착 점을 연결하는 쇄 내 원자의 수이다. 이러한 목적을 위해, 직쇄 알킬렌 속의 탄소 원자를 대체함으로써 수득된 환, 예를 들면, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌은 하나의 원자로 계수된다.
M1은 표적화 그룹을 나타내고, 이의 정의 및 선택사항은 상기 표적화 그룹의 것과 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 M1은 독립적으로 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드로부터 선택된 것이다.
M1이 포유동물 간세포 상의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드인 경우, 일부 구현예에서, n1는 1 내지 3의 정수일 수 있고, n3은 0 내지 4의 정수이어서 접합체내 M1 표적화 그룹의 수가 적어도 2일 수 있도록 보증한다. 일부 구현예에서, n1+n3 ≥ 2이어서, M1 표적화 그룹의 수가 적어도 3임으로써, M1 표적화 그룹이 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 보다 용이하게 결합ㅎ도록 하며, 이는 세포내로 접합체의 세포내이입(endocytosis)을 촉진한다. 실험은 M1 리간드의 수가 3을 초과하는 경우, 간세포의 표면 상의 M1 리간드와 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합의 용이성이 유의적으로 증가하지 않는다. 따라서, 다양한 양태, 예를 들면, 합성 편의성, 구조/공정 비용 및 전달 효능에서, 일부 구현예에서, n1은 1 또는 2의 정수이고, n3은 0 또는 1의 정수이고, n1+n3은 2 내지 3이다.
일부 구현예에서, 각각의 m1, m2, 또는 m3이 서로 독립적으로 2 내지 10으로부터 선택된 정수인 경우, 많은 M1 리간드 중에서 입체 위치는 M1 리간드와 간세포의 표면 상에서의 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합에 적합할 수 있다. 본 개시내용의 접합체가 보다 간단한 구조, 보다 용이한 합성 및/또는 감소된 비용을 갖도록 하기 위하여, 일부 구현예에서, 각각의 m1, m2 또는 m3는 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고; 일부 구현예에서, m1 = m2 = m3이다.
당해 분야의 기술자는 R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15가 서로 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로부터 선택된 경우, 이는 본 개시내용의 siRNA 접합체의 특성을 변화시키지 않을 수 있고 본 개시내용의 목적을 모두 달성할 수 있음을 이해할 수 있다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 H이다.
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고, 여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고, 출발 물질의 용이한 이용가능성을 고려할 때, 일부 구현예에서, E1은 OH 또는 SH이다.
R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 그룹과 질소 골격 상의 N 원자 사이에 연결을 달성하기 위해 선택된다. 본 개시내용의 맥락에서, "질소 골격"은 N 원자가 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 부착된 탄소 원자에 상호인접하게 연결된 쇄 구조를 지칭한다. 따라서, R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 그룹을 질소 골격 상의 N 원자에 적합한 수단으로 연결시킬 수 있는 임의의 연결그룹이다. 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 고체상 합성 공정으로 제조되는 경우에, R2 그룹은 질소 골경 상의 N 원자에 연결하는 부위 및 R3내 P 원자에 연결하는 부위 둘 다를 가질 필요가 있다. 일부 구현예에서, R2 내에서, 질소 골격 상의 N 원자에 연결하는 부위는 N 원자와 함께 아미드 결합을 형성하고, R3내 P 원자에 연결하는 부위는 P 원자와 함게 포스포에스테르 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, R2는 B5, B6, B5', 또는 B6'일 수 있고:
Figure pct00065

여기서
Figure pct00066
는 그룹이 공유 결합을 경유하여 연결되는 부위를 나타내고;
q2는 1 내지 10의 정수이고; 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다.
L1은 M1 표적화 그룹을 질소 골격 상의 N 원자에 연결시켜 화학식 (308)로 나탄내 바와 같은 siRNA 접합체에 대해 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A4), (A8), (A10), 및 (A11) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A8) 및 (A10) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, L1은 3 내지 25, 3 내지 20, 4 내지 15 또는 5 내지 12개의 원자를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, L1은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개 원자의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, j1은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j1은 3 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, j2는 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j2는 3 내지 5의 정수이다. R'는 C1-C4 알킬이고, 일부 구현예에서, R'는 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 화학식(A27), (A28), (A29), (A30), 및 (A31) 중 하나이고, 일부 구현예에서, Ra는 화학식 (A27) 또는 (A28)이다. Rb는 C1-C5 알킬이고, 일부 구현예에서, 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나이다. 일부 구현예에서, 화학식(A1) 내지 (A26) 내 j1, j2, R', Ra, 및 Rb는 각각 M1 표적화 그룹과 질소 골격 상의 N 원자 사이에 연결을 달성하고 M1 표적화 그룹 중 입체적 위치가 M1 표적화 그룹과 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체 사이의 결합에 보다 적합하도록 하기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) 또는 (422)로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00067

Figure pct00068

Figure pct00069

Figure pct00070

Figure pct00071

Figure pct00072

Figure pct00073

일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 서열 내 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있다. 예를 들면, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥내 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 내 임의의 뉴클레오타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59)내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 말단 영역에 연결될 수 있다. 상기 말단 영역은 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단으로부터 계수하여 제1의 4개 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59)내 P 원자는 siRNA의 안티센스 가닥의 말단 어느 하나에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 상기 위치에 연결된 경우, 세포 내로 도입된 후, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 풀리는(unwinding) 동안에 별개의 siRNA의 안티센스 가닥을 방출함으로써 단백질로의 PCSK9 mRNA의 해독을 차단하고 PCSK9 유전자의 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA내 뉴클레오타이드의 임의의 가능한 위치, 예를 들면, 5' 위치, 2' 위치, 3' 위치, 또는 뉴클레오타이드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA 내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 내 센스 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오타이드의 3'-하이드록시의 탈수에 의해 형성되거나(이러한 경우에, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 포스페이트 그룹 내 P 원자로 고려될 수 있다), 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 내 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시 내 수소 원자를 치환시킴으로써 뉴클레오타이드에 연결되거나, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 내 센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드의 5'-하이드록시 내 수소 원자를 치환함으로써 뉴클레오타이드에 연결된다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA 접합체가 유의적으로 증진된 혈장 내 안정성 및 낮은 오프-표적 효과(off-target effect)를 나타내고, PCSK9 mRNA에 대해 비교적 높은 사일런싱 활성을 나타내고, 또한 혈액 지질에서 보다 높은 억제 효과를 나타냄을 발견하였다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1g에 나타낸 siRNA 중 임의의 하나일 수 있다. 이러한 siRNA를 포함하는 접합체는 PCSK9 mRNA에 대해 보다 높은 사일런싱 활성을 나타낸다.
[표 1a]
Figure pct00074

Figure pct00075

Figure pct00076

Figure pct00077

[표 1b]
Figure pct00078

Figure pct00079

Figure pct00080

Figure pct00081

[표 1c]
Figure pct00082

Figure pct00083

Figure pct00084

Figure pct00085

[표 1d]
Figure pct00086

Figure pct00087

Figure pct00088

[표 1e]
Figure pct00089

Figure pct00090

Figure pct00091

[표 1f]
Figure pct00092

Figure pct00093

Figure pct00094

Figure pct00095

[표 1g]
Figure pct00096

Figure pct00097

본 개시내용의 siRNA 또는 siRNA 접합체에서 인접한 뉴클레오타이드의 각각의 쌍은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 경유하여 연결된다. 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비-브릿지된 산소 또는 황은 음으로 하전되며, 하이드록시 또는 설프하이드릴의 형태로 존재할 수 있다. 더욱이, 하이드록시 또는 설프하이드릴 내 수소 이온은 양이온과 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 양이온은 임의의 양이온, 예를 들면, 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 또는 유기 암모늄 양이온일 수 있다. 용해도를 증가시키기 위하여, 일 구현예에서, 양이온은 알칼리 금속 양이온, 3급 아민과 4급 암모늄 양이온에 의해 형성된 암모늄 양이온으로부터 선택된 하나 이상이다. 알칼리 금속 이온은 K+ 및/또는 Na+일 수 있고 3급 아민에 의해 형성된 양이온은 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 적어도 부분적으로 염의 형태로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합내 비-브릿징 산소 또는 황 원자는 적어도 부분적으로 나트륨 이온에 결합하며, 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 나트륨 염의 형태로 존재하거나 부분적으로 존재한다.
당해 분야의 기술자는 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 상응하는 변형을 지닌 뉴클레오시드 단량체에 의해 본 개시내용의 siRNA 내로 도입할 수 있음을 명확하게 알고 있다. 상응하는 변형을 가진 뉴클레오시드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드를 siRNA 내로 도입하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다. 모든 변형된 뉴클레오시드 단량체는 상업적으로 이용가능하거나 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 제조
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 임의의 적절한 합성 경로로 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라 3' 내지 5' 방향에서 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 순차적으로 연결시키는 단계(여기서, 각각의 뉴클레오시드 단량체를 연결시키는 단계는 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다); siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계; 및 어닐링하는 단계(여기서 siRNA는 상기 본 개시내용의 siRNA이다)를 포함하는, 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다.
더욱이, 이러한 방법은 화학식 (321)로 나타낸 siRNA를 고체 상 지지체에 부착된 뉴클레오시드 단량체 또는 뉴클레오타이드 서열과 커플링 반응 조건 하에서 및 커플링제의 존재하에 부착시킴으로써 화학식 (321)에 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오타이드 서열에 커플링 반응을 경유하여 연결시키는 단계를 추가로 포함한다. 이후에, 화학식 (321)로 나타낸 화합물은 또한 접합 분자로 지칭된다.
Figure pct00098

여기서,
R4는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 화합물 내에서 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 siRNA에 공유 결합을 경유하여 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 siRNA에 포스포디에스테르 결합을 경유하여 반응에 의해 접합시킬 수 있는 임의의 작용 그룹을 포함하는 그룹이고;
각각의 S1은 독립적으로 M1 내 모든 활성 하이드록실 그룹을 그룹 YCOO-로 치환시켜 형성시킨 그룹이고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 M1의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
R4는 질소 골격에 N 원자에 대한 연결을 달성하고 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 합성하기에 적합한 반응 부위를 제공하기 위해 선택된다. 일부 구현예에서, R4는 R2 연결 그룹 또는 보호된 R2 연결 그룹, 및 siRNA와 반응하여 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 형성할 수 있는 임의의 작용 그룹을 포함하는 그룹이다.
일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 siRNA 상의 그룹 또는 뉴클레오시드 단량체와 반응하여 포스파이트 에스테르를 형성하는 제1의 작용 그룹, 및 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹과 반응하여 이와 공유 결합을 형성하거나, 공유 결합에 의해 연결된 고체 지지체를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 카복실 또는 카복실레이트 염이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹에 의해 형성된 공유 결합을 경유하여 분자의 나머지에 연결된 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 포스포디에스테르 결합, 카복실 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 경유하여 연결된다. 일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 수지이다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시, -ORk 또는 화학식 (C3)으로 나타낸 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1), (C2), (C3), (C1'), 또는 (C3')로 나타낸 그룹을 포함한다:
Figure pct00099

여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체 상 지지체를 나타내고
Figure pct00100
는 그룹이 공유결합으로 부착된 부위를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트 그룹, 예를 들면, 화학식 (C3)로 나타낸 그룹을 포함한다. 포스포르아미디트 그룹은 커플링 반응에 의해 뉴클레오타이드의 임의의 위치(예를 들면, 2'-하이드록시 또는 3'-하이드록시)에서 하이드록시와 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있고, 포스파이트 에스테르른 산화 또는 황화를 통해 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합을 형성함으로써, 접합 분자를 siRNA에 접합시킬 수 있다. 여기서, 제2의 작용 그룹이 존재하지 않는 경우에도, 화학식 (321)로 나타낸 화합물은 여전히 뉴클레오타이드에 접합할 수 있지만, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는데 영향을 미치지 않는다. 이러한 상황하에서, 방법, 예를 들면, 포스포르아미디트 고체 상 합성에 의해 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득한 후, 화학식 (321)로 나타낸 화합물을 뉴클레오타이드 서열의 말단에서 뉴클레오타이드 상의 하이드록시와 방응시키고, 포스포로디에스테르 결합 연결 또는 포스포로티오에이트 결합 연결을 후속적인 산화 또는 황화 공정에서 형성시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 siRNA에 접합시킨다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록시를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 고체 상 지지체와 반응하여 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 제공할 수 있는 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 카복실, 카복실레이트 염 또는 포스포르아미디트, 예를 들면, 화학식 (C1), (C2) 또는 (C3)으로 나타낸 바와 같은 작용 그룹을 포함한다. 제2의 작용 그룹이 카복실 또는 카복실레이트 염을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물은 고체 상 지지체(예를 들면, 수지) 상에서 하이드록시 또는 아미노 그룹과 에스테르화 또는 아미드화 반응을 경유하여 반응함으로써, 카복실레이트 에스테르 결합을 경유하여 연결된 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성한다. 제2의 작용 그룹이 포스포르아미디트 작용 그룹을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물은 공통적인 고체 상 지지체(예를 들면, 수지) 상의 하이드록시 그룹과 커플링하고, 산화에 의해 포스포디에스테르 결합을 경유하여 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성할 수 있다. 다음에, 고체 상 지지체에 연결된 상기 생성물로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 순차적으로 연결시킴으로써, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득한다. 포스포르아미디트 고체 상 합성의 공정에서, 제1의 작용 그룹은 탈보호된 다음 커플링 반응 조건 하에서 뉴클레오시드 단량체 상의 포스포르아미디트 그룹과 커플링된다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시 또는 보호된 하이드록시 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같이, 카복실레이트 에스테르 결합, 아미드 결합, 또는 포스포디에스테르 결합을 경유하여 연결된 고체 상 지지체를 포함한다. 이러한 경우에, 고체 상 지지체 대신에 화학식 (321)의 화합물로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 순차적으로 연결함으로써, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득한다.
일부 구현예에서, 카복실레이트는 -COO-M+로 나타낼 수 있고, 여기서 M+는 양이온, 예를 들면, 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 및 유기 암모늄 양이온으로부터 선택된 것이다. 일 구현예에서, 금속 양이온은 알칼리 금속 양이온, 예를 들면, K+ 또는 Na+일 수 있다. 용해도를 증가시키고 반응을 촉진시키기 위해, 일부 구현예에서, 유기 암모늄 양이온은 3급 아민 또는 4급 암모늄 양이온에 의해 형성된 암모늄 양이온, 예를 들면, 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온이다. 일부 구현예에서, 카복실레이트는 트리에틸아민 카복실레이트 또는 N,N-디이소프로필에틸아민 카복실레이트이다.
일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9), (B10), (B9'), (B10'), (B11), (B12), (B11'), 또는 B(12')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하고:
Figure pct00101

Figure pct00102

여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, q2는 1 내지 10의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체 상 지지체를 나타내고
Figure pct00103
는 그룹이 공유결합된 부위를 나타낸다. 일부 구현예에서, q1은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9) 또는 (B10)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B11) 또는 (B12)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, Rk는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr(4,4',4''-트리메톡시트리틸) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, Rk는 DMTr, 즉, 4,4'-디메톡시트리틸일 수 있다.
L1의 정의는 상술한 바와 같다.
일부 구현예에서, L1은 M1 표적화 그룹을 질소 골격의 N 원자에 연결함으로써, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체에 대한 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 중 어느 하나, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.
상기 설명에 따라서, 당해 분야의 기술자는 당해 분야에 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법과 비교하여, 접합 분자가 뉴클레오타이드 서열의 임의의 가능한 위치에 연결되어 있는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 상기 제1의 작용 그룹 및 임의로 제2의 작용 그룹을 사용함으로써 수득될 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 접합 분자는 뉴클레오타이드 서열의 말단 영역, 또는 뉴클레오타이드 서열의 말단 영역에 연결된다. 상응하게, 달리 명시하지 않는 한, 접합체 및/또는 접합 분자의 제조에 관한 다음의 설명에서, 반응, 예를 들면, "탈보호", "커플링", "캡핑", "산화", "황화"를 지칭하는 경우, 당해 분야에서 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 포함된 반응 조건 및 시약은 또한 이러한 방법에 적용될 수 있음이 이해될 것이다. 예시적인 반응 조건 및 시약은 이후 상세히 설명될 것이다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1 내 적어도 하나의 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호합으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1 내 모든 존재하는 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호함으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 기술자에게 공지된 임의의 하이드록실 보호 그룹을 사용하여 M1 내 활성 하이드록실 그룹을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 하이드록시는 화학식 YCOO-로 나타내고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 C1-C10 알킬 및 C6-C10 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이는 할로 및 C1-C6 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의 치환된다. 일부 구현예에서, 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 C1-C6 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 화학식(A46) 내지 (A54)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00104

일부 구현예에서, S1는 A49 또는 A50이다.
일부 구현예에서, 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
상술한 바와 같이, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: siRNA의 다른 가닥을 합성하는 단계(예를 들면, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥이 상기 단계에서 합성된 경우, 이러한 방법은 고체 상 합성 방법에 따라 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계, 또는 이의 역을 추가로 포함한다), 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계, 및 어닐링하는 단계. 특히, 단리하는 단계에서, 뉴클레오타이드 서열 및/또는 접합 분자에 연결된 고체 상 지지체를 절단(cleaving)하고, 필수 보호 그룹을 제거(이러한 경우에, 화학식 (321)의 화합물 내 각각의 S1 그룹을 상응하는 M1 표적화 그룹으로 전환시킨다)하여 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥(또는 안티센스 가닥) 및 상응하는 안티센스 가닥(또는 센스 가닥)을 수득한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 어닐링하여 이중 가닥 RNA를 형성시킴으로써 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득한다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 제1의 뉴클레오시드 단량체와 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에서 커플링제의 존재하에 커플링 반응 조건 하에서 접촉시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 서열 내 제1의 뉴클레오타이드에 연결시키는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결시켜 이러한 유형에 따른 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥 및 목적한 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 서열을 포스포르아미디티 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 합성하는 단계(여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 제1의 작용 그룹 및 제2의 작용 그룹을 포함하는 화합물이고, 여기서 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록실을 포함하고 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 구조를 갖고, (321)의 화합물은 탈보호된 후 제1의 뉴클레오시드 단량체에 연결되고; 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4개 단계 반응을 포함한다); 따라서 접합 그룹에 연결된 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결시켜 유형에 따른 핵산의 안티센스 또는 센스 가닥 및 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 서열을 포스포르아미디트 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 합성하는 단계(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계를 포함한다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 절단하는 단계; 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링 단계.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 이중 가닥 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 유형 및 서열에 따라서, 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결하여 안티센스 및 센스 가닥을 합성(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다)함으로써 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 및 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 화합물을 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 또는 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥과 커플링제의 존재하에 커플링 반응하에 접촉시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 화합물을 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 연결시키는 단계(여기서 화학식 (321)로 나타낸 화합물은 R4가 포스포르아미디트 그룹인 제1의 작용 그룹을 포함하는 화합물이다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 절단하는 단계; siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링하는 단계(여기서, siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥은 접합 그룹에 연결된다).
일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되고, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은:
(1) 화학식 (321)의 화합물 내 하이드록실 보호 그룹 Pk를 제거하는 단계로서, 여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 보호된 하이드록실 ORk를 포함하는 제1의 작용 그룹, 및 화학식 (C1') 또는 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제2의 작용 그룹을 포함하는 화합물인 단계; 탈보호된 생성물을 뉴클레오시드 단량체와 접촉시켜 커플링제의 존재하에서 커플링 반응 조건 하에 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체를 수득하는 단계;
(2) 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, siRNA의 센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 3' 내지 5' 방향으로 합성하는 단계;
(3) siRNA의 안티센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성하는 단계; 및
(4) siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하고 이를 어닐링하여 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는 단계를 포함한다.
여기서, 단계 (1)에서, 상기 화학식 (321)의 화합물내 보호 그룹 Rk를 제거하는 방법은 화학식 (321)의 화합물을 탈보호제와 탈보호 조건 하에서 접촉시킴을 포함한다. 탈보호 조건은 0 내지 50℃의 온도, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃ 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 것, 일부 구현예에서, 디클로로아세트산일 수 있다. 탈보호제 대 화학식 (321)로 나타낸 화합물의 몰 비는 10:1 내지 1000:1이고, 일부 구현예에서, 50:1 내지 500:1이다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기 커플링 반응에 적합한 임의의 조건 및 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 상 합성 방법에서의 커플링 반응의 것과 동일한 조건 및 제제가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도를 포함한다. 화학식 (321)의 화합물 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서, 1:2 내지 1:5이다. 화학식 (321)의 화합물 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:50일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:10일 수 있다. 반응 시간은 200 내지 3,000 초, 및 일부 구현예에서, 500 내지 1,500초이다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행할 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄으로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 무수 아세토니트릴이다. 화학식 (321)로 나타낸 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
단계 (2)에서, 상기 단계에서 제조된 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, siRNA 접합체의 센스 가닥 SS는 3' 내지 5' 방향으로 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성된다. 이러한 경우에, 접합 분자는 수득되는 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건을 포함하는, 단계 (2) 및 (3)에서의 고체 상 합성을 위한 다른 조건, 탈보호제의 유형 및 양, 커플링 반응 조건, 커플링제의 유형 및 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 유형 및 양, 산화 반응 조건, 산화제의 유형 및 양, 황화 반응 조건, 및 황화제의 유형 및 양은 당해 분야에서 다양한 통상의 제제, 양, 및 조건을 채택한다.
일부 구현예에서, 예를 들면, 단계 (2) 및 (3)에서 고체 상 합성은 다음 조건을 사용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 일부 구현예에서, 디클로로아세트산이다. 고체 상 지지체에서 탈보호제 대 보호 그룹 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비는 2:1 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 50:1이다.
커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도를 포함한다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서, 1:5 내지 1:15이다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:100, 및 일부 구현예에서, 1:50 내지 1:80이다. 반응 시간 및 커플링제의 선택은 상기와 동일하다.
캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 및 일부 구현예에서, 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제의 선택은 상기와 동일하다. 캡핑제의 총 양 대 고체상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:100 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 1:10 내지 10:1이다. 캡핑제가 아세트산무수물 및 N-메틸이미다졸을 사용하는 경우에, 아세트산 무수물, N-메틸이미다졸, 및 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1:10 내지 10:10:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:1:2 내지 2:2:1이다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 100초, 및 일부 구현예에서, 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 산화제는 요오드(일부 구현예에서 요오드 수로서 제공됨)이다. 커플링 단계에서 산화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 5:1 내지 50:1이다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 혼합 용매 속에서 수행하며 여기서 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 비는 3:1:1 내지 1:1:3이다. 황화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 50 내지 2,000초, 및 일부 구현예에서, 100 내지 1,000초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 황화제는 크산탄 하이드라이드이다. 커플링 단계에서 황화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 10:1 내지 1,000:1이고, 일부 구현예에서, 10:1 내지 500:1이다. 일부 구현예에서, 황화 반응은 혼합 용매 속에서 수행되며 여기서 아세토니트릴:피리딘의 비는 1:3 내지 3:1이다.
방법은 모든 뉴클레오시드 단량체를 연결한 후 및 어닐링 전에 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계를 포함한다. 단리 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고 일반적으로 고체 상 지지체로부터 합성된 뉴클레오타이드 서열을 절단하는 단계, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거하는 단계, 정제하는 단계, 및 탈염하는 단계를 포함한다.
siRNA의 합성에서 통상의 절단 및 탈보호 방법을 사용하여 고체 상 지지체로부터 합성된 뉴클레오타이드 서열을 절단하고, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거할 수 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체에 연결된 수득되는 뉴클레오타이드 서열을 농축된 수성 암모니아와 접촉시키며; 탈접촉 동안, 그s A46 내지 A54 내 보호 그룹 YCOO-를 하이드록실 그룹으로 전환시키며, 따라서 S1 그룹은 상응하는 M1 그룹으로 전환되어, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제공하고; 여기서 농축된 수성 암모니아는 25 내지 30 wt%의 수성 암모니아일 수 있다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 농축된 수성 암모니아의 양은 0.2 ml/μmol 내지 0.8 ml/μmol일 수 있다.
합성된 뉴클레오타이드 서열 상에 적어도 하나의 2'-TBDMS 보호가 존재하는 경우, 이러한 방법은 고체상 지지체로부터 제거된 뉴클레오타이드 서열을 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드와 접촉시켜 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 여기서, 수득되는 표적 siRNA 서열내 상응하는 뉴클레오타이드는 유리된 2'-하이드록시를 갖는다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 순수한 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드의 양은 0.4 ml/μmol 내지 1.0 ml/μmol이다. 따라서 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 수득될 수 있다.
정제 및 탈염 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산 정제를 NaBr 또는 NaCl의 구배 용출을 사용한 제조 이온 크로마토그래피 정제를 사용하여 수행할 수 있고; 생성물의 수집 및 조합 후, 탈염을 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 수득되는 siRNA 접합체에서, 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비-브릿징 산소 또는 황은 실질적으로 나트륨 이온에 결합하며, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 나트륨 염의 형태로 실질적으로 존재한다. 잘-공지된 이온-교환 방법을 사용할 수 있고, 여기서 나트륨 이온은 수소 이온 및/또는 다른 양이온으로 대체됨으로써, 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 다른 형태를 제공할 수 있다. 양이온은 상술된 바와 같다.
합성 동안, 핵산 서열의 순도 및 분자량을 임의의 시간에 측정하여 합성 품질을 보다 잘 제어할 수 있다. 이러한 측정 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산의 순도는 이온 교환 크로마토그래피로 측정할 수 있고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)으로 측정할 수 있다.
어닐링 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 합성된 센스 가닥(SS 가닥) 및 안티센스 가닥(AS 가닥)을 등몰 비의 주사용 수와 단순 혼합하고, 70 내지 95℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켜 수소 결합을 경유하여 이중 가닥 구조를 형성시킨다. 따라서, 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득할 수 있다.
접합체를 수득한 후, 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 합성된 siRNA 접합체를 또한 수단, 예를 들면, 방법, 예를 들면, 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용한 분자량 검출로 특성화시켜 합성된 siRNA 접합체가 목적한 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 설계된 siRNA 접합체인지, 및 합성된 siRNA의 서열이 목적한 siRNA 서열의 서열인지, 예를 들면, 표 1a 내지 표 1g에 나타낸 서열 중 하나인지를 확인한다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물과 유기 용매 속에서 에스테르화 반응 조건 하에 염기 및 에스테르화 촉매의 존재하에서 접촉시키는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 이온 교환에 의해 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득할 수 있다:
Figure pct00105

화학식 (313)
여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 S1은 각각 상술한 바와 같고;
R6은 화학식 (321)의 R4를 제공하기 위한 그룹이고; 일부 구현예에서, R6은 화학식 (A61)로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00106

여기서 Ri는 질소 골격 상의 N 원자, RkO 및 유리 하이드록시 그룹에 연결할 수 있는 임의의 그룹이고; Rk는 하이드록시 보호 그룹이다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되고, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1) 또는 (C2)으로 나타낸 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
에스테르화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 8 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 에스테르화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 온도 및 20 내지 30시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급부틸 에테르이고, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 하나이고, 일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물이다. 사이클릭 무수물 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
에스테르화 촉매는 에스테르화 반응을 촉매할 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 4-디메틸아미노피리딘일 수 있다. 촉매 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이의 조합일 수 있다. 용해도 및 생성물 안정성을 고려할 때, 염기는 예를 들면, 3급 아민일 수 있다. 일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (313)으로 나타낸 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 10:1이다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 목적한 형태의 카복실산 또는 카복실산 염으로 전환시키는 기능을 제공하며 이온 교환 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. M+ 양이온을 가진 접합 분자는 적합한 이온 교환 용액 및 이온 교환 조건을 사용함으로써 수득할 수 있고, 이는 본원에서 빠져 있다. 일부 구현예에서, 이온 교환 반응은 트리에틸아민 포스페이트 용액을 사용하여 수행하며, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.2 내지 0.8 M이다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.4 내지 0.6 M이고, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 양은 3 내지 6 L/mol이고, 추가의 구현예에서, 4 내지 5 L/mol이다.
화학식 (321)의 화합물은 임의의 적합한 단리 방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피로 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상의 정제: 200 내지 300 메쉬의 실리카 겔 여과기, 디클로로메탄 중 1wt% 트리에틸아민:메탄올 = 100:18 내지 100:20의 구배 용출; 또는 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 여과기, 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 수득하고, 이를 후속 반응에 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 상기 이온 교환 반응에 의해 수득된 생성물을 아미노 또는 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 축합제, 촉합 촉매 및 3급 아민의 존재하에서 추가로 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
고체 상 지지체는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 지지체 중 하나이고, 이들 중 일부는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체는 활성의 하이드록시 또는 아미노 작용 그룹(들)을 함유하는 고체 상 지지체로부터 선택할 수 있고, 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지이다. 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지는 다음의 매개변수를 갖는다: 100 내지 400 메쉬의 입자 크기, 및 0.2 내지 0.5 mmol/g의 표면 아미노 또는 하이드록시 로딩. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 10 내지 400 μmol의 화합물/g의 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 50 μmol/g 내지 200 μmol/g이다.
유기 용매는 임의의 적합한 용매일 수 있거나 당해 분야의 기술자에게 공지된 혼합 용매일 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고; 에테르 용매는 에테르 및/또는 메틸 3급부틸 에테르이고; 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 20 내지 200 L/mol이고, 일부 구현예에서, 50 내지 100 L/mol이다.
일부 구현예에서, 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop), 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(DEPBT) 및/또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 일부 구현예에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 다른 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 수득되는 축합 생성물을 캡핑제 및 아실화 촉매와 유기 용매 속에서 캡핑 반응 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 캡핑 반응을 사용하여 완전히 반응하지 않은 활성 작용 그룹을 제거함으로써, 수속적인 반응에서 불필요한 부산물이 생산되는 것을 피한다. 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃의 반응 온도, 및 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 10시간, 및 일부 구현žŸ에서 3 내지 6시간의 반응 시간를 포함한다. 캡핑제는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 캡핑제일 수 있고, 이는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 캡핑제 1(cap1) 및 캡핑제 2(cap2)로 구성된다. cap1은 N-메틸이미다졸이고, 일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액으로서 제공되고, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:10 내지 1:1이고, 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:1이다. 일부 구현예에서, 피리딘 및 아세노니트릴의 총 용적 대 N-메틸이미다졸의 용적 비는 1:1 내지 10:1, 및 일부 구현예에서, 3:1 내지 7:1이다. cap2는 아세트산 무수물이고, 일부 구현예에서, 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용액으로서 제공되고, 여기서 아세트산 무수물 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:1 내지 1:10, 및 추가의 구현예에서, 1:2 내지 1:6이다.
일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액의 용적 대 화학식 (321)의 화합물의 중량의 비는 5 ml/g 내지 50 ml/g, 및 일부 구현예에서, 15 ml/g 내지 30 ml/g이다. 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용적 대 화학식 (321)의 화합물의 중량의 비는 0.5 ml/g 내지 10 ml/g, 및 일부 구현예에서, 1 ml/g 내지 5 ml/g이다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 등몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 포함한다. 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 10 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 30 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아실화 촉매는 에트테르화 축합 또는 아미드화 축합에 사용될 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 알칼린 헤테로사이클릭 화합물로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 중량 비는 0.001:1 내지 1:1, 및 일부 구현예에서, 0.01:1 내지 0.1:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 분리 방법에 의해 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 유기 용매를 완전히 세척하고 여과하여 반응하지 않은 반응물, 과도한 캡핑제 및 다른 불순물을 제거함으로써 수득할 수 있고, 여기서 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 메탄올로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 접합 분자의 제조 방법은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 포스포로디아미디트와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 추가로 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C3)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도; 1:1 내지 1:50, 예를 들면, 1:5 내지 1:15의 화학식 (313)의 화합물 대 포스포로디아미디트의 몰 비; 1:1 내지 1:100, 예를 들면, 1:50 내지 1:80의 화학식 (313) 대 커플링제의 몰 비; 및 200 내지 3,000초, 예를 들면, 500 내지 1,500초의 반응 시간을 포함한다. 포스포로디아미디트는, 예를 들면, 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀일 수 있고, 이는 상업적으로 이용가능할 수 있거나 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸로부터 선택된 하나 이상, 예를 들면, 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행될 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄로부터 선택된 하나 이상, 예를 들면, 무수 아세토니트릴이다. 화학식 (313)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 예를 들면, 5 내지 20 L/mol이다. 커플링 반응에 의해, 화학식 (313)의 화합물 내 하이드록시 그룹은 포스포로디아미디트와 반응하여 포스포르아미디트 그룹을 형성한다. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있고, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물의 제조 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: 단리된 용매를 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 접촉시킨 다음, 캡핑, 산화, 및 단리하여 화학식 (321)의 화합물을 수득하는 단계(여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹을 포함하고 제2의 작용 그룹은 화학식 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다).
일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 핵산의 고체 상 합성을 위해 당해 분야에 잘 공지된 고체 지지체, 예를 들면, 탈보호된 상업적으로 이용가능한 공통의 고체 상 지지체(NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support, Kinovate Life Sciences, 화학식 (B80)로 나타낸 바와 같음)이다:
Figure pct00107

탈보호 반응은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 온도, 및 30 내지 300초, 예를 들면, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 고체 상 지지체 상의 보호 그룹-DMTr (4,4'-디메톡시트리틸)의 몰 비는 2:1 내지 100:1, 예를 들면, 3:1 내지 50:1이다. 이러한 탈보호를 통해, 반응성의 유리 하이드록시 그룹이 후속적인 커플링 반응을 촉진하기 위해, 고체 상 지지체의 표면 위에 수득한다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기와 같이 선택할 수 있다. 커플링 반응을 통해, 탈보호시 형성된 유리 하이드록시 그룹은 포스포르아미디트 그룹과 반응함으로써, 포스파이트 에스테르 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 예를 들면, 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑 반응은 캡핑제의 존재하에서 수행된다. 캡핑제의 선택 및 양은 상술한 바와 같다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 온도, 및 1 내지 100초, 예를 들면, 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 산화제는, 예를 들면, 요오드(일부 구현예에서, 요오드 수로서 제공됨)이다. 산화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1이고, 예를 들면, 5:1 내지 50:1일 수 있다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 비가 3:1:1 내지 1:1:3인 혼합 용매 속에서 수행된다.
일부 구현예에서, R6은 화학식 (B7) 또는 (B8)의 그룹 중 하나이고:
Figure pct00108

여기서 q2 및 Rk의 정의는 상술한 바와 같다.
이러한 경우에, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음의 제조 방법에 의해 수득할 수 있다: 화학식 (314)으로나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (A-1) 또는 (A-2)로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 아미드화 반응 조건 하에 아미드화 반응용 축합제 및 3급 아민의 존재하에서 접촉시키는 단계 이후에 단리하는 단계:
Figure pct00109

Figure pct00110

여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2, 및 Rk의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 1 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 시간 및 2 내지 16시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 알코올 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 에탄올이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (314)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 3 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응을 위한 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ), 또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이고, 추가의 구현예에서, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온이다. 아미드화 반응용 축합제 대 화학식 (314)로 나타낸 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2.5:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 20:1, 및 일부 구현예에서, 5:1 내지 10:1이다.
화학식 (A-1) 및 (A-2)의 화합물은 임의의 적합한 수단으로 제조할 수 있다. 예를 들면, Rk가 DMTr 그룹인 경우, 화학식 (A-1)의 화합물은 칼슘 글리세레이트를 DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있다. 유사하게, 화학식 (A-2)의 화합물은 3-아미노-1,2-프로판디올을 사이클릭 무수물과 우선 접촉시키고 DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있고, 여기서 사이클릭 무수물은 4 내지 13개의 탄소 원자를 가지고, 일부 구현예에서, 4 내지 8개의 탄소 원자를 가진다. 당해 분야의 기술자는 상이한 사이클릭 무수물의 선택이 화학식 (A-2)의 화합물내 q2에 대한 상이한 값에 상응함을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 사이클릭 무수물이 석신산 무수물인 경우, q2=1이고; 사이클릭 무수물이 글루타르산 무수물인 경우, q2=2이고 등이다.
일부 변형에서, 화학식 (313)의 화합물은 또한 화학식 (314)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 DMTrCl과 순차적으로 반응시켜 제조할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 이러한 변형이 화학식 (313)의 화합물의 구조 및 기능에 영향을 미치지 않을 수 있고 이러한 변형이 상기 방법을 기반으로 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 실현됨을 용이하게 이해할 수 있다.
유사하게, 화학식 (313)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법에 의해 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (313)의 화합물은 증발에 이은 크로마토그래피로 용매를 제거함으로써 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상의 정제: 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 용출 구배를 지닌 200 내지 300 메쉬의 실리카 겔 여과기; 및 (2) 역상 정제: 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출을 지닌 C18 및 C8 역상 여과기. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (313)의 화합물의 조 생성물을 수득하고, 이를 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음의 단계를 포함하는 제조 방법으로 수득할 수 있다: 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 아미드화 반응용 축합제 및 3급 아민의 존재하에서 접촉시키는 단계에 이은 단리 단계:
Figure pct00111

Figure pct00112

여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15의 정의 및 선택사항은 각각 상술된 바와 같다.
화학식 (316)의 화합물은, 예를 들면, 문헌: J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961에 개시된 것일 수 있다. 대안적으로, 화학식 (316)의 화합물은 다양한 방법을 통해 당해 분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 화학식 (316)의 일부 화합물은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제US8106022B2호의 실시예 1에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 축합 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 0.1 내지 24시간의 반응 시간, 및 일부 구현예에서, 10 내지 40℃의 반응 온도 및 0.5 내지 16시간의 반응 시간을 포함한다.
화학식 (314)의 목적한 생성물 화합물의 구조를 고려하여, 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 화학식 (320)에서 n1 및 n3의 합을 기반으로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, n1+n3=3인 경우, 임의의 과도함 없이 완전한 반응을 보증하기 위하여, 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 3.5:1, 및 일부 구현예에서, 3.01:1 내지 3.15:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (320)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol일 수 있다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응용 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴옥시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 또는 1-하이드록시벤조트리아졸이고, 추가의 구현예에서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 및 1-하이드록시벤조트리아졸의 혼합물이고, 여기서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 및 1-하이드록시벤조트리아졸은 등몰량으로 사용된다. 아미드화 반응용 촉 축합제 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 3:1, 및 일부 구현예에서, 1.05:1 내지 1.5:1일 수 있다.
3급 아민은 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민일 수 있고, 일부 구현예에서, N-메틸모르폴린일 수 있다. 3급 아민 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1, 및 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1일 수 있다.
유사하게, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법으로 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발에 이은 크로마토그래피를 통해, 예를 들면, 단리를 위한 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 사용하여 용매를 제거함으로써 단리할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상 정제: 디클로로메탄:메탄올 = 100:5 내지 100:7의 구배 용출을 사용하는 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 여과기; 및 (2) 역상 정제: 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출을 사용하는 C18 및 C8 역상 여과기. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (314)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있고, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
화학식 (320)의 화합물은 상업적으로 이용가능할 수 있거나 공지된 방법을 통해 당해 분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, m1=m2=m3=3이고, n1=1이고, n3=2이고, 각각의 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 H인 경우, 화학식 (320)의 화합물은 Alfa Aesar Inc.로부터 상업적으로 이용가능할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 접합체는 또한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용될 수 있고, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 세부사항에 대해서는, 본 개시내용의 약제학적 조성물의 상기 설명을 참고한다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 접합체의 용도
일부 구현예에서, 본 개시내용은 PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건을 치료 및/또는 방지하기 위한 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건을 방지 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건을 방지 및/또는 치료하기 위한 목적은 본 개시내용의 siRNA 활성 성분을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 RNA 간섭 메카니즘을 통해 달성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건을 방지 및/또는 치료하거나, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건을 방지 및/또는 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 조건은 고콜레스테롤혈청 및, 귀결되는 심혈관 질환, 예를 들면, 죽상경화증, 관상 심장 질환 및 고혈압을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여/투여하다"는 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 본 개시내용의 siRNA 접합체를 목적한 효과를 생산하기 위한 목적한 부위에 적어도 부분적으로 위치시키는 방법 및 경로에 의한, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 대상체의 체내로의 전달을 지칭한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 투여 경로는 국소 투여 및 전신계 투여를 포함한다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 전신 순환과 비교하여 보다 많은 siRNA 접합체의 특수한 부위로의 전달을 야기하는 반면; 전신 투여는 대상체의 기본적인 전신 순환으로 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 전달을 야기한다. 본 개시내용이 고콜레스테롤혈증의 방지 및/또는 치료용 수단을 제공하기 위한 것임을 고려할 때, 일부 구현예에서, 의약을 간으로 전달할 수 있는 투여 방식이 사용된다.
대상체에 대한 투여는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 경구 및 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관내 투여(에어로졸), 폐 투여, 비강 투여, 직장 투여, 및 국소 투여(볼내 투여 및 설하 투여 포함)에 의해 달성될 수 있다. 투여 빈도는 1일, 1주, 격주, 3주, 1개월, 2개월, 4개월, 6개월, 또는 1년마다 1회 이상일 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 또는 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체의 용량은 당해 분야의 통상의 용량일 수 있고, 이는 다양한 매개변수, 특히, 대상체의 연령, 체중 및 성별에 따라 결정될 수 있다. 독성 및 효능은 표준 약제학적 과정, 예를 들면, LD50(집단의 50% 사망을 유발하는 치사 용량), ED50(등급화된 반응에서 최대 반응의 50%를 유발할 수 있고, 실험 대상체의 50%가 정성적인 반응에서 양성 반응을 가지도록 유발할 수 있는 용량), 또는 IC50(등급화된 반응이 1/2까지 억제되는 억제제/약물의 농도)를 측정함으로써, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 측정할 수 있다. 사람에 대한 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타를 기반으로 유도할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체가 예를 들면, 수컷 또는 암컷의 3 내지 5년생의 체중이 2 내지 6 kg인 시노몰구스 원숭이에게 투여된 경우, (i) siRNA 접합체의 경우, 이의 siRNA의 양은 0.001 내지 100 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.01 내지 50 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.05 내지 20 mg/kg의 체중, 다른 구현예에서 0.1 내지 15 mg/kg의 체중, 및 다른 구현예에서 0.1 내지 10 mg/kg의 체중일 수 있고; (ii) siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체로부터 형성된 약제학적 조성물의 경우, 이의 siRNA의 양은 siRNA의 양을 기반으로, 0.001 내지 50 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.01 내지 10 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.05 내지 5 mg/kg의 체중, 및 일부 구현예에서 0.1 내지 3 mg/kg의 체중일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시키는 단계, 및 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포내로 도입시켜, RNA 간섭 메카니즘을 통해 간세포내 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 목적을 실현하는 단계를 포함하여, 간세포내에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 간세포는 간암 세포주(예를 들면, SMMC-7721, HepG2 및 Huh7), 및 단리된 1차 간세포로부터 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 간세포는 HepG2 간암 세포이다.
세포 내에서 PCSK9 유전자의 발현이 본 개시내용의 방법에 의해 억제되는 경우, 본 개시내용의 변형된 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체 중 siRNA의 양은 일반적으로 표적 유전자의 발현을 감소시키고 표적 세포의 표면에서 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM, 또는 0.05 nM 내지 약 5 nM의 세포외 농도를 생성하기에 충분한 양이다. 이러한 국소 농도를 달성하는데 요구되는 양은 다양한 인자, 예를 들면, 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포 층의 수, 전달 경로(국소 또는 전신계) 등으로 변할 것이다. 전달 부위에서 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서의 것보다 유의적으로 더 높을 수 있다.
키트(kit)
본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및 siRNA 접합체 중 적어도 하나를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 용기 속에 변형된 siRNA를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 다른 성분, 예를 들면, 안정화제 또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 변형된 본 개시내용의 siRNA를 제공하기 위한 용기와는 상이한 다른 용기 속에 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 변형된 siRNA와 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 다른 성분(존재하는 경우)을 혼합하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 뿐만 아니라 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체 및/또는 the 접합체, 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제는 임의의 형태, 예를 들면, 액체형, 무수형 또는 동결건조형으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 및 약제학적 조성물 및/또는 접합체 및 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)은 실질적으로 순수하고/하거나 멸균되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 멸균수를 제공할 수 있다.
이후에, 본 개시내용을 실시예로 추가로 나타낼 것이지만, 어떠한 양태에서도 이에 한정되지 않을 것이다.
실시예
달리 명시하지 않는 한, 다음의 실시예에 사용된 시약 및 배양 배지는 모두 상업적으로 이용가능하며 사용된 과정, 예를 들면, 핵산 전기영동 및 실시간 PCR은 모두 문헌: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기술된 방법에 따른다.
본 개시내용에서 합성된 PCSK9 유전자에 대한 siRNA 또는 siRNA 접합체 또는 음성 대조군으로서의 siRNA 또는 siRNA 접합체를 사용하여 세포를 형질감염시킨 경우, LipofectamineTM 2000(Invitrogen)을 형질감염 시약으로서 사용하였다. 구체적인 과정은 제조업자가 제공한 설명서를 참고할 수 있었다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 제공된 시약의 비는 모두 용적 비(v/v)로 계산된다.
모든 실험 데이타는
Figure pct00113
(평균±표준 오차)로 나타내고, 데이타는 Graphpad prism 6.0 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 일원 ANOVA를 분석에 사용하고 터키(Tukey)를 분석 방법으로서 사용하여 그룹 사이의 차이가 유의적인지의 여부를 측정한다. 유의적인 차이가 일원 ANOVA 방법을 사용하여 발견되지 않은 경우, 여기서 전체적인 P<0.05의 경우, T-시험을 2-테일 시험(two-tailed test)을 위해 사용하며; 여기서 p<0.05이고, 2개 그룹 사이에 유의적인 차이는 없다.
제조 실시예 1: 접합체 1의 제조
당해 제조 실시예에서, 표 3에 나타낸 접합체 1을 합성하였고 이의 번호는 L10-siPCSKa1M1S이었다. 이러한 접합체 내 접합된 siRNA는 표 3에서 접합체 1의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열이다.
(1-1) 화합물 L-10의 합성:
화합물 L-10을 다음의 방법에 따라 합성하였다:
Figure pct00114
(1-1-1) GAL-5(접합 분자의 말단 분절)의 합성
Figure pct00115
(1-1-1a) GAL-2의 합성
100.0 g의 GAL-1(N-아세틸-D-갈락토스아민 하이드로클로라이드, CAS 번호: 1772-03-8, NingBo hongxiang bio-chem Co., Ltd.로부터 시판됨, 463.8 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고, 여기에 540 ml의 아세트산 무수물(Enox Inc.로부터 구입, 5565.6 mmol)을 빙수 욕에 가하여 실온에서 1.5시간 동안 교반하에 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 10 L의 빙수에 붓고 감압하에 흡입 여과시켰다. 잔사를 2 L의 물 속에 용해하고 아세토니트릴/톨루엔(아세토니트릴:톨루엔의 v/v 비 = 1:1)의 혼합 용매와 함께 완전히 용해될 때까지 가하였다. 용매를 증발로 제거하여 130.0 g의 생성물 GAL-2를 백색 고체로서 수득하였다.
(1-1-1b) GAL-3의 합성
단계(1-1-1a)에서 수득한 GAL-2(35.1 g, 90.0 mmol)를 213 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 여기에 24.0 g의 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, CAS 번호: 27607-77-8, Macklin Inc.로부터 구입, 108.0 mmol)을 빙수 욕 속에서 질소 대기하에 가하여 실온에서 밤새 반응시켰다.
반응 용액을 희석용 400 ml 디클로로메탄과 함께 가하고, 규조토로 여과하고 1L의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액과 함께 가하고 균일하게 혼합하였다. 유기 상을 단리하였다. 남아있는 수성 상을 각각 300 ml의 디클로로에탄으로 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 세척하였다. 유기 상을 단리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 26.9 g의 생성물 GAL-3을 담황색의 점성 시럽으로 수득하였다.
(1-1-1c) GAL-4의 합성
단계(1-1-1b)에서 수득한 GAL-3(26.9 g, 81.7 mmol)을 136 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 30 g의 무수 4A 분자체 분말에 이어 9.0 g의 5-헥센-1-올(CAS 번호: 821-41-0, Adamas-beta Inc.로부터 구입, 89.9 mmol)과 함께 가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 9.08 g의 TMSOTf(40.9 mmol)를 빙수 욕 속에서 질소 대기 하에 가하여 실온에서 밤새 교반하에 반응시켰다. 4A 분자 체 분말을 여과로 제거하였다. 여액을 희석용의 300 ml의 디클로로에탄과 함께 가하고, 규조토로 여과하고 500 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액과 함께 가하고 세척을 위해 10분 동안 교반하였다. 유기 상을 단리하였다. 수성 상을 300 ml의 디클로로에탄으로 1회 추출하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 추출하였다. 유기 상을 단리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 41.3g의 생성물 GAL-4를 황색 시럽으로서 수득하고, 이를 다음의 산화 반응에서 정제없이 직접 사용하였다.
(1-1-1d) GAL-5의 합성
단계(1-1-1c)에 기술된 방법에 따라 수득된 GAL-4(14.9 g, 34.7 mmol)를 77 ml의 디클로로메탄 및 77 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매 속에 용해하고, 103 ml의 탈이온수 및 29.7 g의 퍼요오드화나트륨(CAS 번호: 7790-28-5, Aladdin Inc.로부터 구입, 138.8 mmol) 각각과 함께 가하고, 빙욕 속에서 10분 동안 교반하였다. 삼염화루테늄(CAS 번호: 14898-67-0, Energy Chemical로부터 이용가능, 238 mg, 1.145 mmol)을 가하여 실온에서 밤새 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 교반 하에 300 ml의 물을 가하여 희석시키고, 포화된 중탄산나트륨을 가하여 pH를 약 7.5로 조절하였다. 유기 상을 단리하고 경사제거하였다. 수성 상을 단리하고 경사제거하였다. 수성 상을 200 ml의 디클로로메탄으로 각각 3회 추출하고, 유기 상을 경사제거하였다. 수성 상을 시트르산 고체를 사용하여 pH를 약 3으로 조절하고 200 ml의 디클로로메탄을 사용하여 각각 3회 추출하고, 수득되는 유기 상을 합하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 6.85 g의 생성물 GAL-5를 백색 발포성 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.01 (br, 1H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07 - 3.95 (m, 3H), 3.92 - 3.85 (m, 1H), 3.74 - 3.67 (m, 1H), 3.48 - 3.39 (m, 1H), 2.20 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55 - 1.45 (m, 4H).
(1-1-2) L-8의 합성
Figure pct00116
J-0(9.886 g, 52.5 mmol, Alfa Aesar Inc.로부터 구입) 및 단계(1-1-1)에서 수득한 GAL-5(72.819 g, 162.75 mmol, 생성물의 수개의 배치를 합하여 수득함)를 525 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 44.782 g, 346.50 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노 포스로늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, 90.158 g, 173.25 mmol) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 23.410 g, 173.25mmol)과 함께 가하여 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 20 ml의 포화된 중탄산나트륨 용액 및 200 ml의 포화된 염수를 가하여 세척하였다. 수성 상을 2회, 각각 100 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 이후에, 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)를 사용하여 정제하였다. 컬럼에 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위한 10 wt% 트리에틸아민을 가하고, 1wt‰ 트리에틸아민으로 평형화하고, 디클로로메탄:메탄올 = 100:25 내지 100:40의 구배 용출로 용출하였다. 용출물을 수집하고, 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 38.8 g의 순수한 생성물 L-8을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.13 - 7.18 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 - 3.98 (m, 9H), 3.88 (dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.66 (m, 3H), 3.44 - 3.38 (m, 3H), 3.17 - 3.30 (m, 4H), 3.10 - 2.97 (m, 4H), 2.35 - 2.20 (m, 6H), 2.15 - 2.08 (m, 9H), 2.07 - 1.98 (m, 13H), 1.94 - 1.87 (m, 9H), 1.81 - 1.74 (m, 9H), 1.65 - 1.42 (m, 18H). MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산치: 1477.59, 실측치: 1477.23.
(1-1-3a) A-1의 합성
Figure pct00117
DMTrCl(4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 101.65 g, 300 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고, 칼슘 DL-글리세레이트 하이드레이트(28.63 g, 100 mmol)와 함께 가하여 45℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 여과하였다. 잔사를 200 ml의 DCM으로 세정하고, 여액을 감압하에 농축 건조시켰다. 잔사를 500 ml의 디클로로메탄 속에 재용해하고 각각 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트(pH = 7-8)로 2회 세척하였다. 수성 상을 각각 200 ml의 디클로로메탄을 사용하여 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하고, 잔사를 정상 상 실리카 겔 컬럼(200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:메탄올 = 1:1:1:0.35 내지 1:1:1:0.55의 구배 용출로 용출하였다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하였다. 잔사를 600 ml의 디클로로메탄 속에 재용해하고, 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 1회 세척하였다. 수성 상을 200 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하고, 잔사를 감압하에 진공 오일 펌프 속에서 밤새 건조시켜 50.7 g의 생성물 A-1을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.28 (m, 7H), 6.89 - 6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 계산치: 407.15, 실측치: 406.92.
(1-1-3b) L-7의 합성
Figure pct00118
단계(1-1-2)에서 수득한 L-8(40 g, 27.09 mmol, 생성물의 수개의 배치를 합하여 수득함) 및 단계(1-1-3a)에서 수득한 A-1(41.418 g, 81.27 mmol)을 합하고 271 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT)(24.318 g, 81.37 mmol)을 가하고, 디이소프로필에틸아민(21.007 g, 162.54 mmol)과 함께 추가로 가하여 교반하에 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 유기 상을 800 ml의 포화된 중탄산나트륨으로 세척하였다. 수성 상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 150 ml의 포화된 염수로 세척하고, 수성 상을 50 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하고, 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증밞 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 밤새 발포-건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용시켰다. 컬럼을 2 kg의 정상 상 실리카 겔(200-300 메쉬)로 채우고, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 200 ml의 트리에틸아민을 가하고, 1 wt% 트리에틸아민을 함유하는 석유 에테르로 평형화시키고, 석유 에테르:에틸아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거함으로써 40.4 g의 순수한 생성물 L-7을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90 - 7.78 (m, 4H), 7.75 - 7.64 (m, 1H), 7.38 - 7.18 (m, 9H), 6.91 - 6.83 (m, 4H), 5.25 - 5.10 (m, 4H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 - 4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93 - 3.84 (m, 3H), 3.76 - 3.66 (m, 9H), 3.45 - 3.35 (m, 3H), 3.24 - 2.98 (m, 10H), 2.30 - 2.20 (m, 2H), 2.11 - 1.88 (m, 31H), 1.80 - 1.40 (m, 28H). MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 계산치: 1564.65, 실측치: 1564.88.
(1-1-4) L-9의 합성
Figure pct00119
단계(1-1-3b)에서 수득한 L-7(40g, 21.4247mmol), 석신산 무수물(4.288g, 42.8494mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 5.235g, 42.8494mmol)을 혼합하고 215 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 13.845g, 107.1235mmol)을 추가로 가하고, 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 수득되는 반응 용액을 800 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성 상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고 감압하에 무수 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용하였다. 컬럼에 1 kg의 정상 상 실리카 겔(200-300 메쉬)을 충전시키고, 1 wt%의 트리에틸아민을 실리카겔의 산도를 중화시키기 위해 가하고, 디클로로메탄으로 평형화시키고, 디클로로메탄:메탄올 = 100:18-100:20 중 1wt‰ 트리에틸아민의 용출 구배로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거함으로써 31.0 g의 조 생성물 L-9 접합 분자를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 3H), 7.41 - 7.29 (m, 5H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 - 5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d, J = 11.1 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd, J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 - 3.65 (m, 9H), 3.50 - 3.39 (m, 6H), 3.11 - 2.90 (m, 5H), 2.61 - 2.54 (m, 4H), 2.47 - 2.41 (m, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 2H), 2.15 - 1.95 (m, 22H), 1.92 - 1.84 (m, 9H), 1.80 - 1.70 (m, 10H), 1.65 - 1.35 (m, 17H), 1.31 - 1.19 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 계산치: 1664.72, 실측치: 1665.03.
(1-1-5) 화합물 L-10의 합성
Figure pct00120
당해 단계에서, 화합물 L-10을 L-9 접합 분자를 고체 상 지지체에 연결시켜 제조하였다.
단계(1-1-4)에서 수득한 L-9 접합 분자(22.751 g, 11 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 6.257 g, 16.5 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.843 g, 22 mmol)을 혼합하고 900 ml의 아세토니트릴 속에 용해하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 수득되는 반응 용액을 아미노메틸 수지(H2NResin, 88 g, 100-200 메쉬, 아미노 로딩: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.로부터 시판됨)와 함께 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃에서 150 rpm/min의 회전 속도로 18시간 동안 수행하였다. 잔사를 2회(각각 300 ml의 DCM) 및 3회(각각 300 ml의 아세토니트릴) 세척하고, 진공 오일 펌프 속에서 18시간 동안 건조시켰다. 이후에, 출발 물질(CapA, CapB, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 아세토니트릴)을 캡핑 반응을 위해 표 2에 나타낸 바와 같은 충전 비에 따라 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃에서 150 rpm/min의 회전 속도로 5시간 동안 수행하였다. 반응액을 여과하였다. 잔사를 각각 300 ml의 아세토니트릴로 3회 세정하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시키고, 잔사를 감압하에 진공 오일 펌프 속에서 밤새 건조시켜 102 g의 화합물 L-10(즉, 고체 상 지지체에 연결된 L-9 접합 분자)을 90.8 μmol/g의 부하(loading)를 사용하여 수득하였다.
[표 2]
Figure pct00121
상기 표에서, 캡(Cap) A 및 캡 B는 캡핑제의 용액이다. 캡 A는 피리딘/아세토니트릴 중 20 용적%의 N-메틸이미다졸의 혼합 용액이고, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 3:5이다. 캡 B는 아세토니트릴 중 20 용적%의 아세트산 무수물의 용액이다.
(1-2) 접합체 1의 센스 가닥의 합성
표 3에서 siRNA의 센스 가닥 접합체 1을 뉴클레오시드 단량체를 하나씩 3' 내지 5' 방향으로 상기 단계에서 제조한 화합물 L-10으로부터의 주기로 출발하여, 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 뉴클레오타이드의 정렬 서열에 따라 센스 가닥으로 합성하였다. 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 환원의 4-단계 반응을 포함하였다. 여기서, 2개의 뉴클레오타이드가 포스포디에스테르 결합을 경유에 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응은 이후의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었고; 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 연결을 경유에 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 황화의 4-단계 반응이 이후의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었다. 합성 조건은 다음과 같다.
뉴클레오시드 단량체를 0.1 M 아세토니트릴 용액 속에 제공한다. 각각의 단계에서 탈보호 반응을 위한 조건은 동일한데, 즉, 25℃의 온도, 70초의 반응 시간, 탈보호 시약으로서 디클로로메탄(3% v/v) 중 디클로로아세트산의 용액, 및 5:1의 디클로로아세트산 대 고체상 지지체 상의 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비이다.
각각의 단계에서 커플링 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 1:10의 고체 상에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비, 1:10의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰비, 1:65의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰 비, 600초의 반응 시간, 커플링 시약으로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)의 0.5 M 아세토니트릴 용액이다.
각각의 단계에서 캡핑 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 캡핑제의 용액으로서 1:1의 몰 비의 캡 A 및 B의 혼합 용액, 및 1:1:1의 캡핑제 대 고체상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비(아세트산 무수물: N-메틸이미다졸: 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열)이다.
각각의 단계에서 산화 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 및 산화제로서 0.05 M 요오드 수; 및 30:1의 요오드 대 커플링 단계에서 고체 상에 연결된 핵산 서열의 몰 비이다. 반응은 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 혼합 용매(3:1:1) 속에서 수행한다.
각각의 단계에서 황화 반응 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 300초의 반응 시간, 및 황화 시약으로서 크산탄 하이브리드; 및 황화 시약 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 120:1의 몰 비를 포함한다. 반응은 아세토니트릴:피리딘의 혼합 용매(1:1) 속에서 수행한다.
마지막 뉴클레오시드 단량체의 연결이 완료된 후, 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열을 절단하고, 탈보호, 정제, 탈염 및 동결건조시켜 센스 가닥을 수득하며, 여기서,
절단 및 탈보호를 위한 조건은 다음과 같다: 지지체에 연결된 합성된 뉴클레오타이드 서열을 25 wt% 수성 암모니아에 가하여 55℃에서 16시간 동안 반응시키고, 여기서 수성 암모니아의 양은 0.5 ml/μmol이다. 남아있는 지지체를 여과로 제거하고, 상층액을 진공 하에 농축 건조시켰다.
정제 및 탈염 조건은 다음과 같다: 핵산의 정제는 NaCl의 구배 용출로 제조 이온 크로마토그래피 정제 컬럼(Source 15Q)을 사용하여 달성한다. 구체적으로, 용출제 A는 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출제 B는 1.5 M 염화나트륨, 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출 구배: 용출제 A:용출제 B = 100:0 내지 50:50이다. 용출물을 수집하고, 합하고 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 탈염시킨다. 구체적인 조건은 탈염용 세파덱스 컬럼(Sephadex column)(여과기: 세파덱스 G25) 및 탈이온수를 사용한 용출이다.
검출 방법은 다음과 같다: 상술한 센스 가닥의 순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 측정하였고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정한 값이 계산된 값으로 확인되었다는 사실은 이의 3' 말단이 l-9 접합 분자에 접합된 센스 가닥 SS가 합성되었음을 나타낸다.
(1-3) 접합체 1의 안티센스 가닥의 합성
표 3에서 접합체 1의 안티센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해, 공통의 고체 상 지지체(UnyLinker™ 로딩된 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)로부터의 주기로 출발하여 합성하였다. 고체 상 합성 방법에서 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 황화, 절단 및 탈보호, 및 정제 및 탈염의 반응 조건은 센스 가닥의 합성과 동일하였다. 이후에, 동결건조를 수행하여 안티센스 가닥을 수득하였다. 안티센스 가닥의 순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 검출하였고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치하였다는 결과는 표적 서열을 가진 안티센스 가닥 AS가 합성되었음을 나타낸다.
(1-4) 접합체 1의 합성
접합체 1의 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 각각 주사용 수에 용해하여 40 mg/mL의 용액을 수득하였다. 이를 등몰 비로 혼합하고, 50℃에서 15분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시켜 어닐링된 생성물을 생산하고, 동결건조시켜 동결건조된 분말을 수득하였다. 접합체를 초 순수 물(18.2MΩ*cm (25℃)의 저항성을 지닌 Milli-Q 초 순수 물 장치(ultra-pure water instrument))를 사용하여 0.2 mg/mL의 농도로 희석시키고, 분자량을 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 장치(Waters Corp.로부터 구입, 모델: LCT Premier)로 측정하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치하였다는 사실은 합성된 접합체 1이 L-9 접합 분자를 진니 설계된 표적 이중 가닥 핵산 서열이었음을 나타낸다. 접합체 1은 화학식 (403)으로 나타낸 구조를 갖는다. 당해 접합체내 접합체된 siRNA는 표 3에 나타낸 바와 같은 접합체 1(또한 L10-siPCSKa1M1S로서 지칭됨)의 서열을 갖는다.
제조 실시예 2: 접합체 2 내지 7의 제조
표 3에 나타낸 바와 같은 접합체 2 내지 7을 합성에 포함된 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열이 표 3에 나타낸 바와 같이 접합체 2, 접합체 3, 접합체 4, 접합체 5, 접합체 6, 또는 접합체 7에서 접합된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 서열이었음을 제외하고는, 제조 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 따라서, 접합체 2 내지 7이 각각 수득되었다. 접합체 2 내지 7을 측정하였다.
[표 3]
Figure pct00122
제조 실시예 3: siRNA 서열의 합성
표 3에 나타낸 바와 같은 SiRNA 1을 다음을 제외하고는 제조 실시예 1에서와 동일한 방법으로 합성하였다:
1) 센스 가닥에 대해, 주기를 공통의 고체 상 지지체(UnyLinker™ 로딩된 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)로부터 출발하였다;
2) 안티센스 가닥에 대해, siRNA 1의 서열은 siRNA의 안티센스 가닥 1이 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드에서 5'-포스페이트를 갖는다는 점에서 접합체 1 내에 접합된 siRNA의 안티센스 가닥의 것과 상이하였다. 따라서, 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 따른 안티센스 가닥의 제조 동안, 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체의 연결 후, 화학식 (CPR-I)의 단량체(Suzhou GenePharma Inc.로부터 제품 번호 13-2601-XX로 구입)를 안티센스 가닥의 5' 말단에 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응으로 연결하여 5'-포스페이트 변형을 형성시켰다.
Figure pct00123
연결 동안, 사용된 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화, 절단 및 탈보호, 정제 및 탈염의 조건은 센스 가닥의 합성시 사용된 것과 동일하였다.
SiRNA 2를 siRNA 2의 합성에 포함된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 표 4에 나타낸 바와 같은 siRNA 2의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열이었음을 제외하고는 siRNA 1에 대한 것과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
SiRNA 3 내지 6을 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 핵산 서열이 표 4에 나타낸 바와 같은 siRNA 3, siRNA 4, siRNA 5 또는 siRNA 6의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열이었고 여기서 이러한 siRNA의 안티센스 가닥은 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드에서 5'-포스페이트 변형을 가졌다는 것을 제외하고는 siRNA 1을 제조하는 것과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 따라서, 5'-포스포로티오에이트 변형을 지닌 안티센스 가닥을 CPR-I 단량체의 연결에서 산화 반응 조건을 황화 조건으로 대체함으로써 제조할 수 있따. 따라서, siRNA 3, siRNA 4, siRNA 5 또는 siRNA 6을 각각 수득하였다.
[표 4]
Figure pct00124
실험 실시예 1 시험관내 psiCHECK 시스템에서 siRNA의 억제 활성 및 오프-표적 효과
당해 실험 실시예에서, 본 개시내용의 siRNA의 온-표적 활성 및 오프-표적 효과를 온-표적 플라스미드의 발현에 대한 siRNA 1 내지 6의 각각의 안티센스 가닥의 억제, 및 시험관내 psiCHECK 시스템에서 오프-표적 플라스미드의 발현에 대한 siRNA의 안티센스 가닥의 씨드 영역 또는 센스 가닥의 씨드 영역의 억제를 평가하였다.
문헌: Kumico Ui-Tei et. al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleics Research, 2008.36(7), 2136-2151에 기술된 방법에 따라서, 검출용 플라스미드를 작제하고 검출된 siRNA를 사용하여 HEK293A 세포 내로 동시-형질감염시키고; 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준에 siRNA의 온-표적 활성 및 오프-표적 효과를 반영시켰다. 구체적인 단계는 다음과 같다:
[1] 검출용 플라스미드의 작제
4개 유형의 검출용 플라스미드를 psiCHECKTM-2(PromegaTM) 플라스미드를 사용하여 작제하였으며, 여기서 GSCM은 온-표적 플라스미드를 나타내고; PSCM, GSSM 및 PSSM은 오프-표적 플라스미드를 나타낸다:
(1) siRNA의 안티센스 가닥의 온-표적 활성을 검출하는데 사용된 GSCM은 검출된 siRNA의 안티센스 가닥의 서열에 대해 완전히 상보성인 영역을 함유하는 표적 서열을 함유하며, 여기서 siRNA 1, 2, 4, 5 및 6에 상응하는 GSCM 내 표적 서열은 서열 번호: 373으로 나타내고:
Figure pct00125
Figure pct00126
siRNA 3에 상응하는 GSCM 내 표적 서열은 서열 번호: 374로 나타낸다:
Figure pct00127
(2) 센스 가닥의 오프-표적 효과를 검출하는데 사용된 PSCM은 검출된 siRNA의 안티센스 가닥과 정확하게 동일한 표적 서열을 함유하고, 여기서 각각의 siRNA에 상응하는 PSCM 내 표적 서열은 표 5a에 나타낸다:
[표 5a]
Figure pct00128
(3) GSSM은 안티센스 가닥의 씨드 영역의 오프-표적 효과를 검출하는데 사용되며, 여기서 각각의 siRNA에 상응하는 GSSM에서 표적 서열은 표 5b에 나타낸다:
[표 5b]
Figure pct00129
(4) PSSM은 센스 가닥의 씨드 영역의 오프-표적 효과를 검출하는데 사용되며, 여기서 각각의 siRNA에 상응하는 PSSM 내 표적 서열은 표 5c에 나타낸다:
[표 5c]
Figure pct00130
상술한 표적 서열의 단일 카피를 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 내로 각각 클로닝하였다.
[2] 세포 배양 및 형질감염
(1) GSCM 및 siRNA 1의 동시-형질감염
HEK293A 세포(Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD로부터 구입)를 10% 태아 소 혈청(FBS, Hyclone company), 및 0.2 vol% 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone company)을 함유하는 H-DMEM 완전 배지(Hyclone company) 속에서 37℃에서 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기 속에서 배양하였다.
HEK293A 세포를 96-웰 플레이트에 8 × 103개의 세포/웰에서 접종하였다. 16시간 후, 세포 성장 밀도는 70 내지 80%에 도달하였다. 이때에, 배양 웰 속의 H-DMEM 완전 배지를 읍입하였다. 80 μl의 Opti-MEM 배지(GIBCO company)를 각각의 웰에 가하고 배양을 1.5 시간 동안 지속하였다.
GSCM 검출 플라스미드를 DEPC 물로 희석하여 200 ng/μl의 검출 플라스미드 작업 용액을 수득하고; siRNA 1을 DEPC 물 속에서 siRNA 작업 용액으로 각각 1000 nM, 333 nM, 111 nM, 37.0 nM, 12.3 nM, 4.12 nM, 1.37 nM, 0.46 nM, 0.15 nM, 0.05 nM 및 0.017 nM의 11개의 상이한 농도에서 제조하였다.
A1 내지 A11 용액을 각각 제조하였다. A1 내지 A11 용액의 각각의 부위는 궁극적으로 상술한 11개 농도 중 하나에서 1 μl의 siRNA 작업 용액, 0.05 μl의 검출 플라스미드 작업 용액(10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
B 용액을 제조하였다. B 용액의 각각의 부위는 0.2 μl의 Lipofectamine™ 2000 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
C 용액을 제조하였다. C 용액의 각각의 부위는 0.05 μl의 검출 플라스미드 작업 용액(10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
B 용액의 하나의 부위를 A1 내지 A11 용액 각각의 하나의 부위 및 C 용액의 하나의 부위와 각각 순차적으로 혼합하였다. 혼합물을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 12개의 형질감염 복합체 X1 내지 X12를 수득하였다. 각각의 형질감염 복합체를 3개 제조하였다.
형질감염 복합체 X1 내지 X11을 각각 배양 웰에 20 μl/웰의 양으로 가하고 균일하게 혼합하고, 동일한 siRNA 농도에서 형질감염 복합체의 3개의 분취량을 각각 3개의 상이한 배양 웰에 가하여 10 nM, 3.33 nM, 1.11 nM, 0.37 nM, 0.123 nM, 0.0412 nM, 0.0137 nM, 0.0046 nM, 0.0015 nM, 0.0005 nM 및 0.00017 nM(시험 그룹 1 내지 11로 기록함)의 최종 siRNA 농도에서 동시-형질감염 혼합물을 수득하였다.
형질감염 복합체 X12를 각각 3개의 다른 배양 웰에 20 μl/웰의 양으로 가하여 siRNA가 없는 형질감염 혼합물(대조군 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
siRNA를 함유하는 공-형질감염 혼합물 및 siRNA가 없는 혼합물을 배양 웰 속에서 4시간 동안 형질감염시킨 후, 각각의 웰에 20% FBS를 함유하는 100 μl의 H-DMEM 완전 배지를 가하였다. 96-웰 플레이트를 CO2 항온처리기에 두고 항온처리를 24시간 동안 지속시켰다.
(2) 다른 siRNA 및 플라스미드의 동시-형질감염.
GSCM 및 siRNA 2 내지 6을, siRNA1을 siRNA 2 내지 6으로 연속적으로 대체하는 것을 제외하고는, GSCM 및 siRNA 1과 동일한 방식으로 동시-형질감염시켰다.
PSCM 및 siRNA 1 내지 6을, GSCM을 PSCM으로 연속적으로 대체하는 것을 제외하고는, GSCM 및 siRNA 1 내지 6과 동일한 방식으로 동시-형질감염시켰다.
GSSM 및 siRNA 1 내지 6을, GSCM을 GSSM으로 연속적으로 대체하는 것을 제외하고는, GSCM 및 siRNA 1 내지 6과 동일한 방식으로 동시-형질감염시켰다.
PSSM 및 siRNA 1 내지 6을, GSCM을 PSSM으로 연속적으로 대체하는 것을 제외하고는, GSCM 및 siRNA 1 내지 6과 동일한 방식으로 동시-형질감염시켰다.
[3] 검출
배양 웰 속의 배지를 흡입하였다. 150 μl의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약과 H-DMEM의 혼합 용액(1:1의 용적 비)를 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 항온처리를 10분 동안 실온에서 수행한 후, 120 μl의 혼합된 용액을 96-웰 ELISA 플레이트로 이전시켰다. ELISA 플레이트의 각각의 웰 속에서 개똥벌래(Fir)의 화학발광성 값을 Synergy II 다중모드 미세플레이트 판독기(multimode microplate reader)(BioTek company) 속에서 판독하였다. 이후에, 60 μl의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리를 수행한 후, ELISA 플레이트의 각각의 웰에서 Renilla(Ren)의 화학발광성 값을 Fir을 판독하기 위한 정렬에 따라 미세플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
ELISA 플레이트의 각각의 웰의 발광성 비(비 = Ren/Fir)를 계산하고, 각각의 시험 그룹 또는 대조군 그룹의 발광성 비(비(시험) 또는 비(대조군))은 3개의 배양 웰의 비의 평균이었다. 참고로서 대조군 그룹의 발광성 비를 사용하여, 각각의 시험 그룹의 발광성 비를 표준화함으로써 비(시험)/비(대조군)의 비 R을 수득하였으며, 이는 발현 수준, 즉, 리포터 유전자 Renilla의 상대적인 잔류 활성을 나타낸다. siRNA의 억제율은 (1-R) x 100%이었다.
log(억제제) 대 반응-가변 기울기(4개의 매개변수) 용량 효과 곡선을 Graphpad 5.0 소프트웨어의 비선형 회귀 분석을 사용하여 상이한 siRNA(siRNA 1, siRNA 2, siRNA 3, siRNA 4, siRNA 5 또는 siRNA 6)로 형질감염한 후 psiCHECK 시스템 내에서 리포터 유전자 Renilla의 상대적인 잔류 활성에 따라 핏팅하였다. 도 1a 내지 1f는 siRNA 1 내지 6 각각의 용량-효과 곡선이고, 여기서 가로좌표는 siRNA의 농도(lg nM)의 대수를 나타내고, 세로좌표는 Renilla의 상대적인 잔류 활성(%)을 나타내고, 각각의 점은 대조군 그룹에 대해 시험 그룹의 3개의 배양 웰에서 Renilla의 상대적인 잔류 활성의 평균을 나타낸다.
GSCM을 표적화하는 시험할 siRNA의 IC50 값을 핏팅된 용량-효과 곡선에 상응하는 함수를 기반으로 계산하였다. 함수는 다음과 같다:
Figure pct00131
여기서:
Y는 비 R, 즉, Renilla의 상대적인 잔류 활성(%)이고,
X는 형질감염된 siRNA의 농도의 대수이고,
Bot는 정상 상태의 하단에서 Y 값이고,
Top는 정상 상태의 상단에서 Y 값이고,
X'는 Y가 상한과 하한 사이의 중간 값인 X 값이고,
HillSlope는 X'에서 곡선의 기울기이다.
Y가 50%인 경우 상응하는 X50 값은 용량-효과 곡선 및 상응하는 함수를 기반으로 측정하였다. 각각의 siRNA의 IC50 값을 계산하였다(IC50 값 = 10^X50 (nM)). IC50 값 및 R2 값을 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00132
표 6 및 도 1a 내지 도 1f는 본 개시내용의 siRNA가 0.0194 nM 내지 0.0561 nM의 범위의 IC50 값으로 시험관내 HEK293A 세포내에서 비교적 높은 억제 활성을 나타내었음을 나타낸다.
이의 상응하는 PSCM, GSSM 및 PSSM에 대한 siRNA 1 내지 6의 용량-효과 곡선을, GSCM을 PSCM, GSSM 및 PSSM로 각각 대체하는 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법을 사용하여 차례로 수득하였다. 결과는 각각의 농도에서 각각의 siRNA가 이의 상응하는 오프-표적 플라스미드 PSCM, GSSM 및 PSSM에서 억제 효과를 가지지 않음을 나타낸다.
상기 결과는 본 개시내용의 siRNA가 양호한 효적화 특이성을 가지며, 센스 가닥, 안티센스 가닥의 씨드 영역 및 센스 가닥의 씨드 영역이 명백한 오프-표적 효과를 가지지 않음을 나타낸다.
실험 실시예 2 비-사람 영장류(NHP)에서 siRNA 접합체의 효능의 평가
3 내지 4년생의 일반적인 시노몰구스 원숭이(체중: 2.4 내지 3.1 kg)를 이의 체중에 따라 2개 그룹으로 나누었다. 이의 1/2이 수컷인, 4 마리의 시노몰구스 원숭이의 각각의 그룹에게 접합체 4 또는 5 각각을 단일 피하 주사하였다.
4 내지 5년생의 일반적인 시노몰구스 원숭이(체중: 4.0 내지 5.5 kg)를 이의 체중에 따라 3개 그룹으로 나누었다. 이의 모두가 수컷인, 3마리의 시노몰구스 원숭이 각각의 그룹에게 접합체 1, 2 또는 7 각각의 단일 피하 주사를 주사하였다.
각각의 접합체를 멸균 염화나트륨 주사를 사용하여 9 mg/ml(siRNA를 기반으로 함; 이후 동일하게 적용) 용액을 제조하였다. 각각의 동물에게 투여된 용적은 1ml/kg이고, 투여 용량은 9 mg/kg이었다. 투여 전 일 수 n은 D-n으로 정의하였고, 투여일은 D1으로 정의하였고, 투여 후 n번째 일은 Dn으로 정의하였다.
(2-1) 간 조직에서 PCSK9 mRNA의 검출
D-7 및 D15에, 간 천공(liver puncture)을 접합체 1, 접합체 2, 접합체 4, 접합체 5 또는 접합체 7가 각각의 그룹에서 투여된 시노몰구스 원숭이에서 각각 수행하였다. 각각의 시간에, 약 2×2×8 mm3로 측정된 간 조직을 수집하고, 1ml의 RNAlater 보존 용액(Sigma Aldrich company)을 함유하는 1.5mL의 멸균 EP 튜브에 저장하였다. 4℃에서 24시간 동안 냉장고에 둔 후, 이를 저장을 위해 -80℃로 이전시켰다.
이후에, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 이후에, 간 조직의 총 RNA를 추출하고 트리졸(Thermo Fisher company)로 설명서에서 총 RNA 추출을 위한 과정에 따라 수득하였다.
각각의 동물의 간 조직으로부터 추출된 총 RNA에 대해 1 μg의 총 RNA를 역 전사용 주형으로서 취하고, GoldenstarTM 올리고(Oligo(dT)17을 프라이머로서 수득한 역 전사 키트 GoldenstarTM RT6 cDNA 합성 키트(Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd.에서 구입, 제품 번호 TSK301M) 속에 제공된 시약을 사용하여20 μl의 역 전사 반응 시스템을 키트의 설명서에서 역 전사용 과정에 따라 제조하였다. 상술한 간 조직 각각의 총 RNA를 역 전사시켰다. 역 전사를 위한 조건은 다음과 같았다: 각각의 역 전사 반응 시스템을 두고 50℃에서 50분 동안 항온처리한 다음 85℃에서 5분 동안 항온처리하고, 최종적으로 4℃에서 30초 동안 항온처리하고; 반응이 완료된 후, 80 μl의 DEPC 물을 각각의 역 전사 반응 시스템에 가하여 cDNA-함유 용액을 수득하였다.
각각의 역 전사 반응 시스템에 대해, qPCR용 주형으로서 5 μl의 전술한 cDNA-함유 용액, 및 NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus 키트(Novoprotein Scientific Co., Ltd.로부터 구입, 제품 번호 E096-01B) 속에 제공된 시약을 사용하여 20 μl의 qPCR 반응 시스템을 제조하였으며, 여기서 PCR 프라이머의 서열을 표적 유전자 PCSK9를 증폭시키는데 사용하였고 내부 대조군 유전자 GAPDH는 표 7에 나타내며, 각각의 프라이머의 최종 농도는 0.25 μM이다. 각각의 qPCR 반응 시스템을 ABI StepOnePlus 실시간(Real-Time) PCR 장치에 두고, 3-단계 방법을 사용하여 증폭시켰다. 증폭 과정은 95℃에서 1-분 동안 예비-변성, 95℃에서 30초 동안 변형, 및 60℃에서 30초 동안 어닐링에 이어, 72℃에서 30초 동안 연장으로 이루어졌다. 상술한 변성, 어닐링, 및 연장을 40회 반복한 후, 증폭된 표적 유전자 PCSK9 및 내부 대조군 유전자 GAPDH를 함유하는 생성물 W를 수득하였다. 생성물 W를 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 및 95℃에서 15초 동안 항온처리하였다. 생성물 W에서 표적 유전자 PCSK9 및 내부 대조군 유전자 GAPDH의 용융 곡선을 각각 실시간 형광성 정량적 PCR 장치를 사용하여 수집하고 표적 유전자 PCSK9 및 내부 대조군 유전자 GAPDH의 Ct 값을 수득하였다.
[표 7]
Figure pct00133
D15 및 D-7 표적 유전자 PCSK9의 발현 수준의 상대적인 정량적 계산을 비교 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여 수행하였다. 계산 방법은 다음과 같다:
Figure pct00134
여기서 ΔCt(D-7 평균)은 투여 전 각각의 동물의 ΔCt(D-7)의 산술 평균이다. 따라서, 각각의 동물은 ΔΔCt(D15) 및 ΔΔCt(D-7)에 상응한다.
동물에서 D15의 PCSK9 mRNA의 발현 수준을 당해 동물의 D-7을 기반으로 표준화하였으며, 여기서 D-7의 PCSK9 mRNA의 발현 수준은 100%로 정의하였다;
PCSK9 mRNA의 상대적인 발현 수준 = 2^(-ΔΔCt(D15)) x 100%;
PCSK9 mRNA에 대한 접합체의 억제율 = (1-2^(-ΔΔCt(D15))) x 100%.
이의 동물에게 동일한 접합체를 제공한 그룹의 경우, PCSK9 mRNA에 대한 접합체의 억제율은 당해 그룹의 모든 동물에서의 억제율의 산술 평균이었다.
표 8은 간 PCSK9 mRNA에 대한 각각의 접합체의 억제율을 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00135
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 9 mg/kg의 단일 투여 후, 모든 siRNA 접합체는 투여 7일전과 비교하여 투여 후 15일째에 PCSK9 mRNA에 대해 56% 이상의 억제율을 나타내었고, 여기서 접합체 1 및 접합체 4는 NHP 간 조직내 PCSK9 mRNA에 대해 각각 79% 및 81%의 억제율을 나타내었다.
(2-2) 혈청 속에서 PCSK9 단백질 함량의 검출
접합체 4가 투여된 NHP의 경우, 정맥 혈액 수집을 투여 전 D-15, 및 D-9 및 D1에 수행하고, 정맥 혈액 수집을 투여 후 D3, D8, D14, D22, 및 D29 각각에서 수행하였다. 혈액 수집을 D127까지 18주 동안 매주 수행하였다.
접합체 1 또는 7이 투여된 NHP이 경우, 정맥 혈액 수집을 D-14, 및 투여 전 D-7 및 D1 각각에 수행하고, 정맥 혈액 수집을 투여 후 D4, D8, D15, D22, 및 D29 각각에 수행하여 수집하였다. 혈액 수집은 이후 D85까지 12주 동안 매주 수행하였ㄷ.
혈청을 실온에서 수집된 혈액 샘플 각각으로부터 분리하였다.
(2-2-1) 접합체 4가 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 PCSK9 단백질 함량의 검출
접합체 4의 투여 후 D-9, D8, D14, D85, D92, D99, D106 및 D120에 수집한 혈청을 선택하고, 각각의 시점에서 수득한 전술한 혈청을 Calibrator Diluent RD5P(1:5 희석) 시약으로 사람 프로단백질 컨버타제 9/PCSK9 Quantikine ELISA 키트(R&D Systems company, 미국 제품 번호 DPC900) 속에서 25배 희석시키고, 450 nm에서 각각의 희석된 혈청의 흡광도를 완전 자동 마이크로플레이트 판독기(SYNERGYTM MX, Biotek company)를 사용하여 키트의 설명서에서의 과정에 따라 검출하였다. 키트내 표준물의 각각의 희석 농도 및 이의 상응하는 흡광도 값에 따라서, 표준 곡선을 Graphpad 5.0 소프트웨어의 선형 회귀 함수를 사용하여 플롯팅하고, 상응하는 선형 방정식을 수득하였다: Y = aX + b, 여기서 a는 핏팅된 직선의 기울기이고, b는 X가 0인 경우 상응하는 Y 값(y 절편)이다. 희석된 혈청 속의 PCSK9 단백질 함량은 각각의 혈청의 측정된 흡광도 값을 상기 방정식내로 적용시켜 계산하였다. 각각의 시점에서 수득된 혈청 속의 PCSK9 단백질 함량을 희석 배수에 따라 수득할 수 있다.
표준화된 PCSK9 단백질 수준 = (투여 후 PCSK9 단백질 함량/투여 전 PCSK9 단백질 함량)
PCSK9 단백질의 발현에 대한 억제율 =(투여 후 1-PCSK9 단백질 함량/투여 전 PCSK9 단백질 함량)×100%;
여기서 투여 전 PCSK9 단백질 함량은 D-9의 PCSK9 단백질 함량이다.
투여 후 각각의 시점에서 PCSK9 단백질 함량을 투여 전 PCSK9 단백질 함량을 기준으로 표준화하였고; 투여 전 PCSK9 단백질 수준은 100%로 정의하였고, 도 2에서 D0로 나타내며; 시노몰구스 원숭이에게 9 mg/kg의 접합체 4의 단일 피하 주사를 제공한 후, 상이한 시점에서 혈청 속의 표준화된 PCSK9 단백질 수준을 도 2에 나타낸다.
(2-2-2) 접합체 1 또는 7이 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 PCSK9 단백질 함량의 검출
접합체 1 또는 7이 제공된 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 함량을, (1) D-14, D-7, D8, D15, D22, D29, D36, D43, D50, D57, D64 및 D85의 혈청을 선택하고; (2) 투여 전 PCSK9 단백질 함량이 D-14 및 D-7의 2개의 PCSK9 단백질 함량의 산술 평균이었던 것을 제외하고는, (2-2-1)에서와 유사한 방법을 사용하여 검출하였다. 시노몰구스 원숭이에게 9mg/kg의 접합체 1 또는 7의,단일 피하 주사를 제공한 후, 상이한 시점에서 수득한 표준호된 PCSK9 단백질 수준을 도 2에 나타낸다.
도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 단일 투여 후 14일 째에, 접합체 4는 NHP 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 발현에 대해 90% 이상의 억제율을 나타내었고, 투여 후 12주까지 PCSK9 단백질의 발현에 대해 50% 이상의 억제율을 유지하였다.
접합체 7의 경우, 단일 투여 후 22일째에, 이는 NHP 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 발현에 대해 82%의 억제율을 나타내었고, 투여 후 9주까지 PCSK9 단백질의 발현에 대해 66% 이상의 억제율을 유지하였다.
접합체 1의 경우, 단일 투여 후 15일 째에, 이는 NHP 혈청 속에서 PCSK9 단백질의 발현에 대해 83%의 억제율을 나타내었고 투여 후 7주까지 PCSK9 단백질의 발현에 대해 65% 이상의 억제율을 유지하였다.
(2-3) 혈청 속에서 혈액 지질(LDL-c 및 CHO) 함량의 검출
(2-3-1) 접합체 4가 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 혈액 지질(LDL-c 및 CHO) 함량의 검출
(2-2)에서 접합체 4의 투여 후 각각의 시점에서 수득한 혈청을 선택하고, 각각의 시점에서 수득한 혈청 속의 혈액 지질(LDL-c 또는 CHO) 함량을 완전 자동 생화학 분석기(Hitachi 7060)로 LDL-C 검정 키트(DENUO CH7538, Shanghai Zhicheng Biotechnology Co., Ltd.) 또는 CHOL 검정 키트(DENUO CH7532, Shanghai Zhicheng Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하여 이의 설명서에서의 과정에 따라 측정하였다.
표준화된 혈액 지질 수준 = (투여 후 혈액 지질 함량/투여 전 혈액 지질 함량) x 100%.
혈액 지질에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 혈액 지질 함량/투여 전 혈액 지질 함량) x 100%.
여기서, 투여 전 혈액 지질 함량은 투여 전 D-15, D-9 및 D1의 3개의 혈액 지질 함량의 산술 평균이고; 혈액 지질은 LDL-c 또는 CHO를 지칭한다.
투여 후 각각의 시점에서 혈액 지질 함량을 투여 전 혈액 지질 함량을 기반으로 표준화하였고, 투여 전 혈액 지질 수준을 100%로 정의하였으며, 도 3 및 도 4에서 D0로 나타낸다.
시노몰구스 원숭이에게 9 mg/kg의 접합체 4를 단일 피하 주사한 후, 상이한 시점에서 혈청 중 표준화된 LDL-c 수준 및 표준화된 CHO 수준을 도 3 및 도 4에 각각 나타낸다.
(2-3-2) 접합체 7이 투여된 시노몰구스 원수이의 혈청 속에서 혈액 지질 (LDL-c 및 CHO) 함량의 측정
접합체 7이 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 혈액 지질(LDL-c 및 CHO)의 함량을 (1) (2-2)에서 접합체 7의 투여 후 각각의 시점에서 수득한 혈청을 혈액 지질의 검출을 위해 선택하고; (2) 투여 전 혈액 지질의 함량을 투여 전 D-14, D-7 및 D1의 3개의 혈액 지질 함량의 산술 평균이었던 것을 제외하고는 (2-3-1)에서와 동일한 방법을 사용하여 검출하였다. 시노몰구스 원숭이에게 9mg/kg의 접합체 7을 단일 피하 주사로 제공한 후, 상이한 시점에서 수득한 혈청 속의 표준화된 LDL-c 수준 및 표준화된 CHO 수준을 ㄷ 3 및 도 4에 각각 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 단일 투여 후 14일째로부터, 접합체 4는 LDL-c에서 유의적인 억제 효과를 나타내었다. 투여 후 22일째에, 접합체 4는 LDL-c에 대해 64%까지의 억제율을 나타내었다. 접합체 4는 투여 후 2주 내지 11주째에 LDL-c에 대해 50% 이상의 억제율을 유지하였다. 접합체 4가 투여된 NHP의 혈청 속에서 LDL-c 수준은 127일의 관찰 기간에 걸쳐 투여 전보다 지속적으로 더 낮았다.
접합체 7에서, 단일 투여 후 22일째에, 접합체 7은 LDL-c에 대해 36%의 억제율을 나타내었다. 접합체 7은 투여 후 2주 내지 4주째에 LDL-c에 대해 약 30%의 억제율을 유지하였다. 접합체 7이 투여된 NHP의 혈청 속에서 LDL-c 수준은 11주의 관찰 기간에 걸쳐 투여 전의 것보다 연속적으로 더 낮았다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 단일 투여 후 14일째로부터, 접합체 4는 또한 CHO에서 유의적인 억제 효과를 나타내었다. 투여 후 22일째에, 접합체 4는 CHO에 대해 38% 까지의 억제율을 나타내었다. 접합체 4는 투여 후 2주 내지 8주째에 CHO에 대해 30% 이상의 억제율을 유지하였다. 접합체 4가 투여된 NHP의 혈청 중 CHO 수준은 127일의 관찰 기간에 걸쳐 투여 전의 것보다 연속적으로 더 낮았다.
접합체 7에 대해, 단일 투여 후 22일 째에, 접합체 7은 CHO에 대해 38%의 억제율을 나타내었다. 접합체 7은 투여 후 2주 내지 8주째에 CHO에 대해 기본적으로 30% 이상의 억제율을 유자하였다. 접합체 7이 투여된 NHP의 혈청 속에서 CHO 수준은 11주의 관찰 기간에 걸쳐 투여 전의 것보다 연속적으로 더 낮았다.
(2-4) 간 천공 전 및 후에 혈액 경로 및 응고 기능 시험
간 천공 전 및 후에, 접합체 4 또는 5가 투여된 동물을 정맥내 혈액 샘플링에 적용하였다. 혈액 경로 및 응고 기능을 전 자동의 5개 분류 혈액학 분석기((ADVIA 2120/ADVIA 2120i, Siemens company, 독일) 및 전자동 혈액 응고 분석기(CA-7000/CS-2000i, Sysmex company, 일본)를 각각 사용하여 검출하였다. 결과는 각각의 접합체가 투여 전과 비교하여, 혈액 경로 및 응고 기능에서 유의적인 효과를 가지지 않음을 나타내며, 이는 본 개시내용의 siRNA 접합체가 양호한 생물학적 안전성을 가짐을 나타낸다.
실험 실시예 3 랫트 및 마우스에서 siRNA 접합체의 독성의 평가
당해 실험 실시예에서, 작은 동물에서 본 개시내용의 siRNA 접합체에 대한 독성 반응을 접합체 1, 4 또는 7을 제공한 랫트 또는 마우스에서 임상 독성 반응을 관찰하고, 간 중량, 혈액 경로, 혈액 생화학, 혈액 지질 및 다른 지표를 검출하고, 육안 해부학 및 조직병리학적 실험을 수행함으로써 평가하였다.
(3-1) 랫트에서 독성의 평가
(3-1-1) 접합체 1 또는 4가 투여된 SD 랫트에서 독성 시험
모두 수컷인, 6 내지 9주령 및 210 내지 250 g으로 칭량된 SPF 등급 SD 랫트(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로터 구매, 생산 허가 번호: SCXK (Beijing) 2016-0011 또는 SCXK (Beijing) 2016-0006)를 이의 체중에 따라 각각의 그룹에서 5마리의 랫트로 3개 그룹으로 나누었다. 랫트에게 접합체 1, 접합체 4 또는 1xPBS(pH 7.4) 대조군을 각각 피하 주사하였다. 접합체의 투여량을 체중을 기반으로 계산하였다. 각각의 접합체을 1xPBS(pH 7.4)를 사용하여 60 mg/ml의 용액으로 제조하였고, 투여 용적은 5 ml/kg이었고, 투여 용량은 300 mg/kg이었다.
단일 피하 투여 후, 다음의 지표를 검출하였다:
(1) 일반적인 상태의 관찰: 전반작인 상태의 관찰은 1일당 2회 수행하였다;
(2) 체중: 체중을 투여 전 D1, 투여 후 D3, D6, D10 및 D14, 및 D15(절개가 수행된 경우)에 수행하였다.
(3) 사료 섭취: 사료 섭취를 D2-3, D6-7 및 D12-13 각각에 측정하였다.
(4) 혈액학: 절개 D15에, 1.9 ml의 혈액을 랫트의 복부 대동맥으로부터 수집하였고, 여기서 1.0 ml의 혈액을 EDTA-K2로 항응고처리하고, 전체 혈액을 직접 주사하여 다음의 세포학적 지표: 적혈구 수(RBC), 백혈구 수(WBC), 혈소판 수(PLT), 헤모글로빈(HGB), 헤마토크릿(hematocrit)(HCT), 평균 혈구 용적(mean corpuscular volume)(MCV), 평균 혈구 혈색소(mean corpuscular hemoglobin)(MCH), 평균 혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration)(MCHC), 망상적혈구 수(reticulocyte count)(RET), 망상적혈구의 퍼센트(percentage of reticulocyte)(RET%), 호중구의 수 및 퍼센트(NEU), 림프구의 수 및 퍼센트(LYM), 단핵구의 수 및 퍼센트(MONO), 호산구의 수 및 퍼센트(EOS), 및 호중구의 수 및 퍼센트(BASO)를 검출하고; 나머지 0.9 ml의 혈액 샘플을 시트르산나트륨으로 항응고시키고 1800xg에서 15℃ 내지 25℃에서 10분 동안 원심분리하고 혈액 응고 시간을 검출하기 위해 사용된 혈장을 분리하였다(프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬빈 시간(activated partial thrombin time)(APTT));
(5) 혈액 생화학: 투여 후, 0.6 ml의 혈액을 D2에 랫트의 경정맥으로부터 수집하고, 3 ml의 혈액을 절개 전 D15에 랫트의 복부 대동맥으로부터 수집하고; 이들 모두 항응고되지 않았던, 혈액 샘플을 1800xg에서 15℃ 내지 25℃에서 10분 동안 원심분리하고 혈청을 알칼린 포스파타제(ALP), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 크레아틴 키나제(CK), 락테이트 데하이드로게나제(LDH), γ-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT), 우레아(Urea), 크레아티닌(Crea), 나트륨 이온 농도(Na+), 칼륨 이온 농도(K+), 클로라이드 이온(Cl-), 혈당(GLU), 총 빌리루빈(TBIL), 총 단백질(TP), 알부민(ALB) 및 알부민/글로불린 비(A/G)를 측정하기 위해 분리하였다.
(6) 육안 해부학 및 조직병리학적 실험: 동물을 D15에 절개하고, 각각의 기관을 칭량하고, 조직병리학적 실험을 수행하였다.
(3-1-2) 접합체 7이 투여된 SD 랫트에서의 독성 시험
접합체 7이 투여된 SD 랫트에서 독성을, 접합체 4를 접합체 7로 대체하고; 접합체 7을 1xPBS(pH 7.4)를 사용하여 20 mg/ml 용액 및 6 mg/ml의 용액 각각으로 제조하고; 투여 용적이 5 ml/kg이었고, 투여 용량이 각각 100 mg/kg 및 30 mg/kg이었음을 제외하고는, (3-1-1)와 동일한 방법을 사용하여 검출하였다. 혈액 생화학의 지표(5)의 경우, 혈액을 투여 후 절개 전 D8 및 D15 각각에 수집하였다.
결과는 접합체 어느 것도 랫트에서 명백한 독성을 나타내지 않았음을 나타낸다.
(3-2) 마우스에서 독성의 평가
5 내지 6주령의 이의 1/2이 수컷이 10마리의 SPF 등급 ICR 마우스(SPF (Beijing) biotechnology co., LTD.로부터 구입)에게 접합체 1, 접합체 4 또는 접합체 7을 피하 주사하였다. 투여는 연속 2주 동안 주당 1회, 총 3회(각각 D1, D8 및 D15) 수행하였다. 접합체의 투여량은 체중을 기반으로 계산하였다. 각각의 접합체를 1xPBS(pH 7.4)를 사용하여 30 mg/ml 용액으로 제조하고, 투여 용적은 10 ml/kg이었고, 투여 용량은 300 mg/kg이었다.
투여를 3회 수행한 후, 다음의 지표를 검출하였다:
(1) 일반적인 상태의 관찰: 일반 상태의 관찰은 1일당 1회 수행하였다;
(2) 체중: 체중을 투여 전 D1, D8 및 D15, 및 투여 전 및 D16(절개가 수행된 경우)에 수행하였다.
(3) 사료 섭취: 사료 섭취를 매주 측정하였다.
(4) 혈액 생화학: D16에 절개를 수행하는 경우, 1 ml의 혈액을 안구를 제거하여 수집하였고, 항응고되지 않앗고; 혈액을 우선 37℃에서 60분 동안 항온처리한 다음 4℃에서 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈액 생화학적 측정을 위한 혈청을 수득하였고; 시험 지표는 랫트 독성 시험에서 혈액 생화학적 지표와 동일하였다.
(6) 육안 해부학 및 조직병리학적 실험: 동물을 D16에 절개하고, 각각의 기관을 칭량하고, 조직병리학적 실험을 수행하였다.
결과는 응집체가 마우스내에서 명백한 독성을 나타내지 않았음을 나타낸다.
상기 결과는 본 개시내용의 접합체가 양호한 생물학적 안전성을 가짐을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 구현예를 상기에 상세히 기술하지만, 본 개시내용은 상기 구현예의 구체적인 세부사항에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 기술적 해결책에 대한 다양한 단순 변화가 본 개시내용의 기술적 개념의 범위내에서 이루어질 수 있으며 이러한 단순한 변화는 본 개시내용의 영역 내에 있다.
상기 구현에에 기술된 구체적인 기술적 특징 각각은 모순이 유발되지 않는 한 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음을 주목해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위하여, 다양한 조합 방식은 본 개시내용에서 더 이상 기술되지 않는다.
또한, 본 개시내용의 다양한 상이한 구현예는 본 개시내용의 개념으로부터 벗어나지 않는 한 조합될 수 있고, 이는 또한 본 개시내용으로 고려되어야 한다.
Sequence Listing <110> SU ZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO.,LTD <120> NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONJUGATE, PREPARATION METHOD, AND USE <130> FP1200369P <150> 201910431319.2 <151> 2019-05-22 <150> 201910433243.7 <151> 2019-05-23 <160> 426 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 aagcaagcag acauuuaun 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 gauaaauguc ugcuugcuu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 aagcaagcag acauuuaun 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 nauaaauguc ugcuugcuu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 aagcaagcag acauuuaun 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 nauaaauguc ugcuugcuug g 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 ccaagcaagc agacauuuau n 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Sequence <220> <223> siRNA <400> 91 guuuuguagc auuuuuauua a 21 <210> 92 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 92 uuaauaaaaa ugcuacaaaa ccc 23 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 93 guuuuguagc auuuuuauua a 21 <210> 94 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 94 uuaauaaaaa ugcuacaaaa ccc 23 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 95 guuuuguagc auuuuuauua a 21 <210> 96 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 96 uuaauaaaaa ugcuacaaaa ccc 23 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 97 uuuguagcau uuuuauuaa 19 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 98 uuaauaaaaa ugcuacaaaa c 21 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 99 uuuguagcau uuuuauuaa 19 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 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<223> siRNA <400> 346 uuuuauuuua aaaagucacc aua 23 <210> 347 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 347 uggugacuuu uuaaaauaaa a 21 <210> 348 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 348 uuuuauuuua aaaagucacc aua 23 <210> 349 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 349 gugacuuuuu aaaauaaaa 19 <210> 350 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 350 uuuuauuuua aaaagucacc a 21 <210> 351 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 351 gugacuuuuu aaaauaaaa 19 <210> 352 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 352 uuuuauuuua aaaagucacc a 21 <210> 353 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 353 gugacuuuuu aaaauaaaa 19 <210> 354 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 354 uuuuauuuua aaaagucacc a 21 <210> 355 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 355 uggugacuuu uuaaaauaaa a 21 <210> 356 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 356 uuuuauuuua aaaagucacc aua 23 <210> 357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 357 uggugacuuu uuaaaauaaa a 21 <210> 358 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 358 uuuuauuuua aaaagucacc aua 23 <210> 359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 359 uggugacuuu uuaaaauaaa a 21 <210> 360 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 360 uuuuauuuua aaaagucacc aua 23 <210> 361 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 361 aagcaagcag acauuuauc 19 <210> 362 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 362 gauaaauguc ugcuugcuug g 21 <210> 363 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 363 uuuguagcau uuuuauuaa 19 <210> 364 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 364 uuaauaaaaa ugcuacaaaa c 21 <210> 365 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 365 gccuggaguu uauucggaa 19 <210> 366 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 366 uuccgaauaa acuccaggcc u 21 <210> 367 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 367 cuguuuugcu uuuguaacu 19 <210> 368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 368 aguuacaaaa gcaaaacagg u 21 <210> 369 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 369 gguuuuguag cauuuuuau 19 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 370 auaaaaaugc uacaaaaccc a 21 <210> 371 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 371 gugacuuuuu aaaauaaaa 19 <210> 372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 372 uuuuauuuua aaaagucacc a 21 <210> 373 <211> 491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 373 ggcgtgcctg ccaagctcac acagcaggaa ctgagccaga aacgcagatt gggctggctc 60 tgaagccaag cctcttctta cttcacccgg ctgggctcct catttttacg ggtaacagtg 120 aggctgggaa ggggaacaca gaccaggaag ctcggtgagt gatggcagaa cgatgcctgc 180 aggcatggaa ctttttccgt tatcacccag gcctgattca ctggcctggc ggagatgctt 240 ctaaggcatg gtcgggggag agggccaaca actgtccctc cttgagcacc agccccaccc 300 aagcaagcag acatttatct tttgggtctg tcctctctgt tgccttttta cagccaactt 360 ttctagacct gttttgcttt tgtaacttga agatatttat tctgggtttt gtagcatttt 420 tattaatatg gtgacttttt aaaataaaaa caaacaaacg ttgtcctaac aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa a 491 <210> 374 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 374 gcgtggccaa gggtgccagc atgcgcagcc tgcgcgtgct caactgccaa gggaagggca 60 cggttagcgg caccctcata ggcctggagt ttattcggaa aagccagctg gtccagcctg 120 tggggccact ggtggtgctg ctgcccctgg cgggtgggta cagccgcgtc ctcaacgccg 180 cctgccagcg cctggcgagg gctggggtcg tgctggtcac cgctgccggc aacttccggg 240 acgatgcctg cctctactcc ccagcctcag ctcccgaggt catcacagtt ggggccacca 300 atgcccaaga ccagccggtg accctgggga ctttggggac caactttggc cgctgtgtgg 360 acctctttgc cccaggggag gacatcattg gtgcctccag cgactgcagc acctgctttg 420 tgtcacagag tgggacatca caggctgctg cccacgtggc tggcattgca gccatgatgc 480 tgtctgccga gccggagctc accctggccg agttgaggca gagactgatc cacttctctg 540 ccaaagatgt catcaatgag gcctggttcc ctgaggacca gcgggtactg 590 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 375 gataaatgtc tgcttgcttg g 21 <210> 376 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 376 ttaataaaaa tgctacaaaa c 21 <210> 377 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 377 ttccgaataa actccaggcc t 21 <210> 378 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 378 agttacaaaa gcaaaacagg t 21 <210> 379 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 379 ataaaaatgc tacaaaaccc a 21 <210> 380 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 380 ttttatttta aaaagtcacc a 21 <210> 381 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 381 aacctaccta ctccatttat c 21 <210> 382 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 382 tggggtgcta cggtttatta a 21 <210> 383 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 383 cttaagttct gggattcgga a 21 <210> 384 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 384 caagtggggt aggttgtaac t 21 <210> 385 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 385 gtttggggtg ctaattttta t 21 <210> 386 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 386 gttgtcaggg ggcaaataaa a 21 <210> 387 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 387 tcgcccgtga ggcttgcttt t 21 <210> 388 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 388 ggccgccccc ggctacaaac a 21 <210> 389 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 389 ggaatccgcc cctccaggca g 21 <210> 390 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 390 ctggcacccc tcaaaacagt g 21 <210> 391 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 391 cgcccccgta gacaaaacca c 21 <210> 392 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 392 ggggcggggc caaagtcaca c 21 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 393 gaaggggaac acagaccagg 20 <210> 394 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 394 ctccatcagg ccacagtgaa 20 <210> 395 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 395 gggagccaaa agggtcatca 20 <210> 396 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 396 cgtggactgt ggtcatgagt 20 <210> 397 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 397 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 398 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 398 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 399 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 399 agaccuguuu ugcuuuugu 19 <210> 400 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 400 acaaaagcaa aacaggucu 19 <210> 401 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 401 agaccugudt uugcuuuugn 20 <210> 402 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 402 ncaaaagcaa aacaggucu 19 <210> 403 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 403 agaccugudt uugcuuuugn 20 <210> 404 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 404 ncaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 405 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 405 cuagaccugu dtuugcuuuu gn 22 <210> 406 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 406 ncaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 407 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 407 agaccugudt uugcuuuugu 20 <210> 408 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 408 acaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 409 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 409 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 410 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 410 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 411 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 411 agaccugudt uugcuuuugu 20 <210> 412 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 412 acaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 413 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 413 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 414 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 414 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 415 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 415 agaccugudt uugcuuuugu 20 <210> 416 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 416 acaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 417 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 417 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 418 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 418 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 419 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 419 agaccugudt uugcuuuugu 20 <210> 420 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 420 acaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 421 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 421 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 422 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 422 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23 <210> 423 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 423 agaccugudt uugcuuuugu 20 <210> 424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 424 acaaaagcaa aacaggucua g 21 <210> 425 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 425 cuagaccugu dtuugcuuuu gu 22 <210> 426 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 426 acaaaagcaa aacaggucua gaa 23

Claims (58)

  1. 화학식 (308)로 나타낸 구조를 갖는 siRNA 접합체(conjugate):
    Figure pct00136

    상기 식에서,
    n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
    각각의 m1, m2, 또는 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
    R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고:
    Figure pct00137

    여기서,
    E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
    Nu는 siRNA이고;
    상기 siRNA는 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하고; siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성(reverse complementary)이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 다음의 그룹 i) 내지 vi) 중 하나로부터 선택된 서열이다:
    i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00138

    여기서, Z1은 C이고 Z2는 G이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00139

    여기서, Z5는 A이고 Z6은 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00140

    여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 포함하고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00141

    여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00142

    여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다; 및
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
    Figure pct00143

    여기서, Z21은 A이고 Z22는 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되고; 여기서 R2는 임의로(optionally) C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가지고;
    각각의 L1은 독립적으로 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의로 대체되고; 여기서 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 임의로 가지고;
    Figure pct00144
    는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타내고;
    M1은 표적화 그룹(targeting group)을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 L1이 화학식 (A1) 내지 (A26)의 그룹 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고:
    Figure pct00145

    여기서,
    각각의 j1은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고; 각각의 j2는 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 R'는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    각각의 Ra는 화학식(A27) 내지 (A45)의 그룹 또는 이의 어느 조합으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고:
    Figure pct00146

    Figure pct00147

    각각의 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이거나;
    L1은 화학식(A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 화학식(A1), (A4), (A8), (A10), 및 (A11) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 화학식 (A1), (A8) 및 (A10) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 3 내지 25개 원자의 길이를 가지거나;
    L1은 4 내지 15개 원자의 길이를 가지고;
    Figure pct00148
    는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타낸다.
  3. 제2항에 있어서, j1이 2 내지 10의 정수이고; j2가 2 내지 10의 정수이고; R'가 C1-C4 알킬이고; Ra가 A27, A28, A29, A30, 및 A31 중 하나이고; Rb가 C1-C5 알킬이거나;
    j1이 3 내지 5의 정수이고; j2가 3 내지 5의 정수이고; R'가 메틸, 에틸, 및 이소프로필 중 하나이고; Ra가 화학식 A27 또는 A28로 나타낸 바와 같은 그룹이고; Rb가 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나인 siRNA 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n1이 1 내지 2의 정수이고; n3이 0 내지 1의 정수이고; n1+n3이 2 내지 3인 siRNA 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 m1, m2 또는 m3이 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고/이거나, m1 = m2 = m3인 siRNA 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화 그룹이 독립적으로 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 친화성을 갖는 리간드이거나;
    각각의 표적화 그룹이 독립적으로 아시알로당단백질 또는 사카라이드이거나;
    각각의 표적화 그룹이 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-크실로푸라노스, L-크실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코스아민, 시알산, 갈락토스아민, N-아세틸갈락토스아민, N-트리플루오로아세틸갈락토스아민, N-프로피오닐갈락토스아민, N-n-부티릴갈락토스아민, N-이소부티릴갈락토스아민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오ㅛ-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나;
    표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각이 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민인 siRNA 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15가 서로 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸이거나;
    각각의 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 H인 siRNA 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 질소 골격 상의 N 원자에 연결하는 부위 및 R3 내의 P 원자에 연결하는 부위 둘 다를 포함하거나;
    R2 내에서, 질소 골격 상의 N 원자에 연결하는 부위가 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3 내의 P 원자에 대해 연결하는 부위가 P 원자와 함께 포스포에스테르 결합을 형성하거나;
    R2가 화학식 (B5),(B6),(B5') 또는 (B6) 중 어느 하나로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹인 siRNA 접합체:
    Figure pct00149

    Figure pct00150

    여기서,
    Figure pct00151
    는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타내고;
    q2는 1 내지 10의 정수이다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421), 또는 (422)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 접합체:
    Figure pct00152

    Figure pct00153

    Figure pct00154

    Figure pct00155

    Figure pct00156

    Figure pct00157

    Figure pct00158
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결되고, 말단 영역은 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단으로부터 계수하여 처음 4개 뉴클레오타이드를 지칭하거나;
    화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단에 연결되거나;
    화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되거나;
    화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA 내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5 위치에 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된, siRNA 접합체.
  11. 제1항에 있어서,
    i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는, siRNA 접합체.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z4 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z4가 A, U 또는 C로부터 선택되거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z8 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z8이 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z12 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z12가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z16 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z16이 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z20 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z20이 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z24 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z24가 A, C 또는 G로부터 선택된, siRNA 접합체.
  13. 제12항에 있어서, Z3이 Z4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z7이 Z8에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z11이 Z12에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z15가 Z16에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z19가 Z20에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z23이 Z24에 대해 상보성인 뉴클레오타이드인, siRNA 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II가 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 염기쌍오류(mispairing)가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는, siRNA 접합체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III이 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV가 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 동일한 길이를 갖고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는, siRNA 접합체.
  16. 제15항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 3으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 4로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CCC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 ACCC이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 63으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 64로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 U이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GU이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GGU이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GGGU이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 123으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 124로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AUAG이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 183으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 184로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GAC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AGAC이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 243으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 244로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레로타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CUG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UCUG이거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 303으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 304로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AUG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UAUG인, siRNA 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 각각 서로에 대해 완전히 역 상보성인, siRNA 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함하고, 이는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행(overhang) 말단을 형성하거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드이거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성인, siRNA 접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 5로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 6으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 7으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 8로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 65로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 66으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 67로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 68로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 125로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 126으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 127로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 128로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 185로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 186으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 187로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 188로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 245로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 246으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 247로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 248로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 305로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 306으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 307로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 308로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, siRNA 접합체.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1, siPCSKa2, siPCSKb1, siPCSKb2, siPCSKc1, siPCSKc2, siPCSKd1, siPCSKd2, siPCSKe1, siPCSKe2, siPCSKf1 또는 siPCSKf2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는, siRNA 접합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 변형된(modified) 뉴클레오타이드이고/이거나, 적어도 하나의 포스페이트 그룹이 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹인, siRNA 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드가 독립적으로 플루오로 변형된(modified) 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로(non-fluoro) 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 적어도 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 적어도 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I 내 7, 8 및 9번 위치 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA 접합체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 독립적으로 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환함으로써 형성된, 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체이거나;
    뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드가 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 뉴클레오타이드 유사체가 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나;
    각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고, 여기서 메톡시 변형된 뉴클레오타이드가 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시킴으로써 형성된 뉴클레오타이드를 지칭하는, siRNA 접합체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14 및 16번 위치에서의 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14 및 16번 위치에서의 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA 접합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1, siPCSKa1-M2, siPCSKa1-M3, siPCSKa2-M1, siPCSKa2-M2, siPCSKa2-M3, siPCSKb1-M1, siPCSKb1-M2, siPCSKb1-M3, siPCSKb2-M1, siPCSKb2-M2, siPCSKb2-M3, siPCSKc1-M1, siPCSKc1-M2, siPCSKc1-M3, siPCSKc2-M1, siPCSKc2-M2, siPCSKc2-M3, siPCSKd1-M1, siPCSKd1-M2, siPCSKd1-M3, siPCSKd2-M1, siPCSKd2-M2, siPCSKd2-M3, siPCSKe1-M1, siPCSKe1-M2, siPCSKe1-M3, siPCSKe2-M1, siPCSKe2-M2, siPCSKe2-M3, siPCSKf1-M1, siPCSKf1-M2, siPCSKf1-M3, siPCSKf2-M1, siPCSKf2-M2 또는 siPCSKf2-M3 중 어느 하나인, siRNA 접합체.
  26. 제21항에 있어서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 포스페이트 그룹 내 포스포디에스테르 결합 내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환시켜 형성된 포스포로티오에이트 그룹이거나; 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹인, siRNA 접합체:
    Figure pct00159
  27. 제26항에 있어서, siRNA 내에, 포스포로티오에이트 연결이 다음 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나 내에 위치하는, siRNA 접합체:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1S, siPCSKa1-M2S, siPCSKa1-M3S, siPCSKa2-M1S, siPCSKa2-M2S, siPCSKa2-M3S, siPCSKb1-M1S, siPCSKb1-M2S, siPCSKb1-M3S, siPCSKb2-M1S, siPCSKb2-M2S, siPCSKb2-M3S, siPCSKc1-M1S, siPCSKc1-M2S, siPCSKc1-M3S, siPCSKc2-M1S, siPCSKc2-M2S, siPCSKc2-M3S, siPCSKd1-M1S, siPCSKd1-M2S, siPCSKd1-M3S, siPCSKd2-M1S, siPCSKd2-M2S, siPCSKd2-M3S, siPCSKe1-M1S, siPCSKe1-M2S, siPCSKe1-M3S, siPCSKe2-M1S, siPCSKe2-M2S, siPCSKe2-M3S, siPCSKf1-M1S, siPCSKf1-M2S, siPCSKf1-M3S, siPCSKf2-M1S, siPCSKf2-M2S 또는 siPCSKf2-M3S 중 어느 하나인, siRNA 접합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5'-포스페이트 뉴클레오타이드가 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드가 화학식 (3) 내지 (6) 중 어느 하나로 나타낸 바과 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드인, siRNA 접합체:
    Figure pct00160

    여기서,
    R은 H, OH, 메톡시 또는 F로부터 선택되고;
    "염기"는 AU, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
  30. 제1항 내지 제29 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1P1, siPCSKa1-M2P1, siPCSKa1-M3P1, siPCSKa2-M1P1, siPCSKa2-M2P1, siPCSKa2-M3P1, siPCSKa1-M1SP1, siPCSKa1-M2SP1, siPCSKa1-M3SP1, siPCSKa2-M1SP1, siPCSKa2-M2SP1, siPCSKa2-M3SP1, siPCSKb1-M1P1, siPCSKb1-M2P1, siPCSKb1-M3P1, siPCSKb2-M1P1, siPCSKb2-M2P1, siPCSKb2-M3P1, siPCSKb1-M1SP1, siPCSKb1-M2SP1, siPCSKb1-M3SP1, siPCSKb2-M1SP1, siPCSKb2-M2SP1, siPCSKb2-M3SP1, siPCSKc1-M1P1, siPCSKc1-M2P1, siPCSKc1-M3P1, siPCSKc2-M1P1, siPCSKc2-M2P1, siPCSKc2-M3P1, siPCSKc1-M1SP1, siPCSKc1-M2SP1, siPCSKc1-M3SP1, siPCSKc2-M1SP1, siPCSKc2-M2SP1, siPCSKc2-M3SP1, siPCSKd1-M1P1, siPCSKd1-M2P1, siPCSKd1-M3P1, siPCSKd2-M1P1, siPCSKd2-M2P1, siPCSKd2-M3P1, siPCSKd1-M1SP1, siPCSKd1-M2SP1, siPCSKd1-M3SP1, siPCSKd2-M1SP1, siPCSKd2-M2SP1, siPCSKd2-M3SP1, siPCSKe1-M1P1, siPCSKe1-M2P1, siPCSKe1-M3P1, siPCSKe2-M1P1, siPCSKe2-M2P1, siPCSKe2-M3P1, siPCSKe1-M1SP1, siPCSKe1-M2SP1, siPCSKe1-M3SP1, siPCSKe2-M1SP1, siPCSKe2-M2SP1, siPCSKe2-M3SP1, siPCSKf1-M1P1, siPCSKf1-M2P1, siPCSKf1-M3P1, siPCSKf2-M1P1, siPCSKf2-M2P1, siPCSKf2-M3P1, siPCSKf1-M1SP1, siPCSKf1-M2SP1, siPCSKf1-M3SP1, siPCSKf2-M1SP1, siPCSKf2-M2SP1 또는 siPCSKf2-M3SP1 중 어느 하나인, siRNA 접합체.
  31. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA로서; 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드가 독립적으로 플루오로 변형된 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고;
    i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 포함하고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드를 포함하거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드인, siRNA.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 독립적으로 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시킴으로써 형성된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체인, siRNA.
  33. 제32항에 있어서, 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드가 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 뉴클레오타이드 유사체가 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된, siRNA.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고, 여기서 메톡시 변형된 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭하는, siRNA.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는, siRNA.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z4 위치에서의 차이를 포함하고, Z4가 A, U 또는 C로부터 선택되거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z8 위치에서의 차이를 포함하고, Z8이 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z12 위치에서의 차이를 포함하고, Z12가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z16 위치에서의 차이를 포함하고, Z16이 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z20 위치에서의 차이를 포함하고, Z20이 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Z24 위치에서의 차이를 포함하고, Z24가 A, C 또는 G로부터 선택된, siRNA.
  37. 제36항에 있어서,
    Z3가 Z4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z7이 Z8에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z11이 Z12에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z15가 Z16에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z19가 Z20에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Z23이 Z24에 대해 상보성인 뉴클레오타이드인, siRNA.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II가 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는, siRNA.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III이 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV가 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 동일한 길이를 갖고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는, siRNA.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 3으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 4로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CCC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 ACCC이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 63으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 64로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 64이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 U이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GU이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GGU이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GGGU이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 123으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 124로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AUAG이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 183으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 184로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 GAC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AGAC이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 243으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 244로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레로타이드의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 CUG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UCUG이거나;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 303으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 304로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 304이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 AUG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 UAUG인, siRNA.
  41. 제40항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 각각 서로에 대해 완전히 역 상보성인, siRNA.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함하고, 이는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행 말단을 형성하거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드이거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성인, siRNA.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 5로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 6으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 7로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 8로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 65로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 66으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 67로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 68로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 125로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 126으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 127로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 128로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 185로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 186으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 187로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 188로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 245로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 246으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 247로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 248로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 305로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 306으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 307로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 308로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, siRNA.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1, siPCSKa2, siPCSKb1, siPCSKb2, siPCSKc1, siPCSKc2, siPCSKd1, siPCSKd2, siPCSKe1, siPCSKe2, siPCSKf1 또는 siPCSKf2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는, siRNA.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1, siPCSKa2-M1, siPCSKb1-M1, siPCSKb2-M1, siPCSKc1-M1, siPCSKc2-M1, siPCSKd1-M1, siPCSKd2-M1, siPCSKe1-M1, siPCSKe2-M1, siPCSKf1-M1 또는 siPCSKf2-M1 중 어느 하나인 siRNA.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 포스페이트 그룹이 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹인 siRNA.
  47. 제46항에 있어서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 포스페이트 그룹 내 포스포디에스테르 결합 내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환시켜 형성된 포스포로티오에이트 그룹이거나; 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹인, siRNA:
    Figure pct00161
  48. 제47항에 있어서, siRNA 내에, 포스포로티오에이트 연결이 다음 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나 내에 위치하는, siRNA:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1S, siPCSKa2-M1S, siPCSKb1-M1S, siPCSKb2-M1S, siPCSKc1-M1S, siPCSKc2-M1S, siPCSKd1-M1S, siPCSKd2-M1S, siPCSKe1-M1S, siPCSKe2-M1S, siPCSKf1-M1S 또는 siPCSKf2-M1S 중 어느 하나인, siRNA.
  50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5'-포스페이트 뉴클레오타이드가 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드가 화학식 (3) 내지 (6) 중 어느 하나로 나타낸 바과 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드인, siRNA:
    Figure pct00162

    여기서,
    R은 H, OH, 메톡시 또는 F로부터 선택되고;
    "염기"는 AU, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
  51. 제31항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1P1, siPCSKa2-M1P1, siPCSKa1-M1SP1, siPCSKa2-M1SP1, siPCSKb1-M1P1, siPCSKb2-M1P1, siPCSKb1-M1SP1, siPCSKb2-M1SP1, siPCSKc1-M1P1, siPCSKc2-M1P1, siPCSKc1-M1SP1, siPCSKc2-M1SP1, siPCSKd1-M1P1, siPCSKd2-M1P1, siPCSKd1-M1SP1, siPCSKd2-M1SP1, siPCSKe1-M1P1, siPCSKe2-M1P1, siPCSKe1-M1SP1, siPCSKe2-M1SP1, siPCSKf1-M1P1, siPCSKf2-M1P1, siPCSKf1-M1SP1 또는 siPCSKf2-M1SP1 중 어느 하나인, siRNA.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siPCSKa1-M1SP, siPCSKb1-M1SP, siPCSKc1-M1SP, siPCSKd1-M1SP, siPCSKe1-M1SP 또는 siPCSKf1-M1SP 중 어느 하나인, siRNA.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 siRNA에 접합적으로(conjugatively) 연결된 접합 그룹을 포함하는, siRNA 접합체.
  55. PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태를 치료 및/또는 방지하기 위한 의약의 제조시의, 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  56. PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, PCSK9 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 질환 또는 생리학적 상태의 치료 및/또는 방지하는 방법.
  57. 유효량의 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물과 간세포를 접촉시킴을 포함하여, 간세포에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  58. 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 키트(kit).
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